Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов

Амелина, Виолетта Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов"

На правах рукописи

Амелина Виолетта Сергеевна

КИСЛЫЕ ПУКЛЕАЗЫ И ИХ РОЛЬ В ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЯХ ВОДНЫХ ОРГАНИЗМОВ

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Петрозаводск 2006

Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, ВЫСОЦКАЯ Римма Ульяновна

доктор биологических наук, ШАРОВА Наталья Петровна доктор биологических наук ОЛЕЙНИК Виктор Михайлович

Московский Государственный областной университет

Защита состоится " о " декабря 2006 года в -лг часов на заседании Диссертационного совета КМ 212.087.01 при Карельском Государственном педагогическом университете по адресу: 185035 Республика Карелия, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17, ауд. 113 главного корпуса.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельского государственного педагогического университета.

Автореферат разослан" ¥ " ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малкиель А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из фундаментальных проблем биологии является проблема адаптации. По определению Дж. Харборна (1985), адаптация «представляет собой способность живых организмов приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды с одновременным повышением вероятности выживания и самовоспроизводства». На клеточном и тканевом уровне приспособительные реакции реализуются, главным образом, за счет качественных и количественных преобразований ферментных систем (Хочачка, Сомеро, 1988).

Многочисленная группа ферментов, осуществляющих расщепление нуклеиновых кислот с образованием фрагментов различной длины, объединяется под названием нуклеазы (Шалот, 1968). Нуклеазы с максимальной активностью при кислых значениях рН локализованы, преимущественно, в лизосомах, где наряду с другими кислыми гидролазами осуществляют различные катабо-лические реакции, лежащие в основе важнейших физиологических и биохимических процессов (Покровский, Тутельян, 1976; Высоцкая, Руокалайнен, 1993). В частности, лизосомальным ферментам принадлежит большая роль в процессах внутриклеточного переваривания биополимеров, аутолгое структур и клеток, утративших своё значение, а также, в процессах оплодотворения, спермато- и оогенеза, метаморфоза, дифференцировки, деления и старения клеток, апоптозе, в защите организма от чужеродных агентов, начальных стадиях иммуногенеза, лизисе тканей при повреждении, детоксикации ксенобиотиков (Покровский, Тутельян, 1976; Немова, Высоцкая, 2004; Кулинский, 1999; Барановский и др., 2004; Griffiths, Isaaz, 1993; Reddy et al., 2001; Evans, Aguilera, 2003; Terman et al., 2006).

Чрезвычайная важность обмена нуклеиновых кислот в жизнедеятельности клетки обусловливает интерес к ферментам их катаболизма. К настоящему моменту детально изучены нуклеазы микроорганизмов (Lyon et al., 2000; Condon, 2003; Person et al., 2003), млекопитающих и человека (Барановский и др., 2004; Ikeda et al., 1997; Brambila et al., 2001; Krieser et al., 2002; Evans, Aguilera, 2003), некоторых насекомых (Бочкова, 1980; Кони-чев и др., 1982; Kawane et al., 2003; Evans et al., 2002). Работы по изучению нуклеаз рыб и других водных организмов единичны (Высоцкая и др., 1980; Бердышев, Бабенюк, 1985; Попов и др., 2003). Экологическая значимость этих ферментов практически не исследована. Между тем, изучение нук-леолитических ферментов именно у водных обитателей, характерной особенностью которых является более тесная связь со средой обитания, могло бы внести существенный вклад в понимание механизмов адаптации ога-низмов на биохимическом уровне.

Цели и задачи исследования. Цель работы - изучение активности кислых РНКаз и ДНКаз морских и пресноводных организмов, принадлежащих к разным таксонам, выяснение роли нуклеаз в приспособительных реакциях гидробионтов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• определить активность кислых нуклеаз в органах и тканях рыб и беспозвоночных гидробионтов;

• исследовать значимость нуклеаз в ответных реакциях пойкилотерм-

ных животных при воздействии на них естественных и антропогенных факторов среды;

• изучить фракционный состав кислых нуклеаз у разных видов гидро-бионтов;

• выяснить возможность применения исследуемых показателей в эколо-го-биохимическом мониторинге водоемов.

Научная новизна работы. Получены новые данные по изменению активности и молекулярной гетерогенности состава кислых нуклеаз морских и пресноводных гидробионтов под действием естественных факторов среды (соленость, гипоксия) и различных типов антропогенного загрязнения водоемов (тяжелые металлы, нефтепродукты, компоненты буровых растворов). Впервые показана возможность применения теста активности ли-зосомальных нуклеаз для оценки химических взаимовлияний животных в сообществах обрастания. Впервые исследована нуклеазная активность ли-зосом морских беспозвоночных. Охарактеризован спектр изоформ кислой дезоксирибонуклеазы у ранее не изученных в этом отношении объектов.

Практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о роли лизосомальных нуклеаз в биохимических адаптаци-ях водных организмов к естественным, антропогенным и биотическим факторам окружающей среды. Результаты исследований по влиянию различных типов загрязнения воды на исследуемые биохимические показатели указывает на возможность их применения в эколого-биохимическом мониторинге для оценки физиологического состояния гидробионтов при техногенной трансформации водных экосистем.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), международной конференции «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря» (Петрозаводск, 2004), международной конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), школе-конференции по биологии развития (Звенигород, 2005), конференции «Структурно-функциональные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообщества)» (Петрозаводск, 2005), X научной конференции ББС МГУ (пос. Пояконда, 2006), выездном заседании Бюро ОБН РАН (Петрозаводск, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 11 статей и 14 тезисов докладов, в том числе, в центральной реферируемой печати статья и краткое сообщение.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, четырех глав результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает Зой.названия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы изложены современные представления о структуре, свойствах и биологической роли ферментов, гидролизующих нуютеи-

новые кислоты, в том числе в адаптациях животных к действию различных экологических факторов.

Глава 2. Материал и методы исследований

Материал. Эксперименты по теме диссертации проводились в 2003 -2006 гг. в лаборатории экологической биохимии Института биологии Карельского НЦ РАН. Материал для отдельных исследований был получен при содействии лаборатории физиологии и токсикологии водных животных Института биологии внутренних вод РАН (пос. Борок), Кандалакшского государственного природного заповедника (Мурманская обл.), Беломорской биологической станции Зоологического института РАН "Картеш" (Карелия, Лоухский р-он), лаборатории экологической токсикологии СевНИИРХ (г. Петрозаводск), кафедры зоологии и экологии ПетрГУ (г. Петрозаводск).

Объектами исследований служили морские и пресноводные гидробио-нты, относящиеся к различным таксонам: костистые рыбы, двустворчатые моллюски, ракообразные. В экспериментах использовали 6 видов пресноводных рыб, относящихся к 4 семействам: сем. Esocidae (щука Esox lucius L.), сем. Percidae (окунь Perca fluviatilis L., судак Sitzostedion lucioperca L.), сем. Coregonidae (сиг Coregonus lavaretus L., ряпушка Coregonus albula L.), сем. Cyprinidae (лещ Abramis brama L.), 2 вида морских рыб сем. Gadi-dae (навага Elegimis navaga Pallas, треска Gadus morhua L.), беспозвоночных Белого моря: двустворчатых моллюсков сем. Mytilidae (мидий Mytilus edulis L.) и ракообразных амфипод рода Gammaridae spp.

В качестве материала для биохимического анализа использовали различные органы и ткани рыб (белые мышцы, печень, гонады, жабры, селезенка и почки), отдельные органы моллюсков (мантия и нога), а также го-могенаты цельных организмов беспозвоночных мидий и амфипод.

Приготовление го.чогенатов тканей. Из тканей готовили 10 %-ные гомогенаты в 0,25 М растворе сахарозы (pH 7,4), содержащем 0,001 М ЭДТА при помощи тефлонового гомогенизатора Поттера-Эльвейема. Для учета мембранносвязаной активности ферментов в суспендирующую среду добавляли неионный детергент Тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1 % (Покровский, Тутельян, 1976). Полученный гомогенат центрифугировали в течение 30 мин на центрифуге с охлаждением при 12 000 об/мин. Супернатант использовали для анализа.

Определение акпшвпости кислых нуклеаз. Активность кислых нукле-аз определяли спектрофотометрически по нарастанию кислотораствори-мых продуктов гидролиза. В качестве субстратов для определения активности ферментов использовали 0,1 %-ные растворы соотвествующих нуклеиновых кислот на ацетатном буфере, pH 5,0 для ДНКазы и 5,2 для РНКазы. Активность кислой ДНКазы (КФ 3,1.4.6) - по методу А. А. Покровского и А. И. Арчакова (1968), кислой РНКазы (КФ 3.1.4.23) — по методу А. П. Левицкого с соавт. (1973). Активность нуклеаз выражали в условных единицах АЕ2бо в 1 мин на 1 г сырого веса ткани или на 1 мг белка. Содержание белка в тканях определяли по методу Лоури.

Разделение множественных молекулярных форм кислой ДНКазы. Фракционирование изоформ кислой ДНКазы осуществляли по несколько модифицированной методике энзим-электрофореза (Коничев и др., 1980;

Попов и др., 2003). Электрофорез проводили в вертикальных пластинах по-лиакриламидного геля в щелочной буферной системе, включая в разделяющий гель вьтсокополимерную ДНК для выявления дезоксирибонуклеазной аетивности белковых фракций (Boyd, 1970).

Статистическая обработка данных. Результаты исследовании обработаны общепринятыми статистическими методами (Кокунип, 1975). Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали с помощью критерия Стьюдента для малых выборок (п < 30). Различия между выборками считали достоверными при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Распределение нуклеазной активности лизосом в органах и тканях различных видов рыб

Лизосомы присутствуют во всех клетках животных, за исключением, быть может, зрелых эритроцитов. Однако, количественные и качественные характеристики лизосомальных ферментов в разных органах могут варьировать, в связи с дифференциацией клеток высокоразвитых организмов и приобретением лизосомами, помимо внутриклеточного пищеварения, дополнительных функций, таких как, макрофагия, кринофагия, участие в ало птозе и иммуногенезе, реконструктивная функция и др. (Покровский, Тутельян, 1976; Покровский, Крыстев, 1977; Halton, 1997; КоЫег et al., 2002; Griffiths, 2003;).

В данной главе представлены результаты изучения тканевого распределения активности кислых нуклеаз в различных органах и тканях 6 видов пресноводных и 2 видов морских рыб (табл. 1).

Таблица I. Активность кислой ДНКазы в органах разных видов пресноводных и морских рыб (в АЕ260 на 1 г ткани в 1 мин при 30 °С)

Пол * * Нсчснь Жабры Гоиа.1ы | Мышцы Почки

судак ¥ 1,230 ±0,062 0,800 ± 0,040 0,760 ± 0,038 0,310 ±0,016

лещ 9 в 0,920 ± 0,046 0,770 ± 0,039 0,720 ± 0,036 0,820 ±0,041 0,700 ± 0,035 0,340 ±0,017 0,240 ±0,012 0,300 ±0,015 1,420 ±0,71 1,120 ±0,056

окунь ? б 1,006 ±0,050 1,090 ±0,055 0,613 ±0,031 0,539 ± 0,027 0,796 ± 0,040 1,372 ±0,069 0,313 ±0,016 0,296 ±0,015 0,683 ± 0,034 0,862 ± 0,043

ряпушка ? б 0,511 ±0,026 0,400 ± 0,020 0,471 ± 0,024 0,280 ±0,014 0,618 ±0,031 0,413 ±0,021 0,238 ±0,012 0,218 ±0,011

сиг s-6 0,879 ± 0,044 0,724 ± 0,036 0,854 ± 0,043 0,460 ± 0,023 0,428 ±0,021 1,017 ±0,051 0,283 ±0,014 0,350 ±0,017

щука 9 с? 0,986 ± 0,049 0,619 ±0,031 0,465 ± 0,023 0,528 ± 0,026 0,894 ± 0,045 0,516 ±0,026 0,413 ±0,021 0,395 ± ,020

треска ¥ 6 0,689 ± 0,034 0,260 ±0,013 0,363 ±0,018 0,283 ±0,014 0,266 ±0,013

навага ¥ сJ 0,789 ± 0,039 0,826 ±0,041 0,443 ± 0,022 0,436 ± 0,022 0,799 ± 0,040 0,340 ±0,017 0,333 ±0,017

Анализ полученных данных показал, что максимальная активность ли-зосомальных нуклеаз присуща активно метаболизирующим органам, таким как печень и почки. Несколько ниже, но также достаточно высокая нуклеазная активность лизосом отмечена в жабрах рыб. Наименьшей активностью характеризуется мышечная ткань. Установленные закономерности распределения активности кислых РНКазы и ДНКазы в тканях рыб обнаруживают значительное сходство с количественным соотношением лизосом в исследованных тканях, описанным в литературе для разных объектов (Покровский, Тутельян, 1976; Покровский, Крыстев, 1977). Особенно высокий уровень дезоксирибонуклеазной активности в кислой области рН отмечается в гонадах половозрелых самцов, что связано с участием ли-зосомальных ферментов в процессах сперматогенеза и оплодотворения (Нечаевский, Иванов, 1995; Высоцкая, 1999; Позднякова и др., 2003).

Необходимо отметить, что сравнение биохимических показателей у разных видов рыб затруднено широкой вариабельностью активности ферментов в зависимости от физиологического состояния организма, стадии жизненного цикла, влияния различных факторов среды обитания (Высоцкая и др., 1980; Немова, 1996). В целом, виды, относящиеся к одному семейству, имеют сходную картину распределения нуклеазной активности в различных органах, но величины ферментативной активности различаются. Таким образом, между положением вида рыб на эволюционной лестнице и величиной активности ли-зосомальных нуклеаз прямой зависимости не обнаружено.

Глава 4. Влияние различных типов антропогенного загрязнения на активность кислых нуклеаз водных организмов

4. 1. Влияние накопления ртути в тканях рыб в сочетании с зачислением и гумификацией водоема на активность кислых нуклеаз окуня Perca fluviatilis L.

Биогеохимический цикл ртути, поступающей в водоемы при атмосферном переносе и с территории водосборного бассейна, в значительной степени зависит от сопутствующих факторов среды, главным образом, реакции среды и содержания органики в воде (Мур, Рамамурти, 1987; Степанова, Комов, 1996; Немова и др, 2001; Немова, 2005; Hintelmann et al., 1997). Специфической особенностью малых озер Карелии является заболоченность водосборной территории и, как следствие, повышенное содержание гуминовых веществ и водородных ионов, способствующих образованию биодоступных форм ртути (За-личева и др., 2002; Моисеенко, 2002). В таких условиях даже фоновые концентрации ртути в водоемах могут представлять серьезную опасность для гидро-бионтов (Комов, 2004; Немова, 2005).

Для изучения биохимического ответа рыб на сочетанное действие перечисленных факторов был проведен сравнительный анализ нуклеазной активности у окуней, отловленных в 1999—2002 гг. из ряда водоемов Карелии, близких по ряду гидрохимических характеристик, но существенно различающихся по степени закисленности и гумифицированности (табл. 2). Концентрацию соединений ртути в мышцах рыб определяли сотрудники ИБВВ РАН (пос. Бо-рок) с помощью метода атомной абсорбции (Назаренко и др., 1986).

По результатам проведенных исследований выявлены заметные отличия в активности исследованных ферментов в тканях окуней из темновод-

ных закисленных озер с повышенным содержанием ртути в мышцах по сравнению с обитателями светловодных, менее кислых водоемов с низким содержанием ртути (рис. 1.). Как правило, активность лизосомальных нук-леаз в органах рыб из самого кислого и гумусного оз. Вуонтеленъярви была значительно снижена. Изменение активности обоих исследуемых ферментов были однонаправлены, однако, дезоксирибонуклеазная активность снижается в большей степени, чем активность рибонуклеазы.

Таблица 2. Некоторые гидрохимические характеристики исследованных озер и содержание ртути в мышцах обитающих в них окуней Perca fluviatilis L.

í'/í:;/; водоем S (га) ;цветность (Шгеп) рИ концентрация llg в мышцах рыб Г::: ("мг/кг сырой массы)

оз. Урос 426 9 5.9 0.12(0.06-0.18)

оз. Чучъярви 112 8 5.0 0.10(0.08-0.13)

оз. Вендюрское 998 23 7.0 0.15(0.10-0.24)

оз. Вегарусъярви 1880 105 5.1 0.34 (0.20 - 0.44)

оз. Вуонтеленъярви 394 186 4.6 0.53 (0.32-1.03)

Наибольший интерес в экологических и экотоксикологических исследованиях представляет модуляция метаболизма в органах, участвующих в поглощении (жабры), выведении (почки) и детоксикации (печень) ксенобиотиков. В данном эксперименте в печени окуня наблюдается дозозави-симый эффект понижения активности кислой ДНКазы по мере увеличения накопления в тканях рыб обоих полов. Ингибирование дезоксирибо-нуклеазной активности лизосом наиболее сильно проявляется у самцов окуня. В печени самок отчетливо прослеживается та же тенденция.

□ оз. Урос " □ оз. Чучьярви

Воз. Вендюрское "Воз. Вегарусъярви юз. Вуонтеленъярви

печень жабры мышцы гонады самки

жабры | мышцы | гонады самцы

Рис. 1. Активность кислой ДНКазы (ДЕ260/ г тк/ мин) в тканях окуня из озер Карелии.

Точный механизм ингибирования на данный момент не установлен, однако, основываясь на данных литературы можно предположить, что имеет место конкурентное вытеснение тяжелыми металлами ионов металлов-активаторов

из центров связывания, либо восстановление сульфидных групп, приводящее к разрыву дисульфидных связей, нарушению конформации фермента и потере активности (Керова и др., 1974; Эйхенбергер, 1993; Ball, Bcnedík, 1992). Помимо этого, токсиканты могут влиять на активность ферментов опосредовано, через субстрат, меняя его свойства и, как следствие, доступность для фермента (Трахтенберг и др., 1994; Благой, 1998; Дмитриева, 2002).

В отличие от печени, основным фактором, влияющим на активность ли-зосомальных нуклеаз в жабрах, является рН воды в озере, из которого выловлена рыба. Наибольшая активность кислой ДНКазы в данном органе отмечена у рыб, обитающих в водоеме с нейтральной реакцией воды (оз. Вен-дюрское). Превалирующее повреждающее действие кислой среды для жабр рыб при сочетанном действии низкого рН и загрязнения воды тяжелыми металлами отмечают многие исследователи (Лукьяненко, 1987; Моисеенко, Шарова, 2006; Mazeaud, Mazcaud, 1981; McDonald, 1983; Rosseland, Staurnes, 1994). Однако повышенная кислотность среды сама по себе редко является фактором, снижающим численность рыб (Rosseland, Staumcs, 1994). На ор-ганизменном уровне основной токсический эффект связан с присутствующими в воде поллютантами, а действие высокой концентрации Н+ в среде в формировании токсикозов у рыб сводится к снижению барьерной функции жабр, вследствие нарушения контроля мембранной проницаемости клеток жаберного эпителия (McDonald, 1983; Rosseland, Staurnes, 1994).

У костистых рыб большая часть двухвалентных металлов, в том числе Hg2+, выводится через почки (Аминева, Яржомбек, 1984). Вовлечение ли-зосом в процесс экскреции приводит к повышенной концентрации соединений ртути в указанных органеллах и ингибированию активности лизосо-мальных ферментов (Чекунова, Фролова, 1986; Немова, 2005).

Активность лизосомальных нуклеаз в гонадах окуней обоих полов из светловодных озер Урос и Чучьярви достаточно высока. У самок и в наиболее закисленных гумифицированных водоемах Вегарусъярви и Вуонте-ленъярви не отмечается снижения исследуемых биохимических показателей, в отличие от самцов, у которых нуклеазная активность снижается в два раза. Гонады у рыб ежегодно обновляются, вследствие чего накопление ксенобиотиков в данном органе должно быть минимальным, и, соответственно, их влияние на метаболические функции незначительно. Вопреки этому, в семенниках рыб отмечается высокий уровень аккумуляции ртути (Трахтенберг, Иванова, 1984), что и приводит к выраженному ингибированию активности лизосомальных нуклеаз у самцов.

В 2005 году совместно с сотрудниками ИБВВ РАН (пос. Борок) были проведены аналогичные исследования в ряде озер Карелии (Лоухский р-он). Объектом также являлся окунь Perca fluviatilis. Водосбор исследуемых озер находится на заболоченной территории, что обуславливает особенности их гидрохимии: высокую цветность воды и несколько пониженные значения рН (5,9 - 7,4). Озера Среднее, Круглое и Кривое относятся к типичным малым бессточным озерам. Озеро Жемчужное превосходит остальные водоемы по размерам, является проточным и располагается западнее остальных, ближе к населенным пунктам, в связи с этим, в мышцах окуней, выловленных в данном водоеме, наблюдается повышенный уровень соединений

ртути — 0,37 мг/кг сырой массы ткани. В мышцах окуней из остальных озер содержание ртути составляет 0,14 мг/кг ткани.

В данном случае изменение биохимических показателей окуней, различающихся аккумуляцией ртути, был несколько иным. В печени и гонадах рыб обоих полов окуней озера Жемчужное, с максимальным содержанием ртути в тканях, отмечается повышенная активность кислых нуклеаз. Активность ДНКазы в жабрах рыб из этого водоема незначительно снижалась.

Повышение активности кислых нуклеаз у окуней, выловленных из оз. Жемчужное, имеет адаптивное значение. Как известно, лизосомы принимают участие в детоксикации и экскреции низких доз катионов тяжелых металлов (Чекунова, Фролова, 1986), в связи с этим, индукция активности кислых гидролаз отражает повышенную потребность организма в защитных функциях лизосом в условиях метаболического стресса, вызванного ртутной интоксикацией. Роль лизосом в данном случае, по всей видимости, состоит не только в выведении ксенобиотика из клетки, но и в освобождении клетки от поврежденных макромолекул, в том числе нуклеиновых кислот с нарушенной структурой.'

При сравнительном анализе результатов двух натурных исследований становится очевидным, что окунь из водоемов Северной Карелии, характеризующихся реакцией среды близкой к нейтральной, отличается более высокой устойчивостью к ртутной интоксикации организма по сравнению с обитателями более закисленных озер. Таким образом, интегральное воздействие накопления ртути у рыб при сопутствующей значительной аци-дификации (рН < 5,5) и гумификации водоема приводит не только к инги-бированию лизосомальных нуклеаз в тканях окуня Perca fluviaíilis и биохимических реакций, катализируемых этими ферментами, но и подавляет протекторные функции лизосом в целом, снижая, тем самым, адаптивные способности рыб, возможность выживания и размножения вида при действии описанного комплекса факторов.

В целом, самцы оказались более чувствительны к неблагоприятным факторам среды, чем самки. Об этом свидетельствует более высокая степень ингибирования активности лизосомальных нуклеаз в органах самцов окуня. Следует также отметить, что при анализе отловленного материала из различных по кислотности озер было обнаружено, что в оз. Вуонтеленъ-ярви преобладают самки, что лишний раз подтверждает вывод о более высокой токсикорезистентности самок.

4. 2. Изменение активности лизосомальных нуклеаз пресноводных рыб при загрязнении водоема отходами предприятий горно-обогатительной и металлургической промышленности Кольского полуострова

Влияние горно-обогатительного производства на водные экосистемы изучали на двух представителях сиговых рыб: ряпушка Coregonus albula L. и сиг Coregonus lavareíus L., выловленных в летний период 2003 г. из озера Ковдор. Данный водоем испытывает сильную антропогенную нагрузку, и в наших исследованиях рыбы из этого озера приняты за опытную группу. Условным контролем служили экземпляры сиговых рыб из водоемов, не испытывающих значительного загрязнения: водохранилище Нижняя Пи-ренга (сиг) и оз. Сямозеро (ряпушка).

Озеро Ковдор испытывает мощное загрязнение сточными водами Ков-дорского ГОКа, занимающегося добычей и обогащением комплексных железных и апатит-баделитовых руд, а также коммунально-бытовыми стоками г. Ковдор. Гидрохимический состав воды характеризуется высоким содержанием стронция, железа, алюминия, марганца и кадмия (в порядке убывания), так же отмечается повышенная концентрация анионов: сульфатов, фосфатов и, в особенности, нитратов. Качество поверхностных вод водохранилища Нижняя Пиренга признано удовлетворительным (уровень микроэлементов не превышает ПДК для рыбохозяйственных водоемов). Реакция воды исследуемых водоемов близка к нейтральной (в водохранилище рН воды составляет 6,66-7,23, в озере Ковдор — 7,98).

Сопоставление данных по изменению нуклеазной активности в тканях ряпушки С. albula и сига С. lavaretus показало, что биохимическая реакция изученных видов на загрязнение водоема промстоками неодинакова.

В органах ряпушки из загрязненного водоема активность кислой ДНКазы была повышена во всех тканях, за исключением гонад (рис. 2). Максимальные отличия значений ДНКазной активности зафиксированы в печени самок ряпушки. Нуклеолитиче-ская активность лизосом у сигов из загрязненного озера Ковдор, напротив, была снижена по сравнению с контролем (рис. 3).

Повышение исследуемых показателей у ковдорской ряпушки по сравнению с контрольным уровнем ферментативной активности свидетельствует о значительных перестройках метаболизма, имеющих, по всей видимости, приспособительное значение. Наиболее показательна в этом плане резкая активация лизосомальных нуклеаз в печени рыб из загрязненного водоема, указывающая на мобилизацию защитных функций данного органа. Детоксикацион-ные системы печени С. albula при данном уровне антропогенной нагрузки, очевидно, оказываются достаточно эффективными для предотвращения значительного негативного воздействия ксенобиотиков в других органах и тканях рыб, о чем можно судить по отсутствию характерного ингибирования де-зоксирибонуклеазной активности в условиях интоксикации организма тяжелыми металлами. Следует заметить, что иногда трудно провести грань между приспособительной активацией и патологическими изменениями, для которых так же характерна высокая активность ферментов катаболизма, в частности, лизосомальных гидролаз (Высоцкая и др., 1991). Однако привлечение результатов морфо-анатомического анализа показало, что доля рыб, имеющих

МЫПЦЬ!

жабры

Рис. 2. Активность лизосомальной ДНКазы (в АЕ260/г тк/мин) в тканях ряпушки Coregonus albula из разных озер.

выраженные нарушения внутренних органов, была незначительна. Более того, ряпушка, обитающая в озере Ковдор, характеризуется предельно крупными размерами и активным размножением. На основании вышесказанного предположение адаптивного характера биохимических изменений, наблюдаемых в тканях рыб указанного вида из загрязненного озера, кажется вполне обоснованным.

У сигов Coregonus lavarehis, обитающих в условиях загрязнения воды стоками ГОКа, в отличие от ряпушки, пониженна активность кислых ДНКазы и РНКазы практически во всех исследуемых органах по сравнению с показателями рыб из контрольного водоема. Первоначальное предположение о снижении уровня метаболических процессов у сигов из озера Ковдор было отвергнуто на основании результатов исследования других лизосомальных и цигоплазматических ферментов, активность которых оказалась выше, чем в контрольной группе рыб (Высоцкая и др., 2005). И только в случае нуклеаз наблюдалось снижение общей активности ферментов под действием данного типа загрязнения. Причиной данного явления, вероятно, служит более высокий уровень накопления в тканях сишв опытной группы, по сравнению с ряпушкой, эссенциальных микроэлементов. В первую очередь это относится к Cu Zn2 и Мп2+, способных в зависимости от концентрации выступать в роли, как активаторов, так и ингибиторов кислых нуклеаз (Керова и др., 1974; Бердышев, Бабенюк, 1985). Это предположение было подтверждено результатами эксперимента in vitro по действию различных доз сульфата цинка на рибо- и дезоксирибонуклеазную активность изолированных лизосом.

Различие биохимической реакции рыб разной видовой принадлежности наблюдали также при исследовании влияния отходов медно-никелевого производства на активность ферментов сига Coregonus lavaretus L., щуки Esox lucius L. и окуня Perca fluviátil is L., выловленных в июле 2004 г. из двух озер Мурманской обл., различающихся по степени антропогенной нагрузки - оз. Раякоски и оз. Куетсиярви. Оба водоема относятся к озерно-речной системе р. Пасвик. Источниками загрязнения в оз. Куетсиярви (опытный объект) являются сточные воды одного из крупнейших в Европе медно-никелевого комбината "Печенганикель", аэротехногенные выбросы предприятия, содержащие тяжелые металлы и их аэрозоли, а также бытовые стоки пос. Никель. Воды озера характеризуются высоким содержанием тяжелых металлов, преобладают ионы Ni, Fe, Мп и Al, в меньшей степени, Си и Zn. Оз. Раякоски находится на территории заповедника и в настоящее время не подвержено значительному загрязнению, поэтому образцы из этого озера использовали в качестве контрольных.

Рис. 3. Активность кислой ДНКазы (в ДЕ260/г тк/мин) в тканях сига Согецопия 1а\>агеШч из разных водоемов.

Анализ активности лизосомальных нуклеаз у рыб из указанных водоемов показал, что в наименьшей степени воздействию техногенных вод подвержен окунь Perca fluvialilis. В тканях окуня отмечены минимальные различия исследуемых показателей, максимальные - у сига. Наиболее интересным результатом является различие реакции нуклеаз на загрязнение у самок сига и щуки: у самок сига повышение РНКазной и ДНКазной активности в печени сопровождается угнетением активности указанных ферментов в жабрах, у щуки наблюдается прямо противоположная картина.

Среди исследованных объектов по изменению нуклеазной активности лизосом выделяется сиг Coregonus lavaretus, динамика показателей окуня и щуки обнаруживает значительное сходство. Причиной этому служат различия в биологии рыб, главным образом, характера питания и места обитания в водоеме, что, в свою очередь, определяет различие путей поступления и уровнь интоксикации тяжелыми металлами. У видов, обитающих в верхних горизонтах вод (щука и окунь), поглощение металлов происходит, в основном, через жабры. У глубинных видов, питающихся бентосом (сиг), существует дополнительный источник поступления ксенобиотиков - донные седименты с абсорбированными в них тяжелыми металлами. Отмеченные особенности в характере изменений нуклеазной активности в тканях сига и щуки позволяют предположить, что у данных видов основные защитные функции связаны с разными органами. Стратегия адаптации щуки Esox lucius к загрязнению вод отходами металлургического производства заключается, очевидно, в препятствовании проникновению металлов в организм за счет повышения барьерной функции жабр. Активация лизосо-мального аппарата в данном органе направлена, с одной стороны, на поддержание структуры клеток жаберного эпителия, испытывающих значительную токсическую нагрузку, с другой, на усиление выведения поглощенных токсикантов в окружающую среду.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод о крайне неблагоприятном влиянии промышленного комплекса Кольского полуострова на жизнедеятельность гидробионтов и состояние водных экосистем в целом. Обитающие в загрязненных водоемах рыбы до определенной степени способны адаптироваться к ухудшению качества воды, однако, устойчивость водных организмов зависит от ряда факторов. Одними из основных факторов, влияющих на токсикорсзистснтность низших позвоночных, являются особенности биологии вида, а также половая принадлежность рыб. В целом, самцы оказались более уязвимы к данному типу антропогенного загрязнения, чем самки. Наиболее очевидным свидетельством в пользу этого утверждения является сохранение нормального уровня активности исследуемых показателей в гонадах самок, чего нельзя сказать о самцах.

4. 3. Влияние антропогенного загрязнения морских побережий на активность кислых нуклеаз беспозвоночных гидробионтов

Проблема загрязнения прибрежной акватории Белого моря вследствие хозяйственной деятельности человека в настоящее время стоит чрезвычайно остро. Наиболее неблагополучная экологическая ситуация наблюдается в Кандалакшском заливе. Спектр поллкггантов, попадающих в залив, достаточно широк. В первую очередь, это бытовые стоки населенных

пунктов, нефтяное загрязнение, органические вещества, образующиеся при разложении отходов деревообрабатывающей промышленности, ионы различных металлов, в том числе, тяжелых (Наумов, Оленев, 1981). Удобными и часто используемыми объектами экологических исследований являются беспозвоночные прибрежной зоны благодаря их повсеместному распространению, привязанности к месту обитания и ключевой роли в трофических цепях морских биоценозов (Регеранд, Дубровина, 1995; Riba, Del Vals et al., 2004; Nagelkerken, Debrot, 1995).

В данном разделе представлены результаты исследования влияния комплексного загрязнения на нуклеазную активность лизосом в тканях типичных представителей макрозообентоса Беломорского побережья: двустворчатых моллюсков Mytilus edulis L. и ракообразных амфипод Gam-maridae. Животных собирали в различных зонах прибрежной акватории Кандалакшского залива в летний период 2003 года. Точки сбора проб различались по удаленности от населенных пунктов и типу загрязнения (табл. 3). Контролем служили особи из условно «чистых» зон Белого моря, наиболее удаленных от источников антропогенного воздействия - мыс Турий (точка 1) и губа Порья (точка 2).

Таблица 3. Характеристика точек сбора амфипод СаттапЛае арр. и мидий М. ес1иИз в Кандалакшском заливе Белого моря.

