Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний

Шелковникова, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний"

На правах рукописи

Шелкошшкова Татьяна Александровна

Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва-2011

4845472

Работа выполнена в лаборатории нейрохимии физиологически активных веществ и в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института физиологически активных веществ РАН (ИФАВ РАН).

Научные руководители: кандидат биологических наук

Нинкина Наталья Николаевна

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Бачурин Сергей Олегович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, член-

корреспондент РАМН Ярыгин Константин Никитич

доктор биологических наук, профессор Георгиева Софья Георгиевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится 19 мая 2011 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общемировая тенденция к увеличению средней продолжительности жизни и, как следствие, повышение частоты заболеваний нервной системы, сопровождающихся прогрессирующими дегенеративными процессами, обусловило возрастающий интерес ученых и клиницистов к изучению этих расстройств. Особое внимание уделяется изучению молекулярных и клеточных механизмов развития нейрональной патологии, так как их понимание необходимо для разработки подходов к ранней диагностике и терапии этих неизлечимых в настоящее время заболеваний. Нейродегенеративные болезни - крайне неоднородная нозологическая группа, к которой относятся как социально значимые расстройства, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (БП), так и целый ряд реже встречающихся заболеваний, например, болезни двигательного нейрона (БДН) и хорея Гентингтона. Однако, несмотря на гетерогенность этой группы, недавно в патогенезе этих заболеваний был выделен общий механизм, в основе которого лежит патологическая агрегация конформационно измененных белков, сопровождаемая образованием характерных гистопатологических структур - сенильных бляшек, телец Леви, нейрофибриллярных клубков и т.п. Сходный молекулярный механизм патогенеза подобных заболеваний позволил объединить их в группу протеинопатий.

Как уже сформированные гистопатологические структуры, так и отдельные этапы агрегации таких белков являются потенциальными мишенями для разработки терапевтических подходов и создания болезнь-модифицирующих препаратов. В связи с этим очевидна необходимость более подробного изучения общего звена патогенеза протеинопатий. Важным инструментом для исследования молекулярных изменений, ведущих к развитию протеинопатий, является их моделирование как в бесклеточных in vitro системах, так и in vivo - с использованием клеточных линий и генетически модифицированных лабораторных животных. В настоящее время ведется активная работа по созданию и характеристике таких моделей. Модельные in vivo системы позволяют, во-первых, изучать физиологические функции и нарушения метаболизма склонных к агрегации белков, лежащие в основе патогенеза протеинопатий, а во-вторых, могут быть использованы для первичного отбора потенциально эффективных в отношении протеинопатии терапевтических средств.

В последнее время был выявлен ряд новых белков, вовлеченных в патогенез протеинопатий, что, в свою очередь, потребовало создания новых модельных систем, а также характеристики на новом уровне уже имеющихся in vivo моделей, для того чтобы более полно использовать их потенциал.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание и характеристика клеточных и трансгенных моделей патологической агрегации белков, участвующих в развитии и прогрессии нейродегенеративных процессов, и их использование для исследования нейропротекторных свойств лекарственного препарата Димебон. В задачи работы входили:

1. Сравнительная морфологическая и функциональная характеристика моторных и сенсорных систем трансгенных мышей с прогрессирующей гамма-синуклеинопатией (линия ThylmySN) с целью подтверждения возможности использования этой линии в качестве модели нейродегенеративных заболеваний со специфическим повреждением двигательных нейронов.

2. Исследование влияния препарата Димебон на молекулярно-клеточные процессы, сопровождающие развитие гамма-синуклеинопатии у трансгенных мышей линии ThylmySN.

3. Исследование эффектов препарата Димебон в ранее охарактеризованной трансгенной модели альфа-синуклеинопатии, воспроизводящей ранние стадии БП.

4. Разработка методов моделирования протеинопатий, ассоциированных с мутациями в генах, кодирующих белки FUS и TDP-43 человека, и изучение патогенетических свойств указанных белков.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы впервые:

• проведена сравнительная характеристика состояния сенсорной и моторной функций у трансгенных мышей линии ThylmySN с повышенной продукцией склонного к агрегации белка гамма-синуклеина, характеризующихся прогрессирующей нейродегенеративной патологией, и получены данные о воспроизведении симптоматических признаков БДН у мышей данной линии;

корреляция этих свойств с клиническими характеристиками пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС), являющихся носителями этих мутаций.

• с использованием трансгенной модели (мыши линии ThylmySN) показано, что мишенями нейропротекторного действия Димебона могут являться высокоагрегированные формы амилоидогенного белка гамма-синуклеина;

• получено указание на то, что молекулярный механизм действия Димебона может быть связан с его эффектом на убиквитин-протеасомную систему;

• обнаружена селективность действия Димебона в отношении типа нейронов или в отношении метаболизма определенных склонных к агрегации белков, что вносит существенный вклад в понимание механизма нейропротекторного действия этого препарата.

Практическая значимость. Характеристика мышиной модели гамма-синуклеинопатии, выполненная в рамках данной работы, подтвердила возможность использования трансгенной линии ThylmySN в качестве модели БДН для тестирования новых подходов к терапии этих тяжелых заболеваний. Идентификация молекулярных мишеней препарата Димебон с использованием мышиной модели гамма-синуклеинопатии, а также данные по ограниченному эффекту этого препарата в модели БП могут использоваться для разработки рекомендаций по клиническому применению препарата. Полученные в исследовании линии клеток, экспрессирующих мутантные формы белков FUS и TDP-43, могут быть использованы как для дальнейшего изучения метаболизма этих белков и оценки их роли в развитии внутриклеточной патологии, так и для отбора препаратов, способных направленно действовать на метаболизм этих белков - потенциальных мишеней для терапии FUS и TDP-43 протеинопатий. В целом, полученные данные могут найти практическое применение в фармацевтической химии, биоскрининге и доклинических исследованиях.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 11-м Международном симпозиуме по достижениям в области терапии болезни Альцгеймера (Женева, Швейцария, 2010), на Ежегодном съезде Европейского общества молекулярных биологов (Барселона, Испания, 2010), на 6-ом Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010), на 40-ой конференции Общества нейронаук

США (Сан-Диего, США, 2010), на 23-ей Международной молодежной зимней школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2011), а также на 10-ой Международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона (Барселона, Испания, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в периодических изданиях, включенных в Перечень ВАК, и 7 публикаций в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, содержит 24 рисунка и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 150 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные и введение препарата Димебон. В работе были использованы трансгенные мыши линии ThylmySN, характеризующейся пан-нейрональной сверхпродукцией гамма-синуклеина мыши, и линии aSyn (1-120), характеризующейся продукцией укороченной формы альфа-синуклеина человека в дофаминергических нейронах. Обе линии велись на генетическом фоне C57BL/6J. Экспериментальные и контрольные группы трансгенных мышей начинали получать Димебон с возраста 1 мес (ThylmySN) или 3 мес (aSyn (1-120)) с питьевой водой (10 мкг/мл), доступ к которой не ограничивался. Спонтанную двигательную активность мышей оценивали в тесте «домашняя клетка». Координацию движений животных анализировали в тестах «ротарод» при постепенном ускорении вращения стержня и тесте «перевернутая сетка». Для оценки тактильной чувствительности использовали набор калиброванных волосков фон Фрея.

Гистохимический анализ и антитела. Головной мозг, спинномозговые корешки и узлы после фиксации окрашивали на амилоид в 1% водном растворе тиофлавина S, для окраски по Нисслю использовали 0,5% раствор крезилового фиолетового, для толуидинового окрашивания срезов - раствор, содержащий 1% толуидина и 1% тетрабората натрия. Для детекции с помощью биотинилированных вторичных антител использовали 3,3-диаминобензидин в качестве хромогена. Число ТГ-позитивных нейронов в вентральной области покрышки и черной субстанции или

нейронов в спинномозговых нервных узлах определяли стереологически на окрашенных серийных срезах, с учетом поправки Аберкромби. Для детекции микроглии использовали биотинилированный агглютинин I из Ricinus communis. Для специфической детекции белка FUS в экспериментах на культурах клеток использовали моноклональные антитела против С-концевого эпитопа FUS. Для детекции белков (иммуногисто- и цитохимическое окрашивание, иммуноблоттинг) использовали следующие первичные антитела: кроличьи против GFAP и GFP, мышиные против ТГ, убиквитина, альфа-синуклеина и гамма-синуклеина. В качестве вторичных использовали антитела против IgG мыши или кролика: биотинилированные или конъюгированные с флуорохромами А1еха546 или А1еха488.

Генетические конструкции и клеточные культуры. Для трансфекции культивируемых клеток использовали плазмидные конструкции на основе вектора pEGFP-Cl, позволяющего экспрессировать рекомбинантные белки, слитые с GFP. Мутантные варианты гена FUS человека были созданы путем введения в участок кДНК, кодирующий сигнал ядерной локализации, четырех точечных замен, вызывающих изменение аминокислотной последовательности (R518K, R522G, P525L и R524T) в кодируемом белке. В конструкциях для экспрессии укороченных форм белков FUS и TDP-43 были полностью удалены участки генов, кодирующие сигнал ядерной локализации. В работе использована перевиваемая культура клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Клетки выращивали на покровных стеклах, обработанных поли-Ь-люином, или на чашках Петри, трансфекцию осуществляли с помощью реагента Lipofectamine2000 (Invitrogen, США). Для микроскопии клеточные культуры фиксировали последовательно холодным 4% параформальдегидом и 100% метанолом, ядра окрашивали DAPI. При использовании флуорохром-конъюгированных вторичных антител микрофотографии получали при помощи оснащенного камерой конфокального микроскопа (Leica Microsystems, Швейцария).

Дифференциальное фракционирование растворимых и агрегированных белковых форм осуществляли при помощи ультрацентрифугирования (при 100 ООО g) с использованием набора высокосолевых буферов с различным содержанием детергентов. Детекцию белков проводили методом иммуноблоттинга.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительная морфологическая и функциональная характеристика моторных и сенсорных систем у трансгенных мышей с прогрессирующей гамма-

синуклеинопатией

В тканях нервной системы трансгенных мышей линии ТкуШуБМ накопление склонного к агрегации белка гамма-синуклеина сопровождалось прогрессирующим нарушением координации движений, а на поздних стадиях - параличом конечностей. Это наблюдение позволило предположить развитие у животных этой линии патологии двигательных нейронов, сходной с патологией, характерной для БДН человека. Однако функция сенсорных нейронов, которая у большинства пациентов с БДН существенно не нарушена, у мышей трансгенной линии ПуШуБЫ ранее не изучалась. Для того чтобы подтвердить селективность поражения двигательных нейронов и, следовательно, что данная линия является адекватной моделью основных аспектов патологии при БДН, была выполнена сравнительная оценка степени нарушения сенсорной и моторной функций у мышей трансгенной линии ТИу1ту5Ы. Для этого был использован комплексный подход, включающий поведенческое тестирование, оценку числа сенсорных и моторных нейронов в отдельных клеточных популяциях (или отдельных структурах нервной системы), гистологическую и биохимическую оценку состояния этих нейронов и нервных волокон.

Для оценки двигательной функции животных был использован тест на способность удерживаться на перевернутой сетке. У мышей линии ТкуМуБЫ (возраст от 2 до 12 мес) по сравнению с животными дикого типа (возраст 18 мес) было зарегистрировано возраст-зависимое ухудшение двигательной функции, при этом в возрасте 12 мес трансгенные животные были практически неспособны удерживаться на сетке, тогда как большинство животных дикого типа даже в возрасте 18 мес могли удерживаться на сетке в течение 60 сек (Рис. 1, В). Эти результаты хорошо согласуются с полученными ранее данными теста «ротарод», указавшими на прогрессирующее нарушение двигательной функции у мышей линии ТИу1ту8Ы. Затем при помощи набора волосков Фрея была исследована тактильная чувствительность трансгенных животных и животных дикого типа. Статистически значимых различий между контрольными и трансгенными животными в возрасте 4 мес выявлено не было (Рис. 1, А), ухудшения состояния сенсорной функции с возрастом также не отмечалось (Рис. 1, Б).

1 'S 70 | 3 60

I 1 50

ai ^ 40 ¡-30

Рис. 1. Сравнительный анализ двигательной и сенсорной функций у трансгенных животных линии ThylmySN (TG) и животных дикого типа (WT). Тактильная чувствительность у животных в возрасте 4 мес (А) и различного возраста (Б). (В) Двигательная функция животных в тесте «перевернутая сетка». А и Б - на оси Y указан % мышей, которые отдергивали конечность при соответствующем значении силы волоска. В — у основания столбца — процент мышей в данной возрастной группе, способных удерживаться на сетке 60 сек как минимум в одной из 3 попыток. * -р<0,05; *** -р<0,001.

_ WT TG

5000 4500

а 4000 m t

о -1 3500

5 s

3000 2500 2000 1500 1000 500

а о

>5 п

S с

I «5

О О

С X

О л

т I

-ь

Б * «8 1. t *

1 шш

RCAI Д

-о

Рис. 2. Нейроны в спинномозговых чувствительных узлах мышей линии Пу1ту$1Ч (Тв) и мышей дикого типа (\¥Т). (А) Число нейронов в нервных узлах поясничной области (Ь4-Ь5). (Б) Окрашивание амилоид-специфическим красителем Тиофлавином Б. Иммунореактивность на гамма-синуклеин (В) и маркеры нейровоспалительных реакций микроглиоза (11СА1) (Г) и астроглиоза (йРАР) (Д). У основания столбцов указано число проанализированных узлов. Стрелками указаны Тиофлавин 8-позитивные включения. Шкала для всех рисунков - 25 мкм.

Таким образом, в данной модели на поведенческом уровне действительно имеет место прогрессивная двигательная патология, не сопровождаемая ухудшением сенсорной функции. Избирательное угасание двигательной функции у трансгенных животных может быть связано с гибелью отдельных популяций двигательных нейронов при накоплении токсических продуктов агрегации гамма-синуклеина, при этом сенсорные нейроны, по-видимому, более устойчивы, либо обладают более высокими компенсаторными возможностями. Для подтверждения избирательной гибели двигательных, но не сенсорных нейронов в данной модели была изучена популяция нейронов спинномозговых узлов, включающих тела только сенсорных нейронов. Статистически значимой разницы в числе сенсорных нейронов у трансгенных мышей с развитой симптоматикой и мышей дикого типа соответствующего возраста обнаружено не было (Рис. 2, А). Несмотря на то, что у трансгенных животных в нервных узлах обнаруживались Тиофлавин в-позитивные амилоидные отложения (Рис. 2, Б), окрашивание на убиквитин и гамма-синуклеин не позволило обнаружить структуры, содержащие эти белки (Рис. 2, В). Состав отложений амилоидного типа в данном участке нервной системы требует дальнейшего изучения. Гистологический анализ признаков нейровоспаления -окраска срезов на маркеры астроглиоза (ОРАР) и микроглиоза (ЯСА1) - не выявил каких-либо отклонений от нормы (Рис. 2, Г, Д). В целом, существенных различий по состоянию спинномозговых узлов между трансгенными мышами и мышами дикого типа обнаружено не было, что согласуется с данными поведенческого тестирования.

Для исследования выживаемости двигательных нейронов были выбраны две популяции - нейроны передних рогов спинного мозга и нейроны двигательного ядра тройничного нерва. Число нейронов в передних рогах спинного мозга даже у гетерозиготных по трансгену животных в возрасте 12 мес по сравнению с мышами дикого типа было существенно снижено (Рис. 3, А). Сходная картина была выявлена и при изучении популяции мотонейронов в двигательном ядре тройничного нерва трансгенных мышей, где, помимо статистически значимого снижения числа нейронов,также наблюдались выраженные нейровоспалительные изменения -микроглиоз и реактивный астроглиоз (Рис. 3, Б, В). Следующим этапом в оценке состояния сенсорной и моторной систем в линии ТкуШуБЫ стал анализ состояния нервных волокон, интактность которых необходима для нормальной передачи

нервного импульса от двигательного нейрона к мышце. Методом иммуногистохимического анализа оценен уровень продукции гамма-синуклеина в седалищном нерве животных трансгенных мышей и мышей дикого типа (Рис. 4, А). Было обнаружено, что гамма-синуклеин в большом количестве накапливается в нервных волокнах у трансгенных животных, что позволило предположить существование негативного воздействия олигомерных и/или высокоагрегированных форм белка на отростки нервных клеток. Для определения возможного эффекта избыточного накопления гамма-синуклеина отдельно на чувствительные и двигательные волокна были исследованы передние (эфферентные) задние (афферентные) корешки спинного мозга. При анализе поперечных срезов через задний корешок (Рис. 4, Г) у трансгенных животных морфологических изменений по сравнению с животными дикого типа обнаружено не было, тогда как в передних корешках спинного мозга трансгенных мышей отмечались выраженные дегенеративные изменения, включая многочисленные убиквитинированные включения, а также микроглиоз (Рис. 4, В). Для количественной оценки степени повреждения нервных волокон была определена средняя площадь волокон А-типа (наиболее крупные миелинизированные волокна) на поперечных срезах через передние и задние корешки. Действительно, этот показатель у мышей линии ТИу1ту8И по сравнению с животными дикого типа был ниже для передних, но не для задних корешков (Рис. 4, Б). Гибель нервных волокон в данном случае может происходить как антероградно - начинаться после нарушения связи между телом нейрона и отростком в связи с накоплением токсичных продуктов агрегации гамма-синуклеина и/или при механическом повреждении волокна крупными агрегатами, так и уже после гибели нейрона.

Таким образом, существование моторной дисфункции в данной модели было подтверждено на всех уровнях, тогда как существенных изменений в сенсорной системе обнаружить не удалось. Мышей линии ТкуШуБЫ можно считать адекватной моделью БДН, не сопровождаемых развитием сенсорной нейропатии, к которым принадлежит подавляющее большинство случаев этих заболеваний. Данная модель может быть использована для отбора нейропротекторных препаратов, способных защищать двигательные нейроны от токсичности, вызванной агрегацией амилоидогенных белков.

А 120

передний рог спинного двигательное ядро

мозга тройничного нерва

Рис. 3. Популяции мотонейронов 12-месячных мышей линии Т11у1ту$1У (Тв) и мышей дикого типа (ЧУТ). (А) Число мотонейронов в передних рогах спинного мозга и (Б) в двигательном ядре тройничного нерва. (В) Нейровоспалительные процессы в двигательном Ю симп. - трансгенные животные с развитой нейрональной — животные с одной копией трансгена. У основания столбца **-р<0,01, *** - р <0,001. Шкала 50 мкм.

ядре троиничного нерва. симтоматикой, Тй гет. указано число животных. УУТ

I О — 70 -£-

X СЧ С 1 во

§ 2

1 1 20

2 ь

5 с 0 УУТ

тс

передний корешок

ТС

задний корешок

Рис. 4. Нервные волокна 12-месячных мышей линии ТИу1ту$М (ТО и мышей дикого типа (\УТ). (А) Экспрессия гамма-синуклеина в седалищном нерве: продольный срез через нерв. (Б) Средняя площадь волокон типа А на срезах через передний и задний корешки. (В) Иммуногистохимическая детекция убиквитина и активированной микроглии в передних корешках. (Г) Поперечный срез через передний и задний корешки спинного мозга (окрашивание толуидином). *** -р<0,001. Шкала 20 мкм.

1200

в 1000

800

>х

1 600

0 с

1 400

200

2. Влияние препарата Димебои па содержание нерастворимых форм амилоидогснмого белка и на состояние убиквитин-протеасомной системы в трансгенной модели гамма-синуклеиноиатии

Ранее было показано, что препарат Димебон. у которого были обнаружены

нейропротекторные свойства, способен влиять на молекулярно-клеточные процессы

образования и/или ликвидации патологических белковых отложений т vivo. Тем не

менее, точный молекулярный механизм действия этого препарата до сих пор не

установлен. Задачей данного раздела работы стало изучение действия Димебона на

конечные продукты белковой агрегации — нерастворимые белковые включения, а

также оценка состояния одной из систем клеточной защиты, активируемой при

протеинопатиях, - убиквитин-протеасомной системы. В качестве объекта

исследования использовались мыши линии ThylmySN, для которых было ранее

показано накопление нерастворимых форм амилоидогенного белка и высокая

активность убиквитин-протеасомной системы в спинном мозге. Кроме того, ранее

была показана способность препарата Димебон приводить к снижению числа

амилоидных агрегатов и реактивного астроглиоза в спинном мозге в этой модели, а

также улучшать двигательную функцию животных. У получавших Димебон

животных удалось выявить существенное снижение содержания агрегированных

нерастворимых форм гамма-синуклеина в препаратах спинного мозга (Рис. 5, А). При

этом содержание детергент-растворимых промежуточных продуктов белковой

агрегации, которые высвобождаются из

осадков в присутствии неионного детергента

Тритон Х-100, было одинаковым в препаратах

из экспериментальной и контрольной групп.

