Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster

Юдина, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster"

На правах рукописи

ЮДИНА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФУНКЦИЙ ГЕНА MERLIN НА МОДЕЛИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА DROSOPHILA MELANOGASTER

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

OOd^oj''—

Новосибирск 2009

003463533

Работа выполнена в лаборатории генетики клеточного цикл£ Учреждения российской академии наук Институт цитологии и генетики С РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Омельянчук Леонид Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна

доктор биологических наук, Демаков Сергей Анатольевич

Ведущее учреждение: Петербургский институт ядерной физики РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится Z У _2009г. на

заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090. Тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан Ц С&М/гДЖЯ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев

Актуальность проблемы

Способность к регуляции пролиферации - важнейшее свойство многоклеточных организмов, необходимое им, чтобы контролировать свой размер и форму, поэтому нарушения в контроле деления клетки могут иметь тяжелые последствия для организма в целом. Ошибочная активация пролиферации часто заканчивается формированием опухоли и развитием рака. Многие гены, как непосредственно контролирующие пролиферацию, так и косвенно вовлеченные в контроль клеточного цикла, были идентифицированы в качестве онкогенов и тумор-супрессоров.

Среди известных тумор-супрессоров интересен открытый в 1993 году ген Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий белок мерлин (или шванномин), принадлежащий к суперсемейству р4.1 - большой группе цитоплазматических белков, связанных с мембраной. Наибольшую степень сходства он имеет с белками подсемейства ERM (EZRIN- RADIXIN- MOESIN). Отсюда название MERLIN -MOESIN-EZRIN-RADIXIN-like-protein. Мутация этого гена вызывает у человека заболевание нейрофиброматоз второго типа, характеризующееся формированием билатеральной акустической шванномы, поражающей восьмую пару черепно-мозговых нервов, а также других опухолей, ассоциированных с центральной нервной системой, таких как менингиомы и эпендимомы (Martuza, Eldridge, 1988; Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993).

Чтобы исследовать клеточные функции белка мерлин, используют его гомологи у мыши и у дрозофилы. У обоих видов особи, гомозиготные по мутации, не выживают, что свидетельствует о жизненно важных функциях мерлина (McClatchey et al., 1997; Fehon et al., 1997). В отличие от человека у мышей, гетерозиготных по NJ2 мутации, не образуются шванномы и другие характерные опухоли. У них развиваются злокачественные остеосаркомы и фибросаркомы, причем метастатического характера (McClatchey et al., 1998). Что касается дрозофилы, то она тоже подходит для изучения функций белка мерлин, несмотря на отсутствие шванновских клеток - мишени болезни у человека. Эксперименты с использованием мутаций с потерей функций мерлина и FLP-FRT системы для получения соматических мозаичных клонов мутантных эпителиальных клеток показали, что, как и у млекопитающих, мерлин-дефицитные клетки дрозофилы характеризуются гиперплазией. Таким образом, мерлин выполняет функцию тумор-супрессора и у дрозофилы (LaJeunesse et al., 1998).

К настоящему времени описаны четыре мутации гена Merlin у дрозофилы. Ни один из аллелей не вызывает эмбриональной гибели, три из этих мутаций, Мег1, МрУ, Мег4 , вызывают гибель на стадии личинки и куколки. Единственный жизнеспособный аллель - Мег3. Мухи, гомозиготные по Мег3, доживают до взрослого состояния, но стерильны, их крылья более широкие, для глаз характерна нерегулярность фасеток, а на голове образуются аномальные кутикулярные структуры (Fehon et al., 1997).

Чтобы выяснить, каким образом мутация Мег3 вызывает стерильность самцов, нами были проведены исследования сперматогенеза Drosophila melanogaster. Сперматогенез объединяет в себе два типа клеточных делений: митотическое и мейотическое, а также процессы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, он является удобной экспериментальной J

моделью для изучения функций белков на клеточном и молекулярном уровнях. Нами было обнаружено, что мутация Мег влияет на процессы компактизации яде и поляризации цист, что приводит к серьезным нарушениям сперматогенеза н стадии индивидуализации спермиев, что и вызывает стерильность самцов.

Ранее было показано, что мутация Мег1 затрагивает особый участок белка «Blue Box» (170YQMTREM177), который идентичен у человеческого п дрозофилиного гомологов белка. Он имеет важное значение для правилышг функционирования белка (LaJeunesse et.al., 1998). Для изучения этого района, а также других функциональных доменов мерлина, были созданы конструкции, кодирующие различные мутантные и усеченные копии белка на основе вектора pUAST, который позволяет экспрессировать копии генов в соматической ткани в системе GAL4-UAS (LaJeunesse et al., 1998). Спецификой нашей работы является использование модифицированного UAS-вектора - pUASp, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии белков в генеративных тканях дрозофилы (Rorth, 1998).

Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые дл правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции н' основе вектора pUASp, кодирующие различные мутантные формы мерлина. Hawi было показано, что белок мерлин, который является тумор-супрессором i соматических тканях дрозофилы, играет существенную роль в процесс сперматогенеза. В частности, открытая форма белка участвует в агломсрацш митохондрий на стадии «луковицы», а закрытая влияет на цитокинез в мейозе Таким образом, в соматической и генеративной тканях мерлин функционирует по разному.

Целью данной работы было изучение клеточных функций гена Merlin н модели сперматогенеза Drosophila melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Показать роль белка мерлин в сперматогенезе D. melanogaster.

2. Изучить локализацию белка мерлин в клетках зародышевого пути самцов D melanogaster.

3. Получить линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей кодирующих различные усеченные формы белка мерлин, в векторе pUASp, которы позволяет экспрессировать целевой трансген в клетках зародышевого пути самцо D. melanogaster.

4. Проанализировать эктопическую экспрессию конструкций в составе вектор pUASp, содержащем последовательности, кодирующие различные усеченны формы белка мерлин, в клетках зародышевого пути и в соматической ткани самцо D. melanogaster.

5. Проанализировать особенности и возможные аномалии сперматогенеза, вызванные эктопической экспрессией трансгенных конструкций в клетка зародышевого пути дрозофилы.

6. Основываясь на результатах анализа сперматогенеза дрозофилы при эктопической экспрессии полноразмерной и усеченных копий белка мерлин, определить роль различных доменов белка в выполнении его функций.

Научная новизна и практическая ценность работы: Впервые, на модели сперматогенеза Drosophila melanogaster были изучены клеточные функции белка

мерлин, оказывающие влияние на сперматогенез Drosophila melanogaster: влияние на цитокинез, на поляризацию цист и морфогенез митохондрий, изучено взаимодействие белка мерлин и колокализация с клеточными структурами.

Получены линии мух, несущие последовательности, кодирующие различные аллели гена Merlin в векторе pUASp, позволяющем получить эктопическую экспрессию трансгенных конструкций в клетках зародышего пути.

Изучено влияние эктопической экспрессии полученных конструкций в векторе pUASp в различных органах и тканях Drosophila melanogaster.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Белок мерлин дрозофилы имеет множественные функции в сперматогенезе, такие как цитокинез, морфогенез митохондрий и поляризация цист.

2. Белок имеет доменную структуру. Была выявлена функциональная значимость отдельных доменов белка. Функции белка в соматической и генеративной ткани различны. Для соматической ткани достаточно первых 350 аминокислот белка, в то время как для правильного протекания всех вышеперечисленных процессов в генеративной ткани необходим только полноразмерный белок. С-концевой домен белка играет ключевую роль в морфогенезе митохондрий.

Апробация работы

Основные результаты исследований были представлены в стендовых докладах на Международной конференции по исследованию дрозофилы JDRC8 (июль 2007 г., Япония, Кобе) и на X Международной молодежной Школе-конференции (сентябрь 2006 г., Владивосток), а также устным докладом на I Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (сентябрь 2008г., Украина, Харьков).

Структура и объем работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 123 страницах, включает 23 рисунка, 3 таблицы, список цитируемой литературы включает 115 ссылок.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 статьи - в научных журналах, в которых по требованию ВАК Минобрнауки России должны быть опубликованы основные научные резуьтаты дмссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук по биологическим наукам.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Цитологический анализ нарушений сперматогенеза дрозофилы проводился совместно с к.б.н. Дороговой Н.В., к.б.н. Гусаченко A.M. и д.б.н. Омельянчуком Л.В.. Электронная микроскопия сделана к.б.н. Губановой Н.В.

Благодарности

Выражаю свою глубокую признательность за помощь и огромный вклад в выполнение этой работы, в первую очередь, д.б.н. Омельянчуку J1.B, к.б.н. Дороговой Н.В. и K.6.H. Гусаченко A.M. Также я глубоко признательна коллективу лаборатории генетики клеточного цикла- к.б.н. Федоровой С.А., Нерушевой О.О., Галимовой Ю.А., Дубатоловой Т.Д., д.б.н. Лебедевой Л.И., к.б.н. Копылу С.А.,

д.б.н. Груздеву А.Д. за помощь в экспериментальной работе и дружеск> поддержку. Я выражаю огромную благодарность коллегам и друзьям, оказавшим разных этапах моей работы неоценимую помощь: Баричевой Э.М., Карагодш Д.А., Блинову А.Г., Головниной К.А., Демакову С.А., Волковой Е.И. и мноп другим.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster были получены из Блумингтонского центра линий дрозофилы (Bloomington Stock Center, USA); а также у', Df(l)w6Tc23; А2-3, Ki f ■ источник эндогенной транспозазы, любезно предоставлена из лаборатории И.Ф. Жимулева; у et vf, ywsn, M-5,Bscwa, FM7,yB, Sb любезно предоставлены из лаборатории И.К. Захарова.; трансгенные линии, содержащие кДНК мутантных аллелей Мег3, Mer34 ,MeriJ, Мег''379, Мег1''69, а также нормального аллеля Мег+, любезно предоставлены из лаборатории Р.Фехона (США), описаны в работе (LaJeunesse et al. 1998); (74-1) w"'ä; P{w+mC =PTT-GA}PdfmmJTM3, Sb! Ser', получена методом GFP-белковой ловушки и любезно предоставлена А. Дебеком (Институт Жака Моно, Париж); In(l)Bincn, В sn y+w+ В, In(l)sc4Lscm, In(l)S, у sc4/ ff Yy+ C(1)DX, ywf/ /любезно предоставлены из лаборатории Чадова Б.Ф.

Получение трансгенных линий дрозофилы: Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые для правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции в составе вектора pUASp (Rorth, 1998), кодирующие следующие формы белка мерлин: белок, в котором отсутствует «Blue Box» - Mer^® (в этом белке удалены аминокислоты с 170 по 177), белок с заменой Met177-»Ile в этом районе - Мег3, С-концевую часть белка - Мег345"635, N-концевые части белка: Мег1'379 и Мег1'169 и полноразмерную копию нормального белка - Мег+. Конструкции (LaJeunesse et al., 1998) были получены путем переклонирования уже существующих конструкций в векторе pUAST (Brand, Perrimon, 1993) в вектор pUASp, позволяющий получать эктопическую экспрессию изучаемых генов как в генеративной, так и в соматической тканях. Трансформация зародышевой линии дрозофилы проводилась по методике, описанной в статье (Шилова и др.,2007). Для каждой конструкции получено и проанализировано несколько независимых трансгенных линий дрозофилы.

Иммуноцитохимическое окрашивание органов дрозофилы для детекции на флуоресцентном микроскопе проводилось согласно (Xue, Cooley, 1993), с некоторыми модификациями. Антитела против белка мерлин были любезно предоставлены профессором Р. Фехоном (R. Fehon) и описаны в статье (LaJeunesse et al, 1998), в работе также были использованы антитела против тпус-эпитопа (Santa Cruz Biotechnology, USA).

Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen) была проведен согласно методике разработанной в лаборатории генетики клеточного цикла.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin

Гемизиготные по мутации Мег3 самцы жизнеспособны, но стерильны (LaJeunesse et al., 1998). Семенные пузырьки таких самцов по сравнению с

семенными пузырьками мух контрольной группы - несущих балансер РМ6 (линия, I содержащая мутацию Мег3 поддерживалась с балансером ГМб), более мелкие, спермин в них неподвижные и в небольшом количестве. Окрашивание ацетоорсеином показало, что у мух Мег3 головки спермиев в пределах одной цисты , рассеяны, в то время как в контроле головки спермиев выглядят как единый пучок (Рис. 1). У мутантных самцов также были обнаружены два основных типа нарушений сперматогенеза:

1. У мутантных самцов встречаются сперматиды на стадии «луковицы», содержащие два и более ядер и небенкернов равного размера. Этот тип нарушений,

I вероятно, связан с нарушениями цитокинеза в мейозе (удобно считать количественно нарушения цитокинеза в мейозе на стадии «луковицы», в норме на этой стадии в клетке содержится одно ядро и один небенкерн).

2. Обнаружены трехполюсные и четырехполюсные веретена деления в сперматоцитах в течение второго деления мейоза, что, вероятно, является результатом неполного цитокинеза в предыдущем мейотическом делении.

Гемизиготные самцы по мутации Мег4 нежизнеспособны, они погибают на стадии личинки и куколки. Но всё же были выделены семенники из единичных ' куколок и изучены аномалии сперматогенеза у самцов Мег4. Характер нарушений в | сперматогенезе у мутантов Мег такой же, как и у мутантов Мег3, но количество аномалий больше: тогда как у мутантов Мег3 встречаются цисты с нормально сформированными головками спермиев, у мутантов Мег они практически отсутствуют.

Рис.1. Морфология сменников,

выделенных из самцов контрольной группы РМ6 (Б и Г) я семенников мутантов Мег3 (А и В). Окрашенные ЭАР1 семенники самцов контрольной группы имеют наполненные семенные пузурькн (£). Семенные пузырьки мутантов Мег3 пустые (А) (стрелки указывают на семенные пузырьки). Окрашивание ацетоорсеином:

семенники самцов контрольной группы содержат строго упорядоченные пучки спермиев (Г), в то время как у мутантов Мег3 пучки спермиев дезорганизованы (В) (стрелками указаны пучки спермиев). Масштаб 100 мкм.

Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы

Было проведено иммуноцитохимическое окрашивание цист, выделенных из фертильных самцов контрольной группы (Шб) и из мутантов Мег3, с использованием специфических моноклональных антител против белка мерлин.

В цистах самцов FM6 наблюдается следующая локализация мерлина на различных этапах сперматогенеза: в сперматоцитах мерлин в основном расположен на клеточной поверхности и в незначительной степени в цитоплазме, так же как и в соматических тканях и на ранних стадиях гаметогенеза (McCartney, Fehon, 1996). Далее в течение прометафазы и метафазы мейоза мерлин перемещается в цитоплазму клеток. Затем мерлин перераспределяется, и окрашивание становится более интенсивным в области, в которой далее в телофазе будет сформировано сократительное кольцо. Наиболее интенсивное окрашивание мерлина в процессе цитокинеза наблюдается вблизи новообразованных клеточных мембран. Сходное распределение паттернов мерлина происходит и в течение второго деления мейоза: на стадии «луковицы» мерлин концентрируется на небенкерне, специфической структуре, формирующейся в результате объединения митохондрий при дифференцировке сперматид. Это интенсивное связывание мерлина с небенкерном остается и на последующей стадии «кометы» (начало элонгации сперматид), в течение которой небенкерн распадается на две субединицы, хорошо различимые при иммунноцитохимическом окрашивании антителами против белка мерлин. В цистах, содержащих зрелые спермии, мерлин обнаруживается по всей длине удлиненного небенкрена. Также можно наблюдать присутствие мерлина в виде гранул выше передней части головок спермиев. Эта область соответствует расположению акросомы, специализированной клеточной структуры, являющейся производной аппарата Гольджи.

Локализация белка мерлин в норме и у мутантов Me/ совпадает.

Миссенс мутация Мег не затрагивает эпитоп, антитела к которому были использованы (LaJeunasse, 1998), поэтому эта мутация никак не мешает распознаванию и окрашиванию антителами мугантного мерлина. Мутация Me г3 не влияет на локализацию белка в кортикальной области клетки, на митохондриях и акросомах. Митохондрии, как и их дериват небенкерн, равномерно окрашиваются иммуноцитохимически вплоть до окончания сперматогенеза, хотя морфология этих структур значительно нарушается в процессе элонгации. Используя те же антитела, ранее было показано, что мерлин имеет сходную кортикальную локализацию в имагинальных дисках личинок дикого типа и мутантов Мег3 (LaJ eunesse, 1998).

Тот факт, что локализация белка в норме и у мутантов Мег совпадает свидетельствует о том, что у мутантов нарушена линкерная функция белка с другими структурами, нарушение которой и приводит ко всем наблюдаемым нами аномалиям элонгации.

Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектора pUASp

Для изучения функциональных доменов белка мерлин были создань различные усеченные копии кДНК гена Merlin (LaJeunesse et al., 1998).

Разные аллели гена Merlin мы клонировали в вектор pUASp. К генам, кодирующим разные мутантные формы белка мерлин, добавлена последовательность, кодирующая myc-эпитоп. Это сделано для того, чтобы

эктопическая экспрессия генетических конструкций легко детектировалась цитологически.

Для каждой конструкции было получено несколько (не менее 4) независимых трансгенных линий мух. С помощью генетического картирования были определены хромосомы, в которые произошла инсерция конструкций, кодирующих разные аллели гена Merlin. Все полученные линии были проанализированы на способность экспрессировать мутантные формы белка в соматической и генеративной тканях (в крыловом имагинальном диске под действием специфичного для этой ткани драйвера 1096-GAL4 и в клетках зародышевого пути в семенниках под действием драйвера nanos-GALA). Также все конструкции были проанализированы на способность восстанавливать жизнеспособность летальной мутации Мег под действием драйверов с повсеместной экспрессией da-GkLA и Actin-GALA. Все линии мух, полученные для отдельно взятой конструкции, одинаково проявляли себя в способности восстанавливать фенотип летальной мутации Мег4. Уровень нарушений, вызываемых определенной конструкцией при эктопической экспрессии под действием всех использованных в работе драйверов, в разных независимых линиях был одинаковый. Мы полагаем, что все линии, полученные для каждой конкретной конструкции, были равнозначны. Поэтому для более детапьного исследования было взято по одной линии мух для каждой конструкции.

Линии, использованные в этой работе, содержали встроенные трансгены в следующих хромосомах: конструкция pUASp-mycMer'~!69 встроена в первую хромосому D.melanogaster, pUASp-mycMer1'3 9 во вторую хромосому, pUASp-mycMer345'635 в третью, pUASp-mycMer3 во вторую, pUASp-mycMer^83 во вторую, pUASp-mycMer+ в третью хромосому.

Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin

В случае мутации Мег4 образуется короткий нефункциональный белок длиной 170 аминокислот, не содержащий никаких функционально значимых сайтов для взаимодействия с другими белками клетки. Для спасения летального фенотипа мутации Мег были использованы полученные конструкции, активируемые драйвером ifa-GAL4, обеспечивающим повсеместную экспрессию (Таблица 1).

Повсеместная экспрессия полноразмерного белка мерлин приводила к полному восстановлению жизнеспособности мух и восстановлению всех процессов в сперматогенезе мух и, как следствие, к восстановлению фертильности.

Аналогичный эксперимент был проведен с трансгенной конструкцией UASp-mycMer3. В этом случае также происходило спасение летального фенотипа, образовывался класс самцов, выживших за счет экспрессии Мег3. У этих самцов в сперматогенезе были обнаружены нарушения, характерные для оригинального аллеля Мег3, восстановления фертильности не происходило.

В случае эктопической экспрессии UASp-mycMer''379 на фоне Мег жизнеспособность летальных мутантов Мег4 полностью восстанавливалась, но в

сперматогенезе восстановления не происходило, наблюдалась картина характерная для мутантов Мег4, фертильность не восстанавливалась.

При эктопической экспрессии pUASp-mycMer^3, pUASp-mycMer345 635 н; фоне мутации Мег4 спасения летального фенотипа мутации Мег4 не происходит.

Надо заметить, что в экспериментах по спасению фенотипа летально мутации Мег конструкцией р UASp-mycMerABB происходит незначительно восстановление в соматической ткани и в сперматогенезе (из куколок вылетел незначительное количество ослабленных самцов, которые погибли в первые чась жизни). Картина нарушений в сперматогенезе сходна с таковой у мутантов Мег3.

Таким образом, результаты по восстановлению фенотипа мутации Мег полностью согласуются с результатами, полученными ранее на соматической ткани (LaJeunesse et al., 1998), и подтверждают, что полученные конструкции составе вектора pUASp обеспечивают необходимый уровень экспресси исследуемых форм белка мерлин в ответ на активацию требуемым драйвером.

Было выявлено влияние отдельных доменов белка мерлин на сперматогенез D. melanogaster (Таблица 1). Полное восстановление сперматогенеза и фертильности обеспечивал только полноразмерный белок мерлин. Ни одна из усеченных или мутантных форм мерлина не обеспечивали полного восстановления сперматогенеза. Таким образом, можно заключить, что и N-концевой домен и С-концевой домен важны в этом процессе, а также важен район «Blue Box», который контролирует внутримолекулярные конформационные переходы белка мерлин.

Таблица 1. Восстановление жизнеспособности и мутантов Мег4 с помощью различных усеченных форм белка.

сперматогенеза у

Усеченные варианты белка мерлин

mycMer+

mycMer3

шусМет'

дви-

шусМег шусМег

1345-635

Способность спасать летальный фенотип у мутантов Мег4

Способность восстанавливать сперматогенез у мутантов Мег4

Т(*»у"

(*)- было обнаружено незначительное количество мух, доживающих до имаго, но с сильно ослабленной жизнеспособностью

(**)- уровень нарушений в сперматогенезе у мутантов Мег4 снижен до уровня Мег3

Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-тусМег+ и UASp-тусМег345-635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

Самцов yw/Y; +; nanos-GAL4 скрещивали с самками yw; pUASp-mycMer*;+ (где *- это гены Мег3, Mei^B, Мег''379), с самками yw; +; pUASp-mycMer** (где**-это гены Мег+ и Мег345'635) и самками yw,pUASp-mycMer';+;+. Также были проведены и реципроктные скрещивания. Среди потомков отбирали особей, содержащих драйвер и трансген по наличию двух копий гена mini-white.

Анализ эктопической экспрессии генов тусМег+ и тусМег341'635 под контролем драйвера nanos-GAL4 в клетках зародышевого пути самцов D.melanogaster выявил два типа нарушений сперматогенеза: нарушения элонгации цист и нарушения структуры небенкерна, начиная со стадии элонгации сперматид.

Нарушения элонгации цист. В нормальной цисте, находящейся в процессе элонгации, ядра всех сперматид находятся на одном конце цисты и в процессе удлинения синхронно перемещаются вместе с базальным концом цисты. В случае эктопической экспрессии генов тусМег+ и тусМег345'635 в некоторых цистах происходят изменения, приводящие к нарушению элонгации сперматид, что ведет к асинхронности перемещения ядер к базальному концу цисты. Морфология самих ядер при этом не нарушается, они претерпевают характерные для них изменения: компактизуются и удлиняются. Такое аномальное расположение ядер может повлиять на дальнейший процесс индивидуализации, в ходе которого образуются отдельные спермии. В начале индивидуализации вокруг ядер собираются актиновые конусы, которые затем синхронно движутся вдоль аксонемы по направлению к хвосту сперматид. По мере движения актинового комплекса происходит реорганизация мембран, разделение сперматид, лишняя цитоплазма и мембранный материал в конце индивидуализации отщепляются в виде «мусорной сумки» (Waste bag). Образование индивидуализационного комплекса происходит в одной точке, на одном уровне для всех сперматид внутри цисты, движение происходит синхронно для всех сперматид в пределах одной цисты. Поэтому расположение ядер на разном уровне может нарушить структуру индивидуализационного комплекса, что может мешать образованию зрелых спермиев (рис.2).

Рис.2. Влияние эктопической экспрессии встроек mycMer+ и тусМег345"635 на сперматогенез.

А - нормальная циста в процессе элонгации. Ядра собраны в один пучок на базальном конце цисты (стрелки).

Б - мутантная циста в процессе элонгации. Ядра не собраны в один пучок на базальном конце, они равномерно распределяются по всей длине цисты (стрелки). Окраска семенников, выявляющая ДНК (DAPI). Масштаб 5 мкм.

Нарушение структуры небенкерна. По мере удлинения цисты небенкерн тоже вытягивается в двураздельную уплощенную структуру, которая тянется вдоль всей сперматиды. Эктопическая экспрессия генов mycMer+ и тусМег345'635 приводит к тому, что в самом начале процесса элонгации сперматид небенкерн лишь немного удлиняется и на этом его вытягивание приостанавливается. На этой стадии ( неполностью удлиненные небенкерны расположены средней части цисты. На более поздних стадиях элонгации этот единый неудлинившийся агломерат распадается на более мелкие группы митохондрий, которые распределены вдоль всей длины цисты. Специфическое окрашивание митохондриальных дериватов проводили с , помощью MitoTracker Red в семенниках мух дикого типа (Рис. 3-А) и при эктопической экспрессии pUASp-mycMer+ (Рис. 3-Б,В) и pUASP-mycMer345'635 (нарушения, вызванные эктопической экспрессией этой конструкции, аналогичны представленным на Рис. 3-Б и 3-В),

Описанные нарушения ярко выражены при эктопической экспрессии конструкций pUASp-mycMer+ и pUASP-mycMer345' 35, но наряду с мутантными цистами оставалось достаточное количество нормальных цист, поэтому возникшие аномалии не сказатась на общем уровне фертильности.

Сопоставляя характер распределения белка мерлин с особенностями динамики митохондрий, можно сделать вывод, что белок принимает активное участие в морфогенезе этой структуры, начиная от ранних стадий сперматогенеза, и заканчивая дифференцировкой в зрелые спермии. Несмотря на то, что в ранних сперматоцитах митохондрии распределены по цитоплазме в виде отдельных телец, они прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму и, таким образом, формируют единую сеть. Постепенно митохондрии сближаются и ассоциируют на уровне мембран так, что сеть митохондрий трансформируется в более компактный и морфологичеки выраженный агломерат, который способен динамично менять свою форму и внутриклеточную локализацию в зависимости от этапа сперматогенеза.

AG В

' 1 *

• S/V" 'чИИг'

Рис.3. Влияние эктопической экспрессии встройки тусМег* на сперматогенез. Нормальные сперматиды на стадии элонгации (А); сперматиды на стадии элонгации, в которых нарушена структура митохондриальных дериватов под действием эктопической экспрессии pUASp-mycMer+ (Б, В). Масштаб 10 мкм. Окраска митохондриальных дериватов - Mitotracker Red. Окраска семенников, выявляющая ДНК (DAPI). Масштаб 10 мкм.

Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer^, UASp-mycMer^3 и UASp-mycMer1'379 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

Эктопическая экспрессия конструкций UASp-mycMer1, UASp-mycMerи UASp-mycMer1'379 под контролем драйвера nanos-GPAA вызывает сходные между собой нарушения, приводящие к блокированию цитокинеза как в митотическом, так и в мейотическом делениях клетки. При этом разделение хромосом и формирование дочерних ядер происходит нормально. В результате аномального цитокинеза образуются многоядерные клетки (от двух до четырех ядер в общей цитоплазме). Из таких клеток образуются многоядерные сперматиды, в которых происходят характерные морфологические преобразования, связанные с дифференцировкой в спермин, такие как: удлинение клеток, компактизация ядра, формирование небенкерна. Однако, зрелые спермии из этих сперматид не образуются (рис.4).

При эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer*, UASp-mycMer и UASp-mycMer1'379 под контролем драйвера nanos-GAL4 на фоне нормального белка мерлин процент нарушений цитокинеза на стадии «луковицы» составил: для UASp-mycMer} 83%, для UASp-mycMerт 96%, для UASp-mycMer1 'т 75%.

При эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer*, UASp-mycMer^3 и UASp-mycMer1'379 под контролем драйвера da-GAL4 на фоне нормального белка мерлин процент нарушений цитокинеза на стадии «луковицы» составил: для UASp-mycMer* 85%, для UASp-mycMerт 100%, для UASp-mycMer' 379 75%.

Частоту нарушений цитокинеза на стадии луковицы считали как отношение числа цист с аномалиями цитокинеза на стадии «луковицы» к общему числу цист на данной стадии.

Были проведены исследования сперматогенеза у взрослых самцов D.melanogaster с мутацией Мег3 и у куколок с мутацией Мег. В сперматогенезе этих самцов также были выявлены случаи нарушений цитокинеза в мейозе. Подсчет нарушений цитокинеза у мутантов Мег и Мег затруднен тем, что до стадии «луковицы» доходят не все сперматоциты второго порядка, к тому же из-за нарушений цитоскелета в клетках затруднен анализ отдельных клеток. Но всё же процент нарушений был ниже чем при эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer , UASp-mycMerт и UASp-mycMer1'379 и составил 40%.

Любопытен тот факт, что на стадии «луковицы» при эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMeP, UASp-mycMerи UASp-mycMer1'379 под контролем драйверов da-GAL4 и nanos-GAL4 при образовании многоядерной клетки, сохраняется, как правило, количество небенкернов соответствующее количеству ядер в этой клетке. Ранее были описаны мутации, нарушающие цитокинез на стадии мейоза (Giansanti et al., 2004), нарушения фиксировались на стадии «луковицы» путем подсчета количества ядер и небенкернов в клетке. Но при всех этих мутациях на стадии «луковицы» в многоядерных клетках небенкерны, как правило, сливались в единый большой небенкерн. Возможно, что это связано с тем, что механизмы нарушений цитокинеза разные у мутантов, описанных в работе (Giansanti et al., 2004) и у мутантов по гену Merlin.

Цитокинез - это процесс деления цитоплазмы и разделения двух дочерних клеток. В этот процесс вовлечены две зависимые друг от друга системы, которые

функционируют совместно в течение всего процесса: формирование сократительного кольца и формирование центрального веретена деления (Giansanti et al., 2004). У D.melanogaster сократительное кольцо включает в себя актин, немышечный миозин И, регуляторную легкую цепь миозина II и анилин. Ранее не было показано, что мерлин участвует в цитокинезе. Тот факт, что мерлин взаимодействует с актином, микротрубочками и тяжелой цепью миозина II, позволяет предположить, что мерлин может быть вовлечен в формирование сократительного кольца, в формирование веретена деления и восстановление мембраны. Как известно, положение средней зоны веретена определяет положение будущей цитокинетической перетяжки (Murray, Hunt, 1993), поэтому можно было ожидать, что цитологически наблюдаемые случаи дефекта цитокинеза при эктопической экспрессии некоторых аллелей гена Merlin могут быть объяснены искажениями мейотического веретена. Полученные нами данные по расхождению хромосом показали, что дефекты цитокинеза, обнаруживаемые при цитологическом исследовании, не являются вторичным следствием дефектов веретена, а связаны с процессом собственно цитокинеза.

Рис. 4. Влияние эктопической экспрессии встроек тусМег3 , тусМегл£В и тусМег1'379 на 1 сперматогенез.

А- нормальный аполярный сперматоцит первого порядка

Б - двуядерный аполярный сперматоцит первого порядка, образовавшийся в результате отсутствия цитокинеза во время митотического деления гениальной клетки В - нормальные клетки на стадии «луковиц», содержат по одному ядру и одному небенкерну (ядра указаны стрелками, небенкерны-треугольниками)

Г - клетка на стадии «луковицы», содержащая четыре ядра и четыре небенкерна. Фазовый контраст.

(ядра указаны стрелками, небенкерны-треугольниками) Масштаб 5 мкм

Роль конформационных внутримолекулярных переходов в белке мерлин для сперматогенеза дрозофилы

Проанализировав нарушения сперматогенеза, которые происходили е результате эктопической экспрессии полученных конструкций в зародышевой линии клеток самцов В. melanogaster, мы выявили два различающихся доминантных фенотипа: нарушение цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе при сверх-экспрессии генов тусМег1'379, тусМег3 и тусМегмв (при сверхэкспрессии генов тусМег345'635 и тусМег* нарушений цитокинеза обнаружено не было) и нарушение структуры митохондриального деривата в процессе элонгации

цист при сверх-экспрессии генов тусМег345'635 и тусМег+ (в случае эктопической экспрессии других конструкций такого фенотипа мы не наблюдали).

Усеченные формы белка тусМег345"635 и mycMer+ имеют одну общую структурную особенность, это наличие нормального функционального С-концевого участка белка. Вероятно, этот участок играет важную роль в формировании и правильном функционировании митохондрий на поздних этапах сперматогенеза, а именно, в процессе элонгации цист. Возможно, С-концевой участок белка при эктопической экспрессии в зародышевой линии на фоне нормального белка мерлин в клетке, способен вступать в конкурентные взаимодействия с нормальным мерлином за определенные сайты связывания с другими белками, например, за фосфорилирование РАК и РКА киназами. Однако, тусМег3 и шусМег в также имеют нормальный С-концевой участок. Следовательно, в этих формах белка С-концевой домен должен быть нефункциональным. Это возможно, если конформация этих форм белка закрытая, то есть N- и С- концевые домены белка связаны.

Таким образом, исходя из сходного спектра нарушений, вызванных сверхэкспрессией тусМег1'379, тусМег3 и тусМегЛБВ, мы приходим к выводу, что эти формы белка находятся в закрытой конформации и прочно связаны с мембраной. Закрытая форма мерлина нефосфорилированная по положению 559 (соответствует положению 518 в белке человека), связывается с кортикальным актином и участвует в формировании кортекса (Curto, 2007). Избыток такой формы белка, приводит к тому, что в результате прочного связывания плазматической мембраны клетки и кортикального актинового цитоскелета затрудняется процесс цитокинеза и разделения мембран.

У дрозофилиного гомолога белка не было описано альтернативного сплайсинга гена Merlin и не было обнаружено существования различных изоформ, как это было показано для белка человека. Но были показаны конформационные переходы и внутримолекулярные взаимодействия внутри молекулы белка (Curto et al., 2007; Muränen et al., 2007). Стабилизация форм осуществляется путем фосфорилирования двух сайтов на N- и на С-концевых доменах. Открытая и фосфорилированная форма белка по положению 559 (518) способна образовывать гетеродимеры с эзрином и давать сигнал к пролиферации клеток. Открытая и нефосфорилированная форма белка участвует в стабилизации и полимеризации микротрубочек путем связывания с ними. В мерлине есть два сайта связывания с микротрубочками на N- и на С- конце белка, которыми мерлин, как линкер, может соединять соседние микротрубочки (Muränen et al., 2007). В такой форме мерлин участвует в агломерации митохондрий и формировании компактной структуры небенкерна на стадии «луковицы» в сперматогенезе дрозофилы. Закрытая и нефосфорилированная по положению 559 (518) форма мерлина участвует в связывании с кортикальным актином и контролирует пролиферацию клеток (Curto et al., 2007). Избыток такой формы мерлина в клетке приводит к нарушениям цитокинеза, как в мейозе, так и в митозе.

Копформации мерлина в клетке в норме

С-конец

Закрытая нефосфорнлнроаанная

Открытая нефосфорилированная

4-vfl

Открытая фосфорилнрованная

При эктопической экспрессии разных аллелей гена Merlin возникает: mycMer3

mycMer1"1 ^^^^

Избыток белка в

c-тус eisiS^J «>«кР"той»

¡Г' "I.; . конфоомации

mycMer'

Избыток белка в закрытой копформации, т.к. эта конфо'/миЛЬ:! белка аналогична закрытой форме

Нарушения цитокинеза

Избыток мерлина в открытой

нефосфорилированной

Нарушения структуры

митохондриального

деривата

Рис.5. Схема конформационных внутримолекулярных переходов в белке мерлин иллюстрирующая предлагаемую нами гипотезу.

Заключение

В настоящей работе удалось найти ранее неизвестную функцию белк^ мерлин, это участие в процессе морфогенеза митохондриального тельца -небенкерна. В связи с этим возникает вопрос, есть ли подобный эффект % млекопитающих? Обнаруженный нами дефект цитокинеза в мейозе самцо£ возникает как под действием мутаций гена, так и при эктопической экспрессии Изучение более широкого спектра мутаций, затрагивающих формирование! небенкерна, позволит ответить на вопрос - имеется ли причинная связь межд, эффектом мутаций на формирование митохондриального тельца и на цитокинез.

Другим важным аспектом функционирования белка мерлин является роль отдельных белковых доменов в выполнении различных функций. Наше

исследование позволило выявить особую роль района «Blue Box» и С-концевого участка белка в сперматогенезе. Исходя из результатов, полученных на клетках млекопитающих, для объяснения роли этих доменов в регуляции активности белка необходимо предполагать наличие конформационных переходов между открытой и закрытой формой белка. Известно, что такие конформационные переходы связаны с фосфорилированием белка мерлин. Потому в дальнейшем мы планируем создать конструкции, кодирующие константно фосфорилированную и константно нефосфорилированную по положению 559 формы белка мерлин и проанализировать влияние их эктопической экспрессии на процесс сперматогенеза и на развитие соматических тканей. Такие эксперименты позволят глубже понять связь функций и конформаций белка мерлин, предложенную в диссертации. Также планируется провести более детальные электронномикроскопические исследования нарушений морфогенеза митохондрий, вызванных эктопической экспрессией С-концевого участка белка и полноразмерного белка мерлин, в генеративной ткани самцов дрозофилы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что мутации гена Merlin приводят к нарушениям цитокинеза в мейозе самцов, поляризации и элонгации сперматид и аномалиям в формировании митохондриального деривата.

2. Изучена локализация белка мерлин в клетках зародышевого пути самцов D. melanogaster. Показано, что белок в сперматоцитах имеет кортикальную локализацию, которая в мейозе сменяется на митохондриальную. Такая локализация далее сохраняется и на последующих стадиях сперматогенеза. В зрелых спермиях также обнаруживается локализация белка на акросомах.

3. Получены линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей, кодирующих различные усеченные формы белка мерлин, в векторе pUASp, который позволяет экспрессировать целевой трансген в клетках зародышевой линии самцов D. melanogaster {UASp-mycMer+, UASp-mycMer145'635. UASp-mycMer3, UASp-mycMerASB, UASp-mycMer'~m, UASp-mycMer1''69).

4. Показано, что данные конструкции позволяют эктопически экспрессировать полноразменую и усеченные копии белка в клетках зародышевого пути самцов и в соматической ткани.

5. Анализ нарушений сперматогенеза, произошедших в результате эктопической экспрессии полученных конструкций в зародышевой линии клеток самцов D. melanogaster, выявил два различающихся доминантных фенотипа:

1) сверх-экспрессия генов тусМег1'379, тусМег* и тусМегАВВ, кодирующих мутантные белки вызывает нарушения цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе. Этот фенотип хорошо согласуется с фенотипом изученных мутаций гена Merlin.

2) сверх-экспрессия генов тусМег345'633 и тусМег+ вызывает нарушения элонгации цист и структуры митохондриальных дериватов. Последнее хорошо согласуется с полученными сведениями о локализации бежа на митохондриальном деривате.

6. Предложена модель функционирования белка мерлин, основанная на конформационных внутримолекулярных переходах между открытой и закрытой формами, обобщающая полученные нами результаты и ранее известные литературные данные.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Dorogova N.V., Akhmametyeva Е.М., Kopyl SA., Gubanova N.V., Yudina O.S. Omelyanchuk L.V. and Chang L.S. The Role of Drosophila Merlin in Spermatogenesis / BMC Cell Biology. 2008. Jan 10;9:1.

2. Юдина O.C., Гусаченко A.M., Ахмаметьева E.M., Омельянчук JI.B Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по опухолевом супрессору Merlin // Генетика. 2008. Т. 44. №3. С. 357-359.

3. Юдина О.С., Галимова Ю.А. Структурный анализ супрессора опухоле Merlin с помощью трансгенных конструкций в сперматогенезе Drosophila. / Информационный Вестник ВОГиС. 2008а. Том 12. №3. С. 406-411.

4. Юдина О.С., Дорогова Н.В., Галимова Ю.А., Омельянчук JI.B. Различи функций супрессора опухолей Merlin в соматической и генеративной тканях самцо дрозофилы // Сборник научных статей: I Международной конференции «Дрозофил в экспериментальной генетике и биологии» Харьков-2008. С. 131-134.

5. Болоболова Е.У., Дорогова Н.В., Юдина О.С., Омельянчук Л.В., Чанг Л.Ш Влияние эктопической экспрессии гена-супрессора опухоли Merlin на морфогене митохондрий в сперматогенезе Drosophila melanogaster II Сборник научных статей I Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике биологии» Харьков-2008. С. 107-119.

6. Yudina O.S., Perceva Y.A., Dorogova N.V.,Omelyanchuk L.V., Chang L.S., Feho R.G. The Role of Tumor-Supressor Merlin Protein Domains in Drosophila melanogaste Spermatogenesis // the 8th Japanese Drosophila Research Conference. 2007. P. 124.

7. Юдина O.C., Нерушева O.O., Дорогова H.B., Омельянчук Л.В. Визуализащ динамики мембран ЭПР в спермио- и сперматогенезе с использованием GFP маркеров на модели Drosophila melanogaster // X Международная молодежи Школа-конференция, сентябрь 2006 г. С. 53.

Подписано к печати 26.01.2009 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 100. Заказ № 13

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юдина, Ольга Сергеевна

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

1.4. Апробация работы

1.5. Структура и объем работы

1.6. Публикации

1.7. Вклад автора

1.8. Благодарности

1.9. Список использованных сокращений

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Онкогенез и тумор-супрессоры

2.2. Нейрофиброматоз 2 типа

2.3. Характеристика белкового семейства ERM

2.3.1. Функциональная организация

2.3.2. Регуляция активности ERM белков

2.4. MERLIN - особый член семейства ERM

2.4.1. Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования

2.4.2. Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками

2.4.3. Модельные организмы для изучения белка мерлин

2.4.4. Локализация белка мерлин в органах и тканях

2.4.5. Гомология дрозофилиного и человеческого мерлина

2.4.6. Участие белка мерлин в сигнальных путях и его тумор-супрессорные свойства

2.4.7. Характеристика мутаций гена Merlin у дрозофилы

2.4.8. Функциональные домены белка мерлин, необходимые для его активности и правильной внутриклеточной локализации

2.4.8.1. Внутриклеточая локализация усеченных форм мерлина

2.4.8.2. Способность усеченных форм мерлина спасать летальный эффект мутации Мег

2.4.8.3. Фенотипы, наблюдаемые при сверхэкспрессии 30 усеченных и мутантных форм мерлина

2.5. Основные этапы сперматогенеза у дрозофилы

2.6. Использование системы GAL4-UAS для изучения функций продуктов генов 38 Заключение по обзору литературы:

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними

3.2. Выделение геномной ДНК дрозофилы

3.3. Проведение полимеразной цепной реакции

3.4. Очистка продуктов ПНР

3.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и ее очистка

3.6. Трансформация E.coli плазмидной ДНК

3.7. Выделение плазмидной ДНК

3.8. Лигирование ДНК

3.9. Трансформация компетентных клеток E.coli лигазной смесью

3.10. Отбор клонов, содержащих плазмиду со встройкой гена, кодирующего мутантную форму белка мерлин

3.11. Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из клонов E.coli после трансформации лигазной смесью

3.12. Определение нуклеотидной последовательности полученных конструкций

3.13. Трансформация клеток зародышевого пути D. melanogaster

3.14. Иммуноцитохимическое окрашивание крыловых имагинальных дисков и семенников

3.15. Окраска семенников DAPI

3.16. Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen)

3.17. Окраска семенников ацетоорсеином

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin

4.2. Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы

4.3. Нарушение поляризации цист у мутантов Мег3 и Мег

4.4. Электронномикроскопические исследования семенников

4.5. Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp

4.5.1. Анализ эктопической экспрессии мутантных вариантов белка мерлин в соматической ткани

4.5.2. Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin

4.6. Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по тещ Merlin

4.7. Эктопическая экспрессия усеченных копий тепа Merlin в сперматогенезе на фоне нормального белка мерлин

4.7.1. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer+ и UASp-7пусМег345'635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

4.7.2. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer3, UASp-mycMerи UASp-mycMerна сперматогенез на фоне нормального белка мерлин

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Восстановление жизнеспособности мутации Мег4 в соматической ткани

5.2. Отличие усеченной формы мерлина шусМег1"330 от шусМег1"

5.3. Восстановление сперматогенеза у самцов Мег4 при эктопической экспрессии различных форм мерлина

5.4. Роль белка мерлин в соматической и генеративной тканях

5.5. Значение С-концевого домена мерлина в сперматогенезе дрозофилы

5.6. Значение мерлина в стабилизации структуры небенкерна

5.7. Участие мерлина в цитокинезе

5.8. Сравнительный анализ нарушений, вызванных мутациями гена Merlin, и нарушений, возникающих в результате эктопической экспрессии

5.9. Внутриклеточная локализация мерлина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster"

1.1. Актуальность проблемы

Среди известных тумор-супрессоров интересен открытый в 1993 году ген Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий белок мерлин (или шванномин), принадлежащий к суперсемейству р4.1 - большой группе цитоплазматических белков, связанных с мембраной. Наибольшую степень сходства он имеет с белками подсемейства ERM (EZRIN- RADIXIN-MOESIN). Отсюда название MERLIN - MOESIN-EZION-RADIXIN-Iike-protein. Мутация этого гена вызывает у человека заболеванием нейрофиброматоз второго типа, характеризующееся формированием билатеральной акустической шванномы, поражающей восьмую пару черепно-мозговых нервов, а также других опухолей, ассоциированных с центральной нервной системой, таких как менингиомы и эпендимомы (Martuza, Eldridge, 1988; Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993).

Что касается дрозофилы, то она тоже подходит для изучения функций белка мерлин, несмотря на отсутствие шванновских клеток - мишени болезни у человека. Эксперименты с использованием мутаций с потерей функций мерлина и FLP-FRT системы для получения соматических мозаичных клонов мутантных эпителиальных клеток показали, что, как и у млекопитающих, мерлин-дефицитные клетки дрозофилы характеризуются гиперплазией. Таким образом, мерлин выполняет функцию тумор-супрессора и у дрозофилы (LaJeunesse et al., 1998).

К настоящему времени описаны четыре мутации гена Merlin у дрозофилы. Ни один из аллелей не вызывает эмбриональной гибели, три из этих мутаций, Мег1, Мег2, Мег4 , вызывают гибель на стадии личинки и куколки. Единственный жизнеспособный аллель - Мег3. Мухи, гомозиготные по Мег3, доживают до взрослого состояния, но стерильны, их крылья более широкие, для глаз характерна нерегулярность фасеток, а на голове образуются аномальные кутикулярные структуры (Fehon et al., 1997).

Чтобы выяснить, каким образом мутация Мег3 вызывает стерильность самцов, нами были проведены исследования сперматогенеза. Drosophila melanogaster. Сперматогенез объединяет в себе два типа клеточных делений: митотическое и мейотическое, а также процессы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, он является удобной экспериментальной моделью для изучения функций белков на клеточном и молекулярном уровнях. Нами было обнаружено, что мутация Мег3 влияет на процессы компактизации ядер и поляризации цисты, что приводит к серьезным нарушениям сперматогенеза на стадии индивидуализации спермиев, что и вызывает стерильность самцов.

Ранее было показано, что мутация Мег3 затрагивает особый участок белка - «Blue Box» (170YQMTREM177), который идентичен у человеческого и дрозофилиного гомологов белка. Он имеет важное значение для правильного функционирования белка (LaJeunesse et al., 1998). Для изучения этого района, а также других функциональных доменов мерлина, были созданы конструкции, кодирующие различные мутантные и усеченные копии белка на основе вектора pUAST, который позволяет экспрессировать копии генов в соматической ткани в системе GAL4-UAS (LaJeunesse et al., 1998). Спецификой нашей работы является использование модифицированного UAS-вектора — pUASp, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии белков в генеративных тканях дрозофилы (Rorth, 1998).

Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые для правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции на основе вектора pUASp, кодирующие различные мутантные формы мерлина. Нами было показано, что белок мерлин, который является тумор-супрессором в соматических тканях дрозофилы, играет существенную роль в процессах сперматогенеза. В частности, открытая форма белка участвует в агломерации митохондрий на стадии «луковицы», а закрытая влияет на цитокинез в мейозе. Таким образом, в соматической и генеративной тканях мерлин функционирует по-разному.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Юдина, Ольга Сергеевна

ВЫВОДЫ:

3. Получены линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей, кодирующих различные усеченные формы белка мерлин, в векторе pUASp, который позволяет экспрессировать целевой трансген в клетках зародышевой линии самцов D. melanogaster (UASp-mycMer+, UASp-mycMer345'635, UASp-mycMer3, UASp-mycMer^8, UASp-mycMer1' 379, UASp-mycMer1'169).

1) сверх-экспрессия генов тусМег1'379, тусМег3 и тусМегАВВ, кодирующих мутантные белки вызывает нарушения цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе. Этот фенотип хорошо согласуется с фенотипом изученных мутаций гена Merlin.

2) сверх-экспрессия генов тусМег345'635 и тусМег+ вызывает нарушения элонгации цист и структуры митохондриальных дериватов. Последнее хорошо согласуется с полученными сведениями о локализации белка на митохондриальном деривате. 6. Предложена модель функционирования белка мерлин, основанная на конформационных внутримолекулярных переходах между открытой и закрытой формами, обобщающая полученные нами результаты и ранее известные литературные данные.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Ген Merlin дрозофилы, гомолог гена человека Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий супрессор опухолей мерлин, играет важную роль в процессе клеточной пролиферации и у дрозофилы. Особи, несущие мутацию Мег3

1ПП

Met1 "-»lie) в этом гене, жизнеспособны, но стерильны (LaJeunesse, 1998). Учитывая, что сперматогенез является удачной моделью, сочетающей пролиферацию клеток, их морфологическую дифференцировку, а также два типа клеточных делений, мы решили сконцентрироваться на исследовании функционирования этого супрессора опухолей в зародышевой линии самцов D. melanogaster.

У самцов, гемизиготных по мутации Мег3, образуется лишь небольшое количество зрелых, но неподвижных спермиев. Головки спермиев'в пределах одной цисты рассеяны, в то время как в норме все головки спермиев выглядят как один большой пучок. Были обнаружены нарушения на разных этапах сперматогенеза у самцов Мег3 такие как: нарушения цитокинеза на стадии предмейотического митоза и в мейозе, трехполюсные и четырехполюсные веретена деления в сперматоцитах в течение второго деления мейоза, которые являются результатом неполного цитокинеза в предыдущем мейотическом делении. Были обнаружены дефекты поляризации мутантных цист, следствием которого является фенотип «разбросанных» головок спермиев. Ранее процесс поляризации цист был описан и назван таковым в работе (Cross and Shellenbarger, 1979), где проводилось прижизненное изучение сперматогенеза. В обзоре (Lindsley, Tokyuasu 1978) также имеется описание этого процесса, исходя из данных электронной микроскопии, причем название «поляризация» цист не было использовано. Каких- либо данных о генетическом контроле этого процесса до выполнения настоящей работы не было.

Для того, чтобы определить каким образом функционирует белок мерлин в клетке и для того, чтобы понять каким образом отсутствие нормального белка мерлин в клетке вызывает весь вышеописанный каскад нарушений сперматогенеза, мы создали конструкции на основе вектор pUASp, позволяющие экспрессировать трансгенные конструкции, а именно, различные усеченные копии белка мерлин, в зародышевой линии дрозофилы. Усеченные копии гена Merlin были созданы на основе уже существующих и описанных в работе (LaJeunesse et al., 1998) конструкций клонированных ранее в векторе pUAST, который обеспечивает экспрессию только в соматической ткани.

Наши конструкции позволяют эктопически экспрессировать полноразменую и усеченные копии белка, как в клетках зародышевого пути самцов, так и в соматической ткани. Полученная нами эктопическая экспрессия в соматической ткани более интенсивна по сравнению с таковой у исходных конструкций на основе pUAST вектора. j л

Мы показали, что фертильность мутантов Мег и Мег полностью восстанавливается при экспрессии в зародышевой линии самцов нормального гена Merlin. Этот факт свидетельствует о том, что наблюдаемый фенотип не является вторичным эффектом мутации, а наблюдаемые нарушения в сперматогенезе самцов, мутантных по гену Merlin, вызваны мутацией именно в этом гене.

Проанализировав нарушения сперматогенеза, которые происходили в результате эктопической экспрессии полученных конструкций в зародышевой линии клеток самцов D. melanogaster, мы выявили два различающихся доминантных фенотипа: нарушение цитокинеза в предмейотических митозах и в мейозе при сверх-экспрессии генов mycMer1'379, mycMer3 и тусМегмв (при сверх-экспрессии генов mycMer345'635 и тусМег+ нарушений цитокинеза обнаружено не было) и нарушение структуры митохондриального деривата в процессе элонгации цист при сверх-экспрессии генов mycMer345'635 и тусМег+ (в случае эктопической экспрессии других конструкций такого фенотипа мы не наблюдали).

Усеченные формы белка mycMer345"635 и mycMer+ имеют одну общую структурную особенность, это наличие нормального функционального Сконцевого участка белка. Вероятно, этот участок играет важную роль в формировании и правильном функционировании митохондрий на поздних этапах сперматогенеза, а именно, в процессе элонгации цист. Возможно, С-концевой участок белка при эктопической экспрессии в зародышевой линии на фоне нормального белка мерлин в клетке, способен вступать в конкурентные взаимодействия с нормальным мерлином за определенные сайты связывания с другими белками, например, за фосфорилирование РАК и РКА киназами. Однако, mycMer3 и тусМеглвв также имеют нормальный С-концевой участок. Следовательно, в этих формах белка С-концевой домен должен быть нефункциональным. Это возможно, если конформация этих форм белка закрытая, то есть N- и С- концевые домены белка связаны.

Таким образом, исходя из сходного спектра нарушений, вызванных сверхэкспрессией mycMer1"379, mycMer3 и mycMer^0, мы приходим к выводу, что эти формы белка: находятся в закрытой конформации и прочно связаны с мембраной. Закрытая форма мерлина нефосфорилированная по положению 559 (соответствует положению 518 в белке человека), связывается с кортикальным актином и участвует в формировании кортекса (Curto, 2007). Избыток такой формы белка, приводит к тому, что в результате прочного связывания плазматической мембраны клетки и кортикального актинового цитоскелета, затрудняется процесс цитокинеза и разделения мембран.

Полученные нами результаты и литературные данные свидетельствуют о том, что разные формы мерлина в разных тканях и процессах функционируют по-разному (схема возможных внутримолекулярных ассоциаций в мерлине представлена на Рис. 23). У дрозофилиного гомолога белка не было описано альтернативного сплайсинга гена Merlin и не было обнаружено существования различных изоформ, как это было показано для белка человека. Но были показаны конформационные переходы и внутримолекулярные взаимодействия внутри молекулы белка (Curto et al., 2007; Muränen et al., 2007). Стабилизация форм осуществляется путем фосфорилирования двух сайтов на N- и на Сконцевых доменах. Открытая и фосфорилированная форма белка по положению 559 (518) способна образовывать гетеродимеры с эзрином и давать сигнал к пролиферации клеток. Открытая и нефосфорилированная форма белка участвует в стабилизации и полимеризации микротрубочек путем связывания с ними. В мерлине есть два сайта связывания с микротрубочками на N- и на С- конце белка, которыми мерлин, как линкер, может соединять соседние микротрубочки (Muränen et al., 2007). В такой форме мерлин участвует в агломерации митохондрий и формировании компактной структуры небенкерна на стадии «луковицы» в сперматогенезе дрозофилы. Закрытая и нефосфорилированная по положению 559 (518) форма мерлина участвует в связывании с кортикальным актином и контролирует пролиферацию клеток (Curto et al., 2007). Избыток такой формы мерлина в клетке приводит к нарушениям цитокинеза, как в мейозе, так и в митозе.

В настоящей работе удалось найти ранее неизвестную функцию белка в процессе морфогенеза митохондриального тельца — небенкерна. В связи с этим возникает вопрос, есть ли подобный эффект у млекопитающих? Найденный нами дефект цитокинеза в мейозе самцов возникает как под действием мутаций гена, так и при эктопической экспрессии. Изучение более широкого спектра мутаций, затрагивающих формирование небенкерна, позволит ответить на вопрос - имеется ли причинная связь между эффектом мутаций на формирование митохондриального тельца и на цитокинез.

Другим важным аспектом функционирования белка мерлин является роль отдельных белковых доменов в выполнении различных функций. Наше исследование позволило выявить особую роль района «Blue Box» и С-концевого участка белка в сперматогенезе. Исходя из результатов, полученных на клетках млекопитающих, для объяснения роли этих доменов в регуляции активности белка необходимо предполагать наличие конформационных переходов между открытой и закрытой формой белка. Известно, что такие конформационные переходы связаны с фосфорилированием белка мерлин. Потому в дальнейшем мы планируем создать конструкции, кодирующие константно фосфорилированную по положению 559 (518) и константно нефосфорилированную по этому же положению формы белка мерлин, и проанализировать влияние их эктопической экспрессии на процесс сперматогенеза и на развитие соматических тканей. Такие эксперименты позволят глубже понять связь функций и конформаций белка мерлин, предложенную в диссертации. Также планируется провести более детальные электронномикроскопические исследования нарушений в агломерции митохондрий, вызванных эктопической экспрессией С-концевого участка белка и полноразмерного белка мерлин, в генеративной ткани самцов дрозофилы.

Рис.23. белке мерлин,

Схема конформационных внутримолекулярных иллюстрирующая предлагаемую нами гипотезу. переходов в

Конформации мерлина в клетке в норме

С-конси

Ы-конеч 'ЫЫ-соИ ¿опта л

1а к рыгн я

11 рфпсфо]! II-1IIР П ВЯ1111И Я

Открытая нсфосфорилнровэнная

Открытая фосфор н л н ро ыа нн ая

При эктопической экспрессии разных аллелей гена МегНп возникает: туе Мег1 тусМегАВВ

С-тус

Избыток белка в «закрытой» конформации

В!ие Вох»

Нарушения цитокинеза тусМег'

Избыток белка в закрытой конформации, т.к. эта -1 кон формация белка аналогична закрытой форме

Нарушения цитокинеза туе Мег34*

Избыток мерлина в открытой нефосфорилирован ной форме

Нарушения структуры мнтохондриального деривата шусМег+

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юдина, Ольга Сергеевна, Новосибирск

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки // Издательство «Мир», Москва. 1987. Т.З. С. 92.

2. Бурнашева С.А., Габаева Н.С., Данилова Л.В. Современные проблемы сперматогенеза // Издательство «Наука», Москва. 1982. С. 60.

3. Чадов Б.Ф. От феномена нерасхождения к проблеме коориентации хромосом // Генетика. 1991. Т. 27. № 11. С. 1877-1903.

4. Шилова И.Э., Омельянчк Л.В. Метод трансформации клеток зародышевого пути дрозофилы высококонцентрированной экзагенной ДНК // Генетика. 2007. Т. 43 №1. С. 1-4.

5. Amieva M. R., Wilgenbus К. K., Furthmayr H. Radixin is a component of hepatocyte microvilli in situ // Exp. Cell Res. 1994. V.210. P. 140-144.

6. Antinheimo J., Sankila R., Carpen O., Pukkala E., Sainio M., Jaaskelainen J. Population-based analysis of sporadic and type 2 neurofibromatosis-associated meningiomas and schwannomas // Neurology. 2000. V. 54. P. 71-76.

7. Ashburner M., Golic K.G., Hawley R.S. Drosophila a laboratory handbook // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2005. P. 1409.

8. Baser M.E., Friedman J.M., Aeschliman D., Joe H., Wallace A J., Ramsden R.T., Evans D.G. Predictors of the risk of mortality in neurofibromatosis 2 // Am J Hum Genet. 2002. V. 71. P. 715-723.

9. Bender W., Pierre S., Hognes D.S. et ah, Chromosomal walking and jumping to isolate DNA from Ace and rosy loci of bithorax loci in Drosophila melanogaster I I J. Mol. Biol. 1983. V. 168. P. 17-33.

10. Berryman M., Gary R., Bretscher A. Ezrin oligomers are major cytoskeletal components of placental microvilli: a proposal for their involvement in cortical morphogenesis // J Cell Biol. 1993. V. 131. P. 12311242.

11. Brand A.H., Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes // Development. 1993. V.118. P.401-415.

12. Bretscher A. Purification of an 80,000-dalton protein that is a component of the isolated microvillus cytoskeleton, and its localization in nonmuscle cells // J Cell Biol. 1983. V. 97. P. 425-432.

13. Bretcher A., Edwards K., Fehon R. G. ERM proteins and Merlin: integrators at the cell cortex // Nature. 2002. V.3. P.586-599.

14. Brick D., Lifschitz E., Friedlander M. Mitochondria Differentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Ultrastructural Analysis in the Male Sterile Mutant ms (1) 413 // Journal of Ultrastructure Research. 1979. V. 66. P. 151-163.

15. Brook W.J., Diaz-Benjumea F.J., Cohen S.M. Organizing spatial pattern in limb development // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996 V. 12. P. 161180.

16. Capdevila J., Guerrero I. Targeted expression of the signaling molecule decapentaplegic induces pattern duplications and growth alterations in Drosophila wings // EMBO J. 1994. V.13. p.4459-4468.

17. Claudio J.O., Lutchman M., Rouleau G.A. Widespread but cell type-specific expression of the mouse neurofibromatosis type 2 gen // Neuroreport. 1995. V. 6. P. 1942-1946.

18. Cross D.P., Shellenbarger D.L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures // J. Embryol. Exp. Morph. 1979. 53:345-351.

19. Curto M., Cole B.K., Lallemand D., Liu C.H., McClatchey A.I. Contact-dependent inhibition of EGFR signaling by Nf2/Merlin // The Journal of Cell Biology. 2007. Vol. 177, No. 5. P. 893-903.

20. Dalmay T., Edwards D.R. MicroRNAs and the hallmarks of cancer// Oncogene. 2006. V. 25. P.6170-6175.

21. Edgar B.A. From cell structure to transcription: Hippo forges a new path // Cell. 2006. 124: 267-273.

22. Fabrizio J, Hime G., Lemmon S., Bazinet C. 1998. Genetic Dissection of sperm individualization in Drosophila melanogaster. Development 125: 1833-1843.

23. Franck Z, Gary R, Bretscher A. Moesin, like ezrin, colocalizes with actin in the cortical cytoskeleton in cultured cells, but its expression is more variable//J Cell Sci. 1993. V. 105 (Ptl). P.219-31.

24. Fuller M., Bate M. and Arias AM. Spermatogenesis. In The Development of Drosophila melanogaster //Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. 1993. P.71-147.

25. Gary R., Bretscher A. Heterotypic and homotypic associations between ezrin and moesin, two putative membrane-cytoskeletal linking proteins // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.10846-10850.

26. Gary R., Bretscher A. Ezrin self-association involves binding of an N-terminal domain to a normally masked C-terminal domain that includes the F-actin binding site // Mol. Biol. Cell. 1995. V.6. P.1061-1075.

27. Gatt M.K., Glover D.M. The Drosophila phosphatidylinositol transfer protein encoded by vibrator is essential to maintain cleavage-furrow ingression in cytokinesis // Journal of Cell Science. 2006. V. 119. P. 22252235.

28. Gautreau A., Manent J., Fievet B., Louvard D., Giovannini M., Arpin M. Mutant products of the NF2 tumor suppressor gene are degraded by the ubiquitin-proteasome pathway 11 J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 3127931282.

29. Giansanti M.G., Farkas R.M., Bonaccorsi S. et al. Genetic Dissection of Meiotic Cytokinesis in Drosophila Males // Molecular Biology of the Cell. Vol. 15. P. 2509-2522.

30. Golovnina K., Blinov A., Akhmametyeva E.M., Omelyanchuk L.V., Chang L.S. Evolution and origin of merlin, the product of the

31. Neurofibromatosis type 2 (NF2) tumor-suppressor gene // BMC Evol Biol. 2005. V. 5. P. 69.

32. Gonzalez-Agosti C., Xu L., Pinney D., Beauchamp R., Hobbs W., Gusella J., Ramesh V. The merlin tumor suppressor localizes preferentially in membrane ruffles // Oncogene. 1996. V.13. P. 1239-1247.

33. Gould K. L., Cooper J. A., Bretscher A. & Hunter T. The protein-tyrosine kinase substrate, p81, is homologous to a chicken microvillar core protein // J. Cell Biol. 1986. V.102. P.660-669.

34. Grossniklaus U., Bellen H.J., Wilson C., Gehring WJ. P-element-mediated enhancer detection applied to the study of oogenesis in Drosophila // Development 1989. Oct; 107(2): 189-200.

35. Gutmann D. H. et al The NF2 interactor, hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS), associates with merlin in the 'open' conformation and suppresses cell growth and motility // Hum. Mol. Genet 2001. V. 10. P. 825-834.

36. Hara T., Bianchi A.B., Seizinger B.R., Kley N. Molecular cloning and characterization of alternatively spliced transcripts of the mouse neurofibromatosis 2 gene // Cancer Res. 1994. V. 54. P.330-335.

37. Hemann M.T., Narita M. Oncogenes and senescence: breaking down in the fast lane // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 1-5.

38. Huynh D.P., Tran T.M., Nechiporuk T., Pulst S.M. Expression of neurofibromatosis 2 transcript and gene product during mouse fetal development // Cell Growth Differ. 1996. V. 7. P. 1551-1561.

39. Huang A.M., Rubin G.M. Amisexpression screen identi fies genes that can modulate RAS1 pathway signaling in Drosophila melanogaster // Genetics. 2000. V. 156. P. 1219-1230.

40. Jin H, Sperka T, Herrlich P. Tumorigenic transformation by CPI-17 through inhibition of a merlin phosphatase. // Nature. 2007. 442:576-579.

41. Jindal H.K., Yoshinaga K., Seo P.S., Lutchman M., Dion P.A., Rouleau G.A., Hanada T., Chishti A.H. Purification of the NF2 tumor suppressor protein from human erythrocytes // Can J Neurol Sci. 2006. V. 33. P. 394-402.

42. Kang B. S., Cooper D. R., Devedjiev Y., Derewenda U., Derewenda Z. S. The structure of the FERM domain of merlin, the neurofibromatosis type 2 gene product // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2002. V.58. P.381-391.

43. Kastan M. B. Wild-type p53: tumors can't stand it //Cell. 2007. V.128. P.837-840.

44. Kissil J. L., Johnson K. C., Eckman M. S., Jacks T. Merlin phosphorylation by p21-activated kinase 2 and effects of phosphorylation on merlin localization // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.10394—10399.

45. Knudson A.G.Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proc Natl Acad Sci USA. 1971. V. 68. P. 820-823.

46. Kraut R., Menon K., Zinn K. A gain-of-iunction screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila // Curr Biol. 2001. V. 11(6). P. 417-430.

47. LaJeunesse D. R., McCartney B. M. & Fehon R. G. Structural analysis of Drosophila merlin reveals functional domains important for growth control and subcellular localization // J. Cell Biol. 1998. V.141. P.1589-1599.

48. LaJeunesse D. R., McCartney B.M., Fehon R.G. A systematic screen for dominant second site modifiers of Merlin/NF2 phenotypes reveals an interaction with blistered/DSRF and scribbler.// Genetics. 2001. 158:667679.

49. Lallemand D., Curto M., Saotome I., Giovannini M., McClatchey A.I. NF2 deficiency promotes tumorigenesis and metastasis by destabilizing adherens junctions // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 1090-1100.

50. Lankes W., Griesmacher A., Grunwald J., Schwartz-Albiez R., Keller R. A heparin-binding protein involved in inhibition of smooth-muscle cell proliferation // Biochem. J. 1988. V.251. P.831-842.

51. Lasota J., Fetsch J.F., Wozniak A., Wasag B., Sciot R., Miettinen M. The neurofibromatosis type 2 gene is mutated in perineurial cell tumors: a molecular genetic study of eight cases // Am J Pathol. 2001. V. 158. P. 12231229.

52. Laulajainen M., Muranen T., Carpen O., Gronholm M. Protein kinase A-mediated phosphorylation of the NF2 tumor suppressor protein merlin at serine 10 affects the actin cytoskeleton // Oncogene. 2007 Dec 10. Epub ahead of print.

53. Li Q., Nance M.R., Kulikauskas R., Nyberg K., Fehon R., Karplus P.A., Bretscher A. and Tesmer J.J.G. Self-masking in an Intact ERMmerlin Protein: An Active Role for the Central a-Helical Domain // J. Mol. Biol. (2007) 365, 1446-1459.

54. Lindsley D. L., Tokuyasu K. T. Spermatogenesis 11 In: Genetics and biology of Drosophila, 2nd edition. Academic Press, 1978. P. 225-94.

55. Lomas J., Bello M.J., Aijona D., Alonso M.E. et al. Genetic and epigenetic alteration of the NF2 gene in sporadic meningiomas // Genes Chromosomes Cancer. 2005. V. 42. P. 314-319.

56. Lunde K., Biehs B., Nauber U., Bier E. The knirps and knirpsrelated genes organize development of the second wing vein in Drosophila II Development. 1998. V.125. p.4145-4154.

57. Martuza R.L., Eldridge R. Neurofibromatosis 2 (bilateral acoustic neurofibromatosis) II N. Eng. J. Med. 1988. V.318. P.684-688.

58. McCartney B. M., Fehon R. G. Distinct cellular and subcellular paterns of expression imply distinct functions for the Drosophila homologues of Moesin and the Neurofibromatosis 2 tumor suppressor, merlin // J. Cell Biol. 1996. V.133. P.843-852.

59. McClatchey A. I., Saotome I., Ramesh V., Gusella J. F., Jacks T. The Nf2 tumor suppressor gene product isessential for extraembryonic development immediately prior to gastrulation // Genes Dev. 1997. V.ll. P. 1253-1265.

60. McClatchey A. I., Saotome I, Mercer K, Crowley D, Gusella JF, Bronson RT, Jacks T. Mice heterozygous for a mutation at the Nf2 tumorsuppressor locus develop a range of highly metastatic tumors // Genes Dev. 1998. V.12. P.l 121-1133.

61. McClatchey A, Giovannini M. Membrane organization and tumorigenesis-the NF2 tumor suppressor, Merlin. // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 2265-2267.

62. Miklos G.L, Rubin G.M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms // Cell. 1996. V. 86(4). P.521-529.

63. Morrison H., Sherman LS, Legg J, Banine F, Isacke C, Haipek CA, Gutmann DH, Ponta H, Herrlich P. The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth through interactions with CD44 // Genes Dev. 2001. V.15. P.968-980.

64. Muranen T., Gronholm M., Lampin A., Lallemand D., Zhao F., Giovannini M., Carpen O. The tumor suppressor merlin interacts with microtubules and modulates Schwann cell microtubule cytoskeleton // Hum Mol Genet. 2007. V.16. P. 1742-1751.

65. Muranen T. The Neurofibromatosis 2 tumor suppressor merlin in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Academic dissertation. Helsinki Graduate School in Biotechnology and Molecular Biology. 2007.

66. Murray A., Hunt T. The Cell Cycle. New York: Oxford Univ. Press, 1993.

67. Nakamura F., Amieva M. R. & Furthmayr H. Phosphorylation of threonine 558 in the carboxyl-terminal actin-binding domain of moesin by thrombin activation of human platelets // J. Biol. Chem. 1995. V.270. p.31377-31385.

68. Noguchi T, Miller KG. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. II Development. 2003. V. 130. P. 1805-1816.

69. Obremski V.J., Hall A.M., Fernandez-Valle, C. Merlin, the neurofibromatosis type 2 gene product, and betal integrin associate in isolated and differentiating Schwann cells II J. Neurobiol. 1998. V. 3. P. 487-501.

70. Okada T, You L, Giancotti FG. Shedding light on Merlin's wizardry. II Trends Cell Biol. 2007. 17:222-229.

71. Pakkanen R., Hedman K., Turunen O., Wahlstrom T. & Vaheri A. Microvillus-specific Mr 75,000 plasma membrane protein of human choriocarcinoma cells // J. Histochem. Cytochem. 1987. V.35. P.809-816.

72. Perrimon. N. New advances in Drosophila provide opportunities to study gene functions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.9716-9717.

73. Phelps B.C., Brand H.A. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system // METHODS. 1998. V.14. P.367-379.

74. Pineau P., Marchio A., Cordina E., Tiollais P., Dejean A. Homozygous deletions scanning in tumor cell lines detects previously unsuspected loci II Int J Cancer. 2003. V. 106. P. 216-223.

75. Rong R., Surace E.I., Haipek C.A., Gutmann D.H., Ye K. Serine 518 phosphorylation modulates merlin intramolecular association and binding to critical effectors important for NF2 growth suppression // Oncogene. 2004. V. 23. P. 8447-8454.

76. Rorth P. A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. Oct 29;93(22): 12418-12422.

77. Rorth P. Gal4 in the Drosophila female germline // Mechanisms of Development. 1998. V.78. P. 113-118.

78. Rouleau G. A. et al. Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neurofibromatosis type 2 // Nature. 1993. V.363. P.515-521.

79. Rubin G.M., Spradling A.C. Vectors for P element-mediated gene transfer in Drosophila.il Nucleic Acids Res. 1983 Sep 24;11(18):6341-51.

80. Sainio M, Zhao F, Heiska L, Turunen O et al. Neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein colocalizes with ezrin and CD44 and associates with actin-containing cytoskeleton. // J Cell Sci. 1997. V. 110 ( Pt 18). P. 2249-2260.

81. Sato N., Funayama N., Nagafuchi A., Yonemura S., Tsukita S., Tsukita S. A gene family consisting of ezrin, radixin and moesin. Its specific localization at actin filament/plasma membrane association sites // J Cell Sci. 1992. V. 103 (Pt 1). P. 131-143.

82. Schmucker B., Tang Y., Kressel M. Novel alternatively spliced isoforms of the neurofibromatosis type 2 tumor suppressor are targeted to the nucleus and cytoplasmic granules // Hum Mol Genet.1999. V. 8. P. 1561 -1570.

83. Sekido Y., Pass H.I., Bader S., Mew D.J., Christman M.F., Gazdar A.F., Minna J.D. Neurofibromatosis type 2 (NF2) gene is somatically mutated in mesothelioma but not in lung cancer // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 1227-1231.

84. Sheikh H.A., Tometsko M., Niehouse L., Aldeeb D., Swalsky P., Finkelstein S., Barnes E.L., Hunt J.L. Molecular genotyping of medullary thyroid carcinoma can predict tumor recurrence // Am J Surg Pathol. 2004. V. 28. P. 101-106.

85. Sherr C.J., McCormick F. The RB and p53 pathways in cancer // Cancer Cell. 2002. V. 2. P. 103-112.

86. Sherr CJ. Principles of tumor suppression // Cell. 2004. V. 116. p. 235-246.

87. Shimizu T.3 Seto A., Maita N., Hamada K. Structural basis for Neurofibromatosis type 2. Crystal structure of the merlin FERM domain // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.10332-10336.

88. Stickney J.T., Bacon W.C., Rojas M., Ratner N., Ip W. Activation of the tumor-suppressor merlin modulates its interaction with lipid rafts // Cancer Res. 2004.V. 64. P. 2717-2724.

89. Stewart S.A., Weinberg R.A. Telomeres: cancer to human aging // Annu Rev Cell Dev Biol. 2006. V. 22. P. 531-557.

90. Takeuchi K., Sato N., Kasahara H., Funayama N., Nagafuchi A., Yonemura S., Tsukita S. Perturbation of cell adhesion and microvilliformation by antisense oligonucleotides to ERM family members // J Cell Biol. 1994. V. 125. P. 1371-1384.

91. Toby G.G., Gherraby W., Coleman T.R., Golemis E.A. A novel RING finger protein, human enhancer of invasion 10, alters mitotic progression through regulation of cyclin B levels // Mol Cell Biol. 2003. V. 23. P. 2109-2122.

92. Tokuyasu, K.T. Peacock, W.J., Hardy, R.W. Dinamics of spermatogenesis in Drosophila melanogaster. I. Individualization process // Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 1972. V.124. N.4.p. 479-506.

93. Trofatter J. A., MacCollin M. M., Rutter J. L., Murrell J. RA novel moesin-, ezrin-, radixin-like gene is a candidate for the neurofibromatosis 2 tumor suppressor // Cell. 1993. V.75. P.826.

94. Tseng A.S., Hariharan I.K. An overexpression screen in Drosophila for Genes That Restrict Growth or Cell-Cycle Progression in the Developing Eye // Genetics. 2002. V.162. P. 229-243.

95. Tsuda M., Sasaoka Yu., Kiso M., Abe K., Haraguchi S., Kobayashi S., Saga Yu. Conserved Role of nanos Proteins in Germ Cell Development// Science. 2003. V. 301. P. 1239-1241.

96. Tsukita S., Hieda Y., Tsukita S. A new 82-kD barbed endcapping protein (radixin) localized in the cell-to-cell adherens junction: purification and characterization // J. Cell Biol. 1989. V.108. P.2369-2382.

97. Turunen O, Wahlstrom T, Vaheri A. Ezrin has a COOH-terminal actin-binding site that is conserved in the ezrin protein family.// J Cell Biol. 1994. Sep; 126(6): 1445-53.

98. Van Vactor D.L. Jr., Cagan R.L., Kramer H., Zipursky S.L. Induction in the developing compound eye of Drosophila: multiplemechanisms restrict R7 induction to a single retinal precursor cell. // Cell. 1991. V. 67(6). P. 1145-55.

99. Wikman H., Kettunen E. Regulation of the Gl/S phase of the cell cycle and alterations in the RB pathway in human lung cancer // Expert Rev Anticancer Ther. 2006. V. 6. P. 515-530.

100. Xu H. M. and Gutmann D. H. Merlin differentially associates with the micro tubule and actin cytoskeleton // J. Neurosci. Res. 1998. V.51. P.403-415.

101. Zhang B., Pan X., Cobb G.P., Anderson T.A. microRNAs as oncogenes and tumor-suppressors // Dev Biol. 2007. V. 302. P.l-12.

Информация о работе

Юдина, Ольга Сергеевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila Melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы