Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная локализация и функция белка везикулярного трафика Hrs в сперматогенезе и развитии крыла Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточная локализация и функция белка везикулярного трафика Hrs в сперматогенезе и развитии крыла Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

Мариловцева Екатерина Викторовна

Клеточная локализация и функция белка везикулярного трафика Нгв в сперматогенезе и развитии крыла Ого$ор1гИа те1апо§а$1ег

N

03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 НОЯ 2

005504266

Новосибирск - 2015

005564266

Работа выполнена в лаборатории генетики клеточного цикла Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Омельянчук Леонид Владимирович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Высоцкая Людмила Васильевна

доктор биологических наук, профессор кафедры цитологии и генетики ФЕН Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, г. Новосибирск Огиенко Анна Александровна

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории механизмов клеточной дифференцировки, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «Р2» декабря 2015 г. в 10-00 на заседании диссертационного совета Д 003.074.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите на соискание ученой степени доктора наук в ИМКБ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, д. 8/2, тел. 373-02-49, факс (383) 363-90-78. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН www.mcb.nsc.ru

Автореферат разослан «23п ОК-ТИоРД 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Е.Б. Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из важнейших процессов, необходимых для подержания нормальной жизнедеятельности клетки и организма в целом, является везикулярный трафик. Разнообразие функций системы везикулярного трафика, включающей эндо- и экзоцитоз, процессы внутриклеточного обмена белковыми молекулами органелл и так далее, делает ее участницей многочисленных клеточных процессов, таких как поддержание активности сигнальных путей (reviewed in Seto et al., 2002), акросомогенез (reviewed in Berruti, Paiardi, 2011), цитокинез (Carlton, Martin-Serrano, 2007; Morita et al., 2007) и многие другие.

Известно, что везикулярный трафик наиболее активен в клетках нервной системы, а также в сперматогенезе. Наличие же в сперматоцитах и сперматидах крупных органелл (облегчающих изучение внутриклеточной локализации белков) делает сперматогенез удобной моделью исследования данного биологического процесса.

Одним из ключевых участников везикулярного трафика является Hrs (Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate), консервативный белок эукариот, член Vps (vacuolar protein sorting) семейства вакуолярных сортировочных белков, основной функцией которого является направление белковых молекул, поглощенных в ходе эндоцитоза и меченных единичной молекулой убиквитина, на деградацию в лизосомах, что определяет его способность оказывать влияние на активность некоторых сигнальных путей. Благодаря своему мультидоменному строению молекула Hrs способна связываться со множеством разнообразных белков.

Мутации Hrs (в частности, нонсенс-мутация HrsD2S у дрозофилы) в гомозиготе приводит к тяжелым нарушениям гаструляции и вентрального фолдинга и гибели эмбрионов на ранней стадии (Komada, Soriano, 1999). Более детальное изучение Hrs показало, что он способен принимать участие в регуляции некоторых сигнальных путей, к числу которых относятся EGFR, Wg (Seto, Bellen, 2006), Notch (Vaccari, 2008) и некоторые другие сигнальные пути, однако только в случае с EGFR проводились детальное исследования влияния на него Hrs (показано для эмбриональных фибробластах мыши (Kanazawa et al., 2003) и для эмбрионов и имагинальных дисков плодовой мушки (Chanut-Delalande et al., 2010)).

Кроме того, эксперименты на млекопитающих показали, что белок Hrs является партнером шванномина, тумор-супрессора нейрофиброматоза 2 (имеет 55% гомологии с Merlin дрозофилы) (Scoles et al., 2000; Scoles et al., 2002; Gutmann, 2001), необходимым для поддержания его функции. Более того, согласно данным (Sun et al., 2002), Hrs млекопитающих самостоятельно способен выполнять функцию опухолевого супрессора. Поэтому уточнение

функций гена Hrs может играть роль в вопросах изучения регуляции опухолевого роста и разработки противоруковой терапии.

Основная цель - изучение клеточной локализации белка Hrs в сперматогенезе дрозофилы и выявление функций гена Hrs в развитии крыла Drosophila melanogaster.

Задачи данного исследования:

1. Получить линии D. melanogaster, содержащие встройки последовательностей, кодирующих полноразмерную и различные усеченные формы гена Hrs, в векторе pUASp-GFP, позволяющем экспрессировать трансген в клетках зародышевой линии. С помощью полученных линий изучить локализацию белка в сперматогенезе D. melanogaster.

2. Проанализировать способность Hrs к участию в регуляции цитокинеза в сперматогенезе D. melanogaster.

3. Исследовать спектр экспрессии различных изоформ Hrs (Hrs-RA, Hrs-RB и Hrs-RC), анонсированных в базе данных FlyBase, в крыловых имагинальных дисках, ганглиях и семенниках D. melanogaster.

4. Изучить локализацию отличных от Hrs маркеров эндосом в сперматогенезе D. melanogaster.

5. Исследовать эффекты эктопической экспрессии и сайленсинга (посредством РНК-интерференции) гена Hrs в развитии крыла D. melanogaster и выявить ранее неизвестные точки воздействия Hrs на сигнальные пути, задействованные в данном процессе. Исследовать влияние Hrs на процесс формирования эктопического глаза на крыле D. melanogaster.

Научная новизна работы. Изучен спектр транскриптов гена Hrs в соматических тканях (крыловых имагинальных дисках и ганглиях) и семенниках самцов дрозофилы, показано, наличие изоформ (Hrs-RA и Hrs-RC), специфичных для сперматогенеза D. melanogaster. В работе получены химерные белки, содержащие фрагменты белка Hrs, маркированные GFP, что позволило выявить локализацию Hrs на фузомах (межклеточных цитоплазматических мостиках, объединяющих сперматоциты в синцитии). Установлено, что за указанную локализацию белка ответственен мотив, расположенный между 383 и 472 аминокислотными остатками молекулы Hrs. Установлено, что маркеры эндосом, отличные от Hrs, - Rab4, Rab7, Rabil -локализуются в области акросомы, a Rab4 и Rab7 также на фузоме. Показано, что негативное влияние Hrs на активность сигнального пути Wg в крыле опосредовано влиянием Hrs на формирование паттерна экспрессии Cut в крыловом имагинальном диске. Выявлена роль Hrs в поддержании А/Р границы крылового имагинального диска на поздних личиночных стадиях. Показано существование ранее неизвестной функции гена Hrs в процессе развития крыла

дрозофилы - участие в процессе сужения про-жилок (vein refinement) и синхронизации развития поверхностей крыла.

Научно-практическая значимость исследования. Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные знания о процессах, лежащих в основе регуляции сигнальных путей, участвующих в индивидуального развития организма. В данной работе впервые получены новые маркеры эндосом -фрагменты гена Hrs, маркированные GFP, которые далее были встроены в геном дрозофилы. Подобные маркеры позволяют проводить прижизненное наблюдение деталей поведения эндосом в клетке и изучать клеточные структуры, родственные эндосомам.

Научные положения, выносимые на защиту. Ген Hrs экспрессируется на ранних стадиях сперматогенеза дрозофилы и его белковый продукт ассоциируется с фузомами сперматоцитов за счет сайта связывания, расположенного между аминокислотными остатками 383 и 472. Hrs влияет на активность сигнального пути Wg на уровне формирования паттернов экспрессии Cut, Wg и поддержания границ паттерна экспрессии Ар, и таким образом участвует в поддержании D/V границы крылового имагинального диска. Hrs также участвует в поддержании А/Р границы крылового имагинального диска и в процессе формирования границ жилок крыла на стадии куколки.

Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Все работы молекулярно-биологического и цитологического характера проводились автором. Получение трансгенных линий дрозофилы проводилось при участии н.с. Т.Д. Дубатоловой. Эксперименты по изучению трансдетерминации проводились при участии к.б.н. С.А. Копыла.

Апробация работы. Результаты работы представлены на конференции «Хромосома-2012» (09.2012, г. Новосибирск) и на III Съезде Общества клеточной биологии (10.2012, г. Санкт-Петербург).

Публикации. Содержание диссертации должным образом отражено в автореферате и изложено в 7 публикациях: в 5 статьях, опубликованных в изданиях Перечня ВАК, и в 2 публикациях в виде тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 212 ссылок. Работа изложена на 140 страницах печатного текста, содержит 39 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух. В работе испольовались линии мух, полученные из Bloomington Stock Center, описанные в базе данных FlyBase (http://flybase.org/), а также линии P{UAS-Hrs.L} (синоним P{UAST-Hrs}12) (лаборатория H.J.

Bellen, USA), P{wg-Gal4} и P{PZ}apK56S (лаборатория G. Morata, Spain), yw; UAS-GFP(S65T) (лаборатория С. Lehner, Germany), Р{1АгВ}пеигл"" (лаборатория J. Mattila, Finland), yw*;CyO/Tft;P{Bam-Gal4} (лаборатория геномики ИМКБ СО РАН), yw и y\v;If/CyO;Sb/Tb (лаборатория популяционной генетики ИЦиГ СО РАН), у', Df(l)w67c23; А2-3, Kijf (лаборатория молекулярной цитогенетики ИМКБ СО РАН).

Выделение геномной ДНК и молекулярное клонирование. Выделение геномной ДНК производили с использованием калий-ацетатного (Bender et al, 1983) и фенол-хлороформного методов. Фрагменты гена Hrs вводили в промежуточную вектор pTZ57R/T (#1214, Fermentas) посредством молекулярного клонирования, проведенного в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем. Из полученных плазмид фрагменты гена извлекали посредством рестрикции эндонуклеазами EcoRI и BamHI и вводились в вектор pUASp-GFP. Полученные плазмиды анализировали путем секвенирования в центре секвенирования ДНК ИМКБ СО РАН и использовали для трансформации клеток зародышевого пути дрозофилы.

ОТ-ПЦР анализ. Тотальную РНК из органов и тканей дрозофилы экстрагировали с использованием реагента Trizol®Reagent. Синтез первой цепи кДНК с РНК производили с использованием набора реактивов «Реверта-L» или «SuperScript II ® First Single Strand synthesis system» (Invitrogen) в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем. Для идентификации транскриптов Hrs применяли метод ОТ-ПЦР с использованием комбинаций праймеров #2 и #3 для Hrs-RA, #1 и #2 для Hrs-RB и #4 и #5 для Hrs-RC (#1: TCCTCCTGCTATTCCCTCCT, #2: CGGTTGGTGAAGGTGAACTC, #3: ATGAGCTCGGAGGAGGAACT, #4: CATCTGGCAGCACTGTAAGG, #5: GGAGGGAATAGCAGGAGGAG).

Приготовление препаратов семенников имаго. Семенники дрозофилы извлекали в растворе Хенкса, фиксировали 3,7% растворе формальдегида в 1х PBS 10 минут, промывали lx PBS 3 раза по 5 минут, обрабатывали 1х раствором DAPI 5 минут и снова промывали lx PBS 2 раза по 5 минут. Обработанные семенники заключали в для заливки препаратов (25% глицерин, 10% Mowiol, 5% DABCO, 0,2 М Tris-HCl. pH 8,5).

Детектироване активности репортера ß-галактозидазы в крыловых имагинальных дисках. Имагинальные диски фиксировали в течение 20 минут в 0,75% глутаральдегиде (на 0.1М какодилате натрия), промывали 3 раза по 5 минут lxPBS, и инкубировали в растворе для окрашивания (ЮтМ NaH2P04'2H20/ Na2HP04'2H20, pH 7.2; 150тМ NaCl; ImM MgCl2«6H20; 0.3% Triton Х-100; 3.1mM K[FeII(CN)6]; 3.1тМ K3[FeIII(CN)6]; 0.2% X-gal) в течение ночи.

in situ гибридизация мРНК. РНК-зонды для in situ гибридизации мРНК Hrs и Cut синтезировали с использованием набора реактивов DIG RNA labeling kit (Sp6/T7) (Roche #11175025910) в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем. In situ гибридизацию мРНК проводили в соответствии с протоколами «Simultaneous detection of RNA and proteins by in situ hybridization and immunological staining» (Nagaso et al., 2001) и «In situ protocol for imaginai discs and pupal wings» (Sturtevant, Bier). В анализ брали семенники мух линии yw и крыловые имагинальные диски личинов 3 возраста линий yw, 1096-GAL4/yw и 1096-GAL4>UAST-Hrs. Личиок фиксировали в ФБ (фиксирующий буфер: 4% формальдегид, ЮОмМ Hepes, 2мМ MgS04, 1мМ ЭГТА) при 4°С в течение 24 часов, семенники - при комнатной температуре в течение 30 минут. Объекты отмывали последовательно этанолом и метанолом, обрабатывали смесью ксилола и этанола (1:1), снова отмывали, повторно фискировали и отмывали. Диски извлекали из личинок, отмывали РВТ и обрабатывали раствором протеиназы К (20 мкг/мл) в течение 7-10 минут, после чего инактивировали фермент раствором глицина (2мг/мл). Семенники обрабатывали 80% ацетоном в течение при -20°С в течение 10 минут. Органы отмывали и подвергали, последовательно, предгибридизации (при +65°С, 24 часа) и гибридизации (+65°С, 20 часов). Конечная концентрация комплиментарных и некомплиментарным зондов к Hrs и Cut составляла 2нг/мкл. Органы после гибридизации отмывали, блокировали в 2% BSA и обрабатывали антителами против дигоксигенина, коньюгированными с щелочной фосфатазой. Сигнал мРНК визуализировали посредством обработки образцов раствором NBT (4,5мкл) и BCIP (3,5мкл) в течение 20-30 минут при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Внутриклеточная локализация белка Hrs в сперматогенезе дрозофилы. В семенниках мух линий, полученных в ходе работы, осуществляли эктопическую экспрессию полноразмерной и усеченных форм Hrs, меченных GFP, под драйвером bam-GAL4. Цитологическое исследование семенников показало, что формы HrsB, Hrs4, Hrs8 и Hrs9 локализуются на эндосомах и фузомах сперматоцитов (Рис.1). Формы Hrsl (Рис. 2А) и Hrs2 (Рис. 2Б) не были обнаружены на фузомах, но локализовались в ядрах сперматоцитов и сперматид. Исследование локализации в сперматогенезе GFP (Рис. 2В) и GFP.nls (Рис. 2Г) показало, что ядерная локализация Hrsl и Hrs2 неспецифична. В то же время, поскольку GFP не обнаруживается на фузомах, мы считаем локализацию форм HrsB, Hrs4, Hrs8 и Hrs9 на указанных органеллах специфичной. Результаты исследования позволили локализовать сайт

связывания Нге с фузомой между аминокислотными остатками 383 и 472 (Рис.

3).

Рисунок 1. Локализация полноразмерной и усеченных форм белка Нге, маркированных ОБР, в сперматогенезе дрозофилы. Локализация полноразмерной формы НгеВ в сперматоцитах (А, Б) и сперматидах на стадии «луковицы» (В, Г) и на стадии «листа» (Д, Е). Локализация Нгз4 (Ж, 3), Нге8 (И, К) и Нгб9 (Л, М) в сперматоцитах. Белыми стрелками показана локализация указанных форм на фузомах, оранжевыми стрелками - на эндосомах. Масштаб — 10 микрон.

ь^тт

- * ШМ

Як

ВММ-Я

Рисунок 2. Локализация Нг$1 (А) и Нгб2 (Б), маркированных вРР. Обе формы локазлизуются в ядре (указано белыми стрелками), но не в ядрышковом организаторе (указано черными стрелками) сперматоцитов. вБР (В) и ОРР.пЬ (Г), также локализуются в ядре (отмечено белыми стрелками), но не в ядрышковом организаторе (отмечено черными стрелками) сперматоцитов, что указывает на неспецифичность ядерной локализации Нге1 и Нгб2. Масштаб - 10 микрон.

moinu Hunt токаи

11 91,1 . Г* nu

мэини: wri'di инк:

f*inj«Ml

STAU uotmiur.

H»1

Им*

Рисунок 3. Локализация сайта связывания белка Hrs с фузомами сперматоцитов и ранних сперматид в сперматогенезе дрозофилы. STAM, NF2 и Growth suppression домены являются частями доменов Pro/Glu и coiled-coil.

Мутация и РНК-интерференция гена Hrs не вызывают нарушений цитокинеза в премейотических митозах и мейозах. Известно, что некоторые белки комплексов ESCRT принимают участие в цитокинезе (Carlton, Martin-Serrano, 2007; Morita et al., 2007). Поскольку Hrs - член комплекса ESCRT-0, мы исследовали его роль в цитокинезе. Цитологический анализ семенников личинок, гомозиготных по HrsD2S, семенников имаго линии bam-GAL4>UAS-RNAi-Hrs и мозаичных клонов линии hs-FLP; HrsD2S FRT/Ubi-GFP не показал наличия в них полиплоидных сперматоцитов, являющихся показателем нарушений цитокинеза премейотических митозов. (Рис. 4). Таким образом, согласно результатам трех независимых экспериментов ни мутация, ни РНК-интерференция Hrs не нарушают цитокинеза премейотических митозов и мейозов.

Рисунок 4. Анализ мозаичных клонов (линия У1$-РЬР;Нг$ш РКТ/С/Ы-йРР). Окраска ЭАР1 (А); сигнал йРР (локализация сигнала показана белой стрелкой) (Б); наложение изображений (В). Зеленой стрелкой отмечены клетки Нк°28 РЯТ, белой — клетки И5-РЬР; Ь'Ы-СРР. Масштаб - 10 микрон.

Спектр экспрессии изоформ транскриптов гена Нг$ в семенниках, крыловых имагинальных дисках и ганглиях. Согласно базе данных Р1уЬа5е, существуют 3 изоформы Нгб: Нк-ЯА, Нгз-ЯВ и Нгн-ЯС (Рис. 5А). Результаты ОТ-ПЦР анализ семенников, крыловых имагинальных дисков и ганглиев

дрозофилы (Рис. 5Б) показали, что изоформа Hrs-RB присутствует во всех исследованных тканях, в то время, как изоформы Hrs-RA и Hrs-RC оказались специфичными для семенников. РНК Hrs-RC отличается от РНК Hrs-RB только 5'-НТО; таким образом, трансляция Hrs может специфически регулироваться в ходе сперматогенеза. RA изоформе Hrs соответствует полученная в данной работе форма Hrs8, в которой также отсутствуют домены, необходимые для заякоревания Hrs на эндосомах, но наличествует сайт связывания фузомах. Это может свидетельствовать о роли белковой формы Hrs-A в формировании и/или поддержании функции фузом в ходе сперматогенеза у дрозофилы. Результаты in situ гибридизации мРНК Hrs в семенниках показывают, что экспрессия Hrs имеет место в раннем сперматогенезе, что коррелирует с нашими данными о том, что Hrs играет роль именно на стадии сперматоцитов (Рис. 6).

А

H-í-PB

№

xV Л"

/л.

Рисунок 5. Спектр изоформ транскриптов гена Нгз в семенниках, крыловых имагинальных дисках и ганглиях дрозофилы. (А) Экзонная структура изоформ Я«; вертикальными штрихами показаны сайты посадки праймеров, использованных в ОТ-ПЦР анализе. (Б) Результаты ОТ-ПЦР: изоформы Нк-ИВ и //г^-ЛС обнаружены в семенниках; в крыловых

имагинальных дисках и ганглиях обнаружена только изоформа (Б).

Рисунок 6. In situ гиридизация мРНК Hrs в семенниках дрозофилы с использованием некомплиментарного (отрицательный контроль) (А) и комплиментерного (Б) зондов, меченных дигоксигенином. Стрелкой показана область локализации зонда.

Внутриклеточная локализация маркеров эндосом Rab4, Rab7 и Rabil в сперматогенезе дрозофилы. Исследуя локализацию Hrs в сперматогенезе дрозофилы, мы ожидали обнаружить белок в области акросомы, однако Hrs обнаруживался только на эндосомах и фузомах.

Поскольку природа акросомогенеза не до конца изучена, мы провели анализ локализации маркеров разных типов эндосом Rab4, Rab7 и Rabil в сперматогенезе дрозофилы. Оказалось, что все три исследованных белка локализуются в области формирующейся акросомы в сперматидах и на акросомах спермиев, что подтверждает гипотезу эндосомальной природы акросомы. Кроме того, было показало, что как и Hrs, Rab4 и Rab7 локализуются на фузомах сперматоцитов (Рис. 7).

■ 9Й ■ ¡£2

■ ■ и ■ * Л -. л ' Л

II > II <

о 'ЛГ' р т _

Рисунок 7. Локализация маркеров эндосом Rab4, Rab7 и Rabil в сперматогенезе дрозофилы. В сперматоцитах Rab4 (А, Б) и Rab7 (В, Г) обнаруживаются на фузомах (показано белыми стрелками), в то время как Rabil располагается на эндосомах в цитоплазме (Д, Е). На более поздних стадиях локализация Rab4, Rab7 и Rabil изменяется: в сперматидах все три белка локализуются на эндосомах, формирующих акробласт (Ж-М; показано желтыми стрелками); в спермиях белки концентрируются на акросоме (Н-Т; показано голубыми стрелками). Масштаб - 10 микрон.

Влияние гена Hrs на поддержание DA7 границы крылового имагинального диска. Эктопическая экспрессия гена Hrs под контролем драйверов 1096-GAL4 и 8609-GAL4 вызывает изменение формы, размеров и распределения жилочного материала крыла (Рис. 8). Также эктопическая экспрессия Hrs в крыле приводит к исчезновению крайних рядов сенсорных щетинок переднего края крыла (Рис. 9), что является следствием нарушения формирования и/или поддержания D/V границы крылового диска. Исчезновение сенсорных щетинок проявляется на уровне диска исчезновением паттерна экспрессии Neuralized, гена-мишени сигнального пути Wg, что свидетельствует о негативном воздействии эктопической экспрессии Hrs на активность сигнального пути Wg (Рис. 10). Данный феномен был показан также в работах других авторов (Seto, Bellen, 2006), однако в настоящее время механизм действия Hrs на сигнальный путь Wg не изучен.

10

Рисунок 8. Фенотипические проявления эктопической экспрессии гена Нгя в крыле дрозофилы под контролем драйверов 1096-ОАЬ4 (В) и 8609-ОАЬ4 (Г) в сравнении с контролем (иАБТ-Нгй без драйверов) (Д). (А, Б) - паттерны экспрессии 1096-САЬ4 и 8609-САЬ4 в крыловом диске, соответственно.

Рисунок 9. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем драйвера 7096-GAL4 на формирование сенсорных щетинок переднего края крыла дрозофилы. По сравнению с контролем (линия yw) (А) у особей 1096-GAL4>UAST-Hrs наблюдается частичное исчезновение сенсорных щетинок triple-row (Б).

* - st

Рисунок 10. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем драйвера 1096-GAL4 на экспрессию гена Neuralized в области D/V границы крылового имагинального диска дрозофилы. Кружком отмечен нормальный паттерн экспрессии гена Neur в районе подушки крыла (А). В дисках особей 1096-GAL4>UAST-Hrs>neur-LacZ наблюдается исчезновение паттерна экспрессии гена Neur в области подушки крыла (Б).

В работе Buceta et al. (Buceta et al., 2007) важная роль в формировании D/V границы имагинального крылового диска отводится гену Cut, поддерживающему транскрипционную активность гена Wg и, одновременно,

снижающему активность сигнального пути Wg за счет транскрипционной регуляции гена Armadillo на D/V границе. С помощью иммуноокрашивания актителами против Cut и in situ гибридизации мРНК Cut дисков личинок 1096-GALA>UAST-Hrs мы показали, что эктопическая экспрессия гена Hrs вызывает изменения паттерна экспрессии Cut: в области экспрессии драйвера 1096-GAL4 мРНК и белок Cut распределены диффузно по всей почке крыла (Рис. 11). Изменение паттерна экспрессии Cut проявляется также аналогичным искажением паттерна экспрессии гена tVg(Puc. 12).

Поскольку Cut - ген-мишень сигнального пути Notch, можно предположить, что искажение паттерна его экспрессии является следствием изменения паттерна активности сигнального пути Notch. Из рисунка 13 видно, что эктопическая экспрессия Hrs в крыловом диске приводит к искажению паттерна экспрессии Ар, активность которого, как известно, необходима для поддержания экспрессии Notch. В то же время, негативное влияние на активность экспрессии Ар оказывает сигнальный путь Wg, который, таким образом, ограничивает паттерн Ар дорзальным компартментом крылового диска.

Рисунок 11. При эктопической экспрессии Hrs в почке крыла (В, Е) паттерн экспрессии Cut в диске искажается в сравнении с контролем (yw (А, Г) и yw/1096-GAL4 (Б, Д). (А-В) — иммунокрашивание крыловых дисков антителами к белку Cut; (Г-Е) - in situ гибридизация комплиментарного РНК-зонда D\G-Cut на мРНК Cut в крыловых дисках. Белыми стрелками (Г, Д) показан паттерн распределения мРНК Cut в норме; черной стрелкой (Е) показано искажение паттерна распределения мРНК Cut, тонкими черными стрелками показаны неспецифичные сигналы в трахее.

Таким образом, основываясь на результатах проведённых нами экспериментов, можно сделать вывод, что эктопическая экспрессия Hrs под драйвером 1096-GALA приводит к формированию эктопического паттерна экспрессии Cut в области, соответствующей экспрессии драйвера. Это может являться следствием положительного влияния Hrs на активность сигнального

Рисунок 12. При эктопической экспрессии Hrs в почке крыла (Б) паттерн экспрессии Wg в диске искажается в сравнении с контролем (yw) (А). Стрелкой показано искажение паттерна экспрессии Wg.

пути Notch (Halder et al., 2006; Knoblich, Gallagher, 2006). В свою очередь эктопическая экспрессия Cut приводит к снижению активности сигнального пути Wg и, следовательно, к снижению транскрипционной активности генов Ser и Dl и Ас и Sc, что приводит к исчезновению маргинальных щетинок, и эктопической активации гена Ар в вентральном компартменте крылового диска (Рис. 13), за счёт чего осуществляется положительная обратная связь между

сигнальными путями Notch и Wg (Рис. 14).

*

Рисунок 13. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем драйвера 1096-GAL4 на паттерн экспрессии гена Ар в крыловом имагинальном диске дрозофилы. В норме ген Ар экспрессируется в дорзальном компартменте диска (А). В дисках особей линии 1096-GAL4>UAST-Hrs>ap-LacZ наблюдается искажение паттерна экспрессии гена Ар на D/V границе (Б).

Ар

Notch

Ар ь

DI, Ser

D/V

Sc, Ac

Рисунок 14. Путь воздействия Hrs на активность сигнального пути Wg в крыловом имагинальном диске дрозофилы. D/V - D/V граница, D и V -соответственно, дорзальный и вентральный компартменты крылового диска. Серым обозначены неактивные гены; голубым обозначен Hrs и его предположительная точка воздействия на сигнальный путь Notch; чёрными

13

стрелками показана положительная регуляция активности экспрессии генов, красными затупленными стрелками показана негативная регуляция активности экспрессии генов, пунктирной стрелкой схематично обозначено действие сигнального пути Wg.

Влияние гена Hrs на поддержание А/Р границы крылового имагинального диска. Как уже было сказано, одним из проявлений снижения активности сигнального пути Wg при эктопической экспрессии Hrs является экспансия паттерна экспрессии Ар в вентральную область крылового диска (Рис. 13). Вместе с тем, повышенная активность гена в области пересечения D/V и А/Р границ указывает на влияние Hrs на формирование или поддержание А/Р границы. Данное наблюдение было отмечено нами в работе 2012 года. В статье (Fan et al., 2014) было показано, что Hrs, связывая молекулу Smothened, оказывает негативное воздействие на сигнальный путь Hh на ранних этапах формирования крылового диска и таким образом влияет на формирование А/Р границы. Наш эксперимент (Рис. 15) показал, что в условиях эктопической экспрессии Hrs размеры области локализации Ptc в диске увеличиваются. Поскольку в эксперимент был взят драйвер 1096-GAL4, активизирующийся в конце 2 личиночной стадии, эффект на паттерн Ptc Hrs указывает на участие последнего в поддержании А/Р границы крылового диска.

Рисунок 15. Распределение белка Ptc в имагинальных крыловых дисках контрольных линий yw (А) и 1096-GALA (Б) и при эктопической экспрессии гена Hrs под контролем драйвера 7096-GAL4 (В). Размеры области локализации белка Ptc в зоне повышенной экспрессии гена Hrs увеличена по сравнению с контролем (белая стрелка).

Роль гена Hrs на поздних этапах развития крыла. Эктопическая экспрессия трансгена UAS-RNAi-Hrs под контролем драйверов 7096-GAL4, 7405-GAL4, 8609-G AL4 и 3041-GAL4 фенотипически проявлялась существенным утолщением продольных жилок, что может свидетельствовать о снижении активности сигнального пути Notch, поддерживающего статус клеток межжилок, и/или увеличении активности сигнального пути EGFR, необходимого для формирования жилок. Поскольку Hrs характеризуется высокой стабильностью и сильным материнским эффектом (Lloyd et al., 2002), эффект РНК-интерференции, наблюдаемый данном эксперименте, проявляется на стадии куколки, что свидетельствует об участии Hrs в регуляции процесса

14

сужения про-жилок крыла. Кроме того, РНК-интерференция проявляется уменьшением размеров крыла и, в некоторых случаях, изгибанием крыла (7405-вАЬ4, 8609-ОАЬ4) или разобщение вентральной и дорзальной поверхностей крыла [3041-ОАЬ4), что может указывать на нарушение синхронизации развития противопоожных поверхностей органа (Рис. 16).

Рисунок 16. Фенотипические проявления РНК-интерференции гена Hrs в крыле дрозофилы при экспрессии UAST-RNAi-Hrs под контролем драйверов 1096-GAL4 (Д), 7405-GAL4 (Е), 8609-GAL4 (Ж) и 3041-GAL4 (3) по сравнению с контролем (yw;UAST-RNAi-Hrs) (И). Крылья располагаются вентральной поверхностью вверх. Стрелками указаны аномалии (утолщения жилок, эктопический жилочный материал); также в (Е, Ж) наблюдается искажение формы крыловой пластинки, в (3) - разобщение дорзальной и вентральной поверхностей крыла. (А-Г) - паттерн экспрессии драйверов 7096-GAL4 (А), 7405-GAL4 (Б), 8609-GAL4 (В), 3041-GAL4 (Г) в крыле куколки.

Эктопическая экспрессия гена Hrs усиливает эффект трансдетерминации клеток крыла дрозофилы. Эктопическая экспрессия гена Eyeless в крыловом имагинальном диске стимулирует процесс трансдетерминации (Halder et al., 1995) и формирование эктопического глаза (Рис. 17А). На уровне развивающегося диска клетки, подвергающиеся трансдетерминации, можно идентифицировать по экспрессии гена Elav. (Рис. 17В). Наши эксперименты показали, что ко-экспрессия Hrs и Еу под контролем драйвера 1096-GAL4 приводит к более явному искажению паттерна экспрессии Wg (Рис. 17Д), образование более многочисленных, по сравнению с особями 1096-GAL4>UAST-Ey, скоплений Elav-положительных клеток (Рис. 17Е) и увеличению эктопического глаза (Рис. 17Г). Из литературных данных следует, что при развитии нормального глаза Wg и Еу действуют антогонистически (Lee, Treisman, 2001). Таким образом, влияние эктопической экспрессии Hrs на активность процесса трансдетерминации клеток крыла в клетки глаза дополнительно подтверждает влияния Hrs на активность сигнального пути Wg.

Рисунок 17. Эктопическая экспрессия гена Еу под контролем драйвера 7096-GAL4 приводит к формированию тканей глаза в области крыла (А), при этом в крыловом имагинальном диске искажается паттерн экспрессии гена Wg (Б), и активируется экспрессия гена Elav (В). Эктопическая ко-экспрессия Еу и Hrs под контролем драйвера 1096-GAL4 приводит к видимому увеличению размеров эктопичес'ких глаз (Г). Искажение паттерна экспрессии Wg ярко выражено, а область эктопической экспрессии Elav увеличивается в размерах (Е). (Ж) - паттерн экспрессии Wg в контроле (линиям).

ВЫВОДЫ

1. Получены линии D. melanogaster с геномными встройками, кодирующими полноразмерную форму и 5 усеченных форм гена Hrs, маркированные GFP и экспрессирующиеся под контролем регуляторного элемента UASp. Исследование полученных линий показало, что химерный белок GFP-Hrs локализуется в процессе сперматогенеза на фузомах сперматоцитов, но не на акросомах, как ожидалось исходя из исследований акросомогенеза млекопитающих (Berruti, Paiardi, 2011). Сайт связывания Hrs с фузомой локализован между 383 и 472 аминокислотными остатками.

2. Показано что Hrs не принимает участие в регуляции цитокинеза в сперматогенезе D. melanogaster.

3. Показано, что ген Hrs экспрессируется на ранних этапах сперматогенеза, причем, для генеративных тканей самцов дрозофилы характерно наличие всех изоформ РНК гена Hrs, анонсированных в базе данных FlyBase. Поскольку изоформа Hrs-RA, для которой характерно отсутствие N-концевых доменов, вовлеченных в связывание белка с эндосомами, практически идентична полученной в данной работе усеченной форме Hrs8, на основании полученных данных было выдвинуто предположение, что белковый продукт Hrs-RA играет специфическую роль в поддержании структуры и/или функциии фузом сперматоцитов.

4. Обнаружено, что маркеры эндосом Rab4, Rab7 и Rabil локализуются в области акросомы, что является подтверждением эндосомальной теории акросомогенеза. Кроме того, на ранних стадиях сперматогенеза Rab4 и Rab7 подобно Hrs обнаруживаются на фузоме.

5. Показано, что Hrs оказывает негативное действие на активность сигнального пути Wg опосредованно через формирование паттерна экспрессии гена Cut, и таким образом влияет на поддержание D/V границы крылового имагинального диска, причем данный эффект обнаруживается не только в процессе нормального развития клеток крылового диска, но и в процессе трансдетерминации клеток крыла в клетки глаза. Выявлена роль Hrs в поддержании А/Р границы на поздних этапах развития крылового диска. Также обнаружено, что Hrs имеет функцию на более поздних этапах развития крыла в процессе сужения жилок крыла (vein refinement) и, возможно, поддержания синхронности формирования дорзальной и вентральной поверхностей крыла.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи:

1. Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Волкова Е.И., Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. Влияние морфогена Wg на формирование эктопического глаза у Drosophila melanogaster. Генетика, 2011, том 47, № 8, с. 1026—1031

2. Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. Р-элемент как инструмент анализа генома и протеома Drosophila melanogaster. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, том 15, № 2, с.585-595.

3. Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. Роль гена Hrs в формировании крыла Drosophila melanogaster. Генетика, 2012, том 48, № 9, с.1039-1045.

4. Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. О роли гена Hrs в поддержании границ компартментов крылового имагинального диска Drosophila melanogaster. Генетика, 2015, том 51, № 10, с.1207-1211.

5. Мариловцева Е.В., Дубатолова Т.Д., Галимова Ю.А., Копыл С.А., Омельянчук Л.В. Исследование клеточной локализации HRS и других маркеров эндосом в сперматогенезе Drosophila melanogaster с помощью химерных GFP конструктов. Цитология, 2015, том 57, №7, с. 509-517.

Тезисы конференций:

6. Мариловцева Е.В., Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Омельянчук Л.В. Роль гена Hrs в развитии Drosophila melanogaster. Сборник трудов междунарожной конференции «Хромосома 2012». 2-7 сентября, 2012, Новосибирск, с. 135.

7. Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Мариловцева Е.В.. Омельянчук Л.В. "Роль гена Hrs в формировании крыла Drosophila melanogaster». Сборник трудов III Съезда Общества Клеточной Биологии. 16-18 октября, 2012, Санкт-Петербург, с. 11.

Подписано в печать 02.10.2015 г. Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 281

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07