Обнаруженный эффект снижения содержания

нерастворимых форм белка под действием

Димебона в спинном мозге мышей линии

ThylmySN согласуется с выявленным ранее

Рис. 5. Растворимые (раст.), растворимые в присутствии детергента Тритон Х-100 (Тр.Х-100) и детергент-нерастворимые (нерает.) белки в препаратах спинного мозга трансгенных животных, получавших (+) и не получавших (-) Димебон. В качестве положительного контроля использовался бета-актин.

Tp.X-I00 HERACT. + - +

17 кД

43 кД

уменьшением числа амилоидных включений при хроническом введении Димебона. Одним из возможных механизмов описанного эффекта может являться активация в присутствии Димебона внутриклеточных систем очистки от агрегированных форм белков, в том числе, убиквитин-протеасомной системы. Действительно, содержание мономерного убиквитина у получавших препарат мышей было выше, а количество убиквитинированных белков - ниже, чем у контрольных животных (Рис. 5, Б). Эти результаты могут свидетельствовать о повышенной активности убиквитин-протеасомной системы в клетках спинного мозга получавших Димебон мышей. В целом, эти данные являются свидетельством того, что Димебон способен влиять на процесс формирования или стабильность конечных продуктов белковой агрегации -детергент-нерастворимых структур, которые составляют основу амилоидных включений при различных формах протеинопатий.

3. Исследование эффекта Димебона на патологические изменения, вызванные

сверэкспрессией укороченной формы альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах мышей линии aSyn (1-120) В задачи данного раздела входило сравнительное изучение эффекта Димебона в другой ш vivo модели протеинопатии, вызванной накоплением в нервной ткани еще одного представителя семейства синуклеинов - альфа-синуклеина. Альфа- и гамма-синуклеины имеют сходную структуру, физико-химические свойства и способность к агрегации. Однако при альфа-синуклеинопатиях специфической гибели двигательных нейронов не выявлено. Классическим примером альфа-синуклеинопатии является болезнь Паркинсона (БП), при которой имеют место агрегация альфа-синуклеина и специфическая гибель дофаминергических нейронов. При выборе модели для данного исследования предпочтение было отдано линии, воспроизводящей ранние стадии развития патологии при БП. Линия мышей aSyn (1-120) характеризуется продукцией укороченной с С-конца формы альфа-синуклеина человека в дофаминергических нейронах (под контролем промотора гена ТГ). У взрослых животных этой линии снижен уровень дофамина в полосатом теле, что приводит к снижению двигательной активности, при этом укороченный альфа-синуклеин накапливается в телах нейронов. Тем не менее, выраженных нарушений двигательной функции, характерных для поздней стадии БП, у мышей данной линии не регистрируется. Известно, что ольфакторные нарушения, вызванные изменениями в обонятельной луковице,

наблюдаются у 70-95% пациентов на ранних стадиях БП и предшествуют развитию двигательной дисфункции. У мышей линии с&уп (1-120) наиболее высокий уровень экспрессии трансгена и накопления белка наблюдаются в дофаминергических нейронах обонятельной луковицы. Таким образом, а8уп (1-120) трансгенные мыши представляют собой модель ранних изменений в функции дофаминергической системы, которые предшествуют гибели нейронов на поздних стадиях БП.

Эффект хронического введения Димебона на поведенческие характеристики мышей. При анализе двигательной активности получавших Димебон и контрольных трансгенных мышей в тесте «домашняя клетка» в течение 24 ч значимых различий между группами обнаружено не было (р=0,662, Рис. 6, А), что свидетельствует об отсутствии эффекта препарата на спонтанную двигательную активность мышей линии аБуп (1-120). Тем не менее, получавшие Димебон трансгенные животные были значительно более активны по сравнению с контрольными животными (р=0,019) в первые 15 мин пребывания в новом окружении; активность в этой группе приближалась к активности животных дикого типа (Рис. 6, Б). Таким образом, Димебон стимулирует исследовательскую активность стареющих мышей линии аЗуп (1-120). Так как исследовательское поведение животных обусловлено скоординированной работой многих участков головного мозга и зависит не только от дофаминергической системы, наблюдаемый эффект отражает общее улучшение функции стареющего мозга при использовании Димебона, что согласуется с данными предыдущих исследований. Равновесие и координация движений получавших и не получавших Димебон трансгенных мышей и мышей дикого типа одинакового возраста оценивались с помощью тестов «перевернутая сетка» и «ротарод» (Рис. 6, В и Г). Различий между группами в тесте «перевернутая сетка» обнаружено не было, однако результаты трансгенных животных в тесте «ротарод» были значительно хуже результатов животных дикого типа (р=0,030), введение Димебона не улучшало этих показателей (р=0,806). Известно, что на стадиях БП с развитой двигательной дисфункцией детектируется снижение уровня дофамина в полосатом теле на 80%, тогда как у мышей линии аБуп (1-120) оно достигает лишь 30%, поэтому ухудшение показателей животных в тесте «ротарод» нельзя объяснить только дефицитом дофамина. Здесь, вероятно, играют роль другие патологические изменения в дофаминергических нейронах и/или их синапсах, вызванные сверхпродукцией укоро-

13 .

- контр. Тв © дим. ТО

контр. ТС -»- дим. ТО

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

интервал, ч

3 4 5 6 7

интервал, 15 мин

т контр, дим.

* 300 о

* 2.50 х

« 200 сГ

2 150 о

Ч 100

| 50 а

ш о

Ш коитр. дим.

Рис. 6. Результаты поведенческого тестирования мышей линии а5уп (1-120), получавших и не получавших Димебон (контр. ТС и дим. 1С соответственно), и мышей дикого типа (\¥Т). Спонтанная двигательная активность в течение 24 ч (А) и 2 ч (Б) тесте «домашняя клетка». Темное время суток выделено серым цветом. Анализ координации движений в тестах «перевернутая сетка» (В) и «ротарод» (Г). У основания столбца указано число протестированных животных в группе. #и * — статистически значимые различия (р < 0,05) между показателями животных дикого типа и трансгенных животных и между показателями получавших и не получавших Димебон трансгенных мышей соответственно.

ченного альфа-синуклеина. Сниженные показатели трансгенных мышей в тесте

«ротарод» и отсутствие различий между группами в тесте «перевернутая сетка»

указывают на то. что сверхэкспрессия альфа-синуклеина в дофаминергических

нейронах вызывает селективные изменения в нервной системе животных.

Действие Димебона на число дофаминергических нейронов и содержание моноаминов в полосатом теле. Ранее было показано, что экспрессия укороченной формы альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах приводит к развитию патологических изменений в области черной субстанции: образованию белковых включений, микроглиозу, а также снижению уровня моноаминов в полосатом теле. Был оценен эффект Димебона на число дофаминергических нейронов в этом участке мозга и содержание дофамина и его метаболита дигидрофенилуксусной кислоты в дорсальной части полосатого тела. Различий в числе нейронов и содержании моноаминов между опытной и контрольной группами обнаружено не было (Рис. 7).

9 4000

| 3500

,1 3000 №

1 2500 11 2000 О 1ЯЮ о 1000 X

г 500

чс

и '

5 5

Рис. 7. Функция нигростриарной системы у мышей линии аУуг (1-120). (А) Число дофаминергических нейронов в области черной субстанции (ЧС) и вентральной области покрышки (ВОП). Содержание дофамина (Б) и его метаболита дифенилгидроуксусной кислоты (ДГФУК) (В) в дорсальной части полосатого тела у получавших (дим.) и не получавших (контр.) Димебон трансгенных животных. У основания столбца указано число животных.

Е юо ¡1» в»

5 40

контр. ДИМ. контр. ДИМ.

Дофамин

В:

¿а

контр. ДИМ.

ДГФУК

о X

■ I

9 10

Таким образом, Димебон не способствует улучшению состояния нигростриарной системы в данной модели.

Эффект Димебона на экспрессию гена укороченного альфа-синуклеина и на содержание и локализацию его белкового продукта в дофаминергических нейронах обонятельной луковицы. Поскольку наиболее высокий уровень экспрессии трансгена в данной линии обнаруживается в обонятельной луковице, в эксперименте использовали объединенные образцы ткани обонятельных луковиц

контр. ДИМ.

получавших (Б 1,02) и не получавших Димебон (С1, С2) мышей. Для оценки эффекта препарата на экспрессию трансгена у мышей опытной и контрольной групп были определены уровни мРНК альфа-синуклеина человека с помощью обратной транскрипции-количественной ГПДР и кодируемого ею белка с помощью иммуноблоттинга. Во всех образцах уровень мРНК был одинаковым (Рис. 8, А), интенсивность полос при иммуноблотгинге, соответствующих укороченному

1.6 ? 14

Г2

£ 1.0

I 0.8

£ 0.6 а

ш 04 £0.2 0.0

12кДа

С1 С2 01 02

С1 С2 02

тг а-син В #

«<р 1'

Рис. 8. Экспрессия трансгена (А) и содержание (Б) и локализация (В, Г) альфа-синуклеина в нейронах обонятельной луковицы получавших Димебон (01 и 02, Г) и контрольных (С1 и С2, В) трансгенных мышей. Шкала 20 мкм.

альфа-синуклеину, также была сходной (Рис. 8, Б). Эти результаты указывают на то, что Димебон не изменяет экспрессию трансгена, направляемую промотором ТГ, и не меняет уровень накопления альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах обонятельной луковицы.

В отличие эндогенного альфа-синуклеина, локализованного в основном пресинаптически, укороченный белок накапливается в телах дофаминергических нейронов гломерулярного слоя обонятельной луковицы, поэтому данная популяция нейронов была подходящим объектом для оценки эффекта препарата на накопление белка и его внутриклеточную локализацию. Однако двойное иммуноокрашивание срезов обонятельных луковиц с помощью антител против альфа-синуклеина и ТГ не обнаружило каких-либо эффектов Димебона на локализацию и содержание укороченного альфа-синуклеина (Рис. 8, В, Г).

Таким образом, было показано, что Димебон не оказывает эффекта на биохимические, гистологические и поведенческие изменения при модельной протеинопатии, вызванной экспрессией укороченной формы альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах.

На основании описанных выше и литературных данных по эффекту Димебона в двух трансгенных мышиных моделях (линии ThylmySN и aSyn (1-120)), можно предположить, что действие этого препарата селективно в отношении определенных типов нейронов и/или в отношении определенных белков. Действительно, метаболизм и функции двух изучаемых групп нейронов - дофаминергических и двигательных - существенно различаются, следовательно, они могут быть в разной степени чувствительны к агрегации и токсическому действию белковых агрегатов. Также не следует исключать возможность селективного эффекта препарата только в отношении одного из синуклеинов. Полученные данные позволяют также заключить, что Димебон, по-видимому, не может рассматриваться в качестве эффективного болезнь-модифицирующего средства для лечения альфа-синуклеинопатий.

4. Моделирование FUS и TDP-43 протеинопатии in vitro и свойства модифицированных форм этих белков

Белки TDP-43 и FUS стали своеобразным «связующим звеном» между

наследственными и идиопатическими формами бокового амиотрофического склероза (БАС) - наиболее часто встречающегося заболевания группы БДН - и еще одной

протеинопатии, фронтотемпоральной дегенерации (ФТД), так как оба эти белка были обнаружены в составе гистопатологических агрегатов при обоих заболеваниях. Белковые молекулы FUS и TDP-43 имеют сходную доменную структуру и выполняют в клетке сходные функции - участвуют в регуляции процессинга РНК и ее транспорте. Существуют указания на то, что нарушение именно этих функций FUS и TDP-43 является причиной развития заболевания, поэтому все большее внимание стало уделяться роли нарушения метаболизма РНК в патогенезе БАС и ФТД. Однако биохимические различия в свойствах изоформ белка, кодируемых мутантными вариантами гена FUS, в первую очередь, их способности к агрегации, исследованы недостаточно. В работе были исследованы агрегационные свойства аберрантных форм белка FUS человека, которые кодируются некоторыми мутантными вариантами гена, выявленными у пациентов с БАС (Рис. 9, Б). Исследованные мутации локализовались в участке, кодирующем, согласно данным in silico, сигнал ядерной локализации. Всего было исследовано четыре изоформы белка со следующими аминокислотными заменами: R524T, R518K, R522G и P525L. Кроме того была создана модельная конструкция для продукции укороченной формы белка FUS (Д514-526), в которой сигнал ядерной локализации был полностью удален (Рис. 9, В).

I I 00 11 I I ITDP-43

Рис. 9. Структурная организация белка FUS и его модифицированных форм, использованных в исследовании. (А) Доменная структура белковой молекулы FUS. (Б) Варианты рекомбинантных форм белка FUS, продуцируемые при транзиторной трансфекции клеток экспрессионными кассетами: нормальный полноразмерный белок (WT) и четыре мутантных варианта с аминокислотными заменами. (В) Укороченные варианты белков FUS и TDP-43. А и Б - Положения аминокислотных замен в С-концевом участке выделены затемнением или белой полосой.

Было обнаружено, что при сверхэкпрессии FUS дикого типа, а также R524T и R518K в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y рекомбинантные белки локализуются исключительно в ядре, при этом чаще всего они распределены диффузно (Рис. 10, А). Напротив, в клеточных культурах, трансфецированных конструкциями P525L-, R522G- и A514-526-GFP, химерный белок накапливался в основном в цитоплазме в виде агрегатов различного размера и формы. Диффузное распределение белка в этом случае встречалось редко, а агрегированные формы локализовались в основном в непосредственной близости от ядра. Эти результаты были подтверждены при помощи иммуноблоттинга (Рис. 10, Б).

Б R518K P525L WT

кДа С V С N "сГ*?

Рис. 10. Влияние БАС-ассошшро-ваиных мутаций на локализацию и агрегациопные способности белка

FI S. Б - С - цитпоплазматическая, N -ядерная фракции; антитела против белка FUS. Шкала 25 мкм.

Для объяснения полученных результатов можно предложить две гипотезы. Согласно первой, 13 С-концевых аминокислот - необходимая часть домена, ответственного за транспорт белка в ядро, при этом аминокислотные остатки в положениях 518 и 524 не критичны для нормального функционирования сигнала ядерной локализации, а остатки в положениях 522 и 525 — являются ключевыми для ядерного транспорта FUS. Второе возможное объяснение - аберрантные формы белка P525L и R522G, а также форма, в которой С-концевой участок отсутствует, агрегируют непосредственно после синтеза, поэтому мономерный белок «не успевает» транспортироваться в ядро и детектируется в цитоплазме в виде включений.

На основе имеющихся литературных данных были проанализированы характеристики течения заболевания в зависимости от типа ассоциированной с ним мутации (Табл.1), У пациентов - носителей мутаций R518K и R524T заболевание начинается относительно поздно и характеризуется сравнительно медленной

прогрессией, продолжительность жизни после проявления симптомов в среднем превышает 25 месяцев. При наличии мутаций R522G и P525L, а также делеций R495X и p.G466VfsX14, при которых полностью отсутствует С-концевой участок FUS, заболевание, как правило, начинается рано (до 30 лет), течение болезни более тяжелое и стремительное. Таким образом, по-видимому, существует корреляция между клеточной локализацией мутантного белка, его агрегационными свойствами и возрастом начала заболевания.

Таблица 1. БАС-ассоциированные мутации: характеристики течения заболевания.

Мутация (соответствующая конструкция) Характеристики мутантной формы Клиническое течение заболевания *

Локализация Способность к агрегации Средний возраст дебюта, лет Скорость прогрессии Выживаемость, мес

R518K Ядро Низкая 40.3 ±6.6 Медленно 26.7 ± 14.4

R524T Ядро Низкая 61.6 ± 4.8 Медленно 32.9 ±18.2

RS22G Цитопл. Высокая 28.5 ± 14.8 Медленно 25.1 ±15.6

P525L Цитопл. Высокая 22.0 Быстро 6.0

R49SX (А514-526) Цитопл. Высокая 35.0 ± 16.0 Быстро 14.8

p.G466VfsX14 (Д514-526) Цитопл. Высокая 20.0 Быстро <24

* Данные литературы.

Агрегационные свойства укороченных форм TDP-43 и FUS. При анализе гистологического материала от пациентов с БАС и ФТД белок TDP-43 в составе включений присутствовал главным образом в модифицированной форме -гиперфосфорилиро-ванной, убиквитинированной или укороченной с N-конца (фрагменты -25 кДа). Напротив, модифицированные формы FUS в составе агрегатов в нервной системе больных БАС и ФТД не были обнаружены. Структурные домены, находящиеся на N-конце TDP-43, в молекуле FUS находятся на С-конце. Таким образом, по своей структуре эти два белка являются «зеркальным отображением» друг друга. В настоящем исследовании были изучены агрегационные свойства укороченного с N-конца TDP-43, соответствующего формам, обнаруживаемым в составе агрегатов у больных БАС и ФТД, и структурно подобного ему белка FUS с укороченным С-концом. В работе использовались генетические конструкции для продукции слитых с GFP укороченных форм TDP-43 и FUS: TDP-43 с делецией аминокислотных остатков с 3 по 192 (TDP-43(A3-192)) и FUS - с 359 по 526 (FUS(A359-526)) (Рис. 9, В). В трансфецированных клетках GFP-TDP-43(A3-192) образовывал ядерные и цитоплазматические убиквитинированные включения

Рис. 11. Морфология и статус

убиквитинирования агрегатов, образу-емых TDP-43(A3-192) (А, Б) и FUS(A359-526) (В,Г), и растворимость агрегатов в детергент-содержащих буферах (Д). GFP AT - антитела против GFP. Шкала А-25 мкм, Б-Г-15 мкм.

(Рис. 11, А, Б). GFP-FUS(A3 59-526) также обладал высокими агрегацио иными свойствами, однако все образуемые им включения локализовались в цитоплазме. Кроме того, диффузное распределение белка в клетке было обнаружено в случае GFP-TDP-43(ДЗ-192), но не GFP-FUS(A359-526) (Рис. 11, В, Г). Включения GFP-FUS(A359-526) обнаруживались уже через 4 ч после трансфекции - вероятно, агрегационные способности этой формы белка, очень высоки, поэтому начинает агрегировать непосредственно после синтеза, не накапливаясь в цитоплазме в мономерной форме. Агрегаты обоих химерных белков не окрашивались антителами против убиквитина (Рис. 11, Б, Г), это согласуется с литературными данными о том, что убикитинирование - позднее событие в формировании TDP-43 и FUS положительных гистопатологических структур. Результаты дифференциального фракционирования подтвердили, что агрегаты GFP-FUS (Д359-526) и GFP-TDP-43(A3-192) являются детергент-нерастворимыми (Рис. 11, Д).

Рис. 12. Детекция эндогенного белка и рекомбинантных форм FUS при помощи антител против С-концевого эпитопа.

GFP-FUS(A359-526) агрегаты, в составе которых присутствует эндогенный белок FUS, указаны стрелками. Шкала: А — WT -25 мкм. P525L и FUS(A359-526) - 20 мкм; Б — 15 мкм.

Я P525L4 ч ш * "'"* *> V VV ^Й11 - ШШЩД bS

DAPI FUS(i3S9-526) FUS m I

^¡¡¡¡P .. VO .. ...

Б "" .4*1

DAPI + SFP-FUS + FUS

«г5 * A- В </ J 70кДа«ЩР> FUSAT

Таким образом, укороченные формы двух исследованных белков обладают гораздо более высокой способностью к агрегации по сравнению с полпоразмерными немутированными белками.

Способность GFP-FUS(A359-526) включать эндогенный FUS в агрегаты. В последнее время было найдено множество свидетельств способности белков, не имеющих определенной третичной структуры и обладающих высокими агрегационными свойствами, к индукции агрегации белковых молекул. Такие белки некоторые исследователи предлагают объединить в группу прионогенных белков, то ввиду их «инфекционных» свойств, пусть и не так ярко выраженным, как у прионовых белков. Прионовый домен был обнаружен и на N-конце белка FUS (аа.1-239). В связи с высокими агрегационными способностями и присутствием потенциального прионового домена в составе GFP-FUS(A359-526) была изучена способность этой формы белка индуцировать агрегацию нормального эндогенного белка в трансфецированных клетках. Для этого агрегаты, образованные GFP-FUS(A359-526), были исследованы на предмет присутствия эндогенного белка с помощью антител против С-концевого эпитопа FUS. Антитела узнавали как эндогенный белок, локализованный преимущественно в ядре, так и рекомбинантные белки, в том числе и в составе агрегатов. Исключение составлял GFP-FUS(A359-526) - антитела не детектировали образуемые им GFP-позитивные агрегаты (Рис. 12, А). Тем не менее, при дальнейшем анализе удалось обнаружить клетки, в которых некоторые из агрегатов GFP-FUS(A359-526), узнавались С-конец-специфическими антителами (Рис. 12, Б). Полученные результаты были подтверждены с помощью иммуноблоттинга - эндогенный белок с молекулярной массой 70 кДа был обнаружен в детергент-нерастворимой фракции (Рис. 12, В). Таким образом, GFP-FUS(A3 59-526) действительно способен индуцировать агрегацию эндогенного белка или каким-либо иным образом включать его в состав агрегатов. Возможность индукции агрегации нормального белка FUS изменившими свои агрегационные свойства белковыми молекулами FUS может играть важную роль в патогенезе заболевания: исключение белка из нормального метаболизма и, следовательно, нарушение его функции может иметь крайне неблагоприятные последствия для метаболизма нейронов.

В заключение следует отметить, что разработанные подходы к моделированию молекулярной патологии, характерной для ряда форм БАС и ФТД, являются важным инструментом для изучения механизма развития данных заболеваний и отбора новых препаратов, воздействующих непосредственно на патогенез этих расстройств.

выводы

1. У трансгенных мышей с повышенным уровнем пан-нейрональной экспрессии амилоидогенного белка гамма-синуклеина (линия ThyimjSN) выявлена прогрессирующая с возрастом двигательная дисфункция при сохраненной тактильной чувствительности.

2. Сравнительный анализ популяций двигательных и сенсорных нейронов и их волокон у мышей линии ThylmySN показал селективную гибель двигательных нейронов и дегенеративные изменения в эфферентных волокнах, сопровождаемые нейровоспалительной реакцией, при этом нейродегенеративных процессов в сенсорных нейронах и их отростках выявлено не было.

3. Хроническое применение препарата Димебон приводит к снижению количества нерастворимых форм гамма-синуклеина в тканях спинного мозга трансгенных мышей линии ThylmySN, изменяя при этом соотношение убиквитинированных форм гамма-синуклеина во фракциях растворимых и нерастворимых белков.

4. В трансгенной модели альфа-синуклеинопатии, воспроизводящей характерные черты досимптоматической стадии БП и не затрагивающих двигательные нейроны (линия aSyn (1-120)), было показано, что хроническое применение Димебона неэффективно в отношении поведенческих, гистологических и биохимических проявлений патологии, вызванных агрегацией модифицированного альфа-синуклеина.

5. В разработанных клеточных моделях TDP-43 и FUS протеинопатий было показано, что удаление или модификация ответственных за ядерную локализацию доменов у белков TDP-43 и FUS, вовлеченных в патогенез БАС и ФТД, приводит к нарушению клеточной локализации этих белков и накоплению цитолпазматических включений, сформированных их агрегированными формами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бачурин С.О., Устюгов A.A., Петере О., Шелковникова Т.А., Бухмап В.Л., Нинкина H.H. Блокада нейродегеперативных процессов, вызванных протеинопатией, как новый механизм действия нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих препаратов// Доклады Академии наук: Биохимия и Биофизика. 2009. Т.428, №2. С.262-265.

2. Кохан B.C., Болкунов A.B., Устюгов A.A., Ванькин Г.И., Шелковникова Т.А., Редкозубова О.М., Стрекалова Т.В., Бухман В.Л., Нинкина H.H., Бачурин С.О. Направленная инактивация гена, кодирующего гамма-синуклеин, влияет на уровень тревожности и исследовательской активности мышей// Журнал высшей нервной деятельности. 2011. Т.61, №1. С.85-93.

3. Скворцова В.И., Бачурин С.О., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ковражкина Е.А., Почигаева К.И., Нинкина H.H., Шелковникова Т.А., Устюгов A.A. Новые аспекты патогенеза бокового амиотрофического склероза// Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2011. №2. С.4-9.

4. Ustyugov A., Shelkovnikova Т., Ninkina N., Bachurin S. Synucleinopathy is tempered by Dimebon// Journal of Neurochemistry, Abstracts of the 11th International Geneva/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy, 24-27 March, Geneva, Switzerland. 2010. P.81.

5. Shelkovnikova T.A., Ustyugov A.A., Millership S., Buchman V.L., Ninkina N.N., Bachurin S.O. Dimebon does not affect the phenotype of transgenic mice overexpressing truncated human alpha-synuclein in dopaminergic neurons// Book of Abstracts of the 5th International Interdisciplinary Congress "Neuroscience for Medicine and Psychology", June 5-15. Sudak, Ukraine. 2010. P.308-309.

6. Shelkovnikova T.A., Khritankova I.V., Buchman V.L., Bachurin S.O. and Ninkina N.N. Effects of ALS-associated mutations on the in vivo aggregation and toxicity of human FUS/TLS protein// Book of Abstracts of The EMBO Meeting 2010 September, 4-7, Barcelona, Spain. 2010. P.171.

7. Peters O., Millership S., Shelkovnikova Т., Hann A., Van Der Putten H. Buchman V.L., Ninkina N.N. Gamma-synuclein transgenic mice recapitulate pathological

features of amyotrophic lateral sclerosis// Book of Abstracts of Neuroscience 2010, SfN's 40th annual meeting, November 13-17, San Diego, USA. 2010. P.109. S8 462.1.

8. Шелковникова T.A., Нинкина H.H., Бухман B.JI., Бачурин С.О. БАС-ассоциированные мутации влияют на клеточную локализацию и способность к агрегации белка FUS/TLS// Сборник материалов I Международной конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 17-19 ноября, Москва, Россия. 2010. С.60.

9. Шелковникова Т.А., Нинкина Н.Н., Бухман B.JL, Бачурин С.О. Клеточная локализация и способность к агрегации мутантных форм белка FUS// Сборник материалов XXIII Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 7-10 февраля, Москва, Россия. 2011. С. 13.

10. Ninkina N., Ustyugov A., Shelkovnikova Т., Khritankova I., Bachurin S. Hindering of proteinopathy-induced neurodegeneration as a new mechanism of action for dimebon. Book of Abstracts of 10th International Conference on Alzheimer's & Parkinson's Diseases, March 9-13, Barcelona, Spain. 2011. P. 59.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DAPI 4'-6-diamidino-2-phenylindole

GFAP glial fibrillary acidic protein

GFP green fluorescent protein

БАС боковой амиотрофический склероз

БДН болезни двигательного нейрона

БП болезнь Паркинсона

ГАФДГ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

кДа килодальтон

ПЦР полимеразная цепная реакция

ТГ тирозингидроксилаза

ФТД фронтотемпоральная дегенерация

Подписано в печать 11.04.2011 г.

Печать трафаретная Усл.п.л. -1,5 Заказ № 5303 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шелковникова, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Нейродегенеративные заболевания - протеинопатии.

1.1.1 Общие механизмы образования патологических включений при протеинопатиях.

1.1.2 Белки, способные формировать гистопатологические включения.

1.1.2.1 Белки, образующие амилоидные включения.

1.1.2.2 Белки, образующие агрегаты неамилоидного типа.

1.2 Синуклеинопатии.

1.2.1 Клеточные функции синуклеинов.

1.2.2 Заболевания человека с нарушением метаболизма синуклеинов.

1.2.3 Механизмы нейродегенерации при синуклеинопатиях.

1.3 FUS и TDP-43 протеинопатии.

1.3.1 Нормальные клеточные функции TDP-43 и FUS.

1.3.2 Участие TDP-43 и FUS в формировании гистопатологическихструктур

1.3.3 Механизмы нейродегенерации при TDP-43 и FUS протеинопатиях.

1.4 Моделирование протеинопатий.

1.4.1 Клеточные модели FUS- и TDP-43 протеинопатий.

1.4.2 Трансгенные мышиные модели.

1.4.2.1 Мышиные модели альфа-синуклеинопатии.

1.4.2.2 Мышиная модель гамма-синуклеинопатии.

1.4.2.3 Моделирование TDP-43 протеинопатии у грызунов.

1.5. Нейропротекторные свойства препарата Димебон.

1.5.1 Строение и нейропротекторные свойства препарата Димебон.

1.5.2 Изучение нейропротекторных свойств Димебона в генетических моделях протеинопатий.

1.5.3 Данные клинических исследованиий.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Методы, использованные в работе с животными.

2.1.1 Трансгенные линии и введение препарата Димебон.

2.1.2 Поведенческие методы анализа.

2.1.3 Генотипирование и анализ экспрессии трансгенов.

2.1.4 Гистохимический анализ.

2.2 Генетические конструкции.

2.3 Культуральные методы.

2.3.1 Клеточные культы итрансфекция.

2.3.2 Иммунофлуоресцентная детекция и конфокальная микроскопия.

2.4 Биохимические методы анализа.

2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.4.2 Последовательная экстракция белков.

2.4.3 Денатурирующий гель-электрофорез по Леммли.

2.4.4 Иммуноблоттинг.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Характеристика трансгенной мышиной модели гамма-синуклеинопатии (линия ThylmySN): сенсорная и моторная функции.

3.1.1 Селективная возраст-зависимая двигательная дисфункция.

3.1.2 Чувствительность отдельных групп нейронов к сверхэкспрессии гамма-синуклеина.

3.1.3 Избирательная дегенерация двигательных нервных волокон.

3.2 Моделирование FUS и TDP-43 протеинопатий in vitro и свойства модифицированных форм этих белков.

3.2.1 Клеточная локализация и способность к агрегации мутантных форм белка FUS.

3.2.2 Свойства С-концевого фрагмента TDP-43 и N-концевого фрагмента FUS.

3.2.3 Способность N-концевого фрагмента FUS включать эндогенный FUS в состав агрегатов.

3.3 Влияние препарата Димебон на содержание нерастворимых форм амилоидогенного белка и на состояние убиквитин-протеасомной системы в трансгенной модели гамма-синуклеинопатии.

3.4 Исследование эффекта Димебона на патологические изменения, вызванные сверхэкспрессией укороченной формы альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах мышей линии aSyn (1-120).

3.4.1 Эффект хронического введения Димебона на поведенческие характеристики трансгенных мышей линии. aSyn (1-120).

3.4.2 Изучение действия Димебона на число дофаминергических нейронов и содержание моноаминов в полосатом теле мышей линии аБуп (1-120).

3.4.3 Изучение влияния Димебона на экспрессию укороченного альфа-синуклеина, содержание и локализацию его белкового продукта в дофаминергических нейронах обонятельной луковицы мышей линии аБуп (1-120).

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний"

Общемировая тенденция к увеличению средней продолжительности жизни и, как следствие, повышение частоты заболеваний нервной системы, сопровождающихся прогрессирующими дегенеративными процессами (Hebert et al., 2001; Samii, Nutt, Ransom, 2004), обусловили возрастание интереса ученых и клиницистов к изучению этих расстройств. Особое внимание уделяется выявлению молекулярных и клеточных механизмов развития нейрональной патологии, так как их понимание необходимо для разработки ранней диагностики и новых эффективных методов терапии неизлечимых в настоящее время заболеваний.

Нейродегенеративные болезни - крайне неоднородная группа, к которой относятся как социально значимые расстройства, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, так и целый ряд более редких заболеваний, например, болезни двигательного нейрона и хорея Гентингтона. Однако, несмотря на гетерогенность этой группы, недавно в патогенезе многих из этих заболеваний был выделен общий механизм, в основе которого лежит патологическая агрегация конформационно измененных белков, сопровождаемая образованием характерных гистопатологических структур — сенильных бляшек, телец Леви, нейрофибриллярных клубков и т.п. Несмотря на то, что каждое заболевание характеризуется нарушением метаболизма и агрегацией определенного белка или набора белков, а распределение белковых включений как внутри клетки, так и по отделам нервной системы значительно варьирует, сходный молекулярный механизм патогенеза позволил объединить подобные заболевания в группу протеинопатий (Cummings, 2003). Под протеинопатиями {англ. proteinopathy) понимаются формы нейродегенеративных заболеваний, в основе патогенеза которых б лежит изменение структуры, нарушение метаболизма и агрегация ряда белков, сопровождаемая формированием характерных гистопатологических белковых включений в разных отделах нервной системы.

Как уже сформированные гистопатологические структуры, так и отдельные этапы агрегации таких белков являются потенциальными мишенями для разработки новых терапевтических подходов и создания болезнь-модифицирующих препаратов. В связи с этим очевидна необходимость более подробного изучения общего звена патогенеза протеинопатий. Важным инструментом для исследования молекулярных изменений, ведущих к развитию протеинопатий, является их моделирование как в бесклеточных in vitro системах, так и in vivo — с использованием клеточных линий и генетически модифицированных лабораторных животных. В настоящее время ведется активная работа по созданию и характеристике таких моделей. Модельные in vivo системы позволяют, во-первых, изучать физиологические функции и нарушения метаболизма склонных к агрегации белков, лежащие в основе патогенеза протеинопатий, а во-вторых, могут быть использованы для первичного отбора потенциально эффективных в отношении протеинопатии терапевтических средств.

В результате интенсивных молекулярно-генетических, гистопатологических и биохимических исследований в последнее время был обнаружен ряд новых белков, вовлеченных в патогенез протеинопатий, что, в свою очередь, потребовало создания новых модельных систем, а также дальнейшей характеристики уже имеющихся in vivo моделей, для того чтобы более полно использовать их потенциал. С учетом вышесказанного были сформулированы цель и задачи настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание и характеристика клеточных и трансгенных моделей патологической агрегации белков, участвующих в развитии и прогрессии нейродегенеративных процессов, а также использование этих моделей для исследования нейропротекторных свойств лекарственного препарата Димебон. В задачи работы входили:

1. Сравнительная морфологическая и функциональная характеристика моторных и сенсорных систем трансгенных мышей с прогрессирующей гамма-синуклеинопатией и подтверждение возможности использования этой линии в качестве модели нейродегенеративных заболеваний со специфическим повреждением двигательных нейронов.

2. Исследование влияния препарата Димебон на молекулярно-клеточные процессы, сопровождающие развитие гамма-синуклеинопатии у трансгенных мышей.

3. Исследование влияния препарата Димебон на развитие альфа-синуклеинопатии в раннее охарактеризованной линии трансгенных мышей с ограниченной дофаминергическими нейронами экспрессией мутантной формы альфа-синуклеина человека, моделирующей ранние стадии болезни Паркинсона.

4. Разработка методов моделирования протеинопатий, вызываемых мутациями в генах, кодирующих белки FUS и TDP-43 человека, и изучение патогенетических свойств указанных белков.

Научная новизна работы.

В ходе выполнения работы впервые: • проведена сравнительная характеристика состояния сенсорной и моторной функций у трансгенных мышей линии ThylmySN с повышенной продукцией склонного к агрегации белка гамма-синуклеина, характеризующихся прогрессирующей нейродегенеративной патологией, и получены данные о воспроизведении симптоматических признаков болезней двигательного нейрона у мышей данной линии;

• получены модели FUS и TDP-43 протеинопатий в культуре клеток человека, с помощью которых исследованы особенности внутриклеточной локализации и агрегационные свойства мутантных форм FUS и TDP-43, а также обнаружена корреляция этих свойств с клиническими характеристиками пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, являющихся носителями этих мутаций.

Практическая значимость. Характеристика мышиной модели гамма-синуклеинопатии, выполненная в рамках данной работы, подтвердила возможность использования этой трансгенной линии в качестве модели болезеней двигательного нейрона для разработки новых подходов к терапии этих тяжелых заболеваний. Идентификация молекулярных мишеней препарата Димебон с использованием мышиной модели гамма-синуклеинопатии, а также данные по ограниченному эффекту этого препарата в модели болезни Паркинсона могут использоваться для разработки рекомендаций по его клиническому применению. Полученные клеточные линии, экспрессирующие мутантные формы белков FUS и TDP-43, могут быть использованы как для дальнейшего изучения метаболизма этих белков и оценки их роли в развитии внутриклеточной патологии, так и для отбора препаратов, способных направленно действовать на метаболизм этих белков — потенциальных агентов для терапии FUS и TDP-43 протеинопатий. В целом, полученные в работе данные могут найти практическое применение в доклинических исследованиях, фармацевтической химии и биоскрининге.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на на 11-ом Международном симпозиуме по достижениям в области терапии болезни Альцгеймера (Женева, Швейцария, 2010), на Ежегодном съезде Европейского общества молекулярных биологов (Барселона, Испания, 2010), на 6-ом Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010), на 40-ой конференции Общества нейронаук США (Сан-Диего, США, 2010), на 23-ей Международной молодежной зимней школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2011), а также на 10-ой Международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона (Барселона, Испания, 2011).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, содержит 24 рисунка и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 150 источников.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шелковникова, Татьяна Александровна

выводы

1. У трансгенных мышей с повышенным уровнем пан-нейрональной экспрессии амилоидогенного белка гамма-синуклеина (линия ThylmySN) выявлена прогрессирующая с возрастом двигательная дисфункция при сохраненной тактильной чувствительности.

3. Хроническое применение препарата Димебон приводит к снижению количества нерастворимых форм гамма-синуклеина в тканях спинного мозга трансгенных мышей линии ThylmySN, изменяя при этом соотношение убиквитинированных форм гамма-синуклеина во фракциях' растворимых и нерастворимых белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шелковникова, Татьяна Александровна, Москва

1. Abercrombie М. Estimation of the nuclear population from microtomsections// Anat. Ree. 94, 1946. P. 239-247.

2. Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins// Cell. 2009. №137. P.146-158.

3. Alonso Adel С., Mederlyova A., Novak M., Grundke-Iqbal I., Iqbal K. Promotion of hyperphosphorylation by frontotemporal dementia tau mutations// J Biol Chem. V.279(33). P.34873-34781.

4. Alzheimer A. Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde//Allg Z Psychiat. 1907. №64. P.146-148.

5. Arai Т., Hasegawa M., Akiyama H., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis// Biochem Biophys Res Commun. 2006. V. 351. P. 602-11.

6. Ayala Y.M., Zago P., D'Ambrogio A. et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43// J Cell Sei. 2008. V.121(Pt 22). P.3778-85.

7. Bachurin S., Bukatina E., Lermontova N. Antihistamine agent Dimebon as a novel neuroprotector and a cognition enhancer// Ann NY Acad Sei. 2001. Y.939. P. 425-435.

8. Bachurin S.O., Shevtsova E.P., Kireeva E.G., Oxenkrug G.F., Sablin S.O. Mitochondria as a target for neurotoxins and neuroprotective agents// Ann NY Acad Sei. 2003. V. 993. P.334-344.

9. Bauer P.O., Nukina N. The pathogenic mechanisms of polyglutamine diseases and current therapeutic strategies// JNeurochem. 2009. V.110. P. 17371765.

10. Blair I.P., Williams K.L., Warraich S.T., et al. FUS mutations in amyotrophic lateral sclerosis: clinical, pathological, neurophysiological and genetic analysis// J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2009. V.81. P. 639-641.

11. Bonifati V. Genetics of Parkinson's disease// Minerva Med. 2005. V.96(3). P.175-186.

12. Bosco D.A., Lemay N., Ko H.K. et al. Mutant FUS proteins that cause amyotrophic lateral sclerosis incorporate into stress granules// Hum Mol Genet. 2010. V. 19(21). P.4160-4175.

13. Brain W.R. Diseases of the nervous system, 6th ed. 1962 Oxford University Press, Oxford, p. 531.

14. Bruijn L.I., Houseweart M.K., Kato S., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1// Science. 1998. V.281. P.1851-1854.

15. Brundin P., Melki R., Kopito R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases// Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2010. V.ll(4). P.301-307.

16. Buchman Y.L., Adu J., Pinon L.G., Ninkina N.N., Davies A.M. Persyn, a member of the synuclein family, influences neurofilament network integrity// Nat. Neurosci. 1998. V. 1. P. 101 -103.

17. Cairns N.J., Neumann M., Bigio E.H., et al. TDP-43 in familial and sporadic frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin inclusions// Am. J. Pathol. 2007. V.171. P. 227-240.

18. Caroscio J.T., Calhoun W.F., Yahr M.D. (1994). Prognostic factors in motor neuron disease a prospective study of longevity. In: Rose F.C. (ed). Research progress in motor neuron disease. Pitman, London, pp. 34-43.

19. Caughey B., Lansbury P.T. Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders//Annu. Rev.Neurosci. 2003. V.26. P.267-298

20. Chai Y., Koppenhafer S.L. Bonini N.M., Paulson H.L. Analysis of the role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine disease//J Neurosci. 1999. V.19(23). P.10338-10347.

21. Chen L., Thiruchelvam M.J., Madura K., Richfield E.K. Proteasome dysfunction in aged human alpha-synuclein transgenic mice// Neurobiol. Dis. 2006. V.23.P.120-126.

22. Clayton D.F., George J.M. The synucleins: a family of proteins involved in synaptic function, plasticity, neurodegeneration and disease// Trends Neurosci. 1998. V.21. P.249-254.

23. Cookson M.R., van der Brag M. Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synuclein//Exp Neurol. 2008. №209. P. 5-11.

24. Cummings, J. L. Toward a molecular neuropsychiatry of neurodegenerative diseases// Ann Neurol. 2003. V.54(2). P. 147-154.

25. Cushman M., Johnson B.S., King O.D., Gitler A.D., Shorter J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity// Journal of Cell Science. 2010. №123. P.l 191-1201.

26. Deng H.X., Siddique T. Transgenic mouse models and human neurodegenerative disorders// Arch Neurol. 2000. V.57(12). P.1695-1702.

27. Desplats P., Lee H. J., Bae et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2009. №106. P.13010-13015.

28. Doi H., Okamura K., Bauer P.O., et al. RNA-binding protein TLS is a major nuclear aggregate-interacting protein in huntingtin exon 1 with expanded polyglutamine-expressing cells// J Biol Chem. 2008. V.283(10). P.6489-6500.

29. Dormann D., Rodde R., Edbauer D., et al. ALS-associated fused in sarcoma (FUS) mutations disrupt Transportin-mediated nuclear import// EMBO J. 2010. V.29(16). P.2841-2857.

30. Duan W., Li X., Shi J., Guo Y., Li Z., Li C. Mutant TAR DNA-binding protein-43 induces oxidative injury in motor neuron-like cell// Neuroscience. 2010. V. 169(4). P.1621-1629.

31. Farrer M., Kachergus J., Forno L., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and alpha-synuclein genomic multiplications// Ann. Neurol. 2004. V.55, P.174-179.

32. Fischer O. Miliare Nekrosen mit drusigen Wucherungen der Neurofibrillen, eine regelmassige Veränderung der Hirnrinde bei seniler Demenz// Monatsschr Psychiat Neurol. 1907. №22. P.361-372.

33. Fleming S.M., Salcedo J., Hutson C.B., Rockenstein E., Masliah E., Levine M.S., Chesselet M.F. Behavioral effects of dopaminergic agonists in transgenic mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein// Neuroscience. 2007. V.142, P.1245-1253.

34. Fuentealba R.A., Udan M., Bell S., et al. Interaction with polyglutamine aggregates reveals a Q/N-rich domain in TDP-43// J Biol Chem. 2010 V.285(34). P.26304-26314.

35. Gasser T. Update on the genetics of Parkinson's disease// Mov. Disord. 2007. V.22 Suppl. 17, P.S343-350.

36. Giasson B.I., Duda J.E., Quinn S.M., Zhang B., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclei//Neuron. 2002. V.34, P.521-533.

37. Goedert M., Spillantini M. G. Lewy body diseases and multiple system atrophy as alpha-synucleinopathies// Mol. Psychiatry. 1998. V.3, P.462-465.

38. Gomez-Isla T., Irizarry M.C., Mariash A., et al. Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in human alpha-synuclein A3 OP transgenic mice//Neurobiol. Aging. V.24, P.245-258.

39. Greten-Harrison B., Polydoro M., Morimoto-Tomita M., et al. a(3y-synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction// Proc Natl Acad Sci USA. 2010. V. 107(45). P.19573-19578.

40. Grigorev V.V., Dranyi O.A., Bachurin S.O. Comparative study of action mechanisms of dimebon and memantine on AMP A- and NMDA-subtypes glutamate receptors in rat cerebral neurons// Bull Exp Biol Med. 2003 V.136. P.474-477.

41. Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Tung Y.C., Quinlan M., Wisniewski H.M., Binder L.I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology// Proc Natl Acad Sci USA. 1986 V.83(13). P.4913-4917.

42. Guo Y.S., Wu D.X., Wu H.R., et al. Sensory involvement in the SOD1-G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis// Experimental and Molecular Medicine. 2009. V.41(3). P.140-150.

43. He C., Klionsky D.J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy// Annu. Rev. Genet. 2009. V.43, P.67-93.

44. Hebert L.E., Beckett L.A., Scherr P.A., Evans D.A. Annual incidence of Alzheimer disease in the United States projected to the years 2000 through 2050// Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 2001. V. 15. P. 169-173.

45. Hicks G.G., Singh N., Nashabi A. et al. FUS deficiency in mice results in defective B-lymphocyte development and activation, high levels of chromosomal instability and perinatal death// Nat. Genet. 2000. V.24(2). P. 175179.

46. Hutton M., Lendon C.L., Rizzu P., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17// Nature. 1998. V.393(6686). P.702-705.

47. Iko Y., Kodama T.S., Kasai N., et al. Domain architectures and characterization of an RNA-binding protein, TLS// J Biol Chem. 2004. №279. P.44834-44840.

48. Ito D., Seki M., Tsunoda Y., Uchiyama H., Suzuki N. Nuclear transport impairment of amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations in FUS/TLS // Annals of Neurology. 2010. DOI: 10.1002/ana.22246

49. Ji H., Liu Y.E., Jia T., et al. Identification of a breast cancer-specific gene, BCSG1, by direct differential cDNA sequencing// Cancer Res. 1997. V.57. P.759-764.

50. Kabashi E, Valdmanis PN, Dion P, Rouleau GA. Oxidized/misfolded superoxide dismutase-1: the cause of all amyotrophic lateral sclerosis?// Ann Neurol. 2007. V.62(6). P.553-559.

51. Kabashi E., Lin L., Tradewell M.L., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo// Hum Mol Genet. 2010. V.19(4). P.671-683.

52. Kabashi E., Valdmanis P.N., Dion P., et al. TARDBP mutations in individuals with sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis// Nat Genet. 2008. V.40. P.572-574.

53. Kagan B.L., Thundimadathil J. Amyloid peptide pores and the beta sheet conformation// Adv Exp Med Biol. 2010. V.677. P. 150-167.

54. Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes// EMBO Rep. 2002. V.3. P.583-588.

55. Kahle P J., Neumann M., Ozmen L., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model//Am. J. Pathol. 2001. V. 159. P.2215-2225.

56. Kayed R, Head E, Thompson JL, Mclntire TM, Milton SC, Cotman CW, Glabe CG. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science. 2003 Apr 18;300(5618):486-9

57. Kieburtz K. et al. A randomized, placebo-controlled trial of latrepirdine in Huntington disease // Arch Neurol. 2010. V.67(2). P. 154-160.

58. Klein R. L., Wang D. B., King M. A. Versatile somatic gene transfer for modeling neurodegenerative diseases//Neurotox Res. 2009. V.16(3). P.329-342.

59. Knaevelsrud H., Simonsen A. Fighting disease by selective autophagy of aggregate-prone proteins// FEBS Lett. 2010. V.584(12). P.2635-45.

60. Kraemer B.C., Schuck T., Wheeler J.M., et al., Loss of murine TDP-43 disrupts motor function and plays an essential role in embryogenesis// Acta Neuropathol. 2010. 119(4):409-19.

61. Kruger R., Kuhn W., Muller T., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease// Nat. Genet. 1998. V.18, P.106-108.

62. Kruger R., T. Muller and O. Riess. Involvement of alpha-synuclein in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders// J. Neural. Transm. 2000. №107. P. 31-40.

63. Kurz A., Perneczky R. Neurobiology of cognitive disorders// Curr. Opin. Psychiatry. 2009. V.22(6). P.546-551.

64. Kwong L.K., Uryu K., Trojanowski J.Q., Lee V.M. TDP-43 proteinopathies: neurodegenerative protein misfolding diseases without amyloidosis//Neurosignals. 2008. V.16(l). P.41-51.

65. Kwiatkowski T.J., Bosco D.A., Leclerc A.L. et al. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis // Science. 2009. №323. P. 1205-1208.

66. Lashuel H.A., Lansbury Jr. P.T. Are amyloid diseases caused by protein aggregates that mimic bacterial pore-forming toxins?// Q Rev Biophys. 2006. №39. P. 167-201.

67. Lehman N.L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology// Acta Neuropathol. 2009. V.l 18(3). P.329-347.

68. Lermontova N.N., Redkozubov A.E., Shevtsova E.F., Serkova T.P., Kireeva E.G., Bachurin S.O. Dimebon and tacrine inhibit neurotoxic action ofbeta-amyloid in culture and block L-type Ca(2+) channels// Bull Exp Biol Med. 2001. №132. P.107910-107983.

69. Li W.Q., Bezprozvanny I. Evaluation of Dimebon in cellular model of Huntington's disease// Mol Neurodegener. 2008. №3. P.15.

70. Liu W., Wu Y., Zhou Y. et al. Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers// Cancer Res. 2005. №65. P. 7635-7643.

71. Luk K. C., Song C., O'Brien, et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. №106. P.20051-20056.

72. Mackenzie I.R., Rademakers R., Neumann M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia// Lancet Neurol. 2010. V.9(10). P.995-1007.

73. Maroteaux L., Campanelli J.T., Scheller R.H. Synuclein: a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal// J: Neurosci. 1988. №8. P.2804-2815.

74. Matsuoka Y., Vila M., Lincoln S., et al. Lack of nigral pathology in transgenic mice expressing human alpha-synuclein driven by the tyrosine hydroxylase promoter// Neurobiol. Dis. 2001. №8, P.535-539.

75. Mattson, M.P. Pathways towards and away from Alzheimer's disease// Nature. 2004. №430. P.631-639.

76. Matveeva I.A. Action of dimebon on histamine receptors// Farmakol Toksikol. 1983. №46. P.27-29.

77. Mayeux R. Epidemiology of neurodegeneration// Annual review of Neuroscience. 2003. №26. P.81-104.

78. McKhann G.M., Albert M.S., Grossman M., Miller B., Dickson D., Trojanowski J.Q. Clinical and pathological diagnosis of frontotemporaldementia: report of the Work Group on Frontotemporal Dementia and Pick's Disease//Arch Neurol. 2001. №58. P.1803-1809.

79. McNaught K.S., Shashidharan P., Perl D.P., Jenner P., Olanow C.W. Aggresome-related biogenesis of Lewy bodies// Eur J Neurosci. 2002. V.16(ll). P.2136-2148.

80. Miller G. Pharmacology. The puzzling rise and fall of a dark-horse Alzheimer's drug// Science. 2010. V.327, №5971. P. 1309.

81. Mitchell J.D., Borasio G.D. Amyotrophic lateral sclerosis// Lancet. 2007. №369. P.2031-2041.

82. Mizushima N., Levine B., Cuervo A.M., Klionsky D.J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion//Nature. 2008. №451. P.1069-1075.

83. Neumann M., Rademakers R., Roeber S., Baker M., Kretzschmar HA., Mackenzie I.R. A new subtype of frontotemporal lobar degeneration with FUS pathology//Brain. 2009. №132. P.2922-2931.

84. Neumann M., Sampathu D.M., Kwong L.K. et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis// Science.2006. №314. P.130-133.

85. Nguyen J.V., Soto I., Kim K.Y. et al. Myelination transition zone astrocytes are constitutively phagocytic and have synuclein dependent reactivity in glaucomaII Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. V. 108(3). P. 1176-1181.

86. Nonaka T., Kametani F., Arai T., Akiyama H., Hasegawa M. Truncation and pathogenic mutations facilitate the formation of intracellular aggregates of TDP-43// Hum. Mol. Genet. 2009. V.18(18). P.3353-3364. '

87. Orr H.T., Zoghbi H.Y. Trinucleotide repeat disorders// Ann Rev Neurosci.2007. №30. P.575-621.

88. Pamphlett R, Luquin N., McLean C., Jew SK., Adams L. TDP-43 neuropathology is similar in sporadic amyotrophic lateral sclerosis with orwithout TDP-43 mutations// Neuropathol Appl Neurobiol. 2009. №35. P. 222225.

89. Papp M.I., Lantos P.L. The distribution of oligodendroglial inclusions in multiple system atrophy and its relevance to clinical symptomatology// Brain. 1994. №117(Pt 2) P.235-243.

90. Paxinos G., Franklin K.B.J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2001. Academic Press, 2nd edition.

91. Pesiridis, G. S., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Mutations in TDP-43 link glycine-rich domain functions to amyotrophic lateral sclerosis// Hum. Mol. Genet. 2009. №18. V. R156-R162.

92. Pieper A.A., Xie S., Capota E., et al. Discovery of a proneurogenic, neuroprotective chemical// Cell. 2010. №142. P.39-51.

93. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identifie in families with Parkinson's disease// Science. 1997. №276. P. 2045-2047.

94. Rademakers R., Stewart H., DeJesus-Hernandez M. et al., FUS gene mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis// Muscle Nerve. 2010. №42. P.170-176.

95. Rathke-Hartlieb S., Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L., Haid S., Okochi M., Haass C., Schulz J.B. Sensitivity to MPTP is not increased in Parkinson's disease-associated mutant alpha-synuclein transgenic mice// J. Neurochem. 2001. №77. P.l 181-1184.

96. Rosen D.R., Siddique T., Patterson D. et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis //Nature. 1993. №362. P. 59-62.

97. Saha A.R., Ninkina N.N., Hanger D.P., Anderton B.H., Davies A.M., Buchman V.L. Induction of neuronal death by alpha-synuclein// Eur. J. Neurosci. 2000. №12. P.3073-3077.

98. Samii A., Nutt J.G., Ransom B.R. Parkinson's disease// Lancet. 2004. №363. P.1783-1793.

99. Shefner J.M., Tyler H.R., Krarup C. Abnormalities in the sensory action potential in patients with amyotrophic lateral sclerosis// Muscle Nerve. 1991. №14. P.1242-1246.

100. Shiina Y., Arima K., Tabunoki H., Satoh J. TDP-43 dimerizes in human cells in culture// Cell Mol Neurobiol. 2010. V.30(4). P.641-652.

101. Singleton A.B., Farrer M., Johnson J., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease// Science. 2003. №302. P.841.

102. Sipe J. D., Cohen A.S. Review: History of the amyloid fibril// J. Struct. Biol. 2002. №130. P.88-98.

103. Skovronsky D.M., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Neurodegenerative diseases: new concepts of pathogenesis and their therapeutic implications// Annu Rev Pathol. 2006. №1 P. 151-170.

104. Spillantini M.G., Crowther R.A., Jakes R., Cairns N.J., Lantos P.L., Goedert M. Filamentous alpha-synuclein inclusions link multiple system atrophy with Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies// Neurosci. Lett. 1998. V.251(3). P.205-208.

105. Spillantini M.G., Schmidt M.L., Lee V.M., Trojanowski J.Q., Jakes R., Goedert M. Alpha-synuclein in Lewy bodies// Nature. 1996. №388. P.839-840.

106. Sreedharan J, Blair IP, Tripathi VB, et al. TDP-43 mutations in amilial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis// Science. 2008. №19. P. 1668-1672.

107. Stallings N.R., Puttaparthi K., Luther C.M., Burns D.K., Elliott J.L. Progressive motor weakness in transgenic mice expressing human TDP-43// Neurobiol Dis. 2010. V.40(2) P.404-14.

108. Steele J.W., Kim S.H., Cirrito J.R. et al. Acute dosing of latrepirdine (Dimebon), a possible Alzheimer therapeutic, elevates extracellular amyloid-beta levels in vitro and in vivo // Mol. Neurodegener. 2009. V.4. P. 51.

109. Surguchov A., McMahan B., Masliah E., Surgucheva I. Synucleins in ocular tissues. Mapping of the distributions of a-, P-, and y-synuclein proteins in retina and optic nerve.// J. Neurosci. Res. 2001. №65. P.68-77.

110. Tan E.K., Skipper L.M. Pathogenic mutations in Parkinson disease// Hum. Mutat. 2007. №28, P.641-653.

111. Tudor E.L., Galtrey C.M., Perkinton M.S., et al. Amyotrophic lateral sclerosis mutant vesicle-associated membrane protein-associated protein-B transgenic mice develop TAR-DNA-binding protein-43 pathology// Neuroscience. 2010. V. 167(3). P.774-785.

112. Ueda K., Fukushima H., Masliah E., et al. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease// Proc Natl Acad Sci USA. 1993. №90. P.l 1282-11286.

113. Unger E.L., Eve D.J., Perez X.A., et al. Locomotor hyperactivity and alterations in dopamine neurotransmission are associated with overexpression of

114. A53T mutant human alpha-synuclein in mice// Neurobiol. Dis. 2006. №21. P. 431-443.

115. Urushitani M., Sato T., Bamba H., Hisa Y., Tooyama I. Synergistic effect between proteasome and autophagosome in the clearance of polyubiquitinated TDP-43// J. Neurosci. Res. 2010. V.88(4). P.784-797.

116. Urwin H., Josephs K.A., Rohrer J.D., et al. FUS pathology defines the majority of tau- and TDP-43-negative frontotemporal lobar degeneration// Acta Neuropathol. 2010. №120. P. 33-41.

117. Uversky V.N. Mysterious oligomerization of the amyloidogenic proteins// FEBS J. 2010. V.277(14). P.2940-2953.

118. Uversky V.N. Neuropathology, biochemistry, and biophysics of alpha-synuclein aggregation// J. Neurochem. 2007. №103. P.17-37.

119. Vance C., Rogelj B., Hortobagyi et al. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6// Science. 2009. №323. P. 1208-1211.

120. Verhoef L.G., Lindsten K., Masucci M.G., Dantuma N.P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins// Hum. Mol. Genet. 2002. №11. P.2689-2700.

121. Wacker J.L., Huang S.Y., Steele A.D., et al. Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar aggregates in a mouse model of Huntington's disease// J Neurosci. 2009. V.29(28). P.9104-9114

122. Wakamatsu M., Ishii A., Iwata S., et al. Selective loss of nigral dopamine neurons induced by overexpression of truncated human alpha-synuclein in mice//Neurobiol. Aging. 2008. №29. P.574-585.

123. Wang X., Fan H., Ying Z., Li B., Wang H., Wang G. Degradation of TDP-43 and its pathogenic form by autophagy and the ubiquitin-proteasome system//Neurosci Lett. 2010. V.469(l). P. 112-116.

124. Wang, H.Y., Wang, I.F., Bose, J., Shen, C.K. Structural diversity and functional implications of the eukaryotic TDP gene family// Genomics. 2004. №83. P.130-139.

125. Weingarten M.D., Lockwood A.H., Hwo S.Y., Kirschner M.W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 1975. V.72(5). P.1858-1862.

126. Westermark P., Benson M.D., Buxbaum J.N., et al. Amyloid fibril protein nomenclature// Amyloid. 2002. №9. P. 197-200.Westermark, G. T„

127. Westermark, P. Serum amyloid A and protein AA: molecular mechanisms of a transmissible amyloidosis// FEBS Lett. 2009. №583. P.2685-2690.

128. Woodruff-Pak D.S. Animal models of Alzheimer's disease: therapeutic implications//J. Alzheimers Dis. 2008. V.15(4). P.507-521.

129. Wu L.S., Cheng W.C., Hou S.C., Yan Y.T., Jiang S.T., Shen C.K. TDP-43, a neuro-pathosignature factor, is essential for early mouse embryogenesis// Genesis. 2010. V.48(l). P.56-62.

130. Xu Y.F., Gendron T.F., Zhang Y.J., et al. Wild-type human TDP-43 expression causes TDP-43 phosphorylation, mitochondrial aggregation, motor deficits, and early mortality in transgenic mice// J. Neurosci. 2010. V.30(32). P.10851-10859.

131. Yamashita M., Nonaka T., Arai T., Kametani F. et al. Methylene blue and dimebon inhibit aggregation of TDP-43 in cellular models // FEBS Lett. 2009. №583. P. 2419-2424.

132. Yankner В. A. Mechanisms of neuronal degeneration in Alzheimer's disease//Neuron. 1996. №16. P.921-932.

133. Yazawa I., Giasson B.I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration//Neuron. 2005. №45. P.847-859.

134. Zarranz J.J., Alegre J., Gomez-Esteban J.C., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia// Ann. Neurol. 2004. №55. P.164-173.

135. Zhang H., Kouadio A., Cartledge D., Godwin A.K. Role of gamma-synuclein in microtubule regulation// Exp. Cell. Res. 2010. Oct 23.

136. Zhou H., Huang H., Chen D. et al. Transgenic rat model of neurodegeneration caused by mutation in the TDP gene// PLoS Genet 6. 2010. P. el000887.

137. Zhou W., Schutzman J., Freed C.R. Transgenic mice overexpressing tyrosine-to-cysteine mutant human alpha-synuclein: A progressive neurodegenerative model of diffuse Lewy body disease// J. Biol. Chem. 2008. №283. P.9863-9870.

138. Zhou Y., Inaba S., Liu J. Inhibition of synuclein-gamma expression increases the sensitivity of breast cancer cells to paclitaxel treatment// Int. J. Oncol. 2006. №29. P. 289-295.

Информация о работе

Шелковникова, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы