Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 5763:573.6.085.23

ВАСИЛЬЕВ АНДРЕЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ТКАНЕВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

03.00.25- гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

4°'

Москва, 2003

об я::

БЕС

о

: ,-. ..З V.,.

і ? І- I " ' * ■. ■ і'"'; ■ Г . :_*!;* і

Работа выполнен» в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развитая им. Н. К. Кольцова РАН Директор Института - академик РАН Н, Г. Хрущов

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор В. В. Терских

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В. Н. Ярыг на доктор биологических наук, профессор В, Я. Бродский доктор биологических наук, профессор Л. В. Белоусов

Ведущее учреждение - Институт цитологии РАН

Защита состоится 19 ноября 2003 г. в 14 ч. На заседании Диссертационного совета Д002.238.01 при Институте биологин развития им, Н. 1С. Кольцова РАН по адресу г. Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развитии им. Н. К. Кольцова РАН (г, Москва, ул. Вавилова, 26)

Автореферат разослан 17 октябри 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е. В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Тканевая инженерия, клеточные технологии, исследование закономерностей пролиферации и днффереицировки клеток являются наиболее перспективной и быстро развивающейся областями современной биологии, С развитием именно этих направлений связывают сегодня надегаы яа решение многих медицинских и социальных проблем.

Одним из принципов тканевой инженерии является использование гнстотшнгческих клеточных или тканевых конструкций. Несмотря на растущее применение аллогенных клеточных и тканевых конструкций для восстановления тканевых повреждений, механизмы их влияния не изучены. Отсутствуют исследования, характеризующие механизмы влияния аллогенных трансплантатов на восстановление утраченных структур и функций.

Основополагающим принципом тканевой инженерии является использование стволовых клеток (Bianco and Robey,2001 ),3начни?лъиый интерес, проявляемый кпроблеме стволовых клеток, сегодня смещается в область исследования постнатальных стволовых клеток, как наиболее перспективных. Однако не изученным остается вопрос о самовоспроизведении и фенотипической пластичности стволовых клеток в условиях длительного культивирования.

Моделированию в культуре процессов репарации, исследованием возможностей и механизмов аллогеннх трансплантаций, их воздействием на процесс восстановления тканевых повреждений, а также разработкой эффективных методов тканевой инженерии посвящено данное исследование.

Цель работы - изучение механизмов репарации тканей под воздействием аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов

Задачи исследования

-исследование закономерностей культивирования ЭКЦ * кожи человека, -разработка эффективной технологии культивирования, трансплантации н хранения клеток кожи,

-моделирование и исследование в культуре различных стадий раневого заживления -миграции эпидермиса, регенерации эпидермиса, взаимодействия ЭКЦ н Фб в процессе коптракции (процесс образования рубца),

-изучение влияния эпндермальиого фактора роста на культуру ЭКЦ, -разработка аллогенных клеточных и тканевых трансплшггатов, для восстановления ряда тканевых повреждений, в т.ч.глубоких ожогов, длительно незаживающих ран, язв различной этиологии,

-поиск и идентификация стволовых и прогениторных эпидермальных клеток в культурах ЭКЦ человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных работ исследованы закономерности и особенности культивирования эпидермальных кератнноцитов (ЭКЦ). Обнаружен н впервые описан феномен миграции колоний эпидермальных кератнноцитов в культуре. На моделе контракции трехмерного коллагенового геля исследованы взаимодействие ЭКЦ и фибробласюв. Исследовано влияние эпидермальног© фактора роста на пролиферацию и дифференцироэку клеток кожи, раневой процесс. Исследована модель регенерации эпидермиса в культуре.

(*)-списох сокращений приведен на последней странице автореферата

Разработана оригинальныая методика выделения стволовых эпндермальных клеток в культуре, позволяющая до 80% обогащать популяцию эпндермальных стволовых в культуре. Проведена характеристика эпндермальных стволовых клеток с применением маркеров: рбЗ, пролиферагивных характеристик. Впервые обнаружена экспрессия нестина ЭКЦ человека в культуре.

Экспериментально обосновано применение аллогенных клеточных трансплантатов для восстановления поврежденных тканей в органов.

Теоретически обоснованы и экспериментально разработаны методы трансплантации клеток и тканевых трансплантатов, а ткаже технологии восстановления ряда распространенных тканевых повреждений, в том числе глубоких ожогов, трофических язв, свищей, ожогов и язв роговицы глаза, повреждений гортани.

Иммуннохимически исследованы закономерности восстановления тканей и органов под действием аллогенных клеточных и тканевых трансплантатов. Проведена сравнительная характеристика процессов восстановления дефектов кожи и роговицы под влиянием аллогенных эпителиальных и мезенхимных трансплантатов. Сформулированы общие принципы восстановления тканей аллогенпыми трансплантатами,

Полученные результаты обосновали внедрение аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов для лечения многих распространенных болезней и нашли применение в практике ряда ведущих лечебных учреждений. Результаты проведенных экспериментальных работ заложили научно-методическую основу создаваемого первого в России и СНГ Банка кожных клеточных трансплантатов.

Апробация результатов

Материалы диссертации бши доложены на следующих симпозиумах и конференциях: "Современные направления развития биотехнологий" (Москва, 1991), Международная конференция "Интенсивное лечение тяжелообожженных" (Москва, 1992), 5th Congress of European bum association (Brighton, 1993), "Пластическая хирургия при ожогах и ранах" (Москва, 1994), international conference "Mechanisms of Development: Ontogenetic and Phylogenese aspects" (Москва, 1994), Восьмая научная конференция по проблеме "ожоги" (Санкт-Петербург, 1995), óth Congress of European Burns Association (Verona, 1995), Конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995), Международный симпозиум "Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи" (Тула 1996), Международная конференция, посвященная памяти акад.А.А.Еаева (Москва, 1996), 4-th International Congress of International Wound Association (Tel-Aviv, 19%), Республиканский научный симпозиум "Пролифсратнвные заболевания кожи" (Москва, 1996), Городская научно-практическая конференция (Москва, 1997), The First Joint Russian-American Meeting on Bums and Fire Disasters (St-Petersburg, 1997), -International-European A.I.R.R, Conference (Cologne, Germany, 1997), научно-практическая конференция "Возможности я перспективы совершенствования диагностики и лечения в клинической практике (Москва, 1997), Ш Международаая конференция "Современные подходы к разработке перевязочных средств, шовных материалов и пол:¡мерных имплантатов" (Москва, 1998), 11 Конгресс хирургов Украины (Киев-Донецк, 1998), конференция "¡¿неточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей" (Москва, 1998), ААТВ, 23rd Annua] Meeting (San Diego, 1999), Международный конгресс "Комбустнология на рубеже веков" (Москва, 2000), Symposium of Ocular Trauma (Montreal, Quebec, Canada, 2000), 1-й Международный Конгресс «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 7th ESCRS Winter Refractive Surgery Meeting, (Rome, 2003),

Публикации. По теме диссертации опубликованы 83 печатные работы, в том числе одна монография и 39 статей. Результаты исследований защищены 9 Патентами РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание методов, результаты исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Объем диссертации - страниц, включая таблиц, рисунков, список

литературы содержит источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Выделение и культивирование эпидермалъных кератиноцитог кожи человека

Фрагменты кожи, получаемые после хирургических операций, промывали в растворе Хэнкса и нарезали на кусочки размером 2 х 8 мм. Подготовленные таким образом фрагменты помещали в 2% раствор диспазы (Sigma) в среде DMEM иа 1 час при 37°С или на 18 часов при температуре 4°С.Эпндермис отделяли от дермы по линии базалъной мембраны и промывали в растворе PBS не содержащем ионы Са2+и М$г\Полученные фрагменты обрабатывали раствором трипсина (0.125%) в течение 12 минут при температуре 37°С. Действие трипсина нпгибировали добавлением 5% сыаоротки крупного рогатого скота. Клетки выделяли активным гшпегировашкм. Полученную суспензию центрифугировала при 800 об.мин. в течение 10 мин.Клегочный осадок ресуспендировали в смеси сред ДМЕМ F12(l:i)c добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки, 5 мкг/мл HHcymma(Sigma), Ю^М B3t>npOTCpJiHOJLa(Sigma), 10 нг/ мл эпидермальиого фактора роста, 4 мМ L-глутамиаа (Sigma).

Культивирование эпидермальных кератииоцитов (ЭКЦ) проводили на пластике , покрытым коллагеном t типа. С этой целью уксуснокислый раствор коллагена (1,9 мг/мл) инкубировали в культуральиом флаконе в течение 30-45 мин. при температуре 37°С.Раствор коллагена сливали и сосуд тщательно промывали избытком раствора Хэнкса,

Суспензию вносили в сосуд в концентрациях от 50 до 150 тыс. кл\мл. в зависимости от задач эксперимента. Культивирование проводили в среде ДМЕМ:F 12 с добавление вышеуказанных митогенов в атмосфере 5% С02 и насыщающей влажности, при температуре 37°С. Среду в культуре меняли каждые 3 суток. Культивирование постнатальных и эмбриональных фибробластов человека Постнатальяыс фибробласты выделяли из дермы крайней плоти человека. Выделение проводили в растворе коллагеназы 4 мкг\мл. в среде Игла. Культивирование проводили в среде Игла (Пр-во Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с содержанием 10 % эмбриональной телячей сыворотки. Клетки культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в атмосфере 5% COj и насыщающей влажности при температуре В исследованиях использовали фибробласты 3-20

пассажей.

Приготовление коллагенового геля, дермалъного эквивалента Стерильный 0,34М раствор NaOH соединяли с концентрированной (Х10) питательной средой 199 в отношении 1:2 и на каждые 100мл. смеси добавляли 100мг г луг амина и 9 мл 7, 5%-ого бикарбоната Na, Полученную смесь соединяли с охлажденным уксуснокислым (0.1 %) раствором коллагена 1 типа в соотношении 1:4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатенизации. Для приготовления дермалъного эквивалента, в не застывший коллаген вносили суспензию содержащую фибробласты человека в среде Игла из расчета от 50 до 150 тыс,кл/мл. геля. Моделирование процесса регенерации эпидермиса в культуре ЭКЦ культивировали в течение 21 суток до получения многослойного эпидермальиого пласта. Затем нкубировали выращенный эпидермис в среде DMEM без Са3* , митогенных добавок и сыворотки в течение 3-х суток, что приводило к прекращению пролиферации ЭКЦ и откреплению сформировавшихся супрабазальных слоев эпидермиса. После удаления открепившихся слоев на подложке остаются лишь

базальныс ЭКЦ, лишенные межклеточных контактов. Внесение свежен среды DMEMF12 (1:1) с митогенными добавками и сывороткой вызывает быструю активацию сохранившихся клеток. К 24 часам в ходе стратификации образуется эпидермальный пласт, состоящий из нескольких слоев клеток. К 9 суткам культивирования происходит восстановление исходного эшдермапьного пласта. Морфологические и иммуногистохимические исследования

Для морфологического и им муногисто химического исследования биоптаты, полученные в условиях операционной - перевязочной, доставляли в стерильном, охлажденном (+4*С) физиологическом растворе в течение 2-3 часов с момента взятия. Часть полученного материала префиксировали смесью параформ альдегида и глютзральдегида по Карновскому и фиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия, заливали в аралдит по стандартной методике и в дальнейшем использовали для изготовления полутонких (1 мкм) срезов, которые окрашивали метиленовым синим -азуром II и основным фуксином. Другую часть материала, хранившуюся при температуре -70* С, использовали для приготовления криостатных срезов. Иммуногистохимические реакции проводили на криостатных срезах толщиной 5 мкм, фиксированных охлажденным ацетоном, по стандартному стрептавидин - биотнн -пероксндазному методу с использованием моноклональных ( m ) н поликлональных ( ) первичных антител.

В исследовании использовали антитела, характеризующие: компоненты ВКМ, в том числе компоненты баэальиой мембраны, адгезивные молекулы, промежуточные филаменты, клетки воспалительного инфильтрата, цитокины и факторы роста, компоненты системы матриксных металлопротенназ, пролиферативную активность клеток:

Для выявления продуктов реакции использовали система визуализации HistoStain-Plus (Zymed, USA) с DAB (диаминобензидин) в качестве хромогена. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в эпоксидную смолу. Иммунофлюорссцентное исследование проводилось по аналогичной схеме (непрямой метод), с использованием ФИТЦ для визуализации продуктов реакции.

Результаты и обсуждение Закономерности культивирования эпндермальных кератиноцитов кожи человека

Культура эпндермальных кератиноцитов человека (ЭКЦ) представляет собой сложный, но интересный объект исследований.

Культивирование ЭКЦ проводили в смеси сред ДМЕМ-Р12, при содержании ионов кальция 1 мМ, с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, эгшдсрмального фактора роста, инсулина, изопротеринола, гидрокортизола и, возможно, других добавок (трансферрин, селенит натрия и т.д.). В этих условиях первичная культура ЭКЦ способна переживать 4-6 пассажей. Особенностями ЭКЦ в условиях in vitro является гетерогенность культуры, одновременное прохождение различных процессов:дифференцировки (сочетающейся со стратификацией), пролиферации (сочетающейся с миграцией) и апоптоза. Эти свойства, наряду с огромными исследовательскими и клиническими возможностями, делают культуры ЭКЦ особенно привлекательными для исследования.

Пролиферация ЭКЦ строго зависит от субстарата, при его отсутствие они быстро и необратимо теряют способность пролиферировать и переходят к терминальной дифференцировке. После дезагрегации эпидермиса нарушаются плотные межклеточные соединения, вследствие чего исчезает базолатеральная асимметрия клеток, которая восстанавливается после прикрепления.

Для количественной оценки процесса прикрепления мы использовали ЭКЦ крысы, предварительно меченные in situ С'^-тимидином. Исследование динамики прикрепления ЭКЦ показало, что этот процесс продолжается до 24 часов, после чего число прикрепившихся ЭКЦ снижается (Рис.1),

Открепление клеток не зависит от типа подложки и определяется, вероятно, терминальной диффереыцировкой, к которой клетки были комнтвроваяы еще in situ. Количество клеток, прикрепившихся к фидерному слою эмбриональных фибробластов, значительно превышает число прикрепившихся к пластику, С целью упрощения процедуры выращивания мы заменили фидерные клетки сорбированным яа пластике коллагеном I типа. Сорбированный коллаген стимулировал прикрепление на 30% лучше, чем пластик.

Уже через 4-6 часов после внесения ЭКЦ можно наблюдать небольшие колонии ЭКЦ, которые образуются, прежде всего, за счет миграции клеток из прикрепившихся клеточных конгломератов, а также за объединения в колонии одиночных клеток.Уже через 4 часа после прикрепления ЭКЦ формируют фнлоподииАктивная миграция наблюдается а из прикрепившихся волосяных фолликулов, дающих в дальнейшем устойчивый рост колоний ЭКЦ.

Срт

о «-г—■-..;•,-v..1,. •■• ^—.——I

0 12 24 36 4S 60 72

час

Рис. 1. Динамика прикрепления ЭКЦ к фидерному слою эмбриональных фибробластов и пластику.

На 8-12 сутки начинается экспоненциальная фаза роста культуры. Именно в этот период происходит увеличение площади и числа клеток в колонии. Все колонии, состоящие не менее чем из нескольких десятков клеток гетеро гении по морфологии. Центр колонии состоит из нескольких клеточных слоев, клетки плотно упакованы, уплощены, с признаками морфо генетической стратификации. Края колоний представлены клетками, располагающимися в одни слой. Культура ЭКЦ формируется за счет роста колоний различных размеров. В период с 8 до 14 суток в культуре преобладают мегаколонин, сформировавшиеся за счет роста клеток из прикрепившихся конгломератов ЭКЦ. На этой же стадия роста культуры колонии приобретают способность к направленной миграция. В культуре может наблюдаться как минимум два типа миграции. Наибольшие интерес, по-видимому, представляет собой упорядоченная миграция клеток в составе движущихся колоний.

Со временем отдельные колонии сливаются с образованием сплошных пластов. Уже в сравнительно небольших колониях центральные участки оказываются многослойными, поскольку одновременно с пролиферацией ЭКЦ происходит процесс нх дифференцировки и стратификации (морфогенез), в результате чего образуется структура подобная эпидермису.

По достижении пластами достаточно больших размеров устанавливается постоянная плотность клеток (1800/см2) за счет равновесия между образованием новых клеток, апоптозом и переходом к дифференцировке и слущиваниюфаггаг^оп.Огееп ,1985). В наших условиях, при посадочной концентрации в пределах 30 тыс.клеток/ см2 удается достичь увеличения числа клеток примерно в 50-70 раз за 18-21 суток.

Длительное содержание стратифицированных эпидермалькых

пластов, выращенных на жесткой подложке невозможно. Жесткая подложка не позволяет обеспечивать питание этих клеток со стороны базальной мембраны. Уже через 3-4 суток после хранения пласта в условиях кульшвироваякя наблюдается откренлеяие части пластов, что визуализируется как образование пузырей с некротизированными участками клеток. Впоследствии это приводит к потере жизнеспособности и откреплению всего эпвдермального пласта.

Более естественные условия создаются при культивировании ЭКЦ на коллагеновом геле или на дерме с удаленным эпидермисом, что позволяет питательной среде поступать со стороны базального слоя. На геле эпителиальные пласты могут сохранять свою жизнеспособность и характерную структуру в течение длительного времени.

ЭКЦ человека являются клетками, пассирование которых представляет серьезную проблему. Хот* общие закономерности формирования культуры остаются неизменными, пассированные ЭКЦ обладают большей подвижностью, дяфференцировка этих клеток выражена слабее. Все это легко объясняется отбором в условиях культивирования in vitro клеток с повышенной пролиферативной активностью. Такие изменения в культуре могут указывать и на сохранение стволовых эпидермальиых клеток при длительном культивировании.

Миграция колоний ЭКЦ человека в культуре

Культивирование ЭКЦ по методу Рейнвалъда и Грина начинается с выделения и посева суспензии в смеси сред JJMEM:F12, в культуральный сосуд с фидерными фибробластами.

К 7-10 суткам культивирования образуются уже достаточно крупные колонии, содержащие до сотен тысяч клеток. На определенном этапе колония приобретают асимметричную форму, что позволило предположить их способность к направленному движению (миграция).

Типичные колонии на этой стадии роста имели выгнутый (ведущий) и вогнутый (ведомый) края. При культивировании ЭКЦ с фидерными клетками ведущий край колонии находился в контакте с валиком из фидерных клеток, оттесненных мигрирующей колонией, тогда как за вогнутым краем колонии оставался «след», свободный от фидерных клеток. Отмеченное поведение колоний соответствует описанию вытеснения фибробластов эпителиальными клетками (Ю.М.Васильев н Др., 1991,).

Ведущий край колонии образован мелкими плотно расположенными клетками, которые интенсивно окрашивались гематоксилином, эозином и флуореспеином. Противоположный край колонии состоял из крупных слабо окрашенных клеток, расположенных в один слой. Центр колоний был образован, как правило, разнороднымн клетками: кластеры мелких плотно расположенных интенсивно окрашенных клеток чередовались с крупными бледно окрашеиньгми. По нашим наблюдениям, очень мелкие колонии, содержавшие не более ста клеток, не были способны к активной миграции. Хорошо выраженное перемещение колоний отметалось тогда, когда о пи состояли уже из нескольких тысяч клеток. При дальнейшем увеличении размеров колоний их способность к миграции снижалась. Когда же колонии достигали 5 мм и более в диаметре (40-50 тыс. клеток и более), движение их сначала замедлялось, а в дальнейшем прекращалось.

Для определения скорости движения колоний флаконы с культурами ЭКЦ помешали на термостатируемый столик инвертированного микроскопа.

Скорость движения колоний ЭКЦ на 7-е сутки роста составляла, в среднем, 20 мкм/ч, однако она могла изменяться в зависимости от размера колоний и присутствия фидерных клеток. Максимальная скорость перемещения ЭКЦ наблюдалась на пластике покрытым коллагеном. По нашим наблюдениям, именно к 7 суткам формируются колонии, обладающие максимальной подвижностью. Можно предположить, что

способность к миграций у ЭКЦ усиливается постепенно и, возможно, это связано с началом синтеза компонентов внеклеточного матрикса, базальной мембраны.

Рис.2. Типичная форма мигрирующей колонии ЭКЦ человека на 9 сутки культивирования.

Направление движения колоний представляется случайным. За время менее 6 часов колонии могут изменять направление движения на 45°. В движении отдельные колонии сливаются с образованием мегаколоний. Во всех случаях колонии перемещались как единое целое и их движение не сопровождалось быстрым изменением относительного расположения клеток а колонии. Таким образом, отмеченная нами миграция колоний ЭКЦ отличается от центробежной миграции краевых клеток в колониях ЭКЦ под влиянием факторов роста (Barrandon Y., Green Н, 1985,). Следует отметить, что миграция краевых клеток коррелировала с их способностью к пролиферации. Ниже мы приводим результаты опытов, показывающие, что и миграция колоний ЭКЦ коррелирует с их пролнферативной активностью.

Мы блокировали пролиферацию с помощью мнтомицина С, добавлением в питательную среду немеченого тимидина или путем инкубирования колоний ЭКЦ в среде без Ca и мнтогенов. Поляризованные колонии ЭКЦ инкубировала в питательной среде с добавлением митомицвна С (10 MKrAw,«Sigma)>) в течение 2 ч. при 37°С, затем среду с митомицином заменяли на свежую. После такой обработки скорость миграции колоний снижалась, и через 24 ч движение полностью прекращалось. Поляризованные колонии, при этом, становились округлыми и деления клеток в них не наблюдалось.

Добавление тимидина (Ю^М) приводило к таким же результатам, но носило обратимый характер. Снятие тимидинового блока приводило к возобновлению движения, при этом направление движения часто отличалось от первоначального. Удаление Cai+ из питательной среды приводило к дезагрегации пласта ЭКЦ и обособлению отдельных клеток. Смена питательной срсдк со стандартным содержанием Са1+ на среду без Са1+ и митогенов приводила к остановке миграции колоний, разъединению ЭКЦ и потере колониями асимметричной формы.

Результаты проведенных экспериментов указывают на связь между пролиферацией клеток, миграцией колоний н характерной асимметричной формой. Поскольку движение колоний, обусловлено суммарной активностью составляющих их клеток, мы предположили, что направленность движения и асимметричность колоний могут быть обусловлены неравномерностью распределения делящихся клеток. С этой целью мы в течение 6ч инкубировали движущиеся колонии с 3Н-тим ид ином (I мкКи/мя, 38.6 Ки/ммоль). После этого колонии фиксировали и проводили радио-

автографическое определение индекса меченых клеток. На полученных препаратах были исследованы 22 мигрирующие колонии, выращенные в присутствии фидерных клеток, и 10 колоний, выращенных без фидерных клеток на пластике, покрытом сорбированным коллагеном. Анализ распределения меченых ЭКЦ не выявил статистически значимых различив между ведущим и ведомыми краями колоний. В присутствии фидерных клеток индекс меченых клеток составлял в среднем 30,4% на ведущем крас и 31,3% на ведомом. Для колоний, растущих без фидерных клеток, эти величины составляли соответственно 21,0 и 23,7 %.

Следует отметить, что в отдельных случаях были значительные различия между индексом меченых клеток на ведущих и ведомом краях, что позволяет предполагать существование волн деления клеток.

Способность клеток мигрировать в составе колоний в культуре была обнаружена нами у клеток эпидермоидной карциномы человека А-431. Экспериментальные попытки выявить миграцию колоний у эпителиальных клеток роговицы человека и кролика успеха но вмели.

Способность ЭКЦ к миграции в составе колоний сохраняется и на поверхности трехмерного холлагенового геля. При этом миграционная активность первичных эпидермальных клеток на геле существенно ниже. Способность активно мигрировать проявляют только пассированные ЭКЦ. Присутствие в геле фибробластов повышает выживаемость ЭКЦ, стимулирует их пролиферацию. При этом характер миграции заметно меняется, в колонии появляется несколько фронтов миграции и они приобретают «звездчатую» форму.

Миграция эпителиальных клеток - важный морфогеиетический процесс, определяющий, в частности, характер восстановления тканевых дефектов, В случае глубоких поражений кожи именно миграция эпидермиса является критической стадией. Общим правилом является то, что большей миграционной способностью облазают менее дифференцированные эпителиальные клетки. Тем более лнтереспо, что именно эпидермалышс клетки способны к столь быстрому перемещению, да еще и в составе организованных сгруктур.Такое перемещение наблюдается только в культуре, где нет условий для стратификации эпидермиса и где повышена пролиферативная активность ЭКЦ.

Очевидно, что для обеспечения подвижности эпидермальных клеток следует добиваться репрессии процессов дифференцировки и создания условий для активной пролиферации клеток.

Разработка модели регенерации эпидермиса in vitro и изучение клеточных су б популяций керагнноцнтов

Для выяснения механизмов восстановления кожного покрова путем трансплантации выращенных ЭКЦ необходимо охарактеризовать и изучить пролифератнвные свойства культуры.При этом наиболее важным является поиск, идентификация и изучение стволовых клеток или клеток способных выполнять подобные функция.

Обнаруженные маркеры - такие как Рхинтегрин, об-рецептор к трансферрину, цитокератин 19 и t.fl.(Watt, 2001) не являются критериями, позволяющими провести такое разделение. В последнее время наиболее достоверным критерием, позволяющим идентифицировать субпопуляцию стволовых ЭКЦ in vivo, считается экспрессия ядерного белка рбЗ (Pelegrini et al„ 2001). Показано также, что в то Бремя как в организме рбЗ-содержащие клетки пролиферируют медленно, полученные аз этих клеток клоны проявляет резкое увеличение прояиферативной активности.

До сих пор неизвестно, существуют ли стволовые клетки эпидермиса в культуре при длительных сроках культивирования. Имеются опасеиия (Lavker et al., 1998), что in vitro стволовые клетки активируются и теряют присущие вм свойства, пополняя компартмент активно пролиферирующих транзиторных клеток.

Без специальных приемов, трудно добиться сколь-нибудь значимой синхронизации ЭКЦ. В культуре одновременно происходят несколько взаимосвязанных процессов и присутствуют различные субпопуляции клеток. Так, в культуре могут присутствовать стволовые, или подобные им клетки, наиболее активно пролиферирующне транзиторные клетки и дифференцированные ЭКЦ. Изучение процессов пролиферации и диффереяцировки б эпидермисе человека in vitro затрудняется многоелойностью эпидермального пласта. Кроме того, трудно рассчитывать на выделение и идентификацию строго стволового компартмента клеток.

Для решения этих проблем мы модифицировали метод физиологической регенерации эпидермиса in vitro(Jensen et al., 1988).Суть метода заключается в переводе культур кератнноцитов на среду без кальция н митогенов. Cai+ является мощным промотором стратификации кератиноцитов и, кроме того, необходим для поддержания межклеточных контактов. Лишившись кальция и митогенов, клетки переходят в состояние лролиферативного покоя Go. При этом супрабазальные слои открепляются вследствие разрушенных межклеточных контактов. При добавлении в культуру среды с кальцием и стимуляторами пролиферации, происходит новый цикл активации пролиферации дифференцировки клеток, причем пик пролиферативной активности приходится на 7 сутки после замены среды (Jensen et al., 1988). Полноценное восстановление эпидермиса, после дестратификации, происходит за 9 суток. Разработанный метод позволяет проводить многократную регенерацию эпидермиса in vitro и непосредственно исследовать наиболее значимые базальные клетки, определяющие процессы гомеостаза эпидермиса.

На 21 сутки культивирования эоидермальные кератиноциты формируют многослойный пласт, занимающий не менее 85% культуральной поверхности, с признаками интенсивной кератинизации. Доступные визуализации клетки супрабазальных слоев при этом одинаковы по своей форме и размерам. Для удаления ионов кальция и ростовых факторов игеткн помещали в среду DMEM без кальция (менее 0.01 мМ) и митогенов. Во время инкубации, которая составляла 72 часа, Са2+-зависимые контакты между клетками разрушались, в результате чего супрабазальные слои откреплялись от клеток базального слоя.

Рис. 3, Многослойный эпидермалькый пласт на 21-е сутки культивирования

Интересно, что клетки базального слоя, теряя контакты друг с другом, тем не менее не откреплялись от подложки - это может свидетельствовать о том, что в образовании гемндесмосом Саг* не играет столь существенной роли, как в межклеточных контактах. После перевода культур на полноценную среду с содержанием кальция 1мМ и необходимыми митогенами, клетки базального слоя начинают менять свой фенотип.

Рис, 4.Назальный слой эпидермальных кераткноцнтов после культивирования в среде без кальция и м иго генов.

Через два часа клетки начинают формировать ламеллнподин и межклеточные контакты, Мнтотические клетки не наблюдаются. К девятому часу после замены среды, клетки визуально становятся гетероморфными, некоторые являются более распластанными, причем характерно, что такие клетки с большим ядерно-цитоплазматическим соотношением образуют «кластеры» по 40-70 клеток, фланкированные более распластанными клетками. Межклеточное пространство сужается, что вызвано новообразованными межклеточными контактами; начинают появляться митозы. К двенадцатому часу в культуре образуются локусы с двойным слоем клеток, что свидетельствует о резко возрастающей митогенной активности, переходом части клеток в дифференцировку н дальнейшей стратификации. К 24 часам наблюдается восстановление многослойного эпадермального пласта на большей площади культурального сосуда.

Изучение характера пролиферации при регенерации эпидермиса In vitro.

Для исследования пролиферативной активности ЭКЦ базального слоя при выходе их из состояния пролиферативного покоя, использовали иммуногнстохимическое окрашивание на КІ67 — маркер пролиферируюпшх клеток, содержащийся в клетках на всех стадиях клеточного цикла.

После инкубации пласта ЭКЦ в среде без ионов Саі+ и митогенов в течение 72 часов, в культуре оставался только базальний слой клеток. К базальному слою клеток вносили свежую среду полного состава. Для оценки относительного количества нролнферирующих клеток в культуре, проводился подсчет количества окрашенных на КІ67 клеток на) ООО.

В этот момент содержащих КІ67 клеток в культуре оказывались менее 1%, что указывает на высокую степень синхронизации и отсутствие дролифератмвных событий в культуре. Уже через 3 часа регистрировалось 7% пролиферируюпшх клеток; через 6 и 9 часов эта величина достигала 9 и 13 % соответственно. К 12 часам относительное количество К.І67 положительно окрашенных клеток составляло 22%. Таким образом, наблюдалось активное вхождение в цикл клеток, способных к быстрой активации, предположительно транзи торных, Чтобы рассмотреть характер пролиферации клеток базального слоя в модели регенерации, через 7 суток после проведения первой процедуры регенерации эпидермального пласта in vitro, проводили повторную инкубацию культур в среде с отсутствием ионов Са2+ и митогенов в течение 72 часов. Здесь процесс обнажения базального слоя шел несколько иначе. В отличие от образовывавшихся «тяжей» супрабазальных клеток во время первой дестратиф акации.

при повторном проведении такой процедуры супрабазальные клетки отделяются небольшими группами по 15-20 клеток, обнажая базальний слой. Вследствие истощения базальний слой представлял собой уже не цельный шгасг, как при первичный десгратификации, н занимал не более 50% от общей поверхности культуральной посуды. На момент перевода вторично дестратифицированного эпидермиса на среду полного состава КІ 67-положительными являются порядка 1% клеток, К 3 часам после проведения процедуры регистрировалось 6.3% Кі Ы содержащих клеток, через 6 и 9 часов эта величина достигала 7.5 и 8.0% соответственно.

Рис.5. Динамика изменения количества пролифернруюншх клеток при стимуляции пролиферации после первой и второй дестратификации эпидермиса

Таким образом, данные коррелируют с результатами, полученными после проведения первой регенерации. На этом основании можно сделать вывод об относительно одинаковом компартменте клеток, выходящих из состояния покоя при активации, и вступающих в активную пролиферацию. Различие в количестве пролиферативных событий на 12 ч можно объяснять тем, что во время вторичной регенерации транзиторные клетки преимущественно вступают на путь дифферешшровки и стратификации, в результате чего базальный слой обогащается предположительно стволовыми и проген игорными клетками.

Поведение ЭКЦ вязального слоя в модели повторной регенерация эпидермиса In vitro

ЭКЦ выращивали в течение 24 суток в среде с ,4С-тимидином (0,03 мкКи/мл; 56.7 Ки/мол) для того чтобы пометить все клетки, образующие многослойный эпителиальный пласт. После этого, как описано выше, культуры инкубировали 3 суток в среде без сыворотки и Са2+ и удаляли супрабазальные клеточные слои. Затем добавлением полной питательной среды стимулировали пролиферацию оставшихся базальных клеток. Эту процедуру мы повторила еще два раза с интервалом в 4 суток.

Результаты опытов показывают, что радиоактивность остающихся после первой десгратификации базальных клеток резко уменьшается после второй обработки культур (в 8,5 раз), а после 3 обработки радиоактивность уменьшилась лишь в 2,4 раза. Это уменьшение метки в базальных ЭКЦ в первую очередь связано с комнтнрованием к днфференцировке клеток и переходу их в сулрабазалькое положение. Сохранение же метки, по нашему мнению, происходит за счет персистеншга стволовых клеток. Можно предположить, что сохранившаяся радиоактивность отражает уровень мечевия стволовых клеток. Для дальнейшего изучения поведения компартмента стволовых клеток в культуре определяли содержание рбЗ-положительных клеток и характер их локализации.

Рис.б, Изменение радиоактивности ЭКЦ, остающихся в базальном слое после последовательных дестратификацнй с интервалом 7 суток.

Сшрх 10*

сутки

Идентификация рбЗ-содержащнх клеток в базальном слое эпндсрмальных кератниоцитов.

Известно, что in vivo эпидермис содержит около 5% клеток, условно считающихся стволовыми по ряду признаков и маркеров. (Watt et al„ 2000).

Одним из маркеров, наиболее используемым сегодня, является рбЗ, позволяющий отделить стволовые клетки от транзнторных в стратифицированном многослойном эпителии in vivo. (Pelegriw et al., 2001). Клетки, положительные по рбЗ, активно формируют голоклоны, и составляют около 5% процентов от общей популяции клеток базального слоя. Известно также, что такой клоногенной способностью обладают клетки, сохраняющие метку при импульсном мечении, также составляющие не более 5% от общей популяции кератиноцитов базального слоя (Lavker et al., 2000). Это позволяет считать рбЗ одним из маркеров стволовых клеток in vivo.

Рис.7. Базальний слой кератниоцитов на 9-е сутки культивирования, окрашенный антителами против рбЗ.

В эксперименте анализ на содержание рбЗ проводили на 9 сутки, а также в моделе регенерации эпидермиса на 21 н 30 сутки ( 1 и 2 дестратификация ),

Культуры были зафиксированы и окрашены после проведения первой дестратификащш эпидермиса in vitro, а также после смены среды на среду обычного состава через 3, б и 9 часов. При очевидном увеличении числа клеток базального слоя по сравнению с культурой на 9 сутки роста, относительное количество рбЗ положительных клеток увеличилось незначительно - до 37% и не изменялось после замены среды на полную в течение указанных сроков.

После 7 суток культивирования в среде с нормальным содержанием Са2+ и ростовыми факторами, бьюа проведена вторичная дестратифнкация, культуры были окрашены на содержание рбЗ аналогично предыдущему опыту, сразу по окончании инкубации в бескальциевой среде, а также после замены среда на полную спустя 3, б и 9 часов. При уменьшении количества клеток базального слоя вследствие его истощения, относительное количество рбЗ-содержащих клеток резко возросши и составило 90%. В течение 9 часов после перевода базальных клеток на среду с обычным содержанием кальция и митогенов количество таких клеток оставалось неизменный. Однако интенсивность окрашивания была гораздо выше, чем после первой дестратификации.

100,0% -і- ;

90.0% - і і

і І ео.о% '

і І 70,0% - і

І 60,0%-

І 50,0%

: І 40,0% ■ __. —

: І зо,о% - --■^■-■■.г-. . ;

, * 20,0%- /у^УК: 1

ю.0% - -У- У -1 '

о,о% -—-—і-1———*-і і -

9 суток 1 дестратифнкация 2 дестратифнкация [

Рис.8. Изменение количества рбЗ-положительных клеток в базальном слое после

проведения дестратификации на разных этапах культивирования.

После проведения первой дестратификации их количество незначительно возрастает до 37%, После второй дестратификации в базальном слое насчитывается более 90% рбЗ-положительных клеток.

Мы предполагаем также, что регенерация эпидермиса после первой обработки происходит за счет компаргмента транзиторных клеток, которые вместе со стволовыми находятся в базальном слое. Перевод базальных клеток на среду с обычным содержанием кальция и митогенов является стимулом к активации клеточного резерва, не затрагивающей компаршент стволовых клеток.

Ко времени второй обработки компартмент транзиторных клеток истошен. На это, в частности, указывает резкое увеличение - до 90% относительного числа рбЗ-содержащих клеток. Базальный слой ЭКЦ после проведения второй дестратификации содержит меньшее количество клеток. Истощение базального слоя происходит за счет трансзиторных клеток, которые вследствни своей способности к быстрой пролиферации и дифференшровки в процессе регенерации эпидермиса пополняют компартмент дифференцированных клеток. Такое истощение компатрмента транзиторных клеток приводит к обогащению базального слоя стволовыми клетками.

Срок 7 суток, выбранный нами от одной процедуры дестратификации до другой, недостаточен для полноценной регенерации эпидермиса, в частности, для восстановления компаргмента транзиторных клеток. Однако нельзя исключить, что увеличение относительного числа клеток, зкспрессирующнх рбЗ, может свидетельствовать не только об обогащении культуры стволовыми клетками, ко о функциональном изменении компаргмента зкспрессирующнх рбЗ клеток. Возможно, при активации в период регенерации, рбЗ начинают экспрессировать и транзиторные клетки. Можно допустить, что компартмент транзиторных клеток

неоднороден и может содержать клетки, различающиеся по пролиферативной активности, способности к активации и содержанию рбЗ. Исследование эпидермального пласта из 9-е сутки культивирования, когда в культуре наблюдается пролиферативный «взрыв», но нет еще активных дифференцировочных процессов, показало, что супрабаэалъные слои, активно экспрессирующие Ki67, не экспрессируют рбЗ. Эти данные свидетельствуют в пользу тезиса об истощении компартмента транзиторных клеток и увеличении относительного содержания рбЗ экспрессирующих стволовых клеток. Тем не менее, увеличение (от 30 до 90%) относительного количества рбЗ- содержащих клеток в базальном слое можно объяснить прохождением двух процессов - истощением компартмента транзиторных клеток и активацией стволовых. В любом случае, доказано наличие рбЗ содержащих клеток в базальном слое эпидермиса in vitro, на 9, 24 и 31 сутки культивирования.

Нами доказано наличие стволовых эпидермальных клеток в культуре при длительных сроках культивирования. Несомненно, рбЗ не может служить единственным маркером стволовых клеток, однако на соответствие рбЗ-окрашиваемых клеток свойствам стволовых, указывает увеличение их относительного содержания при истощении компартмента активно пролиферирующих клеток. Значительное число рбЗ-содержащих клеток, даже в ранние сроки культивирования превосходящие предполагаемое число стволовых клеток эпидермиса (5%), также объяснимо.

Влнявня ЭФР и эмбриональной телячьей сыворотки на синтез ДНК в модели регенершви эпидермиса in vitro

Из факторов роста, используемых для культивирования ЭКЦ, наибольший интерес представляет, пожалуй, ЭФР, который помимо митогенного действия оказывает на клетки и трофический эффект. Внесение 10 иг/мл ЭФР в питательную среду DMEM:F12, не содержащую сыворотки и других мятогеиов, почти в 2 раза стимулировало включение 3Н-тиыидина в клетки. Добавление только сыворотки в дозе 5% также стимулировало пролиферацию ЭКЦ, причем сильнее, чем добавление 15% сыворотки. Внесение на фоне ЭФР сыворотки существенно не изменяло включение ЭН-тимидина в ЭКЦ. Очевидно, эффект ЭФР, столь значимый в бессывороточной среде, не проявляется в присутствии сыворотки. Модель регенерирующего эпидермиса позволяет проследить также влияние ЭФР на переход ЭКЦ из базального слоя в супрабазальное положение.

Полученные результаты показывают, что наибольшая радиоактивность клеток оставшихся в базальном слое обнаруживается в культурах, инкубированных с ЭФР, но без сыворотки. В присутствии же сыворотки происходило значительное снижение радиоактивности базалъиых клеток. Поскольку в супрабазальное положение переходят клетки, коми тированные к дифференцировке, можно заметить, что ЭФР задерживает переход клеток в дифференцированное состояние, тогда как сыворотка способствует этому процессу.

Полученные нами результаты показывают, что сыворотка нивелирует эффект ЭФР в культуре, способствует стратификации эпителиальных пластов и дифференцировке ЭКЦ, тогда как действие ЭФР направлено на усиление пролиферации и на поддержание недифференцированного состояния базальных клеток.

По-видимому, ЭФР способствует более длительному сохранению стволовых клеток в культурах ЭКЦ, а использованная модель регенерации эпидермиса может быть применена для изучения поведения стволовых клеток.

Исследование ЭФР в данной модели показало, что фактор предотвращает переход клеток в супрабазальное положение, ингибируя, таким образом стратификацию (терминальную дифференцировку) клеток. Исходя из представлений об иерархическом устройстве эпидермиса, можно утверждать, что ЭФР способствует обогащению субпопуляций транзиторных и стволовых клеток.

Cfflp

1000

1500

500

О

ВДМЕМ:Р-12

BAMEM:F-12 с ЭФР

0flMEM:F-12c3OP и 5%ЭТС

®flMEM:F-12 с ЭФР и 15% ЭТС

Рис.9. Количество ЭКЦ, остающихся в базальном слое под воздействием ЭФР, после стимуляции регенерации.

Идентификаций нестнн-пшгожнтельных клеток в базальном слое эпидермиса

Нести и является общепризнанным маркером нейральных предшественников и экспрессируется в центральной нервной системе крыс, мышей и человека, В последнее время экспрессия нести на показана и в клетках-предшественниках других тканей, например при развитии мышечной ткани, кардиомиоцитов, р-клеток поджелудочной железы и клеток Сертоли, а также в эндотелии аорты быка. Постепенно в ходе днфференцировки экспрессия нестина уменьшается и замещается другими тка1 ^специфичными промежуточными филаментами, такими как нейрофиламенты в нейронах, десмин в мышечной ткани и т. д. Интересно, что экспрессия нестина может индуцироваться в ходе различных регенеративных процессов в уже полностью дифференцированных тканях {Frisen et al, 1995). Кроме того, было показано, что экспрессия нестина связана с делящимися клетками и с клетками, способными к изменению своего фенотипа.

После проведения первой дестратифнкацни культура была зафиксирована 4% параформальдегидом (Serva) и окрашена антителами против нестина человека (кроличьи поликловальные, мышиные моноклональные, Chetnicon) и кератина 14 (Novocaslra). На рис,10 видно, что большая часть клеток в поле зрения нестин-положительна, Тем не менее, интенсивность окрашивания неодинакова. Локализация нестина имеет перинуклеарный характер.

Рис.10, Им мук огистох им и ч еское выявление нестнн-содержащих клеток в базальном слое ЭКЦ

При этом ядро абсолютно не окрашено, а максимальное окрашивание наблюдается в виде кольца в перинуклеарном пространстве, а к периферии его интенсивность рачительно снижается.

Окрашивание носило диффузный характер. Конфокальная микроскопия показала отсутствие фибриллярного распределения нестина в данных клетках. При двойном окрашивании антителами против нестина и кератина 14 эти клетки были кератин поло жительными.

При проведении двух последовательных дестратификаций с интервалами в 7 суток характер окрашивания базального слоя оказался сходным.

Обнаружение нестина в базальном слое Эпидермиса указывает на возможный потенциал элидермальных стволовых клеток в плане дедифференцировки н получении других клеточных типов. Диффузный характер окрашивания может говорить о постепенной потере таких потенций и дифференцировхе по эпидермальному пути с замещением нестиновых на другие промежуточные (например, виментнн) филаменты.

Взаимодействие эпндермальвых кератяноцитов и фибробластов » живом эквиваленте кожи in vitro

Создание in vitro модели живого эквивалента кожи открывает широкие возможности использования такой конструкции в клинической практике для восстановления глубоких эпителио-меэенхимных дефектов. Изучение живого эквивалента позволяет адекватно моделировать клеточные механизмы раневого заживления. Модель живого эквивалента кожи была предложена в 1981 (Bell et al.,1981),

Фибробласты, включенные в гель, реорганизуют фибриллы матрикса, передают на субстрат внутриклеточное механическое напряжение и вызывают его контракцию. (Grinnell F.,2000), Состояние геля, в свою очередь определяет поведение включенных в него клеток. В геле, прикрепленном к поверхности культурального сосуда, создается изометрическое напряжение, которое не проявляется во флотирующем геле. При отсутствии натяжения в матриксе, фибробласты, в течение нескольких часов переходят в состояние покоя, часть клеток подвергается апоптозу (Rosenfeldt and Grinnell, 2000). Фб в геле приобретают некоторые характеристики гладкомышечных клеток, включая экспрессию а-актина и образование стресс-фибрилл. Именно такие миофибробласты приобретают способность контактировать гель. Кроме того, они являются основными клетками синтезирующими основные компоненты внеклеточного матрикса: тенасцин, фибронектин, коллаген I и 10 ткдов. Одновременно эти клетки ответственны за синтез ферментов, вовлеченных в деградацию матрикса. По завершении процесса образования зрелой структуры и прекращения контракции, миофнбробласты элиминируются по механизму апоптоза. Образовавшаяся в результате контракции структура имеет большое сходство с грануляционной тканью и может рассматриваться как наиболее естественное микроокружение и подложка для выращивания ЭКЦ.

В наших экспериментах ЭКЦ человека, высеянные из поверхность геля, в течение первых суток культивирования образовывали небольшие колонии из распластанных клеток. Спустя 1 сутки отмечалась контракция геля, она была уже хорошо выражена в течение 2-3 суток (Рис. 11 ).

Рис. 11 .Контракция геля ЭКЦ, высаженными на его поверхность. 1-200 тыс.,3 - 500, 3-1000 тыс. ЭКЦ, высаженных на поверхность геля

3 г*ля (%)

1»Т—

Вр*ия |ч)

Контракция геля зависела от концентрации ЭКЦ, причем существовала пороговая концентрация, ниже которой изменения площади геля не происходило. Пересадка в центр геля выращенного пласта ЭКЦ, размер которого составлял 10% от исходной площади геля, приводила к контракции с коротким лаг-периодом (РисД2 ),

3 геля [%)

Рис.12 .Влияние пласта ЭКЦ, перенесенного на гель, на его контракцию.

1- контракция геля фибробластами в количестве 200 тысУмл.

2-контракция геля пластом ЭКЦ

3-контракция геля фибробластами в количестве 200 тыс ./мл. и пластом

ЭКЦ.

При суспендировали» в геле ЭКЦ в количестве 500 тыс., последние оставались округлыми, и наблюдалась лишь слабая контракция геля, возможно, обусловленная действием других типов клеток, например меланоцитов, контаманирующих первичную культуру ЭКЦ. Число клеток, проявляющих в геле фибробластоподобную морфологию, не превышало 1%.

На Рис.13, представлена временная зависимость контракции коллагенового геля фибробластами и ЭКЦ при совместном культивировании, В качестве контроля использовали гель с фибробластами, но не содержащий ЭКЦ, Полученные результаты, позволяют сделать вывод о том, что оба типа клеток способны потенцировать действие

друг друга в процессе контракции геля.

D <! К « V S5 is 115

Вр*нл (ч)

Рис.13. Совместная контракция геля суспендированными в нем фибробластами

(200 тысУмл.) и высаженными на его поверхность ЭК Д.

1-без ЭКЦ, 2,3,4-при посадке 250,500 и 1000 тыс.ЭКЦ соответственно.

Для изучения влияния ЭКЦ на контракцию геля мезенхнмными клетками, свежеприготовленный гель с фибробластами, через 1 час после образования, переносили в

в чашку Петри, на дно которой за 20 часов до этого высевали культуру ЭКЦ. Несмотря на отсутствие какого-либо контакта ЭКЦ с ФБ п с гелем интенсивность контракции возрастала дочти на 20%.

Влияние мезенхимных клеток на процесс контракции коллагенового геля было исследовано и при помощи клеток линии ЗТЗ Swiss. Эти фибробластоподобные иммортализованные клетки в коллагеновом геле остаются округлыми и не вызывают его контракцию, поскольку не способны к экспрессии а-актика. Тем не менее, в наших экспериментах, клетки ЗТЗ Swiss усиливали способность ЭКЦ контрастировать гель. Кроме того, трансплантация на поверхность геля ЭКЦ приводит к изменению морфологии части включенных в гель клеток ЗТЗ Swiss. Под влиянием ЭКЦ часть округлых клеток принимала веретеновидную форму. Этот феномен, тем не менее, не влиял на интенсивность контракции.

Отсутствие котракцин в контрольном геле, содержащем удвоенное число клеток ЗТЗ и подпороговую концентрацию ЭКЦ, несмотря на большое количество поляризованных клеток, исключает их прямой вклад в контракцию.

Полученные результаты однозначно указывают на кооперативное участие фиброб ластов и ЭКЦ в контракции коллагенового геля. Способностью взаимодействовать в процессе контракции обладают как первично трипсинизированные, так и пассированные ЭКЦ. Пороговая концентрация первично трипсинизнрованных ЭКЦ, вызывающих контракцию геля, выше, чем для пассированных ЭКЦ, что легко объяснимо поскольку, по нашим данным, только 18 % выделенных из кожи клеток способны прикрепляться к подложке. Значительный лаг-период в контракции геля ЭКЦ очевидно связан с процессами их адгезии. В наших исследованиях показано, что ЭКЦ, суспендированные в геле, остаются округлыми, пеполяризованными и слабо контрастируют гель. После посева на гель ЭКЦ распластываются, поляризуются и образуют колонии в течение 18-20 часов. Для того чтобы ЭКЦ приобрели способность контрактировать гель, они должны прикрепиться к нему и образовать колонии. Пересадка уже сформированного пласта ЭКЦ на гель приводит к сокращению лаг-периода.

Вероятно, что в контракции геля ЭКЦ вовлечен цитоскелет. Сам выращенный эпидермальный пласт создает силу натяжения. Так, после отделения пласта от жесткой

подложки ферментативным путем, происходит его значительное самопроизвольное сокращение.

Усиление ЭКЦ способности ФБ контрактироватъ гель осуществляется посредством дистантного межклеточного взаимодействия, а не только через непосредственное натяжение геля, что указывает на вероятное участие в этих процессах растворимых факторов. Предполагается, что взаимодействие фибробластов и кератиноцитов происходит по двойному паракрикному механизму.

Разработка метода культивирования и трансплантации клеток кожи, выращенных на поверхности микроносителей.

Несмотря на широкое распространение метода культивирования н трансплантации ЭКЦ, предложенного Грином, данная технология не лишена недостатков. Так, процесс выращивания эпидермального пласта занимает 18-23 суток. Любые погрешности в реализации технологии приводят к снижению качества выращенного пласта иди удлинению сроков его подготовки. Подготовленный пласт, занимающий всю поверхность культурального сосуда, должен быть переведен в режим консервирования или без промедления трансплантирован на раневую поверхность. Сохранение выращенного пласта в культуральном сосуде приводит к быстрой диффсрснцировке и стратификации клеток и, как следствие, к снижению его жизнеспособности. Для открепления выращенного эпидермального пласта от поверхности сосуда необходима его обработка раствором диспазы. Снятый пласт контрастирует примерно на 10-20 %, что уменьшает площадь, закрываемую выращенным эпидермисом. Даже небольшие задержки с трансплантацией, изменения температуры или влажности приводят к значительной потере жизнеспособности баэальных клеток, что сказывается па результатах трансплантации. Сама процедура трансплантации сложна, требует создания в клинике специальных условий. Все это сказывается на эффективности технология и сдерживает ее клиническое распространение,

В различных исследовательских центрах предпринимаются попытки разработать более технологичный метод выращивания и трансплантации ЭКЦ. При этом разработчики стремятся обеспечить возможность аппаратурного оформления процесса, взбежать необходимости откреплять для трансплантации пласт от субстрата, осуществляя процесс культивирования и трансплантации на подложке (S.Boyce, G.Warden, 2002),

Нами был разработан метод культивирования и трансплантации клеток кожи, на поверхности микроносителей (МН), представляющих собой коллагеновые микросферы, диаметром 200-300 мкм, разработанные дм масштабного культивирования клеток. Наилучшие результаты по прикреплению ЭКЦ были получены при использовании отечественных коллагеновых микроносителей «Цнтолар» производства ГНИИ особо чистых биопрепаратов

Небольшие количества клеток на МН можно успешно культивировать в стационарных условиях, однако выращивание значительных количеств клеток требуют перемешивания, например, в роллерных аппаратах. Используя роллерное выращивание, мы культивировали клетки при 2-4 об/мин., что предотвращает слипание клеток и МН в конгломераты. При больших скоростях клетки открепляются от субстрата и теряют свою жизнеспособность. Использование МН позволяет сократить сроки подготовки трансплантата, переносить выращенную композицию на раневую поверхность без какой-либо предварительной обработки. Так, нет необходимости добиваться полного заполнения клетками всей поверхности МН. Нами был опробован «принцип 70%», заключающийся в том, что трансплантат считается пригодным, если у 70% МН 70% поверхности заняты клетками. С увеличением числа клеток на поверхности МН растет эффективность трансплантации.

Моделируя процесс трансплантации in vitro, мы переносили выращенные на поверхности МН хератиноциты на поверхность трехмерного коллагенового геля,

включающего в себя фнбробласты (дермальный эквивалент). Уже через S

Рис.14. Миграция эпидермальных клеток с поверхности микроносителей на

трехмерный коллагеновый гель, ft часов после трансплантации.

Очевидно, что миграция проходит и на ране, поскольку именно с раневой поверхности возможно питание клеток. Данная технология позволяет значительно увеличивать плоишь закрываемой клетками раневой поверхности.

Трансплантация выращенных на поверхности МН клеток приводит к возникновению на ране множества островков эпителизацни, что н приводит, в конечном счете, к закрытию эпителиальными клетками раневой поверхности. Для равномерного распределения выращенных на МН ЭКЦ на раневой поверхности, а также для доставки клеток в полости организма мы заключали подготовленные к трансплантации клетки на МН в трехмерный коллагеновый гель. Такой методический прием обеспечивает кратковременное хранение подготовленных к трансплантации клеток. В ином случае клетки на поверхности МН слипаются, образуют конгломераты. Однако при высокой плотности клеток и значительном числе МН в условиях культуры могут образовываться большие конгломераты с некротическими зонами. В составе геля клеточные композиции способны переживать в течение 10 суток без изменения своих свойств. Более того, МН с клетками в составе геяя легко трансплантировать и распределять на раневой поверхности.

В экспериментах по трансплантации таких конструкций на рану лабораторных животных показано, чгто клетки внутри геля быстро мигрируют с поверхности МН на грануляционную ткань. Клинические испытания таких конструкций при лечении ожоговых ран в НИИ скорой помощи им. НЗ.Склифосовского и Военно-медицинской академии (г.С.Петербург) подтвердили простоту и эффективность метода.

Реализация данного подхода позволила разработать технологичный метод долговременного хранения ЭКЦ. Так, при хранении ЭКЦ на поверхности МН в жидком азоте в течение 12 месяцев удавалось достичь 85% сохранности жизнеспособных клеток.

Культивирование на поверхности МН пригодно и для фибробластов. В ходе эксперимента определено, что минимально допустимая посадочная концентрация клеток (концентрация, которую вносят в суспензию МН, для достижения устойчивого роста клеток) составляет 150 тыс./мл. Использование таких концентраций позволяло достичь конечной плотности 500 тыс.кл./мл. Данный подход позволяет создавать смешанные культуры ЭКЦ и ФБ, избегая конкуренции клеток, что важно при создании живого эквивалента кожи.

Включение ФБ в трехмерный коллагеновый гель представляет собой проблему из-за быстрой контракции гелж клетками. Использование ФБ, выращенных на

поверхности МН, позволяет избежать проблем с контракцией. Оптимальные сроки для использования коллагевового геля в качестве эквивалента соединительной ткани в клинике составляет 3 - 4 суток после заключения в гель ФБ на МН. В это время только начинается контракция, что не препятствует манипуляциям с гелем.

Длительное наблюдение за судьбой трансплшгтнрованных МН с клетками показало, что присутствие коллагеновых МН не усиливает воспалительную реакцию в тканях. Примерно через 30-45 суток, в зависимости от места трансплантации, свободные от клеток МН выталкиваются из эпидермиса стратифицирующимся эпидермисом. В ряде случаев МН могут оставаться в дерме более 90 суток, уменьшаясь в размерах, вероятно под влиянием тканевых протеаз.

Таким образом, культивирование ФБ и ЭКЦ, на поверхности МН с их последующей трансплантацией в составе ко.тдагенового геля, является эффективной и доступной технологией. Использование данного подхода позволяет решать различные технологические проблемы: культивирование, кратковременное или долговременное хранение, аппаратурное оформление процесса, трансплантация.

Применение выращенных аллогенных зпидермальпых пластов для реконструкции кожных покровов

Трансплантация культивированных кератиноцитов (ЭКЦ) позволяет закрывать фактически любые площади ожогов, что особенно важно при лечении критических и Сверхкритических ожогов (более 40% поверхности тела). Выращенные in vitro аллогенные эпителиальные пласты были признаны вполне пригодными для закрытия ожогов, поскольку ЭКЦ в культуре не экспрессируют IILA-DR антигены(НеЙоп et al.,1984).

Сейчас очевидно, что трансплантированные пласты ЭКЦ способны не только замещать кожу, но и модифицировать раневую поверхность, стимулируя собственную эггителизацию ран. Экспериментальный и клинический материал, полученный в ходе совместных исследований с Ожоговым центром НИИ скорой помощи им. П.В.Склифосовского (г.Москва) и кафедрой термических поражений Военно-медицинской академии (г. С .Петербург) позволил нам сформировать собственный опыт и сделать выводы об эффективности применения выращенных пластов аллогенных ЭКЦ.

Шестьдесят выращенных трансплантатов была использованы при закрытии ожоговых ран 48 пациентам. Трансплантации проводились Б сроки от двух недель до трех месяцев после травмы на поверхности ожогов Ша-IY степени и донорские раны.

Тридцать трансплантаций было проведено 22 пациентам НИИ скорой помощи. Одному пациенту трансплантация на раневую поверхность была проведена дважды. В четырех случаях трансплантации проводились в две стадии.

В клинике Военно-медицинской академии трансплантации аллогенных эпндермальных пластов были проведены двадцати трем пациентам. Двум пациентам трансплантации были проведены в три стадии и трем пациентам в две.

Целью применения аллогеппых эпидермальиых пластов при ожогах Ша степени являлось улучшение результатов лечения. Действительно заживление ран у таких пациентов наблюдалось в среднем на 7 дней раньше, чем у пациентов лечившихся с применением традиционных технологий.

Максимальная площадь трансплантированного пласта в клинике НИИ скорой помощи составила 450 см3,а в клинике Военно-медицинской академии 1500 см1.

Применение аллогенных эпидермальных пластов оказалось эффективным не только при лечении донорских ран, но и при закрытии поверхностных и глубоких ожогов.

В ряде случаев такие трансплантации способны заменить рутинные трансплантации аутологичной кожи. В таблице 1 приведены данные о полном или частичном закрытии раневых поверхностей трансплантаций аллогенных пластов ЭКЦ.

В клинике НИИ скорой помощи у 22 пациентов с глубоким или/и поверхностными ожогами достичь полного восстановления кожного покрова удалось в 32% случаев.

Табл. 1. Восстановление кожного покрова трансплантацией аллогенных

выращенных эпидермадьных пластов

НИИ скорой помощи Военно-медицинская академия Всего

Полное восстановление 7(32%) 2 (33,3%) 9(32.1%)

Частичное восстановление 7(32%) 2 (33,3%) 9(32,1%)

Отсутствие восставовл ении 8(36%) 2 (33,3%) 10(35%)

Всего 22 6 28

Интересно отметить, что у двух пациентов восстановление кожных покровов произошло за счет мощной краевой эпители задай при лизисе трансплантированных платов ЭКЦ ко времени первой перевязки. Максимальная площадь восстановленных кожных покровов составила 300 см2, что соответствует примерно 4% ожоговой поверхности. Частичное восстановление кожного покрова наблюдалось в 7 случаях, при этом у одного из пациентов частичному восстановлению кожного покрова предшествовал лизис эпндермального пласта. В 8 случаях восстановления кожного покрова добиться не удалось.

Обращает на себя внимание сходство результатов, полученных независимо в двух указанных ожоговых центрах, различающихся традициями и методами лечения обожженных.

Полученные результаты убедительно доказывают возможность применения аллогенных выращенных пластов ЭКЦ в качестве средства восстановления кожных покровов у обожженных с ограниченными глубокими поражениями. Кроме ограниченных глубоких, поверхностных и смешанных ожогах их применение показано при язвах различной этиологии, синдроме Лаэлла, буллезном эпидермолизе, донорских ранах и других дефектах (Philllips and Gilchrest ,1992).

Важно отметить, что аллогенные эпидермальные пласты временно замешают кожные покровы и, модифицируя раневую поверхность, вызывают мощную собственную эпителиэацию.

Трансплантация аллогенных пластов ЭКЦ приводит не к постоянному, ио к долговременному приживлению. Было показано, что аллогенные клетки могут сохраняться на раневой поверхности до 35 дней (Zhao et al.,1992). Наши данные подтверждают возможность длительного сохранения трансплантата. В ряде случаев аллогенные ЭКЦ сохранялись на раневой поверхности до 60 суток.

Быстрое закрытие ожоговых ран значительно улучшает лечение термических поражений, но такие возможности обычно ограничены наличием ресурсов кожи или сроками подготовки аутологнчных кератиноцитов. Нами обосновано клиническое применение выращенных аллогенных эпидермальных пластов в качестве средства временного закрытия ожоговых ран, стимулятора раневого заживления при поверхностных и ограниченных глубоких ожогах, донорских ранах.

Иммуногвстохкмяческое исследование механизмов репарации рай под влиянием аллогенных эпидермальных трансплантатов.

Для исследования был отобран материал, представленный интраоперациониымн биопенями, взятыми от больных с длительно незаживающими (ДНР) и нормально заживающими ранами, находившихся на лечении в ГКБ №29 г, Москвы, ГВКГ МО РФ им. И.Н.Бурденко, клинике кафедры военно-полевой хирургии ГИУВ МО РФ, НИИ

Скорой помощи им, Н.В.Склпфосовского. Всего было исследовано 104 биоптата от 29 пациентов, разделенных на основную я контрольную группы, в том числе 89 биоптатов от 25 пациентов с ДНР, составляющих основную группу, и 15 биоптагов от 4 пациентов с нормальным заживлением ран, входящих в контрольную группу,

Биопсийиый материал у больных основной группы получали из различных участков раневой поверхности (центр и край раны) до начала лечения, а также на 5-е, 10-е, 15-е сутки после трансплантации от больных, у которых наблюдалась положительная динамика в состоянии раны на фоне проводимого лечения. По клиническим дашгым выраженный положительный эффект наблюдался у 62,8% (19,7% - полная реэпитсянзация раны, 43,1% ■- значительное, более чем на 80%, уменьшение плошади раневой поверхности), незначительная положительная динамика - у 27,4% больных, отсутствие эффекта - 9,8%. Выбор больных с позитивной реакцией на проводимое лечение был обусловлен необходимостью изучения возможных путей инициации репаративных процессов у больных с ДНР.

Для закрытия раневого дефекта на предварительно подготовленную раневую поверхность трансплантировали аллогенный (донорский) выращенный эпидермальный пласт. При необходимости, через 7 - 10 дней, производились повторные трансплантации аллогенного пласта ЭКЦ на раневой дефект,

В качестве контроля использовались биоптаты нормально заживающих послеоперационных кожных ран. Биопсии получали в соответствующие сроки: острая операционная рапа, а также на 5-е, 10-е и 15-е сутки. Основу контрольной группы составили биоптаты, подученные из области раневых дефектов кожного покрова, возникших в месте взятия аугодермотрансплантата у больных без тяжелых соматических расстройств.

При гистологическом исследовании биоптатов, полученных от больных с ДНР различного генеза до начала лечения, во вссх случаях была выявлена типичная морфологическая картина длительно незаживающей раны - незрелая грануляционная ткань и воспалительный инфильтрат, содержащий, в основном, клетки моноцитарно/макрофагального рада. В некоторых биоптатах выявлялись отдельные участки разрастания соединительной тканн и очаги некрозов. При иммуногистохимнческом исследовании в воспалительном инфильтрате выявлено преобладание CD68+ клеток, количество лимфоцитов было незначительным, в некоторых случаях СЕМ4" и CDS4, клетки не выявлялись,

В области раневого дефекта и прилегающих областях найдено незначительное количество фибробластов, экспрессирующих aSMA (т.е. имеющих фенотип миофибробластов). В ДНР поверхностные клеточные рецепторы к коллагену (VLA-2) и ламинину (VLA-б) экспрессироваяись в незначительном количестве на поверхности некоторых фнбробластов, входящих в состав незрелой грануляционной ткапи, что может рассматриваться, как нарушение клеточно-матриксных взаимодействий Единичные фнбробласты демонстрировали слабоположительную реакцию при исследовании с антителами против с-МЕТ - клеточного рецептора к HGF.

При анализе состава внеклеточного матрикса в длительно незаживающих ранах до начала лечения были обнаружены выраженные изменения в соотношении его компонентов: отмечалось снижение содержания коллагена Ш типа, распределение значительного количества тенасцака во всех слоях раны, при этом экспрессия коллагена I типа существенно не изменялась. Ламинин до трансплантации диффуэно распределялся в грануляционной ткани, кроме того, отмечалось его накопление в стенках кровеносных сосудов,

Фибронектин (плазменная форма) определялся в значительных количествах, при этом отмечалось его неравномерное распределение в строме в области раневого дефекта, выражавшееся в снижение его содержания в пернваскулярной зоне, где выявлялись скопления клеток воспалительного инфильтрата. Экспрессия клеточно-ассоциированкой формы фибронекшна и мерозина в ране до трансплантации практически отсутствовала.

Í^-V

Ш

Рис. 15. ДПР: незрелая грануляционная ткань и воспалительный инфильтрат. Полутонкий срез. Окраска метиленоеый синий - азур И и основной фуксин, хЮО

Рис.16. CD68+ клетки

(моноциты/макрофаги) в ДНР. Иммунопероксидазный метод. х200

При нммуногистохнмическом исследовании было выявлено практически полное отсутствие экспрессии TGF-fi в длительно незаживающих ранах; bFGF слабо экспрессировался в стенках кровеносных сосудов, локализованных в крае раны.

При исследовании провоспалителькых цитокинов в ДНР было выявлено повышение накопления IL-l(i. Степень интенсивности иммунопероксидазного окрашивания МПМ(5, основным источником которого являлись кератинотпы, расположенные в базальных слоях прилегающего к ране эпителия, была несколько выше, чем интенсивность реакции с антителами к М1Р-]а. Слабоположительную реакцию с антителами к МПЧа демонстрировали моноциты/макрофаги и отдельные фибробласты, локализованные в области раневого дефекта.

Экспрессия ММР-9 отмечалась в клетках воспалительного инфильтрата, локализованных в зоне раневого дефекта и, менее выражено, в кератиноцитах, расположенных в зоне краевой элителизавди. При выявлении TIMP-1 и ТШР-2 в ДНР реакция была слабоположнтельной или отсутствовала.

В острой операционной ране, использовавшейся в качестве контроля, при микроскопическом исследовании отмечалось полнокровие кровеносных сосудов, явления стаза в капиллярах, незначительное количество ПЯЛ в пернваскулярной зоне. Прн нммуногистохнмическом исследовании были выявлены единичные CD68+ клетки, локализовавшиеся диффузно во всех слоях дермы. Положительная реакция с антителами к aSMA обнаруживалась в стенках кровеносных сосудов (гладкомышечные клетки), миофибробласты в дерме не выявлялись. В острой кожной ране была выявлена экспрессия VLA-2 и VLA-6 на поверхности дермальных фибробластов и кератиноцитов, расположенных в базальных и супрабазальных слоях эпидермиса, в которых также отмечалась экспрессия с-МЕТ. Кроме того, в эпидермисе отмечалась выраженная экспрессия СК5/18 и 10/13 типов в базальных и супрабазальных слоях соответственно, что является нормальной локализацией данных внутриклеточных филаментов. Также в базальных слоях выявлялись отдельные Ki-67+ клетки.

При анализе компонентов В КМ отмечалась положительная реакция при выявлении коллагенов I и III типов, равномерно распределенных во всех слоях дермы. Тенасцин в минимальных количествах определялся в субэпителиальных слоях дермы вдоль базальной мембраны. Ламннин выявлялся в стенках кровеносных сосудов и в эпителиальной базальной мембране, которая также включала в себя коллагены IV и VII типов. Клеточно-ассоцинрованная форма фибронектина в незначительных количествах

экснресснровалась в базальных и супрабазальных слоях эпителия и на поверхности дермальных фибробластов.

В острой операционной ране отмечалась слабоположнтельная реакция с антителами против М1Р-1«; экспрессия МПЧр практически отсутствовала. Экспрессия ММР-9 и Т1МР-1/2 в биоптатах контрольной группы была примерпо равной, что демонстрировалось выявлением позитивной реакции умеренной степени выраженности.

Анализируя полученные результаты, можно сказать, что все изученные случаи ДНР характеризуются значительными нарушениями со стороны внеклеточного мзтрикса с выраженным дисбалансом в соотношениях составляющих его компонентов.

Снижение содержания коллагена Ш типа было выявлено во всех изученных биоптатах, при этом количество коллагена I типа оставалось неизменным также во всех случаях, В нормальной дерме на коллаген Ш типа приходится приблизительно 15% от общего числа коллагеновых волокон, основной его функцией является обеспечение механической прочности и эластичности дермы. Кроме того, взаимодействуя с интегриновыми рецепторами, коллагеновые волокна могут влиять на функциональную активность клеточного микроокружения, и, в первую очередь, на синтетическую активность дермальных фибробластов, приводя к изменению спектра синтезируемых ими компонентов внеклеточного матрикса. Обладая меньшей, чем коллаген I типа, устойчивостью к действию протеолитических ферментов, коллаген Ш типа быстрее деградирует при развития ДНР что, в сочетании со сниженной синтетической функцией фибробластов, обусловливает характерный для ДНР дисбаланс компонентов ВКМ.

Изменения структуры ВКМ в ДНР также проявляются накоплением в сгроме тенаспина н плазменного фпброиектина, изменением локализации ламинина. Ламипив, в больших количествах выявлялся в стенках кровеносных сосудов и диффузно откладывался в матрнксе незрелой грануляционной ткани раны и в прилегающей дерме.

Тенасцин, глккопротеид ВКМ, выявляющийся преимущественно в эмбриональной ткани, а так же в ограниченных количествах входящий в состав неизмененной кожи, в значительных количествах обнаруживался в области раны. Интенсивное накопление тенасцина, который проявляя актиадгезивные свойства, в норме способствует миграции клеток и обеспечивает неоангиогенез и формирование грануляционной тканн, в случае развития ДНР препятствует нормальным клеточно-матрикспым взаимодействиям, что также свидетельствует о неполноценности формируемой соединительной ткани.

Одной из возможных причин нарушения синтетической функции фибробластов, приводящей к формированию в ДНР незрелой соединительной ткани, является изменение спектра экспрессируемых цитокинов и факторов роста. В проведенном исследовании было выявлено практически полное отсутствие положительного иммунопероксидазного окрашивания с антителами к ТОР-Р, одному из основных факторов роста; также в большинстве случаев наблюдалось выраженное снижение экспрессии ЪРОР. Известно, что ЬРСР, являясь хемоаттракгантом для фибробластов, также способен регулировать проляферативпую активность, синтез компонентов ВКМ, трансформацию в мнофкбробласты. Не менее важным для формирования полноценной соединительной ткани является присутствие ТОР-р]; помимо активации синтеза компонентов ВКМ, ТСИ-р! нншбирует продукцию протеолитических ферментов, активирует синтез ингибиторов протеаз.

Стедует отметить, что наблюдаемое снижение интенсивности иммунопероксидазного окрашивания с антителами к факторам роста может быть обусловлено не только угнетением их синтеза, но также и повышенной их утилизацией.

Кроме дефицита факторов роста в ДНР было обнаружено повышение интенсивности иммунонероксидазной реакции при выявлении провоспалительных цитокинов-11,-1(5 и М1Р-1р.

MIP-la н MIP-ф - цнтокины, являющиеся хемоаттрактантами для мононуклеарных лейкоцитов. Известно, что MIP-la оказывает более выраженное влияние на миграцию мононуклеарных фагоцитов в очаг воспаления, чем MIP-ip. В некоторых случаях MIP-la и MIP-1P могут проявлять противоположное действие, т.е. угнетать миграцию моноцитов/макрофагов. В проведенном исследовании было выявлено повышение экспрессии MIP-1P в ДНР, при этом экспрессия М1Р-1а в большинстве случаев была вьфажена слабо, что, вероятно, свидетельствует о рассогласовании систем, ответственных за регуляцию миграции клеток воспалительного инфильтрата в очаге повреждения.

Все случая ДНР характеризовались повышенной интенсивностью иммунопероксилазной реакции с антителами к IL-lp - провоспалптельному интокину, который синтезируется большинством клеток организма. Возможно, с увеличением экспрессии IL-1 р, в сочетании с изменением профиля синтеза друшх цитокннов и факторов роста, связано повышение содержания в В КМ ламинина и плазменной формы фибронектина, а также аккумуляция тенасцина при развитии ДНР, однако .данное предположение требует подтверждения.

Неполноценность формируемого в области раны внеклеточного матрикса так же связана с повышенной концентрацией протеиназ и снижением синтеза их ингибиторов, что в итоге обусловливает дисбаланс в процессе реорганизации внеклеточного матрикса со смешением в сторону повышенной утилизации компонентов ВКМ. В нашем .исследовании мы наблюдал» повышение экспрессии ММР-9 в сочетании со снижением выявления TIMP-1 и Т1МР-2.

Некоторыми исследователями была продемонстрирована возможность ММР-9 (желатиназы V типа) принимать участие в утилизации интерстицнальных коллагенов, однако основным субстратом для ММР-9 является коллаген IV типа, входящий в состав базальных мембран. Высокий уровень содержания ММР-9, в сочетании с дефицитом ингибиторов протеаз (ПМР-)/ПМР-2) возможно является причиной замедления ялн отсутствия реэпителизации ДНР, что обусловлено повышенной деградацией одного из основных компонентов баззльной мембраны.

Кроме того, высокая активность в ДНР протеолитическнх ферментов, и в первую очередь сернновых и магриксных металлопротеинаэ в сочетании с недостатком их ингибиторов, может являться причиной повышенной утилизации различных цнтокинов к факторов роста, тем самым обусловливая их дефицит и в сочетании с другими факторами, приводя к развитию длительно протекающего, функционирующего по принципу «порочного крута», патологического процесса.

Типичное для ДНР хроническое воспаление в изученных нами случаях также имело свои характерные особенности: воспалительный инфильтрат в подавляющем большинстве случаев состоял из клеток моноцитарно/махрофагального ряда (CD68+ клетки), и только в некоторых случаях в составе инфильтрата определялись CD4 и CDS - положительные лимфоциты (Т-хелперы и Т-супрессоры соответственно). Преобладание в воспалительном инфильтрате моноцнтов/макрофагов возможно связано с описанными выше нарушениями в системе хемоаттрактантных белков (MIP-la / MIP-1P). Кроме того, мононухлеарные фагошггы являются одним из основных источников про воспалительных цнтокинов и некоторых протеолитических ферментов, поэтому их постоянная повышенная активность в зоне повреждения также может являться причиной замедления репаративных процессов в ране.

Практически все исследованные нами случаи возникновения ДНР характеризовались небольшим количеством мнофибробластов в области раны. Как известно, в норме миофибробласты, отличительной чертой которых является синтез большого количества aSMA что делает их сходными с гладкомышечиыми клетками, ответственны за контракцию раны и принимают активное участие в регуляции заживления кожкых ран. Кроме того, Gabbiani G. с соавт.,2001, продемонстрировал прямую зависимость между количеством мнофибробластов в ране и развитием рубца на месте раневого дефекта, что указывает на возможное участие мнофибробластов в

регуляции синтеза компонентов В КМ. Обнаруженное в наших исследованиях уменьшение количества миофибробластов и связанное с этим отсутствие контракции также является одной из особенностей длительно незаживающих ран.

Следует отметить, что описанные выше изменения выявлялись во всех изученных случаях ДНР, включавших в себя как трофические язвы, развившиеся из фоне варикозной болезни вен нижних конечностей, так и раны, развившиеся в результате термического, либо химического поражения кожных покровов, травматического воздействия и под влиянием инфекционных агентов. Представляет интерес тот факт, что значимых различий в структуре В КМ, соотношениях клеток воспалительного инфильтрата, уровнях интенсивности иммунопероксидазного окрашивания при выявлении факторов роста, питокинов, компонентов системы матриксных прогеиназ и их ингибиторов выявлено не было, несмотря на существенные различия этиологических факторов, приводивших к развитию ДНР,

Для изучения механизмов репарации ДНР было проведено гистологическое и иммунотистохимическое исследование биоптатов, полученных от больных с длнтельпо незаживающими ранами, закрытыми выращенными аллогеннымн кератиноцитымн.

Полученные результаты свидетельствуют о значительных изменениях, происходящих в ходе раневого процесса после закрытия раны. Использование аллогенного выращенного эпидермиса активизирует процессы ремоделировакия ВКМ в ране - на 5-е сутки после трансплантации при иммуногистохимическом исследовании было обнаружено увеличение содержания коллагена Ш типа в сочетании со снижением накопления тенаслина в области раны. Кроме того, наблюдалось перераспределение ламинина, который входил в состав формирующейся в зоне контакта с ЕП провизиональной базальной мембраны, а также положительная иммукопреоксидазная реакция в стенках кровеносных сосудов при выявлении мерозина (Ламинин-2). Появление в сосудистой стенке мерозина является маркером созревания кровеносных сосудов, и, как правило, сочетается с повышением экспрессии ангиогенного фактора роста (УБвР) и увеличением синтеза протеаз, участвующих в процессах неоангиогенеза.

К 15-м суткам после трансплантации соотношение компонентов ВКМ в ДНР было близким к норме, тенасцин обнаруживался в субэпителиальной зоне, что было обусловлено участием в процессах миграции кератиноцитов. Ламияин выявлялся в составе эпителиальной базальной мембраны, которая также включала коллагены IV н УП типов, что соответствует норме.

Табл.2 . Распределение компонентов внеклеточного матрикса, миофибробластов п моноцитов/макрофагов в длительно незаживающих ранах до начала лечения и на 5-е, 10-е и 15-е сутки после трансплантации аллогенного эпидермиса._

Иммуно- гисто химические маркеры В ране до тралепл. 5-е сутки после транспл. 10-е сутки после транспл. 15-е сутки после транспл.

Коллаген I типа ++ ++ ++ ++

Коллаген Ш типа -/+ + ++ ++

Ламивин ++ ++ + +

Тенасцин +++ ++ + -/+

СБ68+ клетки +++ ++ -н- +

аБМА4 клетки + + + +

Критерии оценки: « - > - реакция отсутствует, « -/+*>- слабоположительная реакция, « + »,«++»,«■ +++ м - степени выраженности положительной реакции.

Параллельно с восстановлением базальной мембраны начинается процесс реэпите лизании раны собственными кератнноцитами, имеющими нормальный

фенотип. О высокой активности процессов пролиферации можно судить по повышенному уровню экспрессии КН>7 в базальных слоях эпидермиса реципиента, располагающегося под остатками частично лизированного трансплантата. После трансплантации выращенных аллогенных ЭКЦ на рану значительные изменения наблюдались в синтезе цитокинов и факторов роста. К 5-м суткам после трансплантации отмечалось увеличение интенсивности пммунопероксилазной реакции при выявлении всех исследуемых факторов роста, что по времени совпало с началом процесса активного ремоделирования ВКМ и формирования базальной мембраны. К 10-м - 15-м суткам отмечалось снижение выраженности реакции с антителами к ТСГ-р]. Интенсивность реакции с антителами к ЬРОБ оставалась при этом несколько повышенной. Параллельно с увеличением продукции факторов роста отмечалось снижение содержания провоспалительных цитокинов, интенсивность иммунопероксндааного окрашивания которых к 10-м суткам соответствовала выраженности реакции в контрольных нормально заживающих кожных ранах.

Рис. 17, Увеличение содержания коллагена Ш типа в ране на 5-е сутки после трансплантации.

Иммунопероксидазный метод, хЮО

Рис,18. Накопление ламинина и формирование провизкональной базальной

контакта

мембраны в зоне трансплантатом. 5-е сутки. Нммумопероксидазный метод. х400 Повышенная интенсивность окрашивания с антителами к ММР-9, наблюдавшаяся в ДНР, после трансплантации БП постепенно уменьшалась, нормализовавшись к 10-м суткам. Одновременно в области раны повышалось содержание ПМР-1 и ТІМР-2, достигнувшее нормы также к 10-м суткам. Изменение соотношения ММР-9 и ингибиторов металлопротеиказ по времени совпало с формированием полноценной базальной мембраны н реэпителнзациеЙ раны, что подтверждает наличие прямой зависимости между протеази ой активностью в длительно незаживающих ранах и темпами восстановления базальной мембраны и резпигелизацией раневого дефекта.

Экспрессия (аїрі - ннтегрипов) н \ЪА-6 (афі - интегрннов),

являющихся рецепторами к коллагену и ламиннну, на поверхности кераггяноцитов и фнбробластов, так же свидетельствует о восстановлении нормальных стромально-эпителиальных взаимодействий после трансплантации выращенных кератиноцитов. Количество миофибробластов в ране после трансплантации ЭКЦ не увеличилось по сравнению с ДНР до лечения и оставалось неизменным в течение всего периода заживления ран, что говорит об отсутствии контракции раневого дефекта. При этом во всех случаях заживление происходило без формирования рубца, что является отличительной особенностью репаративных процессов в ранах при применении ЭКЦ.

Кроме того, наблюдаемое отсутствие формирования рубцовой ткани на месте заживающей ДНР в сочетании с небольшим количеством раневых миофибробластов, подтверждает предположение об их влиянии на развитие рубца.

Табл.3 . Экспрессия факторов роста, провоспалительных цитокинов, ММР-9 и Т1МР-1/Т1МР-2 в длительно незаживающих, ранах до начала лечения и на 5-е, 10-е и ] 5-е сутки после трансплантации аллогенного эпидермиса.

Иммуногистохимические Маркеры В ране до транспл. 5-е сутки после транспл. 10-е сутки после транспл. 15-е сутки после транспл.

ВРйР -/+ ++ ++ ++

ТОР-Р - ++ + /-Н- +

+++ ++ + +

М1Р-1и -/+ + + -/+

М1Р-1Р ++ + + -/+

ММР-9 -н- + + +

Т1МР-1 -1+ + +

"ПМР-2 -/+ + +

Критерии оценки: «-я-реакция отсутствует, «-/+»- сдабопалажитеяьная реакция, « + л», * ++ », « +++ л - степени выраженности положительной реакции.

Трансплантированные кератинощгты, сохраняющие жизнеспособность в течение первых, нескольких дней и являющиеся источником протеиназ и их ингибиторов, большого числа факторов роста, а также коллагена IV типа, необходимого для формирования полноценной эпителиальной базальной мембраны. Более того, в зоне контакта трансплантата с подлежащей незрелой грануляционной тканью создаются условия для формирования базальной мембраны.

и>-*» V/.г- €:

зге*-

. * "

-г ^ . * -

• . V" £

Рис.20. Пролиферация кератиноцитов (К.а-67* клетки) в базальных слоях эпидермиса. 10-е сутки.

Иммунопероксидазный метод. х400

Рис.19. Пролиферация кератиноцитов под остатками лизированного трансплантата. 10-е сутки.

Полутонкий срез. Окраска метиленовый синий ~ агур 11 и основной фуксин. хЮО

Аддогенные кератиноциты трансплантата экспрессируют на клеточной мембране рецепторы к различным компонентам В КМ, в т.ч. ламинииу (а,,рг ннтегрины), что обеспечивает создание в месте трансплантации зоны контакта с подлежащим раневым магриксом, вдоль которой начинает формироваться провизкональная базальиая мембрана. В дальнейшем под трансплантатом вдоль провизиональной базальной мембраны, постепенно приобретающей черты нормальной эпителиальной БМ, начинается миграция собственных кератиноцитов, обеспечивающих реэпитеяизацню раневого дефекта.

Проведенное исследование продемонстрировало выраженные изменения межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, характеризующих возникновение и существование длительно незаживающих ран. Отклонения в ходе нормальной воспалительно-репаративной реакции обусловлены многими факторами: воспалительный инфильтрат в ДНР представлен преимущественно клетками моиоцитарно/макрофагального ряда в сочетании с повышенной экспрессией в области раны провоспалительвых цитокинов 1Ь-1(5, М1Р-1о/М1Р-1р и нарушением их нормального соотношения. Длительно незаживающие раны характеризуются повышенной гротеиназцой активностью, в т.ч. увеличением экспрессии ММР-9, и недостаточностью продукции ингибиторов матриксных металло про теин аз (Т1МР-1 и ТТМР-2), что приводит х дисбалансу в процессе ремоделирования В КМ со смещением в сторону повышенной утилизации его компонентов в сочетании с угнетением продукции ТСР- ¡31 и ЪРОР - факторов роста, ответственных за продукцию компонентов ВКМ.

Характерные изменения выявлены также в структуре ВКМ: снижение содержания коллагена Ш типа, при сохранении нормального количества коллагена I типа, изменение локализации ламннина, диффузно накапливающегося в строме, повышение включения в ВКМ фибронектива, аккумуляция тенасцина - матриксного гликопрогеиаа, характеризующего незрелость формируемой соединительной ткани. Было обнаружено, что отличительной чертой всех ДНР является минимальное количество миофибробластов в области раневого дефекта, что обусловливает отсутствие контракции и, как следствие, препятствует заживлению раны.

Исследование ДНР после закрытия аллогенными выращенными эпидермальными клетками в различные сроки после начала лечения, и сопоставление полученных данных с результатами исследования нормально заживающих ран в аналогичные периоды времени наглядно продемонстрировало различия в ходе репаративных процессов.

Большой интерес представляют выявленные особенности ремоделирования ВКМ в ДНР после трансплантации: восстановление содержания коллагена Ш типа, снижение аккумуляции тенасцина, перераспределение лашшкна н формирование провизиональной базальной мембраны свидетельствует о выраженном положительном влиянии аллогенных ЭКЦ на активизацию и регуляцию репаративных процессов в ДНР.

Особенностью репарации ДНР можно также считать наличие хронического воспаления, характеризующегося преобладанием в воспалительном инфильтрате клеток моноцнтарноД<акрофагального ряда и сохраняющегося на протяжении всего срока заживления. Еще одной особенностью заживления ДНР является минимальное количество миофнбробластов в области раневого дефекта, как до начала лечения, так н в ходе репарации. С одной стороны, дефицит миофнбробластов обусловливает отсутствие контракции, характерной для нормально заживающих ран, а с другой -способствует репарации без формирования трубой рубцовой ткани на месте раневого дефекта.

Проведенное исследование продемонстрировало основные особенности, характеризующие длительно незаживающие раны и специфику репаративных процессов в них. Клинически на 15-е сутки у большинства пациентов отмечалось активное заживление раны без формирования рубца, в некоторых случаях происходила полная реэпнтелизация раневого дефекта.

Таким образом, подтверждена целесообразность применения выращенных эпндермальных клеток для лечения ДНР.

Морфологическое изучение репарации ожогового дефекта роговицы после трансплантатів стромільного эквивалента

В двух сериях экспериментов морфологическое исследование ожогового дефекта роговицы в опытной и контрольной группе проводили на 7, 14, 22, 30 сутки после проведения трансплантации.

По данным гистологического изучения на 7 сутки после трансплантации в опытной группе под влиянием трансплантата отмечаются начальные явления эпнтелнэашш с краев раны, пролиферация эпителиальных клеток на участках, граничащих с зоной некроза, ускорение резорбции некротизированных тканевых элементов и активация фибробластических элементов по сравнению с контрольной группой. Однако явления воспалительной реакции и неоваскуляризацип в опыте были выражены больше, чем в конт

Рис.21. 7-е сутки после трансплантации. Край раны. Начало эпителизации на фоне выраженной васкуляризации. Сосуды полнокровны. Периваскулярная

инфильтрация (стрелки). Полутонкий срез. Метнленовый синий + азур II, основной фуксин. Х200

Рис.22. 14-е сутки после трансплантации. Эпителизация по поверхности коллагенового геля (КГ)- Васкуляризацня и моноритарная инфильтрация преимущественно в зоне, прилегающей к гелю (стрелки). Полутонкий срез. Метиленовий синий + азур П, основной фуксин, XI00

К четырнадцатому дню после трансплантант отмечается существенная разница в морфологической картине в опытной к контрольной группе. В опыте происходит активная миграция эпителия из сохранных участков роговицы по поверхности коллагенового геля, активная пролиферация эпителиальных клеток, формирование базальной мембраны. С другой стороны, идет усиление пролиферативной активности Фб, замещающих по кодлагеновому каркасу утраченные стромальные клетки, пораженной стромы неостромой. Отмечается также некоторое подавление васкуляризации. В контроле в эти сроки происходит дальнейшее прогрессировать некротических изменений в сочетании с усилением неоваскуляризации. Степень воспалительной реакции приблизительно одинакова в опыте и в контроле с признаками острого воспаления в контроле.

Морфологическое изучение показывает, что на 22 сутки после трансплантации в опытной группе продолжается замещение коллагенового геля неостромой и активная эпителизация по поверхности вновь образованной стромы. Отмечаются небольшое количество мелких сосудов и единичные скопления мононуклеарных лейкоцитов. По результатам морфологического изучения выявлено, что на 30 сутки после трансплантации в опыте завершается формирование эпителия и боуменовой мембраны, происходит дальнейшее заживление стромального дефекта. Обращает внимание уменьшение воспалительной реакции по сравнению с контролем, где прогрессируют процессы распада, нарушена адгезия вновь образованного эпителия, нарушено формирование базальной мембраны.

Рис.23. 22-е сутки после трансплантация. Элителнзация по поверхности коллагенового геля (КГ). Пролиферация эпителия (Э). Уменьшение

воспалительной реакции. Кровеносные сосуды немногочисленны (стрелки). Полутонкий срез, Метиленовый синий + азур П, основной фуксин. Х100

Рис.24. 22-е сутки после ожога. Контроль, Грануляционная ткань в очаге повреждения. Выраженная

инфильтрация. В глубжележащих слоях стромы формирование грубоволокнистой соединительной ткани. Полутонкий срез. Метиленовий синий + азур И, основной фуксин, XI00

, Полученные данные морфологического изучения ожоговой раны роговицы позволяют заключить, что трансплантация культивированных ФБ в коллагеновом геле (стромальный эквивалент) вызывает короткую по времени, но более выраженную, чем в контроле воспалительную реакцию. Связанный с обострением начальной фазы воспаления запуск ряда клеточных событий в конечном итоге приводит к ускорению процессов реларативной регенерации ожоговой раны роговицы. Кроме того, входящий в состав СЭ коллаген 1 типа является хемоагграктантом для макрофагов, но не для нейтрофилов.

Рис.25, 30-е сутки после трансплантации. Формирование

Боуменовой мембраны в целом завершено (БМ). Инфильтрация отсутствует. Пролиферация и утолщение эпителия над остатками коллагенового геля (КГ) в центре ожога. Полутонкий срез. Метиленовый синий + азур II, основной фуксин. XI00

Рис.26. 30-е сутки после ожога. Контроль. В зоне повреждения (ЗП) сохраняется выраженная воспалительная реакция. Эпнтелиэаяия завершена. Полутонкий срез. Метиленовый синий + азур II, основной фуксин. Х100

Как известно, макрофаги играют одну из ключевых ролей в регенерации ран; путем фагоцитоза очищают рану от некротически измененных тканей, а также способствуют миграции клеток различных типов в очаг поражения, нх пролиферации и

дифференциации, в том числе фибробластов. Происходит восстановление нормачьного профиля экспрессии питокинов и факторов роста в области раны, восстановление баланса между процессами синтеза н утилизации компонентов В КМ, результатом которого является ускорение эпителизации, формирование базальной мембраны. С другой стороны, культивированные ФБ, входящий в состав СЭ, в свою очередь стимулируют миграцию и пролиферацию как эпителиальных клеток, так и собственных ФБ роговицы путем экспрессии ФР и цитокинов, секреции компонентов В КМ. Этим объясняется активация эпителизации по поверхности коллеге нового геля, формирование базальной мембраны, адгезия новообразованного эпителия в опытной группе. Быстрое купирование воспалительной реакции и ускорение восстановления структуры роговичной ткани приводит к уменьшению образования сосудов и способствует формированию более нежного, по сравнению с контролем, рубца. В контроле же, длительное сохранение воспалительной реакции, обусловленное притоком нейтрофилов, способствует дальнейшей деструкции роговичной ткани, замедлению процессов эпителизации, активному врастанию новообразованных сосудов, что заканчивается формированием грубого васкулярнзованного рубца.

Иммуногнстохнмнческое шучение регенерации ожогового дефекта роговицы после трансплантация стромального эквивалента.

При нммуногистохимическом исследовании на 7-е сутки после трансплантации в опыте в большинстве случаев выявлялось позитивное окрашивание иммуногястохимическнх маркеров, свидетельствующих в пользу формирования неостромы в областях, прилегающих к трансплантату: при сохраняющемся воспалительном инфильтрате. Отмечалось увеличение количества фибробластов, в том числе активно пролифернрующих, Кьб7 положительных. При этом aSMA* формы фибробластов практически не выявлялись. Во всех слоях ВКМ отмечалось умеренное диффузное накопление плазменной формы фибронектина. В эндотелии сосудов и в периваскулярной зоне на данном этапе заживления наблюдалось усиленное накопление мерознна. Практически во всех наблюдениях к 7-м суткам отмечалось появление нммунопероксндазного окрашивания с антителами к фактору роста TGF-p. Выраженная позитивная реакция выявлялась в фнбробластах и мононуклеарных лейкоцитах инфильтрата. Экспрессия матриксной металлопротеиназы ММР-9 была крайне низкой. Реакция с антителами к ингибиторам металлопротеиназ TIMP-1 и Т1МР-2 к этому сроку проявлялась крайне слабым внутриклеточным окрашиванием клеток инфильтрата и отдельных фибробластов. В воспалительном инфильтрате наблюдалось преобладание CD68* клеток (моноцитов/макрофагов).

В контроле на 7-е сутки в области ожогового дефекта фибробласгы немногочисленны. Положительная иммунопероксидазная реакция с антителами к Ki-67, характеризующими пролифератнвную активность, отмечалась лишь в единичных клетках. Количество aSMA+ миофибробластов несколько выше, чем в опыте. В строме дефекта отмечалось слабое накопление фибронектина, присутствие мерознна характеризовалось слабым диффузным распределением. Количество CD68+ клеток инфильтрата значительно уступало таковому в опыте, CD4* н CD8+ клеток, также выявлено не было.

В отличие от опыта, контроль характеризовался относительно низкой интенсивностью окрашивания к TGF-p, в сочетании с повышением выраженности нммунопероксидазной реакции в области раны с антителами к ММР-9,

При иммуногистохимическом исследовании яа 14-е сутки после трансплантации практически во всех случаях сохранялась выраженная инфильтрация, причем инфильтрат практически полностью состоял из CD68+ клеток. Количество aSMA+ миофибробластов к этому сроку оставалось по-прежнему незначительным.

Рнс.27.Экспрессая Иб7

пролиферирующими фибробластами. Край раны. 7-е сутки после трансплантации. Иммунопгрксидазный метод, х200

Рис.28, Экспрессия ТйРр фибробластами и клетками воспалительного инфильтрата. 7-е сутки после трансплантации. Иммуноперксидазн ы ¡5 метод. х400

Соотношение компонентов ВКМ в формирующейся Боуменовой мембране было практически нормальным, отмечалось формирование полноценной базальной мембраны, вдоль которой происходила аккумуляция ламинина и коллагена IV типа. Очень слабая экспрессия тенасцнна Т отмечалась только в периваскулярной зоне.

Формирование базальной мембраны сопровождалось активной пролиферацией эпителия, постепенно распространяющегося по поверхности трансплантированного геля, выполняющего область дефекта. В базальном слое эпителия определялись К]-67+ клетки. Помимо этого в новообразованном эпителии отмечена положительная реакция с антителами к с-МЕТ, который экспрессировался во всех эпителиальных слоях, В некоторых случаях в строме выявлялись клетки, сходные со стромальвыми фибробластами, которые при этом демонстрировали положительную реакцию с антителами к с-МЕТ и СК10/13 типов.

На 14-е сутки после трансплантации наблюдалось усиление интенсивности иммунопероксидазной реакции с антителами к ТСрИ-р в области заживающей рань) на фоне сохраняющейся воспалительной инфильтрации. Кроме того, отмечалось повышение интенсивности иммунопероксидазной реакции с антителами к Т1МР-2, что, свидетельствует об увеличении уровня экспрессия данного ингибитора как фибробластами так и эпителиальными клетками. Выраженность иммунопероксидазной реакции при выявлении ТТМР-1 не увеличилась. Интенсивность нммунопероксндазного окрашивания ММР-9 не изменилась.

В отлнчие от опытной группы при репарации в контрольных ожоговых ранах к 14-м суткам отмечалось некоторое увеличение числа аБМА* клеток (миофибробластов). Доля клеток воспалительного инфильтрата, экспрессирующих С068, заметно ниже, чем в опыте. Кроме того, контрольная группа характеризовалась более низкими темпами формирования базальной мембраны, меньшим количеством К> 67* клеток, отсутствием экспрессии с-МЕТ и гораздо менее выраженной интенсивностью иммунопероксщшного окрашивания с антителами к Т1МР-2, Уровень экспрессии металлопротеиназы ММР-9 оставался относительно высоким.

К 22-м суткам в опытной группе отмечалась полная реэпителизация раны. Нормально сформированный эпителий экспрессировал свойственные ему типы промежуточных микрофиламентов, демонстрируя резко позитивное окрашивание с антителами к СК10/13 и 5/18. Количество сосудов в Боуменовой мембране уменьшалось, при этом фибробласты, содержащие а5МА, не обнаруживались Также отмечалось снижение количества И67+ клеток в базальных слоях эпителия и пролиферирующих ФБ в подлежащей неостроме.

Рис.29. Аккумуляция коллагена IV типа вдоль базальной мембраны. 14-е сутки после трансплантации. Иммуноперксидазный метод. х400

Рис.30. Отсутствие коллагена VII типа в новообразованной базальной мембране эпителия роговицы. 22-е сутки после трансплантации. Иммуноперксидазный метод. х400

Восстановленная базальиая мембрана положительно окрашивалась при выявлении коллагена IV типа и давала отрицательную реакцию с антителами к коллагену VII тина, свойственному эпидермальной базальной мембране. Ламинии локализовался в базальной мембране и в минимальных количествах в стенках кровеносных сосудов. К этому сроку эксперимента значительно снижалось содержание фибронектина в строме.

На фоне снижения инфильтрации наблюдалось уменьшение количества CD6S* клеток макрофагального ряда, однако среди клеток инфильтрата обнаруживалось появление единичных CD4 мононуклеарных лейкоцитов (Т-лимфоцитов).

Выраженность экспрессии фактора роста TGF-p и TIMP-1/2 значительно снижалась. Реакция на присутствие ММР-9 в опыте к этому сроку давала отрицательный результат. К 22 суткам в контроле сохранялась довольно выраженная инфильтрация, при этом доля CD<58+ макрофагов среди всех клеток инфильтрата оставалась относительно низкой и незначительно увеличивалась по сравнению с контролем на 14-е сутки. CD4+ и CD8+ клетки не выявлялись. Среди формирующейся грубоволокнистой соединительной ткани продолжали обнаруживаться единичные aSMAf мнофибробласты. Также контрольная груша демонстрировала низкий уровень содержания TGF-P, Т1МР-2, относительное снижение экспрессии ММР-9. Ингибитор TIMP-1 не выявлялся.

Результаты нммуногистохимического анализа на 30-е сутки незначительно отличались от таковых на 22-й день эксперимента. В опыте к этому сроку в большинстве случаев происходило завершение процессов пролиферации, что манифестировалось отсутствием Ki-67* клеток. Снижение уровня инфильтрации сопровождалось уменьшением количества CD68+ моноцитов/макрофагов. Содержание компонентов В КМ соответствовало зрелой строме. Присутствие TGFJJ и тканевых ингибиторов металлопротеиназ резко снижено или практически не выявляется. Контроль к 30-м суткам отличается относительно высоким уровнем инфильтрации, количество CD6S* клеток при этом не увеличивалось по сравнению с предыдущим сроком, В ряде случаев выявлялась положительная реакция на ММР-9. Прочие показатели существенно не отличались от таковых в опытной группе.

Полученные результаты иммуногнстохнмического исследования свидетельствуют о значительных изменениях, происходящих в ходе раневого процесса после закрытия раны СЭ.

Непосредственно после альтерации, сопровождающейся разрушением эпителиального покрова, В КМ и эндотелия кровеносных сосудов в области раны запускается процесс репарации, начинающийся со свертывания крови.

Формирующийся кровяной сгусток, стимулирует миграцию клеток в область раневого дефекта. Первые ПЯЛ появляются в ране уже через несколько минут после повреждения, однако их количество становится максимальным через 1-2 дня, после чего постепенно уменьшается, Однако даже па поздних стадиях заживления ран они в незначительных количествах могут входить в состав сохраняющегося воспалительного инфильтрата. Одновременно с формированием сгустка происходит дегрануляция тромбоцитов, приводящая к высвобождению из а-гранул ТСБ-р. ЮТ-р является мощным хемоаттрактантом для моноцитов/макрофагов, которые инфильтрируют зону повреждения и становятся основным источником цитокинов и факторов роста. Вслед за накоплением в воспалительном инфильтрате клеток моноцитарно/махрофагального ряда в зоне повреждения появляются лимфоциты, что в нашем исследовании проявлялось как появление в очаге С04+ Т-лимфоцитов на 22-й день репаративного процесса. Однако при отсутствии выраженной инфицированности раны, роль лимфоцитов не столь важна, как роль моноцитов.

Использование аллогенных фибробластов в составе коллагенового геля активизирует процессы ремоделировання ВКМ в ране. После трансплантации при иммуиогистохимическом исследовании наблюдалось перераспределение ламинина, выполняющего роль адгезивного субстрата для эпителиальных и мезенхимных клеток. Уже на 7-е сутки в опыте он преимущественно локализовался в стенках кровеносных сосудов в форме мерозина (ламинин-2). Появление в сосудистой стенке мерозина является маркером созревания кровеносных сосудов, и, как правило, сочетается с повышением экспрессии ангиогенного фактора роста (УЕСгР) и умеренным синтезом протеаз, участвующих в процессах неоангиогенеза. В контроле на том же сроке эксперимента ламинин почти не выявлялся в стенках кровеносных сосудов и диффузно откладывался в матриксе незрелой грануляционной ткани раны и в прилегающей строме.

Изменения структуры ВКМ в ходе репарации ожогового дефекта также проявлялись накоплением в строме плазменного фнбронектина. Фибронектин является вторым после ламинипа ключевым глнкопротендным компонентом ВКМ. Выраженным было накопление фнбронектина в опытной группе глаз, что в дальнейшем приводило к более ранней, чем в контроле, его аккумуляции в области базальной мембраны.

Описанные изменения в ходе ремоделировання ВКМ, в особенности усиленное накопление фибронектипа и изменение его локализации может быть напрямую связано с трансплантацией ФБ в область раневого дефекта. Кроме того, более ранняя, чем в контроле, инфильтрация зоны повреждения моноцитами/макрофагами приводит к дополнительной продукции ТвР-р, что влечет за собой активацию миграции и пролиферации ФБ, как было наглядно продемонстрировано в опытной группе глаз. Параллельно с активной пролиферацией идет процесс восстановления базальной мембраны а начинается процесс реэдителизацим раны собственными эпителиальными клетками, имеющими нормальный фенотип.

Изменения в эпителиальных клетках на краю раны можно обнаружить уже через несколько часов после ранения - в них наблюдается ретракция внутриклеточных тонофиламентов, разрыв большинства межклеточных дссмосомальных контактов, обеспечивающих механическое соединение клеток. Ослабление межклеточных контактов и контактов клеток с базальной мембраной, формирование периферических цитоплазматических актиновых филаментов, делают возможным движение эпителиальных клеток в сторону поврежденных тканей. Этому также способствует потеря на поверхности эпителиальных клеток интегриновых рецепторов.

Через 1-2 дня после повреждения эпителиальные клетки, расположенные на краю раны, начинают активно пролиферировать и мигрировать. Несомненно, свое влияние оказывают ростовые факторы, содержащиеся в области повреждения, особенно в начале любой неспецифигаеской воспаяительно-рспаратиьной реакции, а также повышенная экспрессия рецепторов к ним.

Замедление репаративных процессов может быть связано с

неполноценностью формируемого в области раны В КМ, что вероятнее всего опосредовано повышенной концентрацией протеиназ и снижением синтеза ингибиторов. Формирующийся в итоге дисбаланс обусловливает повышенную утилизацию компонентов В КМ. В нашем исследовании в группе контрольных глаз мы наблюдали усиление экспрессии ММР-9 в сочетании с крайне низким уровнем ТМР-2 и полным отсутствием TIMP-1. В то же время в опыте ММР-9 выявлялась только на начальном сроке репарации, а к концу исследования нарастал уровень выработки тканевых ингибиторов. Более высокий синтез TGF-ß на протяжении всего исследования в группе опытных глаз и значительное присутствие ПЯЛ на всех сроках в контроле не противоречили выявленной картине соотношения матриксных протеиназ и их ингибиторов. Так вырабатываемые ПЯЛ штокины острой фазы, в первую очередь интерлейкяиы и TNFo оказывают стимулирующее действие на активность металлопротеиназ, TGF-p, напротив, блокирует индуцированный IL-1 и TNF« синтез мегаллопротеиназ и активатора плазминогена. Следует отметить, что основным субстратом ММР-9 является коллаген IV типа, входящий в состав базальных мембран, В нашем эксперименте снижение интенсивности нммуиопероксидазной реакции при выявлении коллагена IV юта, обусловленное повышенной активностью ММР-9, может служить дополнительным объяснением неполноценности формирования БМ (отслойка эпителия) н замедления реэпителнзациц. Косвенным доказательством того, что сформированная БМ является производной эпителия роговицы в нашем исследовании явилась отрицательная реакция с антителами к коллагену VII типа, являющемуся специфическим компонентом эпидермальной БМ и не входящим в состав БМ в других органах. Это является, также подтверждением гистотипического соответствия вновь образующейся структуры

Практически все исследованные нами случаи характеризовались небольшим количеством миофибробластов в области раны, В норме миофибробласты, отличительной чертой которых является синтез aSMA, ответственны за контракцию раны и образование рубца. Миофибробласты в ране после трансплантации коллагенового геля практически не обнаруживались по сравнению с контрольной группой в течение всего периода заживления ран, что говорит об отсутствии контракции раневого дефекта. При этом в большинстве случаев заживление ожоговых ран происходило без формирования грубой рубцовой ткани. Регуляция контракции происходит в основном под воздействием TGF -Pi и ßj, при помощи которых активируется прикрепление фнбробластов к внеклеточному матриксу посредством интегриновых рецепторов и создание связей между отдельными молекулами коллагена. Кроме того, TGF-ßi индуцирует трансформацию фнбробластов в a-SMA-позитивные миофибробласты, а также контролирует экспрессию ßj- и fij- интегриновых рецепторов. Исходя из этого повышенный уровень TGF-ß, выявленный в опытной группе глаз, должен был способствовать более выраженной контракции раны и образованию рубца в опытной группе глаз, а обратная ситуация развиваться в контроле на фоне более низкой экспрессии того же фактора. В связи с этим следует отметить, что TGF-ß -мультифувкциоиальиый фактор способный в зависимости от состояния н компетенции клеток, а также кх микроокружения, стимулировать или ингнбнровать один и тот же процесс. Использование трансплантата можно отнести к необычным факторам микроокружения, способным препятствовать контракции, что, является отличительной особенностью репаративных процессов в раках при применении клеточных трансплантатов.

Эффективность применения клеточных трансплантатов в лечении больных с дефектами роговицы ожоговой этиологии.

Разработанные нами способы были применены в лечении 21 пациента (21 глаз) с ожогами глаз тяжелой и особо тяжелой степени в различные после травмы сроки(НИИ глазных болезней им.Г.Гельмгольца). В 52% случаев (1 ] пациентов) до поступления в

Институт больным проводилось длительное - более 2-х недель -традиционное лечение ожогового поражения глаз или глубоких дефектов роговицы, У 48% пациентов способ применен в 1 -7 сутки после травмы. Свежий ожоговый дефект роговицы имел места в 4-х случаях (19%), свежий ожоговый дефект роговицы и бульварной конъюнктивы - на 6 глазах (28.6%). Трофическая язва роговицы ожоговой этиологии на момент начала лечения выявлена на 9 глазах (42.8%) и в 9.6% язва роговины сопровождалась изъязвлением конъюнктивы и склеры. Вссго произведено 63 трансплантации культуры аллогенных фибробластов в коллагсновом геле (стромальный эквивалент), из них при 10 трансплантациях одновременно проведена пересадка аллогенных ЭКЦ выращенных па внутренней поверхности контактной линзы.

Во всех случаях (100%) получена активизация репаративных процессов, восстановление дефектов стромы и эпителия роговицы. Однако, если при изолированном изъязвлении роговицы и отсутствии рубцовой деформации век (16 пациентов) получеп быстрый и длительный лечебный эффект (закрытие дефекта в течение 2-х недель, отсутствие рецидива), то пря наличии дефектов конъюнктивы лнмбальной зоны (3 случая) и рубцовой деформации век (заворот, трихиаз, лагофталъм) (2 случая) время полного закрытия дефекта роговицы составило более 2-х недель.

Табл.. 3. Частота заживление ожогового дефект! роговицы при использовании но»ого способа печения {%).

I

□ Заживление О Рецидив

9!

Стойкий лечебный эффект при лечении глубоких дефектов роговицы ожоговой этиологии с помощью предлагаемого способа достигнут в 95 % случаев, в 5% случаев (1 пациент) спустя 1месяц после завершения лечения предлагаемым способом произошел рецидив изъязвления. При отсутствии грубого помутнения роговицы перед началом лечения (52% случаев) во всех случаях (100%) в процессе применения способа и в отдаленном периоде роговица сохраняла свою прозрачность, что позволило получить максимально возможную в таких случаях остроту зрения (0.2-0.7), В случаях мутной роговицы на момент начала лечения (48% случаев) восстановления прозрачности роговицы в процессе лечения, как правило, не наступало и острота зрення в отдаленном периоде составила от правильной проекции света (5%), 0.01-0.06 (38%) и до 0.1 (5%). Однако, в единичных случаях, у пациентов молодого возраста, после лечения было достигнуто повышение прозрачности роговицы и остроты зрения травмированного глаза. Анализ результатов ограниченных клинических испытаний показал высокую эффективность нового способа в стимуляции регенерации пораженной роговицы в разные сроки после травмы. Однако, степень эффекта зависела от тяжести поражения и жизнеспособности прилежащей к роговице лнмбальной конъюнктивы, а также от состояния век.

Табл. 4. Острота зрения в отдаленном периоде при использовании нового способа лечения (%),

48

IUI , и , I_и

0.02-0.09 0.1-0,2 0,3-0.7 Острота зрения

Преимуществом метода явилось формирование помутнения роговицы меньшей интенсивности, чем при использовании других способов лечения.

Разработка методов восстановления дефектов гортанв с использованием живого эквивалента кожи.

Цель работы заключалась в комплексной реконструкции гортани, после резекции с восстановлением всех составляющих ее элементов, включая костно-хрящевой остов, эпителиальную, тканевую выстилку, а также функционально достаточный объем органа. Методика операции разработана д.м.н. И.В.Решетовым и реализуется в Московском НИИ онкологии ям. Герцена.

Мы предложили использовать аллогенный живой эквивалент кожн в качестве трансплантата для восстановления гистотипического эпителия гортани. При этом мы руководствовались изученным принципом аллогенной гастотипической стимуляции.

Рис.31. Схема подготовленного аллогенного трансплантата - живой эквивалент кожи ЖИВОЙ ЭКВИВАЛЕНТ КОЖИ

60 40 20

23,4

P.LC.-0.01

Проблемой явилось, то, что восстановлению, в ходе сложной реконструктивной операции подлежала многослойная структура.

В качестве трансплантата нами была специально разработана оригинальная конструкция, состоящая из трехмерного коллагенового геля с постнатальпыми фибробластами, на поверхности которого культивировали ЭКЦ. Для придания необходимой жесткости конструкция была армирована титановой сеткой, применяемой в хирургии в реконструктивных операциях. (Рас.31).

Отдаленные результаты подтверждают эффективность восстановления функциональных и структурных особенностей гортани трансплантацией живого эквивалента кожи. Не менее эффективно использование трансплантата при восстановлении глубоких дефектов кожи, прежде всего ожогов, трофических язв и ран.

Таким образом, в результате проведенных работ получено подтверждение гипотезы об аллогенной стимуляции гистотипического восстановления тканевых дефектов.

Локалнзанн я Кол-во случаев Клинический диагноз Послеонерационны е осложнения Результат восстанем енног о просвета гортани

Гортань 8 Плоскоклеточный рак ТШ0М0 Гортаноглоточный свищ +

Плоскоклеточный рак Т2ШМ0 Гортаноглоточный свищ +

Карцнносаркома Т2К0М0 Гортаноглоточный свищ +

Плоскоклеточный ракТ2Ы0М0 Воспаление послеоперационной раны +

Плоско клеточный рак Т2М0М0 нет +

11лоскоклеточный рак Т2Х1М0 нет +

Рубповый стеноз гортани нет +

Рубцовый стеноз гортани нет +

Гортань+ трахея 1 Рубцовый стеноз гортани нет +

Заключение

Одним из наиболее перспективных и результативных направлений современной биомедицины является тканевая инженерия, С успехами именно этой области связывают сегодня многие надежды в решении важных социальных и медицинских проблем. Так, активно ведутся работы по воссозданию утраченных структур или функций ряда жизненно важных тканей или органов. В рутинную медицинскую практику вошли трансплантация клеток костного мозга, значительные усилия направлены на восстановление функций печени трансплантацией гепатоцитов или созданием систем «искусственная печень» Клеточные трансплантаты и бносинтетические конструкции с клеточными культурами используются сегодня для лечения инфаркта миокарда, восстановления сосудов, мочевого пузыря, лечения инсулин - зависимого диабета и тд.

Восстановление дефектов мягких тканей и, прежде всего, кожи, занимает особо значимое место. Сегодня методы культивирования и трансплантации эпидермальных клеток используются по всему миру. Параллельно с этим продолжаются работы по совершенствованию и развитию технологий выращивания и трансплантации клеток.

Уникальностью кожи как объекта тканевой инженерии является единство структуры и функции этого органа. Именно поэтому для восстановления дефектов кожи необходимы технологии, приводящие к восстановлению гнсшгипических тканевых структур, С этой целью широко используются аутологнчные клеточные трансплантаты, реже аллогенные, ксеногенные и даже химерные (смешанные аутологично-аллогенные) клеточные конструкции. Несмотря на кажущиеся очевидные преимущества, аутологнчные трансплантации имеют свои значительные недостатки. Это, прежде всего, высокая затратность и технологичность, а тахже значительные сроки подготовки трансплантатов. Эти недостатки сводят к минимуму высокую эффективность, которая должна соответствовать этому подходу.

Использование аллогенных клеточных трансплантатов, являясь, по нашему мнению, одним из oeHoeoiiojiai ающих принципов тканевой инженерии, недостаточно изучено и, как следствие, мало распространено.

Культивирование клеток человека открывает возможность исследовать процессы раневого заживления в моделях in vitro. Это важно еще и потому, что различия в механизмах раневого заживления у большинства животных и человека не позволяют адекватна моделировать процессы в экспериментальной ране. В культуре удается моделировать различные стадии раневого заживления.

В модели контракции коллагенового геля клетками кожи нам удалось показать, что ЭКЦ н ФБ способны непосредственно реорганнзоваватъ подложку, в том числе контрастировать гель.

В процессе контракции кооперативно участвуют ФБ и ЭКЦ. Взаимодействие различных типов может осуществляйся и дистантно, по паракринному механизму, т.е. посредством растворимых медиаторов. Эти результаты противоречат данным, что эпителизацня раны ингибируег образование рубца, а значит и контракцию.

Нами был впервые описан ранее не известный феномен направленной миграции in vitro значительных количеств эпителиальных клеток, объединенных в колонии. Скорость миграции порядка 20 мкм/час является весьма значительной для многослойных клеточных образований. Активность миграции колоний коррелирует с пролнферативной активностью ЭКЦ, что характерно и для процессов in situ.

Хотя механизмы миграции до конца не определены, можно утверждать, что в культуре складываются условия, при которых возможна миграция многоклеточных эпителиальных, образований. Моделирование таких условий позволит приблизиться к управлению эпнтелнзацней тканевых дефектов.

Можно предположить, что для стимуляции пролиферации и миграции клеток по раневой поверхности также следует обратиться к факторам роста. Однако использование ростовых факторов для стимуляции раневого процесса является не

тривиальной задачей, (Pierce and М1И1ое,!995).Понятно, что в такой сложной, многокомпонентной системе как рана, действие фактора не бывает прямым и может опосредоваться любыми другими участниками процесса, однако, анализируя результаты можно говорить об эффективности такого подхода.

Еще одним основополагающим принципом тканевой инженерии является использование в составе тканевого трансплантата стволовых клеток (M.Dunnwatd et al. 2001). Наличие стволовых клеток обеспечивает приживление и длительное функционирование трансплантата в зоне тканевого дефекта, что приводит, в конечном счете, к восстановлению его структуры. Существуют различные мнения по поводу судьбы тканевых стволовых клеток в культуре. Ряд исследователей полагает, что условия культивирования являются не пермиссивными для сохранения стволовых клеток, в частности эпителиальны* стволовых клеток (ЭСК). Наши данные, полученные в модели регенерации эпидермиса in vitro, говорят о сохранении ЭСК при длительных сроках культивирования. Более того, анализируя наличие стволовых клеток по манифестации экспресснонного фактора рбЗ, можно говорить об обогащении популяции эпвдермальных клеток клетками с высоким пролиферативным потенциалом. Это еще раз доказывает, что в культуре происходит отбор клеток по ряду признаков.

Использованная нами модель регенерации эпидермиса in vitro была разработана в 1988 году для характеристики клеточных закономерностей регенерации эпидермиса и с тех пор мало использовалась (Jensen and Bohmd,198S), Модель является адекватной и удобной, для исследования роли различных факторов в регенерации эпидермиса. Именно в этой модели было показано, что ЭФР способен усиливать пролиферацию базальных ЭКЦ. При этом, фактор ингибирует дифференцировку и стратификацию клеток, оставляя их в базальтом слое. Тем самым обработка ЭФР приводит к обогащению всей клеточной популяции эпидермиса пролиферативпо активными базальными клетками.

Модель регенерации эпидермиса in vitro открывает возможность охарактеризовать и исследовать эпядермальные стволовые клетки. Последовательное осуществление дестратификации эпидермиса с последующей его регенерацией приводит к стимуляции детерминированных клеток к дифференцировке и истощает тем самым популяцию транзиторных клеток. Таким образом, последовательное осуществление 2-3 х процедур дестратифнкации-регенерашш эпидермиса, позволяет избавиться от всех комитированных к дифференцировке клеток и получить обогащенную ЭСК культуру.

Используя рбЗ как маркер, нам удалось показать, что после подобной обработки культура содержит до 80% ЭСК, Трудно ожидать, что все рбЗ положительные клетки обладают всеми свойствами стволовых, вероятно в компартмевт рбЗ экспресснрующнх клеток рекрутирована часть транзиторных клеток, но несомненно, что все они отличаются высоким пролиферативным потенциалом (Parsa et al., 1999).

Данный методический прием позволяет синхронизировать ЭСК в периоде пролиферативного покоя. Наши исследования с использованием пролиферативного маркера Ki-67, показывает, что клетки базального слоя находятся в периодах Go и G], Существуют предположения, что синхронизация культивируемых клеток в покое и значительное обогащение популяции стволовыми клетками могут иметь определяющее значение для успешной трапедифференцнровки (Liu and Rao, 2003).

Накопленные к настоящему времени данные позволяют ряду авторов утверждать, что тканевым стволовым клеткам уделяется сегодня неоправданно мало внимания.

К тканевым стволовым клеткам относят сегодня клетки костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки, стволовые клетки кожи (Torna et al., 2001).Ткапевые стволовые клетки проявляют высокую лабильность, способны проявлять шпорипотентность и именно с ними связывают сегодня надежды на значимые практические результаты.

По нашему мнению в список наиболее перспективных тканевых стволовых клеток, несомненно, можно добавить эпителиальные клетки.

Используя модель регенерации эпидермиса in vitro, нам удалось впервые показать экспрессию нестина в культуре ЭКЦ, Нестан является маркером предшественников для многих типов клеток. Экспрессию этого фактора связывают, сегодня со способностью клеток к изменению своего фенотипа. Одновременная экспрессия нестина и рбЗ позволяет говорить о возможной пластичности эпителиальных клеток. Так, эпителиальные клетки лимба роговицы, продуцирующие нестин, способны к дифференцировке в нейральные клетки. Такой же способностью к транедифференцировке могут обладать и ЭСК. Перспективно исследовать трансформацию ЭСК в клетки других типов эпителия -например, эпителий тимуса. Не менее обнадеживает возможность транеднфференцировки ЭСК в гепатоциты, р-клетки поджелудочной железы.

Использование эпидермиса как источника стволовых клеток, открывает возможность аутологичных трансплантаций. Это снимает значительную часть морально-этических проблем, связанных с использованием эмбриональных стволовых клеток и делает такой подход клинически перспективным.

Однако уже сегодня область применения искусственных тканевых конструкций значительна.

В рамках данного исследования нами разработана серия тканевых трансплантатов для восстановления различных тканевых дефектов. Применение клеточных трансплантатов для новых объектов потребовало их модификации или разработки новых способов культивирования и доставки клеток. Для создания приемлемых тканевых трансплантатов для различных типов дефектов были применены разнообразные биосинтетические конструкции. Так, нами была разработана технология культивирования, хранения и трансплантации клеток кожи (как ФБ, так и ЭКЦ) на поверхности коллагеиовых микроносителей. Использование МН позволяет доставлять клетки фактически в любые полости организма, избежать травматичной процедуры ферментативного открепления выращенных клеток от подложки. Одновременно решается проблема и криоконсервирования выращенных клеток,

Непосредственно для восстановления дефектов роговицы нами была разработана оригинальная технология культивирования клеток на внутренней поверхности терапевтических контактных линз. Реализация этого технологического подхода позволила внедрить применение выращенных клеток в офтальмологическую практику.

Использование дермального (стромальпого) тканевого эквивалента, эпидермальных выращенных клеток имеет свои показания, однако наиболее эффективным и универсальным, позволяющим восстанавливать глубокие мезенхимно-эпителиальные дефекты, является использование трехмерного живого кожного эквивалента, представляющего собой фибробласты и ЭКЦ в комплексе с трехмерным коллагеновым матриксом. Применение такого комплекса позволяет успешно восстанавливать ткань после глубоких ожогов, трофических язв.

Оригинальным и эффективным было применение ЖЭК для восстановления полнослойных дефектов гортани.

Показанная высокая эффективность и технологичность применения аллогенных трансплантатов для восстановления тканевых дефектов различной этнологии позволяет утверждать, что «аллогенность» трансплантатов является важным принципом тканевой инженерии, открывающим этому направлению значительные перспективы. Аллогенность предполагается и в случаях использования трансплантатов стволовых клеток, например костного мозга.

Таблица 5,

Разработанные возможности применения трансплантатов в восстановлении тканевых дефектов.__

Тканевая (клеточная) конструкция Тип тканевого дефекта

Аутологичные эпидермалькые пласты Глубокие обширные ожоги.

Адлогенные эпидермальные пласты, ЭКЦ на поверхности микроносителей. Ограниченные глубокие (ло 10%),

смешанные, обширные поверхностные ожоги.

Аллогенные эпидермальные клетки на Эпителиальные дефекты роговщы.

контарт^ой линзе

Дермальный эквивалент' (стромальный эквивалент), биброб.тасты на поверхности Раны, трофические язвы, урогенйт^льрые и др. евлши. глубокие ожоги или язвы роговицы.

ми!фочйШ£1еЙ воспаление среднего уха, эсюзия шейки матки, патология парадонтаи т.д.

Живой кожный эквивалент* Глубокие ожоги, трофические язвы, раны, полнослойные дефекты тканей, дефект гортани.

()- различные модификации Подчеркиванием выделены оригинальные разработки, выполненные в ходе настоящего исследования.

Важным обстоятельством, определяющим сроки приживления клеточных трансплантатов, является снижение их иммуногенности после длительного культивирования вне организма.

Трансплантаты дермального (стромального) эквивалента, способны сохранятся в области дефекта роговицы до 30 дней, без потери жизнеспособности входящих в него клеток. Не менее 15 суток способен сохраняться на ране выращенный аллогенкый эоддермальный трансплантат. Следует отметить, что нам не удалось выявить закономерности между длительностью временного приживления и эффективностью действия трансплантата. Зачастую, даже после кратковременного (3 суток) нахождения на раневой поверхности наблюдался выраженный эффект.

Тем не менее, очевидно, что действие аллогенного трансплантата обусловлено временным приживлением и установлением метаболятических отношений с тканями реципиента. Такое взаимодействие трансплантата с тканями реципиента реализуется по двойному паракривному механизму. Даже кратковременное «встраивание» аллогенных клеток способно запускать реализацию таких механизмов.

Нам удалось обнаружить некоторые механизмы, определяющие влияние выращенного эпидермиса на раневой процесс. Для исследований была выбрана длительно незаживающая рана, как наиболее трудный и «неблагодарный» объект раневого заживления. Следует отметить, что применение разработанного нами выращенного аллогенного эпидермиса, позволяет добиваться закрытия даже весьма запущенных и длительно существующих тканевых дефектов.

Иммуногистохимическое исследование показало практически полное отсутствие экспрессии ТОГр и РРСР в области раны. Наблюдалась слабая экспрессия №ОР, преимущественно в стенках сосудов, локализованных в краях раны. Грануляционная ткань отличалась незрелостью и неразвитостью. Трансплантация выращенного эпидермиса уже к 5 суткам приводила к усилению экспрессии ЬГйР, ТСРр, РОйР. Повышение носило выраженный, но кратковременный характер и уже к 10 суткам после трансплантации экспрессия ТСРр, РОйР снижалась. Экспрессия ЬРвР оставалась на высоком уровне. Вместе с повышением экспрессии этих факторов,

происходило формирование зрелой соединительной ткани. После трансплантации аллогенного эпидермиса в ране происходили изменения экспрессии и других факторов, однако изменения TGFß, PDGF, bFGF являются красноречивой иллюстрацией быстрых положительных реакций. Эти факторы известны как главные факторы раневого заживления, наряду с EGF (TGF-a), определяющие, поведение клеток кожи {P.Martin, 1997).

Заметное влияние оказывал аллогенный эпидермис на внеклеточный матрпкс. Анализ внеклеточного матрикса длительно незаживающих ран характеризовался значительными нарушениями его структуры. Уже через 5 суток после трансплантации начинался процесс формирования зрелой соединительной ткани- росло число ФБ, росло содержание ранее недостающего коллагена Ш типа. Важно, что происходило восстановление базальной мембраны. Так, наблюдалась экспрессия ламнннна в зоне, непосредственно прилегающей к частично лизированному трансплантату. К 10 суткам наблюдалась заметная экспрессия коллагена IV в Vit типов.

Полученные нами экспериментальные данные говорят не о стимулирующем, а о нормализующем воздействии трансплантата на раневой процесс.

Так, под влиянием выращенных ЭКЦ снижалось содержание тенасцина, повышенное содержание которого препятствовало нормальной реализации раневого процесса. Интересно, что наличие на ране аллогенного эпидермиса не индуцировало трансформацию фибробластов в мкофибробласты, т.е. не усиливало процессы образования рубца.

Формирование базальной мембраны, а по нашему мнению это событие является определяющим эаителизацию раны, приводило к миграции и пролиферации собственного эпителия, имеющего нормальный фенотип. Миграция ЭКЦ, окрашиваемых па Ki-67, проходила под гибнущими аллогенными трансплантатами.

Экспрессия ajbi - н a^bi- интегрннов, являющихся рецепторами к коллагену и ламинину на поверхности ЭКЦ и ФБ также свидетельствует в пользу восстановления нормальных стромально-эпителнальных взаимодействий.

Таким образом, аллогенные выращенные эпндермальные клетки, сохраняются на раневом ложе (кратковременное приживление), стимулируют и нормализуют раневой процесс с последующим лизисом и замещением собственными клетками реципиента. Данный феномен можно охарактеризовать как трансплантационная индукция регенерации.

В случае трансплантации дермального эквивалента, представляющего собой трехмерный коллагеновый гель с ФБ, обпше принципы влияния на репарационные процессы были схожи, В качестве примера можно указать восстановление стромальных дефектов роговицы.

На 7 сутки после трансплантации ДЭ наблюдалось повышение экспрессии TGFß, на фоне его отсутствия в контрольных образцах. Одновременно наблюдалось увеличение числа ФБ, в том числе активно окрашиваемые на пролиферативный антиген Ki-67. Росло содержание фибронектина, преимущественно в форме мерознна (фибронектин-2).

К 14 суткам за счет повышения содержания ламнннна и коллагена IV типа, происходило формирование базальной мембраны. Продолжалась экспрессия TGFß. На эти сроки наблюдения выявлялась активная миграция и пролиферация эпителиальных клеток. Миграция клеток, экслресснруюпшх Ki-67, наблюдалась по поверхности коллагенового геля, внутри которого сохранялись жизнеспособные донорские ФБ.

К 22 суткам наблюдения обычно можно было наблюдать полную эпителнзацню геля, заполняющего дефект, снижение экспрессии TGFß, фибронектина, уменьшение числа пролифернрующих ФБ и эпителиальных клеток. Таким образом, происходило затухание репаратнвных процессов.

Важно, что, как и в случае с восстановлением дефектов кожи трансплантацией ЭКЦ, не происходило трансформации ФБ в мнофнбробласты. Это означает, что вклад контракции в процесс репарации дефектов был минимален и раневое заживление

происходило по физиологическому пути. Компенсаторная регенерация в случаях такого рода, означает закрытие дефектов за счет образования рубца. Более того, интенсивность образования рубца под воздействием клеточпого трансплантата была значительно ниже, чем без него, что приводило к лучшим клиническим результатам.

Несмотря на то, что дермальный трансплантат состоял из ФБ кожи, восстановление носило выраженный гист»типических характер. Окрашивание на содержание коллагена показало отсутствие в базальной мембране коллагена VII типа, характерного доя мембраны эпидермиса и наличие специфического коллагена IV типа.

Наши результаты указывают наподобие механизмов воздействия эпителиальных или мезенхимных клеток в качестве аллогенных трансплантатов. Так, ЭКЦ были не менее эффективны при восстановлении дефектов роговицы, чем лимбальные эпителиальные клетки. Так же ЭКЦ вполне успешно были использованы для восстановления эпителия при эрозии шейки матки. Для восстановления стромы роговицы мы успешно использовали дермальные ФБ, Во всех случаях происходило восстановление гистотшшческих структур.

Крайне интересно, что на разных объектах (строма роговицы и кожа), при использовании различных трансплантатов (выращенный эпидермис и дермальный эквивалент) наблюдались не только схожие конечные результаты, но схожи сами механизмы и медиаторы процессов репарации.

На основании подученных результатов можно сформулировать общие механизмы восстановления тканей под влиянием тканевых трансплантатов.

Рис.33. Общие прнншты восстановления тканей трансплантацией аллогенных клеток

Высокая эффективность применения тканевых трансплантатов н общие механизмы указывают, на то, что репарация тканей вообще и, в частности, раневое заживление является не медицинской, а биологической проблемой и должна решаться сугубо биотех] юлогическими методами.

Открывающаяся при этом возможность использования клеток кожи для восстановления самых различных тканей дает огромные технологические возможности.

Проведенные исследования, охватывающие изучение фундаментальных механизмов репарации тканей и практические аспекты применения тканевых н клеточных

трансплантатов, позволяют серьезно продвинуться в области восстановления утраченных тканевых структур и функций.

Выводы

1. Сформулирована и обоснована концепция гнстотипической стимуляции репарации тканевых повреждений. Экслерментально обоснована эффективность применения аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов. Гистотииическое восстановлен не эпителиальных или мезеихимных дефектов происходит под действием аллогенных транеплантяов по единым механизмам.

2. Экспериментально найдено, что сущность процесса заключается во временном приживлении зллогсиного трансплантата с последующей стимуляцией синтеза компонентов внеклеточного матрнкса, экспрессией факторов роста, активацией пролиферации клеток реципиента, нормализации воспалительного процесса, что приводит к гнстотипичсскому восстановлению дефектов.

3. Разработан рад технологий, а также типов клеточных и тканевых трансплантатов для восстановления различных эпителио-мезенхимных дефектов, в частности, глубоких ожогов, длительно незаживающих ран, язв, свищей, дефектов гортани, поражений роговицы, конъюнктивы,

4. Разработана и исследована модель регенерации эпидермиса в культуре. Впервые показана возможность 80% обогащения субпопуляции батальных кератиноцнтов рбЗ содержащими клетками. Впервые показана экспрессия нести на базальмымн кератин ощггамн в культуре, что свидетельствует о пластичности фенотипа этих клеток. Показана способность эпидермального фактора роста задерживать стратификацию кератиноцнтов.

