Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Клинико-морфологическая характеристика послойной кератопластики при различных способах фиксации материала "Аллоплант" у кроликов

ВАК РФ 06.02.04, Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства

Автореферат диссертации по теме "Клинико-морфологическая характеристика послойной кератопластики при различных способах фиксации материала "Аллоплант" у кроликов"

На правах рукописи

Морозов Илья Юрьевич

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕС КАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛОЙНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ФИКСАЦИИ МАТЕРИАЛА «АЛЛОПЛАНТ» У КРОЛИКОВ

06.02.04 - ветеринарная хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

005058252

1 6 МАЙ Ш

Москва 2013

005058252

Работа выполнена на кафедре биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Научный руководитель: Сотпиквва Лариса Федоровна

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая кафедрой биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Официальные оппоненты: Виденнв Владимир Николаевич

доктор ветеринарных наук, доцент. Кафедра оперативной хирургии ФБГОУ ВПО «Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины»

Позябив Сергей Владимирович

кандидат ветеринарных тук, доцент. Кафедра ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная

сельскохозяйственная академия имени П. А. Столыпина»

Защита диссертации состоится «.¿дъ мая 2013 г. в ^'СОчасов на заседании диссертационного совета при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академии Скрябина, 23; тел. 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан « 2013 года и размещен на сайтах

http://www.vak2.ed.gov.ru/. http://www.mgavm.ru/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование классических и разработка новых методов лечения животных с роговичными травмами является актуальной проблемой ветеринарной офтальмологии. Особую значимость ее решение приобретает в настоящее время, поскольку новые существующие способы воздействия на репаративные процессы ткани роговицы не всегда обеспечивают достаточный эффект. Частота травматизма, тяжесть осложнений, большой удельный вес больных животных с травмой роговицы диетуют необходимость поиска новых способов хирургической коррекции (Е. П. Копегасин, Л.Ф. Сотникова, 2006; А. Г. Шилкии, В. В. Олейник, 2005).

Особый интерес в этом отношении представляет «Аллоплант», используемый в качестве донорского материала при проведении как сквозной, так и послойной кератопластики. Известна его роль в процессах регуляции клеточного метаболизма роговицы (Муддашев Э.Р., Муслимов С.А, Нигматуллин Р.Т., Кийко Ю.И., Галимова В.У., Салихов А.Ю., Сельский Н.Е., Булатов Р. Т., Мусина Л.А. 1999). Немногочисленные научные сообщения в основном, посвященные анализу клинического эффекта замещения собственной тканью, фрагментарны и противоречивы.

Несмотря на имеющиеся исследования в данном направлении, мало изученными остаются вопросы оценки эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллопланг». Отсутствуют данные о клинико-морфологических преобразованиях роговицы, а также критерии оценки морфофункционального состояния роговицы при различных способах фиксации алломатериала.

Недостаточная освещенность данной проблемы в ветеринарной литературе, сложность и многогранность патогенеза регенерации роговицы, необходимость дальнейшего рассмотрения свидетельствует об актуальности избранного научного направления.

Цель исследования: разработать научно-обоснованный подход к клинико-морфологической характеристике послойной кератопластики при различных способах фиксации материала «Аллоплант» у кроликов.

Задачи исследования:

1. Изучить диагностические клинические признаки регенерации роговицы при центральной фиксации аллошшпа и установить их прогностическую

31ИЧИМОСТЬ.

2. Изучить диагностические клинические признаки регенерации роговицы при периферической фиксации аллопланта и установить их прогностическую значимость.

3. Изучить видовой состав и микробную обсемененность коньюнктивалыюй полости у кроликов при различных способах фиксации алломатериала.

4. Определить морфологические и биохимические показатели крови у экспериментальных животных после проведения кератопластики с использованием алломатериала.

5. Установить закономерности патогенеза и морфогенеза заживления роговичных ран в эксперименте, в зависимости от способов фиксации и места локализации материала «Аллопланта.

Научная новпзпа. На основании использования комплексного методического подхода к изучению процесса регенерации роговой оболочки глаза научно обосновано проведение операции с использованием различных способов фиксации материала «Аллоплант». Изучены диагностические клинические признаки регенерации роговицы при центральной и периферической фиксации аллопланга. Выявлено, что клинические признаки переднего отрезка глазного яблока не зависят от способов фиксации аллопланга. Показано, что использование функционального тестирования, витальных красителей, анализа микробной обсемененности позволяет оценить степень выраженности и характер регенеративных изменений поверхности роговицы, от которых в дальнейшем зависит, прозрачность приживления трансплантата.

Выявлено, что характер структурных преобразований роговицы определялся местом локализации трансплантата. Центральный способ фиксации сопровождался прогрессирующими изменениями наружного эпителия и стромы роговицы, наличием алломатериала в препаратах. Выявлено значительное увеличение количества фибробластов и макрофагов вокруг фокальной зоны, нарушение архитектоники коллагеновых волокон стромы и пролиферация клеток роговицы. При периферической фиксации обнаружена слабая регенеративная активность клеток, отсутствие в препаратах алломатериала и гиперплазии эпителия. Толщина роговицы на всем протяжении исследуемого участка не изменялась, что свидетельствовало о ее восстановлении в исследуемый период. Репаративная регенерация роговицы протекала при участии грануляционной ткани, как в контрольной, так и экспериментальной группах независимо от места локализации аллопланга.

Теоретическая и практическая значимость. В результате комплексного методического подхода к обследованию органа зрения, клинико-офтальмических, морфологических исследований, проведена оценка эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллоплант». Разработана тактика проведения послойной кератопластики. Выявленные патогномоничные признаки переднего отрезка глазного яблока, а также результаты использования функциональных тестов (тест Ширмера, проба по Норну) и витальных красителей, характеризующих степень выраженности и характер патологических изменений поверхности роговицы, позволили разработать алгоритм оценки структурно-функционального состояния роговицы при различных способах фиксации аллопланга. Критериями оценки эффективности проведения операции явилась сравнительная характеристика рубцовых помутнений.

Выявленные клинико-морфологические параллели, при ранениях роговицы различной локализации, позволили научно обосновать и внедрить в ветеринарную практику два рациональных способа фиксации биоматериала «Аллоплант». Данные, полученные в процессе эксперимента, дополняют и расширяют сведения о хирургическом лечении мелких домашних животных с роговичными травмами различной локализации. Они могут использоваться в преподавательской деятельности по курсу частной хирургии, а также в работе практикующих офтальмологов в условиях обычной ветеринарной клиники.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Оценка эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллоплант».

2) Диагностические и клинические признаки регенерации роговицы, при различных способах фиксации материала «Аллоплант», основанные на выявлении патогномоничных признаков, затрагивающих передний отрезок глазного яблока, а также результатов использования функциональных тестов (тест Ширмера, проба по Норну).

3) Клинико-морфологические преобразования роговицы при различных способах фиксации.

Сведения о практическом использовании научных результатов

Полученные данные используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных, а также на кафедре ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. Разработанные, в результате научных исследований, данные внедрены в ветеринарную практику. Опубликовано методическое указание «Применение биоматериала «Аллоплант» при поверхностной кератопластике у кроликов».

Апробация и публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ. Основные положения работы были доложены на II Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии, Москва 2011 год, III Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», Москва ВВЦ, 2011.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список. Работа содержит 21 таблицу и 72 рисунка. Библиографический список включает в себя 84 наименования: 27 иностранных и 57 отечественных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» с 2009 по 2012 год.

Морфологические, гематологические, бактериологические исследования проводили на 20 экспериментальных кроликах породы «Советская Шиншилла» подобранных по принципу аналогов с учетом возраста и пола. Масса тела кроликов составляла от 2,5 до 3,5 кг, условия кормления и содержания животных были аналогичными.

В качестве основной модели повреждения роговицы использовали нанесение раны с помощью трепана для послойной пересадки роговицы, что обеспечивало строгую стандартность раневого дефекта. Экспериментальных животных разделили на группы, из

них 10 - с центральным способом фиксации аллопланта, 10 - с периферическим способом фиксации.

Кролика фиксировали, затем в конъюнктивальный мешок инсталлировали раствор алкаина. Трепаном для послойной пересадки с диаметром 5 мм и глубиной повреждения -0,2 мм (устанавливали ограничительным штифтом на трепане), под внутривенным наркозом, выкраивали несквозной диск, включающий эпителий, боуменову мембрану и поверхностный слой стромы. Затем с помощью круглого ножа диск отсепарировали и удаляли. Полученную окружность контурировали инсталляцией ОД % флюоресцеина с последующим промыванием раствором метрогила.

Для диагностических исследований применяли комплекс методов, включающий, общее клиническое исследование животного, исследование области повреждения, гематологические, гистологические и бактериологические методы исследования.

Клинический статус животного оценивали по общепринятым методикам.

При исследовании зоны патологического очага проводили офтальмологическое обследование, включающее клинические методы оценки структурного состояния органа зрения, осмотр при боковом (фокальном) освещении и офтальмоскопию. Критериями при этом служили форма и положение век, состояние кожных покровов и краев века. При исследовании конъюнктивы оценивали ее цвет, влажность, количество и характер отделяемого из конъюнктивапьной полости. При осмотре роговицы определяли ее форму (сферичность), прозрачность, влажность, зеркальность, наличие васкуляризации, пигментации, Рубцовых изменений и изъязвлений. Дополнительную информацию о состоянии роговицы получали при использовании витальных красителей (0,1% раствора флюоресцеина, 1% раствора бенгальского розового и 3% лиссаминового зеленого). Флюоресцеиновой пробой определяли дефекты в эпителиальном слое роговицы. Бенгальским розовым 1% и 3% лиссаминовым зеленым растворами выявляли лишенные муцинового покрытия, погибшие и дегенерировавшие, но еще присутствующие на эпителиальной мембране роговицы клетки. Для определения суммарной слезопродукции использовали функциональный тест Ширмера. С этой целью рабочий конец тест-полоски (5 мм) сгибали на маркированном конце под углом 40-15° и помещали в нижний конъюнктивальный свод в наружной трети глазной щели. При этом перегиб лежал на краю века, а загнутая часть полоски не касалась конъюнктивы. Кролику закрывали глаз, через минуту извлекали тест-полоску и сразу же учитывали результат, измеряя длину увлажненного участка от линии сгиба. Оценку состояния прекорнеальной слезной пленки проводили с помощью пробы по Норну. В нижний конъюнктивальный мешок вводили одну каплю раствора флюоресцеина натрия, после чего определяли время от последнего моргания до появления в подкрашенной слезной пленке разрыва, имеющего вид черного пятна или щели на поверхности роговицы.

Клинико-морфологическое исследование крови проводили по общепринятой методике.

Биохимическое исследование сыворотки крови выполняли на автоматических многофункциональных биохимических анализаторах: Синхрон 4 (фирма Бекман) и Хитачи (Япония). Использовали реактивы фирм Бекман и Хуматрон.

Бактериологические исследования проводили с использованием универсальных питательных сред: мясопептонного бульона (МПБ), мясопептонного агара (МПА), специальных, избирательных, дифференциально-диагностических сред. Культивирование

бактерий проводили при 1° 35 - 37 С0 в течение 24 часов, грибов при 1° 25 - 28 С° дрожжеподобных в течение 1 - 4 суток, плесневых —3 — 10 дней. После культивирования с выросших колоний делали мазки.

Гистологические методы исследования. Энуклеированные глаза подвергали гистологическому исследованию через 3 месяца после операции. Их фиксировали в 10% нейтральном формалине. Центральную колодку заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали на «Фотомикроскопе-1П» («Оптон», Германия). Фоторегистрацию изображения осуществляли на цифровую фотовидеокамеру «ДиаМорф».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Способы фиксации материала «Аллоплант» при послойной кератопластике у кроликов

Для фиксации биоматериала «Аллоплант» применяли одиночные, узловатые, роговичные швы, использовали шовный материал — Рго!еп 8/0, 9/0. Иглу проводили па расстоянии 1 мм от краев раны, через толщу роговицы не захватывая внутренний эндотелиальный слой. Вначале накладывали швы в позиции на"12-3-6-9 часах». После фиксации трансплантата швы накладывали с интервалом 1-1,5 мм в соответствующие меридианы роговицы.

При центральном расположении трепанационной раны использовали 2 способа фиксации алломатериала:

1) фиксация материала, строго соответствующего размеру трепанационного ложа (1 контрольная группа из 5 животных - диаметр аллопланта 5 мм, диаметр ложа 5 мм).

2) фиксация материала на 1 мм больше, чем размер трепанационного ложа (2 экспериментальная группа из 5 животных - диаметр аллопланта б мм, диаметр ложа 5 мм).

При периферическом расположен™ трепанационной раны, также использовали 2 способа фиксации алломатериала:

1) фиксация материала, строго соответствующего размеру трепанационного ложа (1 контрольная группа из 5 животных - диаметр аллопланта 5 мм, диаметр ложа 5 мм).

2) фиксация материала на 1 мм больше, чем размер трепанационного ложа (2 экспериментальная группа го 5 животных - диаметр аллопланта 6 мм, диаметр ложа 5 мм).

Диагностические клинические признаки регенерации роговицы при центральной фиксации аллопланта Изучение динамики регенераторного процесса основывалось на выявлении патогномоничных признаков, затрагивающих передний отрезок глазного яблока, результатах использования функциональных тестов (тест Ширмера, проба по Норну), а также витальных красителей, характеризующих степень выраженности и характер патологических изменений поверхности роговицы и конъюнктивы.

Клинически установлены две фазы заживления роговицы: гидратация и дегидратация.

В период с 1 по 13 сутки воспалительный отек отсутствовал и фаза гидратации протекала латентно (отсутствовала выраженная воспалительная реакция) как в 1 (контрольной), так и во 2-й (экспериментальной) группах.

Таблица 1

Особенности проявления клинической картины регенерации роговицы при центральной

Диаметр аллопланга равен Диаметр аллопланга больше

диаметру ложа диаметра ложа

(1 контрольная группа) (2 экспериментальная группа)

Сияпталш Кол.жив Кол.жив Кол.жив Кол.жив

(абсол. (относит. (абсол. (относит.

число) число, %) число) число, %)

1 2 3 4 5

Светобоязпь - ■ - -

Блефарит 5 100 5 100

Гиперемия и отек век 5 100 5 100

Перикорнеальвая инъекция 5 100 5 100

сосудов

Сметанная инъекция сосудов 5 100 5 100

глазного яблока

Васкуляризация 5 100 5 100

Ириг 5 100 5 100

Миоз 5 100 5 100

Серозно - слизистые истечения 5 100 5 100

Слизисто-гнойные истечения - - - -

Гнойные истечения - - - -

Гкпопион 3 60 2 40

Кератш- 5 100 5 100

Всего 5 100 5 100

группах отмечали усиление признаков воспаления переднего отрезка глазного яблока. У всех животных обеих групп (100% случаев) наблюдали: блефарит, гиперемию и отек век, перикорнеальную инъекцию сосудов, серозно-слизистые истечения, ирит, миоз, васкуляризацию, глубокий паранхиматозный сосудистый кератит. Фибринозное воспаление радужной оболочки с образование гипопиона отмечали у 3 животных 1-й группы (60% случаев) и у 2 животных 2-й группы (40% случаев).

По данным Wendy L., 2000, Пирогова Ю.И., 2002, Barnett К.С., 2002, Дрожжиной Г.И., 2003, David J.Maggs, 2006, CharlesL. Martin, 2007, Derek Nottenbelt, Reginald Pascou, 2008, этот период совпадал с резорбцией избыточного образования коллагеновых структур, снижением биосинтезирующих потенций клеток, трансформацией кератобластов в кератоциты, началом фибриллярной организации коллагеновых волокон и развитием местных иммунных реакций.

Эти данные подтверждаются результатами наших исследований. К 21 суткам у экспериментальной и контрольной групп животных было установлено увеличение

образования слизистого секрета и появление васкуляризации. Обильное скопление гликозаминогликанов в области фиксации алломатериала у всех животных может свидетельствовать о наличии местной иммунной реакции.

Таблица 2

Особенности проявления клинической картины регенерации роговицы при центральной фиксации аллопланта в период с 30 по 41 сутки

Диаметр аллопланта равен диаметру ложа (1 контрольная группа) Диаметр аллопланта больше диаметра ложа (2 экспериментальная группа)

Симптомы Коллега (абсол. число) Кол. жив (относит, число, %) Кол.жив (абсол. число) Кал.жив (относит, число, %)

1 2 3 4 5

Светобоязнь " ~ ' '

Блефарит 5 100 5 100

Гиперемия и отек век 5 100 5 100

Перикорнеаяьная инъекция сосудов 5 100 5 100

Смешанная инъекция сосудов глазного яблока 5 100 5 100

В аскуляризация 5 100 5 100

Ирит 5 100 5 100

Миоз 3 £0 2 40

С ер оз но - слизистые истечения 5 100 5 100

Слш исто-гнойные истечения - - - -

Гнойные истечения ■ -

Гипопион 3 60 2 40

Кератит 5 100 5 100

Всего 5 too 5 100

В период с 30 по 41 сутки наблюдений (фаза дегидратации) у первой и второй групп животных выявлено снижение воспалительных признаков. Несмотря на это, в 100% случаев сохранялся отек век, перикорнеальная инъекция сосудов, васкуляризация, ирит, кератит. Фибринозное воспаление радужной оболочки с образование гипопиона отмечали у 3 животных 1-й группы (60% случаев) и у 2 животных 2-й группы (40% случаев), миоз у 3 животных 1-й группы (60% случаев) и у 2 животных 2-й группы (40% случаев).

Функциональную оценку состояния роговицы осуществляли по показателям стабильности слезной пленки и количественному эквиваленту слезопродукции.

Таблица 3

Оценка стабильности слезной пленки у кроликов при центральной фиксации аллопланта

Сутки 1-20 21-29 30-41

Время разрушения слезной пленки, сек 1 контрольная группа П±1 секунд 7±1 секунд 11±1 секунд

2 экспериментальная группа 11±1 секунд 7±1 секунд 11±1 секунд

Из таблицы следует, что в период с 1 по 20 и с 30 по 41 сутки в 1 и 2 группах животных время разрушения слезной пленки составляло 10 секунд и более. В период с 21 по 29 сутки в обеих группах животных отмечали снижение (6-8 секунд) этого показателя.

При изучении количественного эквивалента состояния слезопродукции (тест Ширмера) выявлено снижение показателей основной и рефлекторной слезопродукции.

Таблица 4

Состояние слезопродукции у кроликов при центральной фиксации аллопланта (тест Ширмера)

Сутки 1-20 21-29 30-41

Длина увлажненного участка тесг-полоски, мм 1 контрольная группа 1611 мм 10±1 мм 16±1 мм

2 экспериментальная группа 1б±1 мм 10±1 мм 16±1 мм

Из таблицы следует, что в период с 1 по 20 и с 30 по 41 сутки в 1 и 2 группах животных показатели теста Ширмера составляли 15 и более мм. В период с 21 по 29 сутки в 1 и 2 группе животных отмечали снижение общей слезопродукции до 9-11 мм.

Через 3 месяца после проведения послойной кератопластики в контрольной и опытной группах отмечали формирование соединительнотканного облака (макулы) в центре роговицы. Зрительные функции были сохранены у всех животных.

На основе обобщения результатов эксперимента можно заключить, что фаза гидратации (14-29 сутки) и дегидратации (30-41 сутки) совпали в контрольной и экспериментальной группах. Фиксация аллопланта диаметром 6 мм, при послойной кератопластике, способствовала регенерации роговицы в те же сроки, что и его фиксация диаметром 5 мм. Процесс регенерации роговицы сопровождался сходными клиническими признаками, как в контрольной так и экспериментальной группах.

Диагностические клинические признаки регенерации роговицы при периферической фиксации аллопланта При периферической фиксации аллопланта клинически установлены две фазы заживления роговицы: гидратация и дегидратация.

В период с 1 по 13 сутки фаза гидратации протекала латентно как в 1 (контрольной), так и в 2 (экспериментальной) группах.

Таблица 5

Особенности проявления клинической картины регенерации роговицы при периферической фиксации аллопланта в период с 14 по 29 сутки

Симптомы Диаметр аллопланта равен диаметру ложа (1 контрольная группа) Диаметр аллопланта больше диаметра ложа (2 экспериментальная группа)

Кол.жив (абсол. число) Кол.ядав (относит, число, %) Кол. жив (абсол. число) Кол.жив (относит, число, %)

1 2 3 4 5

Светобоязнь - - - -

Блефарит - - - -

Гиперемия и отек век 5 100 5 100

Пернкорнеальная инъекция сосудов 5 100 5 100

Смешанная инъекция сосудов глазного яблока 5 100 5 100

В аскуляр из ация 5 100 5 100

Ир ит - • -

Миоз ■ -

Серозно — елго. итеч. 5 100 5 100

Слиз исто-гно йные истечения ■ ■

Гнойные истечения * - ■

Гипопион - - ■

Кератит - -

Всего 5 100 5 100

В период с 14 по 29 сутки у всех животных (100% случаев) наблюдали гиперемию и отек век, перикориеальную инъекцию сосудов, васкуляризацгао, серозно-слизистые истечения.

Установлено, что с 14 дня после проведения кератопластики в двух исследуемых группах имело место разрушение алломатериала. Оно характеризовалось концентрическим истончением, нарушением целостности, разрывами в области фиксации шовного материала, и шчалом васкуляризации. В местах разрыва роговица была прозрачной и блестящей. Можно предположить, что это связано с интенсивностью регенеративных процессов вблизи области лимба, а также плоскостной эпителгаацией. По сути, многослойный плоский эпителий «наползал» под алломатериал.

С 21 дня, как у контрольной, так и у экспериментальной групп, сосуды полностью прорастали под аллоплантом, вызывая отторжение.

Таблица 6

Особенности проявления клинической картины регенерации роговицы при периферической фиксации аллопланта в период с 30 по 41 сутки

Симппюмы Диаметр аллопланта равен диаметру ложа (1 контрольная группа) Диаметр аллопланта больше диаметра ложа (2 экспериментальная группа)

Кол.жив (абсол. число) Кол.жив (относит, число, %) Кол.жив (абсол. число) Кол. жил (относит, число, %)

I 2 3 4 5

Светобоязнь - - - -

Блефарит - - - -

Гиперемия и отек век 5 100 5 100

Перикорнеалъная инъекция сосудов 5 100 5 100

Смешанная инъекция сосудов глазного яблока 5 100 5 100

1 2 3 4 5

Васкуляризация 5 100 5 100

Ир ит - - - -

Миоз - - - -

Серозно — слиз. итсч. 5 100 5 100

Слиз исто-гнойные истечения -

Гнойные истечения - - -

Гипопион

Кератит - - - -

Всего 5 100 5 100

В период с 30 по 41 сутки у всех животных обеих групп (100% случаев) наблюдали гиперемию и отек век, перикорнеальную инъекцию сосудов, васкуляризацию, серозно-слизистые истечения, постепенное отторжение алломатериала и истончение его по всему диаметру.

Оценкой состояния роговицы явились показатели стабильности слезной пленки и количественный эквивалент слезопродукции.

Таблица 7

Оценка стабильности слезной пленки у кроликов при периферической фиксации

аллопланта

Сутки 1-41

Время разрушения слезной пленки, сек 1 контрольная группа 11±! секунд

2 экспериментальная группа 11±1 секунд

Из таблицы следует, что в период с 1 по 41 сутки в 1 и 2 группах животных время разрушения слезной пленки составляло 10 секунд и более.

Таблица 8

Состояние слезопродукции у кроликов при периферической фиксаг^ш аллопланта

(тест Ширмера)

Сутки N41

Длина увлажненного участка тест-полоски, мм 1 контрольная группа 16±1 мы

2 экспериментальная группа 16±1 мм

Из таблицы следует, что в период с 1 по 41 сутки в 1 и 2 группах животных показатели теста Ширмера составляли 15 и более мм.

Через 3 месяца после проведения послойной кератопластики в контрольной и экспериментальной группах отмечали формирование прозрачной роговичной ткани с незначительными участками соединительной. Зрительные функции были сохранены у всех животных 1-й и 2-й групп.

На основе обобщения результатов эксперимента можно заключить, что фаза гидратации и дегидратации совпали в контрольной и экспериментальной группах и протекали латентно на всем протяжении эксперимента. Фиксация аллопланта диаметром 6 мм, при послойной кератопластике, способствовала регенерации роговицы в те же сроки, что и его фиксация диаметром 5 мм. Процесс регенерации роговицы сопровождался сходными клиническими признаками, как в контрольной так и экспериментальной группах.

Таблица 9

Послеоперационное лечение при различных способах фиксации материала «Аллоплант»

Препараты Кратность и длительность применения препаратов

При центральном способе фиксации алло матер нала При иериферическом способе фиксации алломатериала

2. Мидриатики и циклоплегики: Атропина сульфат 1% По I капле 2 раза в день в течение 12-15 дней -

3. Неспецифические антимикробные препараты: Метро гил, Фурацилин 0,02% Инсталляция переднего отрезка глаза 2 раза в день в течение 10-14 дней Инсталляция переднего отрезка глаза 2 раза в день в течение 10-14 дней

4. Антибиотики: Колбиоцин, Тобрекс, Флоксал, Циплолет По 1 капле 3-4 раза в день в течение 30 дней По 1 капле 3-4 раза в день в течение 20-30 дней

5. Нестероидные противовоспалительные средства: Диклоф, Наклоф, Индоколлир По 1 капле 3-4 раза в день в течение 25 дней -

8. Кератопротекторы: Корнерегель, Солкосерил гель, Актовегин По 1 капле 3-4 раза в день до 25 дней По 1 капле 3*4 раза в день до 25 дней

Из таблицы следует, что в послеоперационный период при центральном способе фиксации аллопланта применяли мидриатики по 1 капле 2 раза в день в течение 12-15 дней, неспецифические антимикробные препараты по 1 капле 2 раза в день в течение 1014 дней, антибиотики по 1 капле 3-4 раза в день в течение 30 дней, нестероидные противовоспалительные средства по 1 капле 3-4 раза в день в течение 25 дней, кератопротекторы по 1 капле 3-4 раза в день до 25 дней.

При периферическом способе фиксации аллопланта применяли неспецифические антимикробные препараты по 1 капле 2 раза в день в течение 10-14 дней, антибиотики по 1 капле 3-4 раза в день в течение 30 дней, кератопротекторы по 1 капле 3-4 раза в день до 25 дней.

Результаты бактериологического исследования конъюнктивального содержимого Сравнительный анализ микробного пейзажа конъюнктивальной полости у животных контрольных и экспериментальных групп представлен в таблицах 10 и 11.

Таблица 10

Микрофлора, выделенная из конъюнктивальной полости контрольных групп животных.

Вид микрофлоры

№п/п

1 группа Центральная фиксация I группа Периферическая фиксация

1. Е. coli E. coli

2. Candida spp. Candida spp.

3. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

4. Bact. spp. Bact spp.

5. Streptococcus spp. Streptococcus spp.

6. Diplococcus spp. Diplococcus spp.

Как видно из таблицы 10, у контрольных групп животных в смывах из конъюнктивальной полости были обнаружены Е. Coli, Candida spp., Streptococcus spp.,

Staphylococcus aureus, Bad. spp. и Diplococcus spp.

Таблица 11

Микрофлора, выделенная из конъюнктивальной полости экспериментальных групп

животных.

Вид микрофлоры

№ n/n

2 группа Центральная фиксация 2 группа Периферическая фиксация

1. Е. coli E. coli

2. Candida spp. Candida spp.

3. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

4. Bact. spp. Bact spp.

5. Streptococcus spp. Streptococcus spp.

6. Diplococcus spp. Diplococcus spp.

Как видно из таблицы 11, у экспериментальных групп животных в смывах из конъюнктивальной полости были обнаружены Е. Coli, Candida spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Bact. spp. и Diplococcus spp.

Таким образом, у контрольных и экспериментальных групп животных в смывах из конъюнктивальной полости были выделены следующие микроорганизмы: Е. Coli, Candida spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Bact. spp., Diplococcus spp., не зависимо от способа фиксации материала «Аллоплант» и его локализации на поверхности роговицы.

Гематологические исследования Анализ результатов исследования биохимического состава крови во всех исследуемых группах не выявил отклонений от физиологической нормы. Таким образом, данные показатели не являются объективными в патогенезе регенерации роговицы после проведения послойной кератопластики у кроликов.

Морфологический состав крови у животных с центральным способом фиксации алломатериала изменялся в ходе эксперимента. Выраженный лейкоцитоз был отмечен в период с 14 по 29 сутки исследований (морфологическая картина крови соответствует периоду выраженной воспалительной реакции).

Анализ результатов исследования морфологического состава крови у животных с периферическим способом фиксации алломатериала не выявил отклонений от физиологической нормы (таб. 12).

Таблица 12

Морфологический состав крови при различной локализации аллопланта в период с 14 по

29 сутки после кератопластики

Показатели Центральное расположение аллопланта Периферическое расположение аллопланта Кошроль Единицы

1 грутта 2 группа 1 группа 2 группа

Гемоглобин 115±5 133±6 115±9 130±7 137,5±32,5 г/л

Эритроциты 6±1 5.9Ш.6 6.3±1 6.3±1 6,3±1,3 х 10'7л

Лейкоциты 16,5±1 15,Sil 10±3 И±2 9,35±4,15 хЮ'л

Палочкоад. нейтрофилы 2±1 2±1 1±1 1±1 1,5±1,5 %

Сегментояд. нешрофилы 5712 58±1 46±3 49±2 46±8 %

Эозинофилы 1±1 2±2 1±1 2±1 2±1,5 %

Моноциты 3±2 4*2 5±2 3±2 7±2 %

Базофилы 4±1 5±1 4±1 4±1 4,5±1,5 %

Лимфоциты 55±5 61±3 52±5 60±5 55±15 %

Тромбоциты 300±30 260±44 280±30 320±44 306*206 х Ю'л

Морфологические изменения тканей органа зрения На основании морфологического исследования через 3 месяца после проведения кератопластики было установлено, что репаративная регенерация протекала при участии грануляционной ткани, как в контрольной, так и экспериментальной группах независимо от места локализации биоматериала.

Сравнительный анализ механизма заживления после кератопластики при различных способах фиксации аллопланта показал, что присутствие алломатериала

обнаружено только у животных контрольной группы с центральной фиксацией трансплантата. Вокруг обнаруженного гомогенного образования отмечали скопление фибробластов, макрофагов и гипертрофию клеток эпителия роговицы, что может свидетельствовать об интенсивности регенеративных процессов в ней. В остальных группах исследований аллоплант отсутствовал.

Обнаруженная в 10 % случаев аккумуляция лимфоцитов и нейтрофилов вокруг фокальной поверхностной зоны отражает продолжающийся репаративный процесс.

Установлено, что при периферической фиксации светооптически не выявлено наличие алломатериала, что подтверждает процесс его раннего рассасывания или отторжения. Признаки гиперплазии эпителия отсутствовали, выраженный участок дефекта роговицы не визуализировался. Толщина роговицы на всем протяжении не изменялась, что свидетельствует о ее восстановлении в области лимба в течение периода наблюдений.

Таблица 13

Морфологические признаки регенеративных изменений роговицы кроликов через 3 месяца

исследований

Симптомы Диаметр аллоплаига равен диаметру ложа Диаметр аллоплант а больше диаметра ложа

Цегпр 1 группа Периферия 1 труппа Центр 2 труппа Периферия 2 группа

Гипертрофия (гиперплазия) эпителиального слоя + +

Деформация клеток, нарушение их раз пера. + +

Наличие гомогенного содержимого (алломатериала) +

Наличие фибробластов и макрофагов + +

Раэволокнение стромы роговицы + + + +

Отек эпителиальной ткани +

В ыраженность зоны дефекта роговицы + +

выводы

1. При центральной роговичной фиксации аллопланта острое воспаление переднего отрезка глазного яблока регистрируется с 21 дня. Оно совпадает со сроками регенерации стромы и сопровождается образованием на поверхности аллопланта слизистого секрета (гликозамингликанов). Фаза гидратации характеризуется отеком век, васкуляризацией, фибринозным воспалением радужной оболочки с образованием гипопиона.

2. При периферической роговичной фиксации аллопланта наблюдается его разрушение с 14 дня исследований. Оно выражается в концентрическом истончении биоматериала, нарушении целостности, разрывах в области фиксации шовного материала, и начале васкуляризации центрального участка трепанационного ложа. В местах разрыва наличие блестящей, прозрачной и влажной роговицы свидетельствует об интенсивных регенеративных процессах в области лимба. С 21 дня, как в контрольной, так и в экспериментальной группах сосуды, прорастая под аллоплантом, вызывают его полное отторжение.

3. Независимо от способа фиксации материала «Аллоплант», и его локализации на поверхности роговицы у контрольных и опытных групп животных в смывах из коньюнктивалыгой полости выделены следующие микроорганизмы: Е. Coli, Candida spp., Mucor spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Bact. spp., Diplococcus spp.

4. Биохимические показатели сыворотки крови не являются объективными при оценке характера репаративной регенерации роговицы кроликов, так как практически находятся в пределах физиологической нормы, в то время как морфологические показатели изменяются у животных с центральным способом фиксации алломатериала. Они характеризуются выраженным лейкоцитозом в период с 14 по 29 сутки наблюдений в 1 и 2 исследуемых группах.

5. Характер структурных преобразований роговицы определяется местом локализации транспла1пата. При центральной роговичной фиксации морфологические изменения в роговице характеризуются наличием алломатериала. Скопление фибробластов и макрофагов вокруг гомогенного образования и гипертрофия клеток эпителия, свидетельствует об интенсивности регенеративных процессов в роговице к 3 месяцу исследований.

6. При периферической фиксации светооптичсски алломатериал отсутствовал, что подтверждает процесс его раннего рассасывания или отторжения. Гиперплазия эпителия и выраженный участок дефекта роговицы не визуализировались. Сохранение толщины роговицы на всем протяжении может свидетельствовать о ее полном восстановлении в области лимба в ходе эксперимента.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Представленные данные о клинической картине, диагностике и морфологии регенерации роговицы, являются фундаментальными для проведения послойной кератопластики у животных.

2. Целесообразно проводить полноценное обследование животных с использованием витальных красителей, теста Ширмера и пробы по Норну для достоверной интерпретации структурных и функциональных изменений в тканях роговицы.

3. Полученные данные о клинической картине, морфологии и процессе регенерации роговицы, после проведения послойной кератопластики с применением материала

«Аллоплант» у кроликов, позволяют рекомендовать их в качестве базовых для дальнейшего детального изучения и применения в ветеринарной офтальмологии. Положения диссертации целесообразно учитывать в учебном процессе при чтении лекции и проведении лабораторно-практических занятий по ветеринарной хирургии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозов, И.Ю. Применение биоматериала Аллоплант при поверхностной кератопластике у кроликов / И.Ю. Морозов, Л.Ф. Сотникова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. - 2010. - №4. - С. 14-17.

2. Морозов, И.Ю. Клинико-морфологическая характеристика роговицы кроликов после послойной кератопластики с применением биоматериала Аллоплант / И.Ю. Морозов, Л.Ф. Сотникова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. -2011.-№1. -С.21-23.

3. Морозов, И.Ю. Роль иммуносупрессоров в заживлении роговицы при послойной кератопластике у кроликов / И.Ю. Морозов //Ветеринарная медицина. -2011. -№3-4. -С. 114-115.

4. Морозов, И.Ю. Применение аллопланта при сквозной реконструктивной кератопластике у кроликов / И.Ю. Морозов, Л.Ф. Сотникова // «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии». -2010. -№4. -С.49-52.

5. Морозов, И.Ю. Клинико-морфологическая характеристика регенерации роговицы при различных способах фиксации аллопланта / И.Ю. Морозов, Л.Ф. Сотникова // 2-ая всероссийская межвузовская конференция по ветеринарной хирургии: Сборник научных тезисов.-М.: ФГОУВПОМГАВМиБ,2011.-С. 129-131.

6. Морозов, И.Ю. Сравнительная характеристика способов фиксации материала аллоплант / И.Ю. Морозов, Л.Ф. Сотникова // 2-ая всероссийская межвузовская конференция по ветеришрной хирургии: Сборник научных тезисов. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ,2011.-С. 122-125.

Методика нанесения трепанационной

раны роговицы

1 контрольная группа 1,- скопление гликозамингликанов в области фиксации швов, 2.- гипопион (21 сутки)

1 контрольная группа Диаметр аллопланта 5 мм, диаметр ложа 5 мм (3 мес.)

2 экспериментальная группа скопление гликозамингликанов в области фиксации швов, кератит (21 сутки)

2 экспериментальная группа Диаметр аллопланта 6 мм, диаметр ложа 5 мм (3 мес.)

Нанесение раны с помощью трепана

Инсталляция 0,1 % флюоресцеина

Клиническая картина при центральной фиксации материала «Аллоплант»

Периферическая фиксация

Способы фиксации материала «Аллоплант» при послойной кератопластике

Клиническая картина при периферической фиксации материала «Аллоплант»

1 контрольная группа Васкуляризация, отторжение аллопланта (21 сутки)

1 контрольная группа Диаметр аллопланта 5 мм, диаметр ложа 5 мм (3 мес.)

2 экспериментальная группа Васкуляризация, отторжение аллопланта (21 сутки)

2 экспериментальная группа Диаметр аллопланта 6 мм, диаметр ложа 5 мм (3 мес.)

Морфологические изменения тканей органа зрения

Гематоксилин и эозин об. 20, ок. 7

1- истончение эпителия над алломатериалом;

2-гомогенное образование;

3-гипертрофия эпителия.

Гематоксилин и эозин об. 20, ок. 7

1-гиперплазия роговичного эпителия;

2- расслоение переднего эпителия.

Подписано в печать:

23.04.2013

Заказ № 8404 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Морозов, Илья Юрьевич, Москва

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

04201356387

Морозов Илья Юрьевич

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛОЙНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ФИКСАЦИИ МАТЕРИАЛА «АЛЛОПЛАНТ» У КРОЛИКОВ

06.02.04 - ветеринарная хирургия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Сотникова Л.Ф.

МОСКВА 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................4

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ У ЖИВОТНЫХ.............9

1.1 Строение и морфология роговой оболочки....................................................9

1.2 Особенности регенерации роговичного эпителия.....................................13

1.3 Регенерация боуменовой пластинки и собственного вещества..................15

1.4 Регенерация задней пограничной пластинки и эпителия............................17

1.5 Материалы для проведения кератопластики................................................17

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................23

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................23

ГЛАВА 3. СПОСОБЫ ФИКСАЦИИ МАТЕРИАЛА «АЛЛОПЛАНТ» ПРИ ПОСЛОЙНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКЕ У КРОЛИКОВ..........................30

ГЛАВА 4. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ ПРИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ФИКСАЦИИ АЛЛОПЛАНТА.......................................................................................................35

ГЛАВА 5. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ ПРИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ ФИКСАЦИИ АЛЛОПЛАНТА.......................................................................................................63

ГЛАВА 6. РЕЗУЛЬТАТЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОНЪЮНКТИВАЛЬНОГО СОДЕРЖИМОГО..........89

ГЛАВА 7. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................91

7.1. Биохимический состав крови кроликов.......................................................91

7.2 Морфологический состав крови кроликов....................................................97

ГЛАВА 8. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТКАНЕЙ ОРГАНА ЗРЕНИЯ...................................................................................................................104

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................117

ВЫВОДЫ................................................................................................................125

РЕКОМЕДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ......127

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК..............................................................128

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Совершенствование классических и разработка новых методов лечения животных с роговичными травмами является актуальной проблемой ветеринарной офтальмологии. Особую значимость ее решение приобретает в настоящее время, поскольку новые существующие способы воздействия на репаративные процессы ткани роговицы не всегда обеспечивают достаточный эффект. Частота травматизма, тяжесть осложнений, большой удельный вес больных животных с травмой роговицы диктуют необходимость поиска новых способов хирургической коррекции (Е. П. Копенкин, Л.Ф. Сотникова, 2006; А. Г. Шилкин, В. В. Олейник, 2005).

Особый интерес в этом отношении представляет «Аллоплант», используемый в качестве донорского материала при проведении как сквозной, так и послойной кератопластики. Известна его роль в процессах регуляции клеточного метаболизма роговицы (Мулдашев Э.Р., Муслимов С.А, Нигматуллин Р.Т., Кийко Ю.И., Галимова В.У., Салихов А.Ю., Сельский Н.Е., Булатов Р. Т., Мусина Л.А. 1999). Немногочисленные научные сообщения в основном, посвященные анализу клинического эффекта замещения собственной тканью, фрагментарны и противоречивы.

Несмотря на имеющиеся исследования в данном направлении, мало изученными остаются вопросы оценки эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллоплант». Отсутствуют данные о клинико-морфологических преобразованиях роговицы, а также критерии оценки морфофункционалыюго состояния роговицы при различных способах фиксации алломатериала.

Недостаточная освещенность данной проблемы в ветеринарной литературе, сложность и многогранность патогенеза регенерации роговицы, необходимость дальнейшего рассмотрения свидетельствует об актуальности избранного научного направления.

Цель исследования: разработать научно-обоснованный подход к клинико-морфологической характеристике послойной кератопластики при различных способах фиксации материала «Аллоплант» у кроликов.

Задачи исследования:

1. Изучить диагностические клинические признаки регенерации роговицы при центральной фиксации аллопланта и установить их прогностическую значимость.

2. Изучить диагностические клинические признаки регенерации роговицы при периферической фиксации аллопланта и установить их прогностическую значимость.

3. Изучить видовой состав и микробную обсемененность конъюнктивальной полости у кроликов при различных способах фиксации алломатериала.

4. Определить морфологические и биохимические показатели крови у экспериментальных животных после проведения кератопластики с использованием алломатериала.

5. Установить закономерности патогенеза и морфогенеза заживления роговичных ран в эксперименте, в зависимости от способов фиксации и места локализации материала «Аллоплант».

Научная новизна. На основании использования комплексного методического подхода к изучению процесса регенерации роговой оболочки глаза научно обосновано проведение операции с использованием различных способов фиксации материала «Аллоплант». Изучены диагностические клинические признаки регенерации роговицы при центральной и периферической фиксации аллопланта. Выявлено, что клинические признаки переднего отрезка глазного яблока не зависят от способов фиксации аллопланта. Показано, что использование функционального тестирования, витальных красителей, анализа микробной обсемененности позволяет оценить степень выраженности и характер регенеративных изменений

поверхности роговицы, от которых в дальнейшем зависит прозрачность приживления трансплантата.

Выявлено, что характер структурных преобразований роговицы определялся местом локализации трансплантата. Центральный способ фиксации сопровождался прогрессирующими изменениями наружного эпителия и стромы роговицы, наличием алломатериала в препаратах. Выявлено значительное увеличение количества фибробластов и макрофагов вокруг фокальной зоны, нарушение архитектоники коллагеновых волокон стромы и пролиферация клеток роговицы. При периферической фиксации обнаружена слабая регенеративная активность клеток, отсутствие в препаратах алломатериала и гиперплазии эпителия. Толщина роговицы на всем протяжении исследуемого участка не изменялась, что свидетельствовало о ее восстановлении в исследуемый период. Репаративная регенерация роговицы протекала при участии грануляционной ткани, как в контрольной, так и экспериментальной группах независимо от места локализации аллопланта.

Теоретическая и практическая значимость. В результате комплексного методического подхода к обследованию органа зрения, клинико-офтальмических, морфологических исследований, проведена оценка эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллоплант». Разработана тактика проведения послойной кератопластики. Выявленные патогномоничные признаки переднего отрезка глазного яблока, а также результаты использования функциональных тестов (тест Ширмера, проба по Норну) и витальных красителей, характеризующих степень выраженности и характер патологических изменений поверхности роговицы, позволили разработать алгоритм оценки структурно-функционального состояния роговицы при различных способах фиксации аллопланта. Критериями оценки эффективности проведения операции явилась сравнительная характеристика рубцовых помутнений.

Выявленные клинико-морфологические параллели, при ранениях роговицы различной локализации, позволили научно обосновать и внедрить в ветеринарную практику два рациональных способа фиксации биоматериала «Аллоплант». Данные, полученные в процессе эксперимента, дополняют и расширяют сведения о хирургическом лечении мелких домашних животных с роговичными травмами различной локализации. Они могут использоваться в преподавательской деятельности по курсу частной хирургии, а также в работе практикующих офтальмологов в условиях обычной ветеринарной клиники.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Оценка эффективности реконструктивной кератопластики при ранениях роговицы различной локализации путем усовершенствования способов фиксации материала «Аллоплант».

2) Диагностические и клинические признаки регенерации роговицы при различных способах фиксации материала «Аллоплант», основанные на выявлении патогномоничных признаков, затрагивающих передний отрезок глазного яблока, а также результатах использования функциональных тестов (тест Ширмера, проба по Норну).

3) Клинико-морфологические преобразования роговицы при различных способах фиксации.

Сведения о практическом использовании научных результатов

Полученные данные используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и экзотических животных, а также на кафедре ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. Разработанные, в результате научных исследований, данные внедрены в ветеринарную практику. Опубликовано методическое указание «Применение биоматериала «Аллоплант» при поверхностной кератопластике у кроликов».

Апробация и публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ. Основные положения работы были доложены на II Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии, Москва 2011 год, III Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», Москва ВВЦ, 2011.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список. Работа содержит 21 таблицу и 72 рисунка. Библиографический список включает в себя 84 наименования: 27 иностранных и 57 отечественных авторов.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ У ЖИВОТНЫХ

1.1 Строение и морфология роговой оболочки

Роговица покрыта многослойным неороговевающим полиморфным эпителием.

Гистологически роговица животных состоит из 5 слоев. Уникальность эпителия роговицы состоит в том, что он обеспечивает влажную зеркальную поверхность, выполняя функцию линзы и проводника света. Кроме того, располагаясь на границе с внешней средой, он предохраняет роговицу от потери жидкости и внедрения патогенных агентов.

В эпителии выделяют несколько слоев клеток. Базальный слой представлен рядом высоких призматических клеток, над которыми располагаются 1-3 ряда крыловидных (шиповатых) клеток. Самым поверхностным слоем эпителия является пласт плоских растянутых клеток.

В эпителии роговицы располагаются многочисленные чувствительные нервные окончания, причем их плотность в 300-400 раз выше, чем в эпидермисе (Rozsa A.J., Beuerman R.W., 1982). В пределах эпителиального слоя могут встречаться меланоциты и клетки Лангерганса. Последние относятся к системе мононуклеарных фагоцитов.

Цитоскелет эпителиальных клеток. Цитоскелет всех клеток-эукариотов построен из тонких (актиновые микрофиламенты), толстых (микротрубочки) и промежуточных филаментов (Alberst В. et al, 1989). Состав и строение толстых и тонких филаментов цитоскелета одинаков в клетках, принадлежащих к различным типам тканей. Промежуточные филаменты специфичны. В настоящее время описано 9 типов белков промежуточных филаментов (Nagle R.B. 1994). Один из них - цитокератины (ЦКР) которые представлены семейством из 20 различных протеинов и присутствуют в цитоплазме эпителиальных клеток (Moll R. et al., 1982; 1990).

Предполагается, что ЦКРы не только увеличивают порог прочности

эпителиальных клеток, но и влияют на их организацию и метаболизм. Одна

9

же из их главных функций - прикреплять эпителиальные клетки к соседним на уровне десмосом и к подлежащей базальной мембране, которая через якорные волокна связана со стромой роговицы.

Межклеточные контакты. Многослойный плоский эпителий роговицы подвергается абразивному воздействию со стороны век и поэтому имеет высокоспециализированные механизмы клеточно-клеточной и клеточно-матриксной адгезии. К соединениям между эпителиальными клетками относятся плотные и щелевые контакты, а также десмосомы (Gipson I.K. et al., 1988; Mechanic S. et al., 1991).

Десмосомы располагаются на латеральных поверхностях эпителиальных клеток и способствуют надежным боковым связям между соседними клетками.

ЦКРы влетающие в структуру десмосом, стабилизируют внутренний каркас структуры клетки, сохраняя ее размер и ригидность (Schwarz М.А. et al., 1990; Wheeler G.N. et al., 1991).

Плотные межклеточные контакты обеспечивают барьерные функции эпителия(Ниа1^а J.W. et al., 1989).

Щелевые контакты обеспечивают прохождение химических веществ и электрических сигналов между взаимодействующими клетками. Они состоят из белков коннексинов и сосредоточены в основном в области базальных клеточных мембран (Beyer Е.С. et al., 1990).

Клеточно-матриксные соединения осуществляются через полудесмосомы - разновидность десмосом (Stepp М.А. et al., 1990).

Базальная мембрана - это тонкая пластинка, выявляемая с помощью Shiff (PAS) реакции (тест, позволяющий выявить наличие в тканях гликопротеинов, полисахаридов, некоторых мукополисахаридов, гликолипидов и ряда жирных кислот). Исследуемая ткань после воздействия на нее реактива Шиффа обрабатывается йодной кислотой. В случае положительной реакции исследуемая ткань окрашивается в красный цвет.

Базальная мембрана состоит из коллагена 4 типа, фибронектина и ламинина.

10

С одной стороны она граничит с эпителием, а с другой переходит непосредственно в боуменову мембрану. Клетки эпителия роговицы участвуют в ее формировании, синтезируя компоненты межклеточного матрикса (Sanes J.R. et al., 1990). С возрастом мембрана утолщается и может образовывать дупликаты (Alvarado J. et al., 1983).

Боуменова мембрана - тонкая бесструктурная неэластичная ткань, с тонкими канальцами, в которых проходят нервы из стромы в эпителий. Ее задняя поверхность не имеет четкого контура, сливаясь со стромой. Предполагается, что боуменова мембрана является модифицированным слоем передней части стромы и состоит из беспорядочно ориентированных плотно упакованных небольших коллагеновых волокон, которые окружены протеогликановым комплексом (основное вещество). У собак боуменова оболочка отсутствует.

Проблема восстановления боуменовой пластинки до сих пор остается спорной. Имеются сообщения о ее репарации за счет базального слоя эпителия и коллагенсинтезирующей активности фибробластов стромы роговицы (Багров С.Н., 1980; Гундорова Р. А., 1995). Однако большинство авторов скептически относятся к возможности регенерации передней пограничной пластинки.

Строма составляет около 90% толщины роговицы. Она состоит из коллагеновых пластин, расположенных по всей ширине роговицы параллельно друг к другу и к поверхности. Между коллагеновыми волокнами находятся клетки стромы - кератоциты, обладающие фибробластическими способностями к синтезу и секреции коллагена и гликозамингликанов как в период эмбриогенеза, так и при репаративных процессах (Kenyon K.R., 1983). Коллаген (в основном 1 типа) составляет около 80% всех органических компонентов стромы (Као W.W.Y. et al., 1982). Кроме коллагеновых пластин и кератоцитов имеется еще основное вещество стромы, в состав которого входят гликозамингликаны.

Прозрачность стромы роговицы — результат однородности тканевых элементов, в частности коллагеновых пластин, которые составляют строму роговицы, и их регулярной пространственной организации (Maurise D.M, 1984, 1985; Mishima S., 1982). Точный порядок расположения волокон зависит от относительно низкого содержания воды в строме. Протеогликаны, связанные с коллагеновыми фибриллами, могут лишь в небольшой степени пропитываться водой. Реорганизация коллагеновых фибрилл, которая является результатом стромального набухания, приводит к помутнению роговицы и световому рассеиванию, которые снижают остроту зрения.

Десцеметова мембрана прилежит к задней поверхности стромы. Она синтезируется эндотелиальными кле