Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ"

А~тчъ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ЕАТТАТХОТТАМ Джозеф Джозеф

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в лаборатории генной и клеточной инженерии отдела сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА

Научный руководитель — кандидат биологических наук Никифорова И. Д.

Официальные оппоненты доктор биологических наук Шамина 3. Б., кандидат биологических наук Аветисов В. А.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет, биологический факультет

Защита состоится 1 октября 1991 г в на заседании

специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева.

Адрес 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций

С диссертацией можно ознак^ ч Центральной науч-

ной библиотеке ТСХА

Автореферат разослан « иу . 1991 г

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Посева

Актуальность проблемы. Возрастающая с калдым годом потребность в пище для человека и животных и сокращение пригодных для сельского хозяйства .земель делает особенно актуальной задачу создания форм и сортов культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды (засолению почв, засухе). Проблема становится еще более острой, если учесть повышение засоления почв при орошаемом земледелии. Только в Индии потеря земли из-за накопления . солей при поливном земледелии составляет в год примерно несколько сотен квадратных километров (Flowers 1977),

Пшеница - одна из важнейших зерновых культур в мире. Создание форм и сортов, устойчивых к засолению и засухе, позволит снизить потери урожая от неблагоприятных факторов окружающей среды и вовлечь в сельскохозяйственную .практику новые земли.

Успешное применение клеточных технологий для создания солеустойчивых форм важных сельскохозяйственных растений, таких как - томаты, рис, люцерна и др. создает положительную перспективу для привлечения этих методов к селекции пшеницы. Кроме того,не вызывают сомнений преимущества использования методов культуры клеток для изучения фундаментальных основ солеустойчивости на клеточном уровне.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание методами клеточной селекции на базе сомаклональкой вариабельности форм яровой пшеницы, устойчивых к засолению и засухе. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: , .;. ." •'.

-изучить влияние засоления (хлоридного и сульфатного) и водного стресса на культуру клеток пшеницы различных сортов.

- провести селекцию на клеточном уровне на резистентность к хлоридному и сульфатному засолению и водному . стрессу. • ' * ,- изучить свойства отобранных клеточных линий. ! - получить растения-регенеранты из устойчивых клеточ- ■ ных линий.. •

- провести оценку растений-регенерантов в отношении сохранения признака устойчивости при переходе от клеточного уровня на уровень целого растения и передачи этого признака в поколениях Научная новизна работы В работе впервые методами клеточной селекции получены сояеустойчивые растения-регенеран-ты пшеницы и проанализировано селенное поколение этих растений. Установлена возможность сохранения признака солеустсачивости при переходе от клеточного уровня на уровень целого растения. Показана наследуемость признака устойчивости, что доказывает генетическую природу изменений,произошедших при культивировании клеток пшеницы и отобранных при клеточкой селекции. Предложены ьовые подходы для сокращения сроков необходимых для анализа растений-регенерантов.

Практическая ценность работы Созданные в результате работы резистентные формы лроЕой пшеницы могут служить основой для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к засолению и засухе,что позволит сократить потери урожая от неблагоприятных факторов округляющей среды. Данные формы могут служить донорами устойчивости и могут быть включены в селекционный процесс

Апробация работы Результаты исследования представлены на Международной конференции молодых ученых в Болгарии в 1990г., на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева в 1969 и 1990 годах, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации По материалам диссертации опубликована одна работа.

объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения. Материалы диссертации излолзны на 1£0 страницах текста, содержат £7 таблицы,IV рисунков и фотографий. Библиография содержит 250 источников отечественной и зарубежной литература

'- 3 -

, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '

В качестве объектов исследования были использованы • сорта яровой пшеницы ( Triticum aestivum) селекции Севе-ро-Казахстанского селекционного центра (ВНИИЗХ,Шортанды)-Целинная-21 (Ц-21) и Целинная-юбилейная, (Ц-Ю).Саратовской селекции - Саратовская-29 (С-29).занимающий основные посевные площади Северного Казахстана и Московской селекции -Московская-35 (М-35). Кроме того, объектом исследования был дикий сородич пшеницы - Aegilops speltoides (диплоидная форма N 452 кат. ВИР ).

