Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комбинированное действие мутагенов на вирус гриппа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Комбинированное действие мутагенов на вирус гриппа"

шнштшзтю адршэохрмшш вазаязш оор ндучш-йоолвдовАтгльсго® институт зщдшагюгаи,

мййроешшгий и ш£екцконвьк шлеш2л

Нз правах рукошзя уда В70.8басш.б

АДЦУКАРНЮВА Дадьшр Алишашппа КШШОШРОВАЙВЖ ДШЮТЕЯЗ ШТАГЕГОВ НА ШРУО ГРИППА 03. Ой 05 -Вирусанлта

АВТОРЕФЕРАТ jpccspraiosí in (хй:скше!э уташа отзшня кандидата Стгспгчзскшг пзуг;

Алма-Ата - 1091 г.

Работа шшякэка в Гжпщрт микробиокогак е шруосшэгйн АН КазСОР

Научный руководитель - чгвЕ-корроспсвадэнт АН КавСОР, дбн

a В. Ахштумиш Офщиашию огашшггы - доктор шдвдивоккх ваук, профессор

Г.Д.ааоухиЕа - кандидат бйохогнчзоких наук IIX Цуиэтов

Вэдущзз учрэадэшш - Инатитуг вирувохопш ш. Д й. Еганожяшго

АШ ОООР

Эащята диссертации состоится "_"_1991 года

в и_" теш т BscQiamro Стщштвщювашюго совета

ДСТО. 06.01 в ШШ 8шздэ1шсшзпш, ыикрсбисшэгки и ккфокциошил: боаешей Шннотерства вдракхяраяэнЕЯ Каеагской OOF (АЮОСЕ, г.Алш-Ата,ухН.1£зкатавва,34)

О диссертацией юшо оБвакоштъся в библиотеке НИИ адждешго-логвз.шифобйаЕогю! и лекционных башеной Шттърсева здравоохранения Казахской ООР.г. Алма-Ата.

Автореферат рашеяан "_" _1991 г.

Ушный секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

ЕМ.Нур1сина

-1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Повышенный инторео к аффектам ксмбини-уваниьд воздействий рааличныг генетически авачишх факторов в юстоящэе время овяаан о настоятельной необходимостью оценки nocís действия вовраотащэго уровня вагрявнений окруяавдэй природвой зреды. В нестоящее время о» только радиация, но многие химические »гряваения отавовятоя постоянными компонентами Оиооферы .и дасут в жбэ опасность аоадзйствия на генетические аппарат человека, т-юткых и растений, а такав микроорганизмов и вирусов, циркулирующих а природе.

Ивучение модификации мутагенеза, даиэОвиной при коыОккирован-шх или комплексных вовдействкях различных факторов, расшифровка ее икоаомерностей и механивдое долины вестись на тестерных системах, вшэдщкх либо специализированные объекты, либо оочэтание факторов ) иввэотнш ыехаяиамси действия. В этой откозшши шрокоа приввавие еяхи тестерныэ микроорганизмы (калриыэр,системы Эймза), на которьос юпьггывагггса оочзташа раянообраягод факторов среды. При этом предусмотрены варианту вкпшрншмтоз на этих бактериях, воаволяюодга в ире деленной степени экстраполировать их результаты па аукариоти-юские клетки. Однако нет никаких сведений о поведении вирусов в пакет ситуадкяг. Данные, тлучздаыэ в стггэмаг о другим уровнем гэ-ютачэокой и функциональной организации вэ могут быть перенесены ю «русы пршю. Доллаен быть тщательный самостоятельный анализ. Это аэ гребование отаэснггоя к воемоиюыу спшулирувдвыу репродукцию ви-)уоов аффекту.

Цель и задачи исследования. Цель» вастоядей работы было иву- ' вниз закономерностей мутагевэва вируса и эффектов различных комби-

- г -

наций химических мутагенов и УФ на вирус гриппа. В этой связи необ ходимо бьцо решить следующие задачи:

1. Сравнительный анализ действия различных концентраций химических мутагенов и УФ на репродукцию и изменчивость вирусов.

г. Иаучэние зависимости эффективности действия мутагенов от условий обработки вируса (температуры, рН, продолжительности экспозиции) и физиологического оостояния вируса в момент воздействия.

3. Ивучэние влияния малых дэо химических мутагенов на репродукцию вируса гриппа.

4. Ивучэние вакономерноатей комбинированного действия химических мутагенов и УФ на репродукции н изменчивость вируса.

Научная новизна:

- Впэрвыэ проведены специальные исследования вакономервоотей мутагенеза вирусов гриппа с анализом действия факторов различного цеханивма действия.

- Пэлучэны докавательотва, что в малых возах химические мутагены стимулируют репродукцию ортошксовирусов (Авт. свид.

N 106120В )

- Выявлены оптимальные условия модификации мутагенеза виру-'сов путем предварительной их обработки малши доваш гомологичных и гетерологичных мутагенов. ГЬкавано, что маханием втой модификации связан как с активацией вирионных ферментов, так и репаратив-ных систем 1иетки хозяйка.

Практическая значимость. Стимулирующая способность малых доз мутагенных факторов может найти приложение в ооедании способа ускоренного получэния большой биомассы вирусов и повышении ввделяе-мости вируса ив организма человека и животных. Креме, того стиму-

- а -

ляция рашюлания вируса в органишэ под влиянием сходных факторов окрувавдрй ореды оседает условна интенсификации распространения как в шшдеиичэский, так и ыздагшдешчвский шриод. Это сбо-гоятельотво должно учитываться при оценка гашдэииавогичэскоа и эпиюотсиюгичвсксй онтуаций в вхологнчэски неблагоприятных регионах или предприятиях.

Основные полаавния, вывзоише на еадату?

1. Сравнительная оценка генетшдаскоа вффективгюотн в алкши-та ооединений м кг сочетаний о У&-дучами на вирус гриппа.

2. Результаты аиалква дреоаоа вависшэоти биолотшвского действия ряда химических мутагенных факторов.

а Достоверные данные о воамшшости ксоольаоваиия иалых доа ошичэаких ыутагевоа для стимуляции репродукции, а таю» шдафи-садки мутационного цроцзоса у вирусов.

Апробация. Штериалы диссертационной работы дашэпы на Всего-ваом съезде гетнвнисггов.впидажо^оа.иифсбшзлсгоа и нвфэкщю-зютов (Алма-Ата, 1080), 1 конференции вирусологов Швахтет. Алш-Ата, 1882), Вэоооюаои оозеааниях по хишчзокому цутогенэ-у(УоскЕа,108Э-19ет, 1089), Мвядународааы сшэда "!фтагены скру-ахезэа среда" (Швеция, 1385), Х1У Мэддутародаом контрах» шяфойи-лотов (Англия. 1085), X Конгресса Венгерского сС58еотва шгкрсбда-огов (Венгрия, 1637), Республиканской конфереашш В0ГИ0 (Ал-а-Ата, 1086, 1000), Заседании оекшш гевдтвдао&а аспектов прой-вш**Чаловек и биоофера" (Киев, 1988), Обьединешюы еаоедании вирусологических оекция Ученого совета Йотитута микробиологии и виру-злогии АН КааССР и НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекциоя-ьа ОагэшюП Ш КавССР (Алш-Ата, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, получено авторское свидетельство 'Способ вырещиваниия орто-ыиксовирусов" N1061 ав.

Обьем диссертации и ее структура Диссертация оостоит ив введения» оОэора литературы, 1 глав, ваключэния, выводов и укааателя литературы. Диссертация наложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 0 рисунков. Спиоок литературы вклп-чзот 190 иавваний.

СОДЕРЕАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Вирусы. В экспериментах испольвовад вирус истинной чу*ы птиц (ВЧЦ), штамм Вейбрида. Антигенная формула Н7Н7. Вирус активно рваикоязета куриных эмбрионах (1* ЗИЛ 60/0,1 - 9,0) н культуре клеток куриных фибробластов (БОЕ/ыл - 8,0). ГЬд агаром образует крупное просечные бляшки диаметрои 4-Б ми. йгрус накапливали паооированиеи в 10-дневных раавиваидосся куриных вибрионах. йспольеовали вируосо-дертащую аллантоисную жидкость с инфекционньм титром 7,0-9,0 1ц ЭИД 60/0,1 и титром геыагглхтгинации 1:612 - 1:1024. Клетки. В работе нсоольвовали 9-10 дневные куриные вибрионы, культуру клеток куриных фибробластов, культуру клеток Нэр2. уутагены. Хюорюсюю мутагены: димэтнлсульфат (ДЮ). диэпиоульфвт (ДЭС), Н-нитроао-Н-ыепшючэвина (НШО, Н-нитроео-№-атилшч9Вина (ЮН), иитровогуакидин (НГ), 1,4-био-диавоацетилбутан (ДАБ), 4-нитрохиводкн-оксид (4-ЮОО), получэны с Институте химической фишки АН 000Р.

- в -

У®-лучи, йсточникоы УФ-обдучения служила хеша БУВ-15. Ейрусую суспензию облучали в Штря при постоянней помешивании в тсутотвии прямого освещения.

Определение инфекционной н геыагглютинирующэЯ активности. Го-огмлм десятикратные раввздекия вируса в раствора Хвикоа и вводили о 0,1 ш каждого разведения в адлантоиснув полость куриных зибра-цоа. Инкубировали 24 чаоа пргг 37.° Мнфэкщгонныэ титры рассчитывала о методу КерОера в описании И. П. Адаарина (1062) и выражали в 5 в ВД 50. Геыагглипширующую активность определяли по общепринятому этоду.

Расчет индекса эффективности. Индекс эффективности определяли э формуле а - 1ка - 1еЬ, гдо а - ИЗ, а -ЗИЛ 50/0,1 опытного виру-а, Ь - ЭНД 03/0,1 контрольного вируса. Индекс эффективности ващя-и рассчитывали по отношению к инфэкционности вируса, обработаню-о большими доваыи мутагенов.

Определение ОляшкооОравувдэА активности. Готовили ряд деся-Шфатньа рааведений вируса в среде 109 и 0,5 ид каэдого равввде-т вараяали культуры куриных фибробластов. Чаров 30 иин. адсорСщы ри коын-Ь* клетки валивали поддерхиваппеЯ средой. Инкубировали при 7 в течэние Э-5 суток. Титр вируса выражали в БОЕ/мл.

Ралучэкие 5~«утантов. Вирус. обравуший в культуре однородные ляики диаметром 3-4 мы, обрабатывали соответстауюедши концентра-ияыи испытуемых (мутагенов и варагши культуру по 20-40 ВОЕ/кл. нкубировали при 37 "под агаровым покрытием по Портерфидьду (1960). се мелкие бляшки вместе со столбиком агара под ними откалывали и ере носили в 1мл среды 1№, оставляли в холодильнике на 24 часа, атем гарахали новую партию клеток, процедуру повторяли трижды. За -мутанты принимали вирус, обравуквдий бляшки рашэроц 1,6 мы и эньше.

Получение ^-мутантов. НэсОработанными и обработанными соот-вэтствуп® 1 лш концентрациями испытуемых химических мутагенов круп-вобляшечкыми клонами вируса варакали ионослой и инкубировали под агаровыы покрытием 2 суток при 37°, затем обводили края всех видимых бляшек и культуру переносили на 40°. Черев 2 суток столбик агара с каждой бляшкой, не увеличившей размера при переносе на 40е отбирали в пробирку с 1 мл среды 199 и оставляли в холодильнике на сутки. Процедуру такого еарадения повторяли дважды о использованием материала соответствующих серий отобранных бляшек. Для определения среди них 1з-мутантов каждый клон научали на репродуцируе-мость при пермиссивной и непермкссивкой температуре.

Щзлочная ааюция ДНК с мембранных фильтров выполнялась согласно метода Кона о небольшой модификацией, которая заключалась в использовании МэОН и уменьшении времени алюции. Проведете элюцик описано в работе Форнаса. £ибробласты в лог-фата роста метили й-тшд1дкном (1 мкКи/мл) в течение 24 ч., обрабатывали мутагеном. Клэтки собирали на иеыбрешныэ фильтры, промывали холодный раствором Бэрсена и лишровали 5 мл раствора: 0,2 даурил сарксгзш1ат, 211 МаС1 , О.ОЕЫ На2ЭДТА (рН 10,2). Затем фильтра промывали 3 мл 0,02 И На2ЭДГА (рН 10,2) и влшровали раотворои 0,1Н НаОН и 0.01Н На2ЭДТА (рН 12,7) в течение 2 ч при скорости влкции 0,3 мл/мин в темноте. Четыре ЗЭ-шгаутиыэ фракщш собирали в пробирки, добавляли бычий сывороточный альбумин (2ыг/ил) и ТХУ до концентрации 5% и осаждали на фильтрах Сынпор (ЧЗСР, 0,40 мкм). ДНЕ, оставшуюся на фильтре после эдхвдш промывали Б* раствором ТХУ и 70% атанодоа Относительную радиоактивность каждой аяшрованной фракции вычисляли по формуле К - (Р0 -¿Р9)-Р . где Р„- радиоактивность всех алюиро-вашмх фракций плюс радиоактивность, оставшаяся на фильтре после элюции , Р^, - радиоактивность каждой фракции.

- ? -

Результаты экспериментов подвергались статистической обработка. Вычисление доверительных интервалов проводили по Отыоденту-

. Некоторые вакоиоыервооти действия У&-дучэй и химических мутатаюа ка оргоыиксовируса Анализ закономерности действия мутагешэв начат со сравнитвль-юго изучения кинетики инактивации вируса. Уровень ингибгщии рэгшо-внмя вирусов соответствовал степени тасончности гюпытувыых ссадавэ-iíñ (pite. 1). По мшу крггтерет цшгСолое еффэжпшншн были вфяри серых и оульфовошх кислот (ДИЗ.ДЭО), наименее - представитель дишхеш-онов (ДАБ). Шггровомутагвны (НГ.НМЫ.КЗУ) ванишли прешеауточвоэ да-

ОЕ8КИО.

йигоэру.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ H ИХ ОВСУЩЩЯКЕ

А

S

в

* .

1 i - Ц_I—i_I_1 .1.

oTarTisist

retís* s é г i i t а п н и к W

(Лнцентрации мутагенов, мг/мл

AMC___АЗС ___НИМ —ААЬ__НЭМ

г ist ю п и и к W1Ö9 Wo $5о

i-1-1-1-1-1_I_I_L. Lu_I_I I „ I

9W .

doja УФЛ, hsm 4

îc. 1. Летальные эффект различных (сонцеитраций химических мутагенов и УФЛ на вирус чумы птиц,,

Сравнительную оценку генетической эффективности проводили на основе анализа результатов действия вквитоксических доэ мутагенов, оО&с вочивапцих БОХ выживаемости. Контролен служи фон спонтанных мутаций (0,001) в модельной популяции, рассчитанный при анализе 10000 блягак в температуросшняэмом эксперименте. Мутагены вначительно повивали частоту ts-иутаций, но отличались макду собой по степени вффектнвиоо ш Наибольшее количество мутантов (7.БХ) выделено у вирусов, обработанных 300 дя/иУФ. Спонтанный фон От повышен в оотни ров niai воздействии НГ и ДЫО н в десятки - ДЗО. НШ. ВЭН и ДАВ (табл. 1).

Таблица 1. Частота ts-цутаций вируса чумы птиц, индуцированных 81Свитокоичзскиш десама иутагоюа

Цутаген Козщентрация Общее каг-во Количество Опювоиие к cô-

мут-на,мг/мл бляшк мутантов врму числу блявок, 1

m 0,04 1000 12 1.2

дао 2,6 1200 4 0,33

нm 5 426 3 0,8

mu 12 853 б 0,6

ДАВ 10 1630 6 0,36

нг в 698 11 1.6

У<& 300 да/и 150 12 7.6

боа обработки 10000 3 0,03

Следовательно, по эффективности индуцировать миссено-ыутащш У®-лучи превосходят основные алкилирупаиэ мутагены. Механизм мутагенного действия УФ на РНК-геном пока неясен. Из гюлучэнные в дая-»ой работе результаты укаоывают на высокую чувствительность и ип-

Зиратедыюоть его действия.

Опыт изучения эффективности мутагенных воздействий на различал системах показал ее зависимость от ряда условий, как фиаюло-гочэское состояние генома, режим обработки, способы селекции и др. Специальные исследования этих вопросов на вирусах не проводились. 3 ранних работах Г. Д. Засухиной (1971) указывалось на возможность шдукции мутаций у вирусов лошадиных энцефалитов при воздействии © внутриклеточный вирус, а ааГендон (1967) - при воадействии на «золированную шз вируса РНК. Нам удалось показать определенные фэимущества воздействия мутагенами на гомогенат 8араженшх кле-гок, получанных в ранние стадии репродукции вируса ( 2часа посла заражения). У оргоыиксовирусов о негативный геномом только такой фепарат мог содержать функционально активный геном. Он соответст-¡ует также состоянию внутриклеточного вируса, цикл репродукции которого прерывается в строго определенный период. Частота s- и .s-иутациЯ заметно выше при атом способе воздействия. Более эффективными оказались 0,8-5 мг/мл ДАВ и 0,5-0,9 иг/им НМЫ. Огш выаыва-ш до 8CJX s—мутаций и до б, ОХ ts-мутаций.

Изучение довоюй вависимости мутагенного эффекта на вирусах осавало на необходимость учета специфики сохранения и рашнодшшя трусов. Так, увеличение экспозиции с вирусом одинаковых конценг-иций мутагена приводило к повышению частоты s~- и ts-мутаций. Н" ш происходило на фоне резкого снижения выяиваемости вируса табл. 2).

Надо полагать, что вирусы более чувствительны к мутагенам i при больших акспоеициях о ними погибают, увеличивая тем оа-¡ш хастоту мутадий ореди палого числа выбивших. Причиной сни-гония выживаемости могут о лудить как необратимая денатурация

Таблица 2. Влитию продолжительности экоповиции на частоту а"- и ^-мутаций вируса чумы птиц.

Цутаген Время Кол-во Частота Кол-во Частот

акспо- БОЕ/ ивучеа ¿"-мута- бляшек, га-ыут-

вкции, ил бляшек ций. X не уве- цийД

чао. личив, размер _ПРИ 401 | 1 ,

нш 1 2.010Л 453 111 342 75 6 1.3

2 1,8'Ю1 226 30 196 86 Б 2.3

4 2,ЗЮ2 67 23 34 89 1 1.7

ДАБ 1 8,4-Ю8 663 362 301 45 3 0,4

2 1.4-107 542 164 378 69 6 1.1

4 6,0-107 609 355 154 50 4 0,7

вирусных белков при длительном контакта с мутагеном, так и формирование множества летальных иутаций, ш поддающихся регистрации.

Исходя ив этих обстоятельств, при выборе оптимальны* доз для индукции б- и ^-мутаций, мы сочли цэлесообравным сочетание умеренных концентраций мутагена с короткой с ним экспооицией. Это ваключение согласуется такта о результатами влияния на эффективность мутагенеза рН и 1! Дело в том, что удлинение экспозиции с мутагеном ведет к подкислвнив среды, которое скавдва-отоя отрицательно на жизнеспособности вируса. Значение рН, близкое к нейтральному, сохраняться в течение 1 часа присутствия мутагена в инкубационной среде, является оптимальным как в

яшешш эффективности мутагенов, так и ¡яюнедоятелыюоти ви-гоов. Такое положений складывается и о температурным режимом. & ташде (4®), т.е. в условиях, благоприятных для. сохранения шоспособности вируса, ваш длена его реакция о мутагеном, а $1 37°ускоряется распад мутагена. Поэтому эа оптимальный тем-(ратурный реши принимается комнатная температура (2С?-2б). При 1Коы режиме ¡значите лью выше частота 1з-мутаций (рис.2).

0.2. Влияние температуры воздействия на мутагенез вируса чумы птиц.

Такиы образом, изучение вавнишости эффективности мутаген-х факторов от условий воздействия на вирусы, выявило ряд ооо-нностей. Существенным ся^авалооь физиологическое состояние тема в момент воздейотвия мутагеном. А такие факторы как , время эксповиции на могут подлежать широким вариациям а си-особенности «ивнедоятельности вирусов.,

2. Стимуляция репродукции оргомиксовируоов в клетке под влиянием малых доа химических мутагенов.

С учетом известной закономерности вависимости эффекта от дозы мутагена анализировано действие шрокого диапазона оуйцу-гагенных доа При атом ва малые приняты доги а сотни раа меньшие мутагенных для оргомиксовируоов.

Первичная оценка влияния мутагенов на репродуцируемоотъ вирусов производилась по изменешш величины урожая вируса, ояро делаемой по инфекционное?™ для куриных эмбрионов или Оляшксоб-раэованию в клеточных культурах.

Повышение кнфокциокности ортомиксовируоов получено под влиянием малых доз всех испытанных мутагенов. Наиболее аффективными оказались ДАВ и 1ОД, которые в концентрациях 20-30 жг/мл и 40-50 мкг/мл соответственно повысили инфекционность вирусов от 100 до ООО раа На культуре клеток обиаруяены те хэ ваконо-мерности действия малых доа мутагенов (табл.3).

Как видаю ив таблицы 3, СляшкооОравувдая способность вирусов, обработанных малыми дозами ДАВ и НЭИ, во много раа выш ВОЕ контрольного, не обработанного вируса Наибольшую величину (133 и 15В раз соответственно) они достигают при воздействии 20-40 мкг/мл мутагенов, эффективность малых доз НШ минимальна, превышение контроля не более 20 раа Тем не менее вален сам факт проявления стимулирувдэго репродукцию вирусов эффекта испытанными мутагенами. Он существенно дополняет сведения, имеющиеся по активации роста и равмножэния растений и микроорганизмов.

Сравнительный анализ эффективности способов воздействия малыми дозами мутагенов на клетки ДО заражения и выращивании вируса при постоянном присутствии их © среде культивирования выя-

- 13 -

а Влияняэ шш доз «шичэскюг ыутагешз ва репродукции вируса ¡шщ в культуре куриных вйОровжаегоэ

(СК0Ш8ЯЦИЯ а 420.).

Е^ггагеа йоицэ*?грацил, Наф&чцйовиость, 1е В02/Ш Кратность

ис/цл контроль опыт гозшэшя

воЕ/ия

ДАВ

га

40

го го ю

0,4 4 0,7

0.7 * 0.4 9,2*0,3 10,4 4 0,5 10,2 4 0,4 9.4 4 0,4

18.7

70.8 133,3

92.9 13.3

взгI

ш

30 20 10

8.4 1 0,4

8,8 4 0,6 10.4 4 0,8 10,6 1 0,6 10.6 *СХ4 9,6 4 0,4

3,0

121,7

1(35,0

Ш.О

14,0

Ш£|

ВО 40 30 20 10

8,В * 0.4

8,8 1 0.4 8,8 4 0.3 9,2 - О,Б 9,81 0,4 9,4 * 0,3

1.8 2,0 6,6 22,1 9,0

ли ряд ваконсмэ рносто Й (рно. 3). Обращает прежде воего внимание Ъхьаяя эффективност ь второго способа. В диапазона иоследовая-тх доз кривая стимуляции у НЭМ сохраняет тенденции к дальней-

оды(—) нэц(-г-) дав (-•-)

Рш.а Зффэктывнооть действия далых дав мутагенов на рещш»- . жата вируса чумн втиц в культурах клеток, обработанных до заражения щгахшоц (А) и в условиях присутствия их в оредэ (В).

вшу пйдьеыу, а у ДАВ выходит на плата Лишь у НШ индекс вф-фэютвнооти о возрастанием концентрации идет на убыль. Наиболь-Еио покаватели еффективности (ИЗ 2,0) отмечаются при выращивание вирусов в присутствии 20 ыкг/цл НЭЫ и ДАЕ

Таким образом, получено доказательство отимудирупдэго дэйо-пш «алых доз мутагенов на вирус гриппа, что укашвает на универсальность стимулирущэго аффекта малых доз химичэоких мутагенов на живых органившх различной ступени организации.

; Для йрактичеокого применения иозш рекомендовать способ вредейотвия малыми дозами мутагаюв на вирус вне клетки.

- 15 -

а Модификация мутационного процесса у вирусов.

Ка современном этапе иаучэния кутагеноеа нельзя ограничиваться анализом закономерности действия единичных мутагенных Факторов. Большую актуальность приобретает комбинированные эффекты. Возрастающий уровень загрязнений окружаюодэй среда различными генотсксикантами требует аналиаа влияния их на природные популяции вирусов и связи этого процесса о ростом вирусных инфекций в целом. Для моделирования возможных сочетаний мы изучили вляние на тастоту s- и ts- мутаций раагачных номинаций 4ивич0ских и химических мутагенов о известными иеханивмаки действия.

Оценка аффекта комбинации проившдилась по двум критериям: влиянию малых доз некоторых мутагенов па летальное и мутагенное действия больших доз тех яэ или других факторов. Обнарулэн четкий Еащитный аффект малых доз химических мутагенов от летальных поз гомологичных и гетерологичных факторов, включая УФ-лучи. Различия касались лгал» величины эффективности еаадга Наиболее зффективными оказались малью дозы НШ1 и ДАВ. Более того отмэчэ-ш строгая зависимость от величины легальной дозы. В иаучэшш штимутагенного действия использованы аквитоксические дозы« где а шлые приняты 0,1 ыИ/ид, а оа большие 20, 50-„ 80 lä!/m EMU, 1АВ, ЮН соответствен!». Обнаружено, что предобработка малыш рвами суадэственно сникает количество мелких бляшк в погадал» трусов, обработанных эквитоксичэсгаши доэами НШ1. ШМ, и ДАВ. )то рассматривается нами как розультат вмешательства в иутаци-1нный процесс малых дм мутагенных факторов. Протекторный вф-ект малых доз еда более выражен в отношении индуцированных Ф-мутантов (табл.4).

Та&гаца 4. Чаотота s- в ts-мутацвй щи действии на вирус гриппа раахичнух коибикаций ыутагваоа

Условия обработки Частота S- Частота ts-

цугаций.Х мутацийД

УФЯЮда/ы* 75 7,6

УФ 2QQ Щ/и1 m 13,8

ОД И11ШШ +

ЭШ да/ы1 УФ и M

од мы дав +

300 да/м4 УФ 12 1.7

Наибольший еедегньй вффект щхтивтоя при предварительной обработке ОД ^ташиов в течанш i часа. Удлинение его® ад-ешаадш вэдат к значительному огвшвнкп еаодшюго эффекта. , ■ Таким обрааоа, нами получэиыпераыэ вкотршоетальмаа ныэ ю ёооотшювлшщо детальных и мутационных повреждений, вша* ваёмых мутагенньаш факторами.

4. К механизму защитного действия малых доб мутагенов на вирусы.

Обсуждая возможные механизмы еаадтюго действия малых доз мутагенных факторов на вирусы, мы остановились на юобходишоти изучения двух вопросов. Эхо прямое и опосредованное их действия.

Первое ив шх исходит ив ваших жа данных о повышении эффективности репродукции вируоов в условиях вовдейотвия на внеклеточные вирус малыш доеаыимутагенов. Кроме того мы располагаем данными о действии химических мутагенов на ранние стадии репродукции вируса

гриппа (йуматов и др. .1075, Ахматуллига,1984). Отшчэна стимуляция ¿алыми донами химических мутагенов этапа первичной транскрипции Mîpyca гриппа, осуществляемого вирионной транскриптавой.

Непрямой механивм допустим по двум причинам. Во-первых, трудно юключить возможность активации репаративной системы клеток минимальными доеами мутагенов, погашаемых в них выеоте о обработанным трусом. Во-вторых, шльвя не учитывать опоообнооть вируса гриппа вддуцировать интерферон, вначимость которого в процессе репарации i клетках о последнее время активно обсуждается (Синелыцико-»,1989).

В этой сеяз:1 наш проведеда ивучэние состошшя репаративкой шотеыы клеток, чувствительных к изучавши вирусам гю критерию [юрмирования разрывов в условиях предварительной обработки иаошмн рвами мутагенов и боа него (рио.4). Показано, что 2CS ДНК ¡теток, >брзботанных б мЫ НШ1 пооле предварительного воздействия на шк ),01 Ш HMU остается на фильтрах,'в то время как ДНК клеток, не юдвергавшихся действию малых доз обнаружить на фильтрах та дает-гя. Кроуэ того в условиях инкубации s питательной средо ¡аэлгчзттю »парированной ДНК гагачзгголыю еыпэ в предобработашшг иашш до-аыи метках, нежели обработанных лишь большой дозой ЙШ.

Эти данные имеет непосредственное стшззние к шханмшху ващит-юго действия малых доз химические мутагенов от соврэздзшя гэйсиз вирусов. В клетках с активной систолой репарация более оффестивно [ротокает воостановление повреждений генома вирусов.

Аналивирук результаты ообственных вкспериментов M сопоставляя IX о литературными данными, следует пришить, «гго ыутагекэз аяру-язв человека и животных процэоо специфический, о собственными ме-анивмами я ваконош^хюствмя. Как всякий биологический ггроцооо он юдверяен реаюгошм модификациям, оооОенностя которых связаны

-le-

&

v" 4 k.

■o

S) 8

I

ч

4

4>

«a <9

100 W m то so

f N

\ч\\\ \

\ \ v\\ ; \\ \ <\

V \ \\ \\

Рй-

_1-_--J-:—1-- . . . '

i t ;3 i

Фракции

_________ контроль___0.01 мН +5мМ ИМИ

0.01 ИМ ИМИ _________5*М НММ ■» г vece

_____5 нМ НММ ..............¡IOIHM* !МН НМИ+2яш

Рис.4, Влияние предварительной обработки культуры клеток человека малыми дозами НММ на последующее действие больших ее доз.

федде всю го больной зависимостью формирования и становления «угадай от генетического взаимодействия вирусов о меткой хозяйка, 'ак, результаты по изучению защитного действия малых доз мутагенов 1Т последующих повреждающих воздействий могут быть связаны о дейо-тва как на клетку, так и на вирус. 1йачэ говоря, его, го-видимо-у, оушарный эффект.

ВЫВОДЫ

. Впервые проведены сдациальшэ ксашдазвапия вако!кл®рюотой мутагенеза шфусов со сравнительным аналхюом действия бааьгаго количэства хкшчзских «утагетз и У®-лучей. Показало,что го эффективности индуцировать а- и мутации у ортозгтеовирусов они располагаются:

у® > нг > до > шц > вэм > дав > дао.

Обнаруизка достоверная завксишсть гффэктшшостн действия етгы-танных мутагенов от фивиагогкчзского состояния вирусов в иоиви? воздействия. При всвдейотвии щтагзванк на гошгэшт шргдангш: юшток а ранние срсгш инфекции частота 5- к Ы- н^тащй вкз® в 2-6

Анализ дозовой вавискиости б$5аясгнчздаого еффвэта вьшаая, чю в субмутагвнньк даах сказ ооддошруэт рзщхщкцда ээдгосз й вашими? от воследукда воздействий бояытава доеашг. Лезшая оавшишоть мутагенэва вируиа иээот ссшашаться яшь ка аффекта разных концентраций нспытуэша факторов. Удаияшш таопэ-плции о ними, а таю® вариации рН и темпбратурзого рэзсшз цт-водит к резкому повышению летального действия. Предприняты первые эксперименты по модификация мутагеязза Ифу^ сов в условиях комбинированного воедействия изучэвшвш кутаге-пами. Установлено, что предварительная обработка вируса малыыя

дозами гомологичных и гетеродогичных мутагенов существенно (до 10-16 рав) снижает частоту s- и ts-мутаций, индуцируемых их большими дозами.

6. Показано, что наибольшим протекторным аффектом обладают малыэ дозы ДАВ и HUM. При этом отмечена еавискмооть эффективности ва-циты от величины дозы мутагена. Она выражена больше по отношению высоких доз мутагенов, нежели умеренных.

6. Разработан ряд подходов к ивучзнии механизш модификации мутагенеза вирусов малыми доеами мутагенов, включающий анализ природы стимуляции репродукции вирусов и ооотояния репарационной системы клеток, в которых размножается вирус. В раздельных опытах было показано, до малые дреы мутагенов активирует начальный этап репродукции вирусов, а такю репаративный синтез ДНК 8 культурах клеток и приводят к онижвюш индуцированных рвврывоа ДНК.

7. На основании сравнительного анализа природы активации янзнедеа-тельнооти вирусов и чувствительных клеток высказана гипотеда о комплексном механизме защитного эффекта малых доз мутагенов. Предполагается, что вирусы обладают некими структурами, активация которых приводит к последукщэиу запуску репаративного процесса в системе вирус-клетка.

Список работ, опубликованных го теме диооергации. 1. Ахматуллина Е В., фланова К. Г., Петренко Е. П., Абдукаримова К., Еаймухамедрва У. X., Абдукаримова Д. А. Характеристика температуро-Чувствительных мутантов вируса иотишюз чумы птиц, индуцированных хишчеокими мутагенами//Биология вируоов и вирусных инфекций. -Алма-Ата. -1979< -0.6-0.

S. Ахматулдиаа ЕЕ. Абдукаримова Д.А., Баймухамедова М.X., Дерев-

ова Е Ii Некоторые аспекты действия хюичвокюс мутагенов на виру-ы гриппа // Материалы III Воеоояиого оьеада гигиенистов, втадэ-иологов, микробиологов и кнфекцноюготов. -Алма-Ата. -1980. -С.92-94. , Ахштуллина ЕЕ, Абдукаримада Д.А., Дэниоэнко ИГ. Адаптация яруса гриппа к нивкой температуре // Tea. джл.1 ковфьвяруоалогов ваахтаяа. -Алма-Ата. -108В. -0.15-10.

Ахштуллина ЕЕ» Абдукарююва Д.А., Дврвярва Eli, йзамвевва , Действие химических ыутагетоз на репродукцию ортоаеткоовяруоов ' Химический мутагево8 н качжзтво овльокохозяйотвеаоЯ проду?«-т. -U. -Наука. -198а -0.212-214.

Ахматулягаа Е Е, АЯдукарямэга Д, А., ГуОшакая В. Г. Еэюлсргэ ¡кояомэрноати возникновения ta-ыутаций при эсадейотвии гямячэскя-I мутагенам! //Об. Иикроорганизмы в их реакция на дэйотшга финя-юкжх и поасеских факторов. -Алма-Ата. -1083. -О. 10М18.

Ашатуллииа ЕЕ, Шгавва ИХ, Абдукартюва Д.Д., Sspeaqosa ЕМ., ?ста4ин К. Г. Способ шращивашшя оргошкоовируосз // Азт. ашд. N 381208. -БПЛЛ. К11. -1084 -С. &&.

Абдукарамоза ДА., Ахматуллина ЕЕ Вгшгаиэ малых язе швтстх ггагенов на янактивацгаэ гаруса гршша их большая доами Т(вв^1.тия АН КавОСР. -1088. -MS. -О. 52-60.

Ахштуллина ЕЕ, Якгавва EX.. Абдукаримова S.A. Защитный аф-»кт малых дув химичэскнх мутатаюз ва ортсамкоовируоы ' Tea докл. Ызддугародаого оьвада Hsrraremi скруяаиаэЯ среды". -»ция. -1086.

Ахматуллниа ЕЕ. Абдукарююва ДА., Кулумбвтова O.K. Яв-тоификация репродукция вирусов гриппа в клетка //фундаьюн-иьныэ науки медицине. -Алма-Ата. -108В. L Ахматуллина ЕЕ, Шгаева М.X, Абдукаришва ДА. Мэдифи-

щия мутационного процеоса у ортомякооаирроов //Tea лек*.

Шщужродваго оныиооаума ю ыикробиооогии. -Англия. -1986. И. Юдукаршюза Д.А., Абдукарншва К. А. Зааиокшоть частоты ts-ыутацмй F оргомиксааируосш от воадейотвия ыутагенама в различные стадии их репродукции //Материалы респ.кпаф.КааВО-ШЭ: Генетика и оелекщш рвотешй и микроорганизмов. -Алма-Ата. -1986. -0.131

12. Ахматуллива аЕ .АОдукариыгша Д. А. Некоторые вакоаомэр-юотш действия химических ыутагешз т репродукцию и ившит шт> ортшжсоозируооз // Tea докл. X конгресса Венгерского общества шшроОиошгсш. - 1997.

13, Ахмкгуллиш Н.В., 1^отафин К. Г.. Дэревцрва Е ^, АОдука-ришва Д.А.. Кул^йетоаа О.К. Мнте£Шфикация репродукции вируса гриппа а клетке // Tea докл. У Шадувародвого конгреооа по Острым методам se автоматике.- Кгалия.-198Г7.

, 14. Ахиатуллина ЕЕ., &ковд А.О., КасшЭекова O.R., Джанга-Ж1ш ЕЕ., АОдукаршош Д. А. йэйотвиэ некоторых потенциальны: хшгнчвсяшх вагрявштелэй окружающей среды на бактерии в виру сы //Tea, докл. Секции гевет. аспектов проблемы "Человек и биосфера".-Киев.-198а

1В. .Щцукаримова Д.А. Унификация мутационного процэооа у вирусов //Материалы peon. конф.: ПроОхеш теоретической и прикладной генетики в Казахстана. -Алма-Ата. -1990.41.135. '16. Абдукариюва Д. А. Мутационная изменчивость вирусов //Биология вирусов гриппа человека и животных. Труды ИШВ .-1991,-С. Э-17.

17. Абдукаршова Д. А. .Абдукаришва К. Модификация УФ-ыутаге-неаа орюыиксовируоов малыми доеами НШ и ДАВ //Биология вирусов гриппа человека и животных. -Алма-Ата. -1991. -0.17-21.