Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-патогенетическое обоснование возникновения и манифестации синдрома трисомии 21

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико-патогенетическое обоснование возникновения и манифестации синдрома трисомии 21"

'-о

Ст-

¿с МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

-УКРАИНСКИЙ НАУЧНЫЙ ГИГИЕНИЧЕСКИЙ

ЦЕНТР

На правах росписи

АРБУЗОВА Светлана Борисовна

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ

ОБОСНОВАНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЕ! И МАНИФЕСТАЦИИ СИНДРОМА ТРИСОМИИ 21

05. ОС, -¡Г

Ч4.[)3т23-- генетика (медицинские науки)

Лвшрефера! диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КИЕВ-1996

Работа выполнена в Донецком межобластном медико-генетическом центре

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор

Игорь Романович Бариляк

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Тамара Ивановна Бужиевская

доктор медицинских наук. Заслуженный деятель науки Украины, профессор Калерия Павловна Ганина

академик АМН Украины, член-корреспондент HAH Украины, доктор медицинских наук, профессор Борис Яковлевич Резник

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев

Заишта состоится 1 ноября 1996 года в Ю00 часов на заседании Специализированного ученого совета Д 01.37.03 докторских диссертаций в Украинском научном гигиеническом центре по адресу: 254660, г.Киев-94, ул.Попудренка, 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Украинского научного гишенического центра по адресу: 254660, г.Кнев-94, ул.Попудренка, 50.

Автореферат разослан 30 сентября 1996 г.

Ученый секретарь

Специализированного ученого совета

кандидат биологических наук (^и^у^^^у А.В.Стефанович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность течь;. Синдром Дауна (трисомия 21) является самой частой хромосомной патологией, сопровождающейся грубым интеллектуальным дефектом и пороками развития.

Несмотря на множество работ исследователей всех стран, начиная о г выделения данной патологии в отдельную нозологическую единицу (Даун, 1866) и открытия хромосомной этиологии (Лежен, 1959) до настоящего времени, причины возникновения синдрома окончательно не выяснены. Более того, по-прежнему не известно, что определяет фенотипические и клинические признаки синдрома Дауна (Mikkelsen, 198!, 1990; Фогель, Мотульски, 1990).

Неисследованными остаются причины новы'шенной частоты лейкозов, новообразован!'.», раннего старения у пациентов с трисомисй 21. Нуждаются в объяснении сочетания синдрома Дауна с болезнью Альт еймера и аутоиммунными заболеваниями, различная степень тяжести и профессируюший характер патологии.

Высокая смертность и инвалидность пациентов с трисомией 21 ставят эту патологию в разряд важных нерешенных медицинских проблем. Актупьность проблем!)] усиливается широкой распространенностью синдрома, популяиионная «sacюта которого примерно одинакова во всех странах и в среднем составляет 1:800 живорожденных детей.

В различных аспектах обсуждаются в литературе возможные причины возрастзависнмой частоты синдрома: гормональные1 нарушения, ослабление физиологическою контроля оогенеза, снижение способности эчиминировать аномальный плод, однако доказательного обоснования не найдено. Загадкой также является преимущественное - в 85-95% случаев - материнское происхождение хромосомы 21.

Существует много теорий и научных предположений о влиянии зн-

догенных и экзогенных факторов на нерасхождеиие хромосом при возникновении трисомии 21, но эти данные неоднородны и противоречивы (Hook, 1981; Подугольникова, 1988).

Разработка эффективных мер профилактики синдрома Дауна является первоочередной задачей, успешное решение которой зависит от выяснения механизмов индукции анеуплоидий и единого аргументированного объяснения имеющимся сведениям.

Среди всех известных факторов, вызывающих повышение частоты синдрома Дауна, наиболее существенными признаны: возраст матери, что подтверждено всеми исследователями, и влияние радиации, показанное в большинстве работ. Получены также данные, указывающие на определенную зависимость между низкими дозами облучения и возрастом при нерасхождении хромосом. Установлено, что эффект материнского возраста усиливается при действии радиации (Uchida et al., 1975, 1981; Strigini et al., 1990).

Причины этих явлений не установлены, но есть все основания полагать, что связь между ними существует. Известно, что в основе радиационного поражения лежит образование свободных радикалов. Согласно свободнорадикальной теории старения, накопление свободных радикалов происходит с возрастом, что получило подтверждение в целом ряде исследований, суммирующих влияние активных форм кислорода на биологические системы (Воскресенский и др., 1982; Нагшап, 1991, 1992).

В то же время нами обнаружено большое сходство клинических проявлений синдрома Дауна с изменениями, сопровождающими естественное старение и действие радиации.

Целью настоящего исследования является изучение роли свобод-норадикальных процессов в возникновении и манифестации трисомии 21.

Чадач'и исследования.

¡. Определить популяционную часюгу синдрома Дауна в Донецкой

области

2. Изучить полиморфизм и возрастную изменчивость клинических нроятении синдрома.

3. Выявить характер наследственного отягощения и предраспо-лсженносш к. Вклиилнокению пяточрп;;! п семьях к родословных.

4. Определить специфичность изменения кариотипа у доноров экстрахромосомы 21 на основании углубленного комплексного цитогенетического обследования семей.

5. Изучить интенсивность свободнорадикальных процессов и состояние антиоксидантной системы в семьях с трисомией 21.

6. Провести митекулярно-генстичсский анализ мтохондриальной ¡1НК. \ доноров скстрачромосомы 2!.

7. Создать новый подход к формированию групп высокого !енеш-чесчою риска I: разраГюгап, меры профилактики синдрома.

Научная новизна исследования.

!. Впервые обнаружен повышенный уровень свободных радикалов, усиление процессов перекисного окисления липндов и нарушение антиоксидантной защиты у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21.

2. Впервые проведена комплексная оценка клинических, иитогене-тических и биохимических изменений в семьях с трисомией 21 и установлена причинно-следственная связь выявленных нарушений.

3. Впервые отмечено высокое сходство пороков развития и заболевании при синдроме Дауна с последст виям!! радиационного поражения.

4. Впервые показано, что различия клинических проявлений, тяжесть течения синдрома, раннее старение и прогрессирующий характер патологии у пациентов с трисомией 21 обусловлены степенью

свободнорадикального поражения, усиливающейся с возрастом.

5. Впервые возрастзависимое повышение частоты синдрома Дауна обосновано накоплением свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липддов, интенсификацией процессов пероксидации при старении организма.

6. Впервые выявлено цитоплазматическое наследование предрасположенности к возникновению трисомии 21.

7. Впервые изучена роль митохондриального генома в патогенезе трисомии 21 и обнаружены не описанные ранее мутации в мтДНК у донора экстрахромосомы.

8. Впервые дано объяснение преимущественному материнскому происхождению дополнительной хромосомы 21, гетерогенности клинических проявлений и сочетанию патологий у членов семьи и родственников.

9. Впервые обнаружен разнонаправленный характер активности ключевого фермента антирадикальной защиты - СОД - у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21 и вскрыты механизмы межсистемного взаимодействия, способствующие сохранению беременности аномальным плодом.

10. Предложен новый патогенетически обоснованный подход к формированию групп высокого генетического риска и профилактике синдрома.

Практическая и теоретическая значимость исследования.

1. Установленная популяционная частота синдрома Дауна в Донецкой области и распределение данной патологии в различных возрастных группах женщин имеют первостепенное значение для организации и проведения комплексной программы пренатальной диагностики синдрома и оценки вероятности рождения ребенка с трисомией 21.

2. Обнаруженное цитонлазматическое наследование предрасположенности к возникновению трисомии 21 и выявленная связь синдрома с др>гой патоло1 ней и заболеваниями в родословных указывают на целесообразность диспансерного наблюдения за семьями и родственниками по материнской линии.

3. Разработаны новые клинико-диагностические критерии и показания для включения семей ь фунну ныепкого генетического риска. Необходимо учитывать, что экзогенные факторы, вызывающие повышение уровня свободных радикалов, увеличивают риск возникновения трисомии 21 у потомства.

4. Разбалансировка оксидантно-антиоксидантной системы, выявленная у пациентов с трисомией 21 и доноров экстрахромосомы, является основанием для поиска высокоспецифичных метаболических маркеров сшпрома Дауна во время беременности.

5. Результаты проведенного исследования обосновывают применение а»: iиокишнгиуй терапии ;ыя профилакiикн трисомии 21, широкого спектра ¡аб.).';евани!1 и пороков развития плода. Показано, чго использование комплекса витаминов и микроэлементов на примере назначения донорам эксграхромосомы 21 препарата "5ирегапиох1с1ат" эффективно защищает организм от развития свободнорадикальных повреждений, ишибируя реакции линонероксидацни.