К» , ..Точки сбора Близость к источникам .-, •■ - загрязнения < Преобладающий тип загрязнения

1 мыс Турий 150 км от г. Кандалакша и 30 км от пос. Умба наиболее чистый район

2 губа Порья 90 км от г. Кандалакша и 30 км от пос. Умба чистый район

3 4 о. Ряжков пос. Лувсньга 5 км от пос. Умба побережье пос. Лувсньга бытовые сточные воды, агрохимия

5 6 7 о. Большой Березовый о. Еловый о. Большой Лупчостров 5 км от г Кандалакша 5 км от г. Кандалакша 1 км от г. Кандалакша бытовые сточные воды, повышенное содержание соединений Са и Р из апатитового концентрата из морского порта г.Кандалакша

8 9 о. Большая Половинница о. Малый 2 км от г. Кандалакша 1,4 км от г. Кандалакша радиоактивное точечное загрязнение Б г90 и У90 (апрель 2001 г.)

10 о. Олений 2,5 км от нефтебазы станции Белое море нефтепродукты

11 "механический завод" в городской черте г. Кандалакша неорганические кислоты от аккумуляторов, нефтепродукты, бытовые стоки, отходы деревообработки

Активность изучаемых ферментов у исследуемых гидробионтов варьирует по-разному (рис. 4). У мидий под воздействием различных загрязнителей нуклеазная активность в той или иной мере снижается,

тогда как у амфипод наблюдается превышение активности РНКазы по мере увеличения техногенной нагрузки. Для этих проб отмечена также несколько повышенная активность кислой ДНКазы.

оде о ,15 О ,12 О ,0 9 0 ,0 6 0,0 3 0,00

Л"

0,2 5 0,2 0 0 ,15 0,10

,0 5 -

I«—Г""

,0 0 «С ..I И

л ■ *

Г}

Д ^ *

Рис. 4. Активность лизосомальной РНКазы (в ДЕ260/г тк/мин) в гомогенатах мидий МуШиз есЫНя (А) и амфипод Оаттаг^аг ¡рр. (В) из различных зон побережья Кандалакшского залива Белого моря.

В данном исследовании в качестве контроля служил материал, собранный в двух чистых зонах Кандалакшского залива — удаленный от источников техногенного загрязнения Турий мыс и побережье Порьей губы, прилегающего к территории Кандалакшского заповедника. Различие ферментативной активности у особей из названных зон, а именно, значительно более низкий уровень активности лизосомальных нуклеаз у беспозвоночных из Порьей губы, оказалось неожиданным и интересным результатом. Причем, для обоих видов снижение активности ферментов было пропорциональным - порядка 65 - 70 % для РНКазы и 35 - 40 % для ДНКазы. Однонаправленность и строгое количественное соотношение изменения активности при схожих условиях среды обитания, не испытывающей посторонних воздействий, позволяет предположить, что зафиксированная разность величин ферментативной активности отражает нормальный диапазон варьирования экзаменуемых параметров. Исходя из сказанного выше, отклонением от нормы считали данные, выходящие за границы означенного интервала.

Анализируя полученные результаты в таком ключе, можно отметить более высокую стабильность показателей нуклеаз моллюсков даже в весьма неблагополучных зонах, что, по-видимому, имеет большое значение в приспособительных реакциях организмов с относительно низким уровнем развития регуляторных систем, коими являются мидии (Хлебович, 1981). Это позволяет сохранять каталитическую активность при изменении метаболического фонда клетки. Такое предположение хорошо согласуется с результатами исследования свойств других лизосомальных и цитоплазмати-ческих ферментов М. ес1иН$, для которых также была показана низкая чувствительность к влиянию широкого спектра абиотических факторов (Горо-мосова, Шапиро, 1984; Высоцкая и др., 2005).

В то же время, повышение рибонуклеазной активности ракообразных амфипод Саттаг1йае, свидетельствующее об интенсификации синтетических процессов, и модуляция активности ряда протеолитических фермен-

тов лизосом под влиянием антропогенной нагрузки (Бондарева, 2004), указывают на существенные метаболические сдвиги в клетках амфипод из загрязненных зон. Описанные биохимические перестройки, а также изменения качественного состава белков, отмеченные у другого представителя рода Gammarus, обитающего в зоне городского стока (Руднева, 2000), позволяют заключить, что адаптивные реакции данной группы беспозвоночных к токсическим воздействиям отличаются более высокой специфичностью по сравнению с двустворчатыми моллюсками.

4. 4. Изменение нуклеазной активности лизосом двустворчатых моллюсков Mytilus edulis L. под действием нефтепродуктов и буровых растворов в аквариальных экспериментах

Исследовали влияние нефтяного загрязнения воды на активность лизосо-мальных нуклеаз в тканях мидий Mytilus edulis L. Для этого предварительно акклимированных к лабораторным условиям моллюсков в экспериментальных условиях подвергали воздействию различных концентраций нефтепродуктов. В качестве нефтепродуктов использовалось дизельное топливо, разведенное в морской воде в соотношении 1:9. В каждый из 3-х аквариумов добавляли 15, 50 и 150 мл полученной смеси. В четвертый аквариум раствор дизтоплива не вносили. Истинным контролем, учитывая высокую поглощающую способность морской воды, служили моллюски, содержавшиеся в аналогичных условиях в отдельной изотермической комнате.

Результаты исследований показали, что изменение активности кислых нуклеаз у мидий носит дозозависимый характер (рис. 5).

мантии мантии

Рис. 5. Изменение удельной активности лизосомальных РНКазы (А) и ДНКазы (В) в тканях мидий Mytilus edulis L. под действием раствора дизтоплива (концентрация добавленных нефтепродуктов в мл/л: 1 - 1,0; 2 - 0,3; 3 — 0,1; 4 — 0) (* — отличие от контроля достоверны при р < 0,05).

Двустворчатые моллюски рода Mytilus характеризуются высокой устойчивостью к нефтяному загрязнению, основанной на способности в той или иной степени метаболизировать компоненты нефти различной природы, а также выводить продукты их биотрансформации (Проблемы химического загрязнения..., 1985; Stcgerman, Teal, 1973). Активация ферментов лизосом в тканях мидий, наблюдаемая в данном эксперименте, свидетельствует об адаптивной модуляции обмена веществ моллюсков, направленной, очевид-

но, на повышение эффективности утилизации и детоксикации нефтепродуктов. В частности, значение повышения нуклеазной активности, вероятно, заключается в перераспределении ресурсов клетки для обеспечения процессов транскрипции и трансляции ферментов и других макромолекул, участвующих в метаболизме чужеродных органических веществ. Так, в ряде исследований отмечено значительное увеличение содержания нуклеиновых кислот в клетках моллюсков при экспонировании с сырой нефтью (Дивавин, Ерохин, 1978; Дивавин, 1979; Pisoni et al., 2004). Причем низкие концентрации нефти в большей степени стимулируют синтез РНК, нежели ДНК (Проблемы химического загрязнения..., 1985; Дивавин, 1979).

Аквариальный эксперимент по оценке влияния компонентов буровых растворов на моллюсков был поставлен в лаборатории экологической токсикологии СевНИИРХ. Мидий Mytilus edulis L. подвергали воздействию различных концентраций исследуемых веществ в течение 30 дней, после чего в гомогена-тах цельных мидий определяли активность кислых нуклеаз. Согласно полученным данным, активность РНКазы меняется более значительно, чем ДНКазы, и эти изменения в большей степени носили дозозависимый характер. В частности, дозозависимая активация рибонуклеазной активности отмечается для ПАВ и смазочных материалов. Для лизосомальной ДНКазы, в основном, наблюдается небольшое снижение активности фермента.

Дозозависимый эффект действия нефтепродуктов и буровых растворов на исследуемые биохимические показатели, может быть обусловлен хорошо изученной неспецифической реакцией лизосомалыюго аппарата на метаболический стресс, заключающейся в дифференциальном изменении стабильности мембран лизосом в зависимости от химической структуры, дозы и продолжительности воздействия ксенобиотиков (Moore, 1979; VI-arengo et al, 1981; Moore, 1985; Pellerin-Massicotte et al., 1989; Regoli, 1992; Marigomes, Baybay-Villacorta, 2003).

Глава 5. Влияние естественных (абиотических и биотических) факторов на нуклеазную активность лизосом морских гидробионтов

5. 1. Изменение активности кислых нуклеаз беломорских мидий Mytilus edulis L. в условиях экспериментальной аноксии

Как известно, водные обитатели удовлетворяют энергетические потребности организма, поглощая растворенный в воде кислород (Озернюк, 1992). Изъятие гидробионтов из водной среды, как правило, приводит к развитию гипоксии и быстрой гибели организма. Исключение составляют животные приливно-отливной зоны, обладающие способностью к длительному существованию в бескислородных условиях (Горомосова, Шапиро, 1984; Хочачка, Сомеро, 1988). В связи с этим, исследования механизмов адаптации литоральных моллюсков к анаэробиозу и роль лизосомальных ферментов в этих процессах представляет большой интерес.

Изучали изменение удельной активности кислых ДНКазы и РНКазы (АЕ260/ мг белка) в шмогенатах цельных мидий Mytilus edulis после 24-часового содержания без воды. В эксперименте, поставленном на Беломорской биостанции «Картеш» ЗИН РАН в 2003 г., сравнивали реакцию двух экологических групп моллюсков - литоральных, подверженных периодическому обсыханию, и сублиторальных (плотовых мидий), постоянно находящихся в воде.

Полученные данные показали, что у моллюсков, находившихся без воды в течение суток, наблюдается повышение активности кислых нуклеаз (рис. 6), указывающее на усиление катаболических реакций в клетках моллюсков в условиях аноксии. Активация лизосомального аппарата в данном случае обусловлена переключением метаболизма животных на эндогенные источники энергетических и пластических веществ, т. к. извлечение моллюсков из водной среды означает не только прекращение поступления кислорода, но и дефицит пищи. В таких условиях продукты полного гидролиза нуклеиновых кислот, осуществляемого нуклеазами совместно с другими фофодиэстера-зами лизосом, могут быть использованы в клетке для новых синтезов, адекватных потребностям организма.

Результаты исследования позволяют заключить, что на биохимическом уровне реакция моллюсков Mytilus edulis, принадлежащих к разным экологическим группам, неодинакова. Согласованное по величине и направленности повышение рибо- и дезоксирибонуклеазной активности у литоральных моллюсков свидетельствует о более высокой эффективности адаптивных механизмов, по сравнению с обитателями сублиторали. Повышенная реактивность ферментативных систем лизосом мидий приливно-огливной зоны позволяет скорректировать метаболизм в более короткий срок, что немаловажно для успешного выживания организма при резких и частых изменешмх условий существования.

5. 2. Лизосомальные нуклеазы в приспособительных реакциях морских моллюсков к различной солености воды

Мидии Mytilus edulis L., являясь типичными пойкилосмотйческими организмами, не способны регулировать осмотическую концентрацию полостной жидкости (Бергер, 1986). При этом мидии проявляют высокую эврига-линность, заселяя биотопы с широким диапазоном колебания солености внешней среды, а также сохраняя жизнеспособность при крайних значениях данного фактора (5 %о - 75 %о) в экспериментальных условиях (Хлебович, 1981). Адаптивные реакции, лежащие в основе эврибионтности морских моллюсков, реализующиеся на уровне поведенческих и физиологических реакций, достаточно широко изучены (Луканин, 1971; Наточин, Бергер, 1979; Бергер, Луканин, 1985; Klerowsky, 1963), клеточные и молекулярные механизмы освещены в меньшей степени (Харазова, Бергер, 1974; Meats et al., 1978; Ahokas, Duerr, 1975; Deane et al., 2002). В ряде работ, выполненных на низших позвоночных (осморегуляторы), имеются указания на структурные и функциональные изменения лизосом при опреснении и повышении солености среды (Moore et al., 1979; Bayne et al., 1981; Petroyi et al., 2004). Для беспозвоночных такие данные в литературе фрагментарны.

1(4 -, ju □естественные

ус ЛOB и я Вобсыхание 24 часа

— п *

— ■■■

гт

л с ДНКаза л с Р НКаза

Рис. 6. Удельная активность кислых

нуклеаз (ДЕ26о/мг белка) литоральных (Л) и сублиторальных

(С) мидий в условиях суточного содержания без воды. (*-отличия от контроля достоверны при р < 0,05)

Для исследования участия лизосомальных РНКазы и ДНКазы в соленост-ных адагггадиях морских моллюсков на базе ББС «Картеш» был поставлен эксперимент, в ходе которого литоральных и сублиторальных мидий, предварительно акклимированных к лабораторным условиям, в течение 12 дней выдерживали в аквариумах с водой различной солености: 5 %о, 15 %о, 25 %о, 35 %о и 45 %о при постоянной температуре 10 °С. Контролем служили моллюски из аквариума с соленостью 25 %о, соответствующей нормальному уровню солености поверхностных вод данного района Белого моря. Активность ферментов определяли в тканях ноги, краевой и центральной части мантии.

Анализ результатов эксперимента показал, что сублиторальные мидии более чувствительны к изменению соленостного режима. У данной группы моллюсков наблюдается угнетение нуклеазной активности во всех исследованных органах (рис. 7).

□ 5%о 0

-20

□ 15 %о -40

Ш 35 %о -60

■ 45%о -80

-100

Рис. 7. Активность лизосомальной ДНКазы (А) и РНКазы (В) в тканях сублиторальных мидий при различной солености (ДЕ^бо/ мг белка) (♦-отличия от контроля достоверны при р < 0,05)

т1 ьг

край мантия нога мантии

Рис. 8. Активность лизосомальной ДНКазы (А) и РНКазы (В) в тканях литоральных мидий при различной солености (ДЕ2бс/ мг белка) (*-отличия от контроля достоверны при р < 0,05). Активность исследуемых ферментов в мантии у литоральных мидий снижена при опреснении, однако, в тканях ноги активность кислых нукле-аз не отличается от контроля даже при критической солености 5 %о (рис. 8). В условиях повышенной солености достоверные отличия исследуемых

биохимических показателей от контрольного уровня отмечены только в краевой части мантии, наиболее подверженной воздействию окружающей среды, а также в ткани ноги.

Более значительные отклонения активности исследуемых ферментов у мидий, содержавшихся в гипотонической среде, позволяет констатировать, что опреснение в большей степени угрожает стабильности обменных процессов в организме моллюсков, чем повышенная концентрация солей в среде. Помещение моллюсков в разбавленную морскую воду приводит к повышенной гидратации клеток и дисбалансу содержания ионов К и Na+ в клетке, участвующих в поддержании осмотической концентрации внутренней среды (Бергер, Лука-нин, 1985; Natochin et al., 1979). Накопление в цитозоле ионов калия, являющееся одним из механизмов создания гиперосмотичности клеток моллюсков, оказывает дестабилизирующее воздействие на лизосомальньте мембраны, нарушая их проницаемость (Покровский, Тутельян, 1976). Изменение стабильности лизосомальных мембран и, как следствие, увеличение в размерах (набухание) органелл является одним из первых показателей метаболического стресса (Moore, 1979; Moore, 1985; Domouhtsidou, Dimitriadis, 2001; Marigo-mes, Baybay-Villacorta, 2003; Terman et al., 2006). Несомненно, что изменение состояния мембран, альтерации состава матрикса лизосом оказывают значительное влияние на проявление каталитической активности лизосомальных ферментов (Moore et al., 1987; Marigomes et al., 1989). В частности, одной из причин снижения активности лизосомальных ферментов может быть изменение pH в лизосомах (Покровский, Тутельян, 1976).

Сопоставление реакции литоральных и сублиторальных моллюсков подтвердило сделанный ранее вывод о более высоких адаптивных возможностях мидий приливно-отливной зоны. Так, по результатам эксперимента литоральные моллюски М. edulis, успешно акклимируются к различным уровням солености, демонстрируя полную (в случае повышение солености среды) или частичную (при опреснении) нормализацию исследуемых биохимических показателей.

5. 3. Влияние биотических взаимодействий па биохимические показатели мидий Mytilus edulis L.

На жизнедеятельность прикрепленных морских организмов, помимо абиотических факторов среды, огромное влияние оказывают внутри- и межвидовые конкурентные отношения. Причем лимитирующим фактором развитая в данном случае является не пшца, а место на субстрате. У видов, образующих сообщества обрастания, в ходе эволюции сложился определенный арсенал механизмов борьбы за «жизненное пространство». Эти методы борьбы реализуются на самых различных уровнях: от физического обрастания конкурента и различных поведенческих реакций до аллелопа-тии - химического воздействия, приводящего к подавлению роста или даже гибели особей другого вида. Совокупность этих процессов определяет не только благополучие отдельного вида, но и закономерности формирования сообщества. В связи с этим, понимание характера взаимодействия видов между собой и выявление тонких механизмов таких взаимовлияний в целом и аллелопатии в частности представляет большой интерес.

