Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-биохимическое исследование холестерола и желчных кислот при различной патологии печени у человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клинико-биохимическое исследование холестерола и желчных кислот при различной патологии печени у человека"

раджабов 005009910

Г адомад Одинаевич

КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА И ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ У ЧЕЛОВЕКА

03.01. 04 - биохимия

1 6 ФЕВ 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Душанбе- 2012

005009910

Работа выполнена в отделе клинической биохимии НИИ гастроэнтерологии АМН М3 Республики Таджикистан

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Кадыров Абдурахмон Хафизович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сабурова Анна Мухаммадиевна

доктор медицинских наук, профессор Мансурова Фарида Хамидовна

Ведущая организация:

Таджикский институт последипломной подготовки медицинских кадров Министерство здравоохранения Республики Таджикистан

Защита диссертации состоится «15» февраля 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного СоветаД737. 004. 05 при Таджикском национальном университете по адресу 734025, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Таджикского национального университета.

Автореферат разослан,

Л.

января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

Хамрабаева З.Х.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. На современном этапе развития науки проблема диагностики и эффективного лечения желчнокаменной болезни и других патологий печени, их многочисленных тяжелых осложнений, опасных для жизни больных, остается окончательно не решенной и продолжает привлекать внимание широкого круга биохимиков, клиницистов и научных исследователей.

Интерес к желчнокаменной болезни в последние годы приобрел новый оттенок, благодаря работам (Мансуров Х.Х.,1981;1982;1985), в которых показаны современные представления о камнеобразовании, стадийности развития процесса и, соответственно этому, различных подходов к диагностике.

Анализ литературы показывает, что имеются незначительные сведения о количественном составе желчных кислот в желчи и сыворотке крови больных на различных этапах литогенеза и соотношении важнейших из них при наличии желчных камней, а также содержании их в желчных камнях.

Существуют различные мнения о том, что решающее значение в этиологии желчнокаменной болезни имеет нарушение нормального метаболизма холестерола и его переход в желчные кислоты. С другой стороны, те же самые кислоты и их аналоги, в ряде случаев, могут служить эффективными средствами для лечения желчнокаменной болезни (Максимов В.А. и др., 2008).

Все это доказывает перспективность развития всесторонних исследований по выявлению существующей связи между химией холестерола, желчных кислот и других компонентов желчи, включая их трансформацию и методы определения.

Среди широкого круга физиологически активных стероидов важное место занимают желчные кислоты. Особый интерес представляют основные первичные и вторичные желчные кислоты, такие как холевая, хенодезокси-холевая, дезоксихолевая, литохолевая и дегидрохолевая кислоты, которые входят в основной компонент желчи и сыворотки крови. Все желчные кислоты образуются из холестерола в гепатоцитах.

Значительное распространение заболеваний печени и трудности распознавания их побуждают искать более надежные и достаточно информативные методы диагностики.

Исходя из этого, исследование метаболизма холестерола и желчных кислот в желчи и сыворотке крови здоровых людей и у больных с разными патологиями печени, а также распознавание изменения вышеуказанных компонентов под действием различных препаратов в организме, представляют собой актуальную задачу, как в аспекте развития биохимических исследований, так и для практической медицины.

Цель работы. Целью настоящего исследований является разработка новых методов определения содержания холестерола в сыворотке крови, вы-

явление зависимости содержания желчных кислот от холестерола у здоровых людей и у больных с различными патологиями печени и влияния различных лекарственных препаратов на характер метаболизма желчных кислот.

Задачи исследования:

- Разработать новый способ определения содержания холестерола в сыворотке крови здоровых лиц и больных с использованием газожидкостной хроматографии на различных этапах литогенеза.

- Установить зависимость содержания желчных кислот от холестерола при патологии печени и желчного пузыря,

- Выявить динамику спектра желчных кислот в сыворотке крови больных с метаболическим синдромом на фоне терапии урсодезоксихолевой кислоты с сиафором и эссенциала с сиафором.

- Исследовать содержание желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц

и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом.

Научная новизна.

Используя новый метод определения содержания холестерола в сыворотке крови с использованием газожидкостной хроматографии, удалось установить зависимость содержания желчных кислот от холестерола в сыворотке крови при различных патологиях печени и желчевыделительной системы.

Дана сравнительная оценка содержания холестерола в сыворотке крови у больных хроническим активным гепатитом и циррозом печени.

Выявлено влияние применения урсодезоксихолевой кислоты с сиафором и эссенциала с сиафором на характер изменения содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных метаболическим синдромом.

Установлено, что уровень желчных кислот, особенно хенодезоксихоле-вой, дегидрохолевой и холевой, увеличивается за счет гидролиза холиено-вых кислот. Впервые нами было определено высокое содержание насыщенных жирных кислот в составе отложившихся триглицеридов в гепатоцитах при неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Практическая значимость работы.

Результаты газохроматографического способа определения содержания холестерола в сыворотке крови можно использовать для диагностики и эффективного лечения различных заболеваний.

Данные определения содержания желчных кислот в сыворотке крови могут быть использованы для дифференциации различных патологий печени и желчевыделительной системы.

Результаты определения зависимости содержания желчных кислот от холестерола и сравнение их в сыворотке крови приобретает важное значение для оценки эффективности лечения при использовании различных препаратов.

Достоверность полученных результатов подтверждается:

- высокой чувствительностью и специфичностью использованных химических, биохимических, физико-химических методов исследования;

- проведением систематической обработки экспериментальных результатов общепринятыми методами.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на: республиканской конференции

„Образование и техническая культура в развитии биологических наук” (Душанбе, 2010); республиканской конференции „Вопросы питания и регуляция гомеостаза” (Душанбе, 2010); республиканской научнопрактической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов ТНУ, посвященной году образования и технических знаний (Душанбе, 2010); годичной научно-практической конференции молодых ученых ТГМУ им. Абуали ибни Сино, посвящённой 20-летию независимости Республики Таджикистан „Проблемы и достижения современной медицины“ (Душанбе, 2011). Апробация работы состоялась на (совместном) межкафедральном заседании кафедр биохимии, физиологии человека и животных биологического факультета ТНУ, фармакогнозии и ОЭФ, и биохимии ТГМУ им. Абуали ибни Сино (16 ноября 2011 г., протокол № 5).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 6 - в трудах научно-практических конференций. Получен один патент Республики Таджикистан.

Личный вклад автора в работу состоит в постановке задач исследования, выборе методов их решений, сборе и обработке экспериментальных данных, проведении анализа и обобщения результатов эксперимента, формулировке выводов и положений диссертации, внедрении полученных результатов в практику клинических лабораторий.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 страницах компьютерного набора и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и литературы, содержит 12 таблиц и 10 рисунков. Список использованной литературы включает 118 источника.

Материал и методы исследования

Для выполнения основной задачи данной работы необходимо было осуществить синтез исходных объектов, эталонных образцов желчных кислот и соответствующих им метиловых эфиров, найти оптимальные методики синтеза метиловых эфиров желчных кислот с целью определения содержания их в биологических объектах.

Разработан новый способ определения содержания холестерола в сыворотке крови и желчи у здоровых лиц, а также у больных с различными патологиями печени и желчевыделительной системы.

При выполнении основных задач нашего исследования у больных в сыворотке крови определяли ряд показателей, отражающих функциональное

состояние печени и желчевыделительной системы: содержание общего билирубина, жира, холестерола, жирных кислот, желчных кислот; изучали активность ферментов процесса трасаминирования (АсАТ, АлАТ) и щелочной фосфатазы.

Содержание общего билирубина определяли по Иендрашику-Графу (Колб В.Г., Камышников B.C., 2003). Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным билирубином, дает розово-иолетовое окрашивание.

Для определения концентрации общего холестерола использовалась модифицированная Ильком (Колб В.Г., 1982) реакция Либермана-Бухарда, которая дает изумрудно-зеленое окрашивание в присутствии холестерола и смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты.

Определение содержания желчных кислот в желчи и в сыворотке крови проводили методом газожидкостной хроматографии с использованием газового хроматографа «Хром-5» производства Чехии с пламенно-ионозационным детектором при программировании температуры в интервале 250-265° С, при 1°С/мин. по модифицированной методике А.Х. Кадырова и соавт. (1985, 1986). '

Определение содержание общего холестерола в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии проводили по методике Кадырова А.Х. и др. (2010).

Оптимизация нового способа определения содержания сывороточ- ного холестерола методом газожидкостной хроматографии

Количественное определение желчных кислот, холестерола и других компонентов в желчи и в сыворотке крови приобретает важное значение для диагностики и оценки эффективности лечения. Изменения содержания указанных стероидов в организме под действием различных препаратов, также представляют интерес.

Как мы отметили, газовая хроматография является, несомненно, наиболее важным хроматографическим методом количественного анализа стероидов (на примере холестерола и желчных кислот).

Для определения содержания холестерола в сыворотке крови нами был разработан новый способ с применением газожидкостного хроматографа.

Новый способ определения содержания холестерола в сыворотке крови заключается в том, что к 0,25 мл сыворотки крови добавляют 0,125 мг/мл рабочего раствора трикосана в качестве внутреннего стандарта и экстрагируют холестерол и связанные с ним эфиры с 5 мл хлороформа. Затем остаток подвергают гидролизу при помощи 0,5 мл 4N раствора едкого натрия до образования свободного холестерола. После чего содержание холестерола определяют газохроматографическим методом.

С целью вычисления относительного поправочного коэффициента для холестерола, к анализируемой пробе сыворотки крови добавляли точно измеренное количество стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали трикосан. Затем проводили анализ ряда искусственных смесей исследуемого холестерола со стандартом, снимали ряд хроматограмм при соответствующих режимах прибора и рассчитывали соотношение площадей пиков для определения концентраций. Относительный поправочный коэффициент вычисляли по следующей формуле: где,

О • Бет

К = -----------

Бет • 51

К - относительный поправочный коэффициент

С! - концентрация холестерола

Бет - площадь пика стандарта

Сет - концентрация стандарта

81 - площадь пика холестерола

Процентное содержание холестерола в сыворотке крови оценивали по следующей формуле:

• М ■ К • 100

% Х-Н =-----------------------,где,

Кст • Бет • а

М - масса стандарта

Кст - постоянная величина, Кст = 1

а - количество анализируемой пробы.

На рисунке 1 приведена хроматограмма контрольного эталонного

Рис. 1. Хроматограмма смеси эталонного образца холестерола и внутреннего стандарта трикосана (1 - трикосан; 2 - холестерол).

Стеклянная колонка размером 1,26 м х 0,3 см, заполненная 3% SE-30 на хроматроне N-AW (0,160 - 0,200 мм); t. - термостата 185-240°С при программировании температуры при 10°С/мин.; t. детектора 280°С; t. испарителя - 290°С.

Определение содержания холестерола в сыворотке крови здоровых и больных людей на различных этапах литогенеза

Литературный анализ показывает, что до настоящего времени отсутствуют газохроматографические сведения о количественном составе холестерола в сыворотке крови больных на различных этапах литогенеза.

С целью получения достоверных результатов и установления нормы по определению холестерола в качестве объекта исследования использовали сыворотку крови 16 здоровых людей; 9 женщин и 7 мужчин в возрасте от 20 до 56 лет (контрольная группа). Одновременно исследовали функциональные показатели печени. Биохимическое изучение сыворотки крови у здоровых лиц не выявило каких-либо патологических изменений.

Если содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей составляет 4,6 ммоль/л, то интересные результаты выявлены при анализе газохроматографических данных, которые получены при исследовании крови у больных, находящихся в физико-химической стадии болезни. В данном случае содержание холестерола в среднем составляет 3,2 ммол/л.

Надо отметить, что в физико-химической стадии ЖКБ обследовано 16 больных (10 женщин, 6 мужчин в возрасте от 29 до 61 года). Третью группу также составляли 16 больных (11 женщин, 5 мужчин в возрасте от 37 до 61 года) с клинической стадией желчнокаменной болезни. В этой группе констатировано небольшое повышение количества общего жира, холестерина, активности ферментов щелочной фосфатазы и 5-нуклеотидазы в сыворотке крови.

Анализ результатов, полученных при газохроматографическом исследовании холестерола в сыворотке крови у больных желчнокаменной болезнью в хирургической стадии, показывает, что при этом увеличивается содержание холестерола по сравнению с таковым в физико-химической стадии у лиц контрольной группы.

Все результаты газохроматографических анализов сыворотки крови приведены в таблице 1

Таблица 1 Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей и

больных на различных этапах литогенеза

Возраст, лет Содержание холестерола, ммоль/л

Здоровые (п-16) Стадии ЖКБ

Физикохимическая (п-16) Хирургическая (п-16)

21-56 4,6± 0,22 3,2± 0,15 6,6± 0,31

На основании данных таблицы построен график зависимости содержания холестерола от различных стадий заболевания при

О Контроль Физико- хирургии, заболеваемости химич. ст. ст.

Рис. 2. Зависимость содержания холестерола от стадии заболевания при желчнокаменной болезни

Есть подтверждающий фактор того, что по сравнению с контрольной группой обследованных соответствующего возраста, у больных желчнокаменной болезнью было отмечено статистически достоверное повышение содержания холестерола и снижение концентрации холестерола у больных циррозом печени (Ганджа И.М., 1977).

В отличие от здоровых людей, у больных желчнокаменной болезнью, особенно в ее начальной, физико-химической стадии, наблюдается резкое снижение количества исследуемого холестерола, в среднем до 3,2 ммоль/л.

В хирургической стадии ЖКБ уровень сывороточного холестерола оказывается даже несколько выше, чем у лиц контрольной группы-6,6 ммоль/л. Следовательно, в процессе литогенеза наблюдаются не только периоды активного течения заболевания, но и периоды, когда можно предполагать мобилизацию организма, приспособительных механизмов на пути интенсивного развития литогенеза.

Оценка содержания холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей и у больных циррозом печени

Известно, что решающее значение в этиологии болезней печени и желчного пузыря имеет нарушение нормального метаболизма холестерола и его производных в желчные кислоты.

Исследование содержания желчных кислот и их соотношения в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии является одним из высокочувствительных и информативных методов диагностики различных

заболеваний печени и желчевыводящих путей. Болезни печени, занимающие значительное место в клинической патологии, сопровождаются нарушением одной из важнейших ее функций - экскреции желчи, что приводит к значительному накоплению желчных кислот в сыворотке крови, а также к изменению их соотношения.

Нами была разработана методика определения деконъюгированных форм индивидуальных желчных кислот сыворотки крови методом газожидкостной хроматографии. Мы попытались доказать информативность данного метода, а также его доступность в клинических условиях. Исследование содержания желчных кислот и их соотношения в сыворотке крови имеет важное диагностическое значение в оценке функционального состояния гепатоцитов.

Особый интерес вызывает изучение содержания желчных кислот в зависимости от поражения печени при гепатитах.

С целью получения более достоверного результата, нами была обследована сыворотка крови 28 больных хроническим гепатитом (20 -хроническим активным гепатитом, 8 - хроническим персистирующим гепатитом). Контрольную группу составили 24 практически здоровых человек.

В таблице 2 приведены результаты исследования концентрации общего холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей. Как видно, средний показатель содержания желчных кислот составлял: ХК -0,0068; ХДХК - 0,0066; ДХК - 0,0033; ЛХК - 0,0010 мг/мл. Общая сумма желчных кислот в среднем составила 0,017±0,003 мг/мл.

Таблица 2

Результаты газохроматографического анализа холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей____________

Возра сг, лет Хол естеро л ммоль/л (п-15) Содержание желчных кислот, мг/мл (п-15)

ЛХК дхк ХДХК Дег. ХК ХК I

го- 52 4,8±0,22 0,0010± 0,0002 0,0033± 0,007 0,0066± 0,0015 — 0,006 8± 0,0015 0,0 П± 0,003

Известно, что желчные кислоты выделяются в желчь в виде двух первичных кислот - холевой и хенодезоксихолевой, синтез которых происходит в микросомах печени из холестерина. Поступая с желчью в двенадцатиперстную кишку, 80% из них пассивно всасывается, в основном, в дистальных отделах тонкой кишки, и попадает с током крови обратно в печень. Циркуляция желчных кислот по пути ’’печень — кишечник,, и ’’кишечник - печень,, носит название энтерогепатической циркуляции. Снижение концентрации холатов свидетельствует о гепатоцеллюлярной недостаточности (гепатит, цирроз печени), либо о частичном выключении

холатов из энтерогепатической циркуляции при депонировании их в желчном пузыре при его гипотонии или гипокинезии.

Наиболее выраженное повышение содержания желчных кислот в сыворотке крови наблюдалось у больных хроническим активным гепатитом. При этом средние величины суммарной концентрации желчных кислот составляли 0,22±0,02 (холевая - 0,071±0,017, хенодезоксихолевая -0,048±0,01, дезоксихолевая - 0,072±0,07, дегидрохолевая - 0,016±0,005 и литохолевая кислота - 0,013±0,003 мг/мл).

В группе больных хроническим персистиругощим гепатитом концентрация сывороточных желчных кислот оказалась сравнительно низкой - 0,13± 0,001(холевая кислота - 0,036±0,006, хенодезоксихолевая кислота - 0,037±0,004, дезоксихолевая кислота - 0,038±0,005,

дегидрохолевая кислота - 0,015±0,005 и литохолевая кислота -

0,011±0,003мг/мл.).

Возрастание концентрации желчных кислот в сыворотке крови у больных хроническим активным гепатитом произошло за счет возрастания всех фракций, по-видимому, вследствие нарушения синтетической и секреторной деятельности гепатоцитов. Определение содержания желчных кислот является высокочувствительным тестом в распознавании раннего периода поражения печени.

Таким образом, газохроматографическое определение содержания желчных кислот в сыворотке крови даёт ценную информацию о функциональном состоянии гепатоцитов, и о том, что уровень их в периферической крови во многом зависит от степени выраженности патологического процесса в печени при гепатитах.

Особый интерес представляет изучение содержания желчных кислот в распознавании раннего периода течения заболеваний у больных циррозом печени. Поэтому дальнейшие наши исследования были посвящены изучению содержания желчных кислот, а также соотношения их в сыворотке крови у больных циррозом печени по сравнению с данными сыворотки крови контрольных лиц. Исследовано содержание желчных кислот методом газожидкостной хроматографии в сыворотке крови у 28 больных циррозом печени различной этиологии.

Нами изучен уровень желчных кислот в сыворотке крови больных циррозом печени, преимущественно с явлениями клеточно-печеночной недостаточности, которая оценивалась по градации недостаточности печени, предложенной Х.Х. Мансуровым (1982). ~

Обследовано всего 52 человека: 28 больных циррозом печени и 24 практически здоровых людей. Наряду с этим, проводились исследования по определению функционального потенциала печени.

Нами установлена определенная закономерность между соотношением отдельных фракций сывороточных желчных кислот и степенью выраженности клеточно-печеночной недостаточности у больных циррозом печени.

С усугублением тяжести клеточно-печеночных поражений, содержание общих желчных кислот сыворотки крови прогрессивно уменьшалось, что было связане^-по-видимому, со снижением синтетической деятельности гепа-тоцитов.

Так, у больных циррозом печени легкой степени клеточно-печеночной недостаточности (I) суммарная концентрация желчных кислот сыворотки крови в среднем составила 0,50+0,11 (холевая - 0,26±0,05 мг/мл, хенодезоксихолевая 0,10+0,02; дезоксихолевая - 0,11±0,02; дегидрохолевая 0,02±0,004 и литохолевая - 0,009+0,001). У больных данной группы уровень холацидемии, как следствие нарушения печеночно-кишечной циркуляции желчных кислот, свидетельствует о достаточно сохраненной холатобра-зующей способности гепатоцитов. Соотношение отдельных фракций желчных кислот составило 2,6:1,0:1,1:0,9:0,2.

В группе больных циррозом печени с умеренными явлениями клеточнопеченочной - недостаточности (II) средние величины показателей сывороточных желчных кислот оказались несколько ниже - 0,19+0,03 мг/мл (холевая - 0,07+0,01, хенодезоксихолевая - 0,04±0,007,

дезоксихолевая - 0,0610,01, дегидрохолевая - 0,0210,003, литохолевая -0,006±0,001 мг/мл).

В этом случае снижение уровня сывороточных желчных кислот следует связать, в первую очередь, с уменьшением резервных возможностей холатосинтетической деятельности гепатоцитов. Анализ струюуры холацедемии показал, что наиболее резко снижается уровень холевой кислоты. Выявленный факт, по-видимому, в значительной степени связан с заметным истощением ресурсов процесса 12-а-гидроксилирования.

Данные газохроматографического исследования сыворотки крови в группе больных циррозом печени с выраженной клеточно-печеночной недостаточностью (III) свидетельствуют о прогрессировании нарушения обмена желчных кислот, сопровождающегося дальнейшим снижением их содержаний по сравнению"' с двумя предыдущими группами - 0,0810,01 мг/мл (холевая - 0,007+0,001, хенодезоксихолевая - 0,4+0,007,

дезоксихолевая - 0,033+0,006, дегидрохолевая - в виде следов, литохолевая

- 0,01+0,001 мг/мл). Значительное уменьшение содержания холевой кислоты, объясняется выраженной пассивностью фермента 12-ОС-гидроксилазы.

- В результате этого отмечается относительное увеличение содержания хено-дезоксихолевой кислоты, что является основной степенью выраженности гепатоцеллюлярной недостаточности.

Газохромотографическое исследование сыворотки крови группы больных циррозом печени с ярко выраженной клеточно-печеночной недостаточностью (VI) свидетельствуют о дальнейшем угнетении холатобразующей функции печени. Содержание сывороточных желчных

кислот при этом снижалось до 0,033±0,006 мг/мл (холевая - О,О12±О,0О2 мг/мл, хенодезоксихолевая - 0,010±0,001, дезоксихолевая - 0,011±0,002 мг/мл, литохолевая - 0,01±0,001 мг/мл)

Эти данные свидетельствуют о резком угнетении синтеза всех фракций желчных кислот в печени.

Таким образом, можно сказать, что при циррозе печени содержание желчных кислот в сыворотке крови в несколько раз превышает нормальные величины.

Установление зависимости содержания сывороточного холестерола при различных патологиях печени

Установлено, что 90% холестерола от общего его содержания в организме, составляющего у взрослого человека 140-150 г, содержится в тканях и 10% в тканевых жидкостях (из этого количества 8% приходится на кровь).

Особый интерес вызывает изучение содержания холестерола сыворотки крови в зависимости от поражения печени при гепатитах и циррозах.

С целью получения более достоверного результата, нами была обследована сыворотка крови 40 больных хроническим гепатитом (17 -хроническим активным гепатитом, 8 - хроническим персистирующим гепатитом и 15 больных циррозом печени различной этиологии и морфологической формы; макромодулярной - 7, микромодулярной - 5, смешанной - 3). Диагноз, наряду с клинико-лабораторными данными, подтвержден сканированием, а также исследованием биоптата печени.

Контролем служили результаты исследования холестерола в сыворотке крови у 15 практически здоровых лиц (8 женщин и 7 мужчин) в возрасте от 21 до 52 лет.

Содержание сывороточного холестерола определяли газохроматографическим методом с пламенно-ионизационным детектором.

Результаты газохроматографического анализа сывороточного холестерола приведены в таблице 3.

Таблица 3

Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых лиц и

больных хроническим гепатитом и циррозом печени

Возраст, лет Содержание холестерола (М±т), ммоль/л

Здоровые (п-15) Хрон. актив. Гепатит (п-17) Хрон.персистир. гепатит (п-8) Цирроз (п-15)

21-52 4,8±0.23 6,4±0,3 6,9±0,33 2,9±0,13

В результате проведенных исследований в сыворотке крови здоровых лиц был идентифицирован холестерол, концентрация которого составляла в среднем 4,8 ммоль/л.

В группе больных хронически активным гепатитом средняя концентрация сывороточного холестерола достоверно повышалась до 6,4 ммол/л. ' ' '

У больных хроническим персистирующим гепатитом содержание сывороточного холестерола в среднем оказалось чуть выше - 6,9 ммоль/л.

Возрастание концентрации сывороточного холестерола происходило за счет уменьшения желчных кислот, по-видимому, вследствие нарушения синтетической функции печени.

Полученные данные о содержании холестерола в сыворотке крови у 15 больных циррозом печени различной этиологии указывают на то, что у всех больных оно снизилось и составляло в среднем 2,9 ммоль/л (табл. 3).

Одной из причин снижения содержания холестерола в сыворотке крови у больных циррозом печени можно объяснить тем, что этерификация свободного холестерола происходит в плазме, этот процесс отражает, прежде всего, функциональное состояние (чаще всего функциональную недостаточность) печени.

Кроме того, нельзя не принимать во внимание еще один очень существенный факт-снижение уровня холестерола в крови у больных циррозом. Это влияние на метаболизм холестерола и желчных кислот оказывает количество вМО-СоА-редуктазы и 7(Х-гидроксилазы, которые, как и множество других ферментов, также синтезируются в печени и при нарушении ее функций будет страдать и синтез холестерола.

Содержание холестерола в сыворотке крови определяли методом газовой хроматографии. Общая сумма холестерола в сыворотке крови у лиц контрольной группы в среднем составила 4,8±0,5 ммоль/л, а у больных в среднем составила 4,2+0,5 ммоль/л.

В группе больных циррозом печени с умеренными явлениями клеточнопеченочной недостаточности (II) средние величины показателей сывороточного холестерола оказались несколько ниже - 3,9±0,4 ммоль/л.

Данные результатов исследования сыворотки крови в группе больных циррозом печени с выраженной клеточно-печеночной недостаточностью (III) свидетельствуют о прогрессировании нарушения обмена холестерина, сопровождающегося дальнейшим снижением его концентрации по сравнению с предыдущими группами — 3,7-тимоль/л. Это объясняется выраженным ■угнетением активности фермента ИуЮ - СоА - редуктазы регулирующей скорость биосинтеза холестерола. •

Результаты исследования сыворотки крови группы больных циррозом печени с ярко выраженной клеточно-печеночной недостаточностью (IV) свидетельствуют о дальнейшем угнетении холатобразующей функции печени. Уровень сывороточного холестерола при этом увеличился до 6,2±0,6 ммоль/л.

Влияние урсодезоксихолевой кислоты с сиафором на хараісгер изменения концентрации желчных кислот у больных при метаболическом синдроме

До сих пор не изученными остаются вопросы газохроматографического исследования желчно-кислотного обмена больных метаболическим синдромом под вилянием различных препаратов.

Задачей нашего исследования в этом направлении явилось изучение влияния урсодезоксихолевой кислоты и сиафора на характер изменения содержания желчных кислот при метаболическом синдроме.

Концентрацию желчных кислот изучали в сыворотке крови 24 практически здоровых людей в возрасте от 20 до 56 лет, среди которых было 9 женщин и 7 мужчин. Одновременно у 16 больных с метаболическим синдромом определяли содержание желчных кислот газохроматографическим методом до и после лечения урсодезоксихолевой кислотой с сиофором.

В таблице 4 приведены результаты сравнительного анализа желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей и больных с метаболическим синдромом до и после лечения урсодезоксихолевой кислотой с сиафором в течение 2-х месяцев.

Таблица 4 Содержание желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных метаболи-ческим синдромом до и после лечения

урсофальком + сиафор

Группы обследованных лиц Лече ние Содержание желчных кислот (М±т) мг/мл

ЛХК ДХК ХДХК ДегЛК ХК Сумма ЖК

Больны? метаболическим синдромом (п=16) До 0,00« ± 0,008 0,061± 0,012 0,096± 0,021 0,046± 0,014 0,27± 0,063 0,47± 0,082

Поел е 0,0014± 0,0002 0,007± 0,0014 0,0088± 0,002 0,002?± 0,0009 0,0097± 0,0022 0,03± 0,0051

Практически здоровые люди (п=24) 0,0010± 0,0002 0,003± 0,0007 0,0066± 0,0015 0,0068± 0,0016 0,017± 0,003

Как видно из данных таблицы 4, у больных с метаболическим синдромом и нарушением синтетических функций печени уровень сывороточных желчных кислот оказался значительно выше, почти в 28 раз, чем таковые показатели у лиц контрольной группы. Что касается содержания холевой кислоты, то оно увеличивалось почти в 40 раз.

Увеличение суммы концентрации желчных кислот свидетельствует о заметном снижении функции печени по очищению портальной крови от циркулирующих холатов. Кроме того, на фоне инсулинорезистентности печени содержание желчных кислот активно увеличивается.

В общей сумме желчных кислот содержание холевой кислоты составило 0,27 мг/мл и дезоксихолевой - 0,061 мг/мл, хенодезоксихолевой кис-лоты

- 0,096 мг/мл, дегидрохолевой кислоты - 0,046мг/мл, литохолевой кислоты

- 0,0041 мг/мл, сумма желчных кислот возросла до 0,47 мг/мл.

В отличие от здоровых людей, у больных метаболическим синдромом, наблюдается резкое повышение концентрации всех исследуемых желчных кислот. Содержание же дегидрохолевой кислоты у больных по сравнению со здоровыми людьми увеличивается.

Эти показатели свидетельствуют о том, что в организме человека наблюдаются не только периоды активного течения заболевания, но и периоды, когда происходит мобилизация приспособительных механизмов на пути интенсивного развития ожирения.

Заметное увеличение концентрации холевой кислоты в сыворотке крови больных метаболическим синдромом, которая составила 0,27 мг/мл из общей суммы желчных кислот свидетельствует о нарушении синтеза и экскреции желчных кислот из крови воротной вены в периоды энтеро-гепатической циркуляции.

Такое изменение общей концентрации сывороточных желчных кислот у больных метаболическим синдромом свидетельствует о функциональном состоянии гепатоцитов.

Газохроматографическое исследование содержания желчных кислот в сыворотке крови больных метаболическим синдромом на фоне терапии урсодезоксихолевой кислоты+сиофор, обнаружило снижение содержания всех желчных кислот в сторону контрольного состояния, которое свидетельствует о восстановлении желчно-кислотного метаболизма.

Впервые установлено, что содержание дегидрохолевой кислоты в минимальных количествах у здоровых людей, и повышено у больных с метаболическим синдромом.

Наблюдаемое на начальном этапе лечения повышение содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных с метаболическим синдромом, после проведенной терапии УДХК+сиафором, уменьшалось в сторону контрольных показателей.

Клинико-биохимическое изучение желчных кислот в сыворотке крови больных метаболическим синдромом на фоне терапии препаратами зссенциал + сиафор

Согласно современным представлениям, основой всех проявлений метаболического синдрома является первичная инсулинорезистентность и сопутствующая гиперинсулинемия.

Анализ литературных данных показывает, что газохроматографические сведения о характере изменения содержания желчных кислот в сыворотке

крови у больных метаболическим синдромом на фоне различных медикаментозных препаратов практически отсутствуют.

В данном газохроматографическом исследовании нами была предпринята попытка установить в хроматограмме динамику желчных кислот в сыворотке крови больных метаболическим синдромом на фоне терапии препаратами эссенциал с сиафором.

Нами была изучена эффективность эссенциала+сиафора в лечении 16 больных метаболическим синдромом (средний возраст 49±2,8 лет), с длительностью заболевания от 5 до 10 лет. Больные получали эссенциал в течение 2 месяцев по 2 капсуле 3 раза в день, а сиафор - 850 мг в сутки. Результаты исследований по изменению содержания сывороточных желчных кислот представлены в таблице 5.

Таблица 5

Содержание желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных метаболическим синдромом до и после лечения

эссенциалом+сиафор.

Группы обследова- ны* Лече вне Содержание желчных кислот (М±ш), мг/мл

ЛХК ДХК ХДХК Дег.ХК ХК Сумм аЖК

Больные метаболическим синдромом (п=16) До 0,003Й 0,081 0,0524: 0,013 0,019± 0.03 0,040± -0,02 0,54± 0,04 0,82± 0,06

Поел е 0,С012± 0,001 0,0041t 0,001 0,0076± 0,001 0,0011± 0,008 0,0083± 0,0006 0,022± 0,0001

Практіїчес ки здоровые люди .. ("=20) 0,00104: 0,0004 0,0034± 0,0009 0,00664: 0,001 0,0068± 0,0004 0,017± 0,0005

На фоне проведения терапии отмечено улучшение клинического состояния больных, вероятно, связанное со стабилизацией концентрации желчных кислот.

Содержание сывороточных желчных кислот до лечения у больных метаболическим синдромом составляло: ЛХК - 0,0039+0,001, ДХК -0,52±0,013, ХДХК - 0,19±0,03, Дег.ХК - 0,04±0,09, ХК - 0,54±0,04 мг/мл, а сумма желчных кислот достигала 0,82±0,06 мг/мл.

Как показывают данные исследования деконъюгированных желчных кислот методом газожидкостной хроматографии, у больных метаболическим синдромом после проведения терапии с эссенциалом и сиафором имеет место существенное снижение в сторону контрольных значений в сыворотке крови содержания всех желчных кислот.

Полученные данные указывают на то, что у всех больных метаболическим синдромом содержание желчных кислот в сыворотке крови после терапии достоверно снижалось и составляло при этом 0,022±0,0001

мг/мл (ХК - 0,0083+0,0006; ХДХК - 0,0076±0,001; ДХК - 0,0043±0,001; ЛХК - 0,0012+0,001 и Дег. ХК - 0,0011+0,008 мг/мл).

Таким образом, определение содержания желчных кислот в сыворотке крови больных с метаболическим синдромом до и после терапии эссенциа-лом в сочетании с сиафором, методом газожидкостной хроматографии свидетельствует о том, что у этих больных наблюдается значительное повышение концентрации сывороточных желчных кислот. Изменяется также соотношение желчных кислот в сыворотке крови в сторону увеличения содержания холевой кислоты, ее показатели составляют 0,54 мг/мл, почти в 80 раз превышают значение в контрольной группе.

Характеристика содержания желчных кислот в сыворотке крови

здоровых людей и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом

В литературных источниках нет достаточной информации о характере изменения содержания желчных кислот больных неалкогольным стеатозом и стеатогепатитом.

Задачей настоящего исследования являлось систематическое определение содержания желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом, проведение сравнительной оценки полученных результатов с целью повышения эффективности лечения.

В качестве объекта исследования мы использовали сыворотку крови 84 больных (44 мужчин и 40 женщин), из них 63 больных со стеатозом печени и 21 больного со стеатогепатитом. Возраст обследованных варьировал от 30 до 60 лет. Контрольную группу составили 24 здоровых человека (табл. 6).

Содержание сывороточных желчных кислот определяли газохроматографическим методом.

Таблица 6

Содержание желчных кислот сыворотки крови здоровых людей и

больных со стеатозом печени и стеатогепатитом (М±т), мг/мл

Желчные кислоты Практически здоровые (п=24) Больные

Стеатозом (п= 63) Стеатогепатитом (п=21)

Литохолевая 0,00] 0±0,0002 0,160*0,003 0,038+0,008

Дезоксихолевая 0,0033±0,0003 0,037±0,007 0,041+0,003

Хенодезоксихолевая 0,0066±0,0005 0,092±0,010 0,110+0,02

Дегидрохолевая - 0,013+0,002 0,015+0,004

Холевая 0,0068+0,0005 0,420+0,080 1,170±0,09

X жёлчных кислот 0,017+0,003 0,570+0,120 1,370+0,20

Как видно из данных табл.6, содержание желчных кислот сыворотки крови больных оказалось повышенным по сравнению с контролем и составило в среднем 0,570±0,12 и 1,370+0,2 мг/мл. Однако, у больных со стеато-

зом печени также было отмечено заметное повышение концентрации хено-дезоксихолевой кислоты до 0,092±0,010 мг/мл, холевой кислоты до 0,420±0,020 мг/мл, а при стеатогепатите уровень кислот составил

0,420±0,080 и 1,170±0,090 мг/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных со стеатозом и стеатогепатитом значительно возросло суммарное содержание желчных кислот.

Известно, что желчные кислоты соединяются с высшими жирными кислотами, образуя растворимые в воде комплексы (холеиновые кислоты), которые поступают в стенку кишки и в эпителиальных клетках кишечных ворсинок вновь распадаются на желчные и жирные кислоты. В клетках кишечного эпителия из глицерина и жирных кислот синтезируются жиры.

Результаты газохроматографического исследования свидетельствуют о том, что при стеатозе печени и стеатогепатите происходит гидролиз холеи-новых кислот, в результате чего содержание желчных кислот увеличивается, особенно хенодезоксихолевой, дегидрохолевой и холевой кислот. Эти данные можно использовать как допольнытельный тест для определение диагноза у больных жировой болезнью печени.

Желчные кислоты входят в состав растворимых молекулярных комплексов в различных соотношениях, т.е. на каждую молекулу жирной кислоты приходится не менее 2-х и не более 4-х молекул желчных кислот.

Таким образом, доказано, что в сыворотке крови больных со стеатозом и стеатогепатитом, по сравнению с контролем, значительно возросло содержание желчных кислот за счет активации процесса гидролиза холеиновых кислот. Выявлено содержание насыщенных жирных кислот в составе отложившихся триглицеридов в гепатоцитах у больных неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП).

Выводы

1. Разработан новый способ определения содержания холестерола в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии и определено содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей и больных желчнокаменной болезнью. Установлена зависимость содержания холестерола у больных на различных этапах литогенеза, при хроническом активном гепатите, хроническом персистирующем гепатите и циррозе печени.

2. Дана оценка содержания желчных кислот в сыворотке крови. Выявлены достоверные закономерности по содержанию желчных кислот, установлено, что при хроническом активном гепатите содержание желчных кислот составляет: ХК - 0,071+0,017, ХДХК — 0,048+0,01, ДХК -0,072±0,007, Дег.ХК - 0;016±0,005 и ЛХК - 0,013±0,003 мг/мл; у больных циррозом печени оно составляет: ХК - 0,091+0,018, ХДХК -0,058±0,08, ДХК - 0,064+0,0009, Дег.ХК - 0,015±0,002 и ЛХК -

0,009±0,003 мг/мл. Изучен уровень метаболизации желчных кислот и холестерола в сыворотке крови больных циррозом печени, который отражает функциональное состояние гепатоцитов, усиливается при клеточно-печеночной недостаточности. Установлено, что более значительные изменения при циррозе печени претерпевает содержание холевой кислоты по сравнению с другими желчными кислотами.

3. Выявлена динамика изменения содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных метаболическим синдромом под влиянием урсодезок-сихолевой кислоты с сиафором. Установлено, что УДХК+сиафор снизили содержание холевой и дегидрохолевой кислот в сыворотке крови больных с метаболическим синдромом, при этом содержание других желчных кислот снизилось до уровня контрольных значений. Установлено существенное снижение в сыворотке крови содержание желчных кислот до уровня контрольных значений, а также выявлена нормализация их энтерогепатической циркуляции у больных с метаболическим синдромом после проведения терапии с УДХК+сиафором и эссенциал с сиафором.

4. Экспериментально доказано, что в сыворотке крови больных со стеато-зом печени и стеатогепатитом, по сравнению с группой контрольных лиц, значительно возрастало содержание хенодезокси-холевой, дегидрохолевой и холевой кислот за счет активации процесса гидролиза холеи-новых кислот. Впервые нами было определено высокое содержание насыщенных жирных кислот в составе отложившихся триглицеридов в ге-патоцитах при неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Мироджов Г.К. Способ определения холестерина в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии / Г.К. Мироджов, А.Х. Кадыров, А.А. Кадыров, М.С. Суриев, Г.О. Раджабов // Патент PT № TJ 283. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Республики Таджикистан от 2009 г.

2. Раджабов Г.О. Определения содержания холестерина в сыворотке крови здоровых и больных людей на различных этапах литогенеза методом газожидкостной хроматографии / Г.О. Раджабов, А.Х. Кодыров, A.A. Ко-дыров // Мат. республиканской конференции ’’Образование и техническая культура в развитии биологических наук”. Душанбе. - 2010. -С. 45 -47.

3. Раджабов Г.О. Метод определения содержания сывороточного холесте-рола / Г.О. Раджабов, А.Х. Кадыров, A.A. Кодиров // Здравоохранение Таджикистана. - 2010. - №3. - С. 75-76.

4. Раджабов Г.О. Газохроматографические исследования желчных кислот в сыворотке крови больных с метаболическим синдромом на фоне терапии эссенциал+сиафором / Г.О. Раджабов, А.Х. Кадыров, М.Н: Ходжимура-дов, A.A. Кодиров II Здравоохранение Таджикистана. - 2009. - № 3. -С. 154-156.

5. Раджабов Г.О. Влияние урсодезоксихолевой кислоты + сиафор на характер изменения содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных с метаболическим синдромом / Г.О. Раджабов, А.Х. Кадыров, М.Н. Ходжимурадов, A.A. Кодиров // Здравоохранение Таджикистана. -2009.-№3.-С. 27-30.

6. Раджабов Г.О. Исследование содержания желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом / Г.О. Раджабов, А.Х. Кадыров, М.Н. Ходжимурадов, A.A. Кодиров, Г.Х. Давлатова // В кн.: Вопросы питания и регуляция гомеостаза. - Душанбе -2010-Вып. 10.-С. 138-143.

7. Раджабов Г.О. Газохроматографическое исследование содержания желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных стеатогепатитом и стеатозом печени на различных стадиях заболевания / Г.О.Раджабов, А.Х.Кадыров // Мат. науч. - прак. конф. профессорско-преподавательского состава и студентов, поев, году образования и технических знаний. - Душанбе. - 2010. - С. 126-127.

8. Кодиров АЛ.Сравнительная оценка желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом / A.A. Кодиров, Г.О. Раджабов, А.Х.Кадыров // Мат. годичной науч. - практ. конф. молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуали ибни Сино, по-

священной 20-летию независимости Республики Таджикистан. - Душанбе-2011 .-С. 417-419.

9. Кодиров АЛ. Определение содержания высших жирных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных со стеатозом печени и стеатогепа-титом, методом газовой хроматографии / A.A. Кодиров, Г.О. Раджабов, А.Х. Кадыров // Мат. годичной науч. - практ. конф. молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуали ибни Сино, посвященной 20-летию независимости Республики Таджикистан. - Душанбе. - 2011. - С. 446-449.

Типография ТГМУ им. Абуали ибни Сино

Подписано к печати 21.11.2011г. Формат 60/84^ Еумага офсетная 8$/м2. Объём 1,25 п.п. Тирам 100 зкз. Заказ N° 584.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раджабов, Гадомад Одинаевич, Душанбе

ТАДЖИКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. АБУАЛИ ИБНИ СИНО

61 12-3/696

На правах рукописи

Раджабов Гадомад Одинаевич

Клинико-биохимическое исследование холестерола и желчных кислот при различной патологии печени у человека

03.01.04 - биохимия Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Кадыров А.Х.

Душанбе - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень сокращений, принятых в работе.......................4

Введение --------------------------------------------------------------------------5

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Биохимия холестерола и желчных кислот ------------------------------11

1.2 Методы определения содержания холестерола и желчных кислот в некоторых биологических объектах----------------------------------------------17

1.3 Влияние некоторых препаратов на характер изменения содержания

холестерола и желчных кислот в биологических объектах .................20

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

2.1 Характеристика методов исследования ----------------------------------25

2.2 Исследование показателей липидного обмена--------------------------29

2.3 Определение индекса литогенности желчи------------------------------30

2.4 Определение содержания общего холестерола в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии---------------------------------------31

2.5 Определение суммарного содержания желчных кислот и холевой кислоты желчи-------------------------------------------------------------------------31

2.6 Определение содержания желчных кислот в желчи...................32

2.7 Определение содержания желчных кислот в сыворотке крови методом ГЖХ--------------------------------------------------------------------------------------33

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение оценки содержания холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых и больных людей с различной патологией печени и желчевыделительной системы

3.1. Оптимизация способа определения содержания сывороточного

холестерола методом газожидкостной хроматографии-------------------34

3.2. Определение содержания холестерола в сыворотке крови здоровых и больных людей на различных этапах литогенеза ---------------------------39

3.3. Оценка содержания холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей и у больных циррозом печени-------------------------------45

3.4. Установление зависимости содержания сывороточного холестерола при различных патологиях печени-----------------------------------------------58

3.5. Влияние урсодезоксихолевой кислоты с сиофором на характер изменения содержания желчных кислот у больных при метаболическом синдроме------------------------------------------------------------------------—66

3.6. Клинико-биохимическое изучение желчных кислот в сыворотке крови больных метаболическим синдромом на фоне терапии препаратами эссенциал+сиофор----------------------------------------------------------------74

3.7. Характеристика содержания желчных кислот в сыворотке крови здоровых людей и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом-----79

ЗАКЛЮЧЕНИЕ------------------------------------------------------------85

ВЫВОДЫ-------------------------------------------------------------------91

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ-----------------------------93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ---------------------------------------------94

Перечень сокращений, принятых в работе

1. ЖК - желчные камни

2. ХЖК - холестериновые желчные камни

3. ХС - холестерин

4. СЖК - суммарные желчные кислоты

5. ФЛ - фосфолипиды

6. ХХК - холато-холестериновый коэффициент

7. ХК - холевая кислота

8. ДХК - дезоксихолевая кислота

9. ХДХК - хенодезоксихолевая кислота

10. ЛХК - литохолевая кислота

11. Дег. ХК - дегидрохолевая кислота

12. ЖКБ - желчнокаменная болезнь

13. ЖКБ - II -1 - физико-химическая стадия ЖКБ

14. ЖКБ - II - 3 - хирургическая стадия ЖКБ

15. вМС-СоА - гидроксиметилглутарил Ко А редуктаза (печеночный фермент, регулирующий процесс синтеза холестерола)

16. ГЖХ - газожидкостная хроматография

17. 7а-Гидроксилаза - фермент, участвующий при синтезе первичных желчных кислот

18. УДХК - урсодезоксихолевая кислота

19. МС - метаболический синдром

20. НЖБП - неалкогольной жировой болезни печени

Введение

Актуальность проблемы. На современном этапе развития науки проблемы диагностики и эффективного лечения желчнокаменной болезни и других патологий печени, их многочисленных и тяжелых осложнений, опасных для жизни больных, остаются окончательно нерешенными и продолжают привлекать внимание широкого круга биохимиков, клиницистов и научных исследователей.

Известно, что среди ряда заболеваний желчевыделительной системы ведущее место занимает желчнокаменная болезнь - 60-65% [3].

Интерес к желчнокаменной болезни в последние годы приобрел новый оттенок, благодаря работам, в которых показаны современные представления о камнеобразовании, стадийности развития процесса и, в соответствии с этим, различных подходах к диагностике и лечению [50, 52, 53].

Анализ литературы показывает, что имеются незначительные сведения о количественном составе желчных кислот в желчи и сыворотке крови больных на различных этапах литогенеза и соотношении важнейших из них при наличии желчных камней, а также содержании их в желчных камнях. Проблема лечения желчнокаменной болезни стала одной из важнейших задач в медицине, которая может быть решена путем постоянного контроля за изменением содержания желчных кислот в желчи и сыворотке крови наряду с другими компонентами, и одновременно, изменением состава этих кислот в организме.

Существуют различные мнения о том, что решающее значение в этиологии желчнокаменной болезни имеют нарушения нормального метаболизма холестерола и его трансформации в желчные кислоты. С другой стороны, те же самые кислоты и их аналоги в ряде случаев могут служить эффективными средствами для лечения желчнокаменной болезни [80, 99].

Все это доказывает перспективность развития всесторонних исследований по выявлению существующей связи между химией

холестерола, желчных кислот и других компонентов желчи, включая их трансформацию и методы определения.

Эритроциты крови принято рассматривать как своеобразный биопунктат тканей. Несмотря на специфические особенности устройства их мембран, в липидном составе эритроцитов много общего с таковым, клеток других паренхиматозных органов, прежде всего, сердца и печени. Поэтому, констатируя сдвиги в липидном составе эритроцитов, можно составить представление об аналогичных изменениях в клетках других тканей [42].

Среди широкого круга физиологически активных стероидов важное место занимают желчные кислоты. Особый интерес представляют основные первичные и вторичные желчные кислоты, такие как холевая, хенодезоксихолевая, дезоксихолевая, литохолевая и дегидрохолевая кислоты, которые входят в состав основных компонентов желчи и сыворотки крови. Все желчные кислоты образуются из холестерола в гепатоцитах.

Значительное распространение заболеваний печени и трудности распознавания их побуждают искать более надежные и достаточно информативные методы диагностики.

В связи с этим, количественное определение холестерола и желчных кислот в желчи и в сыворотке крови приобретает важное значение в целях диагностики и оценки эффективности лечения, а также рассмотрения изменений содержания вышеуказанных компонентов в организме под влиянием различных препаратов.

Исходя из этого, исследование метаболизма холестерола и желчных кислот в желчи и сыворотке крови здоровых людей и у больных с разными патологиями печени, а также распознавание изменения вышеуказанных компонентов под действием различных препаратов в организме, представляют собой актуальную задачу, с точки зрения развития биохимических исследований, так и для практической медицины.

Цель исследования.

Целью настоящего исследовани является использование новых методов определения содержания холестерола в сыворотке крови, выявление зависимости содержания желчных кислот от холестерола у здоровых людей и у больных с различными патологиями печени и влияния лекарственных препаратов на характер метаболизации желчных кислот.

Задачи исследования.

1. Разработать новый способ определения содержания холестерола в сыворотке крови здоровых лиц и больных с использованием газожидкостной хроматографии на различных этапах литогенеза.

2. Установить зависимость содержания желчных кислот от холестерола при патологии печени и желчного пузыря.

3. Выявить динамику спектра желчных кислот в сыворотке крови больных метаболическим синдромом на фоне терапии урсодезоксихолевая кислота с сиофором и эссенциал с сиофором (препаратами урсодезоксихолевая кислота, эссенциал и сиофор).

4. Исследовать содержание желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных со стеатозом печени и стеатогепатитом.

Научная новизна.

Используя новый метод определения содержания холестерола в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии, удалось установить зависимость содержания желчных кислот от холестерола при различных патологиях печени и желчевыделительной системы.

Дана сравнительная оценка содержания холестерола в сыворотке крови у больных хроническим активным гепатитом и циррозом печени.

Выявлено влияние урсодезоксихолевой кислоты с сиофором и эссенциала с сиофором на характер изменения содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных метаболическим синдромом.

Установлено, что уровень желчных кислот, хенодезоксихолевой, дегидрохолевой и холевой, увеличивается за счет гидролиза холеиновых кислот. Впервые нами было определено содержание жирных кислот в составе отложившихся триглицеридов в гепатоцитах при неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Практическая значимость.

Результаты газохроматографического способа определения содержания холестерола в сыворотке крови можно использовать для диагностики и эффективного лечения различных заболеваний.

Данные определения содержания желчных кислот методом газожидкостной хроматографии в сыворотке крови, могут быть использованы для дифференциации различных патологий печени и желчевыделительной системы.

Результаты определения зависимости содержания желчных кислот от холестерола и сравнение их в сыворотке крови приобретает важное значение для оценки эффективности лечения при использовании различных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан новый способ определения содержания холестерола в биологических объектах методом газожидкостной хроматографии.

2. Проведен газохроматографический анализ содержания холестерола и желчных кислот в сыворотке крови здоровых лиц и больных на различных этапах литогенеза.

3. Дана сравнительная оценка сывороточного холестерола и желчных кислот при хроническом гепатите и циррозе печени в эксперименте.

4. Установлена зависимость содержания сывороточного холестерола при различных патологиях печени методом газожидкостной хроматографии.

5. Изучено влияние некоторых препаратов на характер изменения содержания желчных кислот у больных метаболическим синдромом.

6. Исследовано содержания желчных кислот в сыворотке крови у больных со стеатозом печени и стеатогепатитом.

Достоверность полученных результатов подтверждается

следующим:

высокой чувствительностью и специфичностью использованных химических, биохимических, физико-химических методов исследования; - проведением систематической обработки экспериментальных результатов общепринятыми методами.

Апробация работы.

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на: республиканской конференции „Образование и техническая культура в развитии биологических наук" - (Душанбе, 2010); республиканской конференции „Вопросы питания и регуляция гомеостаза" (Душанбе, 2010); республиканской научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов ТНУ, посвященной году образования и технических знаний (Душанбе, 2010); годичной научно-практической конференции молодых ученых ТГМУ „Проблемы и достижения современной медицины", посвященной 20-летию

независимости Республики Таджикистан, (Душанбе, 2011). Апробация работы состоялась на (совместном) межкафедральном заседании кафедр биохимии, физиологии человека и животных биологического факультета ТНУ, фармакогнозии и ОЭФ, и биохимии ТГМУ им. Абуали ибни Сино (16 ноября 2011 г., протокол № 5).

Публикации.

По результатам исследования опубликовано 9 научных работ, из них 3 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 6 - в трудах научно-практических конференций. Получен 1 патент.

Личный вклад автора.

Автор самостоятельно определил задачи исследования, выбор методов их решения, собрал и обработал экспериментальные данные, провел анализ и обобщение результатов эксперимента, сформулировал выводы и положения диссертации, внедрил полученные результаты в практику клинических лабораторий.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и литературы, изложенных на 106 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 12 таблицами и 10 рисунками. Список использованной литературы включает 118 источника.

ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1. Биохимия холестерола и желчных кислот

Холестерол представляет собой вторичный одноатомный спирт (3-окси-5-холестенен), в молекуле которого (С27Н46О , молекулярная масса 387 гр) имеется общее для всех стеринов полициклическое ядро циклопентанпергидрофенантрена. Характерно, что в третьем положении кольца " А" расположена гидроксильная группа , а также имеется двойная связь между 5-м и 6-м углеродными атомами; от ядра отходит боковая алифатическая цепь, состоящая из восьми атомов углерода.

Поскольку это соединение является одноатомным вторичным спиртом, правильнее использовать для его обозначения термин "холестерол". (Поскольку холестерол является спиртом, способным образовать эфиры с жирными кислотами, термин "холестерол" все более активно вытесняется словом "холестерин").

Холестерол является основным компонентом билиарной экскреции. Основным местом образования холестерола в организме человека является печень, где синтезируется до 80% всего холестерола (М. S. Brown, 1983). Суточный расход холестерола составляет 1,2 г. Это количество обеспечивается, как за счет поступления холестерина с пищей (примерно 400 мг), так и за счет его синтеза (примерно 80 мг). Баланс холестерола в организме поддерживается выделением его с желчью, как в чистом виде (около 600 мг/сут.), так и в виде желчных кислот [14].

еЬ

Любое повышение биосинтеза желчных кислот, в свою очередь, сопровождается усилением продукции холестерола.

После предварительной солюбилизации желчных кислот и фосфолипидов на поверхности каналикулярных мембран или во внутриклеточных везикулах, холестерол в составе смешанных мицелл секретируется в желчные протоки [69].

Гидролиз и всасывание экзогенного холестерола из просвета тонкой кишки также протекает при участии желчных кислот [76].

Холестерол, в отличие от иных липидов, вещество кристаллическое. Сложные эфиры холестерола - холестериды - образуются при этерификации в спиртовой группе жирной кислотой. Чаще всего в эфирах холестерола встречаются пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты.

Холестерол легко образует комплексы с солями кальция и марганца: в них на две молекулы холестерола приходится одна молекула соли. Формирование таких комплексов вполне вероятно и в организме человека, что может приводить к отложению холестерола на стенках сосудов.

Установлено, что 90% холестерола от общего его содержания в организме (составляющего у взрослого человека 140-150г) содержится в тканях и 10% - в тканевых жидкостях (из этого количества 8% приходится на кровь).

Следовательно, уровень холестерола в крови может и не отражать его содержания в организме, несмотря на то, что весь холестерол тканей организма обладает способностью обмениваться с холестеролом плазмы.

Таким образом, в организме человека выделяется два основных фонда холестерола: структурный, представленный свободным холестеролом плазматических мембран, и метаболически активный, гетерогенный по фракционному составу, эфиросвязанный холестерол. Он обнаруживается в основном в липопротеидах плазмы крови, коре надпочечников, сурфактанте легких.

Содержащийся в лииопротеидах холестерол используется для биосинтеза желчных кислот, стероидных гормонов, витамина Д3, образования новых плазматических мембран строящихся клеток [1].

В плазме крови холестерол находится, главным образом в составе липопротеидов низкой плотности и липопротеидов очень низкой плотности, причем, 60-70 % его представлено в форме сложных эфиров, а 30-40% -свободного, неэтерифицированного холестерола. Свободный и этерифицированный холестерол составляют фракцию общего холестерола.

После сокращения желчного пузыря и выделения желчи в двенадцатиперстную кишку в ответ на стимуляцию содержимым и гормональными стимулами в двенадцатиперстной кишке, в щелочной среде, в присутствии желчи, лецитина, Са+2 и липолитических ферментов запуска