5. Изучены морфогенетическне процессы в культуре эпидермальных кератииоцитов. Впервые обнаружен и исследован феномен направленной миграции колоний кератиноцнтов в культуре, доказана его связь с пролиферацией клеток и колонии.

6. В модели контракции коллагенового геля клетками кожи in vitro показано кооперативное воздействие на контракцию фнброблаетов и кератиноцнтов. Показана способность клеток вступать в дистантные взаимодействия в процессе контракции.

7. Разработаны оригинальные технологии культивирования и трансплантации клеток кожи на поверхности микроносителей, открывающие возможность крнноконсервирования клеточного трансплантата. Методически и технологически обосновано создание первого в России банка кожных клеточных трансплантатов

Список работ, «публикованных ко теме диссертации:

I. Анфиногенов В.Л., Васильев Л.В., Терских В.В.

Создание живого эквивалента кожи как проблема тканевой инженерии,-Материалы конференции "Современные направления развития биотехнологии", Москва,1991, с.5.

3.Васильев А.В., Малахов С.Ф., Парамонов Б.А., Волошин А.В., Терских В.В. Биотехнологические перспективы реконструкции кожного покрова.-Маггериалы конференции "Современные направления развития биотехнологии ".Москва, 1991, с.II.

3 Л.В.Васильев, А.В.Волошин, В.В.Терскнх. Цитология,! 991,12, Т.ЗЗ, С.84-89.

4.Васильев А.В., Парамонов Б .А., Логинов Л.П., Смирнов С.В., Мымрива И.А., Терских В.В.

Восстановление кожного покрова у обожженных путем аутотрансплантацни кератиноцитов, выращенных вне организма больного.- Материалы Международной конференции Интенсивное лечение тяжелеюбожженных", Москва, 1992,с. 58-59.

5.Парамонов Б.А., Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. Аллотрансплантация выращенного эпидермиса как метод восстановления кожного покрова- Материалы Международной конференции "Интенсивное лечение тяжеяообожженных", Москва,1992, с.128.

6.Терских В.В., Васильев А.В.

Реконструкция кожного покрова с помощью тканевой инженерии,- Цитология, 1992,т.34, с.Ю8.

7.Мымрина И.А., Васильев А.В., Адамян А.А., Ильина Т.М., Добыш С.В., Терских В.,В, Тестирование перспективных перевязочных материалов накудьтурах фибробластов и кератиноцитов кожи человека,- Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,1992,5, с.536-538.

8. В.А.Анфипогенов, А.В.Васильев, И-А-Мымрина, В.В.Терских Взаимодействие эиицермальных кератиноцитов и фибробластов в процессе формирования живого эквивалента кожи.-Цитология,т,34,11/12,с.60-б5,1992.

9. С.Ф.Малахов, А.В.Васильев, Б А.Парамонов, Е.А.Баугин, В.В.Терских.

Аутотрансплантация выращенньи вне организма эпидермальных кератиноцитов с целью лечения обширных ожогов - Вестник хирургии им. Грекова,] 993,4,с.59-62.

10. L.P.Loginov, B.A.Paramoaov, S.F.Malakbov, S.V.Sminiov,V.V.Terskikh, A .V, Vasiliev. Application of cultivated epidermic grafts in bum treatment.- 5th Congress European bum association, Brighton, 1993,p.S2 - S4,

II. ParamonovB., Malakhov S., Vasiliev A., Terskikh V.

Allogenic keratinocyte grafting in the treatment of burned patients.- European Bum Association, 5th Congress, Brighton, 1993, p.S 2.

12. А.В.Васильев, А.В.Волошин, ЕА.Воротеляк, В.В.Терских Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов в культуре, Доклады академии наук,1993,2, т.329, С.232-235.

13. А.В.Васильев, В.В.Терских

Действие эпидермального фактора роста на регенерацию эпидермиса m vitro. Доклады академии наук,1994,т. 334,5,С.660-661.

14. А.В.Васильев, Е.А.Воротеляк, В.В.Терскнх

Моделирование регенерапни эпидермиса in vitro: совместное действие сыворотки и эпидермального фактора роста, -Онтогенез, 1994,т.25,№3,с.74-79.

15.Malakhov S.F., Paramonov В.А., Vasiliev A.V., Terskikh V.V.

Preliminary report of clinical use of cultured allogeneic keratwocytes, Bums, 1994,20Jia 5, p.463-466,

16. Васильев А.В., Терских B.B., Малахов С.Ф., Парамонов Б.А.,Смирнов С.В., Лошнов Л.П., Мымрина И, А.

Оригинальный метод культивирования и трансплантации клеток

кожи для лечения ожогов. Материал конференции "Пластическая хирургия при ожогах и ранах" Москва, 1994, с. 14.

17. Малахов С.Ф., Логинов Л.П., Смирнов C.B., Парамонов Б.А^Терских В.В., Васильев

A.B., Данилова Т.И., Заикошгикова А.П.

Опыт применения в клинической практике выращенных аллогенных эпидермальных пластов. Материалы конференции ."Пластическая хирургия при ожогах и ранах", с.51 Москва,1994.

18. Терских В.В., Васильев A.B.

Биомедипипскяе аспекты культивирования клеток, Цитология, т.ЗбДа б, с.506, 1994.

19.Ю.К.СкрыпкянД.А.Кубанова,В. А.Самсонов, А.В.Резайккна, В.В.Терских, Г.М.ЦвегковаД-В.Васильсв, И.И.Богатырева

Перспективы применения культур фибробластов и кератиноцитов человека в дерматологии .-Вестник дерматологии и венерологии, 1994, т.б, с.4-б.

20. С.Ф.Малахов, БЛ.Парамонов, А.В.ВасильевДВ,Терских.

Перспективные направления развития проблемы восстановления кожного покрова у обожженных. "Актуальные вопросы лечения термической травиы и ее последствий", Сборник научных статей, посвященный 20-лешю Московского ожогового центра, 1995, с.28-31.

21. С.Ф.Матахов,Б.А.Парамонов,В.В.ТерскяхЛ.В.Василъсв, .В.СмирновДПЛогинов Биотехнологические методы лечения ожоговых ран. Восьмая научная конференция по проблеме "ожоги" .Тезисы докладов. С.Петербург,1995,с, 106-107.

22. ЛЛ.Логинов, С.В.Смирнов, А.В.Васильев, А.П.Заиконнико ва, Т.И.Данилова,

B.В.Терских, М.В.Шахламов

Лечение глубоких ожогов трансплантацией аллогенных эпидермальных клеток. "Избранные вопросы хирургии и военно-полевой хирургии".Тезисы научных работ. Саратов,1995, C.13I-132. 23 .А.В .Васильев, Л.П.Логинов, С.В.Смирнов, С.Ф.Малахов, Б.А.Парамонов,

A,П.Заиконникова,Т.И. Данилова,В,В .Терских

Применение выращенных аллогенных эпидермальных пластов для лечения обожженных. Травматология и ортопедия России, г. 4, с.34-39,1994.

24. Терских В.В„ Васильев A.B.

Эпндермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации, М, Наука,1995, 104 с.

25. Vasiliev A.V., TersHkh V.V., Loginov L.P., Smirnov S.V., Malakhov S.F., Paramonov

B.A. Novel approach to cultivation and transplantation of human keratinocytes, European Bums Association, (itbeongress, Verona, September 13-15,1995,p,271

26. Малахов С,Ф,, Васильев A.B., Терских ВВ., Логинов Л.П.,Смирнов C.B., Парамонов Б.А.

Перспективы биотехнологнческих методов восстановления кожных покровов. Международный симпозиум "Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи", Тула, 1996, с.6,

27.Птицин Л.Р.. И.Б.Альтман, Васильев A.B., Терских В.В. Продукция рекомбинантных факторов роста и их использование при культивировании и и трансплантации эпидермальных кератиноцитов. Международная конференция посвященная памяти акад.АА^ае ва. 20-22 мая 1996 г., Москва ,с.129.

28. Парамонов Б.А., Васильев A.B., Терских В.Б., Малахов С.Ф. Перспективные биотехнологи чески с методы восстановления кожного покрова у тяжелообожженных. Межвузовский сборник научных трудов "Раневой процесс в хирургии и военно-полевой хирургии",Саратов, 1996, с.67-70,

29. Vasiliev A.V„Smimov S.V., Malakhov S.F., Loginov L.P., Paramonov В.A., Zaikonnikova A.P., Terskikh V.V.

Restoration of skin lesions by transplantation of hnmanepidermal keratinocyte cultured on microcanies. 4-th International Congress of Interactional Wound Association.-Tel-Aviv,

1996.-P.95.

30. Е.А.Воротеляк, А.В.Васильев, С.А.Гусев,Т,М.11овалнй, В.В.Тсрскнх Лльфа-фетопротеин подавляет пролиферацию кератиноцитов in vitro. Известия РАИ, Серия биологическая, 1996,1,0.117-120.

31.E.A. Воротеяяк, Г.П.Сатдыкова, А.В.Васильев, В .В .Терских. Электронно-микроскопическое исследование мигрирующих колоний кератиноцитов. Известия РАН, Серия биологическая, 1996,4,С.485- 489.

32.А.А.Кубанова,В.А.Самсонов,А.В.Резайкина, В.П.Бухова, М.Ю. Парфенова, В.В.Терсхнх, А.В.Васильев, Е.А.Воротеляк

Тестирование лекарствепных препаратов наружного применения в культуре клеток кожи человека,- Методические рекомендации 96/247.Утвержцены Заместителем Министра МЗ РФ 19 февраля 1996 г. Москва, 1996, с. 1-8.

33.Васильев А.В., Емельянов А.В., Данилова Т.Н., Киселев И.В.,Терских В.В., Смирнов С,В.

Создание банка кожных клеточных трансплантатов: принципы и перспективы,-Новые медицинские технологии в лечении тяжелообожженных, Материалы городской научно-практической конференции. Москва,! 997. с.27-31.

34.Paramonov В., Malakhov S,, Vasiliev A., Terskikh V.

Morphological structure of skin reconstructed by keratinocyte sheet grafting,The first joint Russian-Amcrican meeting on bums and fire disasters. P 36, Abstract Book, St.-Petersburg, 1997,

35. Smirnov S-, Emelyanov A., Loginov L, Zaikonnikova A., Vasiliev A., Terskikh V. Biomedical principals of the organization of cell transplants bank. The first joint Russian-American meeting on burns and firedisaslers. P.36-37, Abstract Book, St.-Petersburg,

1997.

36. Vasiliev A.V., S.V.Smirnov, I.I.Ermolinsky, A.P.Zaikonnikova, A.V.Samarova, I.V. Kiseliov, V.V. Terskikh

Restoration of epithelial lesions by transplantation of human allogenic keratinocytes.-Intemational-European A.I.R.R, Conference 1997 at Cologne, Germany. P. 44.

37.Малахов С.Ф., Парамонов БА.,Емельянов А.В.Засильев А.В., Терских В.В. Новые подходы к лечению тяжелых ожогов: трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов. Военно-медицннскнй журнал, 1997, т.СССХУШ, 9, с. 16- 19.

38. Девятое А .С,, Шаплыган JI.B., Ермолинский И.И., Исаев В.В.,Васильев А.В., Данилова Т.Н., Терских В.В.

Первый опыт консервативного лечения мочевых свищей с использованием алдогенных культур клеток человека.- Тезисы докладов научно-практической конференции "Возможности и перспективы совершенствования диагностики и лечения в клинической практйке.Тлавный военный клинический госпиталь им.Н.Н.Бурденко, Москва, 1997 г., С.60-61.

39. А.В.Самарова, ЕА.Воротеля к, А.В.Васи льев,В.В.Терских Пролиферация клеток в мигрирующих колониях клеток зпндермондной карциномы А-431 в культ>ре.Онтогенез,1997,4,Т.28,288-292.

40 .Е.А.Воротеляк, Г.П.Сатдыкова,А.В.Самарова, А-В.Васклъев, Т.И.Данилова, В.В.Терских.

Распределение ДНК-сшггезирующих клеток в мигрирующих колониях эпндермальных кератиноцитов человека. Доклады академии наук, 1997,6, т.З54,0.829-831.

41. Е.А-Воротеляк, А-В.Самарова, А.В.Васильев, В.В.Терских Действие эпидермального фактора роста на миграцию клеток А-431, Известия РАН, Серия биологическая,1997,6,С.734-740,

42.Хрупкин В.И., Низовой А.В,, Леонов С.В., Заиконникова А.П.,Васильев А.В.,

Терских B.B.

Использование фибробластов дня лечения гранулирующих рай. Военно-медицннский журнал, 1998, т.СССХК, 1, с.38-42.

43.Емельянов A.B., Жнляев Е.Г., Смирнов C.B., Васильев A.B., Киселев И.В.,Терских ВВ.

Создание банка кожных клеточных трансплантатов. Материалы Ш Международной конференции "Современные подходы к разработке перевязочных средств, шовных материалов и полимерпых имплаигатов", Москва- 1998, С. 103-104.

44.А.В.Ваеильев, И.А.Чекмарева, С. В Добыт, А.ПЗаиконникова,С,В. Леонов, В.В.Терскнх, ГШ.Головаяова

Конструирование бионолимерных материалов и живых клетоккожи для создания высокоэффективных ранозаживляющих покрытий. Материалы Ш Международной конференции "Современные подходы к разработке перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплаигатов", Москва-1998, С. 106-107,

45.Смирнов C.B., Киселев ИЗ., Заяконникова А.П., Данилова Т.И., Емельянов A.B., Васильев A.B., Терских В.В.

Использование биологических покрытий в лечении нарушения целостности кожи. Материалы П Конгресса хирургов Украины. Киев-Донецк, 1998 "Юптчна xipyprw", с.485-486.

46.И.Л.Давшова ДА.Молочков, A.B. Васи льев£.А.Воротеляк, В.В.Терских Применение культуры клеток базально-клеточного рака для выбора ищшвидуалыюй противоопухолевой терапии.- Российский журнал кожных и венерических болезней, 1998,2, с. 16-21.

47.Ю,К.Скрыпхин, М.АЛирченко.А.В .Васильев, В,А.Самсонов, А.В.Резайкнна, В.В.Терских

Влияние блокаторов Ca каналов на клетки волосяного фолликула в культуре. Вестник дерматологии и венерологии,1998,6,с,56-58,

48.С.Н.Федоров, Д.В.Давыдов, А.В.ВаснльевЛ-В.Перова, Т.И.Данилова, В.В.Шиннн, В.В.Терских

Применение культур лостнаталышх фибробластов кожи человека в офтальмотоксикологических исследованиях. Офтальмохирургия,1998,3,С,49-53.

49.ЛР.Птицин,И,БАльтман>[З.ГуровЛ.В .Васильев, Е.А.Воротеляк, В.В.Терских Продукция рекомбивантного фактора роста кератиноцитов человека в клетках Escherichia coli .Биоорганическая химия, 1998, Т.24,7, С. 523-529.

50.А.В.Васильев, В.В.Терскнх

Стимуляция восстановления тканей путем трансплантации аллогенных клеток. Материалы конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей», 1998,Москва, С.6. 51 ,Е,А.Воротеляк, А.В.Самарова, А.В.Васильев, В.В.Терских Миграция эпидермальных клеток in vitro. Там же , С.7.

52. Д. В.Давыдов, А.В.Васнльев, В.В.Терскнх, В.В.Шикин, С.Ралж

Первый опыт трансплантации аллогенного эпидермиса для восстановления эпителия коньюнкгивальной полости анофтальмической орбиты. Там же, С. 10.

53. Д.В.Давыдов, A3 Заснльев,Т.И. Данилова, В.В.Шнния Использование культур фибробластов и кератиноцитов кожи человека для тестирования полимерных офтальмологических имплантатов, Там же, СТ11.

54.Б.А.Парамонов, А.В.Васильев, В.В.Терских,С .Ф.Малахов. Перспективные биотехнологические методы лечения тяжелообожжегатых, Там же. С.24.

55.С.В.Смирнов, Киселев И.В.,Емельянов А,В.,Заиконннкова А.П.,Терских В.В. Банк клеток и тканей как основа для систематизации работ в области клеточной терапии, Там же, С.28.

56 З.В.Терских, А.В.Васильев

Реконструкция тканей и трансплантация клеток. Там же, С,31,

57. V.V.Terskikh, A.V .Vasiliev

Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes.Intemational Review of Cytology, 1999, V.188, p.4I-72,

58. Н.Ф.Сершепко,А.С.Д евятов J1 .В. Шал лыгия, П.Н.Семенцов, А.В.Васильев, И Л.Ермолинский, В.В.Исаев

Лечение мочевых свищей с применением культуры аллогенньи фибробластов, Урология, 1999,1, С.44-4 59,Smîmov S.V., Vasiliev A.V., Paramonov В.А., LoginovL,, Kiseliov I.V., Danilova Т.1., Terskikh V.V.

Seven-year experience in the treatment of bum patients with allogenic cultured keratinocyies.Annals of Burns and Fire disasters, V. ХП, N 4, p. 212-216,1999.

60.Kiseliov I.V„ Smimov S.V., Vasiliev A.V., Terskikh V.V.

The storage solution for preservation of viable skin, AATB 23 rd Annual Meeting, San Diego, 1999, p.42.

61.Е.А.Воротеляк, О. Г Леонова, В.В.Шннин, А. В. Васильев, В. В. Терских

Рост эпидермальных кератиноцитов человека на коллагеновом геле.-Доклады академии наук, 1999,369,5,с.695-697.

62.Ю.К.Скрыпкип, МА.Чирченко, А.В.Васильев, В.А.Самсонов, А.В.Резайкина,

B.В.Терских

Влияние бдокаторов Са -каналов на клетки волосяного фолликула в культуре. Вестник дерматологии и венерологии, 6, стр.56-61,1998.

63. Васильев А.В., Парамонов Б.А.. Киселев И.В., Терских В.В. Аллогенные кератннониты в практике лечения обожженных. Международный конгресс" Комбустиология на рубеже веков",2000:159,

64.Р.А,Гундорова, П.В.Макаров, Г.В.Ходжабекян, А.А.Иванов, Л.АЛапина, Д.Н.Федоров, В.В.Шннин, В.В.Терских

Трансплантация культивированных клеток как метод леченая глубоких ожоговых дефектов роговицы.Там же. СЛ60. 65 .Р. А.Гундорова,П .В.Макаров,Г.В .Ходжабекян, А.В.Васильев,

Д.В Давыдов, П.А.Правнльникова, В.В.Шннин, Л-А.Лапина, И.Б.Максимов Опыт использования аллогенньи клеток в лечении тяжелых ожогов глаз.Там же.

C.161.

66.Киселев И.В., Смирнов C.B., Иванов А.А., Федоров Д.Н., Терских В.В. Перспективы использования нового метода криоконсервирования кожи в практике лечения обширных ожогов. Там же С, 162-163.

67.Makarov P., GundorovaR., Vasiliev A., Terskikh V^Khodjabekyan G„ IvanovA., Fedorov D., Shinin V., Evsikova A. Transplantation of allogenic cultured cells in tbesymposium of ocuîar trauma. Book of abstracts, Montreal,Quebec, Canada, 2000,-P.15.

68.ИА.Чекмарева, Б.В.Втюриа, А.А.Адамян, С.В.Добыш, О.АЛахарова, А.В.Васнльев, Л.Е.Килимчук

Специфическое влияние эпцдермального фактора роста, иммобилизованного в раневое покрытие с растворимьм коллагеном, на заживление ран в эксперименте, Бюллетень экспериментальной биологин и медицины^ООО, 4, Т.129, С.465-469,

69.В .В .Терских, А.В.Васильев Стволовые клетки эпидермиса. Известия РАН, Серия биологическая, 2001,6,738-744.

70.В.И.Хрупхнн, Л.В.Писарекко, А.Н.Ивашкин, В.В.Терских, А.В.Васильсв, И.В.Киселев, А.Н.Кузин, Д.Н.Федоров

Аллогенная кожа в лечении раневых дефектов мягких тканей: проблемы и перспективы. Военно-медицинский журнал, 2001,т. СССХХН,6, С.29-37.

71. Ivanov A., Fedorov D., Shinin V., Vasiliev A., Paltsev M.,

The stromal -epidermal interaction in chronic wound healing,-Virchows Arch.-2001-Vol. 439,№3,-P.370.

72.Е,А,Воротеляк, АЛИ.Шихвердиева, А,В.Васильев,В.В .Терских Моделирование процесса миграции эпидермальных кератиноцитов человека по

трехмерному коллагеновому гелю. Известия РАН, Серия биологическая,

2002,1,С.30-3

73 .АА.ИвановД.Н. Федоров,А.В.Василъев, Г. В ,Ходжабекян,А.Н.Ивашкин Роль EGF-стимулированного эпидермиса в регуляции заживления ран. Архив патологии, 2002,1, T.64.C.11-13.

74.Д.Н.Фелоров, А.Н.Ивапгкия, В.В.Шинии, А.В.Васильев, А .А. Иванов Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика репаративных процессов в длительно не заживающих ранах. Архив патологии, 2002,1,т.б4,С.8-11.

75.Е.А.Воротеляк, А.Ш.Шихвердкева, А,В,Васильев, В.В.Терских Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля. Известия РАН, Серия биологическая, 2002,4, с.421-426.

76.Д.В.Давыдов, А.В.Васильев, В В.Терских

Трансплантаты для восстановления эпителия конъюнктив альноя полости и возможности современной клеточной биотехнологии. Новое в офтальмологии, 2002,3, с.27-30,

77..A,V.VasiJiev, I.V.Kiseliov, A.A.Ivanov, D.N.Fcdorov, S.V.Smimov, V.V.Teiskikh Prescrvasion of human skiniviability criteria, Annals of Bums and Fire Disasters-2002, Vol. XV-n.3-p. 145-150.

78. В.Н.Хрупкин, А.Н.Ивашкин, Л.В.Писаренко, А.В,НизовоЙ, Е.М.Фоминых, И.В.Кнселев, А.Н.Кузин, ДН.Федоров, А.В.Васильев, В.В.Терских Использование жизнеспособных криоконсервированных аллолермотрансплантатов в лечении раневых дефектов мягких тканей. Вестник хирургии им.Грекова, 2002,

т, 3 б 1, №5, Стр.55-59.

79. Г.В.Ходжабекян, П.В.Макаров, Р.А.Гундорова, А.В.Васильев, В.В.Терских, А.А.Иванов, Д.Н.Федоров, ЛАЛашща.

Биотехнологнчсские методы в лечении глубоких ожоговых дефектов роговицы 1 -й Международный Конгресс « Биотехнология-состояние и перспективы развития», Москва, Материалы конгресса, 2002, С.43-42.

80. A3 .Васильев

Биотехнология и фарм промышленность: проблемы н перспективы. Ш Международная конференция «Биотехнология и бизнес», Москва, 2003, Тезисы Докладов, Стр.Н.

81 .R-Gundorova, P.Makarov, V.Teiskikh, A.Vasiliev, G.Khojabckyan, O. Gladskikh, D.Fedorov, AJvanov

Cultured fibroblasts in the treatment of severe bums of rabbit cornea. 7 th ESCRS Winter refractive surgery meeting« Rome, 7-9 February 2003, p.35.

82.С.В.Смирнов, И.В.Кнселев, О.С.Роговая, А.В.Васильев, В.В.Терских Восстановление кожного покрова путем трансплантации выращенных кератиноцитов, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2003, т. 135, №6, С.711-713.

83.В .В.Терских, А.В.Васильев, ЕАЗоротеляк Структурно-функциональные единицы эпидермиса,

Известия АН, Серия биологическая, 2003, №6, С. Принята к печати

Патенты и полезные модели-

1 .Решение о вьиаче Патента РФ по заявке 4954512/14/055789.-"Способ восстановления кожного покровау тяжелообожженных".

С.Ф.Малахов,В .В.Терских, А .В. Васи льев.Б. А.ПарамоновЛ.В.Во лош ин ,И. А.Мымрина, Н.М.Парамонова,

2.Пагенг на изобретение 2143875, 10.01,2000г.Способ восстановления коггьюнктивальной оболочки,

А.В.Васильев, В.В.Терских, Д.В.Давыдов

3.Патент на изобретение 2173121,-2001 г. Способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы.

Р.А.Гундорова, П.В.Макаров, А.В.Васильев, В.В.Терских, И.Б.Максимов, Д.Н.Федоров

4.Патент на изобретение 2173122,2001, Способ лечения эрозия роговицы, Р.А.Гущюрова, П.В.Макаров, А.В.Васильев, В.В.Тсрских, П.А.Правильникова, О.Г. Черная, Л. А. Лапина

5.Паггент на изобретение 2177283,2001 Способ хирургического лечения дефектов конъюнктивы и роговицы.

Р.А-.Гувдорова, П.В.Макаров, А.В.Васильев, В.В.Терских, П.А-Правильннкова, В.В.Шинин

6.Патепт па изобретите 2177284,2001 Способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы,

Р.А.Гундорова, П.В.Макаров, А.В.Васильев, В.В.Терских, А .А .Иванов, В.В.Шинин

7.Патента на изобретение К°2212792 «Раствор для криопрезервации кожи и роговицы» Смирнов С.В.Диселев И.В.,Емельянов А.В.ДГепшевский А.В.,Васильев A.B., ТерскихВ.В.

8. Решение о выдаче Свидетельства па полезную модель по Заявке 2003105022/20(005941)

от 26.02.2003 «Структура материала для имплантации на гортань»

Чнссов В.И., Терских В.В., Васильев A.B., Решетов И.В., Батухткна Е.В., Роговая О.С,

9.Патент на изобретение №2197906 «Способ реконструкции гортани», Чиссов В.И., Решетов И.В.. Трофимов ЕЛ., Васильев A.B.. Роговая, О.С.Батухтина Е.В.

Слисок сокращений:

БМ—базальная мембрана

ВКМ - внеклеточный метрике

ДПР - длительно незаживающая рана

ДЭ-дермальный(стромальпый) эквивалент

ЖЭК-жнвой эквивалент кожи

МФ - моионуклеарвый фагонит

МН - микроносители, коллагеновые сферы размером 200-300мкм

ПЯЛ - полиморфно-ядерный лейкоцит

СЭ-стромал ьн ы й,(аермя л ьный)экви валент

CK - цитокерятнн

ФБ-фнброблясты

ЭКЦ—элндермальные кератнноциты человека ЭСК - эпителиальная стволовая клетка CD — кластер дифференцнровкн

c-MET/(HGF-r) - рецептор к фактору роста гепатоцитов (HGF)

EGF - эиндермальный фактор роста

EVGF - эндотелиальный фактор роста

FGF - фактор роста фибробластов

HGF - фактор роста гепатоцитов

IL - иитерлейкнн

IFN—интерферон

IGF- и ису л и неподобный фактор роста

KGF-фактор роста кератииоцитов

MCP - моноцнтарный хемотаксическвй белок

M1F- фактор ннгнбирующнй миграцию моноцитов

МІР - макрофагальный воспалительный белок

ММР — матрнксная мета ллопротенн язя

ТІМР-тканевой ингибитор металлопротенназ

РАІ - ингибитор активатора плазминогена

PDGF—тромбощггарный фактор роста

SMA - глядкомышечный актин

TGF - трансформирующий фактор роста

TNF - фактор некроза опухоли

t-PA-тканевой активатор плазминогена

ц-РА-урокииаза

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.10.2003 г. Формат 60x90 1М6. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 150 экз. Заказ 821. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992,ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. M.D Ломоносова.

•2103 3

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Васильев, Андрей Валентинович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Культивирование кератиноцитов

1.2. Дифференцировка кератиноцитов

1.3. Эпителиально-мезенхимные отношения

1.4. Факторы роста

1.5. Стволовые клетки эпидермиса

1.6. Процесс восстановления кожного покрова

1.7. Трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов

1.8. Реконструкция кожного покрова

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РАНЕВОГО

ЗАЖИВЛЕНИЯ IN VITRO.

3.1. Закономерности культивирования эпидермальных кератиноцитов кожи человека

3.2.Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов в культуре

3.3. Взаимодействие эпидермальных кератиноцитов и фибробластов в живом эквиваленте кожи in vitro

3.4. Разработка модели регенерации эпидермиса in vitro и изучение клеточных субпопуляций кератиноцитов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений"

Бурное развитие клеточной биологии открывает возможности для объяснения закономерностей многих физиологических процессов, в частности репарации утраченных структур или функций. Одновременно, накопленные экспериментальные данные и методические приемы позволяют перейти к использованию клеток как трансплантатов и разработать эффективные технологии для клинического применения.

Именно с развитием клеточных технологий связывают сегодня надежды на решение многих актуальных проблем медицины.

Восстановление эпителиальных и мезенхимных дефектов кожи, было, пожалуй, первым успешным опытом применения клеток и клеточных конструкций. Именно тогда было положено начало новому синтетическому направлению в биомедицине, называемому тканевой или клеточной инженерией. Клеточная и тканевая инженерия, предполагающая конструирование in vitro аналогов тканей и органов с последующей трансплантацией в организм является, своего рода, технологической реализацией достижений клеточной биологии как научной дисциплины. Несмотря на более чем двадцатилетний опыт и триумфальное шествие по всему миру возможности применения клеточных технологий далеко не исчерпаны. Более того, открываются новые перспективные направления исследований и разработок.

Одним из таких направлений является моделирование in vitro различных клеточных процессов. Такое моделирование позволяет конструировать в культуре гистотипические аналоги тканевых структур, моделировать межклеточные взаимодействия, вычленять воздействия растворимых факторов или взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом. Перспектива такого подхода для исследований. клеточных механизмов раневого заживления очевидна, поскольку позволяет использовать клетки человека, что повышает адекватность экспериментальных моделей. Общепризнанными являются модели миграции, регенерации эпидермиса, образования рубца. Фактически любую из стадий раневого заживления, не исключая стадию воспаления можно моделировать и исследовать в культуре (Grinnell,1994, Moll et al., 1998).

Созданные in vitro гистотипические тканевые конструкции могут быть с успехом применены и для замещения тканевых дефектов, существенно повышая эффективность лечения целого ряда заболеваний.

Технология восстановления кожных покровов основана на ряде фундаментальных свойств клеток и физиологических процессов:

1. Дезагрегированные эпидермальные клетки легко прикрепляются к субстрату и восстанавливают свою полярность в условиях in vitro,

2. В условиях культуры эпидермальные кератиноциты способны к гистогенной агрегации и образованию гистотипических структур, пригодных для трансплантаций на раневую поверхность,

3. ЭКЦ в культуре сохраняют способность к дифференцировке и морфогенезу, даже если, при этом, нет условий для реализации полной программы дифференцировки,

4. В процессе культивирования ЭКЦ не малигнизируются и сохраняют ' нормальный фенотип,

5. После перенесения на раневую поверхность устанавливается тесный контакт с подлежащими тканями,

6. После перенесения эпителиального пласта на раневую поверхность происходит образование базальной мембраны, что необходимо для нормального развития эпидермиса (Терских, Васильев, 1995),

Накопленный опыт восстановления дефектов кожи позволяет расширить рамки исследований и попытаться применить клеточные трансплантаты для восстановления целостности других тканей.

Исторически клеточные технологии ориентировались на собственные клетки пациентов, рассматривая их как объект культивирования и аутотрансплантации. Лишь самое последнее время исследователи обратились к аллогенным клеточным трансплантатам как перспективному технологическому решению. Опыт аллогенных трансплантаций неожиданно отрыл новые возможности данного подхода. Клеточные аллогенные трансплантаты, более эффективные в сравнении с аллогенными органными трансплантатами, при временном приживлении оказывались способными к значительной гистотипической стимуляции регенерации собственных тканей. Важно, что даже при кратковременном приживлении аллогенных трансплантатов они встраиваются в метаболитические и регуляторные системы организма. Так достигается специфическое воздействие на патологические процессы. Использование клеточных трансплантатов оказывается более точным и эффективным, чем иные подходы к репарации.

Несмотря на растущее число наблюдений, механизмы данного феномена изучены недостаточно, что объективно сдерживает распространение такого подхода. Для системного применения клеточных трансплантатов для восстановления структур и функций разных тканей и органов необходима концепция аллогенных трансплантаций.

Другой важной проблемой клеточной биологии, неразрывно связанной с тканевой и клеточной инженерией является проблема стволовых клеток. Более того, интерес к клеточной и тканевой инженерии во многом стимулирован успехами в изучении стволовых клеток. Сегодня интерес закономерно смещается к исследованиям постнатальных стволовых клеток. Несмотря на значительные результаты в исследованиях стволовых клеток костного мозга, нейральный и мезенхимных стволовых клеток, эпителиальные клетки изучены явно недостаточно. Так, до сих пор остается открытым вопрос об их сохранении при длительном культивировании, пластических возможностях. Уже сегодня утвердительно говорят о нейрональной трансдифференцировке лимбальных эпителиальных клеток (Seigel et al., 2003). Существуют предположения, что эпидермальные стволовые клетки в своих потенциях также могут проявлять высокую степень пластичности.

Все указанные проблемы стали предметом настоящего исследования.

Цель работы - изучение механизмов репарации тканей под воздействием аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов

Задачи исследования:

-исследование закономерностей культивирования ЭКЦ кожи человека, -разработка эффективной технологии культивирования, трансплантации и хранения клеток кожи,

-моделирование и исследование в культуре различных стадий раневого заживления — миграции эпидермиса, регенерации эпидермиса, взаимодействия ЭКЦ и Фб в процессе контракции (процесс образования рубца), -сравнительное исследование механизмов восстановления эпителиальных и мезенхимных тканей под действием аллогенных клеточных трансплантатов, -разработка аллогенных клеточных и тканевых трансплантатов, для восстановления тканевых повреждений, в т.ч. глубоких ожогов кожи и роговицы, длительно незаживающих ран, язв различной этиологии, объемных тканевых дефектов,

-поиск и идентификация стволовых и прогениторных эпидермальных клеток в культурах ЭКЦ человека.

-изучение влияния эпидермального фактора роста на культуру ЭКЦ, Работа проводились на основании:

Постановление Правительства РФ №1314-68 от 21 декабря 1993г. Постановление Правительства РФ № 525-20 от 5 мая 1997г. Постановление Правительства РФ № 145-14 от 22 февраля 2000г. Постановление Правительства РФ № 35-2 от 22 января 2003 г. Исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований, Программой Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине»,

Программой Президиума РАН «Физико-химическая биология», Проект «Механизмы пролиферации и дифференцировки эмбриональных и тканеспецифичных стволовых клеток».

Работа полностью выполнена в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук, директор- академик РАН Н.Г.Хрущов.

Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность учителю и научному консультанту работ, заведующему лабораторией проблем клеточной пролиферации, профессору, д.б.н. Василию Васильевичу Терских за всемерную поддержку и доброе отношение.

Данное исследование не могло состояться без участия и значительной помощи сотрудников лаборатории к.б.н. Е. А. Воротеляк, к.м.н. И. В. Киселева, А. П. Евсиковой, О. С. Роговой. Автор искренне благодарит своих коллег за многолетнюю совместную творческую деятельность.

Кроме того, Е. А. Воротеляк и И. В. Киселев оказали большую помощь при подготовке диссертации.

Автор глубоко благодарит за сотрудничество, помощь и доброе отношение сотрудников ММА им. И.Сеченова д.м.н. А. А. Иванова, к.б.н.О.П.Гладских, к.м.н. Д.Н.Федорова.

Данная работа выполнялась при творческом участии сотрудников многих клинических учреждений. Автор выражает благодарность проф., д.м.н. С.В. Смирнову и к.м.н. Л. П. Логинову (НИИ скорой помощи им.Н.В.Склифосовского ), проф., д.м.н. Р.А. Гундоровой и д.м.н. П. В. Макарову (НИИ глазных болезней им.Г.Гельмгольца), проф., д.м.н. В. И. Хрупкину и к.м.н. С.В.Леонову (Гос.Институт усовершенствования врачей МО РФ), д.м.н. -И. В. Решетову и Е. В. Батухтиной (МНИИ онкологии им. П.А. Герцена), проф., д.м.н.С.Ф.Малахову (Военно медицинская академия, г.С.Петербург), к.м.н. И. И. Ермолинскому (ГВКГ им. Н. Бурденко) за активное участие в работе.

Особенную благодарность автор выражает полковнику А.В.Емельянову за понимание и поддержку данного направления.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Васильев, Андрей Валентинович

Выводы

1. Сформулирована и обоснована концепция гистотипической стимуляции репарации тканевых повреждений. Экспериментально обоснована эффективность применения аллогенных тканевых и клеточных трансплантатов. Гистотипическое восстановление эпителиальных или мезенхимных дефектов происходит под действием аллогенных трансплантаов по единым механизмам.

2. Экспериментально найдено, что сущность процесса заключается во временном приживлении аллогенного трансплантата с последующей стимуляцией синтеза компонентов внеклеточного матрикса, экспрессией факторов роста, активацией пролиферации клеток реципиента, нормализации воспалительного процесса, что приводит к гистотипическому восстановлению дефектов.

3. Разработан ряд технологий, а также типов клеточных и тканевых трансплантатов для восстановления различных эпителио-мезенхимных дефектов, в частности, глубоких ожогов, длительно незаживающих ран, язв, свищей, дефектов гортани, поражений роговицы, конъюнктивы.

4. Разработана и исследована модель регенерации эпидермиса в культуре. Впервые показана возможность 80% обогащения субпопуляции базальных кератиноцитов рбЗ содержащими клетками. Впервые показана экспрессия нестина базальными кератиноцитами в культуре, что свидетельствует о пластичности фенотипа этих клеток. Показана способность эпидермального фактора роста задерживать стратификацию кератиноцитов.

5. Изучены морфогенетические процессы в культуре эпидермальных кератиноцитов. Впервые обнаружен и исследован феномен направленной миграции колоний кератиноцитов в культуре, доказана его связь с пролиферацией клеток в колонии.

6. В модели контракции коллагенового геля клетками кожи in vitro показано кооперативное воздействие на контракцию фибробластов и кератиноцитов. Показана способность клеток вступать в дистантные взаимодействия в процессе контракции.

7. Разработаны оригинальные технологии культивирования и трансплантации клеток кожи на поверхности микроносителей, открывающие возможность криоконсервирования клеточного трансплантата. Методически и технологически обосновано создание первого в России банка кожных клеточных трансплантатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из наиболее перспективных и результативных направлений современной биомедицины является тканевая инженерия. С успехами именно этой области связывают сегодня многие надежды в решении важных социальных и медицинских проблем. Так, активно ведутся работы по воссозданию утраченных структур или функций ряда жизненно важных тканей или органов. В рутинную медицинскую практику вошли трансплантация клеток костного мозга, значительные усилия направлены на восстановление функций печени трансплантацией гепатоцитов или созданием систем «искусственная печень» Клеточные трансплантаты и биосинтетические конструкции с клеточными культурами используются сегодня для лечения инфаркта миокарда, восстановления сосудов, мочевого пузыря, лечения инсулин-зависимого диабета и т.д.

Восстановление дефектов мягких тканей и, прежде всего, кожи занимает. особо значимое место. Сегодня методы культивирования и трансплантации эпидермальных клеток распространены по всему миру. Фактически в каждом промышленно развитом государстве функционируют центры, успешно реализующие эти технологии. Параллельно с этим продолжаются работы - по совершенствованию и развитию технологий выращивания и трансплантации клеток.

Уникальностью кожи как объекта тканевой инженерии является единство структуры и функции этого органа. Именно поэтому для восстановления дефектов кожи необходимы технологии, приводящие к восстановлению гистотипических тканевых структур. С этой целью широко используются аутологичные клеточные трансплантаты, реже аллогенные, ксеногенные и даже химерные (смешанные аутологично-аллогенные) клеточные конструкции. Несмотря на кажущиеся очевидные преимущества, аутологичные трансплантации имеют свои значительные недостатки. Это, прежде всего, высокая затратность и технологичность, а также значительные сроки подготовки трансплантатов. Эти недостатки сводят к минимуму высокую эффективность, которая должна соответствовать этому подходу.

Использование аллогенных клеточных трансплантатов являясь, по нашему мнению, одним из основополагающих принципов тканевой инженерии, недостаточно изучено и, как следствие, недостаточно востребовано непосредственно клинической практикой.

Исследованию возможностей аллогенных трансплантаций, их воздействем на процесс восстановления дефектов, а также разработке эффективных методов тканевой инженерии посвящено данное исследование.

Культивирование клеток человека открывает уникальную возможность исследовать процессы раневого заживления в моделях in vitro. Это важно еще и потому, что различия в механизмах раневого заживления у большинства животных и человека не позволяют адекватно моделировать процессы в экспериментальной ране.

В культуре удается моделировать различные стадии раневого заживления.

В модели контракции коллагенового геля клетками кожи нам удалось показать, что ЭКЦ способны непосредственно реорганизовывать подложку, в том числе контрастировать гель.

В процессе контракции кооперативно участвуют фибробласты и кератиноциты. Взаимодействие различных типов осуществляется дистантно, по паракринному механизму, т.е. посредством растворимых медиаторов. Эти результаты противоречат общепринятому суждению, что эпителизация раны ингибирует образование рубца, а значит и контракцию. Очевидно, что ситуация сложнее и подвержена влиянию большего числа факторов.

В случае трансплантации и временного приживления выращенного аллогенного пласта на грануляционной ткани можно рассчитывать на активацию сократительной и метаболитической активностей ФБ и уменьшение площади раны за счет контракции.

Восстановление эпителия кожных покровов является актуальной проблемой, решение которой лежит в области биологических механизмов регенерации. Критическим звеном является собственно эпителизация. При нормальном течении раневого процесса глубокий тканевой дефект замещается неодермой - грануляционной тканью. Миграция эпителиальных клеток на грануляционную ткань происходит крайне медленно, не приводя к закрытию сколь - нибудь обширных тканевых дефектов.

Нами был впервые обнаружен и описан ранее не известный феномен направленной миграции in vitro значительных количеств эпителиальных клеток, объединенных в колонии. Скорость миграции порядка 20 мкм/час является весьма значительной для многослойных, многотысячных клеточных образований.

Подобная скорость описана для мигрирующего одиночного фибробласта. Активность миграции колоний коррелирует с пролиферативной активностью ЭКЦ, что характерно и для процессов in situ. Несмотря на значительную степень подобия, модель миграции ЭКЦ in vitro в значительной мере отличается от эпителизации in situ. В культуре в полной мере не реализуется программа дифференцировки ЭКЦ, выше пролиферативная активность и синхронизированность клеток. В процессе длительного культивирования осуществляется отбор наиболее пролиферативно и метаболитически активных клеток, в результате происходит соответствующее обогащение субпопуляции ЭКЦ.

Феномен миграции распространяется и на трансформированные эпителиальные клетки. Так, миграцию колоний в культуре, хотя и несколько менее выраженную, удалось выявить и у клеток эпидермоидной карциномы А-431. Однако явление не носит общего для всех эпителиев явления. Нам не удалось обнаружить миграции колоний при культивировании эпителиальных клеток роговицы глаза кролика и быка.

Хотя механизмы миграции до конца не определены, можно утверждать, что в культуре складываются условия, при которых возможна миграция стратифицированных многоклеточных эпителиальных образований. Моделирование таких'условий in vitro позволит приблизиться к управлению эпителизацией значительных тканевых дефектов.

Наличие в культуре необходимых для пролиферации и миграции клеток условий обеспечивается внесением в среду митогенов и факторов роста. В составе среды, наряду с эмбриональной сывороткой, обязательно присутствуют инсулин, изопротеринол, эпидермальный фактор роста, гидрокортизон, трансферрин и др.

Можно предположить, что для стимуляции пролиферации и миграции клеток по раневой поверхности также следует обратиться к факторам роста.

Еще одним основополагающим принципом тканевой инженерии является использование в составе тканевого трансплантата стволовых клеток (Dunnwald et al., 2001). В данном исследовании для приготовления живого кожного эквивалента использовали стволовые клетки, выделенные с помощью сортера.

Наличие стволовых клеток обеспечивает приживление и длительное функционирование трансплантата в зоне тканевого дефекта, что приводит, в конечном счете, к восстановлению его структуры. Существуют различные мнения по поводу судьбы тканевых стволовых клеток в культуре. Ряд исследователей полагает, что условия культивирования являются не пермессивными для сохранения стволовых клеток, в частности эпителиальных стволовых клеток (ЭСК). Наши данные, полученные в модели регенерации эпидермиса in vitro, говорят о сохранении ЭСК при длительных сроках культивирования. Более того, анализируя наличие стволовых клеток по манифестации рбЗ, можно говорить об обогащении популяции эпидермальных клеток клетками с высоким пролиферативным потенциалом. Это еще раз доказывает, что в культуре происходит отбор клеток по ряду признаков.

Использованная нами модель регенерации эпидермиса in vitro была разработана в 1988 году для характеристики клеточных закономерностей регенерации эпидермиса и с тех пор мало использовалась (Jensen and Bolund, 1988).

Модель является адекватной и удобной, в частности для исследования роли различных факторов в регенерации эпидермиса. Именно в этой модели нам удалось определить характер влияния ЭФР на эпидермальные клетки. Было показано, что ЭФР способен усиливать пролиферацию наиболее значимой субпопуляции эпидермальных клеток - базальных. При этом, фактор ингибирует дифференцировку и стратификацию клеток, оставляя их в базальном слое. Тем самым обработка ЭФР приводит к обогащению всей клеточной популяции эпидермиса пролиферативно активными базальными клетками, способными также к активному движению.

Модель регенерации эпидермиса in vitro открывает уникальную возможность охарактеризовать и исследовать эпидермальные стволовые клетки. Последовательное осуществление дестратификации эпидермиса с последующей его регенерацией приводит к стимуляции детерминированных клеток к дифференцировке и истощает тем самым популяцию эпителиальных клеток. Таким образом, последовательное осуществление 2 - 3-х процедур дестратификации - регенерации эпидермиса, позволяет избавиться от всех комитированных к дифференцировке клеток и получить обогащенную ЭСК культуру. Используя рбЗ как маркер, нам удалось показать, что после подобной обработки культура содержит до 80% ЭСК.

Трудно ожидать, что все рбЗ положительные клетки обладают всеми свойствами стволовых, вероятно в компартмент рбЗ содержащих клеток рекрутирована часть транзиторных клеток, но несомненно, что все они отличаются высоким пролиферативным потенциалом (Parsa et al.,1999).

Накопленные к настоящему времени данные позволяют ряду авторов утверждать, что тканевым стволовым клеткам уделяется сегодня неоправданно мало внимания (Soria, 2001).

К тканевым стволовым клеткам относят сегодня клетки костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки, стволовые клетки кожи (Toma et al., 2001)

Тканевые стволовые клетки проявляют высокую лабильность, способны проявлять плюрипотентность и именно с ними связывают сегодня надежды на значимые практические результаты.

Так, мезенхимальные стволовые клетки способны генерировать астроциты и, возможно, нейроны, после инфузии в мозг. Нейральные стволовые клетки способны давать начало мышцам, кости, меланоцитам, фибробластам (Ziller et al., 1983). Мезодермальные клетки почки способны в ходе эпителиальной трансформации образовывать почечные протоки (Herz!inger,1995).

По нашему мнению, в список тканевых стволовых клеток, несомненно, можно добавить эпителиальные клетки. Способность к самоподдержанию эпителия очевидна. Последние данные говорят о высокой пластичности эпителиальных клеток. Так, эпителиальные клетки лимба роговицы, продуцирующие нестин, способны, после трансплантации в мозг, к дифференцировке в нейральные клетки. Такой же способностью к трансдифференцировке могут обладать и ЭСК.

Перспективно исследовать трансформацию ЭСК в клетки других- типов эпителия - например, эпителий тимуса, эпителий протоков поджелудочной железы. Не менее обнадеживает возможность трансдифференцировки ЭСК в гепатоциты, (3-клетки поджелудочной железы.

В этом плане реализация технологии последовательной дестратификации-регенерации эпидермиса in vitro открывает уникальные возможности. Это, во-первых, возможность значительно (до 80%) обогащать популяцию эпидермальными клетками с высоким пролиферативным потенциалом. Во-вторых, данный методический прием позволяет синхронизировать ЭСК в периоде пролиферативного покоя. Наши исследования с использованием пролиферативного маркера Ki-67, показывает, что клетки базального слоя находятся в периодах Go и Gi.

Немаловажно, что отобранные клетки длительное время находятся в условиях культивирования, где могут подвергаться пролиферативному отбору.

Существуют предположения, что два этих обстоятельства могут иметь определяющее значение для успешной трансдифференцировки клеток (Liu et al., 2003).

Трансдифференцировка ЭСК может осуществляться как трансплантацией в соответствующее микроокружение, так и предшествующей обработкой in vitro соответствующим комплексом факторов, промотирующих направленную дифференцировку или сочетание этих двух подходов.

Использование эпидермиса как источника стволовых клеток открывает возможность аутологичных трансплантаций. Это снимает значительную часть морально-этических проблем, связанных с использованием эмбриональных стволовых клеток и делает такой подход клинически перспективным.

Однако уже сегодня существуют реальные возможности использования тканевых эквивалентов. Область применения таких искусственных тканевых конструкций значительна.

В рамках данного исследования нами разработана серия тканевых трансплантатов для восстановления различных тканевых дефектов. Применение клеточных трансплантатов для новых объектов потребовало их модификации или разработки новых способов культивирования и доставки клеток. Для создания приемлемых тканевых трансплантатов для различных типов дефектов были применены разнообразные биосинтетические конструкции. Также нами учитывались отечественные технологические и клинические условия, не позволяющие успешно реализовывать сложные процедуры. Так, нами была разработана технология культивирования, хранения и трансплантации клеток кожи (как ФБ, так и ЭКЦ) на поверхности коллагеновых микроносителей. Эта технология позволила решить целый ряд сложных технологических проблем, значительно упростить процедуру трансплантации и расширить границы ее применения. Использование МН позволяет доставлять клетки фактически в любые полости организма, избежать травматичной процедуры ферментативного открепления выращенных клеток от подложки. Одновременно решалась проблема и криоконсервирования выращенных клеток.

Непосредственно для восстановления дефектов роговицы нами была разработана оригинальная технология культивирования клеток на внутренней поверхности терапевтических контактных линз. Реализация этого технологического подхода позволила внедрить применение выращенных клеток в офтальмологическую практику.

Использование дермального (стромального) тканевого эквивалента, эпидермальных выращенных клеток имеет свои показания, однако наиболее эффективным и универсальным, позволяющим восстанавливать глубокие мезенхимно-эпителиальные дефекты, является использование трехмерного живого кожного эквивалента, представляющего собой фибробласты и ЭКЦ в комплексе с трехмерным коллагеновым матриксом. Применение такого комплекса позволяет успешно восстанавливать ткань после глубоких ожогов, трофических язв. Специальная тканевая конструкция, включающая трехмерную коллагеновую губку, импрегнированную растворимым коллагеном с фибробластами, была разработана для закрытия дефектов парадонта.

Оригинальным и эффективным было применение ЖЭК для восстановления полнослойных объемных дефектов гортани.

В ходе выполнения исследований нами была доказана высокая эффективность и технологичность применения аллогенных трансплантатов для восстановления тканевых дефектов различной этиологии. Это позволяет утверждать, что «аллогенность» тканевых трансплантатов является важным принципом тканевой инженерии, открывающим этому направлению значительные перспективы. Аллогенность предполагается и в случаях использования трансплантатов стволовых клеток, например костного мозга. Во всех случаях применения аллогенных трансплантатов не предполагается использования иммуносупрессии. Более того, ряд исследователей полагает, что применение циклоспорина, например, отрицательно сказывается на эффективности восстановления некоторых тканей.

Еще одним обстоятельством, определяющим сроки приживления клеточных трансплантатов, является их сниженная иммуногенность после длительного культивирования вне организма.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Васильев, Андрей Валентинович, Москва

1. Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы // Цитология. 1991. Т. 33. N 12. С.84-89.

2. Васильев А.В., Терских В.В. Действие эпидермального фактора роста на регенерацию эпидермиса in vitro//Доклады академии наук. 1994. Т. 334. N. 5. С. 660-661.

3. Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Терских В.В. Моделирование регенерации эпидермиса in vitro: совместное действие сыворотки и эпидермального фактора роста // Онтогенез. 1994. т.25. N. 3. С. 74-79.

4. Васильев А.В., Терских В.В., Давыдов Д.В. Способ восстановления конъюнктивальной оболочки // Патент на изобретение. 2000. 2143875.

5. Гундорова Р.А., Макаров П.В., Васильев А.В., Терских В.В., Максимов И.Б., Федоров Д.Н. Способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы//Патент на изобретение. 2001. 2173121.

6. Воротеляк Е.А., Сатдыкова Г.П., Васильев А.В., Терских В.В. Электронно-микроскопическое исследование мигрирующих колоний кератиноцитов // Известия РАН. Серия биологическая. 1996. Т. 4. С.485-489.

7. Лиознер Л.Д. Регенерация и развитие.М.: Наука, 1982.

8. Малахов С.Ф., Васильев А.В., Парамонов Б.А., Баутин Е.А., В.В.Терских. Аутотрансплантация выращенных вне организма эпидермальных кератиноцитов с целью лечения обширных ожогов // Вестник хирургии им. Грекова. 1993. 4. С. 59-62.

9. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия // М. Медицина. 1995.

10. Саркисов Д.С., Алексеев А.А., Глущенко Е.В. и др. Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении целостности кожного покрова //Вестник РАМН. 1994. Т. 6. С. 6-11.

11. Саркисов Д.С., Морозов С.С., Туманов В.П. Современная методика лечения ожоговых ран // Воен-мед. журн. 1991. N 7. С.55-56.

12. Серов В.В., Пауков B.C. Воспаление. Руководство для врачей // М. -Медицина. -1995.

13. Терских В.В., Васильев А.В. Эпидермальные кератиноциты человека и животных.Проблемы культивирования и трансплантации // Наука, Москва,1995, С.103.

14. Adams J.С., Watt F.M. Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes// Nature. 1989. V. 340. P. 307-309.

15. Adams JC, Watt FM. Changes in keratinocyte adhesion during terminal differentiation: reduction in fibronectin binding precedes alpha 5 beta 1 integrin loss from the cell surface// Cell. 1990. Oct 19. V. 63(2). C. 425-435.

16. Akhurst R.J., Fee F., Balmain A. Localized production of TGF=beta mRNA in tumour promoter=stimulated mouse epidermis //Ibid. 1988. V. 331. P. 363-365.

17. Alitalo K„ Kuismanen E., Myllyla R. et al. Extracellular matrix proteins of human epidermal keratinocytes and feeder 3T3 cells // J.Cell Biol. 1982. V. 94. N.3. P. 497-505.

18. Andersen J.L., Leder Т., Ehlers N. Keratinocyte migration and peptide growth factors: the effect of PDGF, bFGF, EGF, IGF-I, and TGF- p on human keratinocyte migration in a collagen gel. // Curr. Eye Res. 1997. V. 16. P. 605-613.

19. Anzano M.A., Roberts A.B., Smith J.M. et al. Sarcoma growth factor from conditioned medium of virally transformed cells is composed of both type a and type b transforming growth factors // Ibid. 1983. V. 80, N 20. P.6264-6268.

20. Aoyagi Т., Suya H., Kato N. et al. Epidermal growth factor stimulates release of arachidonic acid in pig epidermis // J.Invest. Dermatol. 1985. V. 84. P.168-171.

21. Arora P.D., Narani N., McCulloch C.A.G. The compliance of collagen gels regulates TGF-p induction of a-SMA in fibroblasts. //Am. J. Pathol. 1999. V. 154. P. 871 882.

22. Ashkenas J, Muschler J, Bissell MJ. The extracellular matrix in epithelial biology: shared molecules and common themes in distant phyla // Dev Biol. 1996. Dec 15. V. 180(2). P. 433-44.

23. Assoian RK, Zhu X. Cell anchorage and the cytoskeleton as partners in growth factor dependent cell cycle progression // Curr Opin Cell Biol. 1997 Feb;9(1). P. 93-8.

24. Atkin S.L., White M.C. D-Valine selective medium does not inhibit human fibroblast growth in vitro // In Vitro Cell.Develop.Biol. 1993. V. 29A. P. 912-913.

25. Aubock J., Irschick E., Romani N. et al. Rejection, after a slightly prolonged survival time, of Langerhans cell-free allogeneic cultured epidermis used for wound coverage in humans // Transplantation. 1988. V. 45. N 4. P. 730-737.

26. Bagutti C, Wobus AM, Fassler R, Watt FM. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: comparison of wild-type and beta 1 integrin-deficient cells // Dev Biol. 1996. V. 179(1). P. 184-96.

27. Baldwin W.M., Cohen N. Hrapchak D.V. Prolonged survival of murine skin grafted across a weak histocompatability barrier as a function of skin grafting technique//Transplantation. 1973. V. 15. P. 419-422.

28. Banks-Schlegel S., Green H. Formation of epidermis by serially cultivated epidermal cells transplanted as an epithelium to athymic mice // Ibid. 1980. V. 29, N. 4. P. 308-313.

29. Barrandon Y., Green H. Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 53905394.

30. Barrandon Y. and Green H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1987a. V. 84. P. 2302-2306.

31. Barrandon Y., Green H. Cell migration is essential for sustained growth of keratinocyte colonies: The roles of transforming growth factor a and epidermal growth factor//Cell. 1987b. V. 50. N .7. P. 1131-1137.

32. Basham T.Y., Nickoloff B.J., Merigan T.C., Morhenn V.B. Recombinant gamma interferon induces HLA-DR expression on cultured human keratinocytes // J.Invest.Dermatol. 1984. V. 83. P.88-91.

33. Bashkin P., Doctrow S., Klagsbrun M. et al. Basic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparinase and heparin-like molecules // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1737-1743.

34. Batova A., Pirisi L., Greek K.E. Retinoic acid induces the secretion of transforming growth factor=beta in cultured human keratinocytes // FASEB J. 1990. V. 4, N. 7. P.1990.

35. Beele H, Naeyaert JM, Goeteyn M, De Mil M, Kint A. Repeated cultured epidermal allografts in the treatment of chronic leg ulcers of various origins // Dermatologica. 1991. V. 183(1). P. 31-5.

36. Bell E., Ehrlich H.P., Sher S. et al . Development and use of a living skin equivalent//J.PIastic and Reconstruct. Surg. 1981. V. 67. N. 3. P. 386-392.

37. Bell E., Rosenberg M. The commercial use of cultivated human cells // Transplant. Proc. 1990. V. 22. N. 3. P. 971-974.

38. Benathan M., Frenk E. Interaction between melanocytes and fibroblasts in vitro //J.Invest. Dermatol. 1989. V. 92. N. 3. P.401A.

39. Berman В., Smith B. Trypsin inhibitors inhibit induction by interferons of HLA-DR antigen expression on human skin cells // Exp. Cell Res. 1989. V. 183. N. 1. P. 215-228.

40. Bianco P., Robey P. Stem cells in tissue engineering // Nature. 2001. V. 414. P. 118-121.

41. Bickenbach J.R. Identification and behaviour of label-retaining cells in oral mucosa and skin//J. Dent. Res. 1981. V. 60. P. 1611-1620.

42. Bickenbach J.R. and Mackenzie I.C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia // J. Invest. Dermatol. V. 82. P. 618-622.

43. Bickenbach J.R., McCutecheon J., MacKenzie I.C. Rate of loss of tritiated thymidine label in basal cells in mouse epithelial tissues // Cell Tissue Kinet. 1986. V. 19. P. 325-333.

44. Billingham R.E. Reynolds J. Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions // Brit.J.PIast.Surg. 1952. V. 5, N. 1. P. 25-36.

45. Birchmeier C., Gherardi E. Developmental roles of HGF/SF and its receptor, the c-Met tyrosine kinase // Trends in Cell Biology. 1998. V. 8. P. 404 410.

46. Bjerknes M., Cheng H., Erlandsen S. Functional gap junctions in mouse small intestinal crypts// Anat. Rec. 1985. V. 212. P. 364-367.

47. Bohnert A., Hormung J., Mackenzie J.C., Fusenig N.E. Epithelial=mesenchymal interactions control basement membrane production and differentiation in cultured and transplanted mouse keratinocytes // Cell and Tissue Res. 1986. V. 244. N. 2. P. 413-429.

48. Bolivar=Flores J., Poumian E., Marsch=Moveno G. et al. Use of cultured human epidermal keratinocytes for allografting burns and conditions for temporary banking of the cultured allografts // Burns. 1990. V. 16. N. 1. P. 3-8.

49. Border W.A., Noble N.A., Yamamoto T. et al. Antagonists of transforming growth factor-p: A novel approach to treatment of glomerulonephritis and prevention of glomerulosclerosis. // Kidney Int. 1992. V. 41. P. 566-570.

50. Borowy-Borowski H., Lipman R., Tomasz M. Recognition between mitomycin С and specific DNA sequences for cross-link formation // Biochemistry. 1990. V. 29. P.2999-3006.

51. Bottaro D.R., Rubin J.S., Ron D.et al. Characterization of the receptor for keratinocyte growth factor: Evidence for multiple fibroblast growth factor receptors // J.Biol.Chem. 1990. Vol.265, N 22. P. 12767-12770.

52. Boudreau N., Noble N.A., Yamamoto T. et al. Antagonists of transforming growth factor-P: A novel approach to treatment of glomerunephritis and prevention of glomerulosclerosis // Kidney Int. 1992. V. 41. P. 566-570.

53. Boudreau N., Werb Z., and Bissel M.J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three-dementional tissue organization and withdrawal from the cell cycle// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 3509-3513.

54. Boyce S.T., Ham R.G. Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media // J.Tissue Cult. Meth. 1985. V. 9. N. 2. P. 83-93.

55. Boyce S., Warden G. Principles and practices for treatment of cutaneous wounds with cultured skin substitutes // The American Journal of Surgery. 2002. V. 183. P. 445-456.

56. Breitkreutz D., Bohnert A., Herzmann E. et al. Differentiation specific functions in cultured and transplanted mouse keratinocytes: Environmental influences on ultrastructure and keratin expression // Differentiation. 1984. Vol.26, N 2. P. 154-169.

57. Brown G.L., Curtsinger L.J., White M. et al. Acceleration of tensile strength of incisiors treated with EGF and TGF-beta //Ann.Surg. 1988. V. 208. P. 788-794.

58. Buckley A., Davidson J.M., Kamerath C.D., Woodward S. Epidermal growth factor increases granulation tissue formation dose dependently // J.Surg.Res. 1987. Vol.43. P.322-328.

59. Burridge K, Fath K, Kelly T, Nuckolls G, Turner C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton // Annu Rev Cell Biol. 1988. V. 4. P. 487-525.

60. Carney S.A. Generation of autograft; the state of the art // Burns. 1986. V. 12. N. 4. P. 231-235.

61. Carter W.G., Ryan M.C., Gahr P.J. Epiligrin, a new cell adhesion ligand for integrin аЗЫ in epithelial basement membranes// Cell. 1991. V. 65. V. 599-610.

62. Carter W.G., Wayner E.A., Bouchard T.S., Kaur P. The role of integrins а2Ы and аЗЫ in cell-cell and cell-substrate adhesion of human epidermal cells. J. Cell Biol. 1990. V. 110. P. 1378-1404.

63. Castagnoli C., Trombotto C.f Ariotti S., Millesimo M., Ravarino D., Magliacani G., et al. Expression and role of IL-15 in post-burn hypertrophic scars. 1999. J.lnvest.Dermatology. V. 113. P. 238-245.

64. Chen Q., Kinch M.S., Lin Т.Н., Burridge K., Juliano R.L. Integrin-mediated cell adhesion activates mitogen-activated protein kinases //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 26602-26605.

65. Chen W.Y., Tseng S.C. Differential intrastromal invasion by normal ocular surface epithelia is mediated by different fibroblasts/ Exp. Eye Res. V. 61. P. 521534.

66. Chin M.L., O'Keefe E.J. Placental keratinocyte growth factor: partial purification and comparison with epidermal growth factor // Arch.Biochem. and Biophys. 1989. V. 269. N. 1. P. 75-81.

67. Clancy J.M.P., Shehade S.A., Blight A.E. et al . Treatment of leg ulcers with cultured epithelial grafts //J.Amer.Acad.Dermatol. 1988. V. 18. P. 1356-1357.

68. Clarke J.A., Burt A.M., Eldad A. Cultured skin for burn injury// Lancet. 1986. N. 8506. P. 809-812.

69. Cobb B.S., Schaller M.D., Leu Т.Н., and Parsons J.T. Stable association of pp60src and pp59fyn with the focal adhesion-associated protein tyrosine kinase, pp125 FAK // Mol.Cell.Biol. 1994. V. 14. V. 147-155.

70. Coffey R.J., Derynck R., Wilcox J.N., Bringman T.S., Goustin A.S., Moses H.L., Pittelkow M.R. Production and autoinduction of transforming growth factor-a in human keratinocytes // Nature. 1987. V. 328. P. 817-820.

71. Coffey R.J., Bascom C.C., Sipes N.J. et al. Selective inhibition of growth=related gene expression in murine keratinocytes by transforming growth factor b // Mol. and Cell. Biol. 1988a. V. 8. N. 8. P. 3088-3093.

72. Coffey R.J., Sipes N.J., Bascom C.C. et al. Growth modulation of mouse keratinocytes by transforming growth factors//Cancer Res. 1988b. V. 48. N. 6. P. 1596-1602.

73. Collins M.K.L., Perkins G.R., Rodriguez=Tarduchy G. et al. Growth factors as survival factors: Regulation of apoptosis // Bio Essays. 1994. V. 16. N. 2. P. 133-138.

74. Collins M.K.L., Sinnett-Smith J.W., Rozengurt E. Platelet=derived growth factor treatment decreases the affinity of the epidermal growth factor receptors of Swiss 3T3 cells//J.Biol.Chem. 1983. V. 258. P. 11689-11693.

75. Compton C.C. Current concepts in pediatric burn care: The biology of cultured epithelial autografts: an eight=year study in pediatric burn patients // Europ.J. Pediat .Surg. 1992. V. 2. P. 216-222.

76. Compton C.C., Gill J.M., Bradford D.A. et al. Skin regeneration from cultured epithelial autografts on fulNhickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting // Lab.lnvest. 1989. V. 60. N. 5. P. 600-612.

77. Compton C.C., Reganer S., Seiler G.R., Landry D.B. Human Merkel cells regeneration in skin derived from cultured keratinocyte growth // Ibid. 1990. V. 62. P. 233-241.

78. Compton C., Tong Y., Trookman N., Zhao H., Roy D. TGF-Ы gene expression in cultured human keratinocytes does not decrease with biologic age // J.Invest. Dermatol. 1994. Vol.103, N 1. P.127-133.

79. Cook H., Stephens Ph., Davies J.K. et al. Defective ECM reorganization by chronic wound fibroblasts is associated with alterations in TIMP-1, TIMP-2 and MMP-2 activity. // J. Invest. Dermatol. 2000. V. 115. P. 225 233.

80. Coraux C., Hilmi C. , Rouleau M.( Spadafora A., Hinnrasky J., Ortonne J.P., Dani C., Aberdam D., Reconstituted skin from murine embryonic stem cells // Current Biology. 2003. V. 13. P. 849-853.

81. Cotsarelis G., Sun T.-T., Lavker R.M. Label-retaining cells reside in the bulge of the pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis//Cell. 1990. V. 61. P. 1329-1337.

82. Coulomb В., Dubertret L. Skin cell culture and wound healing //Wound repair and regeneration. 2002. V. 10, N. 2. P. 109-112.

83. Coulomb В., Lebreton C., Dubertret L. Influence of human dermal fibroblasts on epidermalization //J. Invest. Dermatol. 1989. V. 92. N. 1. P. 122-125.

84. Cuono C.B., Langdon R., McGuire J. Use of cultured epidermal autografts and dermal allografts as skin replacement after burn injury // Lancet. 1986. V. 1. P. 11231124.

85. Curran S.f Murray G.I. Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis. // Euro. J. Cancer. 2000. V. 36. P. 1621 -1630.

86. Damsky C.H. and Werb Z. Signal transduction by integrin receptors for extracellular matrix: cooperative processing of extracellular information // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. V. 4. P. 772-781.

87. Daniels J.T. and Khaw P.T. Temporal stimulation of corneal fibroblast wound healing activity by differentiating epithelium in vitro // Invest.Ophtalmol.Visual Sci. 2000. V. 41. P. 3754-3762.

88. Dedovic Z., Koupilovia I., Suchanek I. Keratinocytes as biological dressing in the treatment of partial-thickness burns in children // Annais of Burns and Fire Disasters. 1998. V.XI. № 11. P.37-40.

89. Defize L.H.K., Boonstra J., Meisenhelder J. et al. Signal transduction by epidermal growth factor occurs through the subclass of high affinity receptors // J.Cell Biol. 1989. V. 109, N 5. P. 2495-2507.

90. Delvoye P., Pierard D., Noel A. et al. Fibroblasts induce the assembly of the macromolecules of the basement membrane //J.Invest. Dermatol. 1988. V. 90. N. 3. P. 276-282.

91. De Luca M., Albanese E., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium fresh or preserved in a frozen state// Burns. 1989. V. 15. N. 5. P. 303-309.

92. Dhawan J., and Farmer S.R Regulation of a1(l)-collagen gene expression in response to cell adhesion in Swiss 3T3 fibroblasts // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 9015-9021.

93. Dhawan J., Lichtler A.C., Rowe D.W., and Farmer S.R. Cell adhesion regulates pro-a1(l) collagen mRNA stability and transcription in mouse fibroblasts // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 8470-8475.

94. Doran T.J., Vidrich A., Sun T.=T. Intrinsic and extrinsic regulation of the differentiation of skin, corneal and esophageal epithelial cells // Cell. 1980. V. 22. N.1. P. 17-25.

95. Dotto G.P., Gilman M.Z., Maruyama M., Weinberg R.A. C=myc and c=fos expression in differentiating mouse primary keratinocytes // EMBO J. 1986. V. 5. N1.. P. 2853-2857.

96. Dover R., Watt F.M. Measurement of the rate of epidermal terminal differentiation: expression of involucrin by S phase keratinocytes in culture and in psoriatic plaques // J.Invest.Dermatol. 1987. V. 89. P. 349- 354.

97. Dunnwald M., Tomanek-Chalkley A., Altxandrunas D., Fishbaugh J., Bickenbach J. Isolation a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering // Exp.DermatoIogy. 2001. V. 10. P. 45-54.

98. Earp H.S., Austin K.S., Blaisdell J. et al. Epidermal growth factor (EGF) stimulates EGF receptor synthesis // J.Biol.Chem. 1986. V. 261. N. 11. P. 47774780.

99. Eckert RL, Crish JF, Robinson NA. The epidermal keratinocyte as a model for the study of gene regulation and cell differentiation // Physiol Rev. 1997. Apr. 77(2). P. 397-424.

100. Eisinger M. Regeneration of epidermis by cells grown in tissue culture // J.Amer.Acad.Dermatol. 1985. V. 12. N. 2. P.402-408.

101. Eldad A., Burt A., Clarke J.A., Gurterson B. Cultured epithelium as a skin substitute//Burns. 1987. V.13. N. 3. P. 173-180.

102. Elder J.T., Fisher G.J., Lindquist P.B. et al. Overexpression'of transforming growth factor a in psoriatic epidermis // Science. 1989. V. 243. N. 4892. P. 811814.

103. Evans С.В., Pillai S., Goldyne M.E. Endogenous prostaglandin E2 modulates calium-induced differentiation in human skin keratinocytes // Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 1993. V. 49. N. 4. P. 777-781.

104. Fan J.M., Huang X.R., N'g Y.Y. et al. IL-1 induces tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation through a TGF-Pi dependet mechanism in vitro // Am. J. Kidney Dis. 2001. V. 37. P. 820 - 831.

105. Fang K.S., Farboud В., Nuccitelly R., Isseroff R.R. Migration of human keratinocytes in electric fields requires growth factors and extracellular calcium // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 111. P. 751-756.

106. Finch PW, Rubin JS, Miki T, Ron D, Aaronson SA. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth // Science. 1989. Aug 18. V. 245(4919). P. 752-5.

107. Flaxman B.A., Harper R.A. Organ culture of human skin in chemically defined medium //J. Invest. Dermatol. 1975. V. 64, P. 96-99.

108. Fleckman P., Langdon R., McGuire J. Epidermal growth factor stimulates ornithine decarboxylase activity in culture mammalian keratinocytes // J.lnvest.Dermatol. 1984. V. 82. P.85-89.

109. Fleckman P., Dale B.A., Holbrook K.A. Profilaggrin, a high-molecular -weight precursor of filaggrin in human epidermis and cultured keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1985. V. 85. P. 507-512.

110. Fleischmajer R., Contard P., Schwartz E., MacDonald II E.D., Jacobs II L., Sakai L.Y. Elastin-associated microfibrils (10 nm) in three-dimentional fibroblast culture //J. Invest Dermatol. 1991. V. 97. P. 638-643.

111. Folkman J., Klagsbrun M., Sasse J. et al. A heparin-binding angiogenic protein basic fibroblast growth factor - is stored within basement membrane // Amer.J.Pathol. 1988. V.130. P.393-400.

112. Franke W.W., Cowin P., Schmelz M., Kapprell H.P. The desmosomal plaque and the cytoskeleton. 1987. CIBA Found. Symp. 1987. V. 125. P. 26-48.

113. Franzi A.T., D'Anna F., Zica Z., and Trabucchi E. Histological evaluation of human cultured epithelium before and after grafting // Burns Suppl.1. 1992. V. 18. 26S-31S.

114. Frisch S.M., Francis H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis //J.Cell Biol. 1994. 124. P. 619-626.

115. Fusenig N.E., Worst P.K.M. Mouse epidermal cell cultures. 2. Isolation characterization and cultivation of epidermal cells from perinatal mouse skin // Exp. Cell Res. 1975. V. 93, N. 2. P. 443-457.

116. Fuchs E., Green H. Regulation of terminal differentiation of the keratinocyte // Cell. 1980. V.19. P. 1033-1042.

117. Fuchs E., Weber К. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease//Annual Rev. Biochem. 1994. V. 64. P. 345-382.

118. Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Mann M.M. et al. Proteoglycan expression during TGF-p-induced keratocyte-myofibroblast transdifferentiation // JBC. 2001. in press. Manuscript 107596200.

119. Fusenig N.E. Epithelial-mesenchymal interactions regulate keratinocyte growth and differentiation in vitro// In: The keratinocyte Handbook. 1994. P. 71-94. Ed: I.Leigh,B.Lane, F.Watt. Cambridge University Press.

120. Gailit J, Clark RA. Wound repair in the context of extracellular matrix // Curr Opin Cell Biol. 1994. Oct;6(5), P. 717-25.

121. Gallico G.G., O'Connor N.E. Cultured epithelium as a skin substitute // Clinics Plast. Surg. 1985. V.12. N. 2. P.149-157.

122. Gallico G.G., O'Connor N.E., Compton C.C. et al. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium // New Engl.J.Med. 1984. V. 311. N. 7. P. 448-454.

123. Gardner H., Broberg A., Pozzi A., Laato M., Heino J. Absence of integrin a1b1 in the mouse causes loss of feedback regulation of collagen synthesis in normal and wounded dermis. // J. Cell Science. 1999. V. 112. P. 263-272.

124. Germain L., Ronabhia M., Guighard R. et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin // Burns. 1993. V.19. N. 2. P. 99104.

125. Ghahary A., Marcoux Y., Karimi-Busheri F., Tredget E.E. Keratinocyte differentiation inversely regulates the express involucrin and transforming growth factor betal //J.Cell.Biochem. 2001. V. 83 (2). P. 239-248.

126. Ghazizdeh S. and Taichman L.B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epitheliunra lineage of adult mouse skin // EMBO Journal. 2001. V.20.№ 6. P.1215-1222 .

127. Gibbs S., E.Boelsma, J.Kempenaar, M.Ponec, Temperature-sensitive regulation of epidermal morphogenesis and the expression of cornified envelope precursors by EGF and TGFa // Cell Tissue Res. 1998. V. 292. P. 107-114.

128. Gilbert S.F., Migeon B.R. D=valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture // Cell. 1975. V. 5. P. 11-17.

129. Gielen V., Faure M., Mauduit G., Thivolet J. Progressive replacement of human cultured epithelium allograft by recipient cells as evidence by HLA class I expression // Dermatologica. 1987. V. 175. P. 166-170.

130. Gilchrest B.A., Marshall W.L., Karassik R.L. et al. Characterization and partial purification of keratinocyte growth factor from the hypothalamus // Ibid. 1984. V. 120. N. 3. P. 377-383.

131. Glenn F.R., Yanagihara D., Klopchin K. et al., Stimulation of all epithelial elements during skin regeneration by keratinoyte growth fator// J. Exper. Med. 1994. V. 179, P. 831-840.

132. Glick A.B., Flanders K.C., Danielpour D. et al. Retinoic acid induces transforming growth factor b 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis // Cell Regulation. 1989. V. 1. N. 1. P. 87-97.

133. Gordon M.J., Riley G.P., Watt S.M., Greaves M.F. Copmartmentalization of a haematopoietic growth factor (GM=CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow microenvironment // Nature. 1987. V. 326. N. 6111. P. 403-405.

134. Gordon P.В., Choi H.U., Conn G. et al. Extracellular matrix heparan sulfate proteoglycans modulate the mitogenic capacity of acidic fibroblast growth factor // J.Cell. Physiol. 1989. V. 140. N 3. P. 584-592.

135. Gordon P.R., Mawhinney T.P., Gilchrest B.A. Inositol is a required nutrient for keratinocyte growth //J.Cell. Physiol. 1988. V. 135. P. 416-424.

136. Gormar F.E., Bernd A., Bereiter=Hahn J., Holzman H. A new model of epidermal differentiation: Induction by mechanical stimulation // Arch. Dermatol. Res. 1990. V. 282. P.22-32.

137. Green H. Terminal differentiation of cultured human epidermal cells // Cell. 1977. V. 11. P. 405-416.

138. Green H. Cyclic AMP in relation to proliferation of the epidermal cell: a new view//Ibid. 1978. V. 15. P. 801-811.

139. Green H. The keratinocyte as differentiated cell type //Harvey Lectures. 1980. V.74. P. 101-139.

140. Green H. Regeneration of the skin after grafting of epidermal cultures // Lab.lnvestig. 1989. V. 60. N.5. P. 583-584.

141. Green H., Kehinde O., Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting // Proc.Nat.Acad.Sci. US. 1979. V. 76. P. 5665-5668.

142. Greenhalgh D.G. The role of apoptosis in wound healing // Intern. J. Biochem. Cell Biol. 1998. V. 30. P. 1019-1030.

143. Greif F., Soroff H.S., Setzer R.W., Taichman L.B. The effect of growth=promoting agents on replication and cell cycle withdrawal in cultures of epidermal keratinocytes // In Vitro. 1988. V. 24. P. 985-989.

144. Griffiths C.E.M., Voorhees J.J., Nickoloff B.J. Gamma interferon induces different keratinocyte cellular patterns of expression of HLA-DR and DQ andintercellular adhesion molecule-l (ICAM-I) antigens // Brit. J.Dermatol. 1989. V. 120. P. 1-8.

145. Grinnell F. The activated keratinocyte: Upregulation of cell adhesion and migration during wound healing // J. Trauma. 1990. V.30. S144-S149.

146. Grinnell F. Fibroblast-collagen-matrix contraction: growth-factor signaling and mechanicalloading //Trends Cell Biol. 2000. V. 10(9). P. 362-365.

147. Gross M., Furstenberger G., Marks F. Isolation, characterization, and in vitro cultivation of keratinocyte subfractions from adult NMRI mouse epidermis: Epidermal target cells for phorbol esters // Ibid. 1987. V. 171. N. 2. P. 460-474.

148. Grotendorst G.R., Soma Y., Takehara K., Charette M. EGF and TGF-alpha are potent chemoattractants for endothelial cells and EGF-like peptides are present at sites of tissue regeneration //J. Cell.Physiol. 1989. V. 139. N. 3. P. 617-623.

149. Guibaud J. Problems created by the use of cultured epithelia // Ann.Medit. Burns Club. 1993. V. 6, N. 2. P. 176-178.

150. Gunn J.M., Bodner J.В., Knowles S.E., Ballard F.J. Inhibition of protein breakdown by epidermal growth factor in JMR90 human fibroblasts and other mammalian cell lines // Biochem.J. 1983. V. 210. N. 1. P. 251-258.

151. Gunn J.L., Shallaway D. Regulation of focal adhesion associated protein tyrosine kinase by both cellular adhesion and oncogenic transformation //Nature. (Lond.). 1992. V. 358. P. 690-692.

152. Gusterson B.A., Edwards P.A.W., Foster C.S., Neville A.M. The selective culture of keratinocytes using a cytotoxic antifibroblast monoclonal antibody // Brit.J.Dermatol. 1981. V. 105. P. 273-277.

153. Haake A.R., Lane A.T. Retention of differentiated characteristics in human fetal keratinocytes in vitro // In Vitro Cell.Develop.Biol. 1989. V. 25. N. 7. P. 592600.

154. Hafemann В., Frese C., Kistler D., Hettich R. Intermingled skin grafts with in vitro cultured keratinocytes experiments with rats // Burns. 1989. V. 15. N. 4. P. 233-238.

155. Hakkinen L.,Koivisto L.,Larjava H., An improved method for culture of epidermal keratinocytes from newborn mouse skin // Methods Cell Sci. 2001. V. 23(4). P. 189-96

156. Halaban R., Langdon R., Birchall N. et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes // J.Cell Biol. 1988. V. 107. N. 4. P.1611-1619.

157. Halfter W., Liverani D., Vigny M., Monard D. Deposition of extracellular matrix along the pathways of migrating fibroblasts // Cell and Tissue Res. 1990. V. 262. N. 3. P. 467-481.

158. Hall P.A. and Watt F.M. Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity// Development. 1989. V. 106. P. 619-633.

159. Han Y.-P., Tuan T.-L., Wu H. et al. TNF-a stimulates activation of pro-MMP2 in human skin through NF-кВ mediated induction of MT1-MMP. // J. Cell Science. 2001. V. 114. P. 131-139.

160. Hancock K., Hackett M.E. Skin equivalents // Lancet. 1989. V. 2. N. 8660. P.440.

161. Hashiro M., Matsumoto K., Okumura H. et al. Growth inhibition of human keratinocytes by antisense c-myc oligomer is not coupled to induction of differentiation // Biochem. and Biophys.Res.Commun. 1991. V. 174. N. 1. P. 287292.

162. Hebda P.A. Stimulatory effects of transforming growth factor-beta and epidermal growth factor on epidermal cell outgrowth from porcine skin explant cultures// Ibid. 1988. V. 91. N. 5. P. 440-445.

163. Heenen M., De Graef Ch.f Galand P. Kinetics of the calcium induced stratification of human keratinocytes in vitro // Cell Prolif. 1992. V. 25. P. 233-240.

164. Hefton J.M., Amberson J.B., Biozes D.C., Weksler M.E.Human epidermal cells no longer stimulate allogenic lymphocytes after growth in culture // J.lnvest.Dermatol. 1981. V .76, N 4. P. 308-309.

165. Hefton J.M., Amberson J.В., Biozes D.G., Weksler M.E. Loss of HLA-DR expression by human epidermal cells after growth in culture // Ibid. 1984. V. 83. P. 48-50.

166. Hefton J.M., Caldwell D.f Biozes D.et al. Grafting of skin ulcers with cultured autologous epidermal cells // J.Amer.Acad.Dermatol. 1986. V.14, N. 3. P. 399-405.

167. Hefton J.M., Finkelstein J., Madden M.R., Shires G.T. Grafting of burn patients with allografts of cultured epidermal cells // Lancet. 1983. V. 2. N. 8347. P. 428-430.

168. Hennings H., Michael D., Cheng C. et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture // Cell. 1980. V. 19. N. 1. P. 245254.

169. Hertfe M.D., Adams J.C., Watt F.M. Integrin expression during human epidermal development in vivo and in vitro // Development .1991. V. 112. P. 193206.

170. Hershko A., Mamout P., Shields R., Tomkins G.M. Pleiotypic response //Nature.New Biol. 1971. V. 232, N. 33. P. 206-211.

171. Herzog S.R., Meyer A., Woodley D., Peterson H.D. Wound coverage with cultured autologous keratinocytes: Use after burn wound excision including biopsy follow up//J. Trauma. 1988. V. 28. N. 2. P. 195-198.

172. Hibbs R.G., Clark W.H. Electron microscope studies of the human epidermis. The cell boundaries and topography of the stratum malpighi // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1959. V. 6. P. 71-76.

173. Hinz В., Celetta G., Tomasek J.J., Gabbiani G. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 2730-2741.

174. Hodges G.M., Livingston D.C., Franks L.M. The localization of trypsin in cultured mammalian cells //J.Cell Sci. 1973. V. 12. P. 887-902.

175. Horwitz A., Duggan E., Buck C., Beckerle M.C., Burridge K. Interaction of plasma membrane fibronectin receptor with talin a transmembrane linkage// Nature (Lond.). 1986. V. 320. P. 531-533.

176. Hotchin N.A., Gandarillas A., Watt F.M. Regulation of cell surface Ы integrin levels during keratinocyte terminal differentiation // J. Cell Biol. 1995. V. 128. P. 1209-1219.

177. Hotchin N.A., Kovach N.L., Watt F.M. Functional down-regulation of а5Ы integrin in keratinocytes is reversible but commitment to terminal differentiation is not //J. Cell Sci. 1993. V. 106. P. 1131-1138.

178. Hotchin N.A., Watt F.M. Transcriptional and post-transcriptional regulation of Ы integrin expression during keratinocyte terminal differentiation // J.Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1452-1458.

179. Housinger T.A., Warden G.D., Lag D., Visse M., Pohlman S. The use of sheet skin grafts in pediatric burn patients. Proc. Amer. Burn. Assn. 1991. V.23: 32. (Abstr.)

180. Hynes R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion // Cell. 1992. V. 69(1). P. 11-25.

181. Jaken S, Leach K, Klauck T. Association of type 3 protein kinase С with focal contacts in rat embryo fibroblasts // J Cell Biol. 1989. Aug; 109(2). P. 697-704.

182. Jensen U.B., Lowell S., and Fiona Watt The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis // Development. 1999. V. 126. P. 24092418.

183. Jensen P.K.A., Therkelsen A.J. Cultivation at low temperature as a measure to prevent contamination with fibroblasts in epithelial cultures from human skin И J.Invest.Dermatol. 1981. V. 77. N. 2. P. 210-212.

184. Jinno Y., Merlino G.T., Pastan I. A novel effect of EGF on mPNA stability II Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. N. 11. P. 4957-4966.

185. Jones P.H., Harper S., Watt F.M. Stem cell patterning and fate in human epidermis // Cell. 1995. V. 80. P. 83-93.

186. Jones P.H., Watt F.M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression // Cell. 1993. V. 73. P. 713-724.

187. Juliano R.L., Haskill S. Signal transduction from the extracellular matrix// J. Cell Biol. 1993. V. 120. P. 577-585.

188. Kaiser S., Schirmacher P., Philipp A. et al. Induction of Bone Morphogenetic Protein 6 in skin wounds. Delayed re-epithelialization and scar formation in BMP-6 overexpressing transgenic mice. // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 111. P. 1145-1152.

189. Kaiser H.W., Stark G.B., Kopp J. et al. Cultured autologous keratinocytes in fibrin glue suspension, exclusively and combined with STS-allograft (preliminary clinical and histological report of a new technique) // Burns. 1994. V. 20. N. 1. P. 23-29.

190. Kane C.J.M., Knapp A.M., Mansbridge J.N., Hanawalt P.C. Transforming growth factor-Ы localization in normal and psoriatic epidermal keratinocytes in situ // J.Cell.Physiol. 1990. V. 144. P. 144-150.

191. Kanoza R.I.J., Brunette D.M., Purdon A.D., Soden J. Isolation and identification of epithelial=like cells in culture by collagenase=separation technique // In Vitro. 1978. V. 14. P. 746-753.

192. Karasek M.A. In vitro culture of human skin epithelial cells //J.lnvest.Dermatol. 1966. V. 47. N. 6. P. 533-537.

193. Karasek M.A. Growth and differentiation of transplanted epithelial cell cultures//J.lnvest.Dermatol. 1968. V. 51. N. 4. P. 247-252.

194. Karasek M.A. Culture of human keratinocytes in liquid medium 11 J.Invest. Dermatol. 1983. V. 81. 24s-28s.

195. Khalfan H.A., HamzaA., Saeed T. et al. Novel method of skin substitution in plastic surgery // Burns. 1989. V. 15. N. 5. P. 335-337.

196. Khire J., Das M. EGF stimulates the processing and export of a secreted form of EGF receptor //FEBS Lett. 1990. V. 272. N. 1,2, P. 69-72.

197. Khouw I.M.S.L., Van Wachem P.B., Plantinga J.A. et al. TGF-p and bFGF affect the differentiation of proliferating porcine fibroblasts into myofibroblasts in vitro. U Biomater. 1999. V. 20. P. 1815 1822.

198. Kirsner R.S., Falanga V., Kerdel F.A., Katz M.H., Eaglstein W.H. Skin grafts as pharmacological agents: pre-wounding of the donor site // Br. J. Dermatol. 1996. V. 135. P. 292-296.

199. Kirchhofer D., Reinhardt C.A., Zbiden G. Collagen synthesis in growing human skin fibroblasts // Exp. Cell Biol. 1986. V. 54. P. 177-182.

200. Klagsbrun M. Bovine colostrum supports the serum=free proliferation of epithelial cells but not of fibroblasts in long=term culture // J. Cell Biol. 1980. V. 84. P. 808-814.

201. Klagsbrun M, Baird A. A dual receptor system is required for basic fibroblast growth factor activity // Cell. 1991. V. 67(2). P. 229-31.

202. Klareskog L., Malmnas Tjernlund U., Forsum UM Peterson P.A. Epidermal Langerhans cells express la antigens // Nature. 1977. V. 268, N. 5617. P. 248-250.

203. Kobayashi H., Yasudo H., Ohkawara A., Dosaka H., Ogiso Y., Kuzumaki N. Enhanced expression of ras gene products in psoriatic epidermis // Arch.Dermatol.Res. 1988. V. 280. P. 259-263.

204. Kornberg L., Earp H.S., Parsons J.T., Schaller M., and Juliano R.L. Cell adhesion or integrin clustering increases phosphorylation of a focal adhesion-associated tyrosine kinase // J.Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 23439-23442.

205. Krohn P.L. Review lectures on senescence.il. Heterochronic transplantation in the study of ageing // Proc. Roy. Soc. Ser.B. 1962. V. 157. P. 128-147.

206. Krupp S., Wiesner L., Krstic R. et al. Mid=term results with cultured epidermal autografts, allogenic skin transplants and cyclosporin A medication // Burns. 1994. V. 20. N. 1. P. 15-20.

207. Kulessa H., Turk G., HoganB. Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6664-6674.

208. Kumagai N., Nishina H., Tanabe H. et al. Clinical application of autologous cultured epithelia for the treatment of burn wounds and burn scars // Plast.Rec.Surg. 1988. V. 82. N. 1.P. 99-108.

209. Maas-Szabowski N., Shimotoyodome A., Fusenig N.E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechenism // J. Cell Science. 1999. V. 112. P. 1843-1853.

210. Maas-Szabowski N., Stark H-J., Fusenig N.E. Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-1-induced keratinocyte growth factor expression in resting fibroblasts//J. Invest. Dermatol. 2000. V. 114. P. 1075-1084.

211. Mackenzie I.C., Bickenbach J.R. Label-retaining keratinocytes and langerhans cells in mouse epithelia // Cell Tissue Res. 1985. V. 242. P. 551-556.

212. Madden M.R., Finkelstein J.L., Staino=Coico L. et al. Grafting of cultured allogeneic epidermis on second=third=degree burn wounds on 26 patients // J.Trauma. 1986. V. 26. P. 955.

213. Maher P.A. Disruptio of cell-substrate adhesion activates the protein tyrosine kinase pp60c-src// Exp. Cell Res. 2000. V. 260. P. 189-198.

214. Maher PA. Activation of phosphotyrosine phosphatase activity by reduction of cell-substrate adhesion // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90(23). P. 11177-81.

215. Maier K., Ehrhard G., Frever J. Anti bacterical activity of cultured human keratinocytes // Arch.Dermatol.Res. 1992. V. 284. P. 119-121.

216. Maier-Reif K. Rapid normalization of epidermal integrin expression after allografting of human keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1996. V. 107. P. 423-427.

217. Malakhov S.F., Paramonov B.A., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Preliminary report of clinical use of cultured allogeneic keratinocytes. Burns. 1994, V. 20. N. 5. P. 463-466.

218. Malcovati M., Tenchini M.L. Cell density affects spreading and clustering, but not attachment, of human keratinocytes in serum-free medium // J.Cell Sci. 1991. V. 99. P. 387-395.

219. Mansbridge J.N., Hanawalt P.C. Role of transforming growth factor beta in the maturation of human epidermal keratinocytes // J.lnvest.Dermatol. 1988. V. 90. N. 3. P. 336-341.

220. Marcelo C.L., Kim Y.G., Kaine J.L., Voorhees J.J. Stratification, specialization, and proliferation of primary keratinocyte cultures. Evidence of a functioning in vitro epidermal cell system //J.Cell Biol. 1978. V. 79. N. 2. Pt.1. P. 356-370.

221. Marchese C., Rubin J., Ron D. et al. Human keratinocyte growth factor activity on proliferation and differentiation of human keratinocytes: Differentiation response distinguishes KGFfrom EGF family//J. Cell. Physiol. 1990. V. 144. N. 2. P. 326-332.

222. Marikovsky M., Breuing K., Yu Liu P. Eriksson E., Higashiyama S., Farber P., Abbraham J., Klagsbrun M. Appearance of heparin-binding EGF-like growth factor in wound fluid as a response to injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90: P. 3889- 3893.

223. Markmann J.E., Tomaszewski J., Posselt A.M. et al. The effect of islet cell culture in vitro at 24 С on graft survival and MHC antigen expression // Transplantation. 1990. V. 49. N. 2. P. 272-277.

224. Marques M.M., Martinez N. Rodriguez-Garcia I., and Alonso A. EGFR family-mediated signal transduction in the human keratinocyte cell line HaCaT. Exp. Cell Res. 1999. V. 252, P. 423-438.

225. Martin G.R. Laminin and other basement membrane components //Ann. Rev. Cell Biol. 1987. V. 3. P. 57 85.

226. Massague J, Cheifetz S, Boyd FT, Andres JL. TGF-beta receptors and TGF-beta binding proteoglycans: recent progress in identifying their functional properties // Ann N Y Acad Sci. 1990. V. 593. P. 59-72.

227. Matsumoto K., Hashimoto K., Hashiro M. et al. Modulation of growth and differentiation in normal human keratinocytes by transforming growth factor b // J. Cell.Physiol. 1990. V. 145. N. 1. P. 95-101.

228. Matsumoto K., Hashimoto K., Yoshikawa K., Nakamura T. Marked stimulation of growth and motility of human keratinocytes by hepatocyte growth factor II Exp. Cell Res. 1991. V. 196. P. 114-120.

229. Matouskova E., Vogtova D., Konigova R. A recombined skin composed of human keratinocytes cultured on cell=free pig dermis // Bums. 1993. V. 19. P. 118123.

230. Mauduit G., Ohrt C., Faure M. et al. Expression of blood group antigens by cultured epidermal cells used as allografts // Acta Derm. Venereol. 1987. V. 67. P. 93.

231. Mazzalupo S., Wawersik M., Coulombe P.A. An ex vivo assay to assess the potential of skin keratinocytes for wound epithelialization // J.Invest.Dermatol. 2002.V.118. P.866-870.

232. McConkey D.J., Orrenius S. Signal transduction pathways to apoptosis // Trends in Cell Biol. 1994. V.4. P. 370-375.

233. McGaw Wm.T., Ten Cate A.R. A role for collagen phagocytosis by fibroblasts in scar remodeling: an ultrastructural stereologic study // J.Invest.Dermatol. 1983. V. 81. P. 375-378.

234. Mcgrath J.A., Schofield O.M.V., Ishidayamamoto A. et al. Cultured keratinocyte allografts and wound healing in severe recessive dystrophic epidermolysis bullosa //J.Amer.Acad.Dermatol. 1993. V. 29. N. 3. P. 407-418.

235. McGuire J., Birchall N., Cuono C. et al. Successful engraftment of allogeneic keratinocyte cultures in recessive dystrophic epidermolysis bullosa // J.Invest.Dermatol. 1987. V. 88. P. 506A.

236. Medawar P.В. The cultivation of adult mammalian skin epithelium in vitro// Quart.J.Microsc.Sci. 1948. V. 89. P. 187-196.

237. Mehrel Т., Hohl D., Rothnagel J.A., Longley M.A., Bundman D., Cheng C., Lichti U., Bisher M.E., Steven A.C., Steinert P.M., Yuspa S.H., Roop D.R. Identification of a major keratinocyte cell envelope protein, loricrin // Cell. 1990. V. 61. P. 1103-1112.

238. Metcalf D. The molecular control of cell division, differentiation commitment and maturation in haemopoietic cells. Nature. 1989. V.339. P. 27-30.

239. Miki Т., Fleming T.P., Bottaro D.P. et al. Expression cDNA cloning of the KGF receptor by creation of a transforming autocrine loop // Science. 1991. V. 251. N. 4989. P. 72-78.

240. Miller S.J., Burke E.M., Rader M.D., Coulombe P.A., Lavker R.M. Re-epithelialization of porcine skin by the sweat apparatus // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 110. P. 13-19.

241. Milo G.E., Ackerman C.A., Noyes J. Growth and ultrastructural characterization of proliferating human keratinocytes in vitro without added extrinsic factors // In Vitro. 1980. V. 16. P. 20-30.

242. Minguell J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells// Exp. Biol, and Med. 2001.V.226.P. 506-520.

243. Mizumo Т., Yasugi S. Susceptibility of epithelia to directive influences of mesenchymes during organogenesis: Uncoupling of morphogenesis and cytodifferentiation // Cell Differ, and Develop. 1990. V. 31. N .3. P. 151-159.

244. Mohri H. Fibronectin and integrins interactions. // J. Invest. Med. 1996. V. 44. P. 429-441.

245. Moll I., Houdek P., Schmidt H., and Moll R. Characterization of epidermal wound healing in a human skin organ culture model: acceleration by transplanted keratinocytes//J. Invest. Dermatol. 1998. V. 111. P. 251-258.

246. Moore M. Putting the neo into neoangiogenesis // J.Clinical Invest. 2002. V. 109. N. 3. P. 313-315.

247. Morhenn V.B., Benike C.V., Cox A.J. et al. Cultured human epidermal cells do not synthesize HLA=DR//J.lnvest.Dermatol. 1982. V. 78. P. 32-37.

248. Morhenn V.B., Shreiber A.B., Soriero O., McMillan W., Allison A.C. A monoclonal antibody against basal cells of human epidermis. Potential use in the diagnosis of cervical neoplasia //J. Clin. Invest. 1985. V. 76: P. 1978- 1983.

249. Moro L.f Venturino M., Bozzo C., Silengo L., Altruda F., Beguinot L.f Tarone G., and Defilippi P. Integrins induce activation of EGF receptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival // EMBO J. 1998. V. 17. P. 66226632.

250. Morris R.J., Potten C.S. Slow cycling (label-retaining) epidermal cells behave like clonogenic stem cells in vitro // Cell Proliferation. 1994. V. 27. P. 279-289.

251. Morrison S.J., Shah N.M., and Anderson D.J. 1997. Regulatory mechanisms in stem cell biology//Cell V. 88. P. 287-298.

252. Morykwas M.J., Stevenson T.R., Marcelo C.L. et al. In vitro and in vivo testing of a collagen sheet to support keratinocyte growth for use as a burn wound covering //J.Trauma. 1989. V. 29. N. 8. P. 1163-1167.

253. Moscona A.A. Rotation=mediated histogenic aggregation of dissociated cells // Exp. Cell Res. 1961. V. 22. P. 455-475.

254. Munger J. S., Harpel J.G., Giancotti F.G., Rifkin D.B. Interactions between growth factors and integrins: latent forms of transforming growth factor-b are ligands for the integrin avbl // Molec Biol, of the Cell. 1998. V. 9. P. 2627-2638.

255. Murray J.C., Stingl G.( Kleinman H.K. et al. Epidermal cells adhere preferentially to type IV (basement membrane) collagen // J.Cell Biol. 1979. V. 80. N.1. P. 197-202.

256. Mustoe T.A., Pierce G.F., Thomason A. et al. Accelerated healing of incisional wounds in rats induced by transforming growth factor beta // Science. 1987. V. 237. P. 1333-1336.

257. Nanchahal J., Dover R., Otto W.R., Dhital S.K. Cultured composite skin grafts. Biological skin equivalents permitting massive expansion // Lancet. 1989. V.2. P. 191-193.

258. Nanney L.B., Stoscheck C.M., Magid M., King L.E. Altered 125 l-epidermal growth factor binding and receptor distribution in psoriasis // J.lnvest.Dermatol. 1986. V. 86. P. 260-265.

259. Nanney L.B., Yates R.A., King L.E. Modulation of epidermal growth factor receptors in psoriatic lesions during treatment with topical EGF // Ibid. 1992. V. 28. P. 296-301.

260. Napoli В., D'Arpo N., Masellis M., D'Amelio D., Genovese MM Use of cultured homologous keratinocytes in the local treatment of Lyell's syndrome // Ann. Burns and Fire Disasters. 1996. V. 9. P. 163-167.

261. Nathan C., Sporn M.B. Cytokines in context // J. Cell. Biol. 1991. V. 113. P. 981 986.

262. Navsaria H.A., Kangesu Т., Manek S. et al. An animal model to study the significance of dermis for grafting cultured keratinocytes on full thickness wounds // Burns. 1994. V. 20. suppl. 1. P. 557-560.

263. Nelson W.G., Sun T.T. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture studies // J. Cell Biol. 1983. V. 97. P. 244-251.

264. O'Connor N.E., Mulliken J.B., Banks=Schlegel S. et al. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells // Lancet. 1981. V. 1. N. 8210. P. 75-78.

265. O'Keefe E., Battin Т., Payne R.I. Epidermal growth factor receptor in human epithelial cells: direct demonstration in cultured cells//J.Invest.Dermatol. 1982. V. 78. P. 482-488.

266. O'Keefe E.J., Chiu M.L. Stimulation of thymidine incorporation in keratinocytes by insulin, epidermal growth factor, and placental extract: Comparison with cell number to assess growth // Ibid. 1988. V. 90. N. 1. P. 2-7.

267. O'Keefe E.J., Payne R.E. Modulation of the epidermal growth factor receptor of humankeratinocytes by calcium ion // Ibid. 1983. V. 81. N. 3. P. 231-235.

268. O'Keefe E.J., Payne R.E., Russell N. Keratinocyte growth=promoting activity from human placenta// J.Cell.Physiol. 1985. V. 124. P. 439-445.

269. O'Shaughnessy R.F., Seery J.P., Celis J.E., Frischauf A., Watt F.M. PA-FABP, a novel marker of human epidermal transit amplifying cells revealed by 2D protein gel electrophoresis and cDNA array hybridization // FEBS Lett. 2000. V. 486. P. 149-154.

270. Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells // Cell. V. 2001. V. 104(2). P. 233-245.

271. Otey C.A., Pavalko F.M., Burridge K. An interaction between a-actinin and the Ы integrin subunit in vitro //J. Cell Biol. 1990. V. 111. P. 721-729.

272. Pal K., Graver P.L. A simple method for the removal of contaminating fibroblasts from cultures of rat mammary epithelial cells // Cell. Biol.Intern.Rep. 1983. V. 7. N. 10. P. 779-783.

273. Partrige M.( Chantry D„ Turner M. et al. Production of interleukin-1 and interleukin-6 by human keratinocytes and squamous cell carcinoma cell line // J. Investig. Dermatol. 1991. V. 96. P. 771-776.

274. Pavlovitch J.H., Rizk-Rabin M., Jaffray P. et al. Characteristics of homogeneously small keratinocytes from newborn rat skin, possible epidermal stem cells //Amer. J. Physiol. 1991. V. 261. P. 964-972.

275. Peehl DM, Ham RG. Clonal growth of human keratinocytes with small amounts of dialyzed serum // In Vitro. 1980a. Jun;16(6). P. 526-40.

276. Peehl DM, Ham RG. Growth and differentiation of human keratinocytes without a feeder layer or conditioned medium // In Vitro. 1980. Jun;16(6). P. 516-25.

277. Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O, Martinelli E, Fantozzi I, Bondanza S, Ponzin D, McKeon F, De Luca M. p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001. P. 98(6). P. 3156-61.

278. Pentland A.P., Marcelo C.L., Jordan M.A., Voorhees J.J. Effects of gas tension on epidermal keratinocyte DNA synthesis and prostaglandin production // J.Invest.Dermatol. 1986. V. 86. N. 2. P. 177-180.

279. Phillips T.J. Cultured skin grafts: Past, present, future //Arch.Dermatol. 1988. V. 124. P. 1035-1038.

280. Philllips T.J.,Gilchrest B.A.: Clinical application of cultured epithelium. Epith.Cell.Biol. 1992. V. 1. P. 39-46,

281. Pierce G.F., Mustoe T.A., Longelbach J. et al. Platelet=derived growth factor and transforming growth factor=b enhance tissue repair activities by unique mechanisms // J.Cell Biol. 1989. V. 109. P. 429-440.

282. Pierce G., Mustoe T. Pharmacological enhancement of wound healing // Annu.Rev.Med. 1995. V. 46. P. 467-481.

283. Pierce G.F., Yanagihara D., Klopchin K. et al. Stimulation of all epithelial elements during skin regeneration by keratinocyte growth factor // J.Exp.Med. 1994. V. 179. N. 3. P. 831-840.

284. Pietenpol J.A., Holt J.T., Stein R.W., Moses H.L. Transforming growth factor Ы suppression of c=myc gene transcription: Role in inhibition of keratinocyte proliferation // Proc.Nat.Acad.Sci. US. 1990a. V. 87. N. 10. P. 3758-3762.

285. Pietenpol J.A., Stein R.W., Moran E. et al. TGF-M inhibition of c=myc transcription and growth in keratinocytes is abrogated by viral transforming protein with pRB binding domains // Cell. 1990b. V. 61. N. 5. P. 777-785.

286. Pitts J.D., Kam E., Morgan D. The role of junctional communication in cellular growth control and tumorigenesis // In Gap Junctions. 1988. P. 397-409. Pub. A.R. Liss Inc.

287. Plopper G.E., McNamee H.P., Dike L.E., Bojanowski K., Ingber D.E. Convergence of integrin and growth factor recepor signaling pathways within the focal adhesion complex// Molec. Biol, of the Cell. 1995. V. 6. P. 1349-1365.

288. Plowman G.D., Green J.M., McDonald V.L. et al. The amphiregulin gene encodes a novel epidermal growth factor-related protein with tumor=inhibitory activity// Mol. and Cell Biol. 1990. V. 10. P. 1969-1981.

289. Polakowska R., Piacentini M., Bartlett R. et. al. Apoptosis in human skin development: Morphogenesis, periderm, and stem cells // Develop.Dynamics. 1994. V. 199. N. 3. P. 176-188.

290. Potten C.S., Hendry J.H. Clonogenic cells and stem cells in the epidermis. Int. J. Radiat. Biol. 1973. V. 24. P. 537-540.

291. Potten C.S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell // Cell Tissue Kinet. 1974. V. 7. P. 77-88.

292. Potten C.S. Cell replacement in epidermis (keratopoiesis) via discrete units of proliferation // Int. Rev. Cytol. 1981. V. 69. P. 271-318.

293. Potten C.S. Stem cells in epidermis from the back of the mouse. In: Stem Cells: Their Identification and Characterisation. 1983. P. 200-232. Ed. C.S. Potten.

294. Potten C.S. Cell cycles in cell hierarchies // Int. J. Rad. Biol. 1986. V. 49. P. 257-278.

295. Potten C.S., Hendry J.H. Differential regeneration of intestinal proliferative cells and cryptogenic cells after irradiation // Int. J. Rad. Biol. 1975. V. 27. P. 413424.

296. Potten C.S. and Morris R.J. Epidermal stem cells in vivo // J. Cell Sci. Suppl.1988. V. 10. P. 45-62.

297. Potten C.S., Schofield R., Lajtha L.G. A comparison of cell replacement in bone marrow, testis and three regions of surface epithelium // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 560. P. 281-299.

298. Potten C.S., Wichmann H.E., Dobek K., Birch J., Codd T.M. Horrocks L., Pedrick M., Tickle S.P. Cell kinetic studies in the epidermis of mouse. Ill The percent labelled mitosis (PLM) technique // Cell Tissue Kinetics. 1982. V. 18. P. 59-70.

299. Price F.M., Camalier R.F., Gantt R. et al. A new culture medium for human skin epithelial cells // In Vitro. 1980. V. 16. P. 147-158.

300. Prunieras M., Regnier M., Fougere S., Woodley D. Keratinocytes synthesize basaMamina proteins in culture //J.Invest.Dermatol. 1983. V. 81. N. 1 suppl. P. 74s-81s.

301. Puck T.T., Marcus P.I. A rapid method for viable cell titration and clone production with HeLa cells in tissue culture: The use of X=irradiated cells to supply conditioning factors// Proc.Nat.Acad.Sci. US. 1955. V. 41. P. 432-437.

302. Pullan S., Wilson J., Metcalfe A., Edwards G.M., Goberdhan N. Tilly J., Hickman J.A., Dive C., and Streuli C.H. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium // J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 631-642.

303. Quaglino D., Nanney L.B., Ditesheim J.A., Davidson J.M. Transforming growth factor=beta stimulates wound healing and modulates extracellular matrix gene expression in pig skin: Incisional wound model // J.Invest.Dermatol. 1991. V. 97. P. 34-42.

304. Quinlan R.A., Schiller D.L., Hatzfeld M., Achtstatter Т., Moll R.f Jorcano J.L., Magin T.M., Franke W.W. Patterns of expression and organization of cytokeratin intermediate filaments //Ann N.Y. Acad. Sci. 1985. V. 455. P. 282-306.

305. Raff M. Social controls on cell survival and cell death // Nature. 1992. V. 356: PP. 397-400.

306. Raghavan S, Bauer C, Mundschau G, Li Q, Fuchs E. Conditional ablation of betal integrin in skin. Severe defects in epidermal proliferation, basement membrane formation, and hair follicle invagination //J Cell Biol. 2000. V. 150(5). P. 1149-60.

307. Raines E.W., Dower S.R., Ross R. lnterleukin-1 mitogenic activity for fibroblasts and muscle cells due to PDGF-AA. // Science. 1989. V. 243. P. 292 396.

308. Rawson C.L., Loo D.T., Duimstra J.R. et al. Death of serum=free mouse embryo cells caused by epidermal growth factor deprivation // J.Cell Biol. 1991. V. 113. N. 3. P. 671-680.

309. Regauer S., Seiler G.R., Barrandon Y. et al. Epithelial origin of cutaneous anchoring fibrils// Ibid. 1990. V. 111. N. 5. pt 1. P. 2109-2116.

310. Regnier M., Schweizer J., Bailly M.S., Pruniera M. Expression of high molecular weight (67 K) keratin in human keratinocytes cultured on dead deepidermized dermis// Exp.Cell Res. 1986. V. 165. P. 63-72.

311. Reilly C.F., Fritze L.M.S., Rosenberg R.D. Heparin=like molecules regulate the number of epidermal growth factor receptors on vascular smooth muscle cells //J.Cell.Physiol. 1988. V. 136. N. 1. P. 23-32.

312. Reiss M., Dibble C.L. Reinitiation of DNA synthesis in quiescent mouse keratinocytes; regulation by polypeptide hormones, holera toxin, dexamethasone, and retinoic acid // In Vitro. 1988. V. 24. N. 6. P. 537-544.

313. Reiss M., Sartorelli A.C. Regulation of growth and differentiation of human keratinocytes by type b transforming growth factor and epidermal growth factor // Cancer Res. 1987. V. 47. P. 6705-6709.

314. Reiss M., Zhou Z.-L. Uncoupling of the calcium=induced terminal differentiation and the activation of membrane-associated transglutaminase in murine keratinocytes by type=b transforming growth factor// Exp.Cell Res. 1989. V. 183. N. 1. P.101-111.

315. Rheinwald J.G., Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizating colonies from single cells // Cell. 1975. V. 6. P. 331-344.

316. Rheinwald J.G., Green H., Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes //Nature. 1977. V. 265. N. 5593. P. 421424.

317. Rice A., Bernard Ph., Foures C. et al. Long=term culture of peripheral blood stem cells: The effect of the addition of an irradiated stromal layer // Exp.Hematol. 1989. V. 17. N. 9. P. 984-988.

318. Rice R.H., Green H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross=linked envelope: Activation of the cross—linking by calcium ions // Cell. 1979. V. 18. N. 3. P. 681-694.

319. Ristow H.I., Messmer Т.О. Heparin as a growth inhibitor for cultured keratinocytes // J.Cell Biol. 1988. V. 107. P. 269a.

320. Rizk=Rabin M., Pavlovitch J.H. Epidermal calcium=binding protein: A marker of early differentiation of basal layer keratinocytes of rats // Cell and Tissue Res. 1993. V. 272. P. 161-168.

321. Rizzino A., Kazakoff P., Nebelsick J. Density=induced down regulation of epidermal growth factor receptors // In Vitro Cell Develop.Biol. 1990. V. 26. N. 5. P. 537-542.

322. Roberts H.S., Spooncer E., Rarkinson E.K. et al. Metabolically inactive 3T3 cells can substitute for marrow stromal cells to promote the proliferation anddevelopment of multipotent haemopoietlc stem cells // J.Cell.Physiol. 1987. V. 132. P. 203- 207.

323. Roberts H.S., Gallagher J., Spooncer E. et al. Heparan sulphate bound growth factors: A mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis // Nature. 1988. V. 332. N. 6162. P. 376-378.

324. Rochat A., Kobayashi K., Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis // Cell. 1994. V. 76. P. 1063-1073.

325. Rodeck U., Jost M., Kari C., Shih D.T., Lavker R.M., Ewert D.L., Jensen P.J. EGF-R dependent regulation of keratinocyte syrvival // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 113-121.

326. Rodemann H.P. Differential degradation of intracellular proteins in human skin fibroblasts of mitotic and mitomycin С (MMC)-induced postmitotic differentiation states // Differentiation. 1989. V. 42. N. 1. P. 37-43.

327. Rollins BJ, O'Connell TM, Bennett G, Burton LE, Stiles CD, Rheinwald JG. Environment-dependent growth inhibition of human epidermal keratinocytes by recombinant human transforming growth factor-beta // J Cell Physiol. 1989. V. 139(3). P. 455-62.

328. Ronfard V., Broly H., Mitchell V. et al. Use of human keratinocytes cultured on fibrin glue in the treatment of burn wounds // Burns. 1991. V. 17. N. 3. P. 181-184.

329. Rosenfeldt H., Grinnell F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices//J.Biol.Chem. 2000. V. 275(5). P. 3088-92.

330. Ross R. The fibroblast and wound repair // Biol.Rev. 1968. V. 43. N. 1. P. 5196.

331. Rouabhia M. In vitro production and transplantation of immunologically active skin equivalents // Laboratory Investigation. 1996. V. 75. N. 4. P. 503-517.

332. Rouabhia M., L.Germain, J.Bergeron, F.Auger Allogenic-syngeneic cultured epithelia. //Transplantation, 1995, V.59, № 9. P. 1229-1235.

333. Rowden G., Lewis M.G., Sullivan A.K. la antigen expression on human epidermal Langerhans cells // Nature. 1977. V. 268. N. 5617. P. 247-248.

334. Rubin J., Osada H., Finch P.W. et al. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells // Proc.Nat.Acad.Sci. US. 1989. V. 86. N. 3. P. 802-806.

335. Rubin JS, Bottaro DP, Chedid M, Miki T, Ron D, Cheon G, Taylor WG, Fortney E, Sakata H, Finch PW, et al. Keratinocyte growth factor // Cell Biol Int. 1995/ V. 19(5). P. 399-411.

336. Sahlgren C.M., Mikhailov A., Hellman J., Chou Y-H. et al. // Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase//J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 16456-16463.

337. Samuel J., Noujaim A.A., Willans D.J., Brzezinska G.S., Haines D. M., Longenecker B.M. A novel marker for basal (stem) cells of mammalian stratified sguamous epithelia and sguamous cell carcinomas // Cancer Res. 1989. V. 49. P. 2465-2470.

338. Savill N. Mathematical model of hierarchically structured cell populations under equilibrium with application to the epidermis // Cell Prolif. 2003 V. 36. P. 1-26

339. Seishima M., Nojiri M., Esaki C., Yoneda K., Eto Y., Kitajima Y. Activin A induced terminal differentiation of cultured human keratinocytes // J.lnvest.Dermatol. 1999. V. 112. P. 432-436.

340. Schaffer M.t Barbul A. Lymphocyte function in wound healing and following injury // Br.J.Surg. 1998. V. 85. P. 444-460.

341. Schofield R. 1978. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell // Blood Cells. V. 4. P. 7-25.

342. Schor S.L., Schor A.M., Grey A.M. et al. Mechanism of action of the migration stimulating factor produced by fetal and cancer patient fibroblasts: Effect on hyaluronic acid synthesis // In Vitro. 1989. V. 25. N. 8. P. 737-746.

343. Schro"der J.M. Cytokine networks in the skin // J. Invest. Dermatol. 1995. V. 105. P. 20s-24s.

344. Seery J.P., Watt F.M. Asymmetric stem-cell divisions define the architecture of human oesophageal epithelium // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 1447-1450.

345. Seishima M., Takagi H., Okano Y. et al. Ganglioside=induced terminal differentiation of human keratinocytes: Early biochemical events in signal trunsduction //Arch. Dermatol.Res. 1993. V. 285. N. 7. P. 397-401.

346. Seiger G.M., Sun W., Salvi R., Campbell L.M., Sullivan S., Reidy J. Human corneal stem cells display functional neuronal properties.// Mol. Vision, 2003. V.9.P.159-163.

347. Serini G., Bochaton-Piallat M.-L., Ropraz P. et al. The fibronectin domain EDA is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-pi. //J. Cell. Biol. 1998. V. 142. P .873-881.

348. Sharpe R.J., Arndt K.A., Bauer S.I., Maione Т.Е. Cyclosporine inhibits basic fibroblast growth factor=driven proliferation of human endothelial cells and keratinocytes //Arch.Dermatol. 1989. V. 125. P. 1359-1362.

349. Shipley G.D., Keeble W.W., Hendrichson J.E. et al. Growth of normal human keratinocytes and fibroblasts in serum-free medium is stimulated by acidic and basic fibroblast growth factor //J.Cell.Physiol. 1989. V. 138. N. 3. P. 511-518.

350. Shipley G.D., Pittelkow M.R., Wille J.J.,Jr. et al. Reversible inhibition of normal prokeratinocyte proliferation by type b transforming growth factor growth inhibitor in serum=free medium // Cancer Res. 1986. V. 40. P. 2068-2071.

351. Shoyab M., Plowman G.D., McDonald V.L. et al. Structure and function of human amphiregulin: A member of the epidermal growth factor family // Science. 1989. V. 243. N. 4894. P. 1074-1076.

352. Simon M. The epidermal cornified envelope and its precursors. In: The Keratinocyte Handbook. Leigh I.M., Lane E.B., Watt F.M. (eds). Cambridge, Cambridge University Press, 1994: 275-292.

353. Singer A., Clark R., Cutaneous wound healing // New England journal of medicine. 1999. V. 341. N. 10. P. 738-746,

354. Smith G. and Boulanger C.A. Mammary epithelial stem cells: transplantation and self-renewal analysis // Cell Prolif. 2003. V.36 (Suppl.1), P.3-15.

355. Smola H., Thierko"tter G., Fusenig N.E. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction // J. Cell Biol. 1993. V. 122. P. 417429.

356. Soma Y., Grotendorst G.R. TGF=b stimulates primary human skin fibroblast DNA synthesis via an autocrine production of PDGF=re!ated peptides // J.Cell.Physiol. 1989. V. 140. P. 246-253.

357. Somers Т., Verbeken G., Delaey В., Duinslaeger L., Govaerts P., Offeciers E. Treatment of chronic postoperative otorrhear with cultured keratinocyte sheets // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1997. V. 106. P. 15-20.

358. Sordillo L.M., Oliver S.P., Akers R.M. Cultures of bovine mammary epithelial cells in D=valine modified medium: Selective removal of contaminating fibroblasts // Cell Biol.lnternat.Rep. 1988. V. 12. N. 5. P. 355-364.

359. Sporn M.B., Todaro G.J. Autocrine secretion and malignant transformation // New Engl.J.Med. 1980. V. 303. P. 878-880.

360. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. Stem cells find their niche // Nature. 2001. V. 414. P. 98-103.

361. Sta Iglesia D.D., Gala P.H., Qui Т., Stepp M.A. Integrin expression during migration and restratification in the tenascin-C- deficient mouse cornea // J. Histochem. Cytochem. 2000. V. 48. P. 363-375.

362. Stanley J.R., Foidart l.= M., Murray J.C. et al. The epidermal cell which selectively adheres to a collagen substrate is the basal cell // J.Ivest.Dermatol. 1980. V. 74. P. 54-58.

363. Steinmuller D., Tyler J.D. Cross=priming reveals similar tissue=restricted CTL=defined alloantigens on mouse, rat and human epidermal cells // Transplant. Proc. 1983. V. 15. P. 238- 243 .

364. Stenn D.S. and DePalma L. Re-epithelialization. In The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair 1988. New York : Plenum Press. (Ed: R.A.F. Clark and P.M.Henson). P. 321-335.

365. Stepp M.A., Spurr-Michaud S., Tisdale A., Elwell J., Gipson I.K. a6b4 integrin heterodimer is a component of hemidesmosomes // Proc. natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8970-8974.

366. Stepp M.A., Zhu I., Sheppard D., Cranfill R.L. Localized distribution of a9 integrin in the cornea and changes in expression during corneal epithelial cell differentiation./^ Histochem. Cytochem. 1995. V. 43. P. 353-362.

367. Stetler-Stevenson W.G. Matrix metalloproteinases in angiogenesis: a moving target for therapeutic intervention//J. Clin. Invest. 1999. V. 103. P. 1237-1241.

368. Streuli CH, Bissell MJ. Expression of extracellular matrix components is regulated by substratum //J Cell Biol. 1990. V. 110(4). P. 1405-15.

369. Stoker M., Gherardi E., Rennyman M., Gray J. Scatter factor is a fibroblast=derived modulator of epithelial cell motility // Nature. 1987. V. 327. P. 239242.

370. Stoll S.W., Benedict M., Mitra R., Hiniker A., Elder J.T., Nunez G. EGF receptor signalling inhibits keratinocyte apoptosis: evidence for mediation by Bcl-XL //Oncogene 1998. V. 16. P. 1493-1499.

371. Swartzendruber D.C., Wertz P.W.,Kitko D.J., Madison K.C., Downing D.T. Molecular models of the intercellular lipid lamellae in mammalian stratum corneum // J. Invest. Dermatol. 1989. V. 92. P. 251-257.

372. Swindle CS, Tran KT, Johnson TD, Banerjee P, Mayes AM, Griffith L, Wells A. Epidermal growth factor (EGF)-like repeats of human tenascin-C as ligands for EGF receptor//J Cell Biol. 2001. V. 154(2). P. 459-68.

373. Taipale J, Miyazono K, Heldin CH, Keski-Oja J. Latent transforming growth factor-beta 1 associates to fibroblast extracellular matrix via latent TGF-beta binding protein//J Cell Biol. 1994. V. 124(1-2). P. 171-81.

374. Tamm I., Kikuchi T. Activation of signal trunsduction pathways protect quiescent Balb/c-3T3 fibroblasts against death due to serum deprivation // J.Cell.Physiol. 1991. V. 148. N. 1. P. 85-95.

375. Taipale J, Keski-Oja J. Growth factors in the extracellular matrix // FASEB J. 1997. V. 11(1). P. 51-9.

376. Taylor G, Lehrer MS, Jensen PJ, Sun TT, Lavker RM. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis // Cell. 2000. V. 102(4). P. 451-61.

377. Teepe R.G.C., Burger A., Ponec M. Immunohistochemical studies on regeneration in cultured epidermal autografts used to treat fullthickness burn wounds //Clinical and Experimental Dermatol. 1994. V. 19. N. 1. P. 16-22.

378. Teepe R.G.C., Koebrugge E.J., Ponec M., Vermeer B.J. Fresh versus cryopreserved cultured allografts for the treatment of chronic skin ulcers // Brit.J.Dermatol. 1990a. V. 122. P. 81-89.

379. Teepe R.G.C., Kreis R.W., Koebrugge E.J. et al. The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds // J.Trauma. 1990b. V. 30. N. 3. P. 269-275.

380. Те Pas M.F.W., Ponec M.( Van Bergen en Henegouwen P.M.P. et al. Association of EGF and LDL receptors with the cytoskeleton of cultured keratinocytes //Cell. Biol. Intern. Rep. 1990. V. 14. N. 11. P.989-999.

381. Terskikh V.V., Vasiliev A.V. Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes // International Review of Cytology. 1999. V. 188. P .41-72.

382. Thompson C.H., Rose B.R., Cossart Y.E. Optimised growth of human epidermal cells in vitro without the use of a feeder layer or collagen substrate // Austr.J.Exp.Biol, and Med.Sci. 1985. V. 63, pt. 2. P. 147-156.

383. Thiede M.A., Duong L.T., Rodan G.A., Ernst M. A parathyroid hormone=related peptide produced in response to epidermal growth factor contributes to the mitogenic effect of EGF of human keratinocytes // FASEB J. 1990. V. 4. N. 7. P. A1921-1926.

384. Tinois E., Faure M., Chatelain P. et al. Growth and differentiation of human keratinocytes on extracellular matrix // Arch.Dermatol.Res. 1987. V. 279. N. 4. P. 241-246.

385. Todaro G.J., Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines//J. Cell Biol. 1963. V. 17. P. 299-313.

386. Toma J., Akhavan M., Ferdinandes K., Barnabe-Heider F., Sadikot A., Kaplan D.,Miller F. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell. Biol. 2001. V. 3(9). E205-6.

387. Tong P.S.L., Marcelo C.L. Augmentation of keratinocyte differentiation by the epidermal mitogen, 8=bromo=cAMP // Exp.Cell Res. 1983. V. 149. P. 215-226.

388. Tsuboi R., Sato C., Kurita Y. et al. Keratinocyte growth factor (FGF=7) stimulates migration and plasminogen activator activity of normal human keratinocytes // J.lnvest.Dermatol. 1993. V. 101. P. 49-53.

389. Tsuboi R., Sato C., Shi С =M. et al. Endothelin=1 acts as an autocrine growth factor for normal human keratinocytes // J.Cell.Physiol. 1994. V. 159. N. 2. P. 213220.

390. Tuan T.L., Nichter L.S. The molecular basis of keloid and hypertrophic scar formation // Molecular medicine today. 1998. V. 1. P. 19-25.

391. Uchida N. Fleming W.H., Alpern E.J., Weissman I.L. Heterogeneity of hematopoietic stem cells // Curr. Opin. Immunol. 1993. V. 5. P. 177-184.

392. Ulbrecht M., Rehberger В., Strobel I. et al. HLA=G: Expression in human keratinocytes in vitro and in human skin in vivo // Europ.J.Immunol. 1994. V. 24. N. 1. P. 176-180.

393. Ulubayram K., Nur Cakar A., Korkusuz P. et al. EGF containing gelatin-based wound dressing. // Biomater. 2001. V. 22. P. 1345 1356.

394. Vaittinen S., Lukka R., Sahlgren C. et al., Specific and innervation regulated expression of the intermediate filament protein nestin at neuromuscular and myotendinous junctions in skeletal muscle // Am.J.Patology, 1999. V.154, 2, P.591-600/

395. Van Bergen en Henegouwen P.M.P., Defize L.H.K., De Kroon J. et al. Ligand=induced association of epidermal growth factor receptor to the cytoskeleton of A-431 cells // J.Cell Biochem. 1989. V. 39. P. 455-465.

396. Van der Merwe A.E., Mattheyse F.J., Bedford M. et al. Allografted keratinocytes used to accelerate the treatment of burn wounds are replaced by recipient cells // Burn. 1990. V. 16. P. 193-197.

397. Van Muijen G.N.P., Warnaar S.O., Ponec M. Differentiation=related changes of cytokeratin expression in cultured keratinocytes and in fetal, newborn, and adult epidermis // Exp.Cell Res. 1987. V.1 71. P. 331-345.

398. Van Obberghen=Shilling E., Roche N.S., Flanders K.C. et al. Transforming growth factor=beta 1 positively regulates its own expression in normal and transformed cells //J.Biol.Chem. 1988. V. 263. P. 7741-7746.

399. Vitolo D., Ciocci L., Baroni C.D. Laminin a2-chain (merosin m-chain) and metastatic potential of microcitoma //Virchows Arch. 2001. V. 439. P.362.

400. Vlodavsky I., Fuks Z., lshai=Michaeli R. et al. Extracellular natrix-resident basic fibroblast growth factor: Implication for the control of angiogenests // J.Cell Biochem. 1991. V. 45. N. 2. P. 167-176.

401. Vorotelyak E.A., Satdykova G.P., Vasiliev A.V., and Terskikh V.V. Electron microscope study of migrating keratinocyte colonies // Wound Repair and Regeneration. 1995. V. 3. N. 1 P. 114.

402. Vuori K, Ruoslahti E. Activation of protein kinase С precedes alpha 5 beta 1 integrin-mediated cell spreading on fibronectin // J Biol Chem. 1993. V. 268(29). P. 21459-62.

403. Waseem A., Dogan В., Tidman N., Alam Y., Purkis P., Jackson S., Lalli A., Machesney M., Leigh I.M. Keratin 15 expression in stratified epithelia: downregulation in activated keratinocytes//J. Invest. Dermatol. 1999. V. 112. P. 362-369.

404. Waters M.J., Tweedale R.C., Whip T.A. et al. Dedifferentiation of cultured thyroid cells by epidermal growth factor: Some insights into the mechanism // Mol. and Cell. Endocrinol. 1987. V. 49. P. 109-117.

405. Watt FM. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1998. V. 353(1370).P. 831-837.

406. Watt F.M. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis //J.Cell Biol. 1984. V. 98. N. 1. P. 16-21.

407. Watt F.M. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture // J.Cell Sci. 1987. Suppl.8. P. 313-326.

408. Watt F.M., Green H. Involucrin synthesis is correlated with cell size in human epidermal cultures // J.Cell Biol. 1981. V. 90. P. 738-742.

409. Watt F.M., Green H. Stratification and terminal differentiation of cultured epidermal cells // Nature. 1982. V. 295. N. 5848. P. 434-436.

410. Wedhank T.,V. Altun, R.Ramrattan, Van der Kwast et al., Epidermal participation in post-burn hypertrophic scar development // Virchov Archiv.1999. V. 431. P. 221-226.

411. Werner S, Breeden M, Hubner G, Greenhalgh DG, Longaker MT. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse //J Invest Dermatol. 1994. V. 103(4). P.469-73.

412. Werner S, Peters KG, Longaker MT, Fuller-Pace F, Banda MJ, Williams LT. Large induction of keratinocyte growth factor expression in the dermis during wound healing // Proc Natl Acad Sci USA. 1992/V. 89(15). P. 6896-900.

413. Whitby D.J., Longaker M.T., Harrison M.R., Adzick N.S., and Ferguson M.W.J. Rapid epithelialization of fetal wounds is associated with the early deposition of tenascin. J. Cell Biol. 1991. V. 99. P. 583-586.

414. Winkler M.E., O'Connor L., Winget M., Fendly B. Epidermal growth factor and transforming growth factor a bind differently to the epidermal growth factor receptor // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 6373-6378.

415. Withers H.R. The dose-survival relationship for irradition of epithelial cells of mouse skin // Brit. J. Radiol. 1967. V. 40. P. 187-194.

416. Woodley D.T., Stanley J.R., Reese M.J., O'Keefe E.J. Human dermal fibroblast synthesize laminin // J.lnvest.Dermatol. 1988. V. 90. N. 5. P. 679-683.

417. Woodley D.T., Briggaman R.A., Herzog S.R. et al. Characterization of "neo=dermis" formation beneath cultured human epidermal autografts transplanted on muscle fascia //J. Invest.Dermatol. 1990. V. 95. P. 20-26.

418. Worst P.K.M., Valentine E.A., Fusenig N.E. Formation of epidermis after reimplantation of pure primary epidermal cell cultures from perinatal mouse skin // J. Nat.Cancer Inst. 1974. V. 53. N. 4. P. 1061-1064.

419. Wroblewski J., Engstrom M., Edwall-Aridsson C., et al. Distribution of nestin in the developing mouse limb bud in vivo and in micro-mass cultures of cells isolated from limb buds // Differentiation, 1997, V.61, 3, P.151-159.

420. Yamada M. Okigaki T. Promotion of epithelial cell adhesion on collagen by proteins from rat embryo fibroblasts // Cell Biol.lntern.Rep. 1983. V. 7. N. 12. P. 1115-1121.

421. Yamazaki K., Roberts R.A., Spooncer E. et al. Cellular iteractions between 3T3 cells and iterleukin=3=-dependent multipotent haemopoietic cells: A model system for stromal=cell=mediated haemopoiesis // J.Cell.Physiol. 1989. V. 139. N. 2. P. 301-312.

422. Yang J-S., Lavker R. M., Sun T-T. Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential // J. Invest. Dermatol. 1993. V. 101. P. 652- 659.

423. Young D., Langdon R., Kahn R. et al. Analysis of the fate of allografted dermis using a DNA fingerprinting technique //Proc.Amer.Burn Assoc. 1989. V. 12. P. 71-75.

424. Zhao X., .Das A, Thoreson W., James J., Wattnem Т., Rodrigues-Sierra J., Ahmad I. Adult corneal epithelium:a model for studying neural potential of non -neural stem cells/progenitirs // Developmental biology. 2002. V. 250. P. 317-331.

425. Zhao Y.B., Zhao X.=F., Li A. (Ngao) et al. Clinical observations and methods for identifying the existence of cultured epidermal allografts // Burns. 1992. V. 18. P. 4-8.