Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов Arthrobacter globiformis КЗТ-1, контролирующих дегалогенирование 4-хлорбензойной кислоты, в клетках Escherichia coli и Pseudomonas putida

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов Arthrobacter globiformis КЗТ-1, контролирующих дегалогенирование 4-хлорбензойной кислоты, в клетках Escherichia coli и Pseudomonas putida"

Па правах рукописи

^ I Глотникова Елена Генриховиа

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕ Arthrobacter glohiforntis КЧТ-1, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ДЕГАЛОГЕНИРОВАНИЕ 4-ХЛОРГ>ЕГООЙИОИ КИСЛОТЫ, В КЛЕТКАХ Escherichia coli и Pseudomonas putida

03.00.15 - генетика

Автореферат „¡иссертации на соискание ученом степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино) и в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г.Пермь)

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор А.М.Боронин

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Т.В.Цой

Консультант: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.А.Демаков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.В.Каменева кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.СЛненко

Ведущее учреждение: Институт микробиологии РАН

Защита состоится ^^ г/ 1995 г в часов

на заседании диссертационного совета (Д .098.12.01) при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИ И генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан " ^ " ('¿^Ю&Л 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ,. ; __ >' у Щербакова В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемьг.В последние десятилетия в окружающую среду выбрасывается значительное количество галогенированных органических веществ, которые человек производит и использует н качестве гербицидов, пластмасс ц растворителей; Талогенсодержащие соединения являются устойчивыми и токсичными веществами, и при их разложении возможно накопление опасных метаболитов. В связи с этом проблема биодеградацпи галогенсо-держащих соединений в окружающей среде является очень актуальной и широко исследуется. Эффективным для детоксикащш такого рода соединений является биологический метод очиспш, с использованием как природных, так и гешю-гшженерных штаммов мжроорганизмов-деструкторов. В последние годы он приобрел большое значение, особенно для биоремедианин загрязненных почв, промышленных стоков и грунтовых вод. С этой точки зрения изучение генетических механизмов оиодеградацш галогенсодержащих соединений представляет значительный интерес.

Большинство токсичных и трудно разлагаемых ксенобиотиков принадлежат к галогенированным ароматическим соединениям, в том числе хлор-бензойным кислотам. Последние, являясь промежуточными метаболитами многих хлорароматиков (включая полихлорированные бифеш-шы), представляются удобной моделью для развития генанализа процессов разложения гало-генсодержащих соединений.

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. К сегодняшнему дню выделены и охарактеризованы по способности разлагать различные хлорированные бензойные кислоты более 30 штаммов микроорганизмов, большинство из которых выделены из окружающей среды (Gliosal et al., J 085; Reineke et. al., 198S: Neilson, 1900; llardman, -10<> 1; Chaudluy and Chapalamadugu. 1901; Mohn and Tiedji, 1092), а некоторые получены при использовании генетических и тшо-пнженернмх методов (Reineke, 19S(>: I.ehvbach et al., 10S4; C.osc-higaiio et al.. 1994). Исследования показали, что большинство выделенных штаммов микроорганизмов, способных разлагать хлорбензойные кислоты, осуществляют отщепление галогена (реакцию дегалогенирования) после разрыва ароматического кольца, и описано только несколько штаммов бактерий, которые осуществляют дегалогенирование на первых этапах до расщепления ароматического кольца (Marks et al., 19S4; Shimao et al., 1080; Fetzner et al„ 1989).

Практически все работы по получению с использованием методов генной инженерии генетически модифицированных штаммов бактерий, способных к деградации хлорсодержащих ароматических соединений, основаны на "конвергентном" подходе:- предложенном группами Кнакмусса и Тиммиса, который основан па использовании распространенного среди бактерий почвы модифицированного opmo-пути расщепления хлоркатехолов п наращивании его ферментами первичных реакций окисления обычных ароматических углеводородов, характеризующихся широкой субстратной специфичностью, (Jeene.s et al., 1982; Reineke, 1086; Timmis et al., 1988). При этом дегалогенирование происходит на глубоких стадиях метаболизма, что может сопровождаться по-

явлением интермедиатов еще более токсичных, нежели первичные субстраты. Другим ограничением является неприменимость указанного подхода к деградации целого ряда соединений, в частности, полихлорированных бифенилов.

Выделение микроорганизмов, способных к отщеплению атомов галогенов от углеродного скелета молекулы субстрата на первых стадиях деграда-тивного метаболизма (раннее дегалогенирование) открывает возможности реализации нового, дивергентного подхода к конструированию рекомбинантных путей деградации галогашрованных ароматических ксенобиотиков путем надстройки предсущесгвующих путей деградации незамещенных ароматиков ферментами прямого дегалогенирования (дегалогеназами).

В 1990-х годах был опубликован ряд работ, в которых изучались механизмы действия ферментов прямого дегалогенирования хлорированных бензо-атов, биохимия этих ферментов, а также работы по клонированию генов, контролирующих такого рода реакции (Groenewegen, 1992; Schmitz et al., 1992; Schölten et al., 1991; Fetzner and Liiigens, 1994).

Основной целью диссертационной работы бьшо изучение генетических систем, контролирующих прямое дегалогенирование хлорбензойных кислот, у трех штаммов почвенных бактерий: Arthrobacter gbbiformis КЗТ-1, Согупе-bacterivm sepedonicum КЗ-4, Pseudomonas cepacia. КЗ-2, а также клонирование генов Arthrobacter gbbiformis КЗТ-1, ответственных да дегалогенирование 4-хлорбензойной кислоты, в клетках E.coli и конструирование гибридного пути разложения 4-хлорбензоата в клетках P.putida КЗ-6.

В задачи данного исследования входило:

1. Изучение генетического контроля деградации хлорбензойных кислот в штаммах Arthrobacter gbbiformis КЗТ-1, Corynebacteriimi sepedonicum КЗ-4, Pseudomonas cepacia КЗ-2, выяснение роли плазмид у данных штаммов в дегалогенировании хлорбензоатов.

