Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и структурный анализ фрагмента гена альдегиддегидрогеназы маш Vigna radiata
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и структурный анализ фрагмента гена альдегиддегидрогеназы маш Vigna radiata"

2 1 АП? ШЗ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

ПОНОМАРЕВ АНАТОЛИЙ ГАВРИЛЬЕВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ФРАГМЕНТА ГЕНА АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ МАШ Vigna radiata.

специальность 03. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в группе клонирования гена Института биологических проблем криолитозоны СО РАН

Научный руководитель - канд. биол. наук В. В. Бубякина

Официальные оппоненты - член - корр. РАМН, докг. мед. наук,

профессор В. С. Гайцхоки канд. биол . наук, ст. науч. сотр. Т. Н. Прияткина

Ведущее учреждение - Институт цитологии РАН

Защита состоится «/^ » 1998 г. в 16 час.

на заседании диссертационного совета К.063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург , Университетская наб., 7/9 (ауд 90).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « У » 1998 г.

Ученый секретарь совета Р. И. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Установление аминокислотной последовательности белков без их выделения на основании данных о структуре генов стало одной из быстро развивающихся областей биохимии и молекулярной биологии. Благодаря быстроте такого анализа, получен обширный материал о сходстве и различиях в первичной структуре одноименных белков различного происхождения, выявлены консервативные и вариабельные участки в пределах отдельных доменов, установлено, что функционально - гомологичные белки образуют семейства и суперсемейства, подразделяющиеся по степени сходства аминокислотных последовательностей на дискретные группы - классы, подсемейства. Накопление подобной информации имеет большое теоретическое и практическое значение, поскольку позволяет установить филогенетические связи внутри семейств, направление и тенденции эволюционных изменений генов животных, растений и бактерий и их продуктов, таким образом, имеет отношение к проблеме эволюции отдельной белковой функции, а также выясняются взаимосвязи структуры и функции. Участие в целом ряде ключевых метаболических путей и недостаточность информации о семействе NAD(P)+ - зависимых альдегиддегидрогеназ (ALDH) высших растений, катализирующих окисление широкого спектра эндогенной или экзогенной природы алифатических и ароматических альдегидов до соответствующих кислот, делают их исследование с помощью такого подхода актуальным.

Найдено участие бетаиновой альдегиддегидрогеназы (К.Ф.1.2.1.8) в биосинтезе глицинбетаина - осмолита, обеспечивающего устойчивость ряда растений к условиям нехватки влаги, засоленности [Rhodes, Hanson, 1993; Wood et al., 1996] и, возможно, к воздействию холода [Kishitani et al„ 1994]. Предполагается участие митохондриальной альдегиддегидрогеназы высших растений (К.Ф.1.2.1.3) в биосинтезе индолилуксусной кислоты - фитогормона ауксина [Asker, Davies, 1985], в биосинтезе глицина [Davies, 1960; Asker, Davies, 1985], в детоксикации вредных альдегидов, возникающих, например, при заболеваниях растений [Cui, 1996].

Степень изученности альдегиддегидрогеназ высших растений мала по сравнению с таковыми млекопитающих и человека. Информация о

них представлена несколькими неполными физико-химическими характеристиками, полученными при исследовании частично очищенных белков [Davies, 1960; Wightman, Cohen, 1968; Takeuchi, Uritani, 1981; Asker, Davies, 1985]. Информации по полной структуре ни одного из их генов нет. Есть только сведения по клонированию кДНК BADH шпината, сахарной свеклы, ячменя и сорго [Rhodes, Hanson, 1993 ; Wood et al., 1996], кДНК нефосфорилирующих глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназ гороха и маиса [Habenicht et al., 1994] и кДНК белка RF2 кукурузы, подобного митохондриальной альдегиддегидрогеназе млекопитающих со степенью гомологии около 60% [Cui et al., 1996].

Настоящая работа посвящена выявлению в геноме представителя семейства бобовых - маш Vigna radiata (англ. назв. mung bean) генов семейства альдегиддегидрогеназ. В ней также отражен этап подготовки к клонированию гена митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata.

Цели и задачи исследования. Основными целями предлагаемой работы были поиск и идентификация в геноме Vigna radiata протяженных фрагментов генов семейства альдегиддегидрогеназ. В рамках подготовительного этапа к клонированию гена митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata была поставлена цель, заключающаяся в выделении высокоочищенной 54 - кДа субъединицы митохондриальной альдегиддегидрогеназы и получении антител к ней. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Поиск протяженных фрагментов генов альдегиддегидрогеназ Vigna radiata на тотальной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе анализа участков консервативности известных генов альдегиддегидрогеназ, и метода полимеразной цепной реакции.

2. Клонирование, секвенирование протяженных фрагментов генов альдегиддегидрогеназ Vigna radiata. Сравнительный анализ нуклео-тидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей этих фрагментов с последовательностями известных генов альдегиддегидрогеназ и их белковых продуктов.

3. Выделение и характеристика высокоочищенной 54 - кДа субъединицы митохондриальной альдегиддегидрогеназы корней Vigna radiata. Получение поликлональных моноспецифических антител, необходимых для клонирования ее гена.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе представлены новые данные о получении из генома Vigna radiata

протяженного (651 п. н.) фрагмента гена, кодирующего частичную последовательность неописанной ранее альдегиддегидрогеназы высших растений. Получение этих данных имеет фундаментальное значение. Этот фрагмент может служить специфическим зондом для поиска полноразмерного гена неизвестной ранее альдегиддегидрогеназы, исследование которого расширит представление о семействе генов альдегиддегидрогеназ высших растений и кодируемых ими белках. Получение белкового продукта этого гена и познание энзиматических свойств дадут возможность найти подходы к исследованию его непознанной функции.

Получены поликлональные моноспецифические антитела к высокоочищенной 54 - кДа субъединице митохондриальной альдегиддегидрогеназы Vigna radiata с высокой антигенсвязывающей активностью, позволяющей их использовать в качестве зонда для клонирования ее гена. Сочетание данных о свойствах белкового продукта и его гена облегчит поиск неизвестной функциональной роли фермента.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах биохимического отдела и заседаниях Ученого совета Якутского института биологии СО РАН и на 8-м Международном симпозиуме «Энзимология и молекулярная биология карбонильного метаболизма» (Дейдвудд, США, 1996)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, включая 22 рисунка и 11 таблиц, список литературы включает 157 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение тотальной ДНК из двухдневных корней маш проводили с помощью протеиназы К и последующей очистки в градиенте плотности хлористого цезия [Дрейпер, Скотт, 1991].

Полимеразная цепная реакция проводилась в амплификаторе Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer) с использованием Taq ДНК -полимеразы, реакционного буфера и смеси dNTP (Boehringer Mannheim). Праймеры были синтезированы и хроматографически очищены в НПК

«Гамма» (С. - Петербург). Режим ПЦР был следующим: денатурация - 1 мин при 92°С, отжиг праймеров - 1 мин при постепенном понижении температуры от 66°С до 46°С, синтез - 4 мин при 72°С (до 47 циклов). После 22 цикла ПЦР добавлялись новые порции Taq ДНК - полимеразы и смеси dNTP. Конечная реакционная смесь объемом 60 мкл содержала по 160 мкМ каждого dNTP, по 0,1 мкМ каждого праймера, 3,33 мкг/мл ДНК, 60 ед/мл Taq ДНК - полимеразы, 50мМ KCl, 10 мМ трис - HCl, pH 8,3, 1,6 мМ MgCl2, 10% - ный глицерин, 0,04% - ный твин. Реамплификацию проводили при 55°С (35 циклов) в реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис - HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50мМ KCl, pH 8,3, 0,001% - ный желатин, 200 мкМ каждого dNTP, 0,1 мкМ каждого праймера, 30 ед/мл Taq ДНК -полимеразы,< 1 мкг/100 мкл ДНК.

Для подбора праймеров использовали программу Oligo.

Препаративный и аналитический электрофорез выполнялись в 1% -ном агарозном геле.

Подготовка очищенных препаратов ДНК индивидуальных фрагментов для секвенирования и клонирования была осуществлена с помощью набора для экстракции ДНК из агарозных гелей (Qiagen). Достраивание 3' - концевых участков ДНК продуктов ПЦР проводилось с помощью фрагмента Кленова ДНК - полимеразы I (USB) при 22°С в течение 30 мин в присутствии смеси dNTP в буфере, рекомендуемом изготовителем. ПЦР - фрагменты фосфорилировали перед лигированием с помощью полинуклеотидкиназы Т4 (Boehringer Mannheim) в том же буфере в присутствии АТР при 37°С в течение 30 мин.

Подготовку вектора для клонирования ДНК плазмиды pGEM-7Zf(+) (Promega) осуществляли с помощью гидролиза эндонуклеазами рестрикции HindlH+Smal (Promega) в условиях, рекомендуемых изготовителем. Гидролизованную векторную ДНК очищали от эндонуклеаз рестрикции с помощью набора (Qiagen). Дефосфорилирование вектора проводили с помощью щелочной фосфатазы (Boehringer Mannheim) в течение 1 часа при 37°С в буфере, рекомендуемом изготовителем.

Реакцию лигирования проводили в буфере (50 мМ трис - HCl, pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 1мМ DTT), содержащем 1мМ АТР, 5% - ный полиэтилен-гликоль-8000 и ДНК - лигазу фага Т4 (GibcoBRL) в течение 24 часов при 14°С. Использовали молярное соотношение ДНК вектора к ДНК фрагмента, равное 1:5.

Для трансформации использовали компетентные клетки Epicurian Coli XL2 - Blue Ultra - competent Cells (Stratagene).

Выделение плазмидной ДНК осуществлялось с помощью набора FlexiPrepK.it (Pharmacia Biotech). Наличие вставок в ДНК pGEM-7Zf(+) анализировали гидролизом эндонуклеазами рестрикции PvuII (Promega) и HindIII + EcoRI.

Секвенирование ДНК по методу Сэнгера [Sanger et al., 1977] проводилось с помощью набора «Perkin Elmer» (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) с AmpliTaq ДНК-полимеразой, праймеров ПЦР (или секвенирующих праймеров SP6 и Т7), амплифи-катора (Perkin Elmer). Анализ секвенирующих смесей проводился на автоматическом секвенаторе ДНК 373А (Applied Biosystems). Сравнение последовательностей проводили с помощью программы ClustalV [Higgins et al.,1992] и BLASTN 1.4.9.MP [Altschul et al.,1990].

Частичноочищенный препарат альдегиддегидрогеназы из митохондрий был получен с помошью модифицированного метода Аскера и Дэвиса [Asker, Davies, 1985] с использованием хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и аффинной хроматографии на 5' - AMP - сефарозе. Для получения высокоочищенной альдегиддегидрогеназы использовали высокоэффективную гель-фильтрацию в денатурирующих условиях на колонке с TSK-3000SW (Тоуо - Soda).

Активность фермента определяли на спектрофотометре UV-240 (Shimadzu) при длине волны 340 нм по увеличению концентрации NADH. Фракции после хроматографии в денатурирующих условиях анализировали при длине волны 280 нм. Для количественного определения белка использовали метод Лоури с модификациями [Коваленко и др., 1981] или метод Бредфорда [Bradford, 1976]. Электро-форетический анализ белков проводили в системе Лэммли [Laemmli, 1970]

N-концевой анализ выполняли с помощью дансильного метода в присутствии DS - Na [Weiner et al., 1972], идентифицируя дансильные производные тонкослойной хроматографией на силикагеле.

Аминокислотный анализ проводили методом обращеннофазовой хроматографии с помощью аминокислотного анализатора Pico-Tag (Waters).

Иммунизация кроликов проводилась подкожно небольшими дозами по 20 - 50 мкг препарата 54 кДа - субъединицы альдегиддегидрогеназы, полученного с помощью гель - фильтрации в денатурирующих условиях. Появление антител в сыворотке анализировалось с помощью иммуноферментного метода. Моноспецифические антитела были

очищены на сорбенте с иммобилизованной альдегиддегидрогеназой. Синтез сорбента с иммобилизованной альдегиддегидрогеназой был осуществлен, используя биотин - стрептавидиновую систему [Wilcher, Bayer, 1988].

Иммуноблот после электропереноса [Towbin et al.,1979] и иммуно-дот после нанесения препарата альдегиддегидрогеназы на нитроцеллюлозу проводили путем инкубации в растворе, содержащем 10 мкг/мл моноспецифических кроличьих антител против альдегиддегидрогеназы или антител неиммунизированного кролика. Сорбированные антитела визуализировали реакцией 4 - хлор - 1 - нафтола с пероксидазой, конъю-гированной со вторичными антителами.

Окрашивание нитроцеллюлозы осуществляли красителем амидочерным [Schaffer, Weissman, 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение протяженных продуктов ПЦР с помощью вырожденных праймеров и их анализ методом прямого секвенирования. Структуры шести праймеров для ПЦР (верхние: Ul, U2, U3, нижние: L1, L2, L3), были основаны на результатах поиска с помощью программы ClustalV участков с высокой консервативностью среди нуклеотидных последовательностей генов альдегиддегидрогеназ Aspergillus niger и nidulans, Saccaromyces cerevisiae, кДНК BADH шпината и сахарной свеклы из базы данных EMBL. Структуры праймеров U3 и L1 показаны в таблице 1.

Таблица 1. Праймеры для ПЦР

177 184

U3 Trp Lys Ile Ala Pro Ala Lou Ala 5' TGG AAA ATT GCT CCA GCA/T CTT GC 3'

404 398

LI Val Pro Gly Phe Ile Glu Glu 5' AC AGG GCC AAA AAT TTC G/TTC 3'

Примечание: номера аминокислотных остатков соответствуют таковым ALDH1 и 2 человека [Hsuet. al.,1985],_

В результате ПЦР получены электрофоретически гомогенные протяженные продукты амплификации с размерами 700 - 1700 п.н. С помощью частичного прямого секвенирования были проанализированы с праймера L1 продукты амплификации с размерами около 700 - 800 п.н., возможно, являющиеся фрагментами неинтронированных генов. Результаты этого секвенирования были использованы для поиска близкородственных последовательностей с помощью программы BLASTN 1.4.9.МР в 4-х базах данных (GenBank + EMBL + DDBJ + PDB). Оказалось, что только продукт амплификации с праймеров U3 и L1 с размером около 700 п.н. (названный U3/L1L) имеет нуклеотидную последовательность, структурно гомологичную генам представителей суперсемейства альдегид-дегидрогеназ.

2 Клонирование и секвенирование U3/L1L и U3/L1H продуктов амплификации. Для определения полных нуклеотидных структур фрагменты U3/L1L и близкий к нему по размеру (около 850 п.н) U3/L1H были клонированы в векторной плазмиде pGEM-7Zf(+) по сайтам HindIII и Smal. Анализ клонов рестриктазами PvuII, HindIII+EcoRI обнаружил клон 1 (с вероятной вставкой U3/L1L фрагмента и сайтом для рестрик-тазы HindIII в ней) и клон 13 (с вероятной вставкой U3/L1H фрагмента). Результаты секвенирования с праймера L1 клона 1 (pmbALDHl) показали, что нуклеотидная последовательность, представленная 3'-половиной фрагмента, совпала с результатами прямого секвенирования. Результаты секвенирования с праймера U3 этого клона показали, что частичная нуклеотидная последовательность 5' - половины фрагмента также имеет высокую гомологию с нуклеотидными последовательностями генов альдегиддегидрогеназ. Для уточнения нуклеотидной последовательности U3/L1L фрагмента проведено клонирование двух его субфрагментов с размерами примерно 200 и 500 п.н. по HindIII - Smal сайтам в составе плазмиды pGEM-7Zf(+) и их секвенирование с помощью праймеров SP6 и Т7. В итоге собранная нуклеотидная последовательность (между прай-мерами) фрагмента гена ALDH с размером 651 п.н. приведена на рис.1. Она имеет высокую гомологию (около 60%) с генами ALDH Vibrio cholerae, Rhodococcus sp., ацетальдегиддегидрогеназы AcDH-II Alcaligenes eutrophus. Подобно U3/L1L фрагменту клон 13, названный pmbALDHl3, был секвенирован с праймеров L1 и U3. На основании позиционной идентичности, составляющей около 80%, фрагменты генов U3/L1L и U3/L1H можно считать кодирующими частичные последовате-

льности альдегиддегидрогеназ высших растений, относящихся к одному классу.

3. Сравнительный анализ частичной выведенной аминокислотной последовательности неописанной ранее АЬРН высших растений с известными альдегиддегидрогеназами. Выведенная аминокислотная последовательность фрагмента гена АЬБН

Ala Gly Asn Cys Ile Val Leu Lys Pro Val Glu Gin Thr Pro Ala Ser Ile Trp 18

GCG GGT AAC TGT ATT GTT TTA AAA CCT GTT GAA CAG ACC CCT GCG AGC ATT TGG

Val Leu Ile Glu Leu Ile Gin Asp Leu Leu Pro Pro Gly He Leu Asn Ile Val 36

GTT TTA ATT GAA CTC ATT CAA GAC TTA СТА CCA CCC GGT ATT TTA AAC АТС GTC

Asn Gly Туг Gly Val Glu Val Gly Arg Pro Leu Ala Thr Asn Pro Arg Ile Ala 54

AAC GGT TAT GGT GTT GAA GTG GGT CGT CCA CTC GCA ACC AAT CCA CGT ATT GCT

Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Thr Ala Val Gly Gin Met He Met Gin Туг Ala 72

AAA ATT GCA TTC ACT GGC TCT ACT GCT GTG GGT CAA ATG АТС ATG CAA TAT GCC

Thr Glu Asn Val Ile Pro Val Thr Leu Glu Phe Gly Gly Lys Ser Pro Asn lie 90

ACT -GAA AAC GTA ATT CCT GTA ACG TTG GAA TTT GGT GGT AAG TCT CCA AAC АТС

Phe Phe Glu Asp Ile Met Asp Gin Asp Asp Glu Phe Leu Asp Lys Ala Leu Glul08

TTC TTT GAA GAC ATT ATG GAT CAA GAC GAT GAG TTC TTA GAC AAA GCC CTT GAA

Sly Phe Ala Met Phe Ala Leu Asn Gin Gly Glu Ile Cys Thr Cys Pro Ser Argl26

GGT TTT GCC ATG TTT GCA CTT AAC CAA GGT GAA ATT TGT АСА TGT CCA TCA CGC

Ala Leu Val Gin Gly Ser Ile Ala Asp Lys Phe Leu Glu Met Ala Val Glu Argl44

ATT GCA GAT AAA TTC CTT GAA ATG GCA GTT GAA CGT GCT TTA GTT CAA GGA AGT

Val Lys Arg Ile Lys Thr Gly His Pro Leu Asp Thr Glu Thr Met Ile Gly Ala.162

GTG AAA CGC ATT AAA AC G GGT CAC CCG CTC GAT АСА GAA ACG ATG ATT GGT GCG

Gin Ala Ser Leu Glu Gin Gin Glu Glu lie Leu Gly Cys lie Ala Ser Gly ArglSO

CAA GAG GAA ATT TTG GGT TGT АТС GCA TCA GGT CGC CFA GCT TCA CTT GAA CAA

Gly Glu Gly Ala Gin Val Leu Thr Gly Gly Ser Glu Arg Asn Glu Val Gly Serl98

GGT GAA GGT GCA CAA GTA CTG АСА GGT GGT AGT GAG CGT ДАТ GAA GTG GGT TCT

Gly She Tyr Ile Glu Pro Thr Ile Phe Lys Gly Thr Asn Asp Met Lys lie Phe216

ACC ATT TTC AAA GGC ACC AAT GAC ATG AAA ATT TTC GGT TTC TAT ATT GAA CCA

Sin 217

CAA

Рис. 1 Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности U3/L1L фрагмента гена ALDH маш. Цифрами справа указаны номера аминокислот от начала фрагмента.

маш из 217 аминокислот (рис. 1) представляет примерно 40% длины неизвестной ранее ALDH высших растений в ее центральной части. Проведен ее сравнительный анализ с 16 аминокислотными последовательностями известных ALDH [Hempel et al., 1993]. На рис. 2 показано ее выравнивание с пятью из них. Сравнительный анализ, основанный на совпадении позиций аминокислотных остатков показал, что в ней совпадают позиции Lys (индекс 242), Gly (индекс 274,297, 329,363, 444), Cys (индекс 366), Pro (индекс 462), Thr (индекс 463), которые выде-

240 250 260 270 2S0 290

## * # . .*# . * . # # Mbaldh AGNCIVLKEVEQTPRSIWVLIELIQD-LLPPGILN-IVNGYGVEVGRPL-ATNPRIAKIAFTS Cllhu cgntwvkpaeqtpltalhvislikeagfppgwn-ivpgygetagsai-sshmdidkvait;g

C12h'J TGNWVMKVAEQTELTALYVIHLIKEAGFPEGWN-IVPGFGETAGAAX-ASHEDVDKVAETG Aspraldh AGHTWLKTAQQTPLSALAAIKLIKEAPFPAGVIN-VXSGFGRTAGAAI-SSHMDIDKVAFTG Vchlaldh AGCTVVLKPAEQTPVSILFLIEIIGD-LIPAGVIil-WNGFGSEAGNAL-ATSQRIDKLAITG Spbtaldh AGCTAVLKPSELASVTCLEFCEVCNEVGLPPGVLNICLTGLGPDAGAPL-VSKPDVDKIAFTG

300 310 320 330 340 350 360

*. # .* . ** . * . #.

Mbaldh STAVGQMIM--------QYATENVIPVTLEFGGKSPNIFFEDIMDCDDEELDKALEGFAMFALNQ

Cllhu STEVGKLIK-------EAAGKSNLKRVTLELGGKSPCIVLADA-----DLDNAVEFAHHGVFYHQ

C12hU STEIGRVIQ-------VAAGSSNLKRVTLELGGKSPNIIMSDA-----DMDWAVEQAHFALFFKQ

Aspraldh STLVGPTIL-------QAAAKSNLKKVTLELGGKSPNIVFDDA-----DIDNAISWANFGIFFNH

Vchlaldh STEIGNHIL--------KCAADNLIPSTIELGGKSPNIYFPDIFEHEDQYLDKCIEGi.LLAFFNQ

Spbtaldh SSATGSKVM--------ASAAQLVKPVTLELGGKSPXVVFEDV-----DIDKWEWTIFGCFWTN

370 380 390 400 410 420

* . . . * . *#

Mbaldh GEICTCPSRALVQGSIADKFLEMAVERVKRIKT---------GHPLDTETMIGAQASLEQQEKIL

Cllhu GQCCIAASRIFVEESIYDEFVRRSVERAKKYIL---------GNPLTPGVTQGPQIDKEQYDK1L

C12hU GgCCCAGSRTFVQEDIYDEFVERSVARAKSRVV---------GNPFDSKTEQGPQVDETQFKKIL

Aspraldh GQGCCAGSRILVQEGIYDKFVARFKERAQKNKV---------GNPFEQDTFQGPQVSCLQFDRIM

Vchlaldh GEVCTCPSRILVHESIYEKFISKIIERVALIKQ---------GWPLBTETQIGAQVSKEQYDKIL

Spbtaldh GQICSATSRLLVHESIAAEFVDKLVKWTKNIKI---------SDPFEEGCRLGPVISKGQYDKIM

430 440 450 460 470

.# . # * . *

Mbaldh GCIATGRGEGAQ-VLTGGSERN---EVGSGFYIEPTIFKG-TNDMKIFQ

Cllhu DLIESGKKEGAK-LECGGGE-----WGNKGYFVQPTVFSNVTDEMRIAK

C12hu GYINTGKQEGAK-LLCGGGI-----AADRGYFIQPT7FGDVQDGMTIAK

Aspraldh EYINHGKKAGAT-VATGGDR-----HGNEGYFIQPTVFTDVTSDMKIAQ

Vchlaldh GYIQIGKDEGAE-LIFGGHPNNQENYLSGGYYIKPTLFFG-KNQMHIFQ Spbtaldh KFISTAKSEGAT-ILYGGSRPE---HLKKGYYIEPTIVTDXSTSMQIWK

Рис. 2. Сравнение аминокислотной последовательности, выведенной из структуры ДНК фрагмента гена ALDH маш, с аминокислотными последовательностями ALDH в соответствии с результатами их выравнивания [Hempel et al„ 1993].

Цифрами отмечены, введенные авторами выравнивания, индексные числа. Mbaldh - ALDH маш Vigna radiata, Cllhu - ALDH1 млекопитающих, C12hu - ALDH2 млекопитающих, Aspraldh - ALDH Aspergillus nidulans, Vchlaldh - ALDH Vibrio cholerae, Spbtaldh - BADH шпината.

ляются в группу строго консервативных или инвариантных аминокислотных остатков (выделены шрифтом). Оказалось, что Суэ (индекс 366) соответствует позиции каталитического Суз-302 ALDH1 к 2 млекопитающих. В следующей группе близких к инвариантности

аминокислот (выделены подчеркиванием) совпали позиции Phe (индекс 295), Thr (индекс 296), Ser (индекс 298), Val (индекс 324), Lys (индекс 331), Gly (индекс 330, 415, 445),Glu (индекс 327), Asp (индекс 339). Исключениями являются Phe (индекс 359), Gin (индекс 364), вместо которых в этих положениях в альдегиддегидрогеназе маш находятся Ala и Glu. Было также обнаружено соответствие позиций Glu (индекс 327) и Glu-268 ALDH1 и 2 млекопитающих, которой вероятно принадлежит роль в ионизации Cys-302, способствующей образованию тиополуаце-таля из альдегида [Abrióla, Pietruszko, 1992; Píetruszko et al., 1993]. Наконец в группе инвариантно сходных и сходных аминокислот (знаки # и *, соответственно) совпали позиции Leu (индекс 241, 257, 283), Ser (индекс 250), Ile (индекс 271, 305, 426, 474), Ihr (индекс299), Val (индекс 272, 321, 374, 441, 464), Lys (индекс 425). Члены этой группы входят в состав так называемых эквивалентных замен типа Thr / Ser, Arg / Lys и Leu / Не / Val / Met. Исключениями являются Phe (индексы 336), Ala (индекс 418), которые не относятся к категории Leu I Ile / Val / Met и отсутствие аминокислотного остатка в индексе 468 в альдегиддегидрогеназе маш.

В выведенной аминокислотной последовательности фрагмента гена ALDH маш найдено сходство с тремя высококонсервативными областями аминокислотных последовательностей суперсемейства альдегидцегидрогеназ [Hempel et al., 1993]. Первой высококонсервативной области соответствует последовательность Gly - Ser - Thr - Ala - Val - Gly альдегиддегидрогеназы маш. Она сходна с мотивом NAD+-связывающих доменов различных белков Gly - X - Gly - X - X - Gly (индексы 297 - 302). Thr вместо второго Gly - характерная черта большинства альдегиддегидрогеназ [Hempel et al., 1993]. Во второй высококонсервативной области последовательность альдегиддегидрогеназы маш совпадает кроме одной позиции (вместо Leu Phe в индексе 328) с декапептидом Val - Thr - Leu - Glu -Leu - Gly - Gly - Lys -Ser - Pro (индексы 324 - 333), представляющим эту область. Затем идет третья высококонсервативная область, содержащая консенсусный мотив активного сайта альдегиддегидрогеназ (индексы 360 - 368), включающий в себя каталитический Cys - 302 в ALDH1 и 2 млекопитающих (индекс 366), Gly (индекс 363) и Gin (индекс 364). В ALDH маш в позиции индекса 364 вместо Gin находится Glu.

Выведенная аминокислотная последовательность фрагмента гена альдегиддегидрогеназы маш проявляет примерно 45% позиционной

идентичности с ALDH1 и 2 млекопитающих, ALDH Aspergillus niger и nidulans, BADH шпината и высокую идентичность (около 65%) с NAD+-зависимыми альдегиддегидрогеназами Vibrio cholerae (Parsot, Mekalanos, 1991), Rhodococcus sp. (Nagy et al., 1995), AcDH-II Alcaligenes eutrophus (Priefert et al., 1992), имеющими широкую субстратную специфичность. Это позволяет предположить происхождение эукариотического гена альдегиддегидрогеназы маш и трех прокариотических генов от одного предкового гена и сходную субстратную специфичность ферментов.

4. Выделение и характеристика высокоочищенного препарата мито-хондриальной альдегиддегидрогеназы корней маш. В ходе предварительной работы было установлено, что митохондриальная альдегиддегидро-геназа маш подобно митохондриальным альдегидцегидрогеназам млекопитающих и человека является олигомерным белком с молекулярной массой около 200 - 220 кДа, составленным из субъединиц с молекулярной массой 54 кДа, обладающим высоким сродством к ацетальдегиду, строго специфичным к кофактору NAD+. Препарат митохондриальной альдегиддегидрогеназы, полученный на ранних этапах исследования с помощью аффинной хроматографии на 5' - AMP сефарозе, содержал полипептиды с молекулярными массами 54, 41, и 39 кДа. Наиболее эффективным способом разделения белков этого препарата оказалась гель-фильтрация в денатурирующих условиях. Удалось освободиться от полипептида с молекулярной массой 39 кДа. Объемы выхода на колонке полипептидов с молекулярными массами 54 и 41 кДа различались таким образом, что левая часть пика была представлена на профиле элюции полипептидом с молекулярной массой 54 кДа в достаточно чистом виде, о чем свидетельствует электрофоретический анализ препарата в градиентном полиакриламидном геле (рис. 3).

Сравнительный анализ аминокислотного состава митохондриальной

Рис. 3 Электрофореграмма высокого разрешения фракции препарата альдегиддегидрогеназы после высокоэффективной гель-фильтрации в денатурирующих условиях. Указано положение маркерных белков.

кДа

94—

альдегиддегидрогеназы маш с таковыми ALDH2 печени лошади и человека [Ikawa et al., 1985] показал, что они по содержанию большинства аминокислотных остатков сходны. Отличия от ALDH2 печени человека и лошади есть только по содержанию Gly, Ala, Туг, Cys. Значение среднего индекса полярности аминокислотных остатков [Capaldi, Vanderkooi, 1972] составляет 38%, что меньше, чем у ALDH2 печени человека и лошади (> 40%). Результаты определения дансильным методом N-концевых аминокислот показали, что, как и у всех митохондриальных ALDH млекопитающих [Weiner et al., 1989], у митохондриальной ALDH маш N - концевой остаток 54 кДа - полипептида блокирован.

5. Получение поликлональных моноспецифических антител, необходимых для клонирования гена митохондриальной альдегиддегидрогеназы. Оказалось, что полученный препарат высокоочищенной митохондриальной альдегиддегидрогеназы отличается высокой антигенностью. После третьей иммунизации сыворотка кролика в разведении 1 : 1000 способна обнаруживать 0,5 мкг, а в разведении 1: 500 - 5 нг препарата митохондриальной альдегиддегидрогеназы, сорбированного на нитроцеллюлозе. Модифицированный по аминогруппам сукцинимидным эфиром амидокапроилбиотина препарат 54 кДа -субъединицы был иммобилизован на сорбенте, содержащем ковалентно

Рис.4. Электрофореграмма (а) и имму-ноблот (б, в) препаратов ALDH и растворимой фракции белков из коры мозга быка (РФБ).

а: 1 - ALDH (0,5 мкг), 2 - РФБ (5мкг). Окрашивание геля красителем кумасси G-250. Цифры слева указывают молекулярные массы маркерных белков; б: 1 - РФБ, 2 - ALDH. Детектирование моноспецифическими антителами против ALDH;

в: 1 — РФБ, 2 - ALDH. Детектирование антителами из сыворотки неиммунизиро-3 ванного кролика.

связанный стрептавидин. Колонка с иммуносорбентом, содержащим примерно 100 мкг препарата ALDH, объемом 0,4мл за один цикл извле-

кала ю сыворотки около 0,4 мг очищенных антител. В концентрации Юмкг / мл антитела способны в иммунодоте выявлять 100 пкг 54 кДа -субъединицы, не взаимодействуя с белками растворимой фракции из коры головного мозга быка. Аналогичные результаты получены и в иммуноблоте (рис. 4). Окрашивание нитроцеллюлозы после электроблота образцов красителем амидочерным показало, что 54 кДа -субъединица альдегиддегидрогеназы и растворимая фракция бел ков из коры головного мозга быка хорошо сорбировались на нитроцеллюлозе, но моноспецифические аффинноочищенные антитела детектировали только 54 кДа - субъединицу альдегиддегидрогеназы. Можно сделать вывод, что получены поликлональные моноспецифические антитела к митохондриальной ALDH маш с высокой антигенсвязывающей активностью, позволяющей их использовать для клонирования ее гена.

ВЫВОДЫ

1. С применением метода полимеразной цепной реакции и теоретически рассчитанных вырожденных праймеров U3 и LI из генома маш получены 5 протяженных фрагментов ДНК (700 - 1700 п.н.). Фрагменты U3/L1L (около 700 п.н.) и U3/L1H (около 850 п.н.) были клонированы и секвенированы. Гомология между ними составляет около 80%. Поиск гомологов нуклеотидной последовательности фрагмента U3/L1L в базах данных (GenBank + EMBL + DDBJ + PDB) показал, что она имеет до 61% позиционной идентичности с генами представителей суперсемейства альдегиддегидрогеназ.

2. Из нуклеотидной последовательности фрагмента гена U3/L1L выведена аминокислотная последовательность из 217 аминокислотных остатков, охватывающая 40% длины новой не описанной ранее альдегиддегидрогеназы высших растений в ее центральной части, которая проявляет 59% - 69% позиционной идентичности с альдегид-дегидрогеназами Vibrio cholerae, Rhodococcus sp., Alcaligenes eutrophus и около 45% - с ALDH1 и 2 млекопитающих, альдегиддегидрогеназами Aspergillus niger и Aspergillus nidulans, бетаиновой альдегиддегидрогена-зой шпината. При выравнивании частичной аминокислотной последовательности альдегиддегидрогеназы маш с 16 известными альдегиддегидрогеназами совпадают все позиции строго консервативных аминокислотных остатков и трех высококонсервативных областей.

3. С помощью высокоэффективной гель - фильтрации в денатурирующих условиях получен препарат высокоочищенной 54 кДа-субъеди-ницы альдегиддегидрогеназы корней маш Установлен ее аминокислотный состав. Средний индекс полярности ее аминокислотных остатков составляет 38%, что ниже, чем у митохондриальных альдегиддегидрогеназ млекопитающих и подобно им N - концевой остаток 54 кДа - субъединицы блокирован.

4. Получены поликлональные моноспецифические антитела к митохондриальной альдегиддегидрогеназе маш с высокой антиген-связывающей активностью, позволяющей их использовать в качестве зонда для получения ее гена.

.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ли Н. Г., Пономарев А. Г., Бубякина В. В.,Осаковский В. Л. Альдегиддегидрогеназа митохондрий корней маш // Биохимия. 1990. Т. 55. Вып. 9. С. 1590 - 1598.

2. Осаковский В. Л., Пономарев А. Г., Бубякина В. В., Татаринова Т. Д., Кононова С. К., Ли Н. Г., Хохлачев А. В., Коваленко А. В., Пашков В. И., Якунина Н. Б. Альдегиддегидрогеназа митохондрий корней маш Phaseolus aureus. Характеристика и получение моноспецифических поликлональных антител // Биохимия. 1992. Т. 57. Вып. 3. С. 418-429.

3. Bubyakina V. V., Tatarinova Т. D., Ponomarev A. G., Purification of mitochondrial aldehyde dehydrogenase from mung bean roots and preparation of its antibody // In: "8-th International Workshop on Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism". The University of South Dakota, USA. 1996. P. 66.

4. Ponomarev A. G., Bubyakina V. V. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase from mung bean roots // In: "8-th International Workshop on Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism". The University of South Dakota, USA. 1996. P. 69.

Подписано в печать 16.03.98. Формат 60x84/16 Печать ризографическая. Заказ № 01/1603. П. л. 1.00. Уч.-изд. л. 1.0. Тираж 100 экз.

АОЗТ "КопиСервис", 194156, Санкт-Петербург, Б. Сампсониевский пр., 93