Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к стрессам

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к стрессам"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ЕАТТАТХОТТАМ Джозеф Джозеф

НЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССАМ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в лаборатории генной и клеточной инжс нерии отдела сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Научный руководитель — кандидат биологических нау Никифорова И. Д.

Официальные оппоненты: доктор биологических нау Шамина 3. Б., кандидат биологических наук Аветисов В. А

Ведущее учреждение — Московский государственны университет, биологический факультет.

Защита состоится 1 октября 1991 г. в на заседани

специализированного ученого совета Д. 120.35.07 в Москос ской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязеве

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, секто защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной науч ной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан «/3 » . 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

А. С. Лосева

Актуальность проблемы. Возрастающая с каждым годом потребность в пище для человека и животных и сокращение пригодных для сельского хозяйства .земель делает особенно актуальной задачу создания форм и сортов культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды [засолению почв, засухе). Проблема становится еще более острой, если учесть повышение засоления почв при орошаемом земледелии. Только в Индии потеря земли из-за накопления золей при поливном земледелии составляет в год примерно юсколько сотен квадратных километров (Flowers 1977).

Пшеница - одна из важнейших зерновых культур в миге. Создание форм и сортов, устойчивых к засолению и засухе, юзволит снизить потери урожая от неблагоприятных факторов 'Кружащей среды и Еовлечь в сельскохозяйственную практику овые земли.

Успешное применение клеточных технологий для создания олеустойчивых форм важных сельскохозяйственных растений, аких как - томаты, рис, люцерна и др. создает положитель-ую перспективу для привлечения этих методов к селекции шеницы. Кроме того,не вызывают сомнений преимущества ис-эльзования методов культуры клеток для изучения фундамен-альных основ солеустойчивости на клеточном уровне.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было издание методами клеточной селекции на базе сомаклональной фиабельности форм яровой пшеницы, устойчивых к засолению засухе. Для выполнения этой цели были поставлены следующие дачи:

- изучить влияние засоления (хлоридного и сульфатного) и водного стресса на культуру меток пшеницы различных сортов.

- провести селекцию на клеточном уровне на резистентность к хлоридному и сульфатному засолению и водному стрессу.

- изучить свойства отобранных клеточных линий.

- получить растения-регенеранты из устойчивых клеточных линий.

- провести оценку растений-регенерантов в отношении сохранения признака устойчивости при переходе от клеточного уровня на уровень целого растения и пере- дачи этого признака в поколениях. Научная новизна работы. В работе впервые методами клеточной селекции получены солеустойчивые растения-регенеран-ты пшеницы и проанализировано семенное поколение этих растений. Установлена возможность сохранения признака солеустойчивости при переходе от клеточного уровня на уровень целого растения. Показана наследуемость признака устойчивости, что доказывает генетическую природу изменений,произошедших при культивировании клеток пшеницы и отобранных при клеточной селекции. Предложены новые подходы для сокращения сроков необходимых для анализа растений-регенерантов.

Практическая ценность работы. Созданные в результате работы резистентные формы яровой пшеницы могут служить основой для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к засолению и засухе,что позволит сократить потери урожая от неблагоприятных факторов окружающей среды. Данные формы могу^ служить донорами устойчивости и могут быть включены в селекционный процесо.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на Международной конференции молодых ученых в Болгарии в 1990г., на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им^ К. А. Тимирязева в 1989 и 1990 годах, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликована одна работа. /

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической ча!сти, результатов и обсуждения. Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста, содержат 11 таблицы,10рисунков и Щ фотографий. Библиография содержит 250 источников отечест-' венной и зарубежной литературы,

- 3 -

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы сорта яровой пщеницы ( ТгШсшп аезЫушп) селекции Севе-ро-Казахстанского селекционного центра (ВНИИЗХ, Шэртанды)-Целинная-21 (Ц-21) и Целинная-юбилейная. (Ц-Ю).Саратовской селекции - Саратовская-29 (С-29).занимающий основные посевные площади Северного Казахстана и Московской селекции -Московская-35 (М-35). Кроме того, объектом исследования был дикий сородич пшеницы - Аей11орз зреИо1йез (диплоидная форма N 452 кат. ВИР ).

Каллусную культуру получали из незрелых зародышей (14-16 дней после цветения ) на модифицированной среде Мураси-ге-Скуга (МС) с добавлением 2мг/л 2,4Д. Культивирование проводили при температуре 27 *С и постоянном освещении. Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые 4 недели. Интенсивность роста каллуса, определяли по степени Прироста сырой массы каллуса. Обозначали интенсивность прироста, как относительный рост и рассчитывали по формуле:

сырая масса Z - сырая масса 1

Отн. рост ------------------------------- 100 ,

сырая масса 1

где сырая масса 1 - вес экспланта,

сырая масса 2 - вес экспланта в конце пассажа.

Такой вариант' определения интенсивности роста позволяет избежать ошибки от влияния на рост величины экспланта. Определение интенсивности прироста биомассы проводили в 1015 кратной повторности. Прирост биомассы в стрессовых условиях выралшда ,как 7. к контролю ( то есть к росту каллуса панной линии на неселективной среде).

Для изучения влияния солей на рост каллусных культур зазличных сортов пшеницы и для клеточной селекции использо-зали только ' морфогенный каллус. Масса зксплантов в экспери-

- 4 -

ментах варьировала от 20 до 35 миллиграмм.

Клеточную селекцию проводили по различным схемам.

Регенерацию растений из устойчивых клеточных линий проводили на среде Мурасиге и Скуга в селективных условиях. Полученные растеньица (R1) переносили на среду, содержащую 1/2 солей МС и 0,5% NaCl. После укоренения растения переносили в почву.

Оценку потомства растений- регенерантов (R2) проводили на клеточном уровне с помощью индукции каллуса из незрелых зародышей в селективных .условиях, а также на уровне целых растений, полученных при проращивании незрелых зародышей растений-регенерантов в условиях in vitro при засолении и дальнейшем выращивании растений в почве при поливе 1% раствором NaCl.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния засоления на культивируемые клетки различных сортов яровой пшеницы.

Повышение солеустойчивости и засухоустойчивости, для сортов районированых в Северном Казахстане весьма актуально, т. к. земли этого региона подвержены хлоридному и сульфатному засолению ( Строгонов 1976). Попытка достичь повышения устойчивости ' методами клеточной .инженерии представляется правомочной ввиду того, что в литературе существуют данные /Orton 1980,Warren 1982/, свидетельствующие, в пользу клеточного механизма устойчивости к засолению,лежащего в основе солеуст^чивости однодольных. Поэтому создание устойчивых форм пшеницы на базе устойчивых клеточных' линий может оказаться продуктивным подходом. •

Основные трудности, с которыми сталкиваются исследователи при работе по клеточной селекции- -'это-невозможность получить растения-регенеранты из устойчивых клеточных линий, ввиду утраты тканью способности к морфогенезу.

Кроме того, невсегда устойчивость к стрессу на клеточном уровне экспрессируется на уровне целого растения и,тем более, наследуется в поколениях.

Использованные в данной работе сорта' пшеницы ( Мэс-Ковская-35, Саратовская-29, Целинная-21 и Целинная-юбилейная ) являются сортами различного эколого-географического происхождения и обладают различной полевой устойчивостью к засухе и засолению почв.

В работах выполненных ранее в ИФР АН СССР (Бутенко 1988)на различных сортах пшеницы было показано,что эффективность клеточной селекции возрастает, если использовать не первичный каллус,а каллус прошедший несколько субкультивирований. Поэтому в нашей работе для селекции и для изучения ростовых характеристик исходных форм мы использовали ткани из четвертого пассажа.

На рисунке 1 приведены результаты изучения влияния хлоридного(а) и сульфатного (б) засоления на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы и эгилопса.

Прежде всего из представленных данных видно, что на клеточном уровне выявляется сортовая специфика ответа на солевой стресс, и она соответствует полевой устойчивости целых растений. То есть, клетки сорта Московская-35 демонстрируют большую чувствительность к засолению, чем клетки целинных сортов. На основании представленных данных мы можем ранжировать сорта по устойчивости к хлоридному засолению в порядке возрастания: М-35, С-29, Ц-Ю, Ц -21. Клетки эгилопса оказались более устойчивы к хлоридному засолению чем клетки сортов Московская-35 и Саратовская-29, но чувствительнее чем клетки целинных сортов. Эти результаты согласуются с данными,полученными ранее в лаборатории Бутенко Р. Г.

При сравнении влияния хлоридного и сульфатного засоле-йия на рост культивируемых клеток пшеницы различных сортов можно видеть, что все испытанные сорта оказались более чувствительны,к сульфатному засолению. Так угнетение роста на 50% ( Ю- 50 ) при сульфатном засолении наблюдается уже

при 33,35,55*и 55 мМ для М-35,0-29,Ц-Ю и Ц-21 соответствен но. В то время как при хлоридном засолении при 70,75,145 и 150 uU для М -35,0-29, Ц-Ю и Ц-21 соответственно. Клетки эгилопса превзошли по устойчивости к сульфатному засолению все испытанные нами сорта (LD-50 - 105 мМ).

Интересно также, что испытанные сорта'Солее резко отличаются между собой по отношению к хлоридному засолению (диапозон концентраций LD-50 от 70 до150 мМ),в то время, как различия в LD-50 культивируемых клеток на сульфатное засоление лежат в более узком диапозоне концентраций (33-55 NM). • -

Известно, что основными компонентами солевого стресса являются: токсическое действие ионов и осмотический стресс, наступающий вследствие затруднения поступления воды. При сопоставлении влияния различных солей на рост .растений обычно используют зквимолярные или изоосмотичеекие концентрации этих солей. Однако, в одной из публикаций лаборатории Торпа (Канада) при изучении влияния хлорида и сульфата натрия на рост культуры клеток Brassica campastris (Paek 1988) было предложено сравнивать концентрации выравненные по содержанию ионов натрия, т.к. токсическое действие ионов•натрия считается основным компонентом солевого стресса. Такой способ оценки влияния засоления на рост тканей ' позволяет изучать не только действие ионов натрия ,но и сопоставлять токсическое действие анионов. ■ ,

Из представленных на рисунке 1 данных видно,что при сравнении зквимолярных концентраций сульфат натрия более, токсичен для клеток всех^'испытанных сортов пшеницы,чем хлорид (при 100 мМ Na1SOtррст клеток угнетается до 16,20,28 и 33 % у М-35,С-29, Ц-Ю и Ц-21 соответственно,а при хлоридном' до 30 , 38, 62 и 83 £ . Только клетки эгилопса при сравнении, зквимолярных концентраций показали одинаковое, угнетение роста ( около 50Х ). •

Представив, полученные данные о влиянии засоления на рост каллусных клеток пшеницы, и эгилопса ввиде изоосмоти-

ческих кривых ( рис.2а) и в концентрациях выравненных по содержанию ионов натрия (Рис.26), мы обнаружили, что только целинные сорта обладают большей устойчивостью к хлоридному засолению и чувствительны к сульфатному. Сорта Саратовская-29 и Московская-35 по-видимому одинаково чувствительны и к хлориду и к сульфату. На примере этих сортов хорошо выявляется, что нельзя отдавать предпочтение одному из компонентов солевого стресса (осмотическому или токсическому). Так по изоосмотическим кривым сорт Саратовская-29 чувствителен к сульфатному засолению. Однако,такая чувствительность объясняется повышенной концентрацией ионов натрия в изоосмоти-ческих точках сульфата натрия по сравнению с хлоридом. При равных концентрациях ионов натрия рост тканей ингибируется одинаково при хлоридндом или сульфатном засолении. '

Для сорта Московская-35 при сопоставлении влияния изоосмотических концентраций солей на рост тканей не.обнаруживается различий между сульфатом или хлоридом натрия. Можно предположить, что основным в ответе на солевой зтресс для этого сорта является осмотическая регуляция. В то зремя, как для сорта Саратовская-29 основным является ток-зический компонент солевого стресса

Анализируя представленные данные, следует иметь з ви-\у. что каждый из этих способов выражения данных не является универсальным и имеет свои недостатки, так как выделяет -олько одну компоненту такого сложного признака, как ответ [а солевой стресс. Так при анализе' изоосмотических кривых следует учитывать,что в изоосмотических точках концентрация гонов натрия в варианте сульфатного засоления в двое пре-ышает концентрацию натрия при хлоридном засолении. При ыравниванию по натрию следует иметь в виду ошибку вноси-ую различным осмотическим давлением, создаваемым различ-ыми солями.

Сопоставляя результаты влияния хлоридного и сульфат-ого засоления на рост клеток пшеницы выраженные тремя пособами можно заключить, что сравнение эквимолярных кон-

центраций не раскрывает истинной картины токсичности той или иной соли. Когда же данные выражаются в параметрах компонентов солевого стресса (осмотических и токсических) можно расс-читывать на выявление сортовой специфики ответа на хло-ридное и сульфатное засоление.

Влияние водного стресса на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы.

Для выявления степени отрицательного действия осмотического фактора изучали влияние неионных осмотиков на рост культивируемых клеток пшеницы и эгидопса. В культуре клеток водный стресс моделировали добавлением в среду лолиэтиленг-ликоля с молекулярной массой 6000. Результаты этого исследования представлены на-рисунке 3.

Из представленных данных видно,что сорта Северо-Казахстанской селекции более устойчивы к осмотическому стрессу, чем сорт Саратовская-29. Однако, из рисунка 3 . видно, что сортовая специфика ответа- на осмотический, стресс на клеточном уровне не всегда соответствует полевой устойчивости сортов. Так клетки.сорта Московская-35 демонстрируют большую устойчивость к водному стрессу, чем клетки сорта Саратовская-29, тогда как полевая устойчивость к засухе у сорта Саратовская-29 общеизвестна. Такое несоответствие прежде всего объясняется тем, ' что устойчивость к засухе определяется не только клеточной устойчивостью к водному стрессу, но и анатомическими и морфологическими особенностями целого растения. В данном случае^', устойчивость к водному стрессу клеток сорта Московск^я-35, можно объяснить наличием в ее родословной озимого сорта Ыироновская-808,что могло способствовать приобретению признака осмоустойчивости.

Таким образом, из подученных данных видно,что водный стресс моделируемый в культуре тканей позволяет оценить генотипы по их способности к осморегудяции на клеточном уров-

не, но не позволяет судить о засухоустойчивости целых растений. Тем не менее,использование в качестве селектирующего агента полиэтиленгликоля при клеточной селекции может позволить отобрать клеточные линии с повышенной осмоустойчи-востью.а возможность появления морфологических изменений в результате сомаклональной изменчивости делает постановку задачи улучшения сортов пшеницы методами клеточной селекции весьма реальной.

Отбор донорных растений.

Известно, что многие сорта представляют собой популяции, т. е. сорта гетерогенны и могут состоять из нескольких биотипов. Кроме того, существует внутрипопуляционная вариабельность. Поэтому представлялось интересным провести предварительный отбор внутри сорта на уровне проростков более устойчивых форм, которые в дальнейшем использовать в качестве донорных растений.

Для этой цели мы проращивали семена двух сортов пшеницы (Ц-21 и Д-Ю ) в присутствии 1% МаС1 и Ма.БО,. Проросшие в стрессовых условиях семена высаживали в почву и незрелые зародыши из этих растений являлись эксплантами для культуры клеток. Каллусные ткани в возрасте четырех месяцев (т.е.в четвертом пассаже) подвергали солевому стрессу.

Результаты данного эксперимента показали, что каллусные клетки полученные из отобранных растений сорта Целинная -юбилейная реагируют на хлоридное засоление также, как ткани, полученные из всей популяции сорта Однако для сорта Целинная-21 клеточные линии, полученные от растений проросших в стрессовых условиях демонстрируют большую устойчи-вочть и к хлоридному и к сульфатному засолению.-

Таким образом, основываясь на результатах данного эксперимента можно сделать вывод, что отбор донорных растений может повысить (хотя и не всегда) эффективность отбора на клеточном уровне, ввиду повышения стартового уровня ус-

тойчивоста.

- ю -Селекция т vit.ro.

. В нашей работе основным принципом клеточной селекции на устойчивость к хлоридному'и сульфатному засолению являлось длительное культивирование тканей пшеницы в стрессовых условиях.

' Селекцию проводили по двум схемам. Различия меаду этими схемами заключались лишь в первом пассаже. В одном случае концентрации солей в первом пассаже были адаптивными (85,5 шМ для ИаС1 и 35 шМ для йа4Б04)с последующим переносом тканей на сублетальные .концентрации. В другом случае селекцию начинали сразу с сублетальных концентраций селектирующего фактора (171тМ №аС1 или 70 тМ Ма^О^) и культивировали в этих условиях до десятого пассажа.

Мы проследили судьбу эксплантов при культивировании тканей в стрессовых условиях. Как мы отмечали ранее, селекцию начинали с четвертого пассажа. В каждом варианте было по 16 эксплантов. Эксплант считали живым, если при пересадке на свежую питательную среду его приходилось делить, хотя бы на двое.Результаты этих наблюдений представлены на- рисунке 4.

Из приведенных данных видно, что у чувствительных, к засолению сортов от 50 до 70 %. эксплантов гибнет уже после второго пассажа в селективных условиях независимо от схемы селекции..Однако , можно видеть, что даже после пятого пассажа в стрессовых условиях остается достаточно большое количество растущих эксплантов, особенно в тех случаях, когда • селекцию начинал^' с адаптивных концентраций. Основываясь на этих данных можно заключить, что для отбора устойчивых к засолению клеточных линий пшеницы необходимо •дли-. тельное культивирование в стрессовых условиях.

В результате длительной селекции в условиях хлоридного и сульфатного засоления нами выделена 5 клеточных линий сорта Целинная-21, 3 линии-сорта Целинная- юбилейная и одна

концентрация ЫаС1(тМ) — ц-21 —I—Ц-Ю -*- С-29 -о-М-35 -х-Эг.

концентрация N0 зо (тм)

2 Л

Ц-21 -+-Ц-Ю -*~С-29 -о-М-35 -*~Эг,

Рис.Х. Влияние хлоридного (а) и сульфатного (б) засоления на рост каллусной ткани различных сортов пшеницы и эгилопса.

'осмотич. даьл. (атм) <5и°гю/-"ш)!1 . >

Нои Нои » 'К^СЗ^

Рис. 2. Влияние хлориднога к сульфатного засоления на рост кавдсних тканей различных сортов ¡гшеаиш и агилопса

а) сравнение изоосмотических концентраций солей,

б) сравнение-концентраций, выравненных по содержанию ионов натрия. -

. 180 п

6 .10 16 ■ концентрация ПЭГ.6000 (X)

Ц-21

Ц-Ю

С-29

М-35

Эг.

Рис. 3. Влияние полиэгиленгликоля на рост каллусных тканей различных сортов тиеницы и эгилопса.

. ' -Ц-21—Ц-Ю ~°~М-35~*"С-29 Рис.4,. Динамика'гибели зксплантов при различных схемах клеточной селекции: а) 1 пассаж - 85,5 шМ МаС1, последующие - 171 л 0) 1 пассаж и последующие на среде., содержащей 171 тМ N301.

1Ш о ман. ЕШ ооотм ман. ЕЗ 171тм Ыаа Рис.5. Влияние изоосмотических донцентраиий адорида

натрия и маннита на рост устойчивых меточных линий пшениш.

Т. 11елинная~21 Сконтроль)

2. АССК11

3. Целинная-юбилейная (контроль)

4. ВССК6

—Ц-21-^Ц-Ю

Рис. 6. Индукция каллуса из незрелйх зародышей при хлоридном (а) к сульфатном (б) заселении.

линия сорта Саратовская-29. Причем почти все отобраны при селекции на средах.содержащих 171 тМ ИаС1. Только одна линия отобрана при селекции на средах, содержащих Ыа4304и одна на полиэтиленгликоле. Устойчивые клеточные линии обозначали как Селектированные Сомаклоны (ССК). Буква перед абревиатурой обозначает сорта,где А-Целинная-21; В Целинная-юбилейная; С Саратовская-29. В таблице 1 представлены отобранные клеточные линии

Таблица 1.

селектир. время число

N линии фактор. селекции регенерантов

(месяц) .

АССК1 ИаС1 10 17

АССКЗ . ИаС1 10 19

АССК6 НаС1 13 18

АССК11 N301 17 14

АССК12 МаС1 14 ' 4

•ВССК4 ИаС1 10 5

ВССК5 14 1

ВССК6 . N801 14 28

' ссск ПЭГ 8 ' 1

Для.доказательства генетической стабильности отобранного признака принято культивировать клеточные линии в условиях отсутствия селективного давления. Такой прием обычно используют в работах по' генетике соматических клеток животных, где нет возможности провести генетический анализ потомства. Отобранные после длительной селекции клеточные линии мы культивировали 2 пассажа в неселёктивных условиях

- 1г -

с последующим возвратом на селективные среды. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Прирост биомассы каллусов отобранных линий на селективных средах.

! контр.

171 мМ ИаС1

линии

отн. р.

отн. р. I % к конт

70 мМ МайБ04

отн. р. ! % к контр!

Ц-21 580+88

АССК1 293±43

АССКЗ 369Л6

АССК6 164^30

АССКИ 492+127

Ц-Ю 269.±21

ВССК5 536+77

ВССКб 220+38

94±23 16,2

137±14 46,8

147±19 39,8

152±18 92,7

103±25 20,9

33±12 12,3

190+25 35,5

89+19 40,5

116118 20,0

221+27 75,4

226+23 61,2

192±35 117,1

185±30 37,6

94±6 36,1 *

306±41 57,0

178±14 80,9

Анализируя представленные в таблице 2 данные, можно видеть, что отобранные клеточные линии сильно различаются между собой по интенсивности роста в селективных и неселективных условиях. Следует отметить, что почти все линии значительно превосходят по приросту биомассы в стрессовых условиях исходную форму. Только линия АССК 11 после культивирования в условиях отсутствия селективного давления почти утратила свою способность расти в условиях засоления. Таким образом, даже длительное культивирование в селективных условиях не гарантирует от отбора линий, у которых способность расти в условиях засоления обусловлена Физиологической адаптацей.

Обращает на себя внимание -линия АССК6, которая проде-

монстрировала способность расти в условиях засоления лучше (или также) как и в контроле. Повидимому нам удалось отобрать клеточную линию, обладающую признаком солезавискмости.

Хотелось бы отметить, что при рассчете 1 к контролю в этой таблице данные соотносили к приросту данной клеточной линии в отсутствии стресса. Если же соотносить данные о росте отобранных клеточных линий в условиях засоления к приросту исходных (неселектированных) тканей в стрессовых условиях, результат становится еще более убедительным.

Для разделения токсического и осмотического компонентов солевого стресса мы культивировали некоторые из отобранных линий на средах, содержащих маннит или NaCl в изоос-кЮтических концентрациях ( 0,3 M маннит- 1% NaCl). Результаты этого эксперимента приведены на рисунке 5.

Анализируя полученные данные можно сказать,что клетки исходных сортов,не подвергавшиеся селекции, реагируют на эсмотический стресс,- вызванный неионным осмотиком, и на cose вой стресс, вызванный NaCl, однотипно.Значительно ингиби-зуется рост тканей добавлением 0. 3 M маннита и увеличивает-:я это угнетение роста введением токсического компонента. )твет отобранных клеточных линий на стрессовые агенты ока-¡ался различен. Клеточная линия АССК11 при высокой устойчивости к осмотическому стрессу оказалась чувствительной к токсическому действию ионов Na. Для клеточной линии ВССК5 угнетение1 роста, вызванное осмотическим стрессом, почти не увеличивается введением токсического компонента. Можно предположить,. что устойчивость к засолению у клеточной линии ЗССКб базируется на устойчивости к токсическому действию юнов натрия.

Результаты этого эксперимента говорят об ошибочности ¡деланного нами . ранее вывода, о физиологической адаптации шнии АССК11. Можно утверждать, ' что в результате длительной :елекции на еольсодержащих средах отобраны стабильные кле-■очны© линии устойчивые к засолению (АССК1, АССКЗ, ACQK6, ЮСК5 и ВССКб) и к водному стрессу (АССК11).

- 14 -

Следующим этапом нашей работы было получение растений-регенерантов из устойчивых клеточных линий и доказательство возможности передачи признака солеустойчивости в. цепи клетка-растение-клетка.

Регенерация растений из устойчивых клеточных линий.

Как было отмечено ранее, отселектированные клеточные линии различались между собой по интенсивности роста в селективных и неселективных услориях. Кроме того, они отличались от контрольных тканей того же возраста по своей морфологии (имели белый цвет и не содержали зеленых морфогенных очагов,что характерно для морфогенных тканей 'пшеницы).

Для регенерации растений из устойчивых клеточных линий мы использовали селективные и неселективные среды. Было установлено,- что морфогенез, как у устойчивых тканей так и у контрольных, в неселективных условиях проходит эффективнее, чем в присутствии 171 mM NaCl.TaK от 70 до 100 % эксплантов контрольных и устойчивых линий дают регенерацию в неселективных условиях, тогда как в присутствии хлоридного засоления от 0 до 50 Контролем в данном эксперименте служили каллусные ткани исходного сорта того же возраста. Интересно, что при индукции морфогенеза в присутствии NaCl у контрольных тканей образовывались морфогенные зоны и маленькие растеньица, но в последствии они желтели и погибали,тогда как регенеранты из устойчивых клеточных линий имели зеленую окраску и развивались нормально, В таблице 1 предстаплены данные о количестве растений-регенерантов,полученных из устойчивых клеточных линий.

Для изучения влияния засоления на развитие растений in vitro мы помещали сформировавшиеся растеньица на среды, содержащие 1/2 минерального состава среды МС и 0,7% NaCl для дальнейшего развития и укоренения. В результате было установлено, что не все растения, образовавшиеся из устойчивых клеточных линий способны к укоренению в стрессовых

головнях. Контролем в данном эксперименте служили раете-шя-регенеранты, полученные из тканей не подвергавшихся се-юкции. Основная масса контрольных растений желтела и югибала Однако, среди контрольных растений обнаружилась /дна форма, которая нормально развивалась в условиях засо-[ения, что говорит о возможности отбора'среди сомаклональ-:ыу вариантов форм, обладающих признаками устойчивости. К ожалению небольшая выборка не позволяет нам делать выводы частоте возникновения этих форм.

Исходя из полученных данных можно заключить, что ее-екция на клеточном уровне, дополненная селекциейЧт'уроъ-е растений-регенерантов, позволяет отобрать устойчивые ормы, у которых признак устойчивости экспрессируется и на леточном и на организменном уровне.■

Для теоретических и практических целей нашей работы гобенно важно, было показать, что признак отобранный на леточном уровне к экспрессируемый на уровне целого расте-ля передается семенному поколению. Для этого было необхо-ímo подобрать адекватный, доступный метод, позволяющий доводить первичный скрининг на уровне растений.

Прежде всего нами был испытан, часто применяющийся а ; лекционной практике, метод определения энергии ярораста-1Я семян в стрессовых условиях /Удовенко 1988/. Проанализи-)вав таким образом семена исходных сортов, мы обнаружили, ■о этот метод,вопреки утверждениям авторов, не позволяет ютировать испытанные сорта в соответствии их полевой :тойчивости. Согласно полученным нами результатам сорт Мос-|Вская-35 превосходит целинные сорта и по солеустойчивости по устойчивости к засухе.

. Также не дана положительных результатов и попытка прошивания незрелых зародышей в стрессовых условиях Однако, пользуя в качестве теста индукцию каллуса из незрелых за-дышей в стрессовых1условиях мы получили результат не про-воречаший полевой устойчивости и реакции на солевой ресс культивируемых клеток (Рис.6 ):

Следует отметить,что при сравнении результатов представленных на рисунках б и 1 можно видеть, что дедифференци-рущиеся клетки более чувствителены к солевому стрессу, чек клетки прошедшие несколько этапов субкультивирования. Эту результаты согласуются с результатами, полученными ранее е лаборатории Торпа на культуре клеток Brassica napus и Brassica campostris. Объяснением повышенной чувствительности к солевому стрессу тканей при каллусогенезе может служить тот факт, что при дедифференциации в стрессовых условиях ткань зародыша испытывает два стресса - дедифференциа-цию и солевой стресс.

Таким образом, для анализа растений-регенерантов мы использовали метод индукции калл.уса из незрелых зародышей в присутствии 0,3% NaCl, причем донорными растениями нам служили растения-регенеранты (Rl).To есть,анализу подвергались соматические клетки следующего поколения (R2). На рисунке & точкой обозначена интенсивность каллусогенеза из незрелых зародышей растения, полученного из клеточной линии АССК1.

Мы видим,что по индукции морфогенного каллуса из незрелых зародышей в присутствии 0,3% NaCl потомство устойчивой клеточной линии почти вдвое превосходит исходный сорт, что может служить доказательством стабильности отобранного признака и его наследуемости.

Кроме того, для проверки семенного потомства раете-нийрегенерантов мы проращивали незрелые зародыши in vitro в условиях солевого стресса, затем переносили их в почву и после адаптации к почвенным условиям поливали IX раствором NaCl. Полив продолжали до тех пор, когда растения переходили в стадию цветения. Контролем в этих экспериментах служили растения, полученные из семян. После завершения всего периода развития растения подвергли морфометрическому анализу. Некоторые результаты этого анализа приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Ростовые характеристики первого семенного поколения растений, полученных из устойчивой клеточной линии АССК1.

кол-во высота длина длина кол-во КОЛт во

ариант побегов раст. флаг. колоса колос- зерен

на 1 раст. (см) листа (см) ков. в кол.

Ц-21

-N301 5,3+2 90±22 12,3±3 7,6±2 17,5±2 20,2+4

+МаС1 1 51 ±10 6,9±1 4,6±1 9,0±3 6,3+3

АССК1-1

-МаС1 7,3±3 71±4 20,0±3 7-, 4±1 13,5+1 14,3±7

+МаС1 1, 8±1 67±10 15,8±5 6,8±1 12,3+2 11,0±б

Из представленных данных видно, что потомство расте-ля-регенеранта по всем показателям превосходит исходный ?рт. Особенно обращает на себя внимание длина флагового тета, которая у растений, полученных из устойчивой кле-эчной линии превосходит родительский сорт и в контроле и 'опыте. Все растения исходного сорта, росшие в условиях юоления оказались стерильными, в то время как растения } устойчивой клеточной линии завязали семена.

Основываясь на полученных данных, можно заключить, ?о признак устойчивости,, отобранный на клеточном уровне ;редается целому растению и наследуется. К сожалению, вви-г ограниченности во времени, -нам удалось проанализировать )ТОМСТВО только одной устойчивой клеточной линии.

• Выводы

1.. Показано, что ме.тодами неточной селекции могут быть 1зданы формы пшеницы, превосходящие' по устойчивости к за-

солению родительский сорт.

2. Установлено, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, зкспрессируется на уровне целого растения и передается по наследству.

3. Выявлено, что длительное культивирование на сольсо-держащих средах позволяет отобрать генетически стабильные клеточные линии устойчивые к засолению или водному стрессу.

4. Установлено, что на уровне культивируемых клеток сохраняется сортовая специфика ответа на солевой стресс.

5. Показано, что среди испытаных сортов только целинные сорта обладают чувствительностью к сульфатному засолению.

6. Предложен ряд приемов для совершенствования технологии селекции и сокращения сроков проверки растений-реге-нерантов пшеницы и их потомства.

Публикации.

Joseph Е. J. .Nikiforova I.D. Tissue culture for salt resistance in wheat. Abstracts of V International Youth Symposium on Plant Metabolism Regulation. Varna 1990.