Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Клональное микроразмножение в селекции сахарной свеклы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Клональное микроразмножение в селекции сахарной свеклы"

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ - АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

РГ8 ОД

Казахский научно-исследовательский институт Н ¡^¿8 земледелия им. В.Р.Внльямса

На драгах рукописи

АХМЕДОВА ЖАННА В АЛ ИДУ Л Л ОБ НА

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

06.01.05 "Селекция и семеноводство" 03.0023 "Биотехнология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п.Алмалыбак, 1996

Работа выполнена в лаборатории селекции и семеноводства сахарной свеклы Казахского научно-исследовательского института земледелия им. В.Р.Вильямсав 1989-1992 гг.

Научные руководители: академик КАСХН И ААбугалиев,

кандидат сельскохозяйственных наук М.К.Кожахметов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ЕШШаханов,

кандидат биологических наук М.Б Амерханова

Ведущая организация: Казахский государственный национальный университет им. Аль-Фараби

Защита состоится " У" Ш&Щ_ 1996 г.

в 4И часов на заседании специализированного совета Д 55.05.01 при Казахском научно-исследовательском институте земледелия им. В.Р. Вильямса по адресу: 483133, Алматинская область, Каскеленс-кнй район, пос. Алмалыбак, КазНИИЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь специализированного ^

совета, доктор биологических наук ^¿^/^/у/У^.Б.Рамазанова

-I-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность темы. Клональное микроразмножение применяется в селекции сахарной свеклы для сохранения и размножения ценного материала ( Ильенко И.И., 1983 ). Сахарная свекла, являясь перекрестноопыляющейся культурой, плохо завязывает семена при строгом самоопылении. Для сохранения и размножения уникальных генотипов, а также генотипов, вылепляющихся в процессе инбридинга ( инбредных линий ) разработаны различные приемы вегетативного " размножения элитных "растений сахарной свеклы» такие как укоренение отрезков листьев, частей корнеплода, черенков"генеративных побегов, культура многолетников и клональное микроразмножение; Клональное микроразмнояение, в сравнении с традиционными методами вегетативного размножения, обладает рядом преимуществ: I) более высокие коэффициенты размножения; 2) возможность брать экспланты из растений, находящихся в разных фазах развития; 3) экономия площадей теплиц, занятых маточными и размножаемыми растениями; 1) размножение растения, которые с трудом или совсем не размножаются обычными опособами ( Муромцев Г.С. и др., 1990 ).

Несмотря на существенный прогресс а клональном кикрораэ-множении сахарной свеклы все еще требуется должное изучение вопросов введения различных зксплантов тканей свеклы в стерильные условия, влияния особенностей сорта и экспланта на коэффициент размножения, причин слабого почкования и укоренения отдельных генотипов, что определяет актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является определение эффективных методов клоналыюго микроразиножения сахарной свеклы и разработка методически* приемов клонирования & уНю селекционного материала.

В соответствии с этим для исследования били поставлены следующие задачи:

1) определить оптимальный способ стерилизации раатитвльмого материала, оптимальный эксплант ( происхождение, Возраст, размер ) для клепального микроразикоаения;

2) установить возможность размножения & и£Ьо различных

генотипов;

3) изучить влияние компонентов питательной ореды ( фигогормонов, витаминов, адсорбента поливинилпярролидояа, еахсрозв, ми-

-генеральных солей, агара ) на процессы морфо- и органогенеза £л

4) изучить каллусообразующую и регенерационную способность разных топов оксплантоз и генотипов сахарной свеклы;

5) для характеристики каллусных тканей исследовать компонентный состав и относительную активность изопероксидаэ;

6) провести идентификации регенерантов по фенотипическим

и биохимическим ( компонентный состав и относительная активность изопероксидаз ) признакам.

Научная новизна работ. Установлено, что близкие по происхождению линии сахарной свеклы имеют схожие значения по основным показателям, характеризующим процесс микроразмножения - коэффициенту размножения и частоте корнеобразования. Выявлено отсутствие взаимозависимости основных показателей я их зависимости от фергильности или стерильности линий.

разработаны модифицированные питательные среди для каждого этапа кикроразмножения сахарной свеклы.

Показана идентичность электрофоре отческих спектров катодных изопероксидаз однотипных и- одновозрастных тканей регенерантов и растений исходной формы как свидетельство относительной генетической стабильности при микро'размножении.

• Установлена специфичность изопербксидазного спектра каллуса сахарной свеклы на разных стадиях развития, различного, происхождения, - ' '

Установлена идентичность регенерантов, полученных методом клокаяьного микроразмножения, и растений исходной формы по основном фенотипическим и сслездионно-ценным признака«»

Практическая ценность работа» Разработаны методические приемы клонирования сахарной свеклы в условиях «г 'Мю ; Эти дшнше. способствуют совершенствованию технологии никроразнножения, которая иожзт с-уопехс' использоваться в селекционных исследованиях.

Результаты исследований по культуре халлусной ткани служат оснозоЯ-для дальнейшего изучения'халлусообразуюдеЯ и регенграци-. ониой способности-генотипов сахарной свеклы и разработки методических приемов массового получения регенерантов из каллусной ткани.

Получены и переданы в лабораторию селекции и семеноводства сахарной с^клн КазНИП земледелия им, В.Г. Альянса'растения-ре-ггнеранты, лрелстаслнсгдие интерес для селекционно-генетических

исследований.

Апробация работы. Основные положения диссертационной, работа доложены на Республиканской научно-теоретической конференции "Молодые учение - сельскому хозяйству Казахстана" ( 199С ), на П Ме иду народной /'чк^еренцип "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" ( 1993 ); а также изложена в тезисах докладов Республиканской конференции "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане" ( 1990 ), Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии ( 1991 ), Международной научно-практической конференции молодых ученых и социалистов по актуальным проблемам интенсификации сельского хозяйства ( 1993 ), П Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" ( 1993 ), а также на заседаниях методической комиссии КазНИИ земледелия им. В.Р= Вильяме а.