Настоящая работа являлась частью комплексного исследования, целью

которого была разработка методики, позволяющей оценить взаимные химические влияния в сообществах по изменению биохимического статуса животных. Объектом служили мидии Mytilus edulis L., собранные с обрастаний искусственных субстратов около ББС «Картеш» ЗИН РАН. Моллюсков акклимировали к лабораторным условиям. Затем добавляли воду, в которой предварительно в течение 2 суток содержали представителей одного из 5 видов, являющихся основными компонентами сообществ обрастания Белого моря: Mytilus edidis L., Hiatella arctica L., Styela rustica L., Asterias rubens L. и Halichondria panicea Pallas. Экспозиция составляла 24 часа. Контролем служили моллюски, содержавшиеся в природной морской воде. Удельную активность нуклеаз, а также ряда других лизосомальных и цитозольных ферментов, определяли в шмогенатах дистального и проксимального отделов мантии моллюсков.

В дистальном отделе мантии активность кислой ДНКазы достоверно повышалась во всех опытных группах за исключением моллюсков, содержавшихся в воде, кондиционированной особями своего вида (рис. 9). Достоверных изменений активности РНКазы в данной ткани не отмечено, в проксимальном отделе достоверно активность РНКазы повышается под действием воды, в которой содержались морские звезды.

0,25

0,10

0,00

□ контроль

■ Mytilus edulis Ш Hiatella arctica QSfye/a rustica

■ Asterias rubens

0,25

0,10

1 |

U Halichondria panicea

Рис. 9. Активность кислой ДНКазы (ДЕ2бо/ мг белка) в дистальном (А) и проксимальном (В) отделах мантии мидий М. edulis L. под действием воды, кондиционированной различными видами животных (* - отличия от контроля достоверны при р < 0,05). Реакцию в краевой (дистальной) части мантии, имеющей непосредственный контакт с внешней средой, в целом можно охарактеризовать как неспецифическую, свидетельствующую о некотором стрессе, испытываемым моллюсками в экспериментальных условиях. На это, в первую очередь, указывает угнетение фосфомоноэстеразной активности и резкая активация альдолазы. Повышение альдолазной активности отражает увеличение вклада анаэробного распада углеводов в энергетический обмен мидий. Максимально активность альдолазы увеличивается в группе животных, содержавшихся в воде, кондиционированной асццдиями Styela rustica, морскими звездами Asterias rubens и губками Halichondria panicea. Это позволяет предположить, что здесь имеет место изоляция мидий от окружающей среды с целью минимизировать воздействие присутствующих в воде экскреторно-секреторных продуктов этих животных либо, в случае с A. rubens, защититься от хищника.

Кроме того, интересно отметить, что в собственно мантии мидий, содержавшихся в воде, кондиционированной морскими звездами, наблюдается значительное повышение активности практически всех цитоплазмати-ческих и лизосомальных ферментов. Как известно, основной функцией мантии является построение раковины. Такой метаболический всплеск в данной ткани, возможно, отражает защитную стратегию моллюсков, направленную на укрепление раковины в присутствии хищника.

Таким образом, анализ полученных данных показал, что для изучения аллелопатической составляющей внутривидовой и межвидовой конкуренции исследования только нуклеазной активности недостаточно, необходимо комплексное исследование биохимических показателей, позволяющее более полно оценить изменения метаболических процессов организма.

Глава 6. Альтерации спектра множественных молекулярных форм кислой дезоксирибонуклеазы под действием различных факторов среды

Явление молекулярного полиморфизма служит проявлением узкой специализации ферментов и является важным звеном в регуляции клеточного обмена. В частности, множественные формы отдельного энзима могут отвечать за альтернативные пути обмена, прямую и обратную реакцию, изо-формы могут различаться по каталитическим характеристикам, термостабильности, чувствительности к действию модуляторов активности различной природы. Кроме того, гормоны и другие биологически активные вещества могут оказывать влияние не на все, а лишь на определенные изофор-мы. В связи с этим, изучение альтерации спектров множественных молекулярных форм энзимов может применяться в экологических исследованиях, позволяя охарактеризовать изменение биохимических процессов в тканях животных под действием тех или иных факторов среды.

В представленной главе приведены результаты исследований изменения состава множественных форм кислой ДНКазы водных животных, более адекватно реагирующей на внешние влияния, по сравнению с РНКазой.

Изучение спектра изоформ лизосомальной ДНКазы окуня Perca fluviatilis L. из озер Северной Карелии Кривое и Жемчужное (подробное описание водоемов дано в главе 4.1.), отличающихся уровнем аккумуляции ртути в тканях, показало, что печени и жабрам рыб присущ свой набор множественных молекулярных форм фермента (рис. 10). Кроме того, в гетерогенности кислой ДНКазы печени наблюдается выраженная половая специфичность. Самки характеризуются большим разнообразием молекулярных форм фермента, чем самцы, что лишний раз свидетельствует в пользу повышенной устойчивости данного пола к неблагоприятным воздействиям.

Наличие большого количества форм позволяет осуществлять катализ в широком диапазоне варьирования параметров микросреды клетки, в которой функционирует фермент, таких как: изменение рН, ионного состава, доступности субстрата, присутствия эффекторов и др. (Хочачка, Сомеро, 1988). И наоборот, выпадение активности тех или иных молекулярных форм энзима снижает вероятность эффективной компенсации внешних воздействий. Так, в жабрах окуней из озера Жемчужное с повышенным содержанием ртути в тканях, наряду со снижением общей активности ДНКазы, наблюдается исчезновение двух полос нуклеазной активности в энзимограммах.

Изучали качественные и количественные перестройки спектра белков, обладающих способностью гидролизо-вать ДНК, беломорских моллюсков Mytilus edulis L. под влиянием нефтепродуктов и различной солености среды. Для анализа использовали гомоге-наты дельных моллюсков.

Сравнительный анализ результатов фракционирования выявил индукцию активности дополнительных, не обнаруживаемых у контрольных моллюсков, форм ДНКазы. При соленостных адаптациях на эгоимограммах фермента появляются новые изоформы с высокой электрофоретической подвижностью (Rf в интервале 0,6 - 0,8), тогда как, под действием нефтепродуктов основные отличия наблюдаются в зоне медленномигрирующих компонентов (Rf 0,3 — 0,4). Однако, помимо различий в приспособительных реакциях прослеживаются и общие черты, в частности, и в том и в другом случае, максимальное количество фракций кислой ДНКазы отмечено при так называемом «умеренном» воздействии изучаемого фактора.

Следует отметить, что даже в контрольных группах сублиторальных мидий при содержании в одинаковых условиях, максимально приближенных к параметрам естественной среды обитания, наблюдаются различия в наборе изоформ кислой ДНКазы. В токсикологическом экспериме1гге регистрируется дополнительная полоса нуклеазной активности в области медленнодвижу-щихся компонентов. Возможно, это отражает сезонную динамику изучаемых показателей, т. к. описанные исследования проводились в разное время года.

Очевидно, что биологический смысл полиморфизма ферментов заключается в повышении эффективности биохимической адаптации путем тонкой настройки метаболических функций в соответствии с изменениями условий среды. Однако, судя по отсутствию качественных изменений состава кислой ДНКазы, приспособительные реакции литоральных моллюсков имеют иную направленность. Долговременное обитание в среде, характеризующейся четко выраженной периодичностью колебаний ключевых факторов, приводит к синхронизации обменных процессов моллюсков с присущей данной акватории приливно-отливной ритмикой (Хлебович, 1981). Вследствие этого, основной адаптивной стратегией литоральных мидий является пережидание неблагоприятного воздействия с максимальной экономией энергетических и пластических ресурсов организма за счет снижения общего уровня метаболизма.

При критической для морских организмов солености (5 %о), у моллюсков происходит, по всей видимости, нарушение конформации или структуры фермента, вследствие чего основные изоформы кислой ДНКазы (Rf 0,16 и 0,24) на энзимограммах выходят одним широким пиком активности с промежуточным значением Rf, равным 0,2.

дж 9к егк дждкегкегк

Рис. 10. Схема энзимограмм множественных форм кислой

ДНКазы окуней из озер Жемчужное(Ж) и Кривое (К).

выводы

1. Сравнительное изучение активности лизосомальных нуклеаз у ряда видов рыб не выявило связи между уровнем нуклеазной активности и видовой принадлежностью объекта. Исследованные виды пресноводных и морских рыб обнаруживают сходное распределение активности кислых нуклеаз в разных органах и тканях. Наибольшая рибо- и дезоксирибонук-леазная активность присуща активно метаболизирующим органам - печень, почки и гонады половозрелых самцов.

2. Выявлено изменение общей активности кислых нуклеаз, фракционного состава и перераспределение активности между отдельными изофор-мами ДНКазы под действием естественных и антропогенных факторов у рыб и беспозвоночных. Активация лизосомальных нуклеаз направлена на реализацию компенсаторных перестроек нуклеинового и, тесно связанного с ним, белкового обмена, а также освобождение клеток от модифицированных макромолекул. Степень активации нуклеаз зависит от природы и силы действующего фактора.

3. Характер варьирования нуклеазной активности лизосом у рыб и водных беспозвоночных при изменении условий обитания указывает на различие стратегий адаптации, обусловленных, помимо таксономической принадлежности, особенностями биологии организмов.

4. Ингибирование кислых нуклеаз токсикантами (в первую очередь, тяжелыми металлами) приводит к снижению адаптивных возможностей организма, уменьшая возможность выживания и успешного размножения.

5. Высокая чувствительность лизосомальных нуклеаз водных организмов к различным типам антропогенного загрязнения позволяет использовать определение активности и молекулярной гетерогенности кислых нуклеаз для оценки состояния гидробионтов в условиях техногенной трансформации водных экосистем.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Морозов Д.Н., Высоцкая Р.У., Амелина B.C. Влияние загрязняющих веществ различной природы на активность нуклеаз окуня Perca Jluviatilis LJ/ Материалы Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения». Апатиты, 2004. с. 69 - 71.

2. Амелина В. С., Ломаева Т. А., Морозов Д. Н. Активность кислых нуклеаз в тканях сига Coregonus lavaretus L. в условиях загрязнения воды отходами железорудного производства // Тез. докл. междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов». Петрозаводск, 2004. с. 12.

3. Высоцкая Р. У., Ломаева Т. А., Амелина В. С., Веселое А. Е., Морозов Д. Н. Активность лизосомальных ферментов у молоди лосося, различающейся выбором участков обитания // Тез. докл. междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004. с. 26.

4. Высоцкая Р. У., Ломаева Т. А., Амелина В. С., Веселое А. Е., Морозов Д. Н. Активность лизосомальных ферментов у молоди лосося, различающейся выбором участков обитания // Матер, междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004. с. 32 - 35.

5. Амелина В. С. Активность кислых нуклеаз в тканях сига при загрязнении водоема отходами железорудного производства // Вестник молодых ученых. № 2. 2004. С. 93 - 95.

6. Амелина В. С., Высоцкая Р. У., Ломаева Т. А., Шкляревич Г. А. Участие ли-зосомальных нуклеаз в адаптивных реакциях морских беспозвоночных // Матер. IX междунар. конф. «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря». Петрозаводск, 2004. С. 27 - 31.

7. Амелина В. С., Морозов Д. Н., Высоцкая Р. У. Биохимические механизмы устойчивости рыб северных водоемов к комплексным загрязнениям // Матер. IX междунар. конф. «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря». Петрозаводск, 2004. с. 31 — 35.

8. Высоцкая Р. У., Ломаева Т. А., Такшеев С. А., Амелина В. С., Бахмет И. Н. Активность лизосомальных и некоторых других ферментов в тканях мидий при разном уровне солености // Мат. IX междунар. конф. «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря». Петрозаводск, 2004. С. 72 - 76.

9. . Амелина В. С., Высоцкая Р. У., Ломаева Т. А. Две стратега« адаптации беспозвоночных к различным типам антропогенного загрязнения // Матер, конф. мол. исследователей «Физиология и медицина». Санкт-Петербург, 2005. С. 7.

10. Амелина В. С. Возрастные особенности спектра лизосомальных нуклеаз в различных органах ряпушки Coregonus albula L. // Онтогенез. Т. 36. № 5.2005. С. 369 - 370.

11. Амелина В. С. Влияние ртутного загрязнения на лизосомальные нуклеазы рыб // Тез. докл. XII молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, 2005. С. 9 — 10.

12. Амелина В. С., Морозов Д. Н., Кашулин Н. А. Эффекты комплексного загрязнения водоема на некоторые биохимические показатели сига Coregonus lavare-tus L. // Матер, конф. «Структурно-функциональные особенности биосистем Севера (3. Высоцкая Р. У., Амелина В. С., Ломаева Т. А., Такшеев С. А., Немова Н. Н. Влияние ацидности и ртутного загрязнен™ на активность ферментов в тканях окуня Perca fluvialilis L. // Матер, конф. «Структурно-функциональные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообщества). Петрозаводск, 2005. С. 85 - 88.

14. Амелина В. С. Влияние буровых растворов на активность кислых нуклеаз морских беспозвоночных // Тез. докл. междунар. конф. «Современные проблемы водной токсикологии», Борок, 2005. С. 5.

15. Высоцкая Р.У., Амелина B.C., Ломаева Т.А., Морозов Д.Н., Кашулин Н.А. Сравнительное изучение ферментных систем сига и ряпушки при загрязнении водоема отходами горонорудного производства // Тез. докл. междунар. конф. «Современные проблемы водной токсикологии», Борок, 2005. С. 25.

16. Амелина В. С. Роль лизосомальных нуклеаз в адаптациях морских организмов к изменению солености воды. // Матер. IV Междунар. конф. «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера». Вологда, 2005. Ч. 1.С. 12-14.

17. Высоцкая Р.У., Амелина B.C., Ломаева Т.А., Шустова Н. К. Изучение влияния компонентов буровых растворов на активность ферментов беломорских мидий (Mylilus edulis L.) И Матер. IV Междунар. конф. «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера». Вологда, 2005. Ч. 1. С. 94 — 95.

18. Амелина В. С. Роль лизосомальных нуклеаз в адаптациях беломорских мидий к опреснению воды. // Тез. докл. междунар. школы молодых ученых «Адаптации гидробионтов», Ростов-на Дону, 2005. С. 11.

19. Амелина В. С., Морозов Д. Н. Влияние стоков медно-никелевого производства на активность лизосомальных нуклеаз у рыб // Тез. докл. 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино: Путинский НЦ РАН, 2006. С. 249.

20. Амелина В. С., Высоцкая Р. У., Комов В. Т. Оценка состояния рыб в условиях ртутного загрязнения водоема по изменению нуклеазнон активности лизосом

// Докл. Московского общества испытателей природы, т. 39: Биотехнология - охране окружающей среды. Москва, 2006. С. 203.

21. Амелина В, С. Изменение электрофоретических спектров кислой ДНКазы мидий при различной солености // Матер, мсждунар. конф., посвящ. 60-летию КарНЦ, «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика». Секция «Биологические науки». Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2006. С. 36 - 37.

22. Высоцкая Р.У., Такшеев С. А., Немова Н. Н., Амелина B.C., Морозов Д. Н. О видоспецифичности биохимических реакций у рыб при разных типах антропогенного воздействия // Матер, междунар. конф., посвящ. 60-летию КарНЦ, «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика». Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2006. С. 75-78.

23. Высоцкая Р.У., Амелина B.C., Немова Н. Н., Стерлигова О. П. Роль ферментов в развитии адаптивных реакций у ряпушки (Coregonus albula) разных возрастных групп // Матер. Междунар. научной конф. «Инновации в науке и образовании - 2006». Калининград: Калининградский гос. технический университет, 2006. С. 78 - 79.

24. Амелина В. С., Высоцкая Р. У., Халаман В. В. Использование биохимических показателей для оценки взаимовлияний животных в сообществах обрастания Белого моря // Матер. X Научной конф. ББС МГУ, пос. Пояконда. 2006. С. 18-21.

25. Высоцкая Р.У., Амелина B.C., Морозов Д. Н., Ломаева Т.А., Кашулин Н. А. Оценка методами энзимодиагностики резистентности рыб к загрязнению водоема отходами медно-никелевого производства // Мат. Междунар. конф. «Современные экологические проблемы Севера (к 100-летию со дня рождения О. И. Семенова-Тян-Шанского)». Апатиты: ИППЭ Севера КНЦ РАН, 2006. С. 160 - 161.

Изд. лиц. № 00041 от 30.08.99. Подписано в печать 03.11.06. Формат 60x84 '/i6. Бумага офсетная. Гарнитура «Times». Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,4. Печ. л. 1,6. Тираж 100 экз. Изд. № 76. Заказ 620.

Карельский научный центр РАН 185003, Петрозаводск, пр. А. Невского, 50 Редакционно-издательский отдел

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Амелина, Виолетта Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ферменты деполимеризации нуклеиновых кислот, классификация.

1. 1. 1. Локализация нуклеаз в клетке.

1.1.2. Структура ферментов.

1. 1.3. Механизм действия и специфичность нуклеаз.

1.2. Особенности нуклеаз водных организмов.

1.3. Биологическая роль кислых нуклеаз.

1. 4. Участие ферментов лизосом в адаптивных реакциях гидробионтов к некоторым факторам среды.^

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2. 1. Характеристика материала.

2. 1. 1. Объекты исследования.

2.1.2. Определение возраста, пола и стадии зрелости гонад.

2. 1.3. Отбор и хранение биологических проб.

2. 2. Методы исследований.

2.2. 1. Приготовление гомогенатов тканей.

2. 2. 2. Определение активности кислых нуклеаз.

2.2. 3. Количественное определение содержания белка в тканях.

2.2. 4. Выявление множественных форм кислой дезоксирибонуклеазы методом электрофореза в полиакриламидном геле.^

2.2.5. Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Распределение нуклеазной активности лизосом в органах и тканях различных видов рыб.

Глава 4. Влияние различных типов антропогенного загрязнения на активность кислых нуклеаз водных организмов.

4. 1. Влияние накопления ртути в тканях рыб в сочетании с закислением и гумификацией водоема на активность кислых нуклеаз окуня Perca fluviatilis.

4. 3. Влияние антропогенного загрязнения морских побережий на активность кислых нуклеаз беспозвоночных гидробионтов. ^

4.4. Изменение нуклеазной активности лизосом двустворчатых моллюсков МуШш ейиИя Ь. под действием нефтепродуктов и буровых ^ растворов в аквариальных экспериментах.

Глава 5. Влияние естественных (абиотических и биотических) факторов 103 на нуклеазную активность лизосом морских гидробионтов.

5. 1. Изменение активности кислых нуклеаз беломорских мидий

МуШш ейиИя Ь. в условиях экспериментальной аноксии.

5. 2. Лизосомальные нуклеазы в приспособительных реакциях морских моллюсков к различной солености воды.

5. 3. Влияние биотических взаимодействий на биохимические показатели мидий МуШиз еёиНБ Ь.

Глава 6. Альтерации спектра множественных молекулярных форм кислой дезоксирибонуклеазы под действием различных факторов среды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов"

Актуальность темы. Проблема адаптации является центральной проблемой в биологии. По определению Дж. Харборна (1985), адаптация «представляет собой способность живых организмов приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды с одновременным повышением вероятности выживания и самовоспроизводства». На клеточном и тканевом уровне приспособительные реакции осуществляются за счет биохимических процессов, изменяющих тип, количество и функциональную активность таких биополимеров, как многочисленные ферменты и функционально специализированные неферментные белки (Хочачка, Сомеро, 1988). Включение механизмов биохимической адаптации невозможно без участия другой важнейшей группы биополимеров - нуклеиновых кислот.

ДНК является носителем наследственной информации. В основе реализации генетической информации, закодированной в геноме клетки, лежат три фундаментальных процесса - репликация (синтез ДНК), транскрипция (синтез РНК) и трансляция (синтез белка). Чрезвычайная важность ДНК и РНК в развитии и жизнедеятельности живых организмов обусловливает интерес к ферментам, участвующим в обмене нуклеиновых кислот.

Многочисленная группа ферментов, осуществляющих расщепление нуклеиновых кислот с образованием фрагментов различной длины, объединяется под названием нуклеазы (Шапот, 1968). К настоящему моменту детально изучены нуклеазы микроорганизмов (Desai, Shankar, 2003; Condon, 2003; Persson et al., 2000), млекопитающих и человека (Барановский и др., 2004; Ikeda et al., 1997; Brambila et al., 2001; Krieser et al., 2002; Evans, Aguilera, 2003), некоторых насекомых (Бочкова, 1980; Коничев и др., 1982; Kawane et al., 2003; Evans et al., 2002). Работы по изучению нуклеаз рыб и других водных организмов единичны (Бердышев, Бабенюк, 1985; Parnsnitskaia et al., 1972; Wagner et al., 1981; Thebault, Raffin, 1984).

Нуклеазы с максимальной активностью при кислых значениях pH локализованы, преимущественно, в лизосомах, где наряду с другими кислыми гидролазами осуществляют катаболические реакции, лежащие в основе важнейших физиологических и биохимических процессов (Покровский, Тутельян, 1976; Высоцкая, Руокалайнен, 1993). В частности, лизосомальным ферментам принадлежит большая роль в процессах внутриклеточного переваривания биополимеров, аутолизе структур и клеток, утративших своё значение, а также, в процессах оплодотворения, спермато- и оогенеза, метаморфоза, дифференцировки, деления и старения клеток, апоптозе, в защите организма от чужеродных агентов, начальных стадиях иммуногенеза, лизисе тканей при повреждении, детоксикации ксенобиотиков (Покровский, Тутельян, 1976; Немова, Высоцкая, 2004; Кулинский, 1999; Барановский и др., 2004; Kohler et al., 2002; Reddy et al., 2001; Evans, Aguilera, 2003; Terman et al., 2006).

Однако, не смотря на столь пристальное внимание, уделяемое роли лизосомальных нуклеолитических ферментов в различных физиологических и патологических процессах, значимость кислых нуклеаз в адаптации практически не исследована. Между тем, изучение модуляции нуклеазной активности лизосом под действием тех или иных факторов именно у водных обитателей, характерной особенностью которых является более тесная связь со средой, могло бы внести существенный вклад в понимание биохимических адаптивных механизмов живых существ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: • определить активность кислых нуклеаз в органах и тканях рыб и беспозвоночных гидробионтов;

• исследовать значимость нуклеаз в ответных реакциях пойкилотермных животных при воздействии на них естественных и антропогенных факторов среды;

• изучить фракционный состав кислых нуклеаз у разных видов гидробионтов;

• выяснить возможность применения исследуемых показателей в эколого-биохимическом мониторинге водоемов.

Научная новизна работы. Получены новые данные по изменению активности и молекулярной гетерогенности состава кислых нуклеаз морских и пресноводных гидробионтов под действием естественных факторов среды (соленость, гипоксия) и различных типов антропогенного загрязнения водоемов (тяжелые металлы, нефтепродукты, компоненты буровых растворов). Впервые показана возможность применения теста активности лизосомальных нуклеаз для оценки химических взаимовлияний животных в сообществах обрастания. Впервые исследована нуклеазная активность лизосом морских беспозвоночных. Охарактеризован спектр изоформ кислой дезоксирибонуклеазы у ранее не изученных в этом отношении объектов.

Практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о роли лизосомальных нуклеаз в биохимических адаптациях водных организмов к естественным, антропогенным и биотическим факторам окружающей среды. Результаты исследований по влиянию различных типов загрязнения воды на исследуемые биохимические показатели указывает на возможность их применения в эколого-биохимическом мониторинге для оценки физиологического состояния гидробионтов при техногенной трансформации водных экосистем.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2004), международной конференции «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря» (Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2004), научной школе-конференции «Современные проблемы биологии развития и биотехнологии» (ИБР, Звенигород, 2005), международной конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (ИЭФиБ и СПбГУ, Санкт-Петербург, 2005), XII молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Коми НЦ Уральское отделение РАН, Сыктывкар, 2005), конференции «Структурно-функциональные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообщества)» (ПетрГУ, Петрозаводск, 2005), международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (ИБВВ РАН, Борок, 2005), IV международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера» (Вологда, 2005), международной школе молодых ученых «Адаптации гидробионтов» (Ростов-на-Дону, 2005), X Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущинский НЦ РАН, Пущино, 2006), международной конференции Московского общества испытателей природы «Биотехнология - охране окружающей среды» (МГУ, Москва, 2006), международной конференции, посвященной 60-летию Карельского НЦ, «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика». Секция «Биологические науки» (Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2006), X научной конференции Беломорской биологической станции МГУ (пос. Пояконда, 2006), выездном заседании Бюро Отделения биологических наук РАН (Петрозаводск, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых И статей и 14 тезисов докладов, в том числе, в центральной реферируемой печати статья и краткое сообщение.

Считаю своим долгом выразить огромную благодарность всем сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН за участие и поддержку, ценные рекомендации и помощь в работе.

Особая благодарность моему научному руководителю д.б.н Римме Ульяновне Высоцкой.

Благодарю к.б.н. И. Н. Бахмета, к.б.н. Н. К. Шустову, Н. Н. Фокину за организацию аквариальных экспериментов и к.б.н. В. В. Халамана, за новое интересное направление исследований.

Хочу поблагодарить моих первых учителей в области биохимии -преподавателей кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, а также моих родных и близких за понимание и моральную поддержку.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Амелина, Виолетта Сергеевна

выводы

1. Сравнительное изучение активности лизосомальных нуклеаз у ряда видов рыб не выявило связи между уровнем нуклеазной активности и видовой принадлежностью объекта. Исследованные виды пресноводных и морских рыб обнаруживают сходное распределение активности кислых нуклеаз в разных органах и тканях. Наибольшая рибо- и дезоксирибонуклеазная активность присуща активно метаболизирующим органам - печень, почки и гонады половозрелых самцов.

2. Показано изменение общей активности кислых нуклеаз, фракционного состава и перераспределение активности между отдельными изоформами ДНКазы под действием естественных и антропогенных факторов у рыб и беспозвоночных. Активация лизосомальных нуклеаз направлена на реализацию компенсаторных перестроек нуклеинового и тесно связанного с ним белкового обмена, а также освобождение клеток от модифицированных макромолекул. Степень активации нуклеаз зависит от природы и силы действующего фактора.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

АК - аминокислота АЦ - активный центр фермента БСА - бычий сывороточный альбумин ДСН - додецилсульфат натрия ПААГ - полиакриламидный гель ПАВ - поверхностно-активные вещества Поли-А - полирибоадениловая кислота Поли-Г - полирибогуаниловая кислота Поли-У - полирибоуридиловая кислота Поли-Ц - полирибоцитидиловая кислота шМ - микромоль Мг - молекулярная масса

ИТ - относительная электрофоретическая подвижность

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В материалах диссертационной работы предпринята попытка выяснения особенностей функционирования лизосомальных нуклеаз в адаптивных реакциях водных организмов на воздействие ряда факторов среды, как естественных, так и обусловленных деятельностью человека.

Изучению значимости кислых нуклеаз в приспособительных реакциях гидробионтов на комплексное воздействие антропогенных и абиотических факторов в природных водоемах предшествовало сравнительное исследование особенностей распределения кислых нуклеаз у рыб в их естественной среде обитания, не затронутой хозяйственной деятельностью человека, с присущими этим водоемам уникальными характеристиками гидрологического режима, которые невозможно смоделировать в аквариальных экспериментах. Анализ полученных данных показал, что при всей очевидности сходства тканевого распределения рибо-и дезоксирибонуклеазной активности у рыб, для этих ферментов характерна высокая степень эколого-физиологической вариабельности, обнаруживаемая уже при сравнении родов и видов, что не позволяет выявить зависимость показателей нуклеазной активности от систематического положения объекта.

Чрезвычайно острая проблема ухудшения качества природных вод в индустриально развитых районах предопределила исследование влияния различных типов загрязнения на благополучие гидробионтов, обитающих в антропогенно трансформированных экосистемах. Сопоставление нуклеазной активности в тканях рыб из водоемов Кольского полуострова с максимальным и фоновым уровнем загрязнения отходами горнообогатительной и металлургической промышленности позволило сделать вывод о различии адаптивных возможностей исследованных видов рыб к воздействию тяжелых металлов - превалирующих компонентов промышленных стоков. К действию указанного типа загрязнения наиболее устойчив окунь, перестройки нуклеинового обмена в тканях этого вида минимальны, несколько меньшую, но также достаточно выраженную резистентность проявляет ряпушка, а наиболее уязвимый вид - сиг. Степень изменения активности коррелированна с уровнем антропогенной нагрузки на биотоп.

Характер варьирования исследуемых показателей выявил различие стратегий адаптивного ответа у разных экологических групп костистых рыб. Так, у пелагических форм приспособительные реакции направлены, главным образом, на повышение барьерной функции жабр, о чем свидетельствует активация ферментных систем лизосом, с одновременным усилением экскреции токсикантов через жаберный эпителий. В то время как, у бентофагов, по-видимому, в основе адаптации к техногенно измененной среде лежит мобилизация детоксикационных функций печени.

Анализ результатов натурного исследования комплексного воздействия накопления ртути в тканях рыб на фоне закисления и повышенного уровня гумусности водоема показал, что сопутствующие факторы (содержание гуминовых и фульвокислот, низкий рН воды) влияют не только на биодоступность токсиканта, но и существенно сказываются на устойчивости гидробионтов к интоксикации организма соединениями ртути. У окуней, выловленных из наиболее неблагополучных по сочетанию указанных факторов озер, наблюдается значительное ингибирование общей нуклеазной активности и выпадение некоторых фракций лизосомальных нуклеаз, что, несомненно, накладывает определенные ограничения на катаболическую компоненту обмена нуклеиновых кислот. В свою очередь, это влечет за собой снижение способности к эффективной модуляции метаболизма, освобождению клеток от полинуклеотидов с нарушенной структурой и, как следствие, угнетение приспособительных возможностей организмов.

При сравнении специфики изменения активности лизосомальных нуклеаз, обусловленных полом рыб, обнаружена большая чувствительность самцов к загрязнению воды промышленными стоками. Сделанный вывод подтверждается численным преобладанием самок в озерах с высокой техногенной нагрузкой.

Исследования изменения общей активности и фракционного состава Беломорских мидий М. еёиШ под влиянием естественных (соленость, гипоксия) факторов и ксенобиотиков различной природы (нефтепродукты, компоненты буровых растворов, сложные комплексные загрязнения в прибрежной зоне Белого моря) выявили чрезвычайно высокую устойчивость мидий приливно-отливной зоны к различным внешним воздействиям, обусловленную неспецифическими механизмами. Основной адаптивной реакцией моллюсков в стрессовых условиях является снижением общего уровня метаболизма. Происходящие при этом изменения, происходящие в организме мидий, не ограничиваются только снижением интенсивности биохимических реакций. Как было показано и в наших исследованиях, и в работах других авторов, переход на новый уровень метаболизма сопряжен с качественными перестройками ферментных систем. Роль нуклеаз наиболее важна на начальных этапах перестройки обмена, и состоит, по-видимому, в обеспечении процессов синтеза новых каталитических и структурных белков пластическим материалом.

Эффективность компенсаторных реакций на уровне нуклеазной активности лизосом у подопытных моллюсков того же вида, но взятых из константной среды, существенно ниже, что свидетельствует о менее развитых приспособительных механизмах. С другой стороны, в силу этой особенности моллюски данной экологической группы представляются более удачным тест-объектом в эколого-токсикологических исследованиях, нежели литоральные.

Таким образом, высокая и адекватная действующим факторам реактивность кислых нуклеаз гидробионтов свидетельствует об их важной роли в адаптационных перестройках обмена нуклеиновых кислот, заключающейся в обеспечении синтеза новых нуклеиновых кислот в клетке за счет реутилизации менее важных и дефектных полинуклеотидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Амелина, Виолетта Сергеевна, Петрозаводск

1. Аминева В. А., Яржомбек А. А. Физиология рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 200 с.

2. Барановский А. Г., Бунева В. Н., Невинский Г. А. Дезоксирибонуклеазы человека // Биохимия. 2004. Т. 69. № 6. С. 725-742.

3. Батурина И. Д., Бердышев Г. Д. Дезоксирибонуклеазы из внутренних органов карпа. Выделение и некоторые свойства. В кн.: Разнокачественность онтогенеза у рыб. Киев: Наукова думка, 1981. С. 164-172.

4. Безбородова А. А. Нуклеазы микроорганизмов. М.: Наука, 1974. 328 с.

5. Бергер В. Я. Эвригалинность морских моллюсков. Экологические, морфофункциональные и эволюционные аспекты. Л.: Зоол. ин-т АН СССР. 1985, 1980.29 с.

6. Бергер В. Я., Луканин В. В. Адаптивные реакции мидии Белого моря на изменение солености среды. В кн.: Исследование мидии Белого моря. Л.: Зоол. ин-т АН СССР, 1985. С. 4-21.

7. Бергер В. Я., Луканин В. В., Лапшин В. В. Дыхание некоторых литоральных беломорских моллюсков в процессе акклимации к изменениям солености среды // Экология. 1970. Т. 5. С. 69-72.

8. Бердышев Г. Д., Бабенюк Ю. Д. Нуклеазы рыб и их изменение в постнаталыюм онтогенезе // В кн.: Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова думка. 1985. С. 77103.

9. Бердышев Г. Д., Проценко Н. А. Генетическая теория гибели тихоокеанских лососей // Современные вопросы экологической физиологии рыб. М.: Наука, 1979. С. 151-159.

10. Благой Ю. П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10. С. 18-24.

11. Бондарева JI. А. 2004. Влияние некоторых факторов среды на внутриклеточный протеолиз у гидробионтов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Петрозаводск, 23 с.

12. Боровский H.A. Изменение гидрохимических показателей воды при попадании буровых компонентов // Газовая промышленность. 1990. N6. С. 30-38.

13. Бочкова А. П. Нуклеазы насекомых. В сб.: Биохимия насекомых. М.: МГПИ, 1980. С. 48-57.

14. Высоцкая Р. У. Лизосомальные ферменты у рыб и влияние на них природных, антропогенных и патогенных факторов. Автореф. диссер. д-ра биол. наук. Петрозаводск, 1999.

15. Высоцкая Р. У., Амелина В. С., Ломаева Т. А., Шустова Н. К. Изучение влияния компонентов буровых растворов на активность ферментов беломорских мидий (Mytilus edulis L.) // Мат. IV

16. Междунар. конф. «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера». Вологда, 2005. Ч. 1. С. 94-95.

17. Высоцкая Р. У., Руокалайнен Т. Р., Крупнова М. Ю. Кислые нуклеазы пресноводных рыб. В сб.: Биохимия пресноводных рыб Карелии. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР, 1980. С. 4752.

18. Высоцкая Р. У., Руокалайнен Т. Р. Об экологической значимости лизосомальных ферментов. В сб.: Теоретические аспекты экологической биохимии. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 1993. С. 78-91.

19. Высоцкая Р. У., Руокалайнен Т. Р. К вопросу о методике определения активности лизосомальных ферментов. В сб.: Оперативно-информациоиные материалы. Комплексные исследования биоресурсов Карелии. Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР, 1978. С. 48-51.

20. Теннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М. Мир, 1997. 624 с.

21. Глушанкова М. А., Пашкова И. М. Аккумуляция тяжелых металлов тканями рыб озер Псковско-Чудского и Выртсъярв // Тез. докл. II всесоюзн. конф по рыбохоз. токсикологии. СПб, 1991. Т. 1. С. 116117.

22. Горбунова А. В. Влияние повышенной мутности на планктонных фильтраторов // Тр. I всесоюз. конф. по рыбохозяйственной токсикологии. Рига, 1988. Ч. 1. С. 45-46.

23. Горомосова С. А. Влияние гипоксии и некоторых ядов на скорость распада и синтеза углеводов в тканях мидий // Биология моря. 1979. Т. 48. С. 66-69.

24. Горомосова С. А., Таможняя В. А. Уровень трансаминазной активности в тканях мидий в норме и в условиях гипоксии // Биология моря. 1979. Т. 48. С. 70-75.

25. Горомосова С. А., Шапиро А. 3. Основные черты биохимии энергетического обмена мидий. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. 120 с.

26. Груздев А.И. Метод электрофоретического анализа изоферментов лакгатдегидрогеназы рыб // Биохимические методы в экологических и токсикологических исследованиях. Петрозаводск, КарНЦ РАН, Институт биологии. 1993. С. 52-57.

27. Еськова Л. А., Слоним А. Д. Влияние Холодовой акклиматизации на терморегуляцию у монгольской песчанки Meriones unguiculatus II Физиол. журн. СССР. 1975. Т. 61. № 3. С. 454-459.

28. Кашулин Н. А., Лукин А. А., Амундсен П.-А. Рыбы пресных вод субаркгики как биоиндикаторы техногенного загрязнения. Апатиты. 1999. 142 с.

29. Керова Н. И., Пухова Г. Г., Чеботарёв Е. Е. Естественные ингибиторы нуклеаз. Киев: Наук, думка, 1974.

30. Кирпичников В. С. Генетика и селекция рыб. Л.: Наука, 1987. 520 с.

31. Кокунин В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Украинский биохимический журнал. 1975. Т. 47, №6. С. 776-790.

32. Колупаев Б. И. Нормальные и патологические изменения у гидробионтов // Биологические науки. 1989. № 4. С. 51-55.

33. Комаровский Ф. Я., Полищук Л. Р. Ртуть и другие тяжелые металлы в водной среде: миграции, накопление, токсичность длягидробионтов (обзор) // Гидробиологический журнал. 1981. Т. 17. №5. С. 71-82

34. Коничев А. С., Водолеев А. С., Севастьянова Г. А., Филиппович Ю. Б. Выделение, очистка и свойства кислой рибонуклеазы лизосомальной фракции грены тутового шелкопряда // Биохимия. 1980. Т. 45. №5. С. 821-828.

35. Куриненко Б. М., Юсупова Д. В. Некоторые аспекты биологической роли ДНК-деполимераз в связи с их локализацией в клетке. В кн.: Некоторые подходы к изучению биологической роли нуклеаз. Казань: Изд-во Казансткого ун-та, 1972. С. 2-26.

36. Кярнер Ю.К. Роль лизосом в дифференцировке и функционировании клеток развивающихся и дефинитивных тканей: Автореф. докт. биол. наук. Л., 1983. 41с.

37. Левицкий А.П., Барабаш Р.Д., Коновец В.М. Сезонные особенности активности рибонуклеазы и а-амилазы слюны и слюнных желез у крыс линии Вистар // Биохимическая эволюция. Л.: Наука, 1973. С. 192-195.

38. Леменовский Д. А. Соединения металлов в живой природе // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 9. С. 48-53.

39. Леонов А. В., Чичерина О. В. Вынос биогенных веществ в Белое море с речным стоком // Водные ресурсы. 2004. Т. 31. № 2. С. 170 -192.

40. Луканин В. В. Изменение обмена и диапазона активности у беломорских мидий при акклимации к различным соленостям. В кн.: Моллюски: Пути, методы и итоги изучения. Л.: Наука, 1971. С. 36-37.

41. Луканин В. В. Распространение мидии МуШш ейиИь в Белом море. В кн.: Исследование мидии Белого моря. Л.: Зоол. ин-т АН СССР,1985. С. 45-58.

42. Лукьяненко В. И. Экологические аспекты ихтиотоксикологии. М.: ВО «Агропромиздат», 1987. 240 с.

43. Максимович Н. В., Морозова М. В. Структурные особенности макрообрастания субстратов промышленной марикультуры мидий (Белое море)//Труды БиНИИ СПбГУ. 2000. Т. 46. С. 85-108.

44. Маурер Г. Диск-электрофорез: теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир. 1971.247 с.

45. Миронов О. Г. Проблема самоочищения и гидробиологический метод борьбы с загрязнением морской среды. В кн.: Биологическое самоочищение и формирование качества воды. М.: Наука, 1975. С. 19-22.

46. Моисеенко Т. И., Кудрявцева Л. П. Экотоксикологическая оценка техногенных гидрохимических аномалий (на примере Кольского горно-металлургического комплекса) // Геохимия. 1999. № 10. С. 1112-1130.

47. Моисеенко Т. И., Шарова Ю. Н. Физиологические механизмы деградации популяций рыб в закисленных водоемах // Экология. 2006. № 4. С. 287-293.

48. Мур Дж.В., Рамамурти С. Тяжелые металлы в природных водах. М.: Наука, 1987.285 с.

49. Назаренко И.И., Кислоева И.В., Кашина Л.И. и др. Атомно-абсорбционное определение ртути в водах после сорбционного концентрирования на полимерном тиоэфире. Журн. Анал. Химии.1986. Т. 11. Вып. 8. С. 1385-1390.

50. Наумов А. Д., Оленев А. В. Зоологические экскурсии на Белом море: Пособие для летней учебной практики по зоологии беспозвоночных. Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1981. 176 с.

51. Недовесова 3. П. Активность нуклеаз овулировавшей икры и зародышей карпа (Cyprinus carpió) // IV Всесоюзн. совещание эмбриологов. Тез. докл. М.: Наука, 1981. С. 131-132.

52. Нейфах А. А., Тимофеева М. Я. Молекулярная биология процессов развития. М.: Наука, 1977. 312 с.

53. Немировская И. А. Антропогенные и природные углеводороды в экосистеме Белого моря // Матер. IX междунар. конф. «Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря». Петрозаводск, 2005. С. 244-248.

54. Немова H. Н. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб. М.: Наука, 2005. 169 с.

55. Немова H. Н., Высоцкая Р. У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука, 2004.215 с.

56. Немова H.H. Распределение активности кислой протеиназы во фракциях белка из икры форели до и после оплодотворения // Сравнительная биохимия водных животных. Петрозаводск: Карел, фил. АН СССР, 1983. С. 111-118.

57. Нечаевский Ю. В., Иванов В. А. Кислая ДНКаза сперматозоидов вьюна Misgurnus fossilis L. (кандидат на роль фермента, инициирующего элиминацию клеток) // Докл. АН. 1995. Т. 343. № 4. С. 551-554.

58. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма. М. Мир, 1977. 407 с.

59. Озернюк Н. Д. Механизмы адаптаций. М.: Наука, 1992. 272 с.

60. Озернюк Н. Д. Феноменология и механизмы адаптационных процессов. М.: Изд-во МГУ, 2003.215 с.

61. Оно С. Генетические механизмы прогрессивной эволюции. М.: Мир, 1973.227 с.

62. Отчет ТИНРО. Оценка воздействия нефтегазовых разработок на биоресурсы Охотского моря. 1996. http://www.sakhalin.environment.ru/oil/burothod/material/tinro.php

63. Панин JI. Е. Энергетические аспекты адаптации. М.: Медицина. 1978. 192 с.

64. Патин С.А. Добыча нефти и газа на морском шельфе: эколо-го-рыбохозяйственный анализ // Рыбное хозяйство. 1994. N 5. С. 3033.

65. Паус К.Ф. Буровые растворы. М.: Недра. 1973. 216 с.

66. Позднякова Ю. М., Пивненко Т. Н., Касьяненко Ю. И Влияние эндогенных ферментов на состав олигонуклеотидов при их выделении из гонад гидробионтов 2003// Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5. С. 524-529.

67. Покровский А. А., Крыстев JI. П. Печень, лизосомы и питание. София. 1977. 208 с.

68. Покровский А. А., Тутельян В. А. Лизосомы. М.: Наука, 1976. 382 с.

69. Покровский А.А., Арчаков А.И. Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1968. С. 5-59.

70. Проблемы химического загрязнения вод Мирового океана. Том 4. Влияние нефти и нефрепродуктов на морские организмы и их сообщества / под ред. Миронова О. Г. Л.: Гидрометеоиздат, 1985. 136 с.

71. Райдер К., Тейлор К. Изоферменты. М.: Мир, 1983.107 с.

72. Рассказов В. А., Кожемяко В. Б. О специфичности кислых ДНКаз морских организмов к локальной конформации В-ДНК // Докл. АН СССР. 1987. Т. 294. № 6. С. 1497-1500.

73. Руднева И.И. Ответные реакции морских животных на антропогенное загрязнение Черного моря. Автореф на соиск. ученой степени докт. биол. наук. Москва, 2000.

74. Сибирцев Ю. Т., Рассказов В. А. Энлонуклеазы зрелых яйцеклеток морского ежа 51гоп^у1осеЫгоЫ8 ШегтесИш, производящие органический гидролиз ДНК // Докл. АН СССР. 1983. Т. 271. № 2. С. 478-480.

75. Сидоренко С. В. Инфекционный процесс как "диалог" между хозяином и паразитом // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. Т. 3. N 4. С. 301-315.

76. Слоним А.Д. Экологическая физиология животных. М.: Высшая шк., 1971.447 с.

77. Степанова И.К., Комов В.Т. Ртуть в абиотических и биотических компонентах озер Северо-Запада России // Экология. 1996. Т.27. № 3. С. 198-203.

78. Тарасенко С. Н., Христов О. А., Кочет В. Н. Особенности накопления металлов рыбами в условиях техногенного загрязнения водной среды // Тез. докл. VI съезда Всесоюзн. гидробиол. общ. Мурманск, 1991. Т. 2. С. 144-146.

79. Трахтенберг И. М., Иванова Л. А. Современные представления о воздействии ртути на клеточные мембраны // Гигиена и санитария. 1984. №5. С. 59-63.

80. Трахтенберг И. М., Колесников В. С., Луковенко В. П. Тяжелые металлы во внешней среде. Минск, 1994. С. 10-13.

81. Фролов В. А. О связи количества лизосом в миокарде с интенсивностью деления митохондрий и коэффициентом их энергетической активности // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1974. Т. 77. №3. С. 106-109.

82. Халаман В. В. Сопряженность пространственных распределений организмов в Беломорских сообществах обрастания // Журнал общей биологии. 1998. Т. 59. № 1. С. 58-73.

83. Харазова А. Д., Луканин В. В., Насонова Е. А. Включение ЗН-уридина в камбиальные и дифференцированные клетки жиберного эпителия мидий {Муй1ш ейиИ£) при комбинированном действии температуры и солености // Цитология, 1980. Т. 22. № 8. С. 930937.

84. Харазова А.Д., Бергер В.Я. Изменения синтеза РНК в тканях моллюска ЬШоппа ГШогеа при понижении солености среды // Цитология. 1974. Т. 16. № 2. С. 241-243.

85. Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию. М.: Мир, 1985. 312 с.

86. Хлебович В. В. Акклимация водных животных. Л.: Наука, 1981. 136 с.

87. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. 568 с.

88. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов. 1983. 414 с.

89. Чекунова М. П., Фролова А. Д. Роль лизосом в токсикологии металлов // Структура и функции лизосом: Тез. докл. 3-го Всесоюз. симпоз. Тбилиси: ХОЗУ Минуралсибстроя СССР. 1986. С. 228-229.

90. Челомин В. П., Бельчева Н. Н., Захарцев М. В. Биохимические механизмы адаптации мидии МуШш 1го5Би1ш к ионам кадмия и меди // Биология моря. 1998. Т. 24. № 5. С. 319-325.

91. Шапиро А. 3., Бобкова А. Н. Изменение активности ферментов гликолиза в тканях балянусов под влиянием некоторых ядов // Биология моря. 1979. Т. 48. С. 75-84.

92. ШапотВ. С. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968. 212 с.

93. Шляховенко В. А., Негрей Г. 3. О роли перестроек изоэлектрических и электрофоретических спектров рибонуклеаз в лейкозогенезе. В кн.: Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова думка, 1985. С. 11-17.

94. Штадлер Д. В., Миронова Н. JL, Зенкова М. А., Власов В. В. Основы специфичности взаимодействия белков и нуклеиновых кислот//Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. № 2. С. 286-297.

95. Ahokas R. A., Duerr F. G. Salinity tolerance and extracellular osmoregulation in two species of euryhaline teleosts, Culaea inconstans and Fundulus diaphanous II Сотр. Biochem. Physiol. 1975. V. 52. N 3. P. 445-448.

96. Altieri A. H., Witman J. D. Local extinction of a foundation species in a hypoxic estuary: integrating individuals to ecosystem // Ecology. 2006 V. 87. №3. P. 717-730.

97. Arctic Pollution (AMAP). Oslo, 2002.212 p.

98. Ashe H., Seamon E., Vinskis H. V., Levine L. Characterization of a deoxyribonuclease of Mystelus canis liver // Biochim. et biophys. acta. 1975. V. 99. N2. P. 298-306.

99. Bacchiocchi S., Principato G. Mitochondrial contribution to metabolic changes in the digestive gland of Mytilus galloprovincialis during anaerobiosis // J. Exp. Zool. 2000. V. 286. P. 107-113.

100. Baker K. P., Baron W. F., Henzel W. J., Spencer S. A. Molecular cloning and characterization of human and murine DNase II // Gene. 1998. V. 215. N2. P. 281-289.

101. Bakhmet I. N., Berger V. Ja. and Khalaman V.V. The effect of salinity change on the heart rate of Mytilus edulis specimens from differentecological zones // J. Experim. Marine Biology and Ecology. 2005. V. 318. N2. P. 121-126.

102. Ball T. K., Benedik M. J. Disulfide bonds are required for Serratia marscense nuclease activity // Nucleic Acids Research. Vol. 20. N. 19. P. 4971-4974.

103. Barnard E. A. Ribonucleases // Annu. Rev. Biochem. 1969. V. 38. P. 677-732.

104. Barrett A.J., Heath M.F. Lysosomal enzymes // Lysosomes. A laboratory Handbook. Amsterdam-N.Y.-Oxford, 1977. P. 19-145.

105. Bartholeyns J., Baudhuin P. Purification of rat liver particulate neutral ribonuclease and comparison of properties with pancreas and serum ribonucleases // Biochem. J. 1977. V. 164. N 3. P. 675-83.

106. Bayne B. L., Moore M. R., Koehn R. K. Lysosomes and the response by Mutilus edulis L. to an increase un salinity // Mar. Biol. Lett. 1981. N2. P. 193-204.

107. Beintema J. J., Blank A., Schieven G. L., Dekker C. A., Sorrentino S., Libonati M. Differences in glycosylation pattern of human secretory ribonucleases //Biochem. J. 1988. V. 255. N 2. P. 501-505.

108. Belli S. I., Goding J. W. Biochemical characterization of human PC-1, an enzyme possessing alkaline phosphodiesterase I and nucleotide pyrophosphatase activities // Eur. J. Biochem. 1994. V. 226. N 2. P. 433-443.

109. Bernardi G. Dimeric structure and allosteric properties of spleen acid deoxyribonuclease // J. Mol. Biol. 1965. V. 13. N 2. P. 603-605.

110. Birnboim F. Cellular site in Bacillus subtilis of a nuclease which preferentially degrades single-stranded nucleic acids // J. Bacteriol. 1966. V.91.N3.P. 1004-1011.

111. Bitensky L. Lysosomes and connective tissue diseases // J. Clin. Path. V. 31. (Roy. Coll. Path. V. 12). 1978. P. 105-116.

112. Bose S., Ghosh P., Bhattacharya S. Distribution kinetics of inorganic mercury in the subcellular fractions of fish liver. Sci. Total Environ. 1993. Suppl. Pt. l.P. 533-558.

113. Boyd J. B. Characterization of an acid active deoxyribonuclease from the larval salivary gland of Drosophila hydei II Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 209 N2. P. 349-356.

114. Brambila E., Tenorio N., Garcia-Luna E., Waalkes M. P. Effect of abdominal surgery on the activity of acid and alkaline ribonucleases in rats // Exp. Mo.l Pathol. 2001. V. 71. N 2. P. 125-131.

115. Bulnheim H.P. Comparative studies on the physiological ecology of five euryhaline Gammarus species. Oecologia (Berl.). 1979. Vol. 44, pp. 80-86.

116. Cacia J., Quan C. P., Pai R., Frenz J. Human DNase I contains mannose 6-phosphate and binds the cation-independent mannose 6-phosphate receptor//Biochemistry. 1998. V. 37. N 43. P. 154-161.

117. Chow T. Y., Fraser M. J. Purification and properties of single strand DNA-binding endo-exonuclease of Neurospora crassa II J. Biol. Chem. 1983. V. 258. N19. P. 110-118.

118. Clark P., Eichhorn G. L. A predictable modification of enzyme specificity. Selective alteration of DNA bases by metal ions to promote cleavage specificity by deoxyribonuclease // Biochemistry. 1974. V. 13. N25. P. 5098-5102.

119. Condon C. RNA processing and degradation in Bacillus subtilis II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. N 2. P. 157-174.

120. Cordis G. A., Goldblatt P.-J., Deutscher M. Purification and characterization of a major endonuclease from rat liver nuclei // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 596-603.

121. Côté J., Renaud J., Ruiz-Carrillo A. Recognition of (dG)n.(dC)n sequences by endonuclease G. Characterization of the calf thymus nuclease // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. N 6. P 3301-3310.

122. Côté J., Ruiz-Carillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G // Science. 1993. V. 261. P. 765-769.

123. Crary S. M., Niranjanakumari S., Fierke C.A. The protein component of Bacillus subtilis ribonuclease P increases catalytic efficiency by enhancing interactions with the 5' leader sequence of pre-tRNAAsp // Biochemistry. 1998. V. 37. N 26. P. 409-416.

124. Davenport J. Osmotic control in marine animals // Symp. Soc. Exp. Biol. 1985. V. 39. P. 207-244.

125. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins//Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.

126. Deane E. E., Kelly S. P., Luk J. C., Woo N.Y. Chronic salinity adaptation modulates hepatic heat shock protein and insulin-like growth factor I expression in black sea bream // Mar. Biotechnol. N.-Y. 2002. V.4.N2. P. 193-205.

127. Decker R. S., Wildenthal K. Lysosomal alterations in hypoxic and reoxygenated hearts. I. Ultrastructural and cytochemical changes // Am. J. Pathol. 1980. V. 98. № 2. P. 425-444.

128. Desai N. A., Shankar V. Single-strand-specific nucleases // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 26. N 5. P. 457-91.

129. Dobretsov S., Dahms H-U, Qian P.Y. Antilarval and antimicrobial activity of waterborne metabolites of the sponge Callyspongia (Euplacella) pulvinata: evidence of allelopathy // Mar. Ecol. Prog. Ser., 2004, V. 271, P.133-146.

130. Doherty A. J., Worrall A. F., Connolly B. A. The roles of arginine 41 and tyrosine 76 in the coupling of DNA recognition to phosphodiesterbond cleavage by DNase I: a study using site-directed mutagenesis // J. Mol. Biol. 1995. V. 251. N 3. P. 366-377.

131. Domouhtsidou G. P., Dimitriadis V. K. Lysosomal and lipid alterations in the digestive gland of mussels, Mytilus galloprovincialis (L.) as biomarkers of environmental stress // Environ. Pollut. 2001. V. 115. N l.P. 123-137.

132. Drew H. R. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases // J. Mol. Biol. 1984. V. 176. N 4. P. 535-357.

133. Egami F., Nakamura K. Microbial ribonucleases. N-Y.: Springer, 1969. 36 p.

134. Engel S., Pawlik J.R. Allelopathic activities of sponge extracts // Mar. Ecol. Progr. Ser. 2000. V. 207. P. 273-281.

135. Eskin B., Morgan A. R. DNA nicking-closing activity from salmon testes // Can. J. Biochem. 1978. V. 56. N 2. P. 89-91.

136. Evans C. J., Aguilera R. J. DNase II: genes, enzymes and function // Gene. 2003. V. 322. P. 1-15.

137. Fan T. W., Higashi R. M., Macdonald J. M. Emergence and recovery response of phosphate metabolites and intracellular pH in intact Mytilus edulis as examined in situ by in vivo 31P-NMR // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1092. N 1. P. 39-47.

138. Fan T. W., Higashi R. M., Macdonald J. M. Emergence and recovery response of phosphate metabolites and intracellular pH in intact Mytilus edulis as examined in situ by in vivo 31P-NMR // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1092. № 1. P. 39-47.

139. Fang X. W., Yang K., Littrell S., Niranjanakumari P., Pan T. The Bacillus subtilis RNase P holoenzyme contains two RNase P RNA and two RNase P protein subunits // RNA. 2001. V. 7. P. 233-241.

140. Favre D., Ngai P. K., Timmis K. Relatedness of a Periplasmic, Broad-Specificity RNase from Aeromonas hydrophila to RNase I of Escherichia coli and to a Family of Eukaryotic RNases // J. Bacteriol. 1993. V. 175. N12. P. 3710-3722.

141. Fernandez M., Cao J., Villamarin J. A. In vivo phosphorylation of phosphofruetokinase from the bivalve mollusk Mytilus galloprovincialis II Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 353. P. 251-256.

142. Fisher S.W. Changes in the toxicity of three pesticides as a function of environmental pH and temperature. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1991. Vol. 46, pp. 197-202.

143. Franke I., Meiss G., Blecher D., Gimadutdinow O., Urbanke C., Pingoud A. Genetic engineering, production and characterisation of monomeric variants of the dimeric Serratia marcescens endonuclease // FEBS Lett. 1998. V. 425. N 3. P. 517-22.

144. George S. G. Subcellular accumulation and detoxication of metals in aquatic animals // Physiological mechanisms of marian pollutant toxicity. N.-Y., 1982. P. 3-52.

145. Givol D., Goldberger R. F., Anfinsen C. B. Oxidation and disulfide interchange in the reactivation of reduced ribonuclease // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 3114-3116.

146. Grahl K., Franfe P., Hallebach R. The excretion of heavy methals by fish // Symposia Biologia Hungarica. 1985. № 29. P. 357-365.

147. Gray J.S. The ecology of marine sediments. Cambridge University Press, Cambridge, 1981.

148. Guerra-Rivas G., Gomez-Gutierrez C. M., Marquez-Rocha F. J. Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on the pallial fluid bufferingcapacity of the marine mussel, Mytilus galloprovincialis II Comp. Biochem. Physiol. 2002. V. 132. P. 171-179.

149. Gutte B. Study of RNase A mechanism and folding by means of synthetic 63-residue analogs // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. N 2. P. 663-670.

150. Haines A. T., Komov V.T., Jagoe C.H. Lake acidity and mercury content of fish in Darvin National Reserve, Russia // Environ. Pollut. 1992. Vol. 78. P. 107-112.

151. Halton D. W. Nutritional adaptations to parasitism within the platyhelminthes // Int. J. Parasitol. 1997. V. 27. N 6. P. 693-704.

152. Harosh I., Mezzina M., Harris P. V., Boyd J.B. Purification and characterization of a mitochondrial endonuclease from Drosophila melanogaster embryos // Eur. J. Biochem. 1992. V. 210. N 2. P. 455460.

153. Harwell M. A., Gentile J. H. Ecological significance of residual exposures and effects from the Exxon Valdez oil spill // Integr. Environ. Assess. Manag. 2006. V. 2. N 3. P. 204-246.

154. Heppel L. A. Selective release of enzymes from bacteria. // Science. 1967. V. 156. N 781. P. 1451-1455.

155. Hintelmann H., Welbourn P. M., Evans R. D. Measurement of complexation of methylmercury (II) compounds by freshwater humic substances using equilibrium dialysis // Environ. Sci. and Technol. 1997. Vol. 31. P. 489-495.

156. Ibarguren I., Villamarin J. A., Barcia R., Ramos-Martinez J. I. Effect of hypoxia on glycolysis in the adductor muscle and hepatopancreas of themarine mussel Mytilus galloprovincialis Lmk // Rev. Esp. Fisiol. 1989. V. 45. №4. P. 349-355.

157. Ikeda S., Hasegawa H., Kaminaka S. A 55-kDa endonuclease of mammalian mitochondria: comparison of its subcellular localization and endonucleolytic properties with those of endonuclease G // Acta. Med. Okayama. 1997. V. 51. N 2. P. 55-62.

158. Impact of oil, individual hydrocarbons and related chemicals on the marine environment, including used lubricant oils, oil spill control agents and chemicals used offshore. Rep.Stud. GESAMP, 1993.178 p.

159. Ito K., Matsuura Y., Minamiura N. Purification and characterization of fungal nuclease composed of heterogeneous subunits // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 309. N 1. P. 160-167.

160. Jackson J. B. C., Buss L. W. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V.72. P. 5160-5163.

161. James K., Hargreave T. B. Immunosupression by seminal plasma and its possible clinical significance // Immunol. Today. 1984. V. 5. P. 357-363.

162. Jernelov A., Rosenberg R. Stress tolerance of ecosystems. Environ. Conserv. 1976. Vol. 3, pp. 43-46.

163. Jones S. J., Worrall A. F., Connolly B. A. Site-directed mutagenesis of the catalytic residues of bovine pancreatic deoxyribonuclease I // J. Mol. Biol. 1996. V. 264. N 5. P. 1154-1163.

164. Joullie, M. M., Leonard, M. S., Portonovo, P., Liang, B., Ding, X. B. and La Clair, J. J. Chemical defense in ascidians of the Didemnidae family // Bioconjugate Chem., 2003, V.14, P. 30-37.

165. Junowicz E, Spencer JH.Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. II. The effect of different bivalent metals on thespecificity of degradation of DNA.Biochim Biophys Acta. 1973b. V. 312. N l.P. 85-102.

166. Junowicz E., Spencer J. H. Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. I. General properties and activation with different bivalent metals // Biochim. Biophys. Acta. 1973a. V. 312. N 1. P. 7284.

167. Karin M. Metallothioneins: protein in search of function // Cell. 1985. V. 41. P. 9-10.

168. Kawane K., Fukuyama H., Yoshida H., Nagase H., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Okada K., Iida T., Nagata S. Impaired thymic development in mouse embryos deficient in apoptotic DNA degradation //Nat. Immunol. 2003. V. 4. N 2. P. 138-144.

169. Kit I. I., Shuvaiva H. I., Drel V. R. Ihumentseva N. I., Drobot L. B. Study of expression of deoxyribonucleases in mammalian cells by a protein renaturation method in polyacrylamide gel // Ukr. Biochim. Zn. 2002. V. 74. N3. P. 116-119/

170. Klerowsky R. Z. The influence of low salinity and dessication on the survival, osmoregulation and water balance of Littorina littorea II Polsk. Arch. Hydrobiol. 1963. V. 11. N 2. P. 241-250.

171. Kohler A., Wahl E., Soffker K. Functional and morphological changes of lysosomes as prognostic biomarkers of toxic liver injury in a marine flatfish (Platichthys flesus (L.)) // Environ. Toxicol. Chem. 2002. V. 21. N 11. P. 434-444.

172. Krieser R. J., Eastman A. The cloning and expression of human deoxyribonuclease II. A possible role in apoptosis // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N47. P. 909-914.

173. Krug P. J. Defense of benthic invertebrates against surface colonization by larvae: a chemical arms race // Prog. Mol. Subcell. Biol. 2006. V. 42. P. 1-53.

174. Kuligowska E., Klarkowska D., Szarowsky J. W. Purification and properties of endonuclease from wheat chloroplasts, specific for single-stranded DNA//Phytochemistiy. 1998. V. 27. P. 1275-1279.

175. KunitzM. Crystalline desoxyribonuclease; isolation and general properties; spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity//J. Gen. Physiol. 1950. V. 33. P. 349-362.

176. Kurz A. K., Schliess F., Haussinger D. Osmotic regulation of the heat shock response in primary rat hepatocytes // Hepatology. 1998. V. 28. N 3.P. 774-781.

177. Laskowski M. Sr. Enzymes hydrolyzing DNA // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1959. V. 81. P. 776-783.

178. Laskowski M. Sr. DNases and their use in the studies of primary structure of nucleic acids // Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 1967. V. 29. P. 165-220.

179. Laskowski M. Sr. Purification and properties of the mung bean nuclease • // Methods Enzymol. 1980. V. 65. N 1. P. 263-276.

180. Lawrence A.J., Poulter C. Development of a sub-lethal pollution bioassay using the estuarine amphipod Gammarus duebeni. Wat. Res. 1998. Vol.32,No.3,pp. 569-578.193. Lyon etal., 2000

181. Lee O. O., Qian P. Y. Chemical control of bacterial epibiosis and larval settlement of Hydroides elegans in the red sponge Mycale adherens II Biofouling. 2003. V. 19. P. 171-180.

182. Lee RF, Sauerheber R, Benson AA. Petroleum hydrocarbons: uptake and discharge by the marine mussel Mytilus edulis // Science. 1972. V. 177. P. 344-346.

183. Liao Y. D. A pyrimidine-guanine sequence-specific ribonuclease from Rana catesbeiana (bullfrog) oocytes // Nucleic. Acids. Res. 1992. V. 20. N6. P. 1371-1377.

184. Libonati M., Gotte G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers // Biochem. J. 2004. V. 380. N2. P. 311-327.

185. Libonati M., Sorrentino S. Degradation of double-stranded RNA by mammalian pancreatic-type ribonucleases // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 234-248.

186. Libonati M., Sorrentino S. Revisiting the action of bovine ribonuclease A and pancreatic-type ribonucleases on double-stranded RNA // Mol. Cell. Biochem. 1992. V. 117. N2. P. 139-151.

187. Lindahl T., Gaily J. A., Edelman G. M. Deoxyribonuclease IV: a new exonuclease from mammalian tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 62. N2. P. 597-603.

188. Lindahl T., Gaily J. A., Edelman G. M. Properties of deoxyribonuclease 3 from mammalian tissues. J Biol Chem. 1969b. Sep 25;244(18):5014-9. No abstract available.

189. Lindquist N., Hay M.E. Can small rare pray be chemically defended? // Ecology. 1995. V. 76. N 4. P. 1347-1358.

190. Linn S. Tabulation of some well-characterized enzymes with deoxyribonuclease activity. In: Nucleases. N.-Y., 1982. P. 341-357.

191. Loeb V., Siegel V., Holm-Hansen O., Hewitt R., Fraser W., Trivelpiece W., Trivelpiece S. Effects of sea-ice extent and krill or salp dominance on the Antarctic food web. Nature. 1997. Vol. 387, pp. 897-900.

192. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

193. Lu B. C., Wong W., Fanning L., Sakaguchi K. Purification and characterization of an endonuclease from fruiting caps of basidiomycete Coprinus cinereus II Eur. J. Biochem. 1988. V. 174. N 4. P. 725-732.

194. MacLea K. S., Krieser R. J., Eastman A. Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease II alpha // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. N2. P. 415-421.

195. Maeda M., Taga N. Extracellular nuclease produced by a marine bacterium. II. Purification and properties of extracellular nuclease from a marine Vibrio sp. // Can. J. Microbiol. 1976. V. 10. P. 1443-1452.

196. Manio J. Response of headwater lakes to air pollution changes in Finland. Helsinki. 2001.63 p.

197. Marigomez J. A., Soto M., Angulo E. Responses of winkles digestive cells and their lysosomal system to environmental salinity changes // Cell. Mol. Biol. 1991. V. 37. N 1. P. 29-39.

198. Marigomez I., Baybay-Villacorta L. Pollutant-specific and general lysosomal responses in digestive cells of mussels exposed to model organic chemicals // Aquat. Toxicol. 2003. V. 64. N 3. P. 235-257.

199. Marshall J. M. Distributions of chymotrypsinogen, procarboxypeptidase, desoxyribonuclease, and ribonuclease in bovine pancreas // Exp. Cell. Res. 1954. V. 6. N 1. P. 240-242.

200. Matousek J., Trnena L., Oberhauser R., Lichtenstein C. P., Nellen W. dsRNA degrading nucleases are differentially expressed in tobacco anthers // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1994. V. 375. N 4. P. 261-269.

201. Mazeaud M. M., Mazeaud F. The role of catecholamines in the stress response of fish // Stress and fish. Ed. Pickering A. D. London: Academic. 1981. P. 49-75.

202. McDonald D. G. The effects of H+ upon the fish gills of freshwater fish // Can. J. Zool. 1983. V. 61. P. 691-703.

203. McDonald M. R. Deoxyribonuclease from salmon testes. I. Purification and properties // J. Gen. Phys. 1962. V. 45. N 4. P. 77-92.

204. McLucky D., Bryant V. and Campbell R. The effects of temperature and salinity on the toxicity of heavy metals to marine and estuarine invertebrates // Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. 1986. Vol. 24, pp. 481520.

205. Mela L., Goodwin C. W., Miller L. D. In vivo control of mitochondrial enzyme concentrations and activity by oxygen//Am. J. Physiol. 1976. V. 231. P. 1811-1816.

206. Mercury study report to congress: Overwiew / U. S. EPA (U. S. Environmental Protection Agency). N. Y., Washington DS. 1997.

207. Miller M. D., Krause K. L. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis // Protein Sci. 1996. V. 5.N1.P. 24-33.

208. Miyagawa T., Enguchi Y. Acid deoxyribonuclease, acid phosphodiesterase and acid phosphotase of neww born rat epidermis (skin): multiple forms and glycoprotein nature // Comp. Biochem. and Phisiol. 1981. V. 69. N. l.P. 39-43.

209. Moiseenko T., Kudryavtseva L. Trace metal accumulation and fish pathologies in areas affected by mining and metallurgical enterprises in Kola region, Russia// Environ. Poll. 2002. V. 114. P. 285-297.

210. Moloney C.L., Ryan P.G. Antarctic marine food webs. In: Nierenberg, W.A. (Ed.), Encyclopedia of Environmental Biology. 1995. Vol. 1. Academic Press, San Diego.

211. Monko M., Kuligowska E., Szarowsky J. R. A single-strand specific nuclease from a fraction of wheat chloroplast stromal protein // Phytochemistry. 1994. V. 37. P. 301-305.

212. Moore M. N., Viarengo A. Lysosomal membrane fragility and catabolism of cytosolic proteins: evidence for a direct relationship // Experimentia. 1987. V. 43. P. 320-323.

213. Moore M.N. Cellular responses to pollutants // Mar. Pollut. Bull. 1985. Vol. 16. P. 134-139.

214. Moore M. N. Cellular responses to polycyclic aromatic hydrocarbons and Phénobarbital in Mytilus edulis // Mar. Environ. Res. 1979. V. 2. P. 255-263.

215. Morosoli R., Lusena C. V. An endonuclease from yeast mitochondrial fractions //Eur. J. Biochem. 1980. V. 110. N 2. P.431-417.

216. Muko S., Sakai K., Iwasa Y. Dynamics of marine sessile organisms with space-limited growth and recruitment: application to corals // J. Theor. Biol. 2001. V. 210. P. 67-80.

217. Murai K., Yamanaka M., Akagi K., Anai M. Purification and properties of deoxyribonuclease II from human urine // J. Biochem. (Tokyo). 1980. V. 87. N4. P. 1097-1103.

218. Nagelkerken I. A., Debrot A. O. Mollusc communities of tropical rubble shores of CuraDao: long-term (7+ years) impact of oil pollution // Marine Pollution Bull. 1995. V. 30. № 9. p. 592-598.

219. Naseem I., Hadi S. M. Single-strand-specific nuclease of pea seeds: glycoprotein nature and associated nucleotidase activity // Arch. Biochem. Biophys. 1987. V. 255. N 2. P. 437-445.

220. Natochin Ju. V., Berger V. Ja., Khlebovich V. V., Lavrova E. A., Mikhailova O. Ju. The participation of electrolytes in adaptation mechanisms of intertidal moluscs cells to altered salinity // Compar. Biochem. Physiol. 1979. V. 63A. P. 115-119.

221. Neu H. C., Heppel L. A. The release of ribonuclease into the medium when Escherichia coli cells are converted to spheroplasts // J. Biol. Chem. 1964. V. 23. P. 3893-3900.

222. Novikoff A.B. Lysosomes: a personal account // Lysosomes and Storage Diseases. London: Academic Press. 1973. P. 1-41.

223. Obinata M., Mizuno D. Intracellular localization of deoxyribonucleases in Escherichia coli 11 Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 155. N 1. P. 98106.

224. Oefner C., Suck D. Crystallographic refinement and structure of DNase I at 2 A resolution // J. Mol. Biol. 1986. V. 192. N 3. P. 605-632.

225. Olea M.T., Ma H., Nagata T. Quantitative assessment of lysosomal size, number and enzyme activity in mouse kidney during maturational development // Cell, and Mol. Biol. 1991. Vol. 37. N 7. P. 679-685.

226. Ozoh P.T.E. The effect of salinity, temperature and time on the accumulation and depuration of copper in ragworm, hediste Nereis diversicolor (O.F. Muller). Environ. Monitor. Assess. 1994. Vol. 29, pp. 155-166.

227. Pan C. Q., Lazarus R. A. Ca2+-dependent activity of human DNase I and its hyperactive variants // Protein. Sci. 1999. V. 8. N 9. P. 17801788.

228. Pan C. Q., Lazarus R. A. Engineering hyperactive variants of human deoxyribonuclease I by altering its functional mechanism // Biochemistry. 1997. V. 36. N 22. P. 6624-6632.

229. Pan C. Q., Ulmer J. S., Herzka A., Lazarus R. A. Mutational analysis of human DNase I at the DNA binding interface: implications for DNA recognition, catalysis, and metal ion dependence // Protein. Sci. 1998. V.7.N3.P. 628-636.

230. Parnsnitskaia A. J., Rasskazov V. A., Berdyshev G. D. Purification and some properties of ribonuclease from the liver of Oncorhynchus gorbusha Walb. // Ibid. 1972. V. 41B. N 26. P. 32-75.

231. Pellerin-Massicotte J., Peletier E., Paquet M. Cellular and biochemical indicators assessing the quality of a marin environment // Hydrobiologia. 1989. V. 189. P. 587-594.

232. Persson M., Glatz E., Rutberg B. Different processing of an mRNA species in Bacillus subtilis and Escherichia coli II J. Bacteriol. 2000. V. 182. N3. P. 689-695.

233. Perugini M., Giammarino A., Olivieri V., Guccione S., Lai O. R., Amorena M. Polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticidelevels in tissues of Caretta caretta from the Adriatic Sea // Dis. Aquat. Organ. 2006. V. 71. N 2. P. 155-161.

234. Pollack J. D., Razin S., Cleverdon R. C. Localization of Enzymes in Mycoplasma // J. Bacteriol. 1965. V. 90. N 3. P. 617-622.

235. Princewill T. J., Oakley C. L. Deoxyribonucleases and hyaluronidases of Clostridium chauvoei. Ill Relationship between the two organisms // Med. Lab. Sci. 1976. Vol. 33. №2. P. 105-118.

236. Przykorska A., Solecka K., Olszak K., Keith G., Nawrot B., Kuligowska E. Wheat (Triticum vulgare) chloroplast nuclease ChSI exhibits 5' flap structure-specific endonuclease activity // Biochemistry. 2004. V. 43. N 35. P. 11283-11294.

237. Rangarajan E. S., Shankar V. Sugar non-specific endonucleases // FEMS Microbiol. Rev. 2001 V. 25. N 5. P. 583-613.

238. Rangarajan S., Shankar V. Extracellular nuclease from Rhizopus stolonifer: purification and characteristics of single strand preferential - deoxyribonuclease activity // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1473. N 2-3. P. 293-304.

239. Rasskazov A. V., Galkin V. V., Kogemajako V. B., Gaphurov Ju. M Some properties of acid DNase from actinia Radianthus macrodactilus tentacles // Compar. Biochem. and Physiol. 1986. V. 85. N 4. P. 819823.

240. Razin S, Kniszynski A., Lifshitz Y. Nucleases of mycoplazma // J. Gen. Microbiol. 1964. V. 36. P. 323-332.

241. Reddy A., Caler E. V., Andrews N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes // Cell. 2001. V. 106. N2. P. 157-169.

242. Regoli F., Nigro M., Orlando E. Lysosomal and antioxidant responses to metals in the Antarctic scallop Adamussium colbecki // Aquat. Toxicol. 1992. V. 40. P. 375-392.

243. Reich C., Olsen G. J., Pace B., Pace N. R. Role of the protein moiety of ribonuclease P, a ribonucleoprotein enzyme // Science. 1988. V. 239. N 36. P. 178-181.

244. Riba I, Del Vails T. A., Forja J. M., Gomez-Parra A. The influence of pH and salinity on the toxicity of heavy metals in sediment to the estuarine clam Ruditapes philipinarium II Environ. Toxicol. Chem. 2004. V. 23 (5). P. 1100-1107.

245. Ribeyre F., Boudou A. Trophic chains and experimental ecosystems: Study of bioaccumulation and transfer processes // Aquatic toxicology: Fundamental concepts and methodologies. Boca Raton (FL.): CRC Press. 1998. P. 3-46.

246. Riley D. E. Deoxyribonuclease I generates single-stranded gaps in chromatin deoxyribonucleic acid // Biochemistry. 1980. V. 24. N 13. P. 2977-2992.

247. Ritz D.A. Tolerance of intertidal amphipods to fluctuating conditions of salinity, oxygen and copper. J. Mar. Biol. Ass. UK. 1980. Vol. 60, pp. 489-498.

248. Sheader M. The reproductive biology and ecology of Gammarus duebeni (Crustacea: Amphipoda) in southern England. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. Vol. 63, 1983, pp. 517-540.

249. Shepard J.L., Olsson B., Tedengren M., Bradley B. Protein expression signatures identified in Mytilus edulis exposed to PCBs, copper and salinity stress // Mar. Environ. Res. 2000. Vol. 50. N 1-5. P. 337-340.

250. Shuai K„ Das Gupta C. K. , Hawley R. S., Chase J. W., Stone K. L., Williams K. R. Purification and characterization of an endo-exonuclease from adult flies of Drosophila melanogaster // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. N 6. P. 1379-1385

251. Sierakowska H., Shugar D. Mammalian nucleolytic enzimes. Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 1977. V. 20. P. 59-130.

252. Siwecka M. A., Rytel M., Szarkowski J. W. Purification and characterization of nuclease I associated with rye germ ribosomes // Acta Biochim. Pol. 1989. V. 36. N 1. P. 45-62.

253. Smith A. D., Winkler H. The localization of lysosomal enzymes in chromaffin tissue // J. Physiol. 1966. V. 183. N 1. P. 179-188.

254. Sorensen E. M. Metal poisoning in fish. U. S. A.-Texas: CRC Press. 1992.362 p.

255. Sorrentino S., Libonati M. Structure-function relationships in human ribonucleases: main distinctive features of the major RNase types // FEBS Lett. 1997. V. 404. N 1. P. 1-5.

256. Stegerman J. J., Teal J. M. Accumulation, release and retention of petroleum hydrocarbons by the oyster Crassostrea virginica II Mar. Biol. 1973. V. 22. P37-44.

257. Sternlieb I., Goldfisher S. Heavy metals and lysosomes. Front. Biol. 1976. V. 45. P. 185-200.

258. Stoecker D. Relationships between chemical defense and ecology in benthic ascidians // Marine Ecology Progress Series, 1980, V.3, N 3, P. 257-265.

259. Suck D. DNA recognition by DNase I // J. Mol. Recognit. 1994. V. 7. N 2. P. 65-70.

260. Svobodova Z., Dusek L., Heitmanek M. Bioaccumulation of mercury in various fish species from Orlik and Kamyk water reservoirs in the Crech Republic // Ecotoxicol. Environ. Safety. 1999. Vol. 43. № 3. P. 231-240.279. Takeshita et al., 1995;

261. Takeshita H., Yasuda T., Iida R., Nakajima T., Hosomi O., Nakashima Y., Mori S., Nomoto H., Kishi K. Identification of the three non-identical subunits constituting human deoxyribonuclease II // FEBS Lett. 1998. V. 440. N 1-2. P. 239-242.

262. Tanimizu N., Ueno H., Hayashi R. Replacement of Hisl2 or Hisl 19 of bovine pancreatic ribonuclease A with acidic amino acid residues for the modification of activity and stability // J. Biosci. Bioeng. 2002. V. 94.N1.P. 39-44.

263. Taniuchi H., Anflnsen C. B. The amino acid sequence of an extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. I. Linear order of the fragments produced by cleavage with cyanogen bromide // J. Biol. Chem. 1966. V. 241. N 19. P. 4366-4385.

264. Tavernier P. E., Gray E. D. Effects of divalent cations on activity and specificity of streptococcal nucleases B and D. Biochemistry. 1970. Vol. 7. № 14. P. 2846-2852.

265. Terman A., Kurz T., Gustafsson B., Brunk U. T. Lysosomal labilization // UBMB Life. 2006. V. 58. N 9. 531-539.

266. The nomenclature of multiple forms of enzymes. Recommendations // Eur. J. Biochem. 1971. V. 24. N. 1. P. 1-3.

267. Thebault M. T, Raffin J. P. Properties of the lysosomes from liver and gill of rainbow trout, Salmo gairdnerii R.: effect of starvation, salinity and 2,4,5-T // Comp. Biochem. Physiol. B. 1984.V. 79. N 4. P. 541547.

268. Tomkinson A. E., Linn S. Purification and properties of a single strand-specific endonuclease from mouse cell mitochondria // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. N 24. P. 9579-9593.

269. Viarengo A., Zannicchi G., Moore M. N., Orunesu M. Accumulation and detoxication of copper be mussel Mytilus golloprovincialis Lam.: A study of the subcellular distribution in the digestive gland cells // Aquat. Toxicol. 1981.N l.P. 147-157.

270. Vosyliene M. Z., Kazlauskiene N., Joksas K. Toxic effects of crude oil combined with oil cleaner simple green on yolk-sac larvae and adult rainbow trout Oncorhynchus mykiss II Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2005. V. 12. N3. P. 136-139.

271. Wagner A. P., Caloianu-iordachel M., Wagner L. P. The purification and properties of a ribinuclease of a roe of the fis Cyprinus carpio L. // Compar. Biochem. Biophys. 1981. V. 70. N 1. P. 147-151.

272. Ward M. A., Ward W. S. A model for the function of sperm DNA degradation //Reprod. Fertil. Dev. 2004. V. 16. N 5. P. 547-554.

273. Wei C. F., Alianell G. A. , Bencen G. H., Gray H. B. Isolation and comparison of two molecular species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. N22. P. 506-212.

274. Wiener E., Ashworth J. M. The isolation and characterization of lysosomal particles from myxamoebae of the cellular slime mould Dictyostelium discoideum II Biochem. J. 1970. V. 118. N 3. P. 505-512.

275. Yang L. H., Lee O. O., Jin T., Li X. C., Qian P. Y. Antifouling properties of lObeta-formamidokalihinol-A and kalihinol A isolated from the marine sponge Acanthella cavernosa II Biofouling. 2006. V. 22. P. 23-32.

276. Youson J. H. Absorption and transport of ferritin and exogenous horseradish peroxidase in the opisthonephric kidney of the sey lamprey II. The tubular nephron // Cell. Tissue Res. 1975. V. 157. N. 4. P. 503516.

Информация о работе

Амелина, Виолетта Сергеевна
кандидата биологических наук
Петрозаводск, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Кислые нуклеазы и их роль в приспособительных реакциях водных организмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы