Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная модель нейрофибриллярной патологии болезни Альцгеймера и FTDP-17 на основе мутантных форм белка tau

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Клеточная модель нейрофибриллярной патологии болезни Альцгеймера и FTDP-17 на основе мутантных форм белка tau"

На правах рукописи

ХЛИСТУНОВА Инна Ивановна

КЛЕТОЧНАЯ МОДЕЛЬ НЕЙРОФИБРИЛЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И FTDP-17 НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ БЕЛКА TAU.

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2005

Работа выполнена в лаборатории структурной молекулярной биологии, Общество Макс-Планка, Гамбург, Германия

Научный руководитель: профессор Экхард Мандельков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Новоселов Владимир Иванович

доктор биологических наук Косенко Елена Александровна

Ведущая организация: Филиал Института Биоорганической Химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Защита диссертации состоится « 18 » мая_2005 г. в 15-30 часов

на заседании Диссертационного совета Д002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан « 18 » апреля_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Кандидат физико-математических наук _ //'¿¿¿¿с^ Н.Ф. Панина

Введение

Актуальность темы.

Болезнь Альцгеймера является одним из самых распространенных дегенеративных заболеваний нервной системы [Ernst and Hay, 1994; Hebert et al., 1995]. На клеточном уровне для этой болезни характерны нейрофибриллярные сплетения, состоящие из спиралеобразных филаментов белка tau [Kidd, 1963]. Аналогичные нейрофибриллярные структуры наблюдаются при группе заболеваний, объединенных под общим названием фронто-темпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17)[Foster et al., 1997]. Была установлена однозначная корреляция образования этих структур со степенью развития деменции и показано, что их накопление приводит к гибели нейронов [Nagy et al., 1995].

На сегодняшний день описано лишь небольшое количество работ по созданию клеточных моделей для изучения молекулярных механизмов нейрофибриллярной патологии. Ни одна из предложенных моделей на основе полноразмерного белка tau не была адекватна, поскольку в них присутствовали лишь отдельные филаменты при отсутствии характерных нейрофибриллярных сплетений.

Новизна нашего подхода при создании клеточной модели заключалась в использовании конструктов, содержащих только Repeat-region tau, поскольку из литературных данных известно, что этот участок является центральным ядром патологических нейрофибриллярных сплетений [Wischik et al., 1988]. Для получения клеточной модели были использованы охарактеризованные в нашей лаборатории конструкты, приводящие к образованию филаментов in vitro [Barghom et al., 2000].

Цели исследования: Целью работы было создание экспериментальной клеточной модели нейрофибриллярной патологии при болезни Альцгеймера и FTDP-17 на базе мутантных форм белка tau.

Задачи исследования:

1. Получить стабильные индуцибельные клеточные линии нейробластомы мыши, экспрессирующие различные конструкты на основе Repeat-region белка tau.

2. Выявить и охарактеризовать агрегаты мутантных форм белка tau, на клеточном уровне.

3. Провести сравнительный анализ полученных линий для выбора перспективной экспериментальной клеточной модели.

Научная новизна и практическая ценность работы:

1. В ходе работы были получены и охарактеризованы стабильные индуцибельные клеточные линии нейробластомы мыши (N2a tet on), экспрессирующие мутантные формы белка tau (К18; К18/ДК280; К18/ДК280Л277Р/308Р).

2. Было показано образование на клеточном уровне филаментозных высокомолекулярных агрегатов белка, аналогичных патологическим нейрофибриллярным сплетениям, обнаруживаемым в нейронах при болезни Альцгеймера и FTDP-17 .

3. Впервые полученная экспериментальная модельная система нейрофибриллярной патологии, была испытана в скрининге лекарственных веществ.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на конференциях: International Conference on Cell and Molecular Biology, Hamburg, Germany, 2002;

5th Hamburg Conference on Alzheimer Disease, Hamburg, Germany, 2002; The 8th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Stockholm, Sweden, 2002;

The 9th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Philadelphia, Pensylvania, USA, 2004.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 92 страницах машинописного

текста, содержит _3__таблицы и 27__рисунков. Список

литературы содержит 128 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение стабильных индуцибельных клеточных линий нейробластомы мыши (N2a tet он), зкспрессирующих конструкты на основе Repeat-region белка tau (KJ8; К18/АК280; К18/АК280Л277Р/308Р).

Для создания клеточной модели были получены стабильные индуцибельные клеточные линии нейробластомы мыши (N2a tet on), экспрессирующие мутантные формы белка tau (К18; К18/ДК280; К18/ДК280/1277Р/308Р). Использованные конструкты были исследованы и охарактеризованы в нашей лаборатории [Barghorn et al.,

2000]. Было показано, что агрегация белка tau в филаменты происходит за счет формирования ß-структуры вокруг двух гексапептидов: PHF6 (306VQIVYK3n) и PHF6* (275VQIVNK280), при этом мутантная форма tau K18/ÄK280 имела наибольшую тенденцию к агрегации in vitro.

Экспрессия белка в клетках была индуцирована с помощью добавления в культуральную среду доксициклина (1 мкг/мл). Полученные клеточные линии были охарактеризованы на клеточном уровне с помощью конфокальной микроскопии фиксированных препаратов и вестерн блота тотальных клеточных лизатов.

контроль

К18

К18/АК280

К18/ДК280/ 1277РЛ308Р

Тубулин

Tau

Рисунок 1.

Иммунофлюоресценция стабильных клеточных линий. Клетки были индуцированы для экспрессии белка доксициклином в течение двух дней, затем выявлены моноклональными антителами DM la к тубулину и поликлональными K9JA к tau.

Результаты иммунофлюоресценции с применением антител к белку tau и тубулину показали, что морфологически клетки полученных линий не отличались от контроля при высоком уровне экспрессии белка и его диффузном распределении в клетке (Рис. 1).

Для количественного анализа экспресии белка проводили вестерн блот тотальных клеточных лизатов из 104 клеток после двух дней индукции. Как стандарт использовались различные разведения рекомбинантного белка К18/АК280 (рис. 2).

Денситометрический анализ показал, что после двух дней индукции количество К18 было 2.4 ± 0.7; К18/ДК280 1.9 ±0.5; K18/AK280/I277P/308P 2.2 ±0.8 мкг/106 клеток, то есть указанные линии имели примерно одинаковый уровень экспрессии белка, что позволило проводить сравнительный анализ между ними.

1 2 3 4 5

30 kDa -*

20 kDa -► .

Рисунок 2.

Вестерн блот из лизатов клеток N2a после 48 часов индукции. Белок tau был помечен поликлональными антителами K9JA. 1- контроль - рекомбинантный белок К18/ДК280 6 нг; 2- К18; 3-К18/АК280; 4- K18/AK280/I277P/I308P; 5- Контроль (вектор рВ15).

2. Выявление и характеристика агрегатов мутантных форм белка tau на клеточном уровне.

Одним из наиболее распространенных в литературе методов по выявлению филаментозных агрегатов tau из препаратов головного мозга является их экстракция с помощью саркозила по методу Дэвиса. Метод основан на нерастворимости агрегированного белка tau в 1% саркозиле, то есть tau тотального клеточного лизата разделяется на две фракции: саркозилрастворимую (неагрегированный белок) и саркозил-нерастворимую (агрегированный tau, из которого состоят нейрофибриллярные клубочки, характерные для болезни Альцгеймера и FTDP-17).

Чтобы определить, образуются ли в клетках полученных линий агрегаты, подобные тем, что наблюдались в исследованиях с рекомбинантным белком, клетки индуцировались различное время доксициклином. На рисунке 3 приведены данные вестерн блота саркозилрастворимой и саркозил-нерастворимой фракций, меченых антителами к белку tau. Уже после двух дней индукции во всех клеточных линиях выявлено присутствие достаточного количества белка в саркозил-нерастворимой фракции. Однако в линии K18/AK280/I277P/I308P отмечалось образование только низкомолекулярных агрегатов (меньше 20 kDa), а в линиях К18 и К18/АК280 отмечалось присутствие как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных (больше 20 kDa) агрегатов белка tau в саркозил-нерастворимой фракции. Количество белка в саркозил-нерастворимой фракции возрастало с длительностью индукции, но при любом времени индукции количество низкомолекулярных агрегатов было больше количества высокомолекулярных. Наибольшее количество

высокомолекулярных агрегатов и наиболее раннее их появление, уже после 2 дней индукции, наблюдалось в линии, экспрессирующей К18/АК280, в линии К18 их было меньше и появлялись они только после 9 дней индукции.

К18

Индукция (день) 2 5 7 в 11

2 р н р н рн рн рн

**

40 Ш

30 » 20 "

Индукция (день) 2 5 7 Э 11

К18/АК280

ЙРН РНРНРН РН

40 ■ 30' 20'

т

i Щ

Индукция (день) о 2 5 7 9 11

| РН РН РН РН РН

K18/AK280/I277P/308P ж

40 # 30

20 ••

Рисунок 3.

Выявление агрегатов белка tau в саркозил-нерастворимой фракции в вестерн блоте.

контроль - рекомбинантный белок К18/ДК280 (E.coli) Р - саркозилрастворимая фракция белка Н - саркозил-нерастворимая фракция белка

Характеристика агрегатов саркозил-нерастворимой фракции белка проводилась с помощью электронной микроскопии образцов после 7 дней индукции. Препараты инкубировались с поликлональными антителами к белку tau, мечеными частичками золота. Применение этих антител в разведении 1:50 выявило аморфные агрегаты белка, а также длинные нитевидные филаменты. На рисунке 4 приведены данные электронной микроскопии образца саркозил-нерастворимой фракции белка линии К18/АК280 после 7 дней индукции. Наблюдаемые филаменты имели морфологическое сходство с филаментами, полученными из препаратов мозга людей, умерших от болезни Альцгеймера.

Рисунок 4.

Электронная микроскопия саркозил-нерастворимой фракции К18/ДК280 после 7 дней индукции.

Детекция с помощью поликлональных антител K9JA к белку tau, коньюгированных с коллоидным золотом (8 нм). Разведение 1:50.

На следующем этапе работы был проведен анализ наблюдаемых внутриклеточных агрегатов tau во всех полученных линиях с помощью окрашивания фиксированных препаратов 0.1% раствором тиофлавина-S. Окрашивание тиофлавином-S является одним из наиболее широко применяемых методов для внутриклеточного выявления нейрофибриллярных сплетений из белка tau. Клетки индуцировались различное время (2, 5, 7, 9 и 11 дней) доксициклином, после этого фиксировались и окрашивались 0.1% раствором тиофлавина S и антителами к белку tau.

На рисунке 5 приведены данные конфокальной микроскопии клеток после 5 и 7 дней индукции экспрессии белка доксициклином. В линии, экспрессирующей К18/ДК280Л277Р/1308Р, не наблюдалось клеток, позитивно-окрашенных тиофлавином-S, на всем протяжении опыта. Только в линиях, экспрессирующих К18 и К18/ДК280, наблюдались клетки, положительно окрашенные тиофлавином-S. В линии, экспрессирующей К18, после 2 и 5 дней индукции позитивно-окрашенных клеток не наблюдалось. Лишь только после 7 и 9 дней индукции появлялись одиночные клетки, окрашенные тиофлавином-S. После 11 дней индукции число позитивных клеток увеличивалось. Наибольшее количество позитивно-окрашенных тиофлавином-S клеток и наиболее раннее их появление, уже после 2 дней индукции, наблюдалось в линии, экспрессирующей К18/ДК280. Количество позитивных клеток в последующие дни увеличивалось и после 9 дней индукции достигало максимального значения.

5 дней индукции

К18

Тиофлавин-в

Таи

К18/ДК280

К18/АК280/ 1277РЛ308Р

7 дней индукции

К18

Тиофлавин-8

Таи

К18/АК280

К18/ЛК280/ 1277Р/1308Р

Рисунок 5.

Конфокальная микроскопия антителами к белку 1аи.

клеток, окрашенных тиофлавином-8 и

3. Сравнительный анализ полученных линий для выбора перспективной экспериментальной клеточной модели.

Для выбора экспериментальной клеточной модели нейрофибриллярной патологии при болезни Альцгеймера и FTDP-17 был проведен сравнительный количественный анализ полученных агрегатов в клеточных линиях, экспрессирующих К18 и К18/АК280, на основании данных, изложенных выше На рисунке 6 предс!авлены данные денситометрического анализа вестерн блота (рис. 3) саркозилрастворимой и саркозил-нерастворимой фракций белка tau В таблице 1 приведены данные процентного содержания тиофлавин-S-позигивных клеток после 5, 7 , 9 и 11 дней индукции экспрессии белка

16

р

*

О

2 5 7 9 11

Продолжительность индукции (дней)

Ш К18 Щ К18/ДК280 ■ К18/ДК280/1277Р/1308Р

Рисунок 6.

Денситометрический анализ вестерн блота саркозилрастворимой и

Линия клеток 5 дней 7 дней 9 дней 11 дней

МОСК 0% 0% 0% 0%

К18 0.6 % 2% 2% 2.3 %

К18/ДК280 4% 6.7 % 8.3 % 1.3 %

К18/ДК280/ I277P/I308P 0% 0% 0.3 % 0.3 %

Таблица 1.

Процентное содержание тиофлавин S-позитивных клеток после индукции доксициклином.

В клеточной линии K18/AK280/I277PA308P наблюдалось появление только низкомолекулярных агрегатов, высокомолекулярные агрегаты белка tau не наблюдались даже после 11 дней индукции (рис.3). Нейрофибриллярных сплетений внутри клеток также не было обнаружено (рис.5). Образование высокомолекулярных агрегатов и тиофлавин-8-позитивных клеткок наблюдались только в линиях, экспрессирующих К18 и К18/ДК280. Более того в этих линиях была выявлена корреляция по времени индукции в образовании высокомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции белка и появлению нейрофибриллярных сплетений на клеточном уровне. Это представляет возможность использовать линии К18 и К18/ДК280 как клеточные модельные системы нейрофибриллярной патологии. Так как линия К18/АК280 экспрессировала максимальное

количество нейрофибриллярных образований при наименьшем времени индукции по сравнению с К18, то именно эта линия была предложена в качестве экспериментальной клеточной модели нейрофибриллярной патологии, наблюдаемой при болезни Альцгеймера и FTDP-17.

4. Скрининг лекарственных веществ с применением полученной экспериментальной клеточной модели.

Выбранная клеточная модель была экспериментально протестирована на возможность ее практического применения для скрининга лекарственных веществ. 12 лекарственных веществ для этого теста были отобраны в нашей лаборатории в экспериментах по позитивному ингибированию образования филаментов in vitro [Pickhardt et al., 2004] при скрининге 12 ООО лекарственных препаратов (фирма MERCK). 11 протестированных нами соединений оказались токсичны на клеточном уровне. Лишь 1 препарат emodm был нетоксичен и показал эффект ингибирования на клеточном уровне (рис.7). Таким образом, проведенный тест свидетельствует о перспективности и адекватности предложенной нами экспериментальной клеточной модели для скрининга лекарственных веществ.

5. Опыты с линией трансгенных мышей.

Успешность применения полученной клеточной модели на базе К18/ДК280 дала основание использования этого конструкта для

создания модели нейрофибриллярной патологии на организменном уровне. Линия доппель-трансгенных мышей, экспрессирующих К18/АК280, была получена путем скрещивания индивидуальных трансгенных линий: КТ1 - несущей трансактиватор и К4 - несущей конструкт К18/ДК280.

Рисунок 7.

Конфокальная микроскопия клеток линии К18/АК280, окрашенных тиофлавином-S и антителами к белку tau, после индукции экспрессии белка в среде без добавления и с добавлением вещества emodin.

Первая серия экспериментов была проведена с первичными нейронными культурами, полученными из кортикальных нейронов эмбрионов мышей. Предварительные эксперименты показали, что уже

No Emodin

15 цМ Emodin

на 5 день образуется достаточное количество патологических фибриллярных структур в клетках нейробластомы мыши, поэтому последующий анализ уровня экспрессии в первичных нейронных культурах эмбрионов проводили начиная с 5 дня. Вестерн блот тотальных клеточных лизатов позволил выявить полосу, соответствующую экспрессируемому белку, однако наблюдались сильные различия в уровне экспрессии даже между эмбрионами внутри одного помета (рис. 8).

Мышь 301

20 кОа

Эмбрионы 12 3 4

Рисунок 8.

Вестерн блот лизатов клеток первичной нейронной культуры после 5

дней индукции экспрессии белка.

контроль - рекомбинантный белок К18/ДК280 (Е.соП)

Наблюдаемые сильные различия между эмбрионами не позволили объединять эмбриональные препараты для получения достаточного количества материала, необходимого для выявления агрегатов из саркозил-нерастворимой фракции белка по методу Дэвиса.

Следующая серия экспериментов была проведена на препаратах коры головного мозга трансгенных мышей в возрасте от 4 до 10 месяцев. Анализ вестерн блота показал, что следовые количества К18/АК280 в саркозил-нерастворимой фракции белка начинают выявляться с возраста 6 месяцев. Принимая во внимание вариабельность, обнаруженную в первичных эмбриональных нейронных культурах, можно предположить, что увеличение количества К18/АК280 в саркозил-нерастворимой фракции белка в возрасте 7-10 месяцев происходит (рис.9).

8 ш о

Трансгенные мыши

S £ Возраст, мес. V о

I &

5°4 56 789 10

** * J «slf

шИшШВШШв^ЯЯШВВшшШшшШшШ*

40 kDa -► ;■> I

30 kDa -► f> flpl »

20 kDa -►

r* sk

Рисунок 9.

Вестерн блот саркозил-нерастворимой фракции белка, полученной из препаратов коры головного мозга трансгенных мышей

В данной работе было показано, что даже при самом длительном времени индукции на вестерн блотах лизаюв клеточных линий количество высокомолекулярных агрегатов значительно меньше количества низкомолекулярных агрегатов. Возможно, что отсутствие высокомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции белка на вестерн блоте от препаратов взрослых мышей объясняется малым количеством даже низкомолекулярных агрегатов. Очевидно, что для достоверного вывода о присутствии высокомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции белка необходимы дальнейшие эксперименты на мышах старше 10 месяцев.

Выводы

1. Были получены и охарактеризованы стабильные индуцибельные клеточные линии нейробластомы мыши (N2a let on), жспрсссирующие мутантные формы белка tau (К18; К18/АК280, К18/ДК280/1277Р/308Р)

2. Показано, что образование высокомолекулярных агрегатов

наблюдается в саркозил-нерастворимой фракции только линий К18 и К18/ДК280 и скорость их образования записиi or длительности времени индукции

3 Данные электронной микроскопии и позитивное окрашивание тиофлавином-S свидетельствуют о том, что образующиеся в них высокомолекулярные агрегаты, аналогичны патологическим нейрофибриллярным клубочкам, обнаруживаемым в нейронах при болезни Альцгеймера и FTDP-17 .

4. Сравнительное исследование клеточных линий по количеству агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции и времени индукции, необходимого для их образования, позволило выделить линию К18/ДК280 в качестве модельной системы нейрофибриллярной патологии при болезни Альцгеймера и FTDP-17.

5. Предложенная клеточная модель была апробирована для скрининга медицинских препаратов и показала перспективность и адекватность ее применения.

6. Была получена линия трансгенных мышей, экспрессирующая К18/ДК280. Была показана неперспективность работы с первичными культурами нейронов, полученных из эмбрионов, в силу значительной вариации уровня экспрессии. Эксперименты с препаратами головного мозга трансгенных мышей в возрасте 4-10 месяцев показали, что низкомолекулярные аграгаты начинают образовываться только у особей старше 6 месяцев.

Литература

Ernst R L. und Hay J. W. (1994). "The US economic and social costs of Alzheimer's disease revisited." Am J Public Health 84(8): 1261-1264. Hebert L. E., Scherr P. A., Beckett L. A., Albert M. S., Pilgrim D. M., Chown M. J., Funkenstein H. H. und Evans D. A. (1995). "Age-specific mcidence of Alzheimer's disease in a community population " J. Am. Chem. Soc. 273(17): 1354-1359.

Kidd, M. (1963). "Paired hclical filaments in electron microscopy of Alzheimer's disease." Nature 197: 192-193.

Foster, N. L., Wilhelmsen K., Sima A. A., Jones M. Z., D'Amato C. J. und Gilman S. (1997). "Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17: a consensus conference." Ann. Neurol. 41(6): 706-715. Nagy Z, Esiri M.M., Jobst K.A., Morris J.H., King E.M., McDonald B, Litchfield S, Smith A, Barnetson L, Smith A.D. (1995). "Relative roles of plaques and tangles in the dementia of Alzheimer's disease: correlations using three sets of neuropathological criteria." Dementia, 6:21-31 Barghorn S., Zheng-Fischhofer Q., Ackmann M., Biernat J., M. von Bergen und Mandelkow E. (2000). "Structure, Microtubule Interactions, and Paired Helical Filament Aggregation by Tau Mutants of Frontotemporal Dementias." Biochemistry 39(38): 11714-11721.

Wischik С. M., Novak M., Thogersen H. C., Edwards P. C., Runswick M. J., Jakes R., Walker J. E., Milstein C., Roth M. und Klug A. (1988). "Isolation of a fragment of tau derived from the coie of the paired helical filament of Alzheimer disease." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(12): 45064510.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Pickhardt М, Gazova Z, von Bergen M, Khlistunova I, Wang Y, Hascher A, Mandelkow EM, Biernat J, Mandelkow E Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer's paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 2005 Feb 4;280(5):3628-35.

2. Gorf K., Khlistounova I, Biernat J., Rune G., Drexler D., Schoemg K., Bujard H., Haemisch A., Mandelkow E.-M. Generation of conditional Tg mice expressing human tau mutants allows studies of formation and reversal of neurofibrillary pathology. The 9th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Philadelphia, Pensylvania, USA, 2004.

3. Biernat J., Khlistounova I., Mandelkow E.-M. Inducible expression of tau in cell models of Alzheimer neurofibrillary pathology causes tau aggregation in a reversible fashion. The 9th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Philadelphia, Pensylvania, USA, 2004.

4. Pickhardt M., Qazova S., von Bergen M., Wang Y., Khlistounova I., Hascher A., Biernat J., Mandelkow E.-M., Mandelkow E. The 9th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Philadelphia, Pensylvania, USA, 2004.

5. Biernat J., Khlistounova I., Mandelkow E.-M. Inducible expression of tau in cell models of Alzheimer neurofibrillary pathology. 5th Hamburg Conference on Alzheimer Disease, Hamburg, Germany, 2003.

6. Biernat J., Wu Y.Z. Timm T. Khlistunova I., Zheng-Fischhofer Q., Mandelkow E., Mandelkow E.-M. Tau phosphorylation in mikrotubule binding domain by protein kinase MARK/Par-1 regulates neurite formation. The 8th International Conference on Alzheimer Disease and Related Disorders, Stockholm, Sweden, 2002.

7. Biernat J., Wu Y.Z. Timm T. Khlistunova I., Zheng-Fischhofer Q., Mandelkow E., Mandelkow E.-M. Tau phosphorylation in mikrotubule binding domain by protein kinase MARK/Par-1 regulates neurite formation. International Conference on Cell and Molecular Biology, Hamburg, Germany, 2002.

ХЛИСТУНОВА Инна Ивановна

КЛЕТОЧНАЯ МОДЕЛЬ НЕЙРОФИБРИЛЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И FTDP-17 НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ БЕЛКА TAU.

(АВТОРЕФЕРАТ)

Подписано в печать 14.04.05 г.

Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печ. л. 1,0 Отпечатано ООО «Риза», МО. Коломна, ул Астахова, 25.

Тел.: 18-43-39. Лиц. ПЛД № 53-507

»-7585

РНБ Русский фонд

2006-4 5197

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хлистунова, Инна Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА.

1.2 ФРОНТО-ТЕМПОРАЛЬНЫЕ ДЕМЕНЦИИ И ПАРКИНСОНИЗМ,

СВЯЗАННЫЕ С ХРОМОСОМОЙ 17.

1.3 ГИПОТЕЗЫ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

И ФРОНТО-ТЕМПОРАЛЬНЫХДЕМЕНЦИЯХ, СВЯЗАННЫХ С ХРОМОСОМОЙ 17.

1.4 АССОЦИИРОВАННЫЙ С МИКРОТРУБОЧКАМИ БЕЛОК TAU.

1.4.1 Белки, ассоциированные с микротрубочками.

1.4.2 Структура белка tau.

1.4.3 Функции белка tau.

1.5 ОБРАЗОВАНИЕ АГРЕГАТОВ БЕЖА TAU.

2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.1.1 Культивирование бактерий.

3.1.2 Приготовление электрокомпетентных клеток.

3.1.3 Трансформация компетентных клеток.

3.2 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.2.1 Выделение плазмидной ДНК.

3.2.1.1 Минипреп.

3.2.1.2 Максипреп.

3.2.2 Выделение геномной ДНК из ткани хвоста мыши.

3.2.3 Определение концентрации ДНК.

3.2.4 Гель-электрофорез ДНК.

3.2.5 Модификация ДНК.

3.2.5.1 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

3.2.5.2 Дефосфорилирование ДНК CIP-фосфатазой.

3.2.5.3 Амплифицирование ДНК в полимеразной цепной реакции.

3.2.5.4 ТОРО-клонирование.

3.2.5.5 Выделение ДНК из агарозных гелей.

3.2.5.6 Лигирование.

3.2.6 Секвенирование ДНК.

3.3 КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК.

3.3.1 Клеточные линии.

3.3.2 Питательные среды и пассажирование клеток.

3.3.3 Замораживание и оттаивание клеток.

3.3.4 Подсчет клеток в гемоцитометре.

3.3.5 Выделение и культивирование клеток мышиных нейронов.

3.3.6 Выделение и культивирование клеток мышиных фибробластов.

3.3.7 Стабильная трансфекция клеток с помощью DOT АР.

3.3.8 Иммунофлуоресценция.

3.3.9 Тест на люциферазу.

3.4 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.4.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду.

3.4.2 Приготовление клеточных лизатов.

3.4.3 Экстракция белка по методу Дэвиса.

3.4.4 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

3.4.5 Окрашивание гелей Coomassie Brilliant Blue R-250.

3.4.6 Вестерн блот.

3.4.7 Иммунное окрашивание и негативное контрастирование протеинов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 КЛОНИРОВАНИЕ.

4.2 СТАБИЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ К18, К18/ДК280, К18/ДК280/Ш7Р/Б08Р

В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ МЫШИ.

4.2.1 Экспрессия К18 и мутантов в клетках.

4.2.2 Зависимость экспрессии tau-rera от концентрации доксициклина.

4.2.3 Агрегация tau.

4.2.4 Электронная микроскопия.

4.2.5 Окрашивание высокомолекулярных агрегатов tau с помощью тиофлавина S.

4.2.6 Ингибированне индукции путем удаления доксициклина из культуральной среды.

4.3 СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ.

4.4 ПЕРВИЧНЫЕ НЕЙРОННЫЕ КУЛЬТУРЫ.

4.5 ВЫЯВЛЕНИЕ САРКОЗИЛ-НЕРАСТВОРИМЫХ АГРЕГАТОВ IN VJVO.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная модель нейрофибриллярной патологии болезни Альцгеймера и FTDP-17 на основе мутантных форм белка tau"

Болезнь Алъцгеймера является одним из самых распространенных дегенеративных заболеваний нервной системы. На клеточном уровне для этой болезни характерны нейрофибриллярные сплетения, состоящие из спиралеобразных филаментов белка tau. Аналогичные нейрофибриллярные структуры наблюдаются при группе заболеваний, объединенных под общим названием фронто-темпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17). Была установлена однозначная корреляция образования этих структур со степенью развития деменции и показано, что их накопление приводит к гибели нейронов.

На сегодняшний день описано лишь небольшое количество работ по созданию клеточных моделей для изучения молекулярных механизмов нейрофибриллярной патологии. Ни одна из предложенных моделей на основе полноразмерного белка tau не была адекватна, поскольку в них присутствовали лишь отдельные филаменты при г. отсутствии характерных нейрофибриллярных сплетений.

Новизна нашего подхода при создании клеточной модели заключалась в использовании конструктов, содержащих только Repeat-регион tau, поскольку из литературных данных известно, что этот участок является центральным ядром патологических нейрофибриллярных сплетений. Для получения клеточной модели были использованы охарактеризованные в нашей лаборатории конструкты, приводящие к образованию филаментов in vitro.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Хлистунова, Инна Ивановна

6. Выводы

1. Получены и охарактеризованы стабильные индуцибельные клеточные линии нейробластомы мыши (N2a (tet оп)), экспрессирующие мутантные формы белка tau (Kl8; К18/ДК280; К18/ДК280/1277Р/308Р).

2. Показано, что высокомолекулярные агрегаты белка tau наблюдаются в саркозил-нерастворимой фракции только линий К18 и К18/ДК280 и скорость их образования зависит от длительности времени индукции.

3. Данные электронной микроскопии и позитивное окрашивание тиофлавином-S свидетельствуют о том, что высокомолекулярные агрегаты, образующиеся в клетках полученных линий, аналогичны патологическим нейрофибриллярным сплетениям, обнаруживаемым в нейронах при болезни Альцгеймера и FTDP-17 .

4. Сравнительное исследование клеточных линий по количеству агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции и времени индукции, необходимого для их образования, позволило выделить линию К18/ДК280 в качестве модельной системы нейрофибриллярной патологии при болезни Альцгеймера и FTDP-17.

5. Предложенная клеточная модель была апробирована при скрининге медицинских препаратов, результаты которого показали перспективность и адекватность ее применения.

6. Получена линия трансгенных мышей, экспрессирующая К18/ДК280. Показана неперспективность работы с первичными культурами нейронов, полученных из эмбрионов, в силу значительной вариации уровня экспрессии. Эксперименты с препаратами головного мозга трансгенных мышей в возрасте 4-10 месяцев показали, что низкомолекулярные аграгаты начинают образовываться только у особей старше 6 месяцев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлистунова, Инна Ивановна, Пущино

1. Alzheimer, А. (1907). "Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde." Allg. Z. Psychiatrie 64: 146-148.

2. Ernst, R L. und J. W. Hay (1994). "The US economic and social costs of Alzheimer's disease revisited." Am J Public Health 84(8): 1261-1264.

3. Hebert, L. E., P. A. Scherr, L. A. Beckett, M. S. Albert, D. M. Pilgrim, M. J. Chown, H. H. Funkenstein und D. A. Evans (1995). "Age-specific incidence of Alzheimer's disease in a community population." J. Am. Chem. Soc. 273(17): 1354-1359.

4. Kurz, A. (1997). "Neurobiologie, Ursachen und Risikofaktoren der AlzheimerKrankheit." In: Wächtler C., Demenzen, Thieme.

5. Haupt, M., A. Kurz, S. Pollmann und B. Romero (1992). "Psychopathologische Störungen bei beginnender Alzheimerscher Krankheit." Fortschr Neurol Psychiatr 60(1): 3-7.

6. Gilleard, C. J., J. M. Kellett, J. A. Coles, P. M. Millard, M. Honavar und P. L. Lantos (1993). "The St. George's dementia bed investigation study: cardiovascular, neurological and neuropsychological correlates." Acta Psychiatr Scand 87(4): 273-278.

7. Almkvist, O., L. Backman, H. Basun und L. O. Wahlund (1993). "Patterns of neuropsychological performance in Alzheimer's disease and vascular dementia." Cortex 29(4): 661-673.

8. Rossor, M. N., N. C. Fox, P. A. Freeborough und R. J. Harvey (1996). "Clinical features of sporadic and familial Alzheimer's disease." Neurodegeneration 5(4): 393-397.

9. Braak, H. und E. Braak (1991). "Neuropathological staging of Alzheimer-related changes." Acta Neuropathol. 82: 239-259.

10. Braak, E., H. Braak und E. M. Mandelkow (1994). "A sequence of cytoskeleton changes related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads." Acta Neuropathol 87(6): 554-567.

11. Esler, W. P. und M. S. Wolfe (2001). "A portrait of Alzheimer secretases-new features and familiar faces." Science 293(5534): 1449-1454.

12. Fassbender, K., C. Masters und K. Beyreuther (2001). "Alzheimer's disease: molecular concepts and therapeutic targets." Naturwissenschaften 88(6): 261-267.

13. Kidd, M. (1963). "Paired helical filaments in electron microscopy of Alzheimer's disease." Nature 197: 192-193.

14. Tolnay, M. und A. Probst (1999). "REVIEW: tau protein pathology in Alzheimer's disease and related disorders." Neuropathol Appl Neurobiol 25(3): 171-187.

15. Wille, H., G. Drewes, J. Biernat, E. M. Mandelkowund E. Mandelkow (1992a). "Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro." J. Cell Biol. 118: 573-584.

16. Wilhelmsen, K. C., T. Lynch, E. Pavlou, M. Higgins und T. G. Nygaard (1994). "Localization of disinhibition-dementia-parkinsonism-amyotrophy complex to 17q21-22." Am. J. Hum. Genet. 55(6): 1159-1165.

17. Foster, N. L., K. Wilhelmsen, A. A. Sima, M. Z. Jones, C. J. D'Amato und S. Gilman1997). "Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17: a consensus conference." Ann. Neurol. 41(6): 706-715.

18. Spillantini, M. G., J. R. Murreil, M. Goedert, M. R. Farlow, A. Klug und B. Ghetti1998). "Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia." Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95(13): 7737-7741.

19. Poorkaj, P., T. D. Bird, E. Wijsman, E. Nemens, R. M. Garruto, L. Anderson, A. Andreadis, W. C. Wiederholt, M. Raskind und G. D. Schellenberg (1998). "Tau is a candidate gene for chromosome 17 frontotemporal dementia." Ann. Neurol. 43(6): 815825.

20. Butner, K. A. und M. W. Kirschner (1991). "Tau protein binds to microtubules through a flexible array of distributed weak sites." J. Cell Biol. 115(3): 717-730.

21. Lee, G. und S. L. Rook (1992). "Expression of tau protein in non-neuronal cells: microtubule binding and stabilization." J. Cell Sci. 102(Pt 2): 227-237.

22. Gustke, N., B. Trinczek, J. Biernat, E. M. Mandelkow und E. Mandelkow (1994). "Domains of Tau protein and interactions with microtubules." Biochemistry 33: 95119522.

23. Trinczek, B., J. Biernat, K. Baumann, E. M. Mandelkow und E. Mandelkow (1995). "Domains of tau protein, differential phosphorylation, and dynamic instability of microtubules." Mol. Biol. Cell 6(12): 1887-1902.

24. Hasegawa, M., M. J. Smith und M. Goedert (1998). "Tau proteins with FTDP-17 mutations have a reduced ability to promote microtubule assembly." FEBS Lett. 437(3): 207-210.

25. Novak, M., J. Kabat und C. M. Wischik (1993). "Molecular characterization of the minimal protease resistant tau-unit of the Alzheimer's-disease paired helical filament." EMBO J. 12:365-370.

26. Arrasate, M., M. Perez, R. Armas-Portela und J. Avila (1999). "Polymerization of tau peptides into fibrillar structures. The effect of FTDP-17 mutations." FEBS Lett. 446(1): 199-202.

27. Goedert, M., R. Jakes und R. A. Crowther (1999a). "Effects of frontotemporal dementia FTDP-17 mutations on heparin-induced assembly of tau filaments." FEBS Lett. 450(3): 306-311.

28. Rizzini, C., M. Goedert, J. R. Hodges, M. J. Smith, R. Jakes, R. Hills, J. H. Xuereb, R. A. Crowther und M. G. Spillantini (2000). "Tau gene mutation K257T causes a tauopathy similar to Pick's disease." J. Neuropathol. Exp. Neurol. 59(11): 990-1001.

29. Andreadis, A., W. M. Brown und K. S. Kosik (1992). "Structure and novel exons of the human tau gene." Biochemistry 31: 10626-10633.

30. Andreadis, A., J. A. Broderick und K. S. Kosik (1995). "Relative exon affinities and suboptimal splice site signals lead to non- equivalence of two cassette exons." Nucleic Acids Res. 23(17): 3585-3593.

31. D'Souza, I. und G. D. Schellenberg (2000). "Determinants of 4-repeat tau expression. Coordination between enhancing and inhibitory splicing sequences for exon 10 inclusion." J. Biol. Chem. 275(23): 17700-17709.

32. Gao, Q. S., J. Memmott, R. Lafyatis, S. Stamm, G. Screaton und A. Andreadis (2000). "Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia." J. Neurochem. 74(2): 490-500.

33. Hardy J.A. and Higgins G.A., (1992) "Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis." Science 256, pp. 184-185.

34. Chapman P.F. et al., (2001) "Genes, models and Alzheimer's disease." Trends Genet. 17, pp.254-261.

35. Takashima A.et al., Activation of tau protein kinase I glycogen synthase kinase-3ß by amyloid peptide (25-35) enhances phosphorylation of tau in hippocampal neurons. Neurosci. Res. 31 (1998), pp. 317-323.

36. Takashima A. et al., Tau protein kinase I is essential for amyloid beta-protein-induced neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 90 (1993), pp. 7789-7793.

37. Alvarez G. et al., Lithium protects cultured neurons against ß-amyloid-induced neurodegeneration. FEBS Lett. 453 (1999), pp. 260-264.

38. Rapoport M, Dawson HN, Binder LI, Vitek MP, Ferreira A. Tau is essential to beta -amyloid-induced neurotoxicity.Proc Natl Acad Sei USA. 2002 Apr 30;99(9):6364-9.

39. Schönheit B, Zarski R, Ohm TG. Spatial and temporal relationships between plaques and tangles in Alzheimer-pathology.Neurobiol Aging. 2004 Jul;25(6):697-711.

40. Katsuno T, Morishima-Kawashima M, Saito Y, Yamanouchi H, Ishiura S, Murayama S, Ihara Y. Independent accumulations of tau and amyloid beta-protein in the human entorhinal cortex.Neurology. 2005 Feb 22; 64(4):687-92.

41. Braak H, Braak E, Bohl J, Reintjes R. Age, neurofibrillary changes, A beta-amyloid and the onset of Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 1996 May 31;210(2):87-90.

42. Braak H, Braak E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl. 1996;165:3-12.

43. Weingarten, M. D., A. H. Lockwood, S. Y. Hwo und M. W. Kirschner (1975). "A protein factor essential for microtubule assembly." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72(5): 1858-1862.

44. Goedert, M., M. G. Spillantini, R. Jakes, D. Rutherford und R. A. Crowther (1989). "Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease." Neuron 3(4): 519-526.

45. Himmler, A. (1989). "Structure of the bovine tau gene: alternatively spliced transcripts generate a protein family." Mol. Cell. Biol. 9(4): 1389-1396.

46. Kosik, K. S., L. D. Orecchio, S. Bakalis und R. L. Neve (1989). "Developmentally regulated expression of specific tau sequences." Neuron 2(4): 1389-1397.

47. Goedert, M. and R. Jakes (1990). "Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization." Embo J 9(13): 4225-4230.

48. Ackmann, M., H. Wiech und E. Mandelkow (2000). "Nonsaturable binding indicates clustering of tau on the microtubule surface in a paired helical filament-like conformation." J. Biol. Chem. 275(39): 30335-30343.

49. Reszka, A. A, R. Seger, C. D. Diltz, E. G. Krebs und E. H. Fischer (1995). "Association of mitogen-activated protein-kinase with the microtubule cytoskeleton." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8881-8885.

50. Reszka, A. A., R. Seger, C. D. Diltz, E. G. Krebs und E. H. Fischer (1995). "Association of mitogen-activated protein-kinase with the microtubule cytoskeleton." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8881-8885.

51. Sontag, E., V. Nunbhakdi-Craig, G. Lee, G. S. Bloom und M. C. Mumby (1996). "Regulation of the phosphorylation state and micro tubule-binding activity of Tau by protein phosphatase 2A." Neuron 17(6): 1201-1207.

52. Liao, H., Y. Li, D. L. Brautigan und G. G. Gundersen (1998). "Protein phosphatase 1 is targeted to microtubules by the microtubule- associated protein Tau." J. Biol. Chem. 273(34): 21901-21908.

53. Matus, A. (1988). "Microtubule-associated proteins: their potential role in determining neuronal morphology." Annu. Rev. Neurosci. 11: 29-44.

54. Binder, L. I., A. Frankfurter und L. I. Rebhun (1985). "The distribution of tau in the mammalian central nervous system." J. Cell Biol. 101(4): 1371-1378.

55. Esmaeli-Azad, B., J. H. McCarty und S. C. Feinstein (1994). "Sense and antisense transfection analysis of tau function: tau influences net microtubule assembly, neurite outgrowth and neuritic stability." J. Cell Sci. 107(Pt 4): 869-879.

56. Liu, C. W., G. Lee und D. G. Jay (1999). "Tau is required for neurite outgrowth and growth cone motility of chick sensory neurons." Cell Motil. Cytoskeleton 43(3): 232-242.

57. Knops, J., K. S. Kosik, G. Lee, J. D. Pardee, L. Cohen-Gould und L. McConlogue (1991). "Overexpression of tau in a nonneuronal cell induces long cellular processes." J. Cell Biol. 114(4): 725-733.

58. Baas, P. W., T. P. Picnkowski und K. S. Kosik (1991). "Processes induced by tau expression in Sf9 cells have an axon-like microtubule organization." J. Cell Biol. 115(5): 1333-1344.

59. Harada, A., K. Oguchi, S. Okabe, J. Kuno, S. Terada, T. Ohshima, R. Sato-Yoshitake, Y. Takei, T. Noda und N. Hirokawa (1994). "Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein." Nature 369(6480): 488-491.

60. Lindwall, G. und R. D. Cole (1984a). "Phosphorylation affects the ability of Tau protein to promote microtubule assembly." J. Biol. Chem. 259: 5301-5305.

61. Trinczek, B., J. Biernat, K. Baumann, E. M. Mandelkow und E. Mandelkow (1995). "Domains of tau protein, differential phosphorylation, and dynamic instability of microtubules." Mol. Biol. Cell 6(12): 1887-1902.

62. Pope, W., S. A. Enam, N. Bawa, B. E. Miller, H. A. Ghanbari und W. L. Klein (1993). "Phosphorylated tau epitope of Alzheimer's disease is coupled to axon development in the avian central nervous system." Exp. Neurol. 120(1): 106-113.

63. Mawal-Dewan, M., J. Henley, A. Van de Voorde, J. Q. Trojanowski und V. M. Lee (1994). "The phosphorylation state of tau in the developing rat brain is regulated by phosphoprotein phosphatases." J. Biol. Chem. 269(49): 30981-30987.

64. Saito, T., K. Ishiguro, T. Uchida, E. Miyamoto, T. Kishimoto und S. Hisanaga (1995). "In situ dephosphorylation of tau by protein phosphatase 2A and 2B in fetal rat primary cultured neurons." FEBS Lett. 376(3): 238-242.

65. T.D. Bird, E.M. Wijsman, D. Nochlin, M. Leehey and S.M. Sumi et al., Chromosome 17 and hereditary dementia: linkage studies in family with a P301S mutation in tau, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (1997), pp. 667-677.

66. M. Goedert, R.A. Crowther and M.G. Spillantini, Tau mutations cause frontotemporal dementias, Neuron 21 (1998), pp. 955-958.

67. G. Li, H. Yin and J. Kuret, Casein kinase 1 delta phosphorylates Tau and disrupts its binding to microtubules, J. Biol. Chem. (2004).

68. H. Aizawa, H. Kawasaki, H. Murofushi, S. Kotani, K. Suzuki and H. Sakai, A common amino acid sequence in 190-kDa microtubule-associated protein and tau for the promotion of microtubule assembly, J. Biol. Chem. 264 (1989), pp. 5885-5890.

69. R. Brandt and G. Lee, Functional organization of microtubulc-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro, J. Biol. Chem. 268 (1993), pp. 3414-3419.

70. N. Gustke, B. Trinczek, J. Biernat, E.-M. Mandelkow and E. Mandelkow, Domains of tau protein and interactions with microtubules, Biochemistry 33 (1994), pp. 9511-9522.

71. Wille H., Drewes G., Biernat J., Mandelkow E.-M. and Mandelkow E. "Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro". J. Cell Biol. 118 (1992), pp. 573-584.

72. R.A. Crowther, O.F. Olesen, M.J. Smith, R. Jakes and M. Goedert, Assembly of Alzheimer-like filaments from full-length tau protein, FEBS Lett. 337 (1994), pp. 135138.

73. M. Goedert, R. Jakes, M.G. Spillantini, M. Hasegawa, M.J. Smith and R.A. Crowther, Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulfated glycosaminoglycans, Nature 383 (1996), pp. 550-553.

74. M. Perez, J.M. Valpuesta, M. Medina, E.M. Degarcini and J. Avila, Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction, J. Neurochem. 67 (1996), pp. 1183-1190.

75. D.M. Wilson and L.I. Binder, Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions, J. Biol. Chem. 270 (1995), pp. 24306-24314.

76. D.M. Wilson and L.I. Binder, Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease, Am. J. Pathol. 150 (1997), pp. 2181-2195.

77. T. Kampers, P. Friedhoff, J. Biernat, E.-M. Mandelkow and E. Mandelkow, RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments, FEBS Lett. 399 (1996), pp. 344-349.

78. Tau aggregation is driven by a transition from random coil to beta sheet structure.: Biochim Biophys Acta. 2005 Jan 3;1739(2-3): 158-66.

79. J. Knops, K.S. Kosik, G. Lee, J.D. Pardee, L. Cohen-Gould and L. McConlogue, Overexpression of tau in a nonneuronal cell induces long cellular processes, J. Cell Biol. 114 (1991), pp. 725-733.

80. T. Frappier, N.S. Liang, K. Brown, C.L. Leung and T. Lynch et al., Abnormal microtubule packing in processes of SF9 cells expressing the FTDP-17 V337M tau mutation, FEBS Lett. 455 (1999), pp. 262-266.

81. Y. Kanai, J. Chen and N. Hirokawa, Microtubule bundling by tau proteins in vitro: analysis of functional domains, EMBO J. 11 (1992), pp. 3953-3961.

82. G. Lee and S.L. Rook, Expression of tau protein in non-neuronal cells: microtubule binding and stabilization, J. Cell Sci. 102 (1992), pp. 227-237.

83. J. Leger, R. Brandt and G. Lee, Identification of tau protein regions required for process formation in PC12 cells, J. Cell Sci. 107 (1994), pp. 3403-3412.

84. J. Leger, M. Kempf, G. Lee and G.R. Brandt, Conversion of serine to aspartate imitates phosphorylation-induced changes in the structure and function of microtubule-associated protein tau, J. Biol. Chem. 272 (1997), pp. 8441-8446.

85. T. Fath, J. Eidenmuller, T. Maas and R. Brandt, Herpes simplex virus mediated expression of the axonal protein tau in human model neurons (NT2-N cells), Microsc. Res. Tech. 48 (2000), pp. 85-96.

86. S.E. Merrick, J.Q. Trojanowski and V.M.-Y. Lee, Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons, J. Neurosci. 17 (1997), pp. 5726-5737.

87. M. Perez, F. Hernandez, A. Gomez-Ramos, M. Smith, G. Perry and J. Avila, Formation of aberrant phosphotau fibrillar polymers in neural cultured cells, FEBS Lett. 269 (2002), pp. 1484-1489.

88. M. DeTure, L. Ko, C. Easson and S.H. Yen, Tau assembly in inducible transfectants expressing wild-type or FTDP-17 tau, Am. J. Pathol. 161 (2002), pp. 1711-1722.

89. L. Ko, M. DeTure, N. Sahara, R. Chihab and S.H. Yen, Cellular models for tau filament assembly, J. Mol. Neurosci. 19 (2002), pp. 311-316.

90. S.J. Pleasure, C. Page and V.M.-Y. Lee, Pure, postmitotic, polarized human neurons derived from NTera 2 cells provide a system for expressing exogenous proteins in terminally differentiated neurons, J. Neurosci. 12 (1992), pp. 1802-1815.

91. V. Vogelsberg-Ragaglia, J. Bruce, C. Richter-Lansberg, B. Zhang and M. Hong et al., Distinct FTDP-17 missense mutations in tau produce tau aggregates and other pathological phenotypes in transfected CHO cells, Mol. Biol. Cell. 11 (2000), pp. 4093^104.

92. Ishihara T., Hong M., Zhang B., Nakagawa Y., Lee M.K., Trojanowski J.Q. and Lee V.M.-Y. (1999)"Age-dependent emergence and progression of a tauopathy in transgenic mice overexpressing the shortest human tau isoform." Neuron 24: 751-762.

93. Götz J., Chen F., van Dorpe J. and Nitsch R.M. (2001) "Formation of neurofibrillary tangles in P3011 tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils." Science 293:1491-1495.

94. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. (1977) "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." Proc Natl Acad Sei U S A.Dec; 74(12):5463-7.

95. Greenberg SG, Davics P, Schein JD, Binder LI. (1992)"Hydrofluoric acid-treated tau PHF proteins display the same biochemical properties as normal tau." J Biol Chem. Jan 5; 267(l):564-9.

96. Laemmli U. (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature. Aug 15; 227(5259):680-5.

97. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications." Proc Natl Acad Sei USA. Sep; 76(9):4350-4.

98. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории рентгеноструктурного анализа ИТЭБ РАН Е.А. Шляпниковой, Р.И. Артюх, Л.А. Железной, Н.Ф. Ланиной, Г.С. Качаловой за помощь и ценные консультации при оформлении диссертационной работы.1. А?