Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексный подход к оценке микробиоценоза кишечника

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Комплексный подход к оценке микробиоценоза кишечника"

На правах рукописи

ЩЕГЛОВ Владимир Сергеевич

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

19 ДЕК 2013

005544146

Сан кт-Петербу р г 2013

005544146

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Бойцов Алексей Геннадьевич

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

Королюк Александр Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГПМУ Минздрава РФ, заведующий.

Ермоленко Елена Игоревна — доктор медицинских наук, Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, заведующая лабораторией.

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучию человека.

Защита диссертации состоится «27» декабря2013г. в 1 Ь часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «2 Ь » ноября 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы исследования. Бактериологическое исследование на дисбиоз кишечника привлекает внимание специалистов различного клинического профиля и является одним из наиболее востребованных в лабораторной практике. Значительная часть исследований по данной проблеме посвящена проведению разностороннего анализа состояния микробной ассоциации пищеварительного тракта при патологии пищеварительной системы и других органов, проведению коррекции дисбиотических состояний. Востребованность данного исследования требует оптимизации методического обеспечения исследования на дисбиоз кишечника. В ходе исследования на дисбиоз лишь иногда диагностируются кишечные инфекции. По данным ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора структура заболеваемости острыми кишечными инфекциями (ОКИ) в РФ в 2012 г. выглядела следующим образом: сальмонеллез - 6,5%, шигелез -1,8%, другие ОКИ установленной этиологии - 27,4%, кишечные инфекции неустановленной этиологии - 64,3% (Сведения об инфекционных заболеваниях, 2012). У части обследуемых при отсутствии выделения патогенных микроорганизмов патологическое состояние рассматривается лечащим врачом как дисбиоз кишечника с назначением соответствующей коррекции в соответствии с требованиями отраслевого стандарта ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». В ряде случаев это приводит к этиологически некорректному выбору препаратов.

Лабораторное исследование на условно-патогенные микроорганизмы или дисбиоз кишечника должно включать и определение патогенных микроорганизмов. Однако ОСТ 91500.11.0004-2003 не предусматривает минимального перечня определяемых патогенов и использование современных методов диагностики. В последние годы вирусные агенты занимают ведущее место среди этиологических факторов острых кишечных инфекций у детей во всем мире (Горелов A.B., 2004). Доля бактериальных кишечных инфекций значительно снизилась и составляет 7-10%. Увеличилось число вирусно-бактериальных микст-инфекций до 15-17% (Горелов A.B. и соавт., 2005). Вклад возбудителей вирусной этиологии в общую структуру кишечных инфекций детей раннего возраста составляет 57,9%, среди них

доля ротавирусов - 35%, норовирусов - 16,7%, астровирусов - 6,2% (Бод-невС.А. и соавт., 2010). Таким образом, существует необходимость формирования минимального перечня патогенных микроорганизмов и методов их определения применительно к лабораториям, выполняющим исследования надисбиоз кишечника.

Одной из наиболее частых причин формирования дисбиоза кишечника является антибиотикотерапия. В результате подавления ин-дигенных микроорганизмов появляется риск колонизации кишечника токсигенными штаммами Clostridium difficile как в результате инфицирования, так и активации уже имеющихся симбионтов. Традиционное исследование на дисбиоз кишечника в России не подразумевает выявление С. difficile и их токсинов, поэтому требуется целенаправленная оценка их выявляемое™ при дисбиотических состояниях.

Одной из задач исследования на дисбиоз кишечника является подбор препаратов для его коррекции. Применение антибактериальных препаратов сопряжено с подавлением индигенных микроорганизмов кишечного микробиоценоза, поэтому существует потребность в определении чувствительности их к антибиотикам. Пробиотические препараты, применяемые при дисбиотических состояниях, являются актуальной альтернативой антибиотикотерапии. Проблемой заслуживающей особого внимания, является антибиотикорезистентность про-биотических штаммов, используемых в составе данных препаратов. Применение таких полирезистентных штаммов может способствовать распространению устойчивости к антибактериальным препаратам (АБП) среди представителей кишечного биотопа: индигенных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Так лактобактерии, выделяемые от детей грудного возраста, имеют от 8 до 15 маркеров резистентности (Николаева И.В и соавт., 2010). Все чаще появляется информация о плазмидной природе устойчивости лактобактерий к антибиотикам (Gueimonde M. et al., 2006; Huys G. et al., 2006; Masco L. et al., 2006; Saarela M. et al., 2007). Интерпретация результатов определения резистентности лакто- и бифидобактерий к АБП сопряжена с определенными трудностями. Многочисленные противоречия, в отношении оценок частоты находок антибиотикорезистентных штаммов лактобактерий могут быть обусловлены как естественными причинами, так и методическими: отсутствием, как стандартных методов тестирования, так и общепризнанных пограничных значений МИК. Учитывая важность дан-

ной проблемы, необходимо изучение устойчивости к антибактериальным препаратам пробиотических штаммов, индигенных микроорганизмов кишечного биоценоза, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий для оптимизации выбора средств противомикробной терапии.

Степень разработанности темы исследования. Большинство работ, посвященных дисбиозам кишечника, касаются изучения количественно-качественного состава микробиоценоза кишечника, наличию условно-патогенных микроорганизмов и их ассоциаций (Захаренко С.М. и соавт., 2006; Катаева JI.B. и соавт., 2010). Данный подход к изучению регламентируется соответствующим отраслевым стандартом. При этом недооценена {юль возбудителей ОКИ как бактериальной, так и вирусной этиологии, наличие которых влечет за собой дисбиотические изменения.

Так, в соответствии с требованиями ОСТ 91500.11.0004-2003, необходимо выделять 16 групп микроорганизмов, в перечень которых не входят вирусные возбудители и труднокультивируемые патогены (Campylobacter spp., Y.enterocolitica). Нельзя не отметить, что классическое бактериологического исследование на дисбиоз не в полной мере отвечает современным потребностям клинической медицины и существующим возможностям диагностики. В связи с этим, необходима разработка алгоритма исследования на дисбиоз кишечника с формированием перечня выявляемых патогенов как бактериальной, так и вирусной этиологии.

Цель исследования. С помощью современных методов (ПЦР, иммунохроматография) определить частоту обнаружения вирусов и бактерий - этиологических агентов диарейного синдрома у детей, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника, для оптимизации выбора средств противомикробной терапии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций у детей, обследованных на дисбиоз кишечника бактериологическим методом, сопоставить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций с помощью ПЦР и классического бактериологического метода и оценить целесообразность включения генной диагностики в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.

2. Оценить частоту выявления токсинов Clostridium difficile у детей, обследуемых на дисбиоз кишечника, и необходимость включе-

ния иммунохроматографического метода в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.

3. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам возбудителей кишечных инфекций и условно-патогенных энте-робактерий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника.

4. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам индигенных представителей микробиоценоза кишечника и про-биотических штаммов.

Научная новизна исследования:

1. Определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций при проведении классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника и ПЦР, разработан алгоритм комплексного исследования, направленный на улучшение качества микробиологической диагностики кишечных инфекций в ходе исследования на дисбиоз кишечника.

2. Впервые на основании большой выборки определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций в результате проведения классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника (8174 исследований).

3. У детей, обследующихся по поводу дисбиоза кишечника, впервые определена частота обнаружения токсина Clostridium difficile методом иммунохроматографии.

4. Впервые сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам пробиотических штаммов и микроорганизмов кишечного биотопа, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника.

Теоретическая и практическая значимость исследования:

1. Предложен комплексный подход к диагностике дисбиоза кишечника, основанный на применении молекулярно-генетического и бактериологического методов исследования. Показана необходимость при проведении данного исследования целенаправленного поиска наиболее часто встречающихся возбудителей кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии. Получено удостоверение на рационализаторское предложение № 1857, принятое ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 24.06.2011г. к использованию под наименованием «Уточнение диагностики дисбактериоза кишечника».

2. Сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам микроорганизмов кишечного биоценоза и возбудителей кишечных инфекций, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника, являющейся важной информацией для дальнейшего изучения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа.

3. Данные о минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных препаратов для лакто- и бифидобактерий являются важной информацией для проведения дальнейших исследований с целью выяснения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа и разработки критериев безопасности пробиоти-ческих штаммов.

Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного многоцентрового проспективного исследования с использованием бактериологических, молекулярно-генетических, аналитических, статистических методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение комплексного подхода к исследованию на дисбиоз кишечника с использованием полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей кишечных инфекций повышает расшифровку причин дисбиотических состояний.

2. Выявление токсинов С.сИШсПе в рамках комплексного исследования на дисбиоз кишечника целесообразно.

3. Среди штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробак-терий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника, выявляются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Имеет место множественная лекарственная устойчивость лак-тобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов и лакто-бактерий кишечного микробиоценоза.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Степень достоверности полученных результатов проведённых исследований определяется достаточным и репрезентативным объёмом выборок исследований и обследованных пациентов с использованием современных методов исследования. Статистическая обработка полученных результатов осуществлена методами параметрической и непа-

раметрической статистики с использованием компьютерных программ Excel. Достоверность различий определяли, рассчитывая Хи квадрат при р<0,05 и ошибку доли. Методы статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам. Сформулированные в диссертации выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа значительного объёма выборок обследованных пациентов и результатов выполненных исследований. Достоверность работы подтверждается публикацией её результатов в рецензируемых научных изданиях.

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на отчетных научно-практических конференциях сотрудников и молодых ученых СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2010, 2011), на Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микробиологии и клинической микологии с международным участием «XV Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 27 -28 июня 2012г.) и «XVI Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 19 -21 июня 2013 г.) и Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID-2013, Берлин, 27 -30 апреля 2013 г.).

Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры медицинской микробиологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России, протокол № 12/13 от «31» октября 2013 г.; на заседании научной проблемной комиссии «Эпидемиология, профилактика, диагностика и лечение инфекционных (бактериальных, вирусных, микотических, паразитарных и связанных с оказанием медицинской помощи) и некоторых неинфекционных заболеваний» ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, протокол № 3 от 12.11.13.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертационного исследования внедрены в работу бактериологической лаборатории Госпиталя ветеранов войн и бактериологическую лабораторию ЗАО «СИТИЛАБ».

Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный курс кафедры микробиологии Военно-медицинской академии

им. С.М. Кирова и курс практических занятий медицинского факультета СПбГУ.

Личное участие автора в получении результатов исследования.

Автором обоснованы цель, задачи и схемы исследования, осуществлены сбор и анализ литературных источников. Выполнены основные микробиологические исследования. Предложен комплексный подход к исследованию на дисбиоз кишечника. Проанализированы полученные данные, осуществлено обобщение и статистическая обработка результатов исследования, сформулированы выводы и основные положения, выносимые на защиту.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстративный материал представлен 8 рисунками и 24 таблицами. Список использованной литературы содержит 156 источников, из них 87 отечественных и 69 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Классическое бактериологическое исследование на дисбиоз кишечника было проведено у 8174 детей: у 5092 ребенка в возрасте до одного года, у 2101 пациента в возрастной группе от одного года до 6 лет и 981 обследуемого в группе от 6 до 18 лет. Группа обследованных представляла собой случайную выборку лиц, направленных врачами разного профиля для исследования на дисбиоз кишечника. Исследуемый материал поступал из 59 многопрофильных клиник Санкт-Петербурга в клинико-диагностическую лабораторию ЗАО «СИТИ-ЛАБ» в период с 01.05.2008 по 01.05.2009 гг.

Материалом для исследования на дисбиоз кишечника служили фекалии. Исследование включало выделение бифидобактерий, лактобактерий, типичных и лактозонегативных кишечных палочек, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, неферментирую-щих грамотрицательных бактерий, стафилококков, гемолитических форм микроорганизмов, энтерококков, дрожжеподобных грибов рода Candida. Оценка результатов проводилась в соответствии с нормативами, приведенными в Отраслевом стандарте «Протокол

ведения больных. Дисбактериоз кишечника» 91500.11.0004-2003. Идентификацию анаэробных микроорганизмов, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий осуществляли на приборе VITEK 2 Compact, используя карты для идентификации: ANC (244147910), GN (bioMerieux Франция). Определение серогрупп диареегенных эшерихий и серотипов сальмонелл проводилось с помощью сывороток, выпускаемых ОАО «БИОМЕД» им. И.И. Мечникова и Санкт-Петербургским научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток и предприятием по производству бактерийных препаратов.

При проведении комплексного исследования на дисбиоз кишечника обследовано 150 человек. Исследование фекалий включало в себя бактериологический метод и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с определением нуклеиновых кислот Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., EIEC, Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, Norovirus, Adenovirus, Atrovirus, Rotavirus. Группа обследованных представляла собой случайную выборку лиц, направленных врачами разного профиля для исследования на дисбиоз. Отбор по специфическим жалобам или клиническим проявлениям, указывающим на наличие кишечной инфекции, не производился с целью отразить значимость расширенного исследования или отсутствие таковой при диагностике дисбиоза кишечника. Для выделения нуклеиновых кислот из фекалий использовали комплект реагентов «Рибо-сорб» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Проведение ПЦР-диагностики осуществлялось на приборах «Терцик» (ДНК-Технология, Россия), «Ротор Джин-3000» (Corbett research, Австралия), с последующей детекцией продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле и гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Использовались наборы реагентов ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ.

С целью определения частоты встречаемости токсинов Clostridium difficile были изучены образцы фекалий 219 детей: 71 ребенка в группе детей до одного года, 108 детей в возрасте 1-6 лет, 40 детей старше шести лет. Группы обследованных представляли собой случайную выборку лиц, направленных врачами разного профиля для исследования на дисбиоз. Исследование проводили с использованием тест-систем Xpect Clostridium difficile Toxin А/В (Oxoid).

Определение резистентности к антибактериальным препаратам лакто- и бифидобактерий проводили методом серийных разведений с

диапазоном концентраций от 0.015 мкг/мл до 128мкг/мл с последующим определением минимальных ингибирующих концентраций -МИК 50 (для 50% исследованных штаммов) и МИК 90 (для 90% исследованных штаммов). Определение категорий чувствительности проводили в соответствии с рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (2013). Антибиотикорезистент-ность энтерококков, условно-патогенных и патогенных энтеробакте-рий определяли на приборе VITEK 2 Compact (bioMerieux Франция), используя карты для определения чувствительности к антимикробным препаратам клинически значимых грамотрицательных палочек (AST-N102) и карты для определения чувствительности к антимикробным препаратам Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Streptococcus agalactiae (AST-N102).

Протестировано 147 штаммов индигенных лактобактерий, 477 - условно-патогенных энтеробактерий, 166 - патогенных энтеробактерий,

198 штаммов Enterococcus spp., выделенных из материала пациентов, и 53 пробиотических штамма, выделенных из коммерческих препаратов (27 - лактобактерий, 22 - бифидобактерий и 3 штамма энтерококков). Сопоставлена устойчивость 147 штаммов лактобактерий, выделенных из фекалий и 27 штаммов лактобактерий из пробиотических препаратов, 114 штаммов Enterococcus spp., выделенных из фекалий, 84 штаммов Enterococcus spp., выделенных из мочи и 3 штамма Enterococcus spp. из пробиотических препаратов.

Обработку данных осуществляли методами параметрической и непараметрической статистики с использованием компьютерных программ Excel. Достоверность различий определяли, рассчитывая Хи квадрат при р<0,05 и ошибку доли.

Результаты исследования и их обсуждение.

В результате 8174 исследований на дисбиоз было выявлено

199 штаммов возбудителей кишечных инфекций, что составило (2,4±0,3)%. В их числе 114 штаммов диареегенных эшерихий, что составило (1,4±0,3)% от общего количества обследованных, 60 штаммов иерсиний и 25 - сальмонелл, что составило (0,7±0,2)% и (0,3±0,1)% соответственно. Из 114 штаммов диареегенных эшерихий 65 изолятов выделено в группе детей до года (57% от общего числа находок), 40 штаммов - в группе детей 1-6 лет (35%), 9 находок - в

группе детей старше 6 лет (8%). Находки иерсиний преобладали в группе детей старше 6 лет - 42 штамма (70% от общего числа находок иерсиний). В группе детей от года до 6 лет выделено 16 штаммов иерсиний (26,7%), в группе детей младше года - 2 штамма (3,3%). Из 25 штаммов сальмонелл 10 обнаружены в группе детей от года до 6 лет (40% находок), 7 - в группе детей до 1 года (28%), 8 - в группе детей старше 6 лет (32%). Наиболее частые патогены, выявляемые у детей до года при исследовании на дисбиоз, - диареегенные E.coli. Из 65 изолятов, полученных от пациентов в группе детей до одного года, 22 относились к группе энтеропатогенных эшерихий (ЕРЕС) (34,5% от числа выделенных диареегенных эшерихий), 36 штаммов - к группе энтеротоксигенных эшерихий (ЕТЕС), что составило 55%, 7 изолятов (10,5%) относились к серогруппам, представители которых наиболее часто вызывают такие внекишечные поражения, как инфекции мочевыводящих путей (UPEC), бактериемии, менингиты новорожденных (NMEC) согласно Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2005). В группе детей от 1 года до 6 лет из 40 изолятов диареегенных эшерихий 29 штаммов относились к группе энтеротоксигенных эшерихий (72,5% от числа выделенных диареегенных эшерихий), 8 — к группе энтеропатогенных эшерихий (20%), 3 изолята (7,5%) - к серогруппам, представители которых вызывают внекишечные поражения. В группе детей старше 6 лет 7 из 9 культур относились к группе энтеротоксигенных эшерихий, 2 - к группе энтеропатогенных эшерихий.

В результате расширенного исследования, которое включало в себя классический бактериологический метод в параллели с целенаправленным выявлением возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом ПЦР установлено, что из 150 обследованных у 12

- (8±4,4)% были выделены бактериальные возбудители кишечных инфекций, в том числе Campylobacter spp. - у 7 человек - (4,7±1,7)%, Salmonella spp. - у 3 пациентов - (2±1,1)%, Y.enterocolitica. - у 2 человек - (1,3±0,9)%. У 23 обследованных - (15,3±5,9)% были выделены вирусные возбудители кишечных инфекций, в том числе Adenovirus - у 6 человек - (4±1,6)% обследованных), Rotavirus - у 6 человек - (4±1,6)%, Norovirus - у 7 человек - (4,6±1,7)%, Astrovirus

- у 4 человек - (2,7±1,3)%.

Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим методом диагностики увеличивает частоту обнаружения у детей, обследуемых

по поводу дисбиоза кишечника, потенциальных этиологических агентов ОКИ по сравнению с классическим подходом в 9,6 раз с (2,4±0,3)% до (23,3±6,9)%. С помощью ПЦР вирусы, возможная причина ОКИ, обнаруживались в (15,3±2,9)%, бактерии - в (8±4,4)%.

Полученные данные указывают на недооценку роли выявления возбудителей кишечных инфекций как причины развития дисбиоти-ческих состояний. Наиболее часто патогены выявлялись у детей до 6 лет (68,6% от общего числа находок при данном исследовании).

Частота обнаружения токсинов Clostridium difficile у пациентов, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника, составила (1,8±0,9)%. В группе детей до одного года выявлено 2 положительных результата, что составило 2,8% от числа детей этого возраста, у детей в возрасте 1-6 лет - 1 случай выявления токсина (0,9%), среди детей старше шести лет - один случай (2,5%). Обнаружение токсинов С. difficile у детей до одного года не всегда является диагностически значимым, так как у большинства из них отсутствуют сайты связывания для данного токсина. Находки С. difficile и их токсинов у детей раннего возраста являются прямым указанием на несформировавшийся микробиоценоз кишечника или ослабленную колонизационную резистентность индигенных микроорганизмов. Полученные данные свидетельствуют о необходимости избирательного исследования на присутствие токсинов C.difficile у пациентов с учетом клинических и эпидемиологических данных.

При характеристике резистентности к антибактериальным препаратам (АБП) штаммов условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ), выделенных при исследовании на дисбиоз кишечника, протестировано 477 штаммов: 96 штаммов Enterobacter spp., 26 штаммов Citrobacter spp., 144 штамма Klebsiella pneumoniae, 109 штаммов Klebsiella oxytoca, 28 штаммов E.coli с гемолитической активностью, 74 изолята E.coli с типичными свойствами.

Среди условно-патогенных энтеробактерий резистентность хотя бы к одному препарату выявлена от (24,3±4,3)% для штаммов E.coli с типичными свойствами до 100% для штаммов Citrobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp. Резистентность преимущественно затрагивала бета-лактамы, нитрофураны и сульфаниламиды.

Резистентность к амоксициллину/клавуланату составляла от 0,9% у штаммов Klebsiella oxytoca до 100% у штаммов Enterobacter spp. и

Citrobacter spp. Устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения была наиболее выражена к цефотаксиму и составила у штаммов E.coli с гемолитической активностью 14,3%. Резистентность к аминоглико-зидам была наиболее выражена в отношении гентамицина и составляла у штаммов Klebsiella pneumoniae и E.coli с гемолитической активностью 6,2% и 14,3% соответственно. Устойчивость к ципрофлок-сацину была незначительной и составила для штаммов Klebsiella pneumoniae 2,7%. Резистентность к фосфомицину была наиболее выражена среди штаммов Enterobacter spp. и Klebsiella pneumoniae и составила 40,6% и 40,3% соответственно. В 33% случаев штаммы Klebsiella oxytoca были устойчивы к нитрофурантоину. Резистентность к триметоприму/сульфаметоксазолу составила от 6,4% у штаммов Klebsiella oxytoca до 22,9% у штаммов Enterobacter spp.

Среди изученных изолятов Enterobacter spp., E.coli с гемолитической активностью, Klebsiella spp. выявлены штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Среди штаммов E.coli с типичными свойствами и Citrobacter spp. ни одного случая выявления множественной лекарственной устойчивости не было. Среди штаммов E.coli с гемолитической активностью выявлены 4 штамма с МЛУ к 4 группам препаратов, что составило 14,3% от числа изученных штаммов E.coli с гемолитической активностью. У штаммов Klebsiella spp. выявлено 16 случаев множественной лекарственной устойчивости, что составило 6,3% от количества изученных штаммов клебси-елл. При этом среди штаммов Klebsiella pneumoniae частота обнаружения МЛУ составила 9,7%, а среди штаммов Klebsiella oxytoca -1,8%. Среди штаммов Enterobacter spp. случаи МЛУ зафиксированы для восьми штаммов, что составило 8,3% от числа изученных Enterobacter spp. Таким образом, наибольшее количество штаммов, обладающих МЛУ, встречалось среди штаммов E.coli с гемолитической активностью и штаммов Klebsiella pneumoniae.

На основании спектра устойчивости, с помощью прибора VITEK 2 Compact, фенотипически были выявлены ферменты резистентности условно-патогенных энтеробактерий:

1) продукция бета-лактамаз расширенного спектра (Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL), СТХ-М подобные бета-лактамазы класса А - у 10 штаммов;

2) сочетание продукции ESBL и снижение проницаемости клеточной стенки для цефамицинов - 7;

3) прочие случаи выявления бета-лактамаз расширенного спектра (ESBL)-23;

4) цефалоспориназа AmpC - 1;

5) гиперпродукция бета-лактамаз расширенного спектра (высокая экспрессия гена AmpC) - 2;

6) плазмидные цефалоспориназы, кроме АСС-1 - 2;

7) плазмиднокодируемая цефалоспориназа и цефалоспориназа AmpC -3;

8) приобретенная пенициллиназа и непроницаемость клеточной стенки для цефамицинов - 7;

9) продукция аминогликозидмодифицирующего фермента (АГМФ) - TOB NET AMI ААС(б') -1 - 4;

10) продукция аминогликозидмодифицирующего фермента (АГМФ) - ААС(б') -1, ААС(б') - II - 12.

Среди штаммов E.coli с типичными свойствами были выявлены 4 фермента резистентности (5,4% от количества штаммов в группе), среди штаммов E.coli с гемолитической активностью - 8 (28,6%), среди штаммов Enterobacter spp. - 12 ферментов (12,5%), среди штаммов Klebsiella spp. - 47 ферментов (18,2%). Среди штаммов Citrobacter spp. ферменты не обнаружены.

С целью оценки частоты выявления резистентности к АБП среди патогенных энтеробактерий, выделенных при исследовании на дисбиоз кишечника, проанализирована устойчивость 95 штаммов диареегенных E.coli, 46 штаммов Yersinia spp., 25 штаммов Salmonella spp.

Количество устойчивых к нитрофурантоину штаммов сальмонелл, выделенных при исследовании на дисбиоз кишечника, составило (40±4,9)% штаммов, (43,1±5,0)% выделенных штаммов диареегенных эшерихий резистентны к ампициллину, (20±4)% штаммов - к амоксициллину/клавуланату, среди иерсиний (65,2±4,8)% штаммов устойчивы к амоксициллину/клавуланату.

Наибольшее количество штаммов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, выявлено среди штаммов Salmonella spp. (12%). Случаи МЛУ среди диареегенных E.coli и Yersinia spp. составили 4,7% и 2,2% соответственно.

Проведено ранжирование частоты встречаемости резистентности к АБП среди патогенных и условно-патогенных энтеробактерий к 6 антибактериальным препаратам.

Сравнивали устойчивость к амоксициллину/клавуланату, тримето-приму/сульфаметоксазолу, нитрофурантоину, гентамицину, ципрофлок-сацину, цефтазидиму. Выявлены совпадения рангов устойчивости к амоксициллину/клавуланату у штаммов Yersinia spp., диареегенных E.coli, Citrobacter spp. и Enterobacter spp., к нитрофурантоину - у штаммов Salmonella spp. и Klebsiella oxytoca, к гентамицину - у штаммов Salmonella spp. и E.coli с гемолитической активностью. Совпадения свидетельствуют о роли резистентных условно-патогенных энтеробактерий как возможного резервуара генов резистентности и вероятностной передаче их патогенным энтеробактериям. Вследствие этого необходима элиминация выделенных в диагностически значимом количестве условно-патогенных микроорганизмов, устойчивых к АБП.

Среди штаммов лактобактерий, выделенных от пациентов, обследованных на дисбиоз кишечника, резистентность выявлена не менее чем у 84% штаммов к бензилпенициллину, цефазолину, цефтриаксону, цефотаксиму, азтреонаму, ванкомицину, тетрациклину, стрептомицину, амикацину, канамицину, линкомицину, ципрофлоксацину, фурадо-нину. Примечательно, что для амикацина, стрептомицина, канамицина, цефазолина, тетрациклина МИК 50 и МИК 90 отличались на один шаг, что рассматривается как идентичность в пределах одного двойного разведения реальной конечной точки. Для ванкомицина, цефотаксима, цефтриаксона, азтреонама, фурадонина МИК 50 и МИК 90 совпали.

Выявлена резистентность штаммов пробиотических лактобактерий к бензилпенициллину, цефазолину, цефтриаксону, азтреонаму, ванкомицину, стрептомицину, канамицину, офлоксацину, ципрофлоксацину не менее чем для 74% изолятов. Для цефотаксима МИК 50 и МИК 90 отличались на один шаг, что в рамках ошибки метода является идентичным. Для цефтриаксона, азтреонама, ванкомицина МИК 50 и МИК 90 совпали.

Резистентность бифидобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов, к бензилпенициллину, цефазолину, цефтриаксону, азтреонаму, ванкомицину, стрептомицину, амикацину, канамицину, линкомицину, офлоксацину, ципрофлоксацину установлена не менее чем у 72% штаммов. Для офлоксацина и фурадонина МИК 50 и МИК 90 отличались на один шаг. Для цефтриаксона и ванкомицина МИК 50 и МИК 90 совпали.

Фенотипически выраженная резистентность к АБП выявляется как среди бактерий, выделенных от пациентов, так и пробиотических штаммов лакто - и бифидобактерий. Случаи множественной лекарст-

венной устойчивости к 5 и более группам препаратов выявлены не менее чем для 80% штаммов всех групп тестируемых микроорганизмов (рис. 1).

" Лактобактерии, выделенные, при исследовании на дисбиоз кишечника ■ Лактобактерии, выделенные из пробиотических штаммов

□ Бифидобактерии, выделенные из пробиотических штаммов

РисЛ. Множественная лекарственная устойчивость штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium

В отличие от лакто- и бифидобактерий энтерококки в составе пробиотических препаратов используют сравнительно недавно. Вопрос о безопасности таких штаммов неоднозначен, т.к. энтерококки -нередкий возбудитель гнойно-септических инфекций. При сравнении частоты выявления резистентности к АБП среди штаммов Enterococ-cus faecium, выделенных при диагностике дисбиоза, из мочи и пробиотических препаратов, выявлено, что устойчивость к эритромицину составила от 35% до 64,9%, клиндамицину от 80% до 95,2% и тетрациклину от 53% до 95,2%. Это указывает на циркуляцию резистентных штаммов Enterococcus faecium.

ВЫВОДЫ

1. Применение бактериологического метода диагностики в комплексе с ПЦР статистически достоверно (р<0,05) увеличивает частоту обнаружения у детей, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника, этиологических агентов ОКИ по сравнению с классическим подходом в 9,6 раз с (2,4±0,3)% до (23,3±6,9)%. Классический бактериологический метод и полимеразная цепная реакция являются взаимодополняющими методами и должны использоваться параллельно.

2. Частота обнаружения токсина Clostridium difficile иммуно-хроматографическим методом у детей, обследуемых на дисбиоз кишечника, составила (1,8±0,9)% в связи с чем включение иммунохро-матографического метода выявления токсина C.difficile в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника целесообразно по клиническим показаниям и эпидемиологическому анамнезу.

3. Доля патогенных энтеробактерий, выделенных при исследовании на дисбиоз кишечника, устойчивых хотя бы к одному антибактериальному препарату, среди иерсиний составила (65,2±4,8)% штаммов, диареегенных эшерихий - (43,1 ±5,0)% штаммов, сальмонелл - (40,0±4,9)% штаммов.

4. Среди условно-патогенных энтеробактерий резистентность хотя бы к одному препарату выявлена от (24,3±4,3)% для штаммов E.coli с типичными свойствами до 100% для штаммов Citrobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp. Фенотипически автоматизированным методом пограничных концентраций установлено, что у штаммов Е. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. резистентность к бета- лактамам была обусловлена продукцией бета-лактамаз ESBL, а к аминоглико-зидам — синтезом аминогликозидмодифицирующих ферментов ААС(б') -1 и ААС(б') - II.

5. Устойчивость к 5 и более группам антибактериальных препаратов выявлена у (98,0±2,8)% штаммов Lactobacillus, выделенных из кишечника, у (81,5±7,8)% штаммов Lactobacillus и (82,6±7,6)% штаммов Bifidobacterium, входящих в состав пробиотических препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется комплексный характер диагностики дисбиоти-ческих состояний у детей с использованием бактериологического метода и современных методов диагностики ОКИ бактериальной и вирусной этиологии (ПЦР и иммунохроматографии).

2. При назначении антибактериальных препаратов для лечения кишечных инфекций, либо коррекции дисбиотических состояний рекомендуется учитывать чувствительность лактобактерий к ампициллину и гентамицину.

3. Рекомендуется элиминация выделенных в диагностически значимом количестве условно-патогенных микроорганизмов, устойчивых к антибактериальным препаратам.

4. Выявление токсина С.сНЙПсПе рекомендуется проводить при наличии клинических показаний (диарея) и эпидемиологического анамнеза (антибиотикотерапия или пребывание в стационаре).

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы дальнейшей разработки темы лежат в совершенствовании подходов к лабораторной диагностике дисбиотических состояний, пересмотре перечня групп микроорганизмов, определяемых при изучении кишечного микробиоценоза и разработке стратегии исследования на дисбиоз кишечника с целью предоставления клиницистам достоверной информации о состоянии микробиоты, а также в изучении вероятности передачи генов резистентности среди микроорганизмов, являющихся представителями микробиоценоза кишечника и входящих в состав пробиотических препаратов, с целью разработки критериев коррекции дисбиотических состояний и индивидуального подбора пробиотических препаратов, а также с целью изучения генетической безопасности стартовых пробиотических культур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щеглов B.C. Дисбактериоз и кишечная инфекция у детей / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, В.В. Смирнов, Е.В. Горелова, Т.В. Дома-кова, B.C. Щеглов // Материалы Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций». - СПб, 2009. - С. 200.

2. Щеглов B.C. Расширенное микробиологическое исследование при диагностике дисбактериоза / B.C. Щеглов // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2010. -№2-3. -С. М100-М101.

3. Щеглов B.C. ПЦР как составляющая при исследовании на дисбактериоз / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, B.C. Щеглов // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2010. - №4. - С. М28.

4. Щеглов B.C. Дисбиотические изменения как следствие кишечной инфекции / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, B.C. Щеглов // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии». - СПб, 2010. - С. 251-252.

5. Щеглов B.C. Антибиотикорезистентность лактобактерий, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, из пищевых продуктов и пробиотиков / А.Г. Бойцов, С.Л. Ильинская, Л.Ю. Нилова, B.C. Щеглов // Медицинский Академический Журнал. - 2010. - Т 10 -№5 - С 90.

6. Щеглов B.C. Использование антибиотикорезистентных штаммов молочнокислых бактерий. Тенденции и риски / B.C. Щеглов, С.Л. Снегирева, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова И Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии».-СПб, 2011.-С. 154-155.

7. Щеглов B.C. Выявление патогенных E.coli у детей в ходе исследования на дисбактериоз кишечника / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, Л.Ю. Нилова, B.C. Щеглов II Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2011. -№4. - С. М24.

8. Щеглов B.C. Выявление вирусов - возбудителей кишечных инфекций в ходе исследования на дисбактериоз кишечника / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, B.C. Щеглов, Л.Ю. Нилова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2011. - №4. - С. М24-М25.

9. Щеглов B.C. Выявление бактерий и вирусов - возбудителей кишечных инфекций у лиц с дисбактериозом кишечника / Е.А. Ори-шак, А.Г. Бойцов, B.C. Щеглов, Л.Ю. Нилова // Журнал Лаборатория. -2011. -№4. -С. 21-22.

10. Щеглов B.C. Значение полимеразной цепной реакции при диагностике дисбактериоза / B.C. Щеглов, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова // Профилактическая и клиническая медицина. — 2011. - №3(40). - С. 381-383.

П.Щеглов B.C. Применение антибиотикорезистентных штаммов молочнокислых бактерий в пищевой и фармацевтической промышленности: риски и тенденции / Е.А. Оришак, А.Г. Бойцов, Л.Ю. Нилова, B.C. Щеглов, С.Л. Снегирева // Профилактическая и клиническая медицина. - 2011. - №3(40). - С. 372-376.

12. Щеглов B.C. Сравнение антибиотикорезистентности энтеро-бактерий, одновременно выделяемых от пациентов с кишечными инфекциями / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов, Л.Ю. Нилова // Проблемы медицинской микологии. -2012. -Т14. - №2. - С. 117.

13. Щеглов B.C. Роль дополнительных микробиологических исследований в поиске причин дисбиотических состояний у детей раннего возраста / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов // Материалы IV Российского форума «Педиатрия Санкт-Петербурга: опыт, инновации, достижения»-СПб, 2012.-С. 212-215.

14. Щеглов B.C. Выявление кишечных инфекций у детей в возрасте до 6 лет, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов // Материалы IV Российского форума «Педиатрия Санкт-Петербурга: опыт, инновации, достижения» — СПб, 2012.-С. 215-216.

15. Щеглов В.С.Спектр антибиотикорезистентности энтеробакте-рий, одновременно выделяемых от одного пациента / Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова, B.C. Щеглов // Журнал Лаборатория. - 2012. - №3. - С. 26-27.

16. Щеглов B.C. Выявление токсина Clostridium difficile у пациентов, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника / B.C. Щеглов, Е.А. Оришак // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2012. -№4. -С. М45.

17. Щеглов B.C. Эффективность этиологической расшифровки кишечных инфекций на фоне дисбиозов с использованием полиме-разной цепной реакции / B.C. Щеглов, Е.А. Оришак, O.A. Хмелева // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15. - №2. - С. 143.

18. Щеглов B.C. Резистентность лактобактерий - полезное свойство или опасность? / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов, Л.Ю. Нилова // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т15. -№2. - С. 110.

19. Щеглов B.C. Обоснование расширения спектра выявляемых микроорганизмов при исследовании на дисбиоз кишечника / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов, А.Г. Бойцов // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т.15. - №3. - С. 18-21.

20. Щеглов B.C. Пробиотикотерапия и антибиотикорези-стентность / Е.А. Оришак, B.C. Щеглов, Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов // Научное обозрение. - 2013. - №9. - С. 431-441.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБП - антибактериальные препараты

ОКИ - острые кишечные инфекции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

УПЭ - условно-патогенные энтеробактерии

ЛР № 020496

Подписано в печать 25.11.2013 г. Заказ № 249 Формат бумаги 60 х 84/16. Тираж 100 экз. Усл.п.л. 1,0. Северо-Западный государственный медицинский университет

_им. И.И. Мечникова_

Типография ООО «ЛАДОГА», Санкт-Петербург, Выборгская наб., д. 29

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Щеглов, Владимир Сергеевич, Санкт-Петербург

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Северо-Западный государственный медицинский университет

им. И.И. Мечникова

04201452312 Правах рукописи

Щеглов Владимир Сергеевич

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор А.Г. Бойцов

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................4

ГЛАВА 1 ДИСБИОЗЫ И КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ...............................12

1.1 Роль кишечных инфекций в развитии дисбиоза..............................12

1.2 Роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии и поддержании дисбиоза кишечника. Условно-патогенные микроорганизмы как этиологический фактор острых кишечных инфекций...........................17

1.3 Диагностика острых кишечных инфекций в РФ.............................22

1.4 Проблемы коррекции дисбиотических состояний. Пробиотикотерапия и антибиотикорезистентность............................................................................24

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................31

2.1 Объем исследований...............................................................31

2.2 Питательные среды................................................................33

2.3 Методы микробиологических исследований..................................33

2.4 Статистическая обработка результатов..................................................39

ГЛАВА 3 ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ЛИЦ, ОБСЛЕДУЕМЫХ ПО ПОВОДУ ДИСБИОЗА КИШЕЧНИКА.............40

3.1 Выявление возбудителей кишечных инфекций бактериальной этиологии у лиц, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника.......................40

3.1.1 Выделение диареегенных эшерихий в ходе бактериологического исследования на дисбиоз кишечника....................................................40

3.1.2 Выделение иерсиний в ходе бактериологического исследования на дисбиоз кишечника......................................................................44

3.1.3 Выделение сальмонелл в ходе бактериологического исследования на дисбиоз кишечника.........................................................................46

3.2 Изменения микробиоценоза кишечника при ротавирусной инфекции..47

3.3 Расширенное исследование на дисбиоз кишечника и кишечные инфекции.......................................................................................................................48

3.4 Выявление токсина Clostridium difficile у пациентов, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника..........................................................51

ГЛАВА 4 АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ И ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА ДИСБИОЗ КИШЕЧНИКА.............................................................54

4.1 Антибиотикорезистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при исследовании на дисбиоз кишечика. Фенотипическое выявление ферментов антибиотикорезистентности....................................54

4.2 Антибиотикорезистентность патогенных энтеробактерий.................60

4.3 Сравнительная оценка антибиотикорезистентности условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, выделенных от одного пациента при исследовании на дисбиоз кишечника...................................................65

ГЛАВА 5 АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА И МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.......................................................69

5.1 Антибиотикорезистентность лактобактерий, выделенных от людей и лакто- и бифидобактерий, используемых при производстве пробиотических препаратов..................................................................................70

5.2 Антибиотикорезистентность энтерококков, выделенных от людей, и штаммов энтерококков, используемых при производстве пробиотических препаратов..................................................................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................90

ВЫВОДЫ:...................................................................................96

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:.................................................98

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ........................98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................100

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА..................................118

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Заболевания, протекающие с синдромом диареи, продолжают оставаться актуальной проблемой в Российской Федерации. Частота эпизодов диареи у грудных детей колеблется от одного до трех в течение первого года жизни. В зависимости от степени нарушения самочувствия, тяжести диспепсического синдрома и данных анамнеза эти эпизоды расцениваются по-разному: часто как транзиторная ферментативная недостаточность либо дисбиоз, реже как инфекционная диарея (Гончар Н.В., и соавт. 2009).

Как первичное состояние дисбиоз, как правило, встречается только у детей до года при нарушении формирования кишечного микробиоценоза. Однако дисбиоз кишечника может маскировать острые кишечные инфекции (ОКИ), усиливаясь или появляясь на их фоне. В ходе исследования на дисбиоз кишечника иногда диагностируются кишечные инфекции, возбудители которых влекут изменения в составе микробиоты. При отсутствии расширенного микробиологического исследования терапия может быть безуспешной. Но при классическом бактериологическом исследовании на дисбиоз кишечника, без целенаправленного выявления прочих возможных возбудителей ОКИ -кампилобактеров, вирусов, простейших - патогенные микроорганизмы обнаруживаются у ничтожно малого количества пациентов. В последние годы вирусные агенты занимают ведущее место среди этиологических факторов острых кишечных инфекций у детей во всем мире (Горелов A.B., 2004). Доля бактериальных кишечных инфекций значительно снизилась и составляет 710%. Увеличилось число микст-инфекций (вирусно-бактериальных) до 15 -17% (Горелов A.B. и соавт., 2005). Вклад возбудителей вирусной этиологии в общую структуру кишечных инфекций детей раннего возраста составляет 57,9% (ротавирусы - 35%, норовирусы - 16,7%, астровирусы - 6,2%) (Боднев С.А. и соавт., 2010).

По данным ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора структура заболеваемости ОКИ в РФ за 2012 г. выглядела следующим образом: сальмо-неллез - 6,5%, шигелез-1,8%, другие острые кишечные инфекции установленной этиологии - 27,4%, кишечные инфекции неустановленной этиологии -64,3% (Сведения об инфекционных заболеваниях, 2012).

Возможность использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) для установления этиологической структуры ОКИ существенно увеличивает процент расшифровки. ПЦР для диагностики вирусных инфекций имеет ряд таких преимуществ перед другими методами диагностики (культуральным и серологическим), как универсальность методики для широкого спектра возбудителей, высокая чувствительность и специфичность, невысокая себестоимость. Разработанные системы для обнаружения кампилобактеров и иерси-ний также упрощают процесс диагностики инфекций, вызванных трудно-культивируемыми микроорганизмами, и позволяют своевременно начать антибактериальную терапию. Учитывая высокий уровень распространения острых кишечных инфекций у детей, данная возрастная группа особенно нуждается в комплексном микробиологическом обследовании с поиском наиболее вероятных возбудителей кишечных инфекций и оценкой микробиоценоза кишечника.

Проблемой заслуживающей особого внимания является антибиотико-резистентность микроорганизмов, используемых в составе пробиотических препаратов. Применение полирезистентных штаммов может способствовать распространению антибиотикорезистентности среди индигенных микроорганизмов кишечного биоценоза, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, попадающих в кишечный биотоп. Так, лактобактерии, выделяемые от детей грудного возраста, имеют от 8 до 15 маркеров резистентности (Николаева И.В. и соавт., 2010). Все чаще появляется информация о плазмидной природе устойчивости лактобактерий к антибиотикам (Gueimonde М. et al., 2006; Huys G. et al., 2006; Masco L. et al., 2006; Saarela M. et al., 2007). Учитывая важность данной проблемы, необходимо изучение антибиотикорези-

стентности пробиотических штаммов, индигенных микроорганизмов кишечного биоценоза, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий для сопоставления спектров их резистентности и определения возможных рисков от использования препаратов, в отношении которых широко распространена устойчивость.

Степень разработанности темы исследования

Большинство работ, посвященных дисбиозам кишечника, касаются изучения количественно-качественного состава микробиоценоза кишечника, наличию условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и их ассоциаций (За-харенко С.М. и соавт., 2006; Катаева JI.B. и соавт., 2010). Данный подход к изучению регламентируется соответствующим отраслевым стандартом. При этом недооценена роль возбудителей ОКИ как бактериальной, так и вирусной этиологии, наличие которых влечет за собой дисбиотические изменения.

Так, в соответствии с требованиями ОСТ 91500.11.0004-2003, необходимо выделять 16 групп микроорганизмов, в перечень которых не входят вирусные возбудители и труднокультивируемые патогены (Campylobacter spp., Y.enterocolitica). Нельзя не отметить, что классическое бактериологическое исследование на дисбиоз не в полной мере отвечает современным потребностям клинической медицины и существующим возможностям диагностики. В связи с этим, необходима разработка алгоритма исследования на дисбиоз кишечника с формированием перечня выявляемых патогенов как бактериальной, так и вирусной этиологии.

Цель исследования: с помощью современных методов (ПЦР, иммуно-хроматография) определить частоту обнаружения вирусов и бактерий - этиологических агентов диарейного синдрома у детей, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника, для оптимизации выбора средств противомикробной терапии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций у детей, обследованных на дисбиоз кишечника бактериологическим методом, сопоставить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций с помощью ПЦР и классического бактериологического метода и оценить целесообразность включения генной диагностики в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.

2. Оценить частоту выявления токсинов Clostridium difficile у детей, обследуемых на дисбиоз кишечника, и необходимость включения иммуно-хроматографического метода в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.

3. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам возбудителей кишечных инфекций и условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника.

4. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам индигенных представителей микробиоценоза кишечника и пробиотических штаммов.

Научная новизна:

1. Определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций при проведении классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника и ПЦР, разработан алгоритм комплексного исследования, направленный на улучшение качества микробиологической диагностики кишечных инфекций в ходе исследования на дисбиоз кишечника.

2. Впервые на основании большой выборки определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций в результате проведения классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника (8174 исследований).

3. У детей, обследующихся по поводу дисбиоза кишечника, впервые определена частота обнаружения токсина Clostridium difficile методом имму-нохроматографии.

4. Впервые сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам пробиотических штаммов и микроорганизмов кишечного биотопа, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника.

Теоретическая и практическая значимость работы:

1. Предложен комплексный подход к диагностике дисбиоза кишечника, основанный на применении молекулярно-генетического и бактериологического методов исследования. Показана необходимость при проведении данного исследования целенаправленного поиска наиболее часто встречающихся возбудителей кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии. Получено удостоверение на рационализаторское предложение № 1857, принятое ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 24.06.2011г. к использованию под наименованием «Уточнение диагностики дисбактериоза кишечника».

2. Сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам микроорганизмов кишечного биоценоза и возбудителей кишечных инфекций, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника, являющейся важной информацией для дальнейшего изучения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа.

3. Данные о минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных препаратов для лакто- и бифидобактерий являются важной информацией для проведения дальнейших исследований с целью выяснения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа и разработки критериев безопасности пробиотических штаммов.

Внедрение материалов диссертационного исследования

Материалы диссертационного исследования внедрены в работу бактериологической лаборатории Госпиталя ветеранов войн и бактериологическую лабораторию ЗАО «СИТИЛАБ» (Приложение 1, 2).

Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный курс кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и курс практических занятий медицинского факультета СПбГУ (Приложение 3, 4).

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного многоцентрового проспективного исследования с использованием бактериологических, молекулярно-генетических, аналитических, статистических методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение комплексного подхода к исследованию на дисбиоз кишечника с использованием полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей кишечных инфекций повышает расшифровку причин дисбио-тических состояний.

2. Выявление токсинов С.сИШсИе в рамках комплексного исследования на дисбиоз кишечника целесообразно.

3. Среди штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробакте-рий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника, выявляются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Имеет место множественная лекарственная устойчивость лактобак-терий, входящих в состав пробиотических препаратов и лактобактерий кишечного микробиоценоза.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности полученных результатов проведённых исследований определяется достаточным и репрезентативным объёмом выборок исследований и обследованных пациентов с использованием современных методов исследования. Статистическая обработка полученных результатов осуществлена методами параметрической и непараметрической статистики с использованием компьютерных программ Excel. Достоверность различий определяли, рассчитывая Хи квадрат при р<0,05 и ошибку доли. Методы статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам. Сформулированные в диссертации выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа значительного объёма выборок обследованных пациентов и результатов выполненных исследований. Достоверность работы подтверждается публикацией её результатов в рецензируемых научных изданиях. По материалам диссертационного исследования опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на отчетных научно-практических конференциях сотрудников и молодых ученых СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2010, 2011), на Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микробиологии и клинической микологии с международным участием «XV Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 27 - 28 июня 2012г.) и «XVI Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 19-21 июня 2013 г.) и Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID-2013, Берлин, 27-30 апреля 2013 г.).

Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры медицинской микробиологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, протокол № 12/13 от «31» октября 2013 г.; на заседании научной

проблемной комиссии «Эпидемиология, профилактика, диагностика и лечение инфекционных (бактериальных, вирусных, микотических, паразитарных и связанных с оказанием медицинской помощи) и некоторых неинфекционных заболеваний» ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, протокол № 3 от 12.11.13.

Личное участие автора в получении результатов исследования

Автором обоснованы цель, задачи и схемы исследования, осуществлены сбор и анализ литературных источников. Выполнены основные микробиологичес