КИНЕТИКА РОСТА И ВЫЖИВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В СВОБОДНОМ, АГРЕГИРОВАННОМ И ИММОБИЛИЗОВАННОМ СОСТОЯНИИ

Шеховцова, Нина Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
КИНЕТИКА РОСТА И ВЫЖИВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В СВОБОДНОМ, АГРЕГИРОВАННОМ И ИММОБИЛИЗОВАННОМ СОСТОЯНИИ
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИКА РОСТА И ВЫЖИВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В СВОБОДНОМ, АГРЕГИРОВАННОМ И ИММОБИЛИЗОВАННОМ СОСТОЯНИИ"

J -тъо

москсвсиий ордш лешна» ордена октяерьсной ргволсции

Й ОГДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ газдарслвшныя УНИВЕРСИТЕТ теш М.В.ЖШГОССШ

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВВДЕНЙЯ'

На правах рукописи

ШЕХОВЦОВА Нина Валентиновна

уда 631.46

КИНЕТИКА РОСТА И ВЮИШАНИЯ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ В СВОБОДНОМ, АГРЕГИРОВА1ШОМ И И1ЙЮВШ30ВАНН0Ы СОСГОЯВДИ

Специальность 03.00,07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 1988

Рьбота выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени Ы.В. Ломоносова, 4

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Д.Г.Звягинцев, *.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

И.Н.Поэмогова * кандидат биологических наук

Л.Л.Веяиканов Бегущее учрехдение 'Институт микробиологии и

вирусологии АН УССР Защита состоится "»//" 1985 г. на заседании

специализированного совета К.053.05.16; Москва, 119899, Ленгоры, МГУ, факультет почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения ЮТ.

Автореферат разослан 1Й85Г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании специализированного совета, а отзывы на автореферат .присылать в двух экземплярах, заверенных печатью.

Ученый секретарь специализирован!) ого совета

И.П.Бабьаиа

* Актуальность проблемы. До сих пор кинетические исследования в микробиологии били ограничены изучением гомогенного роста микроорганизмов. Самопроизвольная агрегация клеток в сусо енэиокныя культурах или их прикрепление к стенкам <Гер«ентера рассматривались. как нежелательные помехи количественного изучения законов микробного роста (Перт,197Б>. И&гду тем, образование микроколоний, эооглейных скоплений и ценобиев, пленок на поверхности и т. д. является весьма характерной чертой естественного роста микробных популяций в природных средах - почвах, грунтах, водоемах и очистных сооружениях (Звягинцев,1973,1907; Marshall ,1976). Процессы агрегатообразования и прикрепления клеток к инертным поверхностям имеют близкую природа' (Klein, Vorlop,1966) и осуществляются микроорганизмами активно и регулируемо в ответ на условия окружакщей среда. Способность к адгезии и ее регуляции, вероятно, различаются у микроорганизмов разных стратегий жизни, отражая вволюционно закрепленный способ выживания природных популяций в определенных зкотопических условиях. Нам не известны работы, посвященные изучению зависимости этих процессов от количества питательных ресурсов и физиологического состояния микробных популяций, различающихся по своим экологическим свойствам.

Цель работы: изучение количественных закономерностей роста к выживания почвенных бактерий в средах с адсорбентами для объяснения особенностей функционирования микроорганизмов разных экологических стратегий в почвах. }

Осногные задачи исследования. I. Решение методических вопросов количественного изучения роста »mirpo организме в в гомот-й!- , ных и пространственно неоднородных средах, 2. Изучение кинет;;'«я периодического роста и отмирания почвенных бактерий разных экологических стратегий на пршдге Гее^о^т^^погезсепв и Arthro-

L^-Ty '»мьз Г'. ;••». : i-fjassiifü

ык. k'. А.

Ъв(^вг в1оЫГогт1а. 3. Изучение влияния адсорбента на кинетические параметры роста и отмирания микробных культур.

Научная новизна. Разработана система методов динамического изучения роста и отмирания микроорганизмов в средах с адсорбентами (определение массы свободных и прикрепленных клеток, био- и некромассы, активности растущих и выживающих микроорганизмов). Показано, что агрегирование и иммобилизация являются саморегулируемыми процессами, протекащимц в ответ на изменение условий среды, редамцее значение имеют концентрации питательных веществ, СО^ и наличие факторов роста в среде. Выявлена связь между адсорбционной способностью бактерий и их екологической стратегией: псевдоыснады (г -стратеги) иммобилизуются слабо и лишь после прекращения роста, артробактер (К-стратег) иммобилизуется в процессе активного роста. Адсорбенты увеличивают сроки сохранения жизнеспособности бактерияш! при голодании.

Практическое значение. I. Закономерности кинетики роста и отмирания, выявленные в настоящей работе, могут быть использованы для построения имитационных моделей функционирования микроорганизмов в экосистемах. 2, Полученные данные могут найти применение в оптимизации биотехнологяческих процессов выращивания и хранения микробных культур. 3. Результаты работы используются а курсе лекций "Основы биологической кинетики", читаемом на кафедре биояопш почв факультета почвоведения МГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на всесоюзных конференциях: "Микроорганизма в сельской хозяйстве" (1986), "Биофизика микробных популяций* (1967), "Экология популяций" {1988) и на заседаниях кафедры биологии почв МГУ( 1986-68).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Обген работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, изложения полученных

результатов б 3-х главах, заключения и выводов, содержит страниц машинописного текста, рисунков, таблиц, список литературы из . названия (из них - эарубетщые).

Автор выралает глубокую признательность С.н.с. Н.С.Панивову за большую помощь при проведении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВШШ Б работе были использованы культуры бактерий Pseudomonas fluoresoena BKM-I472 и ArthrobHcter. gloMXormie ВКМ-658 (получены из ВКУ КЕМ АН СССР).. • *

Микг1организмы выращивали на синтетической питательной среде (Паннков и др.', i960; Бондаренко, 1ШЗ ) с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии (500 мг/л). В ряде опытов с артробактером минимальную среду обогащали добавлением дрожжевого экстракта (10 мг/л). Периодическое культивирование осуществляли в круглодонних колбах, снабженных устройствами для отбора жидких и газовых проб, на качалке (КО об/мин) при 25*1 °С. Реакция среды в ходе эксперимента оставалась постоянной (рН= 7,0-7,5) без подтитровки. В качестве сорбентов использовали стекловату (1,5 г/л) или стеклоткань (15 г/л). Ннокулятом служила гомогенная суспензия клеток из ранней стационарной фазы периодической культуры.

Оптическую плотность бактериальной суспензии измеряли на Specol-fiio (ПЕР) при 600 нм <D6oo). Количество органических веществ (OB), растворимых, взвешенных и иммобилизован wx, определяли методом бихроматного окисления (ГГаников и др. ,1986). Элементный анализ биомассы производили на СШГ-анализаторе Carlo Brbe. (Италия). Содержание РЩ в клетках определяли с орцином (Белозерский, Проскурякова,1951). Численность жизнеспособных бактерий оценивали по количеству проросших на ША колониеобразущих единиц (КОЕ). Размеры клеток измеряли на отпечатках шкроЛотографий,

полученных со сканирующего микроскола JSU-2 (Япония). Дифференциацию живых и мертвых клеток осуществлял» следующими методами: I. по соотношению одиночных непрорастащих клеток и микроколоний агарових пленках (Poatgate, Hunt« ,1962), 2. по соотношению коротких и удлиненных клеток, проращиваемых на среде о акриламидом (Старостина и др. ,IS82), 3. по абсорбции метиленовой сини (Bono-га, Donatella ,1962) и 4. разработанным нами методом по соот-ношеиию суммарной массы взвешенных частиц и оптической плотности суспензии (см.ниже). Десорбции иммобилизованной биомассы осуществляли механическим растиранием и смывом. Дыхание оценивали по скорости вццеления С02 « учетом процессов растворения газа и pfl-завиеимоге образования карбонатов. Концентрацию COg в газовых пробах определяли методом газовой хроматографии на приборе ЛХМ-61,(Д ( СССР), HCCVj" - как COg после подкиоления раствора в пробах нультуралъной жидкости (рис.1). Потенциальную дыхательную активность определяли в пробах бактериальноИ суспензии в первые 30-60 мин. после внесения глюкозы (I мг/мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Разработка методов изучения динамики роста и отмирания микроорганизмов в средах с адсорбентами

Основными слагаемыми С-баланса периодической культуры являются растворенные органические вещества (РОВ), представленные субстратом (в) и продуктами метаболизма (р), взвешенные частицы, состоящие из живых и ыертвых микробных клеток с суммарной концентрацией х и минерализованный углерод СО^+НСС^- (с), образована ный в процессе дыхания микроорганизмов. Концентрацию РОВ определяли методом бихроматного окисления, принимая за стандарт глюкозу. Для оценки содержания взвешенного ОВ применяли бихроматный метод. Количество затраченного на окисление бихрсмата калибровали по сухой массе бактерий. Сравнение полученного результата с

АТМОСФЕРА —\

н 100

В >»

'Н

■ + *

с? о

С02+НС0з~

',ЛУ (гаэовиП анализ)

10 ч

НИЦ

(анализ жидко! фазы)

Рпс.Х..К метолу определения■интенсивности дихания: А- компоненты карбонатной системы в растущей мякройноН культура, Б- пример регистрации динамика дыхания у Р,£1чогевоепв.

•г *

1,5

А 1.0

<и ■ §

О)

Б 0,5 8

5 ».о

к.

1.5 $

' 8

Я)

М Р

а,5 о * ад

120

■ Время, млн

Рис. 2. Динамика удельного светопоглощенил суспензии клеток Р.Оиогезсепв в ходе прогрева при 55

расчетом полного окисления биомассы бактерий по брутто-формулам, составленным по данным еда -анализа, показало, что серко-хромовая смесь недоокисляет массу клеток Р.Пиогеэсепа на 39, аА,£1оЫ -Гогя1в на 35 К, В дальнейшем неполноту учета корректировали поправочным коэ^ч1ициенто4. Количество минерализованного углерода оценивали прямыми определениям^ см. выше).

В средах без адсорбентов сумма экспериментально определяемых переменных всегда давала величину, совпадащуга в пределах 5 К-ноЯ ошибки с исходным количеством углерода в системе) в + р + х+ с« в + ра+х Поэтому в среде с адсорбентом биомассу иммобилизованных клеток Xй" учитывали в динамике по разнице:

Xй" " (0,,+ Р0+ х0+ 0о) - (а+ Р+ х+ о) (1)

В конце опыта расчетную величину Xй" подтверждали прямыми определениями методом бихроматкого окисления.

ри<^ференцированиый учет био- и некронассы^ При отмирании микроорганизмов в периодической культуре состав взвешенного ОВ (х) не является однородным. Он представлен массой живых клеток (%), массой мертвых клеток или некромассой (х^) и массой частиц детрита, не воспринимающихся при микро скопиро вании как целые клетки (Хц). Каждый компонент имеет своп величину удельного светопогло-цения (£> 1>^оо/х) и вносит разный вклад в инструментально определяемую оптическую плотность суспензии. Почта двукратное различие в удельном светопоглощении живых (Ед) и мертвых (Е^) клеток при 600 нм (рис.2) позволяет использовать совместное определение х и для количественной оценки жизнеспособных голодаицих микроорганизмов при допущении, что Ец» Е^, в единицах массы по формуле!

*ж - (»600 - - <2> 4

2. Рост почвенных бактерий и влияние на него адсорбентов т1пипт!»г1я>ия1 Дня активации хранившихся на ША микроорганизмов проводили серии их последовательных пересевов на Среде с

ra l

S Й

a g

S о n

Cl £

о Я

^ о

a cj

fct t

s •

S en

a t

w о о

В"

о £

5 и) О

з %

о о о

£В

M t

«J?

о о

* Ó»

Cl +

g я

я о

S Со

о I о

« —•

а ~

<п

а с

о ж Ч S

» s

У s

l-í

£3

o ü

4 о

IB H)

a а> о ^

5 5 s о a ч • о

Va* Г С/г C 7c'.ur C/t/4

Концентрация РОВ, Биомасса, мг/л мг углерода/л

s г

§ Ï

ас О Ш О » N

rs _ X 2 о

" \д о Q » Ni XD t \...... r i l i V ' i]

' Г Ч cd jo ¥. Г ¿ Ч/7 * 0 1 .....1 \ ' \„ ■

но <я о О О

1-1 N Со о сто о - -

•ноир J*h 4Ь r/suWewi JH ооЗд -те

a j/3 a crom + ^00 'гшювшзоцолэао

глюкозой. В случае псевдомонад бшо достаточно трех пересевов , чтобы бактерии росли на глюкозе с максимальной удельной скоростью (ц^), Тогда культура, взятая из ранней стационарной фазы, при перенесении на свежую питательную среду продолжала расти с высокой удельной скоростью (ц. 0,33 без агрегатообразования (рис.ЗА) . При втсм изменение х и происходило согласованно по экспонент циальному закону. Дыхательная активность бактерий была стабильно высокой 8,0 мыоль СО^/ч/г биомассы), & выход биомассы по субстрату*^ возрастал в течение 5 часов с 0,35 до 0,73 {здесь и далее У выражается в г углерода Сиокассы/г углерода субстрата) . После потребления 60-70 % глюкозы рост бактерий замедлялся, а затем прекращался при концентрации РОВ 45 мг С/л*

Если для активации использовали культуру, длительно (около месяца) голодающую после исчерпания в среде глюкозы,- то в ходе трех последовательных пересевов рост бактериальной суспензии про» текал в форме агрегатов или флоккул С рис.30. Тогда рост бактерий происходил более медленно (р- 0,53 ч"*) на фоне почти неизменяющейся величины В600. Аномально высокое начальное значение 0,6 при низкой дыхательной активности (3,2 ммоль СО^/ч/г биомассы) свидетельствует о том, что первоначально часть глюкозы включается в состав биомассы без окисления. Далее метаболическая активность микроорганизмов возрастала (4- 9-11 мыоль СС^/ч/гбио-массы), наблхщался распад агрегатов, клетки приобретали подвижность. В результате г»£00 достигала максимального значения 0,320, . атзув снижался в 3 раза. При посеве длительно голодающей ■ культуры псевдомонад на разбавленный бульон обнаруживался гомогенный рост. Отсода можно предполагать, что способность к агрегации зависит от состава среды, в частности, от обеспеченности микроорганизмов факторами роста.

Присутствие в среде твердой фазы не вызывает адсорбции кле-

il m (->< tí. CD

В s Й 3

о §

til

J»

200

100

0,5

0,0,

à i PS;;* crfvT°~ \c DC

i § ICO

4 g N

Время, ч

Kîo. 4. Ли нашла роста P. fluoré в cene в средах с адсорбентами в количество 1,5 г/л (А) л 15 г/л (Б).

А ,о~ контроль без адсорбента; л - опыт о адсорбентом; л , а - концентрация РОВ; О ос таль nue показатели.

ток р.йогеесене и в пределах 5-ной ошибки не сказывается на кинетических параметрах роста этих бактерий« Однако характер метаболизма меняется в сторону'оптимизации соотношения между процессами ана- и катаболизма, о чем гоаорит более стабильный уровень У^/э* 0,53 при росте в средах с адсорбентами (рис.4). ,

А^1оЬ1Гргт1в;1 Развитие культуры существенно различалось на минимальной питательной среде и обогащенной дрожжевым экстрактом,

Б случае гомогенного роста на минимальной среде (рис, 54) увеличе-

—I

ние биомассы происходило экспоненциально С^- 0,012 ч *) н сопро-воздалось пропорциональным увеличением . Начальные значения

0,7 и ч» 0,22 мыоль С02/ч/г биомассы свидетельствуют о частичном включении глюкозы в состав биомассы без окисления. Далее увеличение дыхательной активности до 1,2 ммолъ СО^/ч/г биомассы сопровождалось снижением У^д в 2 раза. На обогащенной среде (рис. 6А) происходило двукратное ускорение и повышение эффективности роста артробактера (^-0,044 ч-1, ^х/в" в среднем). Первоначальное включени в части глюкозы в оостав биомассы без окисления сохранялось 0,76 при ч» 0,46 ммоль СЯ^/ч/г биомассы!. Из-

менение х и Ь^од происходило согласованно, фльтура артробактера развивалась исключительно в виде гомогенной суспензии.

На минимальной среде рост артробактера сначала протекал гомогенно (ц* 0,012 ч"1), а затем на 4-е сутки переходил в агрегированную форму с одновременным кратковременным снижением до 0,14 (pic.bE). Последующий рост агрегатов был счсг!:. медленный, дыхательная активность снижалась с 1,50 до 0,26 ымоль СО^/ч/г биомассы, а величина ц с 0,25 до 0,014 сут'*. Таким образом, наблк>-далась двухфазность роста на одном субстрате, т.н. ложная диауксид (Дорофеев,1985). Вследствие агрегации приток глюкозн и кислорода к клеткам снижался (Вавилин, Васильев,1979), скоростд окисления глюкозы и синтеза лимитирующего рост фактора уравнивались и выход

са §

я £

200

«I

•

1а

I й

о о

Гч

н>

/V Р о* /А 2 .. ■ л , - - 1 II

; Г ; / ' : Д . : я Г^ 4

•/А -с/3

8\ -о-^о —Я—о—

.4 о г

Р 3 а

о «

о и

о ® К

к го

100 ^ 0 о» Ш

50 Й

1.0

В.

2,0 ч о

Время, су т.

Ряс, 5. Динамика роста на шнешдыюИ среда в

свободном (А) я агрегих каином (Б) состояния меток.

I- суммарная биомасса, 2- в60о ' ючаекгртая РОВ, 1- С^+ГООдТ 5- спорость образова:и,'Т ^О^ЮО< б- удельная длительная активность Ч» 7- В^ОЖ Зко:ласси но суЗотрату тзс/в> В- выход биомассы гл СОд ~х/с'

биомассы возрастал. Добавление в среду всего лишь 10 «г/л дрожжевого экстракта не только ускоряло рост бактерий, но и обеспечивало гомогенное развитие популяции.

Влияние адсорбентов на рост артробактера также зависело от состава среды. На минимальной питательной среде тСлкдалось двукратное сокращение лаг-фазы в присутствии 1,5 г/л стекловаты. В обогащенной питательной среде адсорбент (15 г/л)не влиял на кинетические параметры роста культуры (^т 0,44 ч-1, У^у^ 0,60 в средаем), хотя часть биомассы переходила в иммобилизованное состояние (ркс.бБ).

3. Выживание голодающих почвенных бактерий в свободном и иммобилизованном СОСТОЯНИИ г. ti йоге в cena. Состояние голодания микроорганизмов устанавливалось естественным образом после исчерпания в среде глюкозы, В динамике регистрировали величину биомассы, d^^q и численность КОВ. При графическом изображении данных для удобства сравнения масштаб по осям координат выбран таким образом, что все динамические кривые выходят из одной и той же начальной точки. № рис.7 представлены результаты по отмиранию кулыуры Р. flucn-ввоепв в нейтральной среде (рН- 7,23 . За месяц голодания наиболее резко, примерю в 20 раз, снижалась численность КОБ. В то же время наб.подалось уменьшение D6oo и концентрации взвешенного ОВ в 3 и 2 раза соответственно. Отмеченные различия обусловлены накоплением в голодаюцей культуре мертвых клеток и бесформенных взвешенных частиц разрушенных клеток. Динамика хк, рассчитанная по (г), совпадает с изменением численности КОЕ. Таким образом, в единице биомассы на протяжении всего опыта содержится, постоянное количество живых клеток, примерно 7-Ю9 кл/мг. Следовательно! жизнеспособные псевдомонада не меняют своих размеров. Данные морфометричеокого анализа это подтвердили* модальные значения длины и радиуса нлетое

Рис. 6. Динамика роста л.£1оЪ1£олп1в на среде о дрожжевым экстрактом: А- без адсорбента, Б- с адсорбентом (15 т/я).

I- суммарная биомасса х, 2- х>600, Э- масса свободных клеток хов, 4- маоса иммобилизованных клеток х™, рассттанная по <1), б-консентрацвя РОВ, 6- С02+НС03~( 7- удельная дыхатальвая активность ч, 8- скорость образования СС^+НСОд'С 9- выход биомассы по субстрату ^х/а' Ю- выход биомассы по СО^ ^х/о*

составили 1,60 и 0,255 мкм в ранней стационарной фазе и соответственно 1,25 и 0,345 мкм через 27 дней опыта, в ходе голодания клетки "округляются", но сохраняют свой объем (0,37 мин3). Динамика потенциальной дыхательной активности О и внутртклеточного содержания РНК позволяет говорить о высокой Физиологической активности вшкиваицих микроорганизмов. В культуре псевдомонад происходит стабилизация обоих показателе?1 на 20 &-ном уровне от первоначального« Если рассчитывать Ч на единицу массы живых клеток, а содержание РНК на общую массу (учитывая, что РНК частично сохраняется в мертвых клетках), то обе динамические кривые практически совпадают. Их использовали для оценки скорости и эффективности криптического роста сохранивших жизнеспособность клеток По формуле; ТдЧ^д/х, где - интенсивность дыхания голодающих микроорганизмов, а выход биомассы на единицу СО^. Чтобы оценить мы воспользовались данными по динамике изменение показателей $иэиолотческого состояния: 0/Чт= РНК/РНК^ й. Если допустить, что снижение й есть итог чриптического роста, то 1№= ЯдрЛ^р. или зглр- х/(1- н/й0), где н0 и х0- значения т*в момент . исчерпания глюкозы, а х™- биомасса клеток, выросших криптически. В процессе голодания псевдомонад снижалась с 71-10 в перше

г 1 "

сутки до 22-10"° ч спустя месяц, Соответствующие времена генерации составили 41 и 113 су т. КриптпческиЙ рост бактерий оказывается чрезвычайно медленным, но его эффективность сопоставима с тем, что обычно обнаруживают в случае нормального роста на экэо-су б страте 0,2). Скорость отмирания гомогенной культуры псе-

вдомонад в кислой среде (рН=» 5,0) замедляется примерно в 2 раза.

В присутствии адсорбента бактерии начинают связываться с поверхность» сразу после исчерпания в среде глюкозы (ряс.8). Доля иммобилизованной массы псввдомонад в ходе голодания возрастала и на 30 сутки составляла 70 %, Шсокое содержание КОЕ в единице им-

Ряс, 7. Динамика отмирания р,^1иогеаовпэ в среде баз адсорбента.

I- суммарная биомасса х, 2- в600» 3- расочитавная по уравнению 2 (О) и по численности КОБ {• ), 4- концентрадая РОВ, 5-С02+К303-, 6~ с,'та слагаемых материального баланса во углероду (рц:тэ), показаниям физиологического состояния бактерий: О - потенциальная днхатаяьнпя активностьц , • - внутриклеточное содержание РНК,

Рис, 8» Динамика отмирания голодающей культуры Р.Птдогеэсепэ в среде с адсорбентом (15 г/л).

А- опыт о адсорбентом, Б- контроль без адсорбента; В,Г: О , □, л - контроль, ■,а.- опыт; I- суммарная биомасса х, 2- хсв, 3- л™, 4- х^, 5- концентрация РОВ (р), 6- С02+-1Ю0,™ (с), 7-суша слагаемых материального баланса по углероду (р+х+с).

мобилизованного ОБ (7,7-Ю9 кл/мг) говорит о 100 ?6-ной жизнеспособности прикрепленных клеток. В результате в среде с адсорбентом хл стабилизировалась на уровне 72 Jí от х= хим+ хсв. На твеццой поверхности концентрация ионов Н* выше, чем в жидкой фазе. По-видимому ,кислая среда консервирует микроорганизмы, снижая активность всех процессов, в том числе и эндогенного распада клеток. .

f tftloMforraig На рис.9 представлена динамика отмирания суспензии аргробактера в течение в,5 месяцев голодания. Скорость отмирания культуры оказалась на порядок низе,по сравнению с псевдомонадами, а вшшшлщне клетки обладали еще более высокими показателями q и содержания внутриклеточной РНК (50 % от исходных значений), по крайней мере в течение первых 3-х месяцев голодания.

В средах с адсорбентами степень иммобилизации голодаэдих бактерий зависит от условий газообмена. Динамику отмирания артроба-ктера прослеживали в двух вариантах опыта: (I) с пассивной вентиляцией колб (низкое содержание CO^Jh (2) в герметично закрытых сосудах (накопление COg до 1,5 X). В первом варианте количество иммобилизованной биомассы было, стабильным в течение месяца и составляло 40 Si. Содержание КОЕ в единице взвешенного GB было высоким и равнялось 5,2 и 3,3-10^ кл/мг на 6 и 28 сутки голодания соответственно. Численность жизнеспособных клеток в иммобилизованном ОВ через месяц голодания била на порядок меньшей (0,79*10®вл/ иг), что говорит о возможности накопления внеклеточных полимерных веществ на поверхности. Во втором варианте (рис,10) значение х"ш было максимальным в начале голодания (более 75 X от суммарной биомассы >, а через месяц снижалось до 35 jí. В присутствии сорбентов отмирание бактерий существенно замедлялось: через месяц голодания численность К0£/хсв составила 4,0* Ю9, а КОЕ/х*1"- 4,9« Ю9 кл/мг. В контроле без адсорбента количество живых клеток в единице биомассы стабилизировалось на уровне 2,3*10® кл/мг. Б культуре с ад-

200 Время, сут

Рис. 9. Динамика отмирания A.globiformla в среде без адсорбента.

I- суммарная биомасса х, 2- Вео0, 3- масса живых клеток рассчитанная по (2), 4- концентрация РОВ (р), 5- COg+HCOg- (с), 6-еумиа слагаемых материального баланса по углероду (jm-x+c) , 7-показатели физиологического состояния бактерий: о - потенциальная дыхательная активность q,« - внутриклеточное содержание РКК,

г-и»

Время, сут

Рво.Ю. Динамика отиирания гаи ода щей «ультуры ж.з1оЪ1Гогш1» в среде с адсорбентом (15 г/л),

1-Х?®; 2- Ьбоо ; 3- Xе*; 4,5- х; 6,7- концентрация РОВ (р+о ), 8,9-С02+НС03~ (с), 10,11- в+р+зс+о ; 1,2,3,4,6,8,10,12- в опыте о адсорбентом; 5,7,9,11,13- в контроле без адсорбента.

сорбентом наблюдалось более резкое падение я после исчерпания глюкозы. Таким образом, иммобилизация способствовала замедлению эндогенного распада голодающих бактерий и активному делению с дроблению) клеток без истинного роста.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Проведенные исследования выявили ряд закономерностей в процессах роста и выживания Р.£1иогеэеепя и А. е1омго™1а соответствующих их экологическим стратегиям»

Гомогенный рост изученных бактерий сопровождался наиболее эффективным использованием субстрата, а образование биомассы происходило с высокой удельной скоростью по экспоненциальному закону. Условием реализации гомогенного роста служит высокая метаболическая активность инокулята и наличие пасторов роста в среде.

Агрегацию клеток вызывает резкий переход от глубокого лимитирования к избытку субстрата и/или отсутствие факторов роста. В _ результате происходит на^итшие сбалансированности внутриклеточных метаболических потоков катаболизма глюкоза и синтеза клеточного вещества. Несбалансированный рост приводит к отклонениям от экспоненциального закона, в частности, к т.н. логной диауксии или двухфазности роста на одном и том же субстрате. В агрегатах снижался приток глюкозы и кислорода к клеткам, поэтому ^оккупированный.рост шел медленнее. Эффективность агрегированного роста (величина возрастала по сравнению с ростом гомогенным из-за снижения трат на механическую работу у обездвиженных клеток.

Рост в иммобилизованном состоянии наблюдался лишь у артроба-ктера, он проходил сбалансированно и с высокими величинами^* и Т. Все это характеризует А.|;1оЪ1Гогш1з как типичного педобионта, адаптированного к росту и размножению в тесном контакте с твердой поверхность». Псевдомонадц, напротив, в состоянии роста не иммобилизуются датсе при агрегировании клеток, что согласуется с их

преимущественным развитием в яшдкофазных природных средах почвенный раствор, водные пленки ризопланы и т.п. . Однако присутствие адсорбентов оказывает стабилизирукцее воздействие на микроорганизмы! снижая перепады величин х.

При голодании изученных бактериальных популяций в среде без адсорбентов численность КОБ снижается'более интенсивно, чем суммарная биомасса. Низнеспособные организмы обладают достаточно высоким уровнем метаболизма, судя по потенциальной дыхательной активности и внутриклетощюму содержанию РНК. По-видимому, в процессе голодания ослабленные члены популяции приносятся в жертву подвергаются лизису , а содержащиеся в погибших клетках питательные ресурсы становятся достоянием выживающих особей.

Присутствие в среде адсорбентов способствует выживанию популяций обоих вцдое. Голодающие клетки псевдоыонад при иммобилизации подвергаются консервации, вследствие подкисления среда на поверхности адсорбентов. Иммобилизованные клетки артробактера продолжали делиться и после исчерпания глюкозы. При этом наблхщалось замедление зндогенного распада биомассы, что говорит об ускорении нриптического роста. Голодающие бактерии слабее связываются с тве рдой фазой, что повышает вероятность их выживания в природных условиях! неподвижные клетки артробактера могут быть перенесены о почвенным раствором в благоприятную микрозону. Общую картину выжи вання микроорганизмов можно изобразить графом:

В популяции наблюдаются следующие процессы: гибель живых клеток (1)5 автолиз и постиортальное высвобождение в среду водорастворимых внутриклеточных соединений (2), деструкция мертвых клеток на

фрагменты (3), гидролитический распад взвешенных частиц с образованием доступных (4) и недоступных (5) жиэнеспособним микроорганизмам РОВ) криптический рост при потреблении (7) и окислении (8) доступных РОВ; накопление внеклеточных продуктов обмена (5,9); а также иммобилизация и десорбция биомассы. Предполагается возможность взаимного превращения доступных и недоступных РОВ (6,9) и И обратимая адсорбция продуктов Метаболизма на поверхности. Наличие ряда обратимых процессов обеспечивает адаптивную мобильность Системы, а иммобилизация клеток на поверхности придает всей популяции фенотипическуто гетерогенность, что расширяет возможности вшивания в неблагоприятных экотопических условиях-

ВЫВОДЫ

1. Разработана система методов количественного изучения динамки роста и отмирания микроорганизмов в средах с адсорбентами: измерения интенсивности дыхания по скорости образования 002 и НСОд", Определения суммарной концентрации взвешенных частиц с дифферен-1*йрованныы учетом био- и некромассы, водорастворимых органических веществ {субстрат и продукты микробного обмена).

2. Рост почвенных бактерий P. fluoré se епэ и A.globiformle в периодической культуре без адсорбента может проходить в свободном или агрегированном состоянии клеток. Образование агрегатов индуцируется предварительны« голоданием бактерий и/или дефицитом факторов роста. Флоквулированный рост сопровождается отклонением кинетики от простого экспоненциального закона вследствие*несбалансированности процессов потребления субстрата и синтеза биомассы (явление ложкой диауксии).

3. Механизм выживания популяций свободных клеток обоих видов при голоДайии заключается в том, что в жертву приносятся ослабленные членй популяции, а содержащиеся в погибших особях питательные ре-суреы ¡^Нябвятся достоянием выживших микроорганизмов.

П (Ai.it.., -

4. В изученных бактериальных популяциях иммобилизация клеток на поверхности носит самопроизвольный характер и зависит от возраста нультури, наличия в среде источника углерода и энергии, концентрации 00g и pH.

5. Присутствие адсорбента в среде существенно не влияет на кинетически параметры гомогенного роста бактерий и ускоряет ыал о биективное потребление глюкозы артробактером в отсутствие факторов роста. При этом культура ï.tluo^eeoens в период активного роста представлена только свободными клетками, а у A.globiromts в вкс-поненциальной $азе происходит интенсивная иммобилизация.

6. Иммобилизация расширяет возможности для выживания микроорганизмов с разными экологическими стратегиями. Псевдононады связыва- , ются с поверхностью адсорбентов в состоянии голодания, что многократно' увеличивает жизнеспособность популяции за счет консервации клеток. Клетки артробактера прикрепляются к поверхности в благоприятных акотопических условиях, при этом их рост ускоряется. В условиях голодания интенсифицируется критический рост и происходит частичная десорбция бактерий, что облегчает им поиск благоприятных микросред за счет пассивной миграции.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Влияние адсорбентов m длительность сохранения жизнеспособности почвенных бактерий в условиях голодания. В сб.: Цихрооргакиэыы в сельском хозяйстве. Тезисы докладов III Всесоюзной научной конференции. ЫГУ, IS66, с.147.

2.; Устойчивость бактериальных поцуляций я длительному голоданию

(в соавт. о Паниковым Н.С.}* В сб.: Шофизика микробных популяций., '¿езисы всесоюзной научной конференции. Красноярск, 1987, с.61.

3. Оценка жизнеспособности микроорганизмов в поцуляционно-динамических исследованиях, D сб.; Экология поцуляцийvТезисы докладов всесоюзного совещания. И., 1968, ч.1, с.156. .

4. Количественные исследования динамики отмирания голодаюп^ях кп*> кроорганизмов (в соавт. с Паниковам Н.С., Дорофеевым А.Г., Звягинцевым Д»Г.), Микробиология, 1£6С, т.57, выл.6, с. 9ЕЗ-99Х.

0ЮЗНАЧШ1Я И СОКРАЩЕНИЯ х - суммарная биомасса микроорганизмов, иг/л, мг углерода/л а - концентрация субстрата, мг углерода/л р - концентрация э кз ометаболитов, мг углерода/л с - количество минерального углерода ОС^+НСОд" , мг С/л то -скорость образования ОТ^+НСОд" интенсивность дыхания ,

мг углерода СО^ч/л 4 - удельная дыхательная активность, ммоль СО^/ч/г биомассы О - потенциальная дыхательная активность (максимальная величина ч) ^х/д - выход бисыассы на единицу потребленного субстрата, г С/г С " ВЫХ0Д биомассы на единиц образовавшегося г С/г С

- удельная скорость роста, сут"*

- максимальное значение }л

Н- безразмерная переменная физиологического состояния организмов

хсв - масса свободных клеток

х™ - масса иммобилизованных клеток

- масса живых микроорганизмов х^ - масса мертвых микробных клеток хд - масса частиц детрита

ОВ - органические вещества

РШ - растворимые органические вещества

КОЕ - колониеобразуюцие единицы

Л39532 от 16/П-вЭг, Ода.ЗЭ5р,Тир Л00.Тип.В/О "Знание".

Информация о работе