2. Клонирование генов, контролирующих дехлорирование 4-хлорбензоата, из грамположительной бактерии A.globiformis КЗТ-1 в клетках E.coli.

3. Выяснение структурной организации кластера генов feb Arthrobacter gbbiformis КЗТ-1, контролирующих дехлорирование 4-хлорбензоата.

4. Конструирование рекомбинантного пути деградации 4-хлорбензоата в клетках P.putida K3-6R.

5. Анализ экспресс™ feiereнов в клетках E.coli и P.putida.

b. Селекция субвариантов рекомбинантного штамма Pseudomonas puti-det K3-6R(pPC3) с повышенной эффективностью дехлорирования 4-хлорбензоата и последующий их анализ.

7. Конструирование и анализ стабильного рекомбинантного штамма P.putida, несущего гены дегалогенирования в хромосоме.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в клетках E.coli клонированы fcb-гены A.globitormis КЗТ-1, контролирующие реакцию дехлорирования 4-хлорбензоата. Эти гены является как первыми клонированными генами ранних дегалогеназ, так: и первыми генами биодеградации, клонированными из грамположительной бактерии. Показано, что в клетках

родительского штамма A.globiformis КЗТ-1 кластер fcb-генов локализован на плазмиде с молекулярной массой 110 тли. Установлено, что данная плазмида имеет высокую степень гомологии (или идентична) с плазмндой из другой грамположительной бактерии Corynelxictcriurn sepedonicum КЗ-4.

Впервые путем клонирования Гс/>-гсноп в клетки P.putida сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4-хлоробензоата, более эффективный в отношении утилизации субстрата в сравнении с природным штаммом A.glodiformis КЗТ-1. Это определило новые подходы к конструированию штаммов микроорганизмов, способных к эффективно!! деструкции и/пли де-токсикацшг различных ктенобиотиков-поллютантов.

В результате селекции на высоких концентрациях 4-хлорбензоата ре-комбинантного штамма P.putida КЗ-бЫ(рРСЗ) впервые получены супердеструкторы 4-хлорбензойной кислоты, способные утилизировать этот ксенобиотик в гораздо больших количествах, чем описанные природные штатвд микроорганизмов.

Путем интеграции fcb-генов в хромосому штамма P.putida K3-6R получен рекомбинантный штамм K3-6R::Tn5-K2GA[Tcr /с£>А1,А2,АЗ], который характеризуется высокой стабильностью признака утилизации 4-хлорбензоата.

Полученные в работе рекомбинантные штаммы P.putida КЗ-6, утилизирующие в высоких концетрациях 4-хлорбензоат, могут быть рекомендованы для создшшя эффективных технологий биоремедиации почв и водоемов от загрязнений хлорароматическими соединениями.

Рекомбина1Гпп>1с штаммы и плазмиды, содержащие fcfr-гены, были переданы и использованы в совместных исследованиях в Центре микробной экологии Мичиганского государственного университета (гЛансинг, США).

Апробация. Основные положения диссертационной работы были представлены на 11 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (г.Самарканд, 1091), на 111 Международном симпозиуме "Pseudomonas" (Триест, Италия, 1()Q 1). на Конференции Американского общества микробиологов "Анаэробное дсталогашрованне" (Атенс, США, 1992), на Съезде Американского общества микробиологов (Атланта, США. 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура"?! объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 146 страниц машинописного текста, включая 2 таблицы и 32 рисунка. Список литературы включает 165 наименований отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные шташш it плазмиды, В работе были использованы еле-дующие бактериальные штаммы: Arthvobactcv glolnfonnLs КЗТ-1, CoryiH'bac-terium sepedonicum КЗ-4, Pseudomoiias cepacia K3-2, Psvudomonus putida КЗ-6 (предоставлены Г.М.Зайцевым, ИМ БАН), E.coli JM109, E.coli HB101,

E.coli DH5aF, Ejooli K802, Ecoli X925 (коллекция лаборатории биологии плаз-мид, ИБФМ РАН); плазмиды: pUC19, pKNl, pRK415, pRK2013, NPL-1, NAH7, pASNl, pDK8 (коллекция лаборатории биологии плазмид), RSFIOIO (коллекция ГосНИИ "Генетика", г.Москва).

Среды и условия культивирования. Штаммы E.coli выращивали на полноценных и минимальных средах (Миллер,1976; Маниатис и др.,1984). Для штаммов Arthrobacter globiformis КЗТ-1, Corynebacteiiiun sepedomcum КЗ-4, Pseudomonas cepacia K3-2, Pseudomonas putida K3-6 использовали среды Kl и K2 (ЗайцевДарасевичД981; Зайцев,Карасевич, 1985).

Конъюгационный и мобилизационный перенос плазмид проводили согласно процедуре, предложенной (Dunn and Gun,saius,1973).

Элиминацию плазмид проводили по методике (Rlieinwald et al.,1973).

Препаративное выделение плазмидньсх ДНК осуществляли по (Marco et al.,1982), щелочным методом (Маниатис и др.,1984), а также методом Поргг-ного и Уайта (Методы общей бактериологии, 1984).

Трансформацию плазмидной ДНК клеток E.coli проводили по (Dagert and Ehrlich, 1979).

Анализ штаммов на наличие плазмидной ДНК, а также обработку рестриктазами, щелочной фосфатазой, нуклеазой Ва131, фрагментом Кленова ДИК-полимеразьг I E.coli, лигазой фага Т4, разделение фрагментов ДНК в агарозном геле проводили, как описано в (Маниатис и др.,1984).

Реакцию ник-трансляции, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, шбридйзацию ДНК-ДНК осуществляли по (Rigby et ai,1977; Southern, 1975).

Получение мини-клеток E coli и включение 355-метионина проводили в соответствии с рекомендациями (Stoker et al.,1984). Диск-электрофорез белков проводили по (Laemmli,1970).

Идентификацию клонов, приобретших способность к дегалогенированию 4ХБК, проводили в среде Kl (Зайцев,Карасевич,1981), свободной от ионов СГ, с добавлением дрожжевого экстракта (Difco) - 0,1 г/л; бактотриптона (Difco) - 5,0 г/л; глюкозы - 2,0 г/л; 4ХБК - 0,2 г/л. Клоны выращивали в пробирках, содержащих 2 мл среды в течение 48 часов. После центрифугирования (10000 об/мин., 10 мин.) в культуральной жидкости определяли содержание ионов хлора (Резников и др.,1970; Florence et al.,1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Генетический контроль деградации хлорбензойных кислот у бактерий A.globiformiis КЗТ-1, Csepedonicum КЗ-4, P.cepacia КЗ-2.

Ранее было показано, что штаммы A.globiformis КЗТ-1, Csepedonicum КЗ-4 и P.cepacia КЗ-2 способны утилизировать хлорбензойные кислоты как единственный источник углерода и энергии (штамм КЗТ-1 - 4-хлорбензой-ную кислоту (4ХБК), штамм КЗ-4 - 4-хлорбензойную и 2,4-дихлорбензойную кислоты (2.4ДХБК), штамм КЗ-2 - 2-хлорбензойную кислоту) (ЗайцевДСарасе-вич, 1981,1984,1985). Общей характеристикой путей деградации в этих штаммах является то, что дегалогенирование происходит на первых этапах метабо-

лизма хлорбензоатов. В результате дегалогенирования образуются: катехол в штамме КЗ-2 и 4-океибетпоат (40БК) в пггаммах КЗТ-1 и КЗ-4, которые подвергаются последующему расщеплению ароматического кольца по ор-Ш(тти. - _____ _

1.1 .Обнаружение плазмид в штаммах A.ghbifonni.s• КЗТ-1. Cscpcdoni-сит КЗ-4 и P.cepacia КЗ-2.

Анализ штаммов A.globifonnis КЗТ-1. C'.scjxdoriicum КЗ-4 и P.ccpnsin КЗ-2 на наличие зкстрахролюео.малыюи ЛИК показал, что все эти штаммы содержат плазм иды. Плазмиды из штаммов A.globiformLs КЗТ-1 (pBNlâ'Ol) и C.glolrit'oniii.s КЗ-ч CpB.Sl.502) имеют одинаковый размер, определенны!) н 110 тпн (рис.1), и являются одними из первых ЕИшшшд, обнаруженных к грам-нилоаштслышх бактериях. Позднее в фамположительной бактерии Arthro-bäcter sp.Sl' также была обнаружена плазлтда (120 тпн). в шторой находились гены, отвечающие за дегалошшрование 4-хлорбеизоата (Schmitz er al.. 1092). Размер плазмиды из штамма P.cepacia КЗ-2 (pBS1503), установленный по электрофоретической подвижности Срис.Г) и методом электронной микроскопии был определен как 12 + 0,5 тпн.

1.2. Плазмидный контроль дегалогенирования 4-хлорбензоата у штамма A.globifomns КЗТ-1.

Лля выяснения возможности участия обнаруженных плазмид в контроле бподсградацни хлорароматических кислот проводили •эксперименты по ади-мпнашт гекпмпд. В результате обработки клеток пггамма A.globif oruiis КЗТ-1 митомпцином С получили ряд клонов, которые утратили способность к росту на минеральной среде, содержащем ч-хлорбензоаг как единственный источник углерода и энергии, и у которых отсутствовала п.шзмпда. Все mi зл ими панты харжгсризовались споахбностью к росту ira среде, содержащей 4-окс.ибен.зоат или .Ы-дпокепбензоат в качестве единственного источника углерода и оперши. Таким образом, было сделано .заключение о плазмпдной локализации генетических детерминантов (/'гЬтепов), контролирующих реакцию дегалогенирования 4ХБК, у штамма A. globifonntb КЗТ-1. В дальнейшем, после клонирования fcb-генов, расположение -этих генов в плазмиде было подтверждено гпбридизаппоннымп экспериментами.

Из экспериментов по алиминащш плазмид из штамма КЗТ-1 следует, что гены, контролирующие дальнейший метаболизм 4-оксибензоата, находятся в хромосоме.

13. Участие плазмиды pBS1502 н контроле деградации 4ХБК у пггам-ма Càepedoiiicuiu К'3-4.

При псследовашш плазмид из шта\шоп A.globifonnvf КЗТ-i и Слоро-donicum КЗ 1 было обнаружено, что эти плазмиды имеют одинаковы!! размер в 110 тпн, и обработка данных плазмид эндонуклеа^шн рестрикции BainHI и Bgll выявила одинаковое распределение рестрикиионных фрагмен-

о

Рис. 1 .Скрининг штаммов иа наличие плазмид. Электрофорез в 0,7% агароз-ном геле. 1 - K3T-l(pBS1501); 2 - K3-4(pBS1502); 3 - 1СЗТ-1ЕЗ(элиминант); 4 - КЗТ-1Е22(элиминант); 5 - K3T-l(pBS1501); 6 - K3-4(pBS1502); 7 - NPL-1 (100 тпн); 8 - NAH7 (81 тли); 9 - pASNl (20 тан); 10 - КЗ-2 (pBS1503); 11 - RSF1010

тов. Вследствие сходства путей биодеградации в обоих штаммах (способность к деградации 4ХБК) и плазмпдной локализации генов дегалогеназы в штамме КЗТ-1 возможно предполагать лока.итацшо в плазмнде pBSI502 генетических детерминантов,контролирующих дехлорирование 4ХБК (2ДЦХБК) в штамме К3-4. Действительно, в дальнейшем было показано, что клонирован-, нал последователь! ux*n> fс7*-гснов из плазмнды pBSI501 гибридизуетея с ДГ1К плазмиды pBS1502. Таким образом, кажется очевидным, что плазмпда pBS)502 участвует в дегаиогегацхшшш по Kjxiiineii мере одного из утилизируемых штаммом КЗ-4 субстратов - 4ХБК.

Подученные данные свидетельствуют о возможном эволюционном родстве (если не идентичности) плазмид pBSl^Ol п pBS 1502 и указывают па возможность горизонтального распространения генов бподстрадацпи между грлмположлтслытымп бактериями, как это установлено для грамотрицатель-ных бактерий (Воронин. TIoii,19S9). Однако нами не было получено положительных результатов при коныогационных скрещиваниях штаммов КЗ-4 м K3T-1ERS (элимпнант).

2. Клонирование и экспрессия feb-remв, кошролируюцщх дегалогени-рование 4-хлорбензоата, в клетках E.coh.

2.1. Клонировшше /сЬ-генов A.globif ormis КЗТ-1 в клетках E.coli.

В клетках E.coli JM109 в мультикопийном векторе pUC19 была сконструирована клонотека ЯаиЗА-фрагментов тотальной ДНК (обогащегаюй плаз-мвдной ДНК) штамма КЗТ-1.

При анализе 400 рекомбшшнтных Ар'-клопов ü.coli ТМ10С| были обнаружены два клона, способных дехлорировать 4-члорбензоиную кислоту Um.Материалы и Методы). "г)тп клопы содержали рикомбпнантные плазмиды. обозначенные в дальнейшем рСАЗ 1 I и рС'ЛЗОЬ, соответственно, которые н придавали клеткам E.coli способ! теть к дехлорированию 4-хлорбш.*ч"шой кислоты ( рис.2). Анализ с использованием метода тонкослойной хроматографии показал, что 4-окспбензойпа:1 кислота является единственным иродгктом рекомбпнаншон конверсии 4ХБК клетками E.coli (рис.3). Таким образом, в составе рСАЗИ и рСАЗОб был(и) клонирован(ы) /б7>-гсн(ы), кодирующий! е) 4~хдорбепзоат-4-ги;Ч'|<жеидазу (дегалогеназу).

Ныло исжазано.что рекомбинангнып штамм 1М10с)(р(.'АЗ 11) способен пе только к дехлорированию 4-хлорбензсша, но и к дегалогенпрованшо t-бром-и 4-йодбензойных кислот, также как и исходный штамм A.globitormis КЗТ-1 (Зайцев,Карасевич; 1981).

2.2. Анализ клонированного /с/)-кластера генов в клетках E.coli.

Данные физического картирования показали, что нлазмиды рСАЗИ и

рСАЗОЬ практически идентичны, поэтому для дальнейшего анализа быта выбрана рСАЗП. Размер клонированной вставки ДНК п.тазмпды р(!Л311 составил 7,4 тпн. Для выяснения минимального размера |[)рагмента ¡(НК, необходимого для сохранения дегалогеназной активности, бььти сконструированы

£1 Kl SI В! г! Gl PI Hill

ДНК A.globlformls KZT1

BamHi. BAP

частичный гидролиз Sau3. элюция фрагментов 3-10 тпн

Т4-лигаэа

H!и PI Gl ¿i

SI Kl £i Bl

кис.2.схема конструирования и карта рекомбинантной плазмиды рСАЗП. Обозначения: EI - EeoRI, CI - Sacl,KI - Kpnî, SI - Smal, BI-BamHT, ZI - Xbal, Gl - Salí, PI-PstI, Ш -Sphl, Iffll-HindlII.

Рис.3. РГдентификация продуктов реком-бинантной конверсии в штамме Е.соИ .1М109 (рСАЗ 11) методом тонкослойной хроматографии. 1 - Е.соИ Ж109 СрСАЗ 11), 2 -E.mil ,1М 109(риС ^.Метчики: 3 - 4ХБК; 4 - 40БК; 5 -3.4ДОБК.

делецнонные производные нлазмнды ¡Я'АЗ 11.

На ошове рестрнкнпонного анализа нлазмнды рСАЗ 1 1 и ее делецион-ных производных, а также анализа нолииептндов. синтезированных в мини-клетках Е.соИ на матрицах полученных рекомбипантных илазмпд (рис;.4), была построена физическая карта клонированного фрагмента ДНК и определена последовательность расположения генов, кодирующих полниепшды с молекулярными машши - 57 к Да, 50 кЛа. 31 к Да и 17 к*, 1а (рио).

Делеционные мутанты рХВЗ и рБХВ54 (рис.5), имеющие размер вставки 4,2 тпн и 3,2 тпн, соответственно, придавали клеткам Е.со11 способность дехлорировать 4ХБК. На матрицах этих плазмвд синтезируются 3 полипептида с молекулярными массами - 57 к!,а. 31 к Да и 17 к Да. Данные результаты свидетельств)юг, чн> псе 3 гена /'(7хЛ1/сбЛ2/с7АЗ требуются для сохранения 4Х15К* (фенотипа и являются структл'рными.

13 дальнейшем. данные о шиичип трех аруктурных генов, контродпру-ющих реакцию дегалогенироъания, были подтверждены и дополнены, когда была определена и проанализирована нуклеотидная последовательность ДНК

12 3 4

66

46- ,

36 - I.

29-

24-

66,24536- \

\

292420,1 - ;

14,1 -

20-

1

Рис.4. Авторадиограмма [358]-те1-меченых полипептидов, синтезируемых в мини-клетках Ех:оИ, содержащих плазмиды: (А) 1 - рЮ9, 2 - [САЗ 11, 3 -рСАЗОб, 4 - рКШ, 5 - рСАЗ 11-60, 6 - рСН1. (Б) 1 - р11С19; 2 - рВБК; 3 -рСН1; 4 - рРХВ54. Электрофорез в 12,5% 808-Г1ААГ.

Слева приведены полипеппщы с известной молекулярной массой: бычий сывороточный альбумин - 66,2 кДа; овальбумин - 46 кДа; глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназа - 36 кДа; карбоангидраза - 29 кДа; трипсиноген -24 кДа; ингибитор трипсина - 20ДкДа;а-лактальбумин - 14,1 кДа.

(4.713 тпн) клонированного в составе плазмиды рСАЗП фрагмента ДНК кпквенс был сделан в Центре микробной экологии Мичиганского государственного ymmepcmeva, США). Основываясь на результатах анализа спкмнса Ii литера-гфных данных-(Schmitz.et al.,1992, ßabbm vi al.,ll>()2), было (делано (ак.мочение, что ироклонироваппые нами гены /V7jA ] .А2.АЗ объединены ту -етрукчурцьш oiiepOH с чрем.ч открытыми трансляционными рамками, коднру-кшшмп по.ншенгпды в следующем порядке: 4ХБК-КоА-лигаза, 4ХБК-КоА-дс-гал<пепаза и -*А1Ж-КоД-тпоэпч;рл'за.

Было обнаружено, что в присутствии ШПТ в среде культивировано.') рекомбпнантного штамма L.co/i (\11()<)(рС'ЛЗ!!) наблюдалось существенное увеличение скорости реакции дехлорирования, и па осноиаппп что го было сделано заключение об участии векторного промотора в транскрипции

тел-тюк. Для того, чтобы проверить клонированы ли и о клане рСА31 1 /со-гены иод собственным промотором. ц*ми были проведены эксперименты по индукции 4-хло|)бензоатом штамма H.coii .JM1 ()с), содержащего плазмпдх р(Л17(). Плаз.мида рС'Н7() содержит ich к 1А2АЗ гены, переклонированные из рСЛЗП, л ориентации, противош¡ложной щюмотору лактозного онерона, что исключает возможность экспрессии этого гена и его индукции 4-хл<ц)бен.«)а-том в отсутствии собственного регуляторного участка. Результаты экспериментов указывают на наличие в клонированном фрагменте ДНК собственных промоторных последовательностей ДНК, эффективно утилизируемых транскрипционным аппаратом Е.соИ.

\па.пн деленионных вариантов позволил нам юкализова гь (Wich па генетической карте рСЛЗП (рш.5).

!. \ Анализ эффективности де.хдорпровани.ч --\!!1\ рскомбинан тцыми штаммами L'.ioii.

,Iia проверки зффектпвности жспрссеии клонированных п амнлпфпцп-роканпы\ /"гЬл'спон в /•.'.со//. рекомГншаптные штаммы /:xdh IMl()li(p< Л 1 ! ) е. .IM i П()(р('Н 1 ) (рис .51 выращивали н прпсептвин различных концентрации 4ХБК. Как видно из Рпс.О, при концентрациях субстрата до 0,5 i/л наблюдается полное дехлорирование 4ХБК клетками рекомбинантных штаммов. После достижеи!!«! лом» пороы наблюдаете а резкое падение эффективности дехло-рпрованн.ч. вплоть до полного исчезновения.

Следует отметить, что именно при кришческих ишцешрацпл \ !\Г>к (0,5 г/л) наблюдается существенное падение плотности культуры, nj)n дальнейшем повышении концен'1])ации субстрата уровни накопления биомассы но (вращаются к исходно^ В контрольном эксперименте обнаружено, что при иырщцпваппп к.клок 1М1()о(рЛ ( 10) в присутствии различных доз АБК наблюдается аналогичное падение уровня накопления биомассы с погледмю-шим его частичным восстановлением. Однако паление приходится в данном сл>чае на Си».иг »накис концентрации .1\1>К в сравнении с (ч-кимбнпаигными штаммами, что может быть объяснено тем, что в последнем случае токсическое действие субстрата нейтрализуется в результате экспрессии fcl>-генов.

Gl

S3A BI KIt PI

:i KI t P

iii lr.

BII HI XI XI Gl i < 1 1 1 1 1 1

P&c Pfcb fcbM fcbA2 fcbA3 57kDa 31kDa !7kDa

LI Gl BI Klj^PI LI LI

Pkc

fcbR 5QkDa

HI i

S3A

fcbAl,A2,A3 BI

BI

fcbAZ,A3

PI

PI

fcbAZ,A3

XI

XI -i-

KI

fcbAZ,A3

fem

- XI

SntaI,Bal31

febAi.A2.A3

fcbAY

XhoI,Bal31 - BII

Gl

BI I S3A

—^4-H pCA311 Fcb1

fcbAi,A2,A3

7 7,4 Kb

PR

BI

BI

fcbR'

pCHl, рРСЗ Fc b'

PCBF27 Fcb"

pCB4 Fcb"

pPP12 Fcb'

pCBPG Fe Li '

pKXS7 Fcb"

pKX: Fr"

рХВЗ Fcbc

pXBll Fcb"

PFXB54 Fcbc

J,

Рис.5. Физическая и генетическая карты рекомбинантиой плазмиды рСАЗ 11 и ее делеционных производных. Обозначения: EI - EcoRI; CI-SacI; KI-Kpnl; SI - Smal; BI - BaraHI; ZI - Xbal; Gl - Sali; Pl-Pstl; Hl - SphI; ШП - HindlU; LI - Bgll; XI - Xhol; BH - BssHI.

Рис.6 Эффективность дехлорирования 4ХБК рекомбпнантпымн штаммами (A) E.coli .Ш109(рСЛ31 Ij ti (Б) E.coli Ш109(рСШ). Клетки выращивали в течение 48 часов в присутствии 4ХБК в различных концентрациях и определяли содержание свободных ионов СГ в культу-ральнои жидкости (см. Материалы и Метода). Показана зависимость эффективности дехлориржтия 4ХБК (х) or концентрации субстрата в феде роста. Представлены ростовые характеристики рекомГмшаптных штаммов (*) и штамма E.coli ,!M109(pUC19) (+) в приелтепиш различных концентраций 4ХБК.

2.4. Индукция экспрессии fcb-генов 4-хлорбензоатом в клетках E.coli.

Ранее было показано, что 4ХБК является индуктором пути деградации у штамма Aitlirobacter ghbiformis КЗТ-1 (Зайцев,Карасевич,1981). Нами было установлено (см.раздел 4.2.2.), что клонированный в составе рекомбинант-ной плазмиды рСАЗ 11 фрагмент ДНК кодирует полипептид с молекулярной массой - 50 кДа, который не является необходимым для проявления дегалоге-назной активности. Для выяснения роли этого полипептида в экспрессии fcb-reiюв были проведены индукционные эксперименты с отмытыми клетками штаммов E.coli JM109(pCA311) и Ж109(рСН1). Как следует из этих опытов, в отмытых клетках штамма E.coli Ж109(рСА311) уровень 4ХБК-дехлорирующей активности зависит от того, выращены были клетки в присутствии 4-хлоробензоата или в отсутствии его (рис.7). С другой стороны, не было замечено существенного различия в активностях дехлорирования

С1,мг/л/мг сухой биомессы

Рис.7. Скорость накопления ионов СГ в фосфатном буфере рН 7,0 клетками штамма Ж109 (рСАЗП), выращенными в присутствии (1) и отсутствии (2) 4ХБК.

1 -

-1-1--I-1

О 50 100 150 200

минуты

-в~ 1 -Й~2

для штамма Е.соИ Ж109(рСН1) при аналогичных условиях. Так как плазми-да рСН1 является производной плазмиды рСАЗП, и в последовательности ДНК вставки этой плазмиды отсутствует ген, кодирующий полипептид с молекулярной массой - 50 кДа, можно предположить, что данный полипептид является регуляторным фактором (/сбК.), участвующем в активировании 4ХБК-дехлорирующей активности в присутствии субстрата.

Дяя того, чтобы подтвердить это предположение, был проведен компле-ментационный эксперимент. Предполагаемый регуляторный ген 1'с!>}\ был

субклонирован в векторе pUC19. Полученная плазмида pKXS7 была совмещена в /гат-положешш с пдазмидой рРС'З (рпс.8. раздел 3.1). несутцей структурные fchA 1 .Д2.АЗ гены (плазмида рРС'З содержит вставку ЛПК, аналогичную ~ ¡тлпзмпде рС'Ш). Полненный рскомбинантныи штамм liroit )М 1Ol)(pP( '3+pK\S7) был исследован в сргвиешш со штаммом JMH)O(pPCT)'в" опытах с отмытыми клетками. Как след} ет из шкп чснных данных, мы не наблюдали существенных различий в активностях дехлорирования между IM 10<'(рК 3) клетками, выращенными в присутствии и отсутствии 4ХВК, тогда как ишшшбельный характер реакции дехлорирования наблюдался, котла в ьлнка.ч h'xoli 1М10Ч ирис утствовали обе плазмида (pPC3+pKXS7). Таким образом, можно сделать заключение, что /r/)R ген вероятнее всею действительно является регуляторным фактором, действующим в traits положении но отношению к слрукпрцьш fcbAl Л 2,A3 генам.

3. Клонирование н экспрессия /c/j-генов A.globii'ormiv K'iT-1 в клетках P.putula. конструирование гибридного пути деградации 4-хлорбен.зо-ата.

Почвенные грамотрицательные бактерии (и первую очередь рода I'scu-domonas) обладают огромным метаболическим потенциалом; особенно ценным является их способность к утилизации широкого спектра органических соединений, включая токсичные ксенобиотики, в том числе галогенированные. ''>го свойство позволяет использовать нсендомонады для создания штаммет-дест-р\кторов с расширенным спектром утилизации токсичных соединении ттем

К11!1СТрМ1рОВаНПЯ гнбрилны.ч МС'ТабоЛМЧССКПХ livicil I ¡1С ПОЛЬ >,ОВа!!НС\! хнлодок генепы! и гонноп инженерии (Ьоринпн.Цопл''V): Reineke, 1(|V>: riminis е! ai .1 "хм

3.1. Конструирование рекомбшшнтпото штамма P.pitlkbi. способного к jxktv на 4-хлорбензоате.

И клетка\ I'.xoh l\ll!)(.' в векторе ( широким кр\п>м хозяев рКК4 15 (Keen,1988) была сконструирована рскомбииантнан плазмида р|Ч 3. юдержа-шая структурные гены fc/)Al,A2,A3 (¡)ис.8). Из клеток рекомбинантноп» штамма JM 1 (МрРС') плазмида была мобилизована с помощью плазмиды pRkiOla в клетки рецппнентното штамма P.piitkLi K4--0R (l\i!'), способного к полному окислению 4-окспбензоата, но не 4-хло[>бен.«>аы (Карасллшч, >ап -цев. 1984)' (рис.9).

После высева конъюгацнонной смеси па селективную среду, содержа-ю н качестве едшитт-шин'о источника углерода и ->н?ргии 4-хлсмтбензоат, а также тетрациклин (10 мкт, мл), с частотен! менее !'Г" по.чнл.чдпе ь ДХБК'Тс'-колонии, lice, проверенные рекомбинаншые клоны содержали плаз мпд\ (рРСЗ). Эксперименты по выращиванию в СТ -свободной среде (см.Ма-¡ерналы п Метод:,!) в присутствии возрастающих концентраций ¡ХБК в среде показали, что за 48 часов роста рекомбинантный штамм КЗ-оК(рРСЗ) пол постью дехлорирует 3.5 г/л субстрата в сравнении с 1,5 г/л в случае роди-

HiiiHipiaizi

EIKISIBIZIGIPIHIHIII

Kl

вТЦ Ql f . HI Hill

HISlz,

alGI EooHV Smal Apai

tul Smal

/

трансформации E.col! JM1O0

BamHI Kpni

О 8a,Q1 Ul P»t I

ZIGIPIHIHIII

M.S.C.

PI HI Hill HI PI Ql 21 Bl SI Kl El

13

'12/

14 1

P ~P 7ot> lea

11

10

Dial

Л

(1сьА\гр тсг\ з

рРСЗ

U.7 TOE

bhr

Sal Ql " EooRV • Smal

.Stul "Smal

мобилизация в P.putlda KZ6R

m.s.c:

SalGI -EcoRV -Smal

Xmnl

Oral

Рис.8. Схема конструирования и карты рекомбинантных плазмид рРСЗ и рРСЗ-4. Обозначения: Ш - EcoRI, CI - SacI, Kl - Kpni, SI - Smal, BI - BamHI, Л - Xbal, GI - Sail, PI - PstI, HI - SpliI, НШ -HindHI.

соон соон

fcbAlA2AЗ \ З-кето--^ 1 -^ I -^ здипзтный

СООН ^ путь

а' ОН а ОН б СООН

4ХБК 40ЕК 3.4Д0ЕК ЗКМК

РпсЛ. Тибридный путь разложения 4-хлорбензоата рекомбпнант-ным штаммом Р.рий(1а КЗ-61\(рРСЗ). Обозначения: а-4-хлорбензо-ат-4-гидроксилаза; а - 4-оксибензоат-З-гидроксилаза; б - 1Г))отокатехоат -3.4-диоксигеназа; 4ХБК - 4-хлорбензоат; 40БК - 4-оксибшзоат; 3.4ДОБК - 3,4-диоксибен:юат; ЗКМК - 3-карбокси-цис. цис-муконовая кислота.

тельского штамма КЗТ-1. Таким образом, внесение Гг/)-генов в штамм, утилизирующий 4-оксибензоат, привело к образованию гибридного нути деградации 4-хлорбензоата путем вертикального наращивания предсуществокавшего пути.

Аналогичные эксперименты по получению гибридного пути разложения 4ХБК были описаны в 1994 году (ОжсЫдапо ег а1.,1994). В этой работе были использованы клонированные в космидном векторе 4ХБК-дегалогеназные гены пч штамма Ртк1апюгт хр.СВЧЗ (,Ч)уагс1 е! а1.,1 а « качестве реципиента брали грамотрипательный штамм Т1, способный расти на 4()И\ при Д1-ннтрпфпнпр>то1цп.\ \словпя\, но не па 4\НК. Полученный реко.мбннанпып шгамм Т1-р1.'К45-10С приобрел способность расти на 4-\дорбензоате.

3.2. Получение и характеристика производных штамма Р.риСиЫ КЗ-О(рРСЗ). адаптированных к высоким концентрациям 1\ЬК.

Яга того, чтобы пол^ 41 пъ более д|)фектпвио утилизирующие 4\1!К субклоны рекомбинантного штамма Р.риы!» КЗ-Ы-ЦрРСЗ), нами были предприняты -эксперименты по адаптации штамма к высоким концентрациям 4-\\юрбензоата. Так, путем повторит пересевов рекохтбштантного штамма КЗ оК(рРСЗ) на постепенно повышающиеся концентрации 4\бК (от 1 до Юг/л) были получены варианты, характеризующиеся супер-экспрессией /сЬ-генов, которая проявлялась в том, что скорость дехлорирования и концентрация утилизируемого 4ХБК у этих вариантов была в 2-3 раза выше, чем у штамма К'З-ьК(рРСЗ). Наиболее эффективное фенотиттическое выражение функции дехлорирования наблюдалось у штамма КВ-Ы-ЦрК'З-10), адаптированного к росту на Юг/л 4ХБК, который полностью минерализует до о г/л 4-\'лорбен.зоата п]>и росте на минератьной среде.

Интересен тот факт, что все ва])папты, адаптированные к высоким концентрациям 4ХБК, характеризуются более высокой степенью стабильности поддержания плазмиды в клетках по сравнению с исходным штаммом

- IS -

K3-6R(pPC3): так у штамма K3-6R(pPC3-10) до 90% проверенных клонов сохраняли фенотип 4ХБК*Тск (после 20 генераций при выращивании в неселективных условиях), в то время как у штамма КЗ бК(рРСЗ) - только 50%. Проведенный нами рестрикционный анализ плазмид из всех адаптированных вариантов штамма K3-6R(pPC3) выявил во всех случаях наличие делеции размером 3 тпн в векторной части плазмиды рРСЗ (рис.8). Основываясь на этом факте, можно предположить, что повышение стабильности поддержания плазмид в клетках адаптированных штаммов, связано со структурными изменениями исходной рекомбинантной плазмиды рРСЗ.

Однако реальный путь достижения генетической стабильности - интеграция желаемого гена в хромосому реципиента. С этой целью нами были проведены эксперименты по конструированию штамма, содержащего feb-гены в хромосоме P.putida K3-6R.

3.3. Получение и характеристика рекомбшшнтного штамма P.putida K3-6R::Tn5~K2GA[Tc', /сШ,А2ДЗ].

Для этой работы был выбран вектор pDK8, который содержит модифицированный транспозон Tn5-K2GA(Tcr) и способен к мобилизационному переносу в клетки грамотрицательных бактерий, отличных от E.coli, но не способен к стабильному поддержанию в них. Сконструированная в клетках E.coli JM109 плазмида pCDK4 (рис.10), содержащая структурные fcb-гены, была мобилизована в штамм P.putida K3-6R. При селекция трансконъюгантов на среде, содержащей тетрациклин и 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии, был получен рекомбинантный штамм K3-6R::Tn5-K2GA[Tcr fсЛА IА2ДЗ]. Полученный штамм характеризовался высокой стабильностью признака 4ХБК+ независимо от селективных или неселективных условий. Отсутствие плазмиды в клетках данного штамма позволяет предположить, что feb-гены встроены в хромосому.

Нами был проведен сравнительный анализ эффективности деградации 4-хлорбензоата полученного штамма и плазмидных вариантов штамма K3-6R. Результаты показали, что за 20 суток штамм полностью утилизирует до 4 г/л 4ХБК. Эта величина сравнима с таковой для штамма K3-5R(pPC3), но много ниже для адаптированных вариантов последнего. Таким образом, с одной стороны, введение генов дехлорирования в хромосому привело к стаби-лизаци проявления функции, но с другой стороны, так как в хромосоме fcó-гены находятся в единственной копии, плазмидные варианты штамма P.putida K3-6R обладали более высокой эффективностью дехлорирования 4ХБК.

i трансформация

I E.coü JM109

Tn5-2GAlfcbAt.A2.A3l

мобилизация в P.putída KZ6R, интеграция в хромосому

TnS-2GAlfcbA1,A2,A3l

Рис.10. Схема конструирования рекомбинантного штамма Р.pulida K3-6R::Tn5-K2GA[Tcr, /сЬЛ1,А2 ,АЗ].

ВЫВОДЫ

1. В клетках штаммов грамположитеяьных почвенных бактерий - деструкторов хлорбензойных кислот A.gbbiformis КЗТ-1 и Csepedorácum КЗ-4 обнаружены плазмиды с молекулярной массой 110 тон. Эти плазмиды имеют высокую степень гомологаи.

2. Плазмида штамма A.gbbiformis КЗТ-1 pBS1501 содержит гены (fcb), контролирующие первый этап пути деградации 4-хлорбензоата (дехлорирование) до 4-оксибензоата, дальнейшее разложение которого контролируется хромосомными генами.

3. Плазмида штамма Сsepedoniaun КЗ-4 pBS1502, содержащая гены, гомологичные fcb-тенш из штамма A.globifonnv< КЗТ-1, участвует в дехлорирован!® по крайней мере одного из утилизируемых субстратов - 4-хлорбензоата.

4. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A.ghbiformis КЗТ-1, контролирующие реакцию дегалогенировання 4-хлорбензоата. Три структурных гена fcb А1 ,fcb А2 fcb A3, организованных в оперон, кодируют полипептн-дьг с молекулярными массами: 57кДа, 31кДа, 17кДа.

5. Экспрессия fcb-оперона A.gbbiformis КЗТ-1 индуцируется 4-хлор-бензоатом. В составе клонированной последовательности ДНК, содержащей структурные fcfr-гены, обнаружен регуляторный ген (fc6R), осуществляющий регуляцию по типу позитивного контроля.

6. В клетках P.putida КЗ-6 сконструирован рекомбинантньгй путь деградации 4-хлорбензоата. Получены варианты рекомбинантного штамма V.pulida K3-6R(pPC3), характеризующиеся суперэкспрессией /сЬтенов.

7. Путем интеграции fcb-генов в хромосому штамма P.putida K3-6R получен рекомбинантньгй штамм K3-6R::Tn5-K2GA[Tcr fcbAI ,А2А'з\, который характеризуется высокой стабильностью признака утилизации 4-хлорбензоата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. M.GZaitsev, T.V.Tsoi, V.G.Grishenkov, E.G.Plotnikova and A.MJ3oronin. Genetic control of degradation of chlorinated benzoic acids iu Arthrobacter glcr biformis, Coryriebacterium sepedonicum and Pcepacia strains. FEMS Microbiol. Lett., 1991, v.81, pp.171-176.

2. T.V.Tsoi, GJviZaitsev, E.G.Plotnikova, lAKosheleva and А.МВопшш. Cloning and expression of the Avthrobuctcr ghbiformis KZT-1 fcb gene encoding dehalogenase (4-clilorobenzoate-hydroxylase) in E.coli. FEMS MicrobiolLett., 1991, v.81, pp.165-170.

3. Плотникова Е.Г., Цой T.B., Грищенков ВГ„ -Зайцев Ш., Нагаева МБ. и А.М.Воронин. Клонирование гена дегалогеназы fcbA Artluobacter globiformis и конструирование гибридного пути деградации 4-хлорбензоата в Pseudo-

топни putida. Генетика, 1991, т.27, стр.5 S9-597.

I. Плотникова 111'.. Мн.хайлюк Н.В.. Бухтиярова М.Г., ЗаГщев Г.М., Гри-шенкои КГ., ((он Т.К. и Воронин A.M. Гетеродогическая 'жсгфессид генов Arthroharter globi fornix КЗТ-1. контролирующих раннее дегалогенировашю хлорсодержащнх ароматических ксенобиотиков. Втораir Всесоюзный Симнози->м ^Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". г.Самарканд. Тезисы докладов, Москва, 1901, стр. 153.

5 ТА .Tsoi. E.G Piotnikova, О.М./.аИч;\, I.A.Kosiieleva, V.G.Giishenkov and AJVLBoronin. Constraction of the recombinant Pscudoimnan puLidd .strains capab-ie of effective degradation of 4-chlorobenzmte and dechlorination of 4-chlorop-henol. ¿-chlomanilin and their constituent alkylated derivatives. Third inlemation symposium on Pseudomonas biology and biotechnology. Miramare-Grigiidiio Trieste, Italy, 1901. Abstracts, p.171.

6. T.V.Tsoi, E.G.Plotnikova, S.G.Bezborodnikov, G.MZait.sev. AAlBoronin, J.R.C'oie and JLM.Tiedje. Arthmbacter globiformin stiain KZT-1 genes responsible for hydrolitic dehalogenation of 4-clilorobenzoate. ASM Conference:"Anaerobic dehalogenation and its environmental implications", Athens,USАД 992. Abstracts, p. 10.

7. T.YTsoi. E.G.Plotnikova, S.G.Bezborodnikov, G.M.Zaitsev. IAJiasheleva,

A.M.Borornn. J.R.C'oie ami i.M.Tiedic. Arthrohnctvi globifovmis fch genes speci-f\ng hydrohlii para-dehalogenation of J-dilorobenxoate. ln:"('enter for microbial т>1о«\ Research f Hidings. Fall 1992". pp.1 I 1 -1 13. HJ.an.sing. I S-Y

\ ТА .Tsoi. \G Bezborodtiiko\. K.G.Hotnikova and J.R.Cole. Tile haloben xoale dehalogeuatioti fch opetou ol' Ai throhnctci' i'lolufonitis l\ZT-l: Organization. e\)Mession. legnlation. and e\olution. °3th Geneial Meeting of ¡he .ASM. Atlanta. I'SA.IOOT Abstracts, p.394.

Техническая редакция "Пермского медицинского журнала" Тираж ЮО экз.