Каллусную культуру получали из незрелых зародышей (14-16 дней после цветения ) на модифицированной среде Мураси-ге-Скуга (Ш) с добавлением 2мг/л2,4Д. Культивирование проводили при температуре 27*С и постоянном освещении. Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые 4 кедели. Интенсивность роста каллуса. определяли по степени Прироста сырой массы каллуса. Обозначали интенсивность прироста, как относительный рост и рассчитывали по формуле:

сырая масса 2 - сырая масса 1

Отн. рост - —------------— 100 ,

сырая масса 1

" где сырая масса 1 - вес.экспланта, ,

сырая масса 2 - вес экспланта в конце пассажа.

Такой вариант определения интенсивности роста позволяет избежать . ошибки от влияния на рост величины экспланта Определение интенсивности прироста биомассы проводили в lois кратной повторности. фирост биомассы в стрессовых условиях выражал^ ,как X к контролю ( то есть к росту каллуса данной линии на неселективной среде).

Для изучения влияния солей на рост каллусных культур различных сортов пшеницы и для клеточной селекции использовали только ' морфогенный каллус. Масса эксплантов в экспери-

- 4 -

ментах варьировала от 20 до 35 миллиграмм

Клеточную селекцию проводили по различным схемам. Регенерацию растений из устойчивых ,-меточных линий проводили на среде Мурасиге и Скуга в селективных условиях. Полученные растеньица (R1) переносили на среду, содержащую 1/2 солей МС и 0,5% NaCl. После укоренения растения переносили в почву.

Оценку потомства растений- регенерантов (R2) проводили на клеточном уровне с помощью индукции каллуса из незрелых зародышей в селективных условиях, а такта на уровне целых растений, подученных при проращивании незрелых зародышей растений-регенерантов в условиях in vitro при засолении и дальнейшем выращивании растений в почве при поливе 1% раствором NaCl.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния засоления на культивируемые клетки различных сортов яровой пшеницы.

Повышение солеустойчивости и засухоустойчивости для сортов районированых в Северном Казахстане весьма актуально, т.к. земли этого региона подвержены хлоридному и сульфатному засолению ( Строгонов 1976). Попытка достичь повышения устойчивости методами клеточной инженерии представляется правомочной ввиду того, что в литературе существуют данные /Orton 1980,Warren 1982/, свидетельствующие в пользу клеточного механизма устойчивости к засолению,лежащего в основе солеуст9йчивости однодольных. Поэтому создание устойчивых форм пшеницы на базе устойчивых клеточных линий может о сазаться продуктивным подходом

Основные трудности, с которыми сталкиваются исследователи при работе по клеточной селекции - это невозможность получить растения-регенеранты ив устойчивых клеточных линий, ввиду утраты тканью способности к морфогенезу

Кроме того, невсегда устойчивость к стрессу на клеточном уровне экспрессируется на уровне целого растения и,тем более, наследуется в поколениях. •

Использованные в данной работе сорта" пшеницы ( Мос-Ковская-35, Саратовская-29, Целинная-21 и Целиннаа-юбилей-ная ) являются сортами различного эколого-географического происхождения и обладают различной полевой' устойчивостью к засухе и засолению почв.

В работах выполненных ранее в ИФР АН СССР (Бутенко 1988)на различных сортах пшеницы было показано,что эффективность клеточной селекции возрастает, если использовать не первичный каллус,а каллус прошедший несколько субкультивирований. Поэтому в нашей работе для селекции и для изучения ростовых характеристик исходных форм мы использовали ткани из четвертого пассажа.

На рисунке 1 приведены , результаты изучения влияния хлоридного(а) и сульфатного (б) засоления на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы и эгилопса.

* Прежде всего из представленных данных видно, что на клеточном уровне выявляется сортовая специфика ответа на солевой стресс, и она соответствует полевой устойчивости целых растений. То есть, клетки сорта Московская-35 демонстрируют большую чувствительность к засолению,чем клетки целинных сортов. На основании представленных данных мы можем ранжировать сорта по устойчивости к хлоридному засолению в порядке возрастания: М-35, С-29, Ц-Ю, Ц -21. Клетки эгилопса оказались более устойчивы к хлоридному засолению чем клетки сортов Московская-35 и Саратовская-29, но чувствительнее чем клетки целинных сортов.Эти результаты согласуются с данными,полученными ранее в лаборатории Бутенко Р. Г.

• При сравнении влияния хлоридного и сульфатного засоле-йия на рост культивируемых клеток пшеницы различных сортов можно видеть, что все испытанные сорта оказались более чувствительны. « сульфатному засолению. Так угнетение роста на 50% (LD- 50 ) при сульфатном засолении наблюдается уже

при 33.35,55" и 55 мМ длл М-35.С-29.Ц-Ю и Ц-21 соответственно. В то время как при хлоридном засолении при 70,75,145 и 150 мЫ для М -35,С-29, Ц-Ю и Ц-21 соответственно. Клетки эгилопса превзошли по устойчивости к сульфатному засолению все испытанные нами сорта (LD-50 - 105 мМ).

Интересно также, что испытанные сорта более резко отличаются между собой по отношению к хлоридному засолению (диапозон концентраций LD-50 от 70 ДО150 мМ),в то время, как различия в LD-50 культивируемых клеток на сульфатное засоление лежат в более узком диапозоне концентраций (33-55 мМ).

Известно, что основными компонентами солевого стресса являются: токсическое действие ионов и осмотический стресс, наступающий вследствие затруднения поступления воды. При сопоставлении влияния различных солей на рост растений обычно используют зквимолярные или изоосмотические концентрации этих солей. Однако, в одной из публикаций лаборатории Торпа (Канада) при изучении влияния хлорида и сульфата натрия на рост культуры клеток Brasstea campjstns (Paek 1988) оыло предложено сравнивать концентрации выравненные по содержанию ионов наткия, т.к. токсическое действие ионов натрия считается основным компонентом солевого стресса. Такой способ оценки влияния засоления на рост тканей позволяет изучать не только действие ионов натрия ,но и сопоставлять токсическое действие анионов.

Из представленных на рисунке 1 данных видно,что при сравнении эквимолярных концентраций сульфат натрия более токсичен для клеток всех, испытанных сортов пшеницы,чем хлорид (при 100 мМ Na1SQJ рост клеток угнетается до 16,20,28 и 33 % у М-35.С-29, Ц-Ю и Ц-21 соответственно,а при хлоридном до 30, 38, 62 и 83 % . Только клетки эгилопса при сравнении эквимолярных концентраций показали одинаковое угнетение роста ( около 50Х ).

Представив, полученные данные о влиянии засоления на рост каллусных клеток пшеницы и эгилопса ввиде изоосмоти-

ческих кривых ( рис. 2а) и в концентрациях выравненных по содержанию ионов натрия (Рис.26), мы обнаружили, что только целинные сорта обладают большей устойчивостью к хлоридному засолению и чувствительны к сульфатному. Сорта Саратовская-29 и Московская-35 по-видимому одинаково чувствительны и к хлориду и к сульфату. На примере этих сортов хорошо выявляется, что нельзя отдавать предпочтение одному из компонентов солевого стресса (осмотическому или токсическому). Так по изоосмотическим кривым сорт Саратовская-29 чувствителен к сульфатному засолению. Однако,такая чувствительность объясняется повышенной концентрацией ионов натрия в изоосмотических точках сульфата натрия по сравнению с хлоридом. При равных концентрациях ионов натрия рост тканей ингибируется одинаково при хлоридндом или сульфатном засолении. '

Для сорта Московская-35 при сопоставлении влияния изоосмотических концентраций солей на рост тканей не обнаруживается различий, между сульфатом или хлоридом натрия. Можно предположить, что основным в ответе на солевой стресс для этого сорта является осмотическая регуляция. В то время, как для сорта Саратовская-29 основным является токсический компонент солевого стресса .

Анализируя представленные данные, следует иметь в виду, что каждый из этих способов выражения данных не является универсальным и имеет свои недостатки, так как: выделяет только одну компоненту такого сложного признака, как ответ на солевой стресс, :.Так при анализе изоосмотических кривых следует учитывать,что.в изоосмотических точках концентрация ионов натрия в варианте сульфатного засоления в двое превышает концентрацию . натрия при хлоридном засолении. При выравниванию:по натрию следует иметь в виду ошибку вносимую различным осмотическим давлением, создаваемым различными солями. ' .

" Сопоставляя результаты' влияния хлоридного и сульфатного ' засоления на рост клеток пшеницы выраженные тремя способами можно заключите, что сравнение:эквимолярных кон-

центраций не раскрывает истинной картины токсичности той или иной соли.Когда же данные выражаются в параметрах компонентов солевого стресса (осмотических и токсических) можно рассчитывать на выявление сортовой специфики ответа на хло-риднсе и сульфатное засоление.

Влияние водного стресса на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы

Для выявления степени отрицательного действия осмотического Фактора изучали влияние неионных осмотиков на рост культивируемых клеток пшеницы и згилопса S культуре клеток водный стресс моделировали добавлением в среду полизтиленг-ликоля с молекулярной массой 6000. Результаты этого исследования представлены на рисунке 3

Из представленных данных видно,что сорта Северо-Казахстанской селекции более устойчивы к осмотическому стрессу, чем сорт Саратовская-29. Однако, из рисунка 3 видно, что сортовая специфика ответа на осмотический стресс на клеточном уровне не всегда соответствует полевой устойчивости сортов. Так клетки сорта Московская-35 демонстрируют большую устойчивость к водному стрессу, чем клетки сорта Сара-товская-29, тогда как полевая устойчивость к засухе у сорта Саратовская-29 общеизвестна. Такое несоответствие прежде всего объясняется тем, что устойчивость к засухе определяется не только клеточной устойчивостью к водному стрессу, но и анатомическими и морфологическими особенностями целого растения. В данном случаа, устойчивость к водному стрессу клеток сорта Московская-35, можно объяснить наличием в ее родословной озимого сорта Мироновская-808,что могло способствовать приобретению признака осмоустойчивости.

Таким образом, из полученных данных видно,что водный стресс моделируемый в культуре тканей позволяет оценить генотипы по их способности к осморегуллции на клеточьсм уров-

не, но не позволяет судить о засухоустойчивости целых растений. Тем не менее,использование в качестве селектирующего агента полизтиленгликоля при клеточной селекции может позволить отобрать клеточные линии с повышенной осмоустойчи-востью,а возможность появления морфологических изменений в результате сомаклональной изменчивости делает постановку задачи улучшения сортов пшеницы методами клеточной селекции весьма реальной.

Отбор донорных растений.

Известно, что многие сорта представляют собой популяции, т.е. сорта гетерогенны и могут состоять из нескольких биотипов. Кроме того, существует внутрипопуляционная вариабельность. Поэтому представлялось интересным провести предварительный отбор внутри сорта на уровне проростков более устойчивых форм, которые в дальнейшем использовать в качестве донорных растений. .

Для этой цели мы проращивали семена двух сортов пшеницы (Ц-21 и Ц-Ю ) в присутствии 1% ЫаСГ и Проросшие в стрессовых условиях семена высаживали в почву и незрелые зародыши из этих растений являлись эксплантами для культуры клеток. Каллусные ткани в возрасте четырех месяцев (т.е.в четвертом пассаже) подвергали солевому стрессу.

Результаты данного эксперимента показали, что каллусные клетки полученные из отобранных растений сорта Целинная -юбилейная реагируют на хлоридное засоление также, как ткани, полученные, из всей популяции сорта.- Однако для. сорта Целинная-21 клеточные линии, полученные от растений проросших в стрессовых условиях демонстрируют большую устойчи-вочть и к хлоридному и к сульфатному засолению.- , .

Таким образом, основываясь на результатах данного : эксперимента можно сделать вывод, что отбор донорных расте-: ний молоэт повысить (хотя и не всегда) эффективность отбора ; на клеточном "уровне, ввиду повышения стартового уровня ус-

тойчивости.

- 10 -Селекция in vitro.

В нашей работе основным принципом клеточной селекции на устойчивость к хлоридному и сульфатному засолению являлось длительное культивирование тканей пшеницы в стрессовых условиях.

Селекцию проводили по двум схемам. Различия между этими схемами заключались лишь в первом пассаже. В одном случае концентрации солей в первом пассаже были адаптивными (85,5 тМ для ЧаС1 и 35 тМ для NalS01)с последующим переносом тканей на сублетальные концентрации. В другом случае селекцию начинали сразу с суолетальных концентраций селектирующего фактора (17l(nM NaCl или 70 mM Na4S0,) и культивировали в этих условиях до десятого пассажа.

Мы проследили судьбу эксплантов при культивировании тканей в стрессовых условиях Как мы отмечали ранее, селекцию начинали с четвертого пассажа В каждом варианте было по 16 эксплантов. Экспланг считали живым, если при пересадке на свежую питательную среду его приходилось делить, хотя бы на двое. Результаты этих наблюдений представлены на рисунке 4

Из приведенных данных видно, что у чувствительных к засолению сортов от 50 до 70 Z эксплантов гибнет уже после второго пассажа в селективных условиях независимо от схемы селекции. Однако , можно видеть, что дат после пятого пасоажа в стрессовых условиях остается достаточно большое количемво растущих эксплантов, осооенно в тех случаях, когда селекцию начинали' с адаптивных концентраций. Основываясь на этих данных мочшо заключить, что для отсора устойчивых к засолению клеточных линий пшеницы необходимо • длительное культивирование в стрессовых условиях.

В результате длительной селекции в условиях хлоридного и сульфатного засоления нами выделено 5 клеточных линий сорта Целинноя-21, 3 линии сорта Целинная- юбилейная и одна

8.100 аз

60 100 160 200 концентрация ЫаО(тМ)

• Ц-21 -+-Ц-Ю .-«-с-29

-М-35

Эг.

20 . 40; • концентрация

-Ц-21 л-+-Ц-Ю- ,-*-С-

ео во

N0 (тм)

2 4

29 '

■Зг.

Рис.Х. Влияние хлоридаого (а) и сульфатного (б) засоления на рост каллусной ткани различных сортов пшеницу и эгилопса.

Рис. 2. Влияние *лоридаога к с>льЬатного засолен.ш »а рост к^ллусииу TKaiieii различных сортов п^еинш и чгилопса

а) сравнение изо ¡алогических кокизаг^ютй солей. О) сравнение концентраций, EbipaJ шнны* го сояертсан.щ И0110В натрия.

о

о 6 ю 16 г о

концентрация ПЭГбООО (X)

-Ц-21 -+- Ц-Ю -*- С-29 М-35 Эг.

Влияние полиэтиленгликоля на рост каллусшх гкаяей различных сортов пшеницы и эгилолса.

—Ц-21—ц-ю —ы-35 ""С-29 Рис, 4. Динамика гиоели эксялантов при различных схемах клеточной селекции а) X пассаж - ь5,5 им ЫаС1, последующие - 171 ни 0) Т гассыж и гос^едующке ьа сриле, содержа«.»1. 1?! им ЫаС1.

Рис. 3.

ЯШ о ман. ЖЗ аоотм ман. СЗЗ ттм ыаО Гис.5. Влияние изоосмотичвских концентраций тглорида

натрия и маннита на рост устойчивых клеточных линий пшенида. -

Т. Целинная-?! контроль)

2. АССК11

3. Целинная-юбилейная ^контроль)

4. ВССК6

Са) АССК1-1

Рис. 5. Индукция каллуса из незрелйх зародышей при хлоридном (а) и сульфатном (б) засолении.

линия сорта Саратовская-29. Причем почти все отобраны при селекции на средах,содержащих 171 шМ ЫаС1. Только одна линия отобрана при селекции на средах, содержащих Ыа^^и одна на полиэтиденгликоле. Устойчивые клеточные линии обозначали как Селектированные Сомаклоны (ССК). Буква перед абревиатурой обозначает сорта, где А-Целинная-'¿V, В - Целинная-юбилейная; С Саратовская-29. В таблице 1 представлены отобранные клеточные линии

Таблиц^ I.

селектир. N линии фактор.

время число

селекции регенерантов (месяц)

АССК1 N301 10 17

АССКЗ МаС1 10 19

АССК6 N¿£¡1 13 18

АССК11 ИаС1 17 14

АССМ.2 ЫаС1 14 4

ВССК4 МаС1 10 5

ВССК5 14 1

ВССК6 ИаС1 14 28

СССК ПЭГ 8 1

Для доказательства генетической стабильности отобранного признака принято культивировать клеточные линии в условиях отсутствия селективного давления. Такой прием обычно используют в работах по генетике соматических клеток животных, где не.т возможности провести генетический анализ потомства. Отобранные после длительной селекции клеточные линии мы культивировали 2 пассажа в неселективных условиях

с последующим возвратом на селективные среды. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Прирост биомассы каллусов отобранных линий на селективных средах.

I контр. ! 171 мМ ЫаС1 ! 70 мМ №а504 I

линии I--------1------------------Г-------------------1

I отн. р. I отн. р. I % к конт! отн. р. I % к контр!

Ц-21 580188 94±23 16,2 116118 20,0

АССК1 293143 . 137114 46,8 221127 75,4

. АССКЗ 369+16 147±19 39,8 226+23 61,2 '

АССКб 164^30 152118 92,7 192135 117,1

АССК11 4921127 103125 20,9 185130 37,6

Ц-Ю 269.121 33112 12,3 9416 36,1

ВССК5 536±77 .190+25 35,5 306141 • ♦ ' 57,0

ВССК6 22СЦ38 89+19 40,5 178Ц 4 80,9

Анализируя представленные в таблице 2 данные, можно видеть, что отобранные клеточные линии сильно различаются между собой по интенсивности роста в селективных и неселективных условиях. Следует отметить, что почти все линии значительно превосходят по приросту биомассы в стрессовых . условиях исходную форму. Только линия АССК 11 после культивирования в условиях отсутствия селективного давления почти утратила свою способность расти в условиях засоления. Таким образом, даже длительное культивирование в селективных условиях не гарантирует от отбора линий, у, которых способность расти в условиях засоления обусловлена физиологической адаптацей. . --■ •

Обращает на себя внимание 'линия АССК6, которая проде-

монстрировала способность расти в условиях засоления лучше (или такжз) как и в контроле. Невидимому нам удалось отобрать клеточную линию, обладающую признаком солезависимоси и.

Хотелось бы отметить, что при рассчете % к контролю в этой таблице данные соотносили к приросту данной клеточной линии в отсутствии стресса Если же соотносить данные о росте отобранных клеточных линий в условиях засоления к приросту исходных (неселектированных) тканей в стрессовых условиях, результат становится еще солее уоедительным

Для разделения токсического и осмотического компонентов солевого стресса мы культивировали некоторые из оюо-ранных линий на средах, содержащих маниит или НаС1 в изоос-мотических ксущентрациях ( 0,3 М маннит- 1% N¿01). Результаты этого эксперимента приведены на рисунке 5.

Анализируя полученные данные можно сказать,что клетки исходных сортов,не подвергавшиеся селекции, реагируют на осмотический стресс, вызванный неионным осмотиком, и на солевой стресс, вызванный ЫаС1, однотипно. Значительно ингиби-руется рост тканей добавлением О 3 М маннита и увеличивается это угнетение роста введением токсического компонента. Ответ отобранных клеточных линий на стрессовые агенты оказался различен. Клеточная линия АОСКИ при высокой устойчивости к осмотическому стрессу оказалась чувствительной к токсическому действию ионов Иа. Для клеточной линии ВССК6 угнетение роста, вызванное осмотическим стрессом, почти не увеличивается введением токсического компонента. Можно предположить ,. что устойчивость к засолению у клеточной линии ВССК6 базируется на устойчивости к токсическому действию ионов цатрия.

Результаты этого эксперимента говорят об ошибочности сделанного наш ранее вывода о физиологической адаптации линии АССК11. Можно утверждать, что в результате длительной селекции на еольсодержаших средах отобраны стабильные клеточные линии устойчивые к засолению (АССК1, АССКЗ, ЛССК6, ВССК5 и ЕССК6) и к водному стрессу (АССК11).

- 14 -

Следующим этапом нашей работы было получение растений-регенерантов из устойчивых клеточных линий и доказательство возможности передачи признака солеустойчивости в. цепи клет- -. ка-растение-клетка.

Регенерация растений из устойчивых клеточных линий. -

Как было отмечено ранее, отселектированные клеточные линии различались между собой по интенсивности роста в селективных и неселективных условиях. Кроме того, они отличались от контрольных тканей того же возраста по своей морфологии (имели белый цвет и не содержали зеленых морфогенных очагов,что характерно для морфогенных тканей пшеницы).

Для регенерации растений из устойчивых клеточных.линий мы использовали селективные и неселективные среды. Выло установлено,- что морфогенез, как у устойчивых тканей так и у контрольных, в неселективных условиях проходит эффективнее, чем в присутствии 171 mM NaCl. Так от 70 до 100 % эксплантов контрольных и устойчивых линий дают регенерацию в неселективных условиях, тогда как в.присутствии хлоридного засоления от О до 50 %. Контролем в данном эксперименте служили каллусные ткани исходного сорта того же возраста. Интересно, что при индукции морфогенеза в присутствии NaCl у контрольных тканей образовывались морфогенные зоны и маленькие рас-' теньица, но в последствии они желтели и погибали,тогда как регенеранты из устойчивых клеточных:линий имели зеленую окраску и развивались нормально. В. таблице 1 ' предстаплены данные о количестве растений-регенерантов,полученных из устойчивых клеточных линий. .

Для изучения влияния засоления. на развитие растений in vitro мы помешали сформировавшиеся растеньица, на среды, содержащее 1/2 минерального состава среды МС и 0,7% NaCl для дальнейшего развития и укоренения. В результате было установлено, что не все растения, образовавшиеся из устойчивых клеточных линий способны к укоренению в стрессовых

условиях. Контролем в данном эксперименте служили растения- регенеранты, полученные из тканей не подвергавшихся селекции. основная масса контрольных растений желтела и погибала Однако, среди контрольных растений обнаружилась одна форма, которая нормально развивалась в условиях засоления, что говорит о возможности отбора среди сомаклональ-ныу вариантов форм, обладающих признаками устойчивости. К сожалению небольшая выборка не позволяет нам делать выводы о частоте возникновения этих форм.

Исходя из полученных данных можно заключить, что селекция на клеточном уровне, дополненная селекцией~Иа Уровне растений-регенерантов, позволяет отобрать устойчивые формы, у которых признак устойчивости экспрессируется и на клеточном и на организменном уровне.

Для теоретических и практических целей нашей работы особенно важно было показать, что признак отобранный на клеточном уровне и экспрессируемый на уровне целого растения передается семенному поколению. Для этого было необходимо подобрать адекватный, доступный метод, позволяющий проводить первичный скрининг на уровне растений.

Прежде всего нами был испытан, часто применяющийся в селекционной практике, метод определения энергии прорастания семян в стрессовых условиях /Удовенко 1988/. Проанализировав таким образом семена исходных сортов, мы обнаружили, что этот метод,вопреки утверждениям авторов, не позволяет тестировать испытанные сорта в соответствии их полевой устойчивости. Согласно полученным нами результатам сорт Мос-ковская-35 превосходит целинные сорта и по солеустойчивости И по устойчивости к засухе.

Также не дала положительных результатов и попытка проращивания незрелых зародышей в стрессовых условиях Однако, используя в качестве теста индукцию каллуса из незрелых зародышей в стрессовых условиях мы получили результат не противоречащий полевой устойчивости и реакции на солевой стресс культивируемых клеток (Рис. б ).

- 16 -

Следует отметить,что при сравнении результатов представленных на рисунках б и 1 можно видеть, что дедифференци-рующиеся клетки более чувствителены к солевому стрессу, чем клетки прошедшие несколько этапов субкультивирования. Эти результаты согласуются с результатами, полученными ранее в лаборатории Торпа на культуре клеток Brassica napus и Brassica campestris. Объяснением повышенной чувствительности к солевому стрессу тканей при каллусогенезе может служить тот факт, что при дедифференциации в стрессовых условиях ткань зародыша испытывает два стресса - дедифференциа-цию и солевой стресс.

Таким образом, для анализа растений-регенерантов мы использовали метод индукции каллуса из незрелых зародышей в присутствии О,3Z NaCl, причем донорными растениями нам служили растения-рогенеранты (Rl).To есть,анализу подвергались соматические клетки следующего поколения (R2). На рисунке & точкой обозначена интенсивность каллусогенеза из незрелых зародышей растения, подученного из клеточной линии АССК1.

Мы видим,что по индукции морфогенного каллуса из незрелых зародышей в присутствии О,3X NaCl потомство устойчивой клеточной линии почти вдвое превосходит исходный сорт, что может служить доказательством стабильности 'отобранного признака и его наследуемости.: . ,

Кроме того, для проверки семенного потомства расте-нийрегенерантов мы проращивали незрелые зародыши in vitro в условиях солевого стресса, затем переносили их в почву и после адаптации к почвенным условиям поливали 1% раствором NaCl. Полив продолжали до тех пор, когда растения переходили в стадию цветения. Контролем в этих экспериментах служили растения, полученные из семян.' После завершения всего периода развития растения подвергли морфометрическому анализу. Некоторые результаты этого анализа приведены в таблице 3. ' *

Таслица 3

Ростовые характеристики первого семенного поколения растений, полученных из устойчивой клеточной линии АССКЬ

кол-во высота длина длина кол-ве кол-во Вариант побегов раст. флаг. колоса колос- зерен на 1 раст. (см) листа (см) ков. в кол.

Ц-21 -НаС1 +ИаС1 АССК1-1 -ИаС1 +ИаС1

5,3+2 1

7.3*3 1.8Ц

90122 51±10

71 ±4 67±10

12,3±3 6,9±1

20,0±3 15,8±5

7.6+2 4,6±1

7, 4±1 6,8±1

17,5+2 9,013

13.5+1 12.3+2

20,2±4 6,313

14,31? 11,016

Из представленных данных видно, что потомство растения- регенеранта по всем показателям превосходит исходный сорт. Особенно обращает на себя внимание длина флагоього листа, которая у растений, полученных из устойчивой клеточной линии превосходит родительский сорт и в контроле л в опыте. Все растения исходного сорта, росшие в условиях засоления оказались стерильными, в то время как растения иа устойчивой клеточной линии завязали семена.

Основываясь на полученных данных. можно заключить, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне передается целому растению и наследуется. К сожалению, ввиду ограниченности во времени, нам удалось проанализировать потомство только одной устойчивой клеточной линии.

Выводы

1. Показано,что методами клеточной селекции могут Сыть созданы формы пшеницы, превосходящие по устойчивости к за-

солению родительский сорт.

2. Установлено, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, экспрессируется на уровне целого растения и передается по наследству.

3. Выявлено, что длительное культивирование на сольсо-держащих средах позволяет отобрать генетически стабильные клеточные линии устойчивые к засолению или водному стрессу.

4. Установлено, что на уровне культивируемых клеток сохраняется сортовая специфика ответа на солевой стресс,

5. Показано, что среди испытаных сортов только целинные сорта обладают чувствительностью к сульфатному засоле-, нию. ; •

6. Предложен ряд приемов для совершенствования технологии селекции и сокращения сроков проверки растений-реге-нерантов пшеницы и их потомства

Публикации.

Joseph E.J. .Nikiforova I.D. Tissu© culture for salt resistance In wheat. Abstracts of V International Youth Symposium on Plant Metabolism Regulation. Varna 1990.

Объем I1/» п л

Заказ 1847

Тираж 100

Типография Московской с -х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул. 44