П^^пшхции, По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ. ..... ,. -_

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, 5 глав, вызолов» практических рекомендаций. Список литературы включает 237 найме но ваий К. Текст иллюстрирован 29 таблицами и 12. рисунками.

ИЛ ТЕРЛА Л И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал, йоходным материалом служили фертильные и стерильные линии сахарной свеклы в количестве 33 генотипов, различающихся хозяйственно-ценными признаками, происхождением, интенсивностью инбридинга ( у самоопыленных линий ), используемые в селекционной практике лаборатории селекции и семеноводства сахарной свеклы КазНИИ земледелия им. В. Р. Вильяме а.

Исходный материал выращивался в оптимальных полевых ( семенники ) и лабораторных ( проростки ) условиях» Семенники выращивались в Каскеленсяом ОПХ КазНИИ земледелия на пЬливе по общепринятой агротехнике ( 1989-1991 гг. ). Проростки «получали в лабораторных условиях проращиванием оемян в.растильнях на,фильтровальной бумаге ( Филатов П.А. и др., 1985 ).

Методы. Клональноо микроразмножэние осуществляли методами: I) активацией развития пазушных меристем ( Аигрханова М.Б., Ра-хикбаев И.р., 1986 ); 2) образованием адвентивних побегов из

клеток экспланта ( Хасси Г.,1987 ); 3) получением регенерантов из индуцированной каллусной ткани ( Славова Й.В., 1981 ).

В зависимости от цели культивирования использовали различные модификации среды Мурасиге и Скуга {Muia^kL^i X, Skoog 1962 ) - среда для 1-го этапа микроразмножения, среда для П-го этапа микроразмножения, ореда для Щ-го этапа микроразмножения, среда Для каллусогенеза, среда для индукции побегообразования из каллуса.

Оптимальное стерилизующее вещество для растительного материала и его концентрацию подбирали с использованием растворов даацида, перекиси водорода, этанола, хлорной извести, нитрата серебра.

Пробирки с эксплантами для микроразмножения помещали на свет при температуре 23+ 2*С; для индукции каллусогенеза - в термостат при температуре 29 *С. Индуцированную каллусную ткань культивировали на свету при том же режиме, что и эксаланты для ки кро раз м но m кия. Растения-регенеранты высаживали в смесь почвы и перегноя (3:1).

С целью идентификации корнеплода регенерантов и исходных форм, проведшие яровизацию в течение 2-х месяцев в холодильнике при температуре и освещении, выращивали на полевом стационаре отдела биотехнологии КазНИИ земледелия им. В.Р. Шльямса.

Степень'завязывания семян определяли по З.С. Слвсаренко, С.Т.'Бережно ( 1976 ).

Лабораторную всхожесть семян определяли по методике. С. Г. Берекко с соавт. ( 1986 ) проращиванием в растильнях на фильтровальной бумаге.

Для определения качества пыльцы использовали временные давленые препараты; приготовленные по общепринятом методикам ( Кап-тарь С.Г., 1969; Ярмолюк Г.И., Ширяева Э.И., 1982 ), и окрашенные 2-$-ным оцетокармином.

Биохимическая оценка полученных регенерантов, а также кал-лусных тканей проводилась в лаборатории физиологии и биохимик растений КазНИИ земледелия по Ü.B. Перуанскому, Б.Ш. Адамгазино-вой ( 1985 ) исследованием активности катодных, изоперрксидаз методом электрофореза в ПААГ ( îUvij Й. % 1964 ), Относительную активность изопероксидаз рассчитывали по методу £. Н. ¡йц ( 1973 ).

Матекатаческув обработку результатов исследований проводили по H.A. Плохинскону ( 1970 ) и Б.А. Доспухону ( 1973 ).

результат исследовании и их обсуждение

С1ЮСОШ КЛ01МЫЮГО МИКРОРАЗМЮЖЕНИЯ САХАРНОЙ

СБЕШЫ • ■

размножение активацией развития пазукных меристем проростков. Результаты исследования показали, что при никрораэнножеиии данным способом возможно получение достаточного количества клонов. Использование в качестве оксплантов 7-дневных проростков позволяет добиться эффективного размножения, за счет интенсивного образования пазушных побегов. Мы наблюдали неодинаковую выживаемость оксплантов на питательной среде при разных способах сте-.~ ' рилизации проростков. Наиболее высокий выход стерильных проростков (. И0# ) обеспечивала стерилизация раствором нитрата оерейра в 0,1 ой концентрации при экспозиции I час. Также, наблюдали сортовые различия при одинаковых способах стерилизации, что согласуется с данными В.В. Знаменской, Т.П. Жужжало вой ( 1987 ). " Самая низкая выживаемость ( о - 60 % ) наблюдалась у оксплантов : линии СОЛИ—5, вероятно из-за сильной загрязненности семян взяэдх для исследования. '

&ло отмечено варьирование коэффициента размножения (числа побегов на эксплант ) у разных генотипов при одинаковых уаловаях' культивирования - от I : 3 у линии Ср-20 до I :Ю у линии* СЮАН-5. Аналогмчные данные сообщаются в работах как по сахарной свекла ( Ильенко И.И., 1983 ), так и по другим культурам - садовой землянике ( Захаренкова И.А.;. Сучкова Н.К.., 1988 ), картофелю С Смо- -ленская С.2., 1992 ). ...

Формирование корней у размноменных побегов зависало от генотипа и содержания ауксина в среде. 'Исследования показали, что необходим выбор типа и концентрации, ауксина для хаждого генотипа. При использовании двух типов ауксина ( И УК и НУК ) для линии Р09-20 самая высокая укореняемость наблюдалась на среде с 2 мг/л НУК ( 42,1 % ), для линии Ср-33 - с 2 кг/л КУК С 33,3 % ). На было установлено четкой зависимости иежду длиной корней и концентрацией в среде ауксина, вызывающего их образование.

При использовании в качестве исходного материала сильно заг-грязненинх се млн наблюдали вторичное заражение оксплантов ори последующем субкультивирозаиии ( до 50 - 69,7 % ). В связи о этггм» рекомендуется, тестирование исходного материала на зараяеннооть медленно растущими патогенами, для чага необходимо предварите гь,-

-О- 1

ное культивирование на питательных средах, лишенных дорогостоящих «¡оставляющих»

Размножение активацией развития пазушных меристем цветоносных побегов. Проведенные нами, исследования показали, что даяний способ микроразмножения является достаточно эффективным. При использовании в качестве эксплантов верхушечных частей генеративных побегов достигается высокий жход стерильных культур. Размножение происходит за счет интенсивной пролиферации пазушных побегов.

.При определении оптимального способа стерилизации для верхушек генеративных побегов хорошие результата были получены при ступенчатой стерилизации растворами хлорной извести ( 20 #-ный ) и перекиси водорода ( II %-т№ ) - 95,6 % стерильных ¡эксплантов. Достаточно высокий процент выживаемости эксплантов - 94,3 % и 93,8 % - наблюдали при стерилизации с применением раствора Нитрата серебра в 0,1 $-ной концентрации при экспозиции >0 мин. и • 60 мин. соответственно.

При одинаковых способах стерилизации исходного материала отмечены небольшие генотипические различия. Выживаемость разных генотипов при введении з культуру иг ЫНо варьирована в нешироких пределах - от 70 % до 100 %.

Рост верхупек цветоносных побегов на среде для перБого ¡эта-па микроразмкожения зависел от содержания в ней фитогормонов. Наиболее интенсивный рост у четырех генотипов ( А1,АЗ,А4,А5 ) наблюдали при добавлении в среду 0,2 -0,5 мг/л БАИ или 0,05 мг/л БАЯ + I мг/л гиббереллша. За двенадцать дней культивирования оксплалты вытягивались, приобретая пальмовидную форму. Верхушечный "куст" срезали и переносили на среду для второго этапа мик-роразмнокения, содержащую 0,05 мг/л БАП,-на которой происходило непосредственное размножение путем образования пазушных побегов. Проводили, такне, мйкрочеренкование вытянувшегося побега. Коэффициент размножения варьировал от I : 2 ( линия 986 ) до I : 7 С линия Пр-41). Вторичное заражение эксплантов при субкульти ви-роваиии было незначг: :льным (0 - 15,3

Считается, что керистемное происхождение побегов должно 1 обеспечивать генетическую идентичность полученных клонов исходным формам ( &аси Г., 1987 ). Проведенное нами срарнителыюе изучение компонентов пероксидазы-Ю-дневных проростков семян регенератов и исходной формы показало полную их идентичность

(рис. I ).

ОЭП ?

4€

ZZ

38

?0 - -

80 __

ЬЪ __

24 - --

■100 ___ ..... —

ios [.i- —4 и—1-—j —■

a S a. S

Рис. I. Схемы электрофоретических спектров катодных изопероксидаз 10-дневных проростков сахарной свеклы: • '

I - линия 5398; 2 7 лилия Р09-20; а - исходная форма; б - клон

Культура каллусной ткани. Известно, что каллусные ткани характеризуются большой морфологической гетерогенностьп, причиной" тому является различное тканевое происхождение первичных калдус-ных клеток ( Муромцев Г.С. и др., 1990 ). Каллусы разных типов . могут возникать из одного и того ив. экспланта, в одной и той же пробирке ( Кучеренко Л.А., 1991 ). В наших исследованиях морфо-генетическими потенциями обладали разные таен каллуса - пролиферация побегов наблюдалась как из плотного,.тах и из рыхлого кал-, луса. На харахтер каллусогенеза и органогенеза оказывали влияние тип оксплонта и генотип рас тения-донора. Было отмечено, что о увеличением количества пассажей каллус теряет способность к морфогенезу - уже после второго пассажа не наблюдалось появления

-е-.

сгеблещх почек. Бее испытаннее генотипы образовывал! каллус, однако его регенэрациокная. способность менялась в зависимости он генетически:; особенностей исходных рестенш'..

При культивировании эксплантов черевков пробирочных растений на ореде для каллусогеиеза мы наблюдали пролиферацию плотного каллуса белого или желтоватого цзета и рыхлом каллуса белого цвета. Каллус о образующая способность эксплантов варьировала от 70 % у линии 3683 да 100 % у линий ч6Ч5, 61')б и Р1961; частота образования ризогенного каллуса - от 5,3 % С линия 6146 ) до 88,9 % ( линия Р2П') ). Ризогешшй каллус был на способен формировать побеги. При субкультивировании на среде для индукции стеблевого органогенеза на поверхности плотного каллуса наблюдали появление мерцетематичеоких участков и стеблевых почек. Надо ответить, что не из всех мериотематичесхих зон возникли зачатки стебля. Кроме того, не вое зачатки стебля получили дальнейшее развитие с образованием нормальных побегов. Количество каллусов, -образовавших мсрнстематические участки, варьировало в завиеимос-тп от генотипа от 10 % ( линия Р2Л4 ) до 50 % ( линия 6146 ).'

В литературе имеются схаденыя о сопряженности дифференциации и органогенатичеоких процессов ткани Ьп. ^Мго с изменением акгшзноста ферментов различных метаболических систем ( '¿л'п К. сЬ 1986; Аокарова М.А. и др., 1908 ). Нами наблюдалось изменение компонентного состава и активности перо кс ид азы каллусов на различных этапах культивирования ( рис. 2 ),

Установлена специфичность изопероксидазного спектра каллуса различного происхождения ( из черешка и листовой пластинки ) ц. разных -китов каллуса ( плотный, .рыхлый ).

При использовании в.качестве эксплантов цветочных почек основная масса полученной каллуоной ткали имела рыхлую консистенцию, плотный каллус встречался очень редко. Стеблевой органоге-. нез, в этом случае, наблюдали из рыхлого каллуса. Отмечено, что формирование стеблевых, зачатков происходило как в темноте, та]; и. на свету., . , ■ -.

Адвентивные нобс: , разившиеся из плотного каллуса черешков и рыхлого каллуса бутонов, обладали высокой регенерацконной способностью,. В пазухах лиотьзз таких побегов, закладывалось большое количество почек. Наблюдали тдкжо развитие адвентивных побегов на черешках и средних жилках .диотьов.. ...

ОЭП

16

гг

54

80

100 лов

И

ш

Рис. 2. Схемы электрофорэтических спектров катодных азопероксидаз каллуоов сахарной свеклы линии 3683 на различных стадиях развития: I - агрегация; П - дифференциация; Ш - образование почек; а - каллус; б - среда ■

Размножение путем образования адвентивных побегов из черешков и средних яилок листьев пробирочных растений. В числе многих культур и видов растений показана возможность размножения пухем индукции побегов из ткани эксплалта я для сахарной свеклы. Нидоу, А Нц4их ( 1978 ), например, получади пучки придаточных побегов из черешков раотений-регенерантов. 1.1. Павловская, Н.СГ. . Бех ( 1989 ) и аб ли дали регенерацию побегов из ткачей черешка, я то время как листовые пластинки образовывали только каллус. М.Б. Амерханова с соавт. ( 1987 ) наблюдали пролиферации, адвентивных побегов на цветочных почках.

Наши исследования, показали» что образование адвентивных побегов непосредственно из ткани экспланта у сахарной свеклы довольно редкое явление, зависимое, в большей мере, от генотипа исходного растения, что согласуется с данными Нгр&ея. ( 1978 ), которым удавалось наблюдать это на одном генотипе и редко на других. Из 25 испытанных нами генотипов только у 3 линий С 601, 6146, Н-22 ) наблюдали образование пучков придаточных побегов на'черешках и средних жилках листьев регенеран-тов, полученных при размножении пазушными побегами или из кал-" лусной ткани.1 Отмечено, что коэффициент размножения придаточными побегами был выше, чем при размножении пазушными побегами, и варьировал от Г:Ю (. линия-6146 ) до 1:14 ( линия 601 ).

Выход рассадной культуры. При переноса пробирочных растении з нестерильные условия приживаемость в почвенном субстрате варь- . провала от 12,5 % С линия Р09-20 ) до 100 % ( линия СОАН-5 ).

Поскольку сахарная свекла - растение с двулетним циклом -развития, пали были поставлены опыты по сокращению продолжительности цикла развития данной культуры для быстрого получения1 семян от размноженных Ы уИхЬ растений. С этой целью перенос пробирочных растений в почву осуществляли в осенний сезон ( сентябрь - октябрь ). -Прижившиеся растения доращивали в течение 4~5 месяцев в условиях тепличного.комплекса КазНИИ земледелия. Затем корнеплоды диаметром головки от 2 до 4 см яровизировали в искусственных условиях ( холодильнике ) в течение 2-х месяцев. К началу весенне-полевых "работ С. апрель ) корнеплоды высаживали в открытый грунт. Фенологические наблюдения, проведенные за дальнейшим развитием растений, показали, что корнеплоды диаметром го ловки-от 3 до А .см" способны образовывать цветоносные побеги и давать семена.

ФАКТОРЦ, ВЯШПЩ НА ПРОЦЕСС КЛОНАЛЫЮП)

... ШКР0РАЗМП01ЕНИЛ' САХАРНОЙ СВЙШ ' . ' . , .

- К'факторам, "влияющим на .процесс микро размножения относят: I) генотип и состояние родительского растения;- 2) состояние зкспланта; 3}

особенности введения экопланта в стерильную.культуру; условия культивирования с Катаева Н.В., Буте н ко. Р.Г., 198Э

= Сахарная свзкла отнооится к числу видов, растений, которые ^ можно успешно размножать о помощью культуры ткани ( Нкам^ Н*^«. 1978 Известна, также,.роль сортовых особенностей в

-II- , _, .

процессе микроразмножения ( Ильенко И.И.,1983; Нуеталова Т.П. Знаменская В.В., 1908 ), что согласуется с полученными нами. . данными ( табл. I ).

Таблица I

Влияние генотипа на основные показатели при микроразмножении сахарной свеклы ' ----.

линии ! Число побегов на ! эксплаят ! % корнеобра-!. зования

Фертильные

Р09-20. 5.0 + 0,89 34,2 + 0,08

Ср-20 • ■ 3,3 + 0,92 25,0 + 0,07.

С0А11-5 10,2 + 1,25. 4,4 + 0,03

539 8 5,4+0,^ 27,1 + 0,06

Стерильные

5393 . 3,9 + 0,62 29,7 + 0,07

5394 3,0 + 0,28 32,5+0,08

СШ 3,6 + 0,62 38,5 + 0,07

С210 4,7 + 0,61 81,1 + 0,06

С176 5,4 + 1,07 92,9 7 0,04

Пр-41 7,5 + 0,55 61,9+0,06'

Близкие по происхождения! линии, имели, схожие значения по основным показателям, характеризующим процесс микроразмножения ( коэффициент размножения'и частота корнеобразования ): I) фер-тильные линии рамонского происхождения, одноростковые. - Р09-20, Ср-20 и 5398 ; 2) цмс-аналога линии. СО¿11-31 - С210 и (Я7б; 3) цме-аналоги линии СОАН-98 - 5393 и 5394. Не было шявлено взаимозависимости этих показателей и их завиоимоо.ти оз фвртиль-ности или стерильности линий.

Зажнов значение в проявлении морфогенетических способностей эясплантов имеет состояние родительского раотенйя в период изолирования тканей и органов. Для некоторых растений лучшим ороком изоляции является фаза выхода из покоя (.начало активного роста ) и активный рост, экспланты других образует побеги лишь на фаза покоя ( Хае с и Г., 1987 ). В наших исследованиях экспланты верхушек цветоносных побегов,изолированные в фазу массовой бутонизации, имели наиболее высокий уровень морфогенеза ( 77,8 % ) и ко-

-12т

оффициент размножения ( 1:4 ), чем зкапланти изолированиие в фазы начала бутонизации, начала цветения и массового цветения. У акспдантов, изолированных в более поздние сроки. - фазу массового цветения наблюдался наибольший процент инфицирован но о ти. ( 30 % ). Самой выаокоЛ скоростью роста обладали экспланты изолированные в фазу массювой бутонизации - прирост за 10 дней культивирования соотавил 54,7 мм.

Фактор "состояние экспланта" включает такие понятия, как происхождение, физиологический возраст и размер. Способность к ' морфогенезу различна у разшх органов одного и того же растения, В таблице 2 прйдотавлены, полученные нами, суммарные сведения по индуцируемому морфогенезу сахарной свеклы в культуре тканей.

Таблица 2

Морфогенные способности сахарной свеклы в культуре тканей

Эксплант

flrn морфогене;

Добеги (корни ¡каллус ? листовы^

Цветочные почки

Верхушки цветоносных побегов

Проростки

Сегменты черешков пробирочных растений

Сегменты лиатьвв

пробипочных

растений

Семяпочки

+

+

+

+

С наибольшей эффективностью образовывали побеги верхушки цветоносных побегов и проростки. Пролиферация адвентивных побегов на цветочных почках наблюдалась редко. Из оплодотворенных семяпочек формировались либо проростки с первичным корешком и семядольными листьями, в пазухах которых закладывались почки, развиваюииеся затем в побеги.; либо каллусы.

При использовании в качестве эксплаятов верхушек цветоносных побегов разных размеров ( 3; 5; Ю; 15; 20 мм ) набредали увеличение количества морфогенных оксплантов от 66,7 % до 100 % и при-

+

+

+

+■

+

роста за б дней культивирования от 7 мм до 75,4 мм с увеличением размера экспланта соответственно. от 3 мы до 20 мм. Размер экспланта не повлиял иа получение стерильной культуры и. на способность формировать пазушные побеги.

К факторам условий культивирования относят химический ооо-тав и физические свойства питательной среды, физические условия в культуральном сосуде и вне его ( освещение, влажность, температура, газовый состав ).

Эффективность клонального микроразмножения, в значительной' степени, определяется правильным выбором питательной ср^ды. Соо-тав и физические свойства ореди долвди соответствовать там задачам, которые определяются на каждом этапе микроразмножения. Известно, что процесс микроразмножения оостоит из нескольких этапов: I) введение оксплантов в стерильную культуру; 2) ообственно. микроразмножение, т.е. увеличение количества клонов; 3) укоренение размноженных побегов; перенос пробирочных растений в не-стеркльние условия, их адаптация ( Милалки^Х, _ 1974;Выооцки8 " В.Л., 1986 ). Исходя из этого,- нами были разработаны модифицированные питательные среды для каждого этапа микроразмножения.

При культивировании, сахарной свеклы wv vitro мы отолкнулись о проблемой потемнения растительных тканей, и питательной среды'. Согласно Г.Хасси ( 1987 ), многие растения продуцируют избыточные количества фенольных веществ, продукты окисления которых и ваза-вают подобное явление. Добавление нами, в питательную ореду адсорбента полнвинилпнрролидона ( ПВП ) уменьшало потемнение ткани экспланта и появление ненормальных ( витрифицированных ) побегов. На среде, содержащей 1000 мг/л ПВП, не было отмечено потемнения растительных тканей у обоих испытанных генотипов. На контрольном варианте среды, не содержащем ПВП, наблюдали самое большое количество верифицированных побегов - 35 % у линии 6146 и 45 % у линии 601. При увеличении, концентрации. ПВП в ореде до 1000 мг/л. происходило уменьшение витрификациц побегов до 10 % у обоих генотипов. Содержание. ПВП почта не сказалось на коэффициента размножения у лилии 6145, напротив, у линии, 601.наблюдали его увеличение при повышении концентрации адсорбента, 'ч .

Считается, что присутствие биологически активных веществ не-* гормональной природы в питательной среде необходимо для индукции пролиферации каллуоа и регенерации из него побегов или. эмбриоидов» когда же развитие побегов происходит за счет существующих пазус-

ных меристем или. сформировавшихся почек, то обычно влияние биологически активных добавок становится несущественным, ибо побеги способны к' синтезу нужных для их жизнедеятельности веществ ( Катаева Н. В., Бутенко Р.Г., 1983 ). Например, в работе Н.В. Ката-• евой ( 1982 ) было установлено, что применение инозита, пиридо-ксина, никотиновой кислоты, тирозина, рибофлавина, гндролизата казеина, аминокислот и растительных экстрактов не оказывало никакого влияния или отрицательно оказывалось ( в случае высоких концентраций ) на развитии в культуре тканей пазушных побегов гербе ры.

Результаты наших экспериментов, по изучению влияния витаминов по прописи ореды Мурасиге и Скуга на рост и развитие эксплантов проростков сахарной свеклы, свидетельствовали о несущественности их содержания в среде. Для лини;; Р09-20 количество мор-фогенных эксплантов на варианте среды без витаминов составило 100 %, на ореде с добавлением всех витаминов по прописи МС -- 95 % и на ореде с добавлением только твмт-НЫ ( по прописи

) - 87 Для линии Ср-20 варьирование количества морфогенных эксплантов на всех трех вариантах ореды было еще менее значительным ( 94,7 - 95,0 % ). Интенсивность роста эксплантов одного генотипа на воех трех вариантах среды была почти одинаковой. Прирост за 10 дней культивирования для линии Р09-20 составил 4,88-6,15 мм, для линии Ср-20 - 7,12-8,33 мм.

Известно, что все морфогенетические реакции, используемые •при микроразмножении растений, для нормальной реализации нуждаются в экзогенных цитокининах, действие которых сводится к снятию апикального доминирования и индукции развития пазушных почек.

Используя разные концентрации цитокинина в ореде для второго этапа микроразмножения ( собственно размножения ), можно регулировать скорость размножения, В наших экспериментах повыпение концентрации'6-бензиламинопурина ( БАЛ ) до 0,5 мг/л приводило к увеличению коэффициента размножения в 10-12 раз ( в зависимости от генотипа ) по сравнению с контролем. Дальнейшее повышение концентрации БАЛ до 1,0 мг/л угнетало образование пазушных побегов и стимулировало образование каллуса, что нежелательно в данном случае. Исследования по изучению влияния БАЛ на коэффициент размножения сахарной свеклы показали, что оптимальной концентрацией является 0,5 мг/л.

Однако в литературе имеются сведения о стимулирующем действии

зкзогешшх цитокиников на витрификации побегов ('Сафразбекян С. Л. и др., 1990; &дКгт & & я£., 1988 ).Имеется, также, сообщение и о том, что содержание цитокинина в среде не оказывает существенного влияния на развитие витрифицированних побегов ( Попович Е.А., 1993 ). Вообще, о механизмах этого нарушения нормального функционирования пробирочных растений единого мнения нет. По гипотезе С. 7(е\хи е£ сЛ ( 1984 ) причиной витрификации являются питательные среды богатые солями, аммония и цитокинина-' ми, а также ухудшение газообмена в культуральных сосудах, накопление этилена. По данным 3. ЙоШАег <£ а1( 1983 ), тарификация побегов чаще наблвдаэгоя при культивировании, иг хАЬю на жидких средах.

При микроразмножении сахарной свеклы мы также столкнулись о проблемой витрификации. В связи с этим нами были проведены эксперименты по изучению влияния концентрации, БАП и агара я среде на коэффициент размножения и витрификации побегов.'Использование полужидких питательных сред, по сравнения с твердыми, повышало коэффициент размножения в 1,5-2 раза и количество витрифицированних побегов в 2,5-8 раз в зависимости от генотипа и концентрации БАП С рис. 3 ). При, по выше нии концентрации БАП с 0,05 мг/л до 0,2 мг/л наблюдали статистически значимое увеличение количества верифицированных побегов при, последующем субкуль-• тизировании у обоих попытанных генотипов ( линии. Р09-20 и Ср-20 ) как на полужидкой, так и на твердой среде.

По мнению ¡ЬиНоп, ХосАЛй ( 1977 ), использование на третьем этапе микроразмножения ( укоренения ) минимальных сред, содержащих низкие концентрации минеральных-солей и оахарозьг, а также без витаминов, фитогормонов и агара, обусловливает закалку растений к неблагоприятным факторам..внешней среды и, способствует нормальному их росту при пересадке, в почву. В наших исследовали- . ях при уменьшении в 2 раза концентрации минеральных оолей в Среда Мурасиге и Скуга Статистически значимо увеличивалось количество укорененных побегов и уменьшалось число дней до появления корней как у линии Р09-20, так и у лилии Ср-2). На ореде, содержащей 1/2 минеральной основы МС,- корне образование составило 57,9 о у линии Ю9-20 и 73,7 % у линии Ср-20, тогда как на неразбавленной среде - соответственно 20 % и 14,3 %. При использовании питательных сред не содержащих ауксин наблюдалаоь довольно низкая частота корнеобразования у побегов двух испытанных нами генотипов.

Варианта 4 БАЛ, мг/л 0,05 агар, г/л 7,5

0,2

4,0

Рас. 3 . Влияние БАЛ и агара на коэффициент размногания (I) при мякроразмнокении сахарной свеклы

1 I - линия Ср-20, I пассак; ^7} - линия ЕЗ - линия Р09-20, I пассак; Щ _ линия

и ьдгришзкацию побегов (П)

Ср-20, 2 пассаг; Р09-20, 2 пасса*

Причем, статистически достоверная разница, между вариантами. среди с 15 г/л сахарозы и 30 г/л сахарозы наблюдалась только у линии РО9-20 - а повышением концентрации сахарозы росла укорош-емооть побегов. При добавлении в среду I мг/л НУК статиатческа значимо увеличивалось количество укорененных побегов независимо от концентрации сахарозы в ней. Било отмечено, что на среде дополненной НУК побега имели хорошо развитую корневуа систему. В отсутствии ауксина побеги формировали, тонкие одиночные корня.

ФЕноюптст оценка растеншьркгенерантоб,.

ПОХУЧЕНШХ МЕТОДОМ КЛОНАЛЬНОП) МШСРОРАЕМНОШМЯ -

Исходя из того, что клональное микроразмнонение используется в селекции сахарной свеклы для сохранения и размножения ценного материала и целью данного метода является получение ' растений, идентичных исходным, наш. была проведена идентификация полученных регенерантов по фенотипам исходных форм. В результате, между рэгенерантами, полученными, методом активации развития пазушных меристем, и растениями исходной формы на выявлено существенных различий по наступлению отдельных фенофаз развития" семенных растений ( розетки, стеблевания, цветения, созревания-) и продолжительности периода от фазы розетки до фазы созревания" седан. Продолжительность периода от фазы розетки до фазы созревания для линии Р09-20 составила 90 дней ( регенеранты ) а 92 дня ( исходная форма ), для линии Пр-')! - соответственно 88 дней и В9 дней.

Не выявлено различий мемду регенерантаки. к растениями исходной формы по следующим признакам: степень завязывания плодов,-масса 1000 семян, число семян на 10-сантиметровом участке побега, масса семян с одного'растения ( табл.3 ). Статистически достоверная разница наблюдалась' по вьюотё растений и по вахохестп семян - итл показатели были несколько шиа у регенерацтоз. Обтло-нить ото мокно тем, что эти признаки подвержены сильной модифи-кацлонной изменчивости. '

Исходные растения и регенеранты не-отличались по такт фоно-тапнчсским признакам, как габитус куста, форма листьев, пш плодоношения. У односемянных линий 5398, Пр~41, С210 и Р09-20' раз-дельноплодность семян составила: а) у исходных растений соответственно' 09,3??; -98,51; 95,3:* и 91,%'; о) у регенератов соответственно 100,?; 99,7%;-99,5% -и Регеиеригсн мкогосемяиной

Таблица 3

Хозяйственно-ценные признаки семенных растений

регенерантов и исходной формы .........;..... ( Ю9-20 )

Признак ¡Исходная форма ! Ре гене рант

Высота растения, ом 105,3 + 1,72 1С,0 + 1,58

Степень завязывания пло- 63,5 + 0,02 63,8 + 0,02 дов, % "

Число плодов на 10 см по- 14,8 + 0,43 15,2 + 0,51 бега *" ~

Масса 1000 семян, г 15,2 + 0,47 15,4 + 0,39

Масса оемян с одного рас?» 65,9 + 1,8б 67,1 + 1,74 тения, г "" "

Бохожеоть семян, % 72,0 + 0,03 83,0 + 0,02

линии ООАН-5 имели незначительное количество раздельноплодных семян - 4,67

Результаты анализа пыльцы на признак фертильности или стерильности показали, что регенеранты фертильных ( 5398 и СОАН-5 ) и стерильных ( Пр-41 и С210 ) линий сохранили этот селекционно важный признак исходных форм. ( табл. 4 ). Появление незначительного количества стерильных микроспор у фертильных линий объяаня-етоя условиями выращивания саманников » повыиенной температурой

Таблица 4

Качество пыльцы регенерантов ( Р ) и растений исходной формы ( К )

Количества фертильных ! Количество стерильных _микроспор, % !_микроспор, %

К { р I к ! Р

линии.

Фертильные 5398 СОЛН-5

Стерильные Пр-41 С210

78,3 + 0,07 98,1 ♦ 0,05

0,6 + 0,01 0,7 + 0,02

76;0 + 0,04 97,5 " 0,01

0,7 +0 0,9 ± 0,01

21,7 + 0,07 1,9 7 0,05

99,4 + 0,01 99,3 1 0,02

24,0 + 0,04 2,5 1 0,01

99,3 + О 99,1 1 0,01

и низкой относительной влажностью воздуха. Среди стерильных пыльцевых клеток наблюдали как нормальные по размеру, так и мелкие.

в-ц В 0; Д Ы

1. Для клоиальиого микроразмножения сахарной овахлы ус?з.~ новлена эффективность метода активации развития пазушных меристем с использованием в качестве зксплантоз проростков я верхупек цветоносных побегов.

2. Основные показатели, характеризуйте процесс микрораз-мнокения - число побегов на эксплант и частота корнеобразования - варьируют в зависимости, от генотипа. Близкие по происхождении линии сахарной свеклы имеют схожие значения по этим показ1" гелям: а) фертильные линии рамонского происхождения, одноростковые -Р09-20, Ср-20 и 5398; б) цмс-аналоги линии СОАН-31 - С210 и С176; в) цмс-аналоги линии СОАН-98 - 5393 и5394. -Не выявлено -взаимозависимости, этих показателей и их зависимости от фертиль-ности или стерильности линий. Возможно уопешное размножение £п уйю линий диплоидной сахарной свеклы различных по происхождению,

3. Изолирование верхуаек цветоносных побегов а целью кю-нального микроразмножения следует проводить в фазу массовой бу-" тонизации. Зкспланты, изолированные в фазу массовой бутонизации, имеют наиболее высокий уровень морфогенеза ( 77,8$ ), по сравнению с эксплантами. изолированными а фазы начала бутонизации

( 33,3$ ), начала цветения ( 55,6$ ) и массового цветения ( 28,6% ). Увеличение размера экспланта от 3 мм. до 20 мн повышает количество морфогенних эксплантов соответственно он 66,'?% до 100?. "

4. Существенное влияние на увеличение коэффициента размножения сахарной свеклы оказывает БАЛ в концентрации 0,5 кг/л. Дальнейвее повивзние концентрации БАЕ до 1,0 кг/л угнетает образование пазушных побегов.

5. Появление витрифицироважшх побегов при микрорагмкЬаагктг сахарной свеклы зависит от физических свойств ( концентрации агара ) питательной среди, концентрации цктокинина ( ЕАП ) и числа субкультивирований. На полужидких ( 4 г/л агара ) питательных средах наблюдается в 2,5-8 раз С 3 завиеикоа?.! от генотипа и'-концентрации БАЛ ) больве еттрифиц'ирокшиых побегов, чем на-твердых

( 7,5 г/л агара ). Поименное содзржамяе БАЛ. ( 0,2 мг/'л ) стимулирует витрификацив побегоя гтрк поело дуюцем- субкультивировании. Хгл предотвращения ЕИтрифиКЕЩяи на втором этапе микро разинояеция

-гс-

следует использовать твердое питательные среди с низкими ( 0,05 мг/л ) концентрациями БАЕ.

6. Выделено 2 типа каллуса, различающихся по консистенции. Пролиферация побегов наблюдается как из плотного, так и из рыхлого каллуса. На характер каллусогенеэа и органогенеза оказывают влияние тип экопланта и генотип растения-донора. С увеличением количества пассажей каллус теряет регенерационную способность. Изопероксидазный спектр каллуса специфичен в зависимости от егс'типа, цвета, стадии развития и происховд'зния,

7. Регенеранты и растения исходной формы идентичны по олек-трофоретическим спектрам катодных изопероксидаз однотипных и од-ноЕозрастних тканей, что является свидетельством относительной генетической стабильности при микроразмножении.

8. Рзгенеранты и растения исходной формы идентичны по основным фенотипическим признакам, имеющим селекционную значимость.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для наиболее эффективной стерилизации, исходного растительного материала рекомендуется применение 0,1 #-ного раствора нитрата серебра при экспозиции I час.

2. Для предотвращения потемнения тканей экспланта и уменьшения витрификации побегов целесообразно добавление в питательную среду адсорбента поливинилпирролидона ( ПВД ) в концентрации 1000 мг/л.

3. Для повышения укореняемости размноженных побегов следует использовать питательные средыс половинным набором минеральных солей, содержащие ауксин в концентрации 1-4 мг/л.

• , СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО 15Ж ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахмедо.ва Я. В. Введение тканей сахарной свеклы в культуру in vfciw в целях микроклонального размножения // Матер.Респ.конф. "Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане".-Алма-Ата..- 1990.- С.1Г7-П8.

2. Ахмедова I.B., Абугалиев И.А,, Кожахметов М.К. Микроклонирование и выживаемость сахарной свеклы в культуре тканей // Вестник сельскохозяйственно^ науки Казахстана.- 1991.- JS 8.- С. • 30-32.

3. Ахиедова I.В. Клональное микроразмножение сахарной свек-

-21- , ли в культуре "» ьИю // Матер,Эзесоюз.науч.кокф. ш> сашхкохр-зяйственной биотехнологии.- Целинограда,- 1991,- С.115-1Г7.

"4. Ахмедова Ж.В., Алимгазинова Б.111. Бюхимичеокая оценка каллусных тканей сахарной овеклы // Те з. дох л. Мо кд у нар, н ау ч, --практич.конф. молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам интенсификации сельского хозяйства.- Шэртанды.- 1993*- Ч, г.- С.55-55. ' • ' ' ' '

5. Абугалиев И. А., Кожахметов М.К., Ахмедова Ж, В. Перепек» тивц использования биотехнологических методов в селекции сахарной свеклы // Биотехнология в селекции, сельскохозяйственных' культур.- Алматы: Из д.Казахской академии сельскохозяйственных наук.- 1993.- С.55-60. ....... ' ..... "

6. Ахмедова й. В., Кожахметов М.К. Каллусогенез и регенера-" ция сахарной свеклы в зависимости от генотипа и питательной'среды // Биотехнология в селекции сельскохозяйственных кульгур.- '" Алматы: Изд.Казахской академии сельскохозяйственных наук.- 1993.- С. 60-64..........

7. Ахмедова Я.В. Идентификация раотений-регзнерантов сахарной свечды полученных методом клонального микроразмиожения // " Тез.докл. 2 Между нар. конф. "Биология культивируемых клеток рао.-тений и биотехнология",- Адмати,- 1993,- Вып.2.- С.204.

8. Ахмедова Я.В., Абугалиев И.Л., Кокахметов М.К. Фенологическая оценка регенерантов сахарной свеклы, полученных методом клонального микроразмножения // Тез.докл. 2 Мекдунар.конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология",- Алыаты.-- 1993,- Вып.2.- С.205.

9. Ахмедова 1.В. Влияние некоторых факторов на процесс клонального никроразнножения сахарной свеклы // Вестник сельокохо- ' зяйственной науки Казахстана,- 1994,-№ I.*» 0,39-4'».-

10. Ахмедова Ж.В. Влияние происхождения окспланта и состава питательной среда на процесс микрорадннохения оахарной свеклы // Депонировано в КазГосйНТИ» реферат опубликован в сборнике "Депонированные научные работы".- Алматы, 1994.- Ош.З.- С.59.

11. Ахмедова I,В, Кант нызылаасын клонды.т -лЬгс вдЫкен кебейту // Нараы,- 1994.- Я II-12.- С.47-54.. ■"' •

12. Ахмедова 5, В, Эндогеннио и. окзогеннке факторы при клокальном микроразмножении сахарной сяеклы // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.- 1995.- Я I.- С.59-69.

Ахыедова S.B. Кант кызылшасы селекциясыеда клонды in vitro ед1с!мен кебейту. Алматы, 1996, 21 б.

Зерттеу кант кызылтасын клонды In vitro аркьиш кебейту-д1ц ти1мд1 ед1стер1н акщтау жене селекция материалдарын In vitro жагдайывда еск1н алудын ед1стер1н аниктауга арнапган.

Нант кьтылшасыньщ шыгу тег1 жен1нде 61р б1р1не какьш ли-ниялар ecln кабею процес1н сипаттайтын нег!зг! кегссгж1итер1 бойывша, атал айтканда кебею коэффициент! жене тамыр тузу жи1-л1г1 уксас болагывдыгы анщталды. Herlsrl керсетк1штерШц б1р б1р1не теуелс1ад!г1, б1рак олардвд ecin, кебейу жон1нде ес!м-д1ктерд1н фертшц>д1 жене стерильд1 турлер1не байланысты ерек-шед1ктер1 аныкталган. 6ск1н алудьщ, еск1нд1 зарарсыздандыру-дьщ, эксплант алудьщ ти1мд1 вд1стер1 анккталды. Микроеск1нд1ц ер кеаеЩне арнадган сай корект1к орта аныкталды. Жанадан ашкган еск!нд1ч биохимиялык касиеттер1 (иэоперсксидазаньщ спекторы аркылы) жэне селекциялык мацызы бар фекотипт1п белг1-лер! аркылы аныктаудын ©д1стер! керсет1лген.

Akhmedova Zh.V. Mlcropropagation In Sugar'Boot Selection. - Almaty, 1986, 21 p.

The research took place for the Identification of the effective methods of sugar beet clonal Riicropropagation ra. the development of the selection material cloning in vitro. There has been established, that proplnquitial In their origin sugar beet lines have similar meanings In tha main lndeces characterising nlcropropagatlon process, that is propagation coefficient aid rootformatlon frequency. Thsre has been revealed the main correlation absence between characters and their dependence of fertility and sterility of lines. There has been defined the optimal: a) svsthed of mlcropropagation; b) tray of plant material sterilisation; c) explant. For ovory stsge of tnicropropsgatlon there has bson developed nodifleal nutrient media. There has been conducted the Identification of tho received regenersnts according to tho biochemical property (cf spsotrum of the katcds isoperosidpsos) and phsnotyplcal triarts, wicri has bsing .«» 1 »ct icnal importance.