6. Представленные в работе доказательства накопления свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов с возрастом не только у доноров экстрахромосомы, но и в процессе естественного старения. вносят вклад в развитие геронтологии.

7. Доказанная роль свободнорадикальною поражения в возникновении и манифестации синдрома и обнаруженные толковые мутации в ми-тохондриальной ДНК у донора экстрахромосомы 21 открывают принципиально новое направление в изучении анеуплоидий.

Внедрение в практику.

Полученные результаты исследования легли в основу проспективного и ретроспективного медико-генетического консультирования. Внедрена качественно новая схема обследования семей и беременных женщин, выявления заболеваний и нарушений, которые могут служить предвестниками рождения ребенка с синдромом Дауна.

На основании установленных в работе критериев отягощения родословных, возрастзависимого распределения частоты синдрома Дауна, факторов, повышающих вероятность рождения больного ребенка, формируются группы высокого генетического риска, оцениваются результаты исследования маркеров материнской сыворотки во время беременности, рассчитывается прогноз пото.мства, назначаются инвазивные методы пренатальной диагностики. В семьях с отягощенной родословной проводится изучение состояния оксидантно-антиоксидан-тной системы и цитогенетических показателей хромосомной нестабильности.

Использованные в настоящем исследовании усовершенствованные методы получения хромосомных препаратов и биокультуральные технологии внедрены в работу ряда медико-генетических центров Украины:

1. Способ получения хромосомных препаратов из культуры лимфоцитов периферической крови (рац. предложение N 3416, 1996 г.).

2. Способ получения хромосомных препаратов из культуры амнио-тической жидкости (рац. предложение N 3417, 1996 г.).

3. Способ получения фитогемагглютинина из семян фасоли РИазеоШв сосстеи5 Ь для культуральных исследований (рац. предложение N 3418, 1996 г.).

Выпущены методические рекомендации "Гормонодиагностика патологии беременности", Донецк, 1995 г.

Основные положения работы вошли в национальную программу

"Дети Украины", утвержденную Указом Президента Украины N 63/96 от 18.01.96.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Возникновение и манифестация синдрома Дауна обусловлены ме-юбо.шческими нарушениями, наступающими вследствие повышенного уровня свободных радикалов, активации перекисного окисления липи-дов. нарушении ферментных ч неферментных звеньев антпоксидантной защиты у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21.

2. Важная роль в возникновении трисомии 21 принадлежит установленному цитоплазматпческому наследованию предрасположенности к патологии и точковым мутациям в митохондриальной ДНК.

3. Полиморфизм клинических проявлений и прогрессирующий характер патологии у пациентов с трисомией 21, возрастзависимая частота синдрома и цитогепетичеекпе нарушения у допоров экстрахромосомы 21 зависят от степени разбалансировки оксидангно-антиоксилантной системы, усиливающейся с возрастом.

4. Сохранению беременности плодом с трисомией 21 способствует разнонаправленный характер изменения активности С'ОД - резкий дефицит у матери восполняется за счет эффекта дозы гена СОД плода.

5. Применение антпоксидантной терапии приводит к снижению пероксидацни организма, нормализует иитогепегическис и биохимические показатели у доноров экстрахромосомы 21.

Личный вклад в разработку основных положений, выносимых на защиту.

Автор лично разработал новый подход к изучению паю!енеза трисомии 21 и сформулировал методологию исследования. Исследования проводились на базе Межобластного медико-генетического центра г.Донецка при непосредственном участии и научном руководстве соискателя. В рамках организованной автором совместной научно-

исследовательской работы заключительный этап молекулярпо-генети-ческих исследований выполнялся соискателем на базе Института медицинской генетики г.Геттингена, Германия. Автором самостоятельно обработаны результаты работы, подготовлен текст диссертации и сделаны обобщения и выводы. Основные материалы диссертации, кроме работ в соавторстве, изложены в 8 единоличных публикациях.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на: Международной конференции "Ранняя пренатальная диагностика патологии плода" (сентябрь 1990, Прага); Всесоюзной научно-практической конференции "Пренатальный и неонатальный скрининг" (ноябрь 1990, Харьков); 2-м Всесоюзном съезде медицинских генетиков (декабрь 1990, Алма-Ата); 2-й Всесоюзной научно-практической конференции по цитогенетике человека (октябрь 1991, Москва); 2-м съезде медицинских генетиков Украины (октябрь 1995, Львов); 28-м конгрессе Европейского общества медицинских генетиков (апрель 1996, Лондон); конференции по пренатальной диагностике в Центральных и Восточноевропейских странах (сентябрь 1996, Прага).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, изданы методические рекомендации, получено 3 удостоверения на рационализаторские предложения.

Объем и структура работы.

Диссертация написана на русском языке, изложена на 238 страницах машинописи и состоит из введения, восьми глав, заключения и выводов.

Текст диссертации иллюстрирован 34 таблицами и 41 рисунком. Список литературы содержит 237 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В рабою иснолозованы нопуляционные. клинические, иитогенети-

чсскис. биохимические и .молекудярно-юиетическис методы исследования. Схема проведенных исследований представлена на рис.1.

Для цп1оюнс1 ическнх нсслсдозашш иеиольмжадчсь препараты 72-часовий культуры лимфоцитов периферической крови. Культивирование и фиксацию осуществляли по общепринятой методике (Бочков, 1971). Перед началом фиксации применялась собственная модификация изменения температурного режима до введения колхицина для синхронизации митозов в культуре и получения препаратов с большим числом ме-тафаз (Арбузова и др., 1996).

С целью вмяв «еш!» донорства кшолнителыюй хромосомы 21 оценивали »диморфизм по методике Дагищепковой. 1975.

лл.ч выявления хромосомных аберраций стекла окрашивали дифск'ренишпьио С-мекмоч. Анализировалось не менее 100 метафаз калдо'о папиелта. Учет аберраций хромосом осуществляли по общеприня!мм мегодикам (Бочков. Каткова, 1992).

Методами хемилюминесценции. снектрофотометрнн. флуорометрии, иммупоф'|уорссцс11ции определяли уровень своСчиимх радикалов (ХЛ, 1тах), продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегидл (МДА); триглицеридов; антиоксидантов - супероксиддисмугазы (СОД), катал азы, восстановленного иутатиопа (С8Н), а-токоферола; гормонов щитовидной железы (ТТГ. Т^, Тд) и половых гормонов - пролактина, ос ¡ радиола, прогестерона, фолликулостимулнрующего (ФСГ); лютеини-знрующего (ЛГ); показателей энергетического метаболизма - АТФ, фосфора сыворотки (Р;,СЫв) 11 эритроцитов (Р^.Д лактатдегидрогеназы (ЛДГ),

СХЕМА ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Рис.1

креатинкиназы (КК) (Hemmiia et al., ¡984; Владимиров, Арчаков, 1972; Барабой и др., 1991; Чевари и др., 1985, 1991).

В проведенных исследованиях применялись реактивы фирмы "Sigma", США, стандартные наборы "Pointe Scientific", США, "Копе", "Déifia", Финляндия, "Hoffmann La Roche". Швейцария.

Для молекулярно-генетических исследований использовались образ-П!! мнтохо.'црмальнон ДНК, полученные из цельной крови с ЭДТА но методу Miller et al., 1988. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) применялась мультипраймерная система, разработанная Ernst et al., 1994. Условия апмлификации: полимеризация - 1 минута при 53°С, отжиг праймеров - 1 минута при 75°С, денатурация - 1 минута при 92° С. При анализе продуктов ПЦР применялась стандартная методика блот-гибршшчш'ш! rui South;гп (Seibeï ег л/.. 1991 ).

Д'!;1 схршшша ючковых мутаций мтДНК проводили полное секвенпровлиие одного образца ДНК донора экстрахромосомы 21 с использованием набора "Long PCR kit" (Boehrinaer Mannheim, Германия), набора для секвенировапия (Perkin Himer, Германия), автоматических приборов Prism 3/7Л и DNAsis (Hitachi, США) (Anderson et а!., ¡981).

Математическая обработка данных проводилась на компьютере IBM 486-0X2/66 с использованием пакетов программ: STATGRAPHICS версии 3.0 фирмы Statistical Graphics Corporation (США); SAS версии 6.04 (SAS Institute, США); Excel версии 5.0 фирмы Microsoft и Mathematica

версии 2.1 (США). Использовались стандартные функции указанных программных средств и программы, написанные на языкал системы SAS и Visual Basic for Applications.

Результаты исследований и их обсуждение.

Проведенное комплексное исследование позволило определить по-пуляционную частоту синдрома Дауна, общие закономерности клинических, цитогенетических и биохимических нарушений в семьях с трисомией 21, установить их зависимость от процессов пероксвдации, выявить мутации в митохондриальной ДНК у донора экстрахромосомы 21.

Популянионная частота синдрома Дауна .

Популяционная частота синдрома Дауна в Донецкой области за 6 лет составляет 1,35%о - 1:739 живорожденных детей. В табл.1 представлена частота синдрома Дауна в различных возрастных группах женщин за период 1990-1995 гг.

Очевидным результатом проведенного исследования является повышение частоты синдрома Дауна с возрастом матери.

Таблица 1

Частота синдрома Дауна в различных возрастных группах женщин

за 1990-1995 гг.

Возраст 1990 1991 1992 1993 1994 1995

матери %0 %» % %« %0 %а

15-17 0,94 0,00 1,10 0,55 1,09 0,72

18-19 0,49 0,28 0,25 0,39 0,16 0,19

20-23 0,63 0,56 0,70 0,59 0,46 0,57

24-26 1,17 1,16 2,03 1,77 1,63 1,01

27-30 1,40 1,50 1,39 2,17 1,99 1,83

31-35 1,43 1,82 1,50 1,13 2,17 2,41

36-40 3,43 5,45 5,88 4,58 3,83 5,50

41-45 14,35 9,92 6,29 14,71 16,33 18,02

46-48 12,05 14,29 14,29 0,00 46,15 21,51

Средняя частота 1,34 1,28 1,31 1,41 1,44 1,36

Манифест?1ШЗ_еи1!др()ма^гШ1СШ.!1и-.2-1-

Несмотря на активное изучение эффектов дозы генов, расположенных в районе 2!q22, связать их действие с манифестацией синдрома грисомии 21 не удавалось (Anfonarakis ct al., 1989; Cooper, Hall. 1988). Ни один из картированных сенов этого района не имеет прямого отношения к наблюдаемым порокам развития (Аяпегсг., Edr.ian. ¡99->). Даже пятикратное увеличение лозы генов в эксперименте на лабораторных животных не вызывало развития симптомокомплекса синдрома Дауна (Groner et al, 1992). Известны также случаи формирования фенотипа н характерной для синдрома патологии, не сопровождающиеся дупликацией сегмента 21q22 (Delabar et al., 1987).

Мы представили аналогичный пример, когда в семье у двух детей-блнзнсцок с классическим снмитомокомпдексом синдрома Дауна не были »Дшаружйиы изменения в кариопше. Кроме того, проведенное сравнение клинических проявлении трисомии 21 е грисомиями 18 и 13 позволило выявить большое количество общих признаков лчя этих синдромов, чго свидегсльовует о неспецифичности пороков, обусловленных хромосомным дисбалансом.

В результате исследования нами установлено, что у пациентов с трнсомией 21 повышен уровень свободных радикалов, и выявлена разба-лансировка антиоксидантной системы. Активность ключевого фермента антиоксидантной защиты - СОД, катализирующего реакцию превращения супероксидных радикалов, повышена у пациентов с трнсомией 21 в среднем в полтора раза. При этом концентрация GSH и а-гокоферола снижена (в 2 и 1,2 раза), активность каталазы не изменена (табл.2).

Таким образом. СОД, в силу эффекта дозы гена, находится в несоответствии с другими звеньями антирадикалыюй защиты, что при повышенном уровне супероксидных радикалов способствует усиленному образованию более активных радикалов и перекисей.

Таблица 2

Показатели оксидантно-антиоксидантиой системы у пациентов с трисомией 21 (М ± ш)

Изученные показатели Пациенты Контроль

1-16 лет п = 20 1-4 года п = 7 5-10 лет и = 7 11-16 лет п = 6 1-16 лет п = 20

ХЛ, 1тах. усл.ед. 27,2+0,9* 23,5±0,5** 27,6+1,1 29,9±1,5 23,3±0,8

МДА, мМ/мг белка 3,66±0,04* 3,42+0,04** 3,70+0,03 3,79±0,05 3,19±0,03

ДК, Е/л 2,17±0,14* 2,01+0,15** 2,19±0,17 2,39+1,0 1,01 ±0,07

СОД, ед.акт. 38,3±1,2* 44,3±1,5** 37,1±1,9 34,9±1,0 22,3±0,7

Каталаза, % 66,4+2,0 65,1±4,2 67,3+4,2 65,7+3,5 64,1+2,5

а-токоферол, мкМ/л 18,7±0,3* 19,2±0,5** 19,2±0,5 18,1+0,2 21,5+0,2

СБН, мМ/л 0,66±0,05* 0,64±0,09 0,66±0,06 0,69±0,09 1,26±0,08

* - Р < 0.05, достоверность различий между группами пациентов с трисомией 21 и контроля;

** - Р < 0.05, достоверность различий между группами пациентов 1-4 года и 11-16 лет

Как 'следствие" разбачансировки оксидантно-антиоксидантной системы з избыточном количестве образуются продукты ПОЛ - ДК (двукратное повышение) и МДА (увеличен в 1,2 раза). Выявлена прямая корреляционная зависимость между 1тах и МДА (г = 0,852, Р = 0.001).

С полученными нами результатами согласуются сообщения о повышении глу1агионпероксидазь( у пациентов с трисомией 21, объяснение чему найдено не иьыи (Аппегеп ет а!., 1У85).

Увеличение активности глутатионпероксидазы, не картированной на 21-й хромосоме, может быть только компенсаторным, в ответ на образование избыточного количества перекисей, и происходит вследствие повышенного уровня супероксидных радикалов при увеличенной активности СОД, что и обнаружено нами у пациентов с трисомией 21.

Клиническое обследование показало, что при всем единообразии внутри группы, пациенты с трисомией 2) отличаются по тяжести соматического и психического состояния, частоте пороков развития.

Различная выраженность рассогласования оксизантно-антиоксидан-тной системы установлена нами у детей с трисомией 21. Резко повышенный уровень свободных радикалов - на 24% (Р < 0,05) и продуктов ПОЛ (троекратное увеличение по сравнению с контролем, Р < 0,05) выявлен у 20% детей с наиболее тяжелой задержкой умственного и физическою развития, сочетанием пороков сердца, мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта. У двух детей в этой группе выявлены лейкоз и ретинобластома. Состояние антиоксидантной системы характеризовалось понижением всех изученных параметров: содержание а-токоферола на 5%, концентрация С8Н на 33%, а активность каталазы и СОД на 11 % ниже, чем в обще?! группе детей с синдромом Дауна (Р < 0,05).

Обнаружено, что накопление свободных радикалов и продуктов ПОЛ, ослабление звеньев антиоксидантной защиты наступает с возра-

стом.

Уровень пероксидации значительно выше у детей 11-16 лет по сравнению с детьми младшего возраста. Активность СОД в этой группе пациентов на 20% ниже, чем в группе детей 1-4 лет (табл.2). Найдена обратная корреляционная зависимость интенсивности XJI (Imax) от активности СОД (г = -0,706, Р = 0,005).

Усилению свободнорадикального поражения соответствуют: прогрессирующий характер патологии, признаки раннего старения, более глубокий интеллектуальный дефект, нарастание хромосомной нестабильности у пациентов старшей возрастной группы, а также повышенная частота тесно связанных с синдромом аутоиммунных и злокачественных заболеваний.

Подтверждением роли свободнорадикальных процессов в формировании пороков развития при синдроме Дауна служит проведенное нами сравнение признаков синдрома с последствиями радиационного поражения. Наблюдаемые фенотипические и клинические проявления при синдроме Дауна, пороки развития внутренних органов чрезвычайно сходны с эффектами, отмеченными при радиационном воздействии на человека и в эксперименте на лабораторных животных. Высокая степень аналогии обнаружена также в возникновении новообразований, лейкозов, гипотиреоза, сахарного диабета, раннем старении и чувствительности к инфекции. Схожесть пороков и клинических проявлений - последствий радиации прежде всего у потомства (Москалев, 1991) служит подтверждением того, что в основе манифестации синдрома Дауна лежит сво-боднорадикальное поражение, модифицируемое эффектом дозы генов хромосомы 21.

Патология в семьях с трисомией 21.

Различная степень отягощения родословных выявлена нами у 80% обследованных семей. Необходимо отметить, что это были именно те заболевания, стигмы дизэмбриогенеза или пороки развития, которые наблюдаются у пациентов с грисомией 21, а также повторные случаи рождения детей с трисомией 21.

Так. пптслогая у спбсов, независимо от пола ребенка, выявлена у 15% семей. Наиболее часто - в 3,6 % случаев - встречались пороки сердца и в 3,1% - дефекты невральной трубки: анэнцефалия, гидроцефалия, спинно-мозговая грыжа. Отмечены также злокачественные заболевания - опухоль мозга, лейкозы, ретинобластома; инсулиннезависи-мый диабет; расщелина губы и неба; пороки костной системы; задержка умственного развития.

У самих матерей в 5.7% случаев отмечены онкозаболевания и доброкачественные опухоли венских половых органов, в 3,1% -инсулиннезависимый диабет. У 7,8% матерей найдены заболевания щитовидной железы, причем доклинические проявления изменения её функции (гипофункция) выявлены у 36% женщин-доноров экстрахромосомы 21.

Важным является установленный факт, что эти заболевания с высокой частотой и в различных сочетаниях встречаются у родственников по материнской линии. Реже патология выявлена в родословных отца, но также преимущественно у родственников по материнской линии.

В некоторых родословных наблюдалась одинаковая патология, но более характерна гетерогенность клинических проявлений. Например, наличие ннсулшшезависимого диабета, гипотиреоза, онкозаболеваний у родственников матери, имеющей одного ребенка с трисомией 21, второго - с дефектами невральной трубки; или лейкоз и болезнь Альцгейме-

pa, а также другие сочетания в одной родословной.

Повторные случаи анеуплоидий установлены в 2-х семьях. В одной из них - двое живорожденных детей с трисомией 21, во второй семье -ребенок с трисомией 21 и плод с моносомией 45,Х0, выявленный пре-натально.

В 3,6% случаев трисомия 21 обнаружена в родословной матери - у родственников со стороны бабушки пробанда и сибсов матери. В 1,6% -в родословных отца: у родного брата его матери и сибсов отца пробанда.

Повторное рождение детей с трисомией 21 неоднократно описано в литературе и расценивалось как мутация de novo. В то же время повторные случаи синдрома обнаружены и в самоабортах, а также отмечены сочетания в одной семье самоабортов с различными анеуплоидиями (Jacobs, 1979; Alberman, 1981). На уровне констатации фактов приводятся в литературе данные о повышенной частоте аутоиммунных и злокачественных заболеваний в семьях с трисомией 21, а также о связи синдрома Дауна с нейродегенеративной патологией (Hook, 1981; Abramson et al., 1983).

Проведенный нами анализ 239 родословных, включая 190 родословных с различной степенью отягощения, из которых 39 - с повторными браками у матери и (или) бабушки пробанда, указывает на цитоплазматическую передачу наследственной предрасположенности к возникновению патологии, в частности трисомии 21 (рис.2, 3).

Самой частой патологией, обнаруженной у матерей и родственников по материнской линии, является нарушение репродуктивной функции - самоаборты, бесплодие различной продолжительности, нарушения менструального цикла. Характерно наличие повторных самопроизвольных абортов в ранних сроках беременности.

Родословные, демонстрирующие цнтоплазматическос наследование предрасположенности к возникновению патологии

О

опухоль матки

спинио-мозговая грыжа

донор

экстрзхромосомы 21 гипотиреоз

Вэ трисомия 21

инсулиннезависимый диабет

Рис.2

ОНЙ

л

□ щ

о

и

£

О

гипотиреоз

трисомия 21

донор

экстрахромосомы 21

рак груди

инсулиннезависимый диабет

Рис.3

Обнаружена повышенная частота близнецов, включая случаи, когда мать была из близнецовой пары. Отмечено раннее наступление менархе у матерей с нарушением репродуктивной функции.

Типичны изменения уровня половых гормонов, свидетельствующие о нарушении созревания яйцеклетки и овуляции - снижение эстрадиола, повышение прогестерона, гонадотропных гормонов - ЛГ и ФГГ, iинсрнролакiинемия.

Такая же аналогия с последствиями радиационного поражения, как была отмечена в пороках развития и заболеваниях, наблюдается и в отношении нарушений репродуктивной функции.

Имеются сведения о том, что облучение ш útero в дозе всего 0,01-0,05 Гр вызывало повышенную частоту раннего наступления менструации (ускорение созревания), mhoi оилодные беременности, увеличение количества мертворожденных и бесплодия. Эти данные сходны с Экспериментальными наблюдениями, из которых известно, что прена-т.тн.пое облучение, убивая миоше ооцнты, ускоряет разните оставшихся ооаитов. Известно также, что облучение женщин во время беременности повышает риск выкидыша в течение всей беременности, особенно во время имплантации эмбрионов и первых делений зиготы. Установлено, что свободные радикалы стимулируют биосинтез стероидных и гонадотропных гормонов, в частности прогестерона и пролактина, снижают уровень эстрадиола (Москалев, 1991).

Проведенное сравнение с эффектами радиации представляется обоснованным в связи с обнаруженным нами повышенным уровнем свободных радикалов, продуктов ПОЛ и снижением ангиоксидантной защиты (активности СОД, содержания глугатиона и а-гокоферола) у доноров экстрахромосомы 21 (табл.3).

Различная степень разбалансировки оксидантно-антиоксидантной системы отмечена у доноров экстрахромосомы 21.

Таблица 3

Показатели оксидантно-антиоксидантной системы и окислительного фосфорилирования у доноров

экстрахромосомы 21 (М ± ш)

Изученные показатели Женщины Мужчины

1 группа 18-35 лет 2 группа 36-45 лет 18-35 лет

Доноры, п = 40 Контроль, п = 25 Доноры, п = 30 Контроль, п = 25 Доноры, п = 15 Контроль, п = 50

ХЛ, 1тах, усл.ед. 31,0+0,9*° 26,4+0,9 39,9 +1,1* 35,0 ±0,9 34,8 11,9* 26,4+0,5

МДА, мМ/мг 4,71+0,16*° 3,1410,02 5,09+0,19* 3,6210,06 5,2110,27* 3,25+0,02

ДК, Е/л 1,8310,05*°* 0,94+0,04 2,1210,09* 1,13±0,04 2,0110,09* 1,30+0,03

Тр иглиц., мМ/л 0,8910,03*° 0,74+0,03 1,21+0,08* 0,7310,05 1,4810,1* 0,7410,06

СОД, ед.акт. 19,910,6*° 31,1±1,1 18,010,6* 34,710,8 18,410,8* 31,3+0,7

Каталаза, % 69,5+1,0 69,3±1,2 68,6+1,3 66,911,2 66,5+1,0 66,911,1

ОБН, мМ/л 0,8810,05*° 1,7210,11 0,8610,04* 1,5210,11 0,77+0,08* 1,41+0,05

а-токоф., мкМ/л 19,1 ±0,2*° 22,110,1 18,610,2* 22,2+0,1 20,610,5* 21,5+0,2

Р1,сыв. мМ/л 0,88±0,02* 1,1710,04 0,8310,02* 1,2410,04 0,8610,05* 1,0810,03

Р;,э, мМ/л 6,07+0,20* 4,4210,12 5,67+0,13* 4,0810,13 6,3410,45* 3,9510,14

АТФ, мМ/л 0,95+0,02* 1,1710,04 0,9710,02* 1,2210,04 0,9910,05* 1,3210,03

ЛДГ, Е/л 351,7±10,0* 245,6±15,4 368,0+13,6* 242,6112,6 324,5120,6* 249,9110,1

КК, Е/л 111,216,4* 60,113,02 121,8+7,1* 83,011,8 102,017,7* 79,113,8

* - Р < 0,05, достоверность различий между группами доноров и контроля; ° - Р < 0,05, достоверность различий между возрастными группами.

У 14% женщин с резким увеличением, по сравнению с общей группой, интенсивности свободнорадикальнмх процессов, наиболее выраженным снижением всех изученных звеньев антирадикальной зашиты, высоким уровнем продуктов ПОЛ выявлены повторные самоаборты, сахарный диабет, гипотиреоз, значительные изменения половых гормонов, высокая степень отягощения родословных -онкозаболевания и сочетание патологии у сибсов и родственников.

Таким образом, ¡¡ашлсния у доноров экстрахромосомы 21, членов семьи и родственников является проявлением синдрома пероксидации. Выраженность нарушений зависит от степени разбалансировки оксидан-тно-антиоксндантной системы.

Наличие отмеченных пороков развития и заболеваний в семье и у родственников по материнской линии служит основанием для включения семей в группу высокого генетического риска.

Дополнительным показателем неблагоприятного прошоза потомства в семьях с отягощенной родословной являются хромосомные нарушения.

Хромосомные нарушения у.доноров экстрахромосомы 21.

Цито1енетпческое обследование показало, что для доноров окстра-хромосомы 21 характерна хромосомная нестабильность, которая выражается в повышенной частоте аберраций всех типов - хромосомных, хроматидных и геномных (табл.4).

Таблица 4

Частота аберраций в обследуемых группах

Груп- К-во Частота метафаз Частота па 100 клеток

па проанал. с аберра- хроматид- хромосом- геномного

метафаз циями ного типа ного типа типа

I 4900 5,70+0,18*° 0,68+0,08 3,06±0,12 1.99+0.19

¡к 2500 1,48+0,11 0,12±0,07 0,9210,09 0,4410,12

11 3000 7,6910,21*° 0,9410,09 3,9410,23 2,90+0,21

Нк 2500 1,8810,12 0,20+0,07 1,12+0,09 0,5610,13

Ш 2100 5,81+0,20* 0,81±0,08 3,1010,21 1,9710,20

Шк 2500 1,60+0,12 0,16±0,06 0,92+0,12 0,5210,07

* - Р < 0,05 - достоверность различий между группами доноров и контролем (к); женщины I - 18-35 лет, II - 36-45 лет, мужчины III - 18-45 лет; ° - Р < 0,05 - достоверность различий между возрастными группами.

Аберрации хроматидиого типа выявлены в виде одиночных фрагментов и хроматидо-хроматидных обменов, хромосомные аберрации представлены парными фрагментами, дицентрическими и кольцевыми хромосомами, делениями, истинными инверсиями - чаще всего регулярной инверсией хромосомы 9, и соматическими инверсиями и транслокациями.

Особого внимания заслуживают геномные мутации. У 57% доноров экстрахромосомы 21 выявлены триплоидные клетки, наиболее часто добавочными были хромосомы из группы С (в подавляющем большинстве X), хромосома 21, маркерные хромосомы и дериваты. Реже в трисомных клетках обнаружены хромосомы 13 и 1В.

Особенностью кариотипа доноров (26% случаев) является наличие различных добавочных хромосом в клетках. Кроме того у 28% отмечены метафазы, в которых одна или более хромосом имели преждевременно разделившуюся центромеру. Среди гипоплоидных метафаз чаще обнаруживается потеря X хромосомы - ХО.

Отмеченные изменения, которые свидетельствуют о нестабильности хромосомного аппарата и указывают на нарушение функционирования центриолей и веретена деления, резко выражены в группе жешцин-до-норов с высокой степенью разбалансировки оксидантно-антиоксидан-тной системы. В этой группе выявлена наиболее высокая частота аберраций всех типов. Кроме гинернлоидных клеток с одной добавочной хромосомой отмечены метафазы с двумя добавочными хромосомами. Чаще, в 25% случаев, дополнительными были две X (48,ХХХХ), а также разные хромосомы, включая хромосому 21.

Сходные хромосомные аберрации у доноров экстрахромосомы 21 были описаны многими исследователями, однако значительно различаются данные литературы о частоте и спектре выявленных хромосомных нарушений (ДасоЬ5,1977; \^,1984; Бутомо, Ковалева, 1993).

По нашему мнению, такие противоречия объясняются чрезвычайно важным обстоятельством - временем обследования матерей.

Нами установлено, что если у отцов-доноров зкстрахромосомы 21 частота аберраций не изменяется при повторном обследовании, то у матерей, чье преимущественное происхождение дополнительной хромосомы доказано, - зависит от времени, прошедшего после рождения ребенка с трисомией 21.

На примере обследования 26 матерей в динамике установлено: в течение первого месяца иконе рождения ребенка процеш аберрантных клеток был сопоставим с контрольной группой или несколько выше, но значительно ниже частоты аберраций при обследовании матери спустя 5 и более месяцев. Различий в частоте хромосомных изменений через 5-6 месяцев и через год после рождения ребенка не было.

Таким образом, цитогенетические изменения высокоспецифичны для допоров экстрахромосомы, но их выявление у матерей зависит от времени, прошедшего после рождения ребенка. Частота и спектр хромосомны/. нарушений обусловлены степенью перокендации, что продемонстрировано в группах доноров с различной выраженностью разбаланенровки оксидаитио-антиоксидантной системы

Этот вывод согласуется с литературными данными о влиянии свободных радикалов на хромосомный аппарат клетки, а также хорошо изученными цитогенетическими изменениями, наступающими вследствие радиационного поражения. Нестабильность хромосом, соматические де-леции и транслокации, перицентрические инверсии, анеуплоидные клетки зарегистрированы как один из ранних эффектов радиации у людей и в эксперименте у потомства лабораторных животных (Уап\уе1, 1982; Оецшпа е1 а!, 1982; Бочков, 1971, 1992).

Представлены доказательства, что облучение человеческих лимфо-

цитов in vitro малыми дозами может увеличивать частоту нерасхождений в соматических клетках. Особо подвержены действию радиации хромосомы 21 и X (Uchida et al„ 1975).

Действие свободных радикалов во время деления клетки вызывает повреждение молекул ДНК, прочные сшивки и уменьшение конформационной подвижности надмолекулярных комплексов в нуклео-, липопротеидах, склеивание хромосом (хроматид), нарушение формирования, строения или функционирования центриолей и веретена деления (Ли, 1963; Прайор, 1979). Любое из этих событий задерживает или блокирует деление, может вызвать гибель клетки, хромосомные изменения, нерасхождение хромосом. Именно нерасхождение хромосом было первым генетическим эффектом облучения, открытым у дрозофилы (Ли, 1963).

Нарушения, возникающие при действии свободных радикалов у доноров экстрахромосомы 21, по аналогии с радиационным поражением, обусловлены уровнем повышения и длительностью разбапансировки ок-сидантно-антиоксидантной системы.

При достаточных компенсаторных возможностях антирадикальной защиты повышенный уровень свободных радикалов, вызвав нерасхождение хромосом, в силу гораздо большей чувствительности половых клеток, в целом не отразится на здоровье родителей и в дальнейшем - на будущем потомстве. Но равновесие может быть существенно нарушено и выражаться не только в патологии у родителей, но и в повторных случаях трисомии 21, сочетании хромосомных и нехромосомных синдромов у сибсов, как это было показано в семьях с высокой степенью пероксидации.

В зависимости от дозы и времени, наряду с компенсаторными возможностями антиоксидантной защиты, при действии радиации могут не проявляться или возникать патологические изменения различной вы-

раженности. Именно эти параметры Moiyr объяснить противоречия в вопросе влияния радиации на частоту синдрома Дауна (Alberman et al., 1972: Harjulehto-Mervaala et al., 1992). В то же время в большинстве исследований связь между облучением матерей и зачатием детей с синдромом Дауна доказана (Ramsey et al., 1991; Sperling et al, 1991, 1994). Установлено, что действие радиации прежде всего отразилось на частоте рождения детей с синдромом Дауна женщинами старших возрастных групп (IJchida, 198!: Strigini et al., 1990).

Проведенное нами исследование позволяет объяснить причины этих явлений, а также обосновать возрастзависимое повышение частоты синдрома Дауна.

Хромосомная нестабильность, отражающая степень пероксидации у доноров экстрахромосомы 21, более выражена у матерей старшей возрастной фупны (табл.4). В группе 36-45 лет по сравнению с фуппой i «s-35 лет частота аберраш.'й всех типов повышена в целом на 35%. при этом особенно сильно увеличивается с возрастом количество анеуплондных клеток - на 50%. В контроле наблюдается аналогичная тенденция - повышение количества аберраций с возрастом, но их частота меньше, чем у доноров как старшей, так и младшей возрастных групп. При этом хроматидо-хроматидные обмены, а также соматические транслохации и инверсии в контроле выявлен!.! только в фуппе старшего возраста, а клетки с двумя добавочными хромосомами в контроле обнаружены не были.

Сравнение двух возрастных фупп женшин-доноров показало усиление разбалансировки оксидантно-антиоксадантной системы с возрастом. Рост интенсивности свободнорадикальных процессов в фупле 36-45 лет по сравнению с фуппой 18-35 лет составил 30%.

Аналогичная тенденция наблюдалась для продуктов ПОЛ: разность концентраций ДК между возрастными группами доноров составила 16% и статистически значимо в старшей группе доноров по сравнению с младшей повышены концентрации МДА и триглицеридов. Одновременно в старшей группе доноров снижена активность СОД и уменьшена концентрация а-токоферола (табл.3).

В контроле различия интенсивности свободнорадикальных процессов и концентрации продуктов ПОЛ между возрастными группами аналогичны таковым у доноров. В то же время антиоксидантная защита у женщин в контроле претерпевает изменения, отличные от изменений у доноров. Активность СОД в старшей контрольной группе несколько выше, чем в младшей, и имеет тенденцию к снижению только после 41 года, а уровень а-токоферола в обеих группах одинаков, что свидетельствует об активации компенсаторных возможностей антиоксидантной защиты в контрольной группе 36-40 лет.

Таким образом, с возрастом и у доноров, и в контроле происходит разбалансировка оксидантно-антиоксидантной системы и усиливаются признаки пероксидации.

Проведенное нами параллельное сравнение возрастзависимого распределения интенсивности свободнорадикальных процессов с возрастзависимой частотой рождения детей с трисомией 21 показало идентичную направленность обеих зависимостей от возраста матери, свидетельствуя о том, что одним из главных факторов повышения частоты синдрома Дауна и накопления свободных радикалов является возраст.

Полученные данные позволяют объяснить, почему действие радиации увеличивает риск рождения ребенка с трисомией 21 прежде всего у матерей старшего возраста, а также указывают на соотносительную роль генетических и средовых факторов возникновения синдрома.

Роль митохондриального генома в возникновении трисомии 21.

Обшим для двух названных факторов - возраста и радиации, -связанных или сопровождающихся повышением уровня свободных радикалов, являются изменения в митохондриях.

Накопление повреждений в структуре митохондриальной ДНК обнаружено в процессе старения и лучевого поражения (Гусев, Паччешы, 1982, Каиушо, 19S2; Капиап, 1991). Мутации в мтДНК обнаружены у людей в возрасте от 40 лет и старше. Устаноачено, что разбалансировка оксидантно-антиоксидантной системы происходит по мере накопления мутаций в мтДНК (Linnane et al., 1992; Richter, 1992).

В процессе нескольких этапов анализа мтДНК у доноров экстрахромосомы 21 и проведенного нами полного секвенирования обнаружены не описанные ранее точковые мутации, не относящиеся к полиморфизму, в районах АТФ-азы и ND 5 с одинаковыми аминокислотными заменами аланина на триптофан, а также в районе ND 1 с заменой валина на метионин (табл.5, рис.4).

Несмотря на то, что окончательный этап - секвенирование - из-за высоко!! стоимости исследования удалось провести только в одном случае, подтверждением роли митохондриального генома в патогенезе синдрома трисомии 21 является обнаруженное нами снижение эффективно-сзи окислительного фосфорилнрования у доноров гжстрахромосомы 21 как в старшей, так и в младшей возрастных группах (табл.3).

Выявлены стойкое снижение АТФ и неорганического фосфора сыворотки, накопление фосфора эритроцитов, не включенного в АТФ. Параллельное повышение активности лактатдегидрогеназы и креатинки-назм указывает на компенсаторное усиление гликолиза.

Таблица 5.

Точковые мутации в мтДНК, обнаруженные у донора экстрахромосомы 21

Положение Ген Аминокислот- Значение

нуклеотидов ные замены

Т72С D-loop - полиморфизм

A263G D-loop — полиморфизм

A2706G ] 6SrRNA полиморфизм

G3337A ND I Val/Met новая точковая

мутация

С7028Т СОХ I - полиморфизм

G8764A ATPase 6 Ala/Thr новая точковая

мутация

A8860G ATPase 6 Thr/Ala полиморфизм

Т9495С СОХ III - не описано

(полиморфизм)

G9559C СОХ III Arg/Pro полиморфизм

TU335C ND 4 - полиморфизм

C11447G ND 4 Leu/Val полиморфизм

G13243A ND 5 Aia/Thr новая точковая

мутация

G14272C ND 6 Phe/Leu полиморфизм

G14365C ND 6 - полиморфизм

G14368C ND 6 Phe/Leu полиморфизм

Т14766С Cyt b Phe/Leu полиморфизм

Т14766С Cytb lle/Thr полиморфизм

A15226G Cyt b — не описана

(полиморфизм)

Т16298С D-loop полиморфизм

1. TATACCCATTCTAATCGCAATGGCArrCCTAAT<îC'lTACCGAAGGAAAAA'rTC'r/\GGCT/v

:::::::::::: :::::: :::::::::::::-.:: :::::::::::::

2. TGTACCCATTCTAATC(;CAATGGC/\TTCCTAA'rGC'í"'rACCGAAGGAAAAA'ITCrAGGCTA

3340 3350 3360 3370 3380 3390

1. TTTAITACCACAACTAACCTCCTCGGACTCCTGCCTCACTCATTTACACCAACCACCCAA

2. TTTATTGCCACAACTAACCTCCTCGGACTCCTGCCTCACTCATTTACACCAACCACCCAA 8760 8770 8780 8790 8800 8810

1. ATCTAAAAAAAAATCGTIAACCi rCTCCACGTi rCAAGTTCAACTAGGGACTCATA.AATA

2. ATCTAAAAAAAAATCGTTAGCCTTCTCCACG T'rrC.A/vGTTCAACTAGGGACTCA'rAAATA 13230 13240 13250 13260 132.70

Рис.4. Полная последовательность нуклеотидои в районах с найденными точковимн мутациями.

1 - мтДНК донора

2 - контрольная мтДНК

Из работ по изучению митохондриального генома известно, что болезни, связанные с нарушением окислительного фосфорилирования, часто сопровождаются гетеропластическими мутациями в мтДНК, при которых в каждой клетке присутствуют как нормальная, так и мутантная мтДНК, накапливаясь в различных соотношениях. Степень выраженности патологии и риск передачи зависят от доли (содержания) мутантной мтДНК (Shay, Werbin, 1992; Wallace et al„ 1992, 1995).

Обнаруженные нами точковые мутации в мтДНК у донора экстрахромосомы 21 могут быть патогенетическими, но не исключена возможность наличия мутаций и в других районах мтДНК. Показано, что при митохондриальных болезнях с известной локализацией изменений в мтДНК в ряде случаев точковые мутации выявляются в других районах, но с одинаковыми или сходными клиническими проявлениями (Wallace et al., 1995). Установлено, что наиболее характерной чертой мтДНК-болезней является их фенотипическая гетерогенность.

В родословной матери, у которой обнаружены новые точковые мутации, выявлены болезнь Альцгеймера и лейкоз у родственников по материнской линии. Известные по данным литературы повышение уровня свободных радикалов и наличие мутаций в мтДНК при болезни Альцгеймера, инсулиннезависимом диабете, некоторых онкозаболеваниях (Baynes, 1991; Shapira, Cooper, 1992) объясняют связь синдрома Дауна с перечисленными состояниями.

Таким образом, патогенетически обоснованными становятся обнаруженные нами повышение уровня свободных радикалов, интенсифицирование ПОЛ и снижение антиоксидантной защиты у доноров экстрахромосомы 21; установленное при анализе родословных цитоплазмати-ческое наследование предрасположенности к патологии, преимущественно материнское происхождение дополнительной хромосомы 21; общие черты и различия клинических проявлений у сибсов, матерей и родственников по материнской линии.

Результаты проведенного исследования позволили нам схематически продемонстрировать порочный круг причинно-следственной взаимосвязи возникновения и последствий процессов пероксвдации (рис.5).

Патогенетические звенья порочного круга возникновения и последствий синдрома пероксидации

Рис.5

Вынашивание плода с трисомией 21 является таким же следствием синдрома пероксидации у матерей, как и возникновение патологии.

Принципиальным отличием разбалансировки оксидантно-антиокси-дантной системы у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21 является разнонаправленный характер изменения активности СОД -снижение у матерей и повышение у детей, при этом отклонение показателей от контроля примерно одинаково - в среднем в 1,5 раза.

Как было нами установлено, частота хромосомных аберраций у матерей-доноров минимальна в течение первого месяца после рождения ребенка с трисомией 21. По мере увеличения срока, прошедшего после родов, хромосомная нестабильность нарастает.

Аналогичная тенденция обнаружена у матерей-доноров в изменении параметров оксидантно-антиоксидатной системы.

В первые недели после рождения ребенка с трисомией 21 у матерей не наблюдалось снижение СОД до значений, характерных для всей группы доноров. Более того, активность СОД у них была выше, чем в контрольной группе женщин, обследованных в тот же период после родов, и сопоставима с активностью СОД у детей с трисомией 21. В пределах контрольных значений находился уровень свободных радикалов.

При повторном обследовании матерей через 3 и 6 месяцев выявлены резкое снижение активности СОД и усиление интенсивности свобод-норадикальных процессов (табл.6).

Таблица 6

Интенсивность свободнорадикальных процессов и активность СОД в динамике послеродового периода (М ± т)

Изученные показатели Женщины-доноры 18-35 лет Контроль

2 недели после родов п = 20 3 месяца после родов п = 20 6 месяцев после родов п = 20 2 недели после родов п = 20

усл.ед 27,0±0,9** 30,5±0,9* 31,3±0,8* 28,5+0,6

сод, ед.активн. 33,6+1,0** 19,8+0,7* 19,3+0,6* 29,5+0,7

*-Р<0,05, достоверность различий между группами доноров и контроля; **-Р<0,05, достоверность различий между группами "2 недели" и "3, 6 месяцев".

Выявленная тенденция изменения активности СОД и уровня свободных радикалов в зависимости от времени, прошедшего после рождения ребенка с трисомией 21, показывает, что СОД плода в силу эффекта дозы lena оказывает компенсаторное влияние на оксидантную систему матери и снижает уровень пероксидаиии. Чем сильнее выражены процессы ягрч-ксидащш у матери, тем больше ее организм нуждается в дополнительной антиоксидантной защите.

Гаким образом, разнонаправленный характер изменения активное!и СОД способствует стабилизации состояния оксидантно-антиоксидантной системы матери и сохранению беременности плодом с трисомией 21.

Этот вывод позволяет также объяснить установленный факт, что у абортусов гораздо чаше, чем у живорожденных детей, обнаруживается экстрахромосома отцовского происхождения (Hassold, 1984; Muller et а!.. 1996).

В то же время у женщин старшей возрастной ¡руппы с высокой i-renei-! ü> иероксидац!!!] считается способность элиминировать плоды с триоомией 2!. так как срабатывает тог же механизм зависимости от СОД. При этом неважно, нмесг ли хромосома материнское или отцовское происхождение.

Тем не менее, высокий процент элиминации будет наблюдаться у женщин активного репродуктивного периода в тех случаях, когда повышение уровня свободных радикалов будет достаточным, независимо от причин возникновения, чтобы повлиять на нерасхождение хромосом в мейозе, но недостаточным для серьезных нарушений и разбалансировки на уровне организма.

Такие ситуации обьясняются, с одной стороны, более высокой чувствительностью половых клеток, с другой - компенсаторными возможностями антиоксидантной защиты.

Свидетельством тому, что повышение компенсаторных возможностей организма снижает степень пероксидации, независимо от причин, вызвавших повышение уровня свободных радикалов, являются результаты обследования матерей-доноров экстрахромосомы 21 после применения комплекса витаминов, микроэлементов и лечебных трав, обладающих антиоксидантным действием (табл.7, 8).

Обнаружена стабилизация оксидантно-антиоксидантной системы -уменьшился уровень свободных радикалов и продуктов ПОЛ, увеличилась активность СОД, концентрация а-токоферола и восстановленного глутатиона, повысилась эффективность окислительного фосфорилирования. Как следствие снижения свободнорадикального поражения нормализовались цитогенетические показатели хромосомной нестабильности - резко уменьшилась частота аберраций всех типов.

Полученные результаты указывают на реальную возможность профилактики трисомии 21 и широкого спектра пороков развития плода при назначении антиоксвдантной терапии женщинам детородного возраста.

Таким образом, сопоставление полученных данных о свободноради-кальном поражении у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21 с клиническими проявлениями, результатами цитогенети-ческих и молекулярно-генетических исследований позволило предоставить патогенетическое обоснование возникновения, манифестации и профилактики синдрома трисомии 21.

Таблица 7

Показатели оксидантно-антиоксидантной системы и окислительного фосфорилирования у жешцин-допоров экстрахромосомы 21 до и после антиоксидантной терапии (М ± т)

Изученные Доноры, 18-35 лет Контроль,

показатели до терапии после терапии 18-35 лет

п = 40 п = 25 л = 25

1тах. усл.ед. 31,1 ±0,9* 27,0±0,5 26,4±0,9

МДА, мМ/мг белка 4,71 ±0,1 б* 3,55+0,04 3,14±0,02

ДК, Е/л 1,83+0,05* 1,24±0,03 0,94+0,04

СОД, ед.акт. 19,9±0,6* 30,1 ±0,2 31,1±1,1

а-токоферол мкМ/л 19,1+0,2* 21,8±0,2 22,1±0,1

вБИ, мМ/л 0,88±0,05* 1,39±0,07 1,72±0,11

Р,СЫ1, мМ/л 0,88±0,02* 1,11 ±0,02 1,17+0,04

Г'| мМ/л 6,07+0,20* 4.59±0,09 4,42+0,12

АТФ, мМ/л 0,95±0,02х 1,10+0,02 1,17±0,04

л - Р < 0,001 - достоверность различий между показателями до и после терапии

Таблица 8

Частота аберраций у женщин-доноров экстрахромосомы 21 18-35 лет до и после антиоксидантной терапии (М ± т)

Обслед. фуппа К-но проанал метафаз Частота мегафаз с аберрациями Частота на 100 клеток

хроматид-ното типа хромосомного типа геномного типа

до терапии 2500 5.80±0Л8* 0,80+0.10* 3.28+0,12* 1,88+0.10*

после терапии 2500 1,12+0,10 0,20±0,0ъ 0,64+0,0Й 0,28+0,Он

Контроль 2500 1,48±0,1! 0,12+0,07 0,92+0,09 0,44±0,12

* - Р < 0,001 - достоверность различий между показателями до и после терапии

выводы

1. Популяционная частота синдрома Дауна в Донецкой области составляет 1:739 живорожденных детей. Риск рождения больного ребенка повышается с возрастом женщины от 1:1997 в 18-23 года до 1:77 в 41-45 лет.

2. Установлено, что в возникновении и манифестации синдрома трисомии 21 важная роль принадлежит повышенному уровню свободных радикалов, усилению процессов перекисного окисления липидов и нарушению ферментных и неферментных звеньев антиоксидантной системы.

3. Повышенный уровень свободных радикалов у пациентов с трисомией 21 при увеличенной активности СОД, в силу эффекта дозы гена, вызывает активацию перекисного окисления, от степени которой зависят полиморфизм клинических проявлений и тяжесть течения синдрома.

4. У доноров экстрахромосомы 21, в противоположность пациентам с трисомией 21, при повышенном уровне свободных радикалов обнаружено резкое снижение активности СОД и однонаправленное изменение системы антиоксидантной защиты, от компенсаторных возможностей которой зависит выраженность проявлений пероксидации. Разнонаправленный характер изменения активности СОД у матери и плода способствует стабилизации состояния оксидантно-антиоксидантной системы матери и сохранению беременности плодом с трисомией 21.

5. Накопление свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов и разбалансировка антиоксидантной системы происходят с возрастом, что, с одной стороны, объясняет возрастзависимую частоту синдрома Дауна, с другой, - прогрессирующий характер патологии, раннее старение и высокую смертность пациентов с трисомией 21.

6. Дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы проявляется у доноров экстрахромосомы 21 в хромосомной нестабильности, повышенной частоте злокачественных и аутоиммунных заболеваний, изменении гормонального статуса, нарушении репродуктивной функции

вплоть до повторных случаев трисомии 21, в зависимости от степени синдрома перокснаацим, возникновение которого обусловлено еоонюсителыюи ролыо генетических и средовых факторов.

7. Выявлены не описанные ранее точковые мутации в митохопдри-альпой ДНК у матери-донора экстрахромосомы 21 в районах АТФ-азы и N7) 5 с одинаковыми аминокислотными заменами ;панпна на триптофан. а также в районе N0 1 - ватина на мечиопик.

8. Обнаруженные изменения в мтДНК лают основание ппеягтолагт,, что муинии мтДНК являются тем генетическим фактором, который:

- вызывает повышение уровня свободных радикалов и снижение эффективности окислительного фосфорилирования;

объясняет преимущественное материнское происхождение дополнительной хромосомы 21;

- обосновывает отягощение родословных по материнской линии и гетерогенность клинических проявлений в семьях:

'ч./.тнержлчет выявленное ни I ошкпматичео.ое наследование предгмспо южеинос Iи к возникновению трисомии 21.

О', Наличие и сочетание онкопаюло] ий. инсу.чиннезависимот диабега. зчГчшевнниЙ щитовидной железы, самоабортов в ранних сроках в семьях и родословных по материнской .линии служиI предвестником рождении ребенка с трисомней 21 и основанием для включения семьи в фуппу высокого /енечическою риска. Дополнительным показателем неблагоприятного прогноза потомства является выявление хромосомной нслабн и.ности в семьях с о пи пшенным аначиеюм.

10. Антиоксидантная терапия доноров экстрахромосомы 21 привела к снижению уровня свободных радикалов и интенсивности перекисного окисления липидов. повышению энергетической обеспеченности организма, стабилизации хромосомною аппарата. Полученные данные обосновывают использование антиоксидангов женщинами детородного возраста для профилактики широкого спектра патологии плода и, в частности, трисомии 21.

список

опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Арбузова С.Б. О роли митохоидриальной ДНК в происхождении регулярной трисомии хромосомы 21 // Цитология и генетика - 1995.

- Т.29. - N3. - С. 77-80.

2. Арбузова С.Б. Не много ли внимания уделено ядерному геному в патогенезе болезни Дауна? Новая гипотеза II Биополимеры и клетка

- 1995.-Т.П. - N2.-С. 106.

3. Арбузова С.Б. Свободные радикалы в возникновении и клиническом проявлении синдрома Дауна // Цитология и генетика - 1996. - Т.30.

- N2. - С. 25-34.

4. Арбузова С.Б. Возрастзависимая частота синдрома Дауна и свободно-радикальная теория старения //' Цитология и генетика -1996. - Т.30.

- N5. - С.26-34.

5. Арбузова С.Б. Причины возникновения симптомокомплекса пороков развития при синдроме Дауна II Клнпчна ¡мунолопя та алершлопя // Сб1рник наук, праць - Кшв-Луганськ - Вип.1. -1996. - С. 5-9.

6. Арбузова С.Б. Новий пщхщ до вивчення патогенезу регулярно'/ трисомп хромосоми 21 // И з"1'зд мед. генегиклв Укражи: Тези доп. -Льв1в - 1995. - С. 8.

7. Arbuzova S. The role of free radicals in etiology and pathogenesis of trisomy 21 // Europ. J. Hum. Genet. - 1996. - Vol.4, S.l. - P. 157.

8. Arbuzova S. New approach to pathogenesis and etiology of trisomy 21 // The Amer. J. Hum. Genet. - 1996. - N 10. - P. 142.

9. Арбузова С.Б., Николенко M.И. Использование скрининга факторов материнской сыворотки для пренатальной диагностики пороков развития и хромосомных заболеваний плода // Цитология и генетика

- 1995. - Т.29. - N 4. - С. 44-47.

10. Арбузова С.Б., Хлевная Л.А., Казначеева Е.Б. Формирование групп риска и проведение инвазивной пренатальной диагностики // Цитология и генетика - 1995. - Т.29. - N 5. - С. 76-81.

11. Arbu/.cwa S.. Niekolenko M. Maternal serum AFP and hCG in diagnostics of fetal chromosomal abnormalities // Europ. J. Hum. Genet.

19%. - Vol.4, S.l. - P. 157.

12. Арбузова С.Б.. Соловьева В.Д., Федотова О.О, Снижение эффективности окислительного фосфорилирования у доноров экстрахромосомы 21 i! Биополимеры и клетка. - 1996. - Т. 12. N 4. - С.84-87.

13. Николенко МИ.. Арбузова CK. Подбор оптимальных условии проведения цепной реакции синтеза ДНК при идентификации мутаций в 12-м экзоне гена фенилаланиигидрокснлазы человека 11 Биополимеры и клетка - 1990. - Т.6. - N 2. - С. 35-38.

14. Арбузова С.Б., )Оивна Л.А. Удосконалення класично1 методики культивування та фжеаци амнгоцттв // II з'Узд мед. генетик ir, Укра'ши: Тези доп. - Лынв, 1995. - С.9.

15. Дзюба Н.Ф., Дружинша О.Н., Арбузова С.Б. Методи ншвищення якосп цитогенетичних препарат // II злзд мед. генепшв Укра'ши: Тези дои. - JlbBÍB, 1995. - С.61.

16. HIko.tlwko Vi.I., Арбузова (.'.Б. Деяк! особливогп змии; pißiia альфа-•.¡>г i' 4ipt' i eins' и гиро/ад iu Marepi при хр-.шосомнчх норушеннях плоду ü И Уп, мед. leiieTiiKÍB Укра'ши. Теш дон. - Льрдк. 1995. -С. I 09.

17 Фор'-isлишни нотомв лдя npenanvibnoi лишпоикн в Донецькому КНжоблаеному Медико-гене гичному Центр! / Арбузова С.Б., IiiKo'ioHM) М.1., Малова С.Д., Хлшна Л.Л.. Дружинша О.Н. // II з'Узд мед. icnei HKiB Укражн: Тези доп. - JIlbíb, 1995. - С. 8.

18. Арбузова С.Б., Казначеева Е.Б. Опыт применения инвазивных ме-юдов нренакин.ной диагностики во 2 триместре беременноеги // Современные проблемы в клинической циниенезике, сб. науч. труд. - М„ 1991. - С. 2-3.

19. Николенко М.И., Арбузова С.Б. Использование скрининга на а-фе-топрогеин и хорионическии гонадотроннн в нренаппьной диашо-сгике наследственных заболеваний // Пренатальный и неонатальный скрининг врожденной и наследственной патологии.: Тез. докл. Всесокнной научно-нрактич. конф. - Харьков, 1990. - С. 2.6.

20. Арбузова С.Б., Николенко М.И. Массовая скринирующая программа на а-фетопротеин для выявления патологий плода // Второй Все-союзн. съезд мед. ген.: Тез. докл. - Алма-Ата, 1990. - С. 25-26.

21 Николенко М.И., Арбузова С.Б., Шварц Е.И., Хальчицкий С.Е. Идентификация мутаций в гене фенилаланингидроксилазы человека методом подимеразной цепной реакции // Второй всесоюзн. съезд мед. ген.: Тез. докл. - Алма-Ата, 1990. - С. 323.

22 Arbusova S., Nicolenko М. Screening fetal chromosomal diseases and congenital malformations using maternal serum a-fetoprotein (MSAFP) and chorionic gonadotropin (hCG) in second trimester // In: Early Fetal Diagnosis: Recent Progress and Public Health Impact. Karolinum-Charles University Press. - Prague, 1990. - P.7.

23. Arbuzova S. Kalinin D. A new approach to studying the etiology and pathogenesis of trisomy 21 // Brazil. J. Genet.- 1996. - Vol.19, S.2. -P.206.

24. Arbuzova S. Nikolenko M„ Kalinin D. Maternal serum AFP and hCG in diagnostics of Trisomy 21 // Brazil. J. Genet.. - 1996. - Vol.19, S.2. -P.206.

25. Гормонодиагностика патологии беременности / Зяблицев С.В., Яковлева Э.Б., Арбузова С.Б., Сорокатая Э.В., Николенко М.И.: Метод, рек. - Донецк, 1995. - 20с. - (МОЗ Украины).

26. Arbuzova S, Nikolenko М Fetus's inversion of chromosome 9 increases the rate of false-positive maternal serum screening results // PECO-EUCROMIC Congress: Abstract. - Prague, 1996. - P.79.

27. Arbuzova S, Nikolenko M, Khlevnaya L. Prenatal diagnostics of Down's syndrome in the Donetsk region of the Ukraine // PECO-EUCROMIC Congress: Abstract. - Prague, 1996. - P.78.

АрЗузова С.Б. Клинико-патогенетическое обоснование возникновения и

манифестации синдрома трисомш<21. Рукопись диссертации на соискание у ючен степени доктора медицинских наук по специалыюсти14.03.23 - генетика (медицинские науки"). Украинский научный гигиенический центр. Киев. ¡996.

Установлена популяционная частота синдрома Дауна в Донецкой обл. Обнаружены интенсификация свободнораликальных процессов и нарушение аитиохспдангной зашиты у доноров экстрахромосомы и пациентов с трисомией 21. Степенью разбалаисировки оксидантно-аншоксидантной системы, усиливающейся с возрастом, обусловлены тяжесть течения и прогрессирующий характер ¡/aiu.iiiiии при 1РИЧ1МИИ ¿1, вочраетзнвисимня частота синлрома. ВыяЕдены цитоплазматическое наследование предрасположенности к возникновению три-сотш 21, гетерогенность клинических и цитогенетических проявлений у членов семьи и родственников, не описанные ранее толковые мутации в мт-ДНК у донора экстрахромосомы 21, механизмы, способствующие сохранению беременности аномальным плодом. Предложен патогенетически обоснованный подход к формированию групп высокого генетического риска и профилактике синдрома. По теме диссертации опубликованы 27 научных работ.

Arbu/ova S.ii. Clinico-pathogenetic substantiation of the origin and manifestation of trisomy 21 syndrome. The manuscript of dissertation for a Doctor's degree in Medicinc, speciality 14.03.23 - genetics (medical science). Ukrainian Scientific Hygienic Ccr.trc. Kic\. 1496.

Population frequency of Down's .syndrome in the Donetsk region had been established. Intensification of free radical processes and disturbance of antioxydant protection in donors of extra chromosome and patients with trisomy 21 had been found. The difficult course and progressing character of pathology with trisomy 21. the age-dependent frequency of syndrome arc explained by the level of the oxydant-autioxydaiU >>stem's dishalancing that becomes wotse with age. The cytoplasmic inheritance of predisposition to the rise of trisomy 21, heterogeneity of clinical and cytogenetic manifestations in family members and relatives, new point mutations in mt-DNA in a donor of extra chromosome 2!, the mechanisms promoting the effected fetus safety during pregnancy had been revealed. Pathogenetic background of the high genetic risk groups formation and syndrome prevention had been submitted. 27 scientific papers within the context of dissertation had been published.

Ключевые слова: грисомкя 21, возникновение, манифестация, доноры экстрахромосомы 21, оксидантно-антиоксидантная система, хромосомные аберрации, мутации в митохондриальной ДНК