Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетический механизм реакции гидролиза АТР, катализируемой F1-F0 АТРазой субмитохондриальных частиц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетический механизм реакции гидролиза АТР, катализируемой F1-F0 АТРазой субмитохондриальных частиц"

р Г Б од 11 т

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 5 77.152.6

СЫРОЕШКИН Антон Владимирович

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ ГИДРОЛИЗА АТР, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ F,-Fa АТРазоЙ СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ

03.00.04. - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета МГУ.

Научный рукоьодитель: доктор биологических наук, профессор

А.Д. Виноградов Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор.

Ведущая организация: Институт биохими им. А.Н.Баха РАН

Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, биологический факультет.

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

А.А. Банков

кандидат химических наук В.А. Гринкевич

Защита состоится

1996 года в

часов на

Автореферат разослан "¿1

ш

1996 Г.

Ученый лек..)етарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез АТР в митохондриях осуществляется сложным полипептидным комплексом F,-F0 АТРазой (Н+-АТРсинтетазой). Источником энергии для образования ^"Ф°сФ°ангиДРиДной связи в АТР служит градиент концентрации протонов по разные стороны

внутренней мембраны митохондрий, - создаваемый при функционировании дыхательной цепи. Реакция +-зависимого синтеза АТР уникальна, так как в результате её осуществляется сопряжение векторного процесса переноса заряженной частицы и скалярной реакции синтеза кова-лентной связи. Механизм сопряжения этих процессов не установлен. Для F,-F0 АТРазы характерно наличие гистерезисного поведения, связанного с процессами медленной деактивации/активации. Группой А.Д. Виноградова было показано, что гистерезисное поведение Fj-F0 АТРазы обусловлено связыванием (в присутствии ионов магния) продукта реакции гидролиза АТР - аденозиндифосфата в центре с высоким сродством (Kd=2*10~8 М) [Fitin A.F. et al., 1979; Vasilyeva E.A. et al., 1982]. Было также показано, что для проявления торможения АТРазной активности аденозиндифосфатом необходимо насыщение Мд2*-связывающего центра [Bulygin V.V., Vinogradov A.D., 1992]. К настоящему времени в изучении Fj-АТРазы сложилась парадоксальная ситуация: недавно стала известной трехмерная структура фермента с молекулярной массой ~ 360 кДа [Abrahams J.P. et al., 1994 ], тогда как природа субстрата реакции (АТР, или Мд:АТР, или АТР и Мд2*) остаётся невыясненной , а выводы, опубликованные в десятках работ на эту тему, выполненных в разных лабораториях, часто прямо противоречат друг другу. Большинство авторов, исследовавших кинетический механизм реакции гидролиза АТР, не учитывали возможность искажения кинетических данных из-за гистерезисных эффектов [напр., В.К. Акименко и соавт., 1972; Fleury В. et al., 1980]. К настоящему времени возникла необходимость заново исследовать кинетический механизм взаимодействия Fj-F0 АТРазы с нуклеотидами и ионом магния в ходе каталитического цикла с учетом накопленных знаний о гистерезисном поведении фермента. Это и было осуществлено в настоящей работе. Детальный кинетический анализ реакции гидролиза АТР, на наш взгляд, служит минимальной предпосылкой, необходимой для решения вопроса о механизме сопряжения процессов гидролиза АТР с трансмембранным переносом протонов .

Принцип микрообратимости ферментативных реакций является общеп-

ринятым. Однако подробное изучение гисгерезисного поведения АТРазь в нашей группе привело к возникновению гипотезы о неидентичносп путей синтеза и гидролиза АТР [А.Д. Виноградов, 1980] . Сравнительный анализ кинетики реакций гидролиза и синтеза АТР в идентичны) условиях (с точностью до-природы субстрата-нуклеотида), по нашем> мнению, позволит доказать или опровергнуть эту гипотезу.

Цель работы состояла в кинетическом анализе системы ( F,-F0 АТ-Раза (в составе субмитохондриальных частиц) /ATP/Mg2+) с учетом накопленного фактического материала по механизму Мд2+-зависимого ин-гибирования АТРазной реакции ее продуктом, ADP. Для было необходимо: 1) установить природу равновесной формы АТР, являющейся истинным субстратом АТРазы; 2) установить кинетический механизм реакцш-гидролиза АТР; 3) выяснить, ингибируют ли первую, азид-нечувствительную фазу, реакции (и каков механизм торможения) свободный Мд2 +, свободный АТР и продукт реакции гидролиза - ADP; 4) выяснить способна ли Fi-F0 АТРаза, стабилизированная в неактивном состоянии, катализировать синтез АТР.

Научная новизна работы. Показано, что помимо истинного субстрата - комплекса Мд:АТР, для осуществления реакции гидролиза АТР, катализируемой митохондриальной Fj-F0 АТРазой, необходим активатор -свободный ион магния. Km по Mg2* составляет 10 мкМ ( рН=7.4; 25°С; ионная сила - 0.1 мМ). Установлено, что взаимодействие F,-F0 АТРазь с субстратом - комплексом Мд:АТР и активатором - свободным Mg2* описывается кинетически упорядоченным механизмом би-би, пинг-понг, в котором свободный Mgz+ вступает в реакцию в качестве активатора после освобождения одного из продуктов гидролиза (скорее всего, неорганического фосфата). Обнаружена сильная pH-зависимость скорости гидролиза АТР Fj-Fq АТРазой с кажущейся рКа около 7.4 в условиях, когда Mg2+-связывающий центр не насыщен катионом-активатором. Эта зависимость обусловлена конкуренцией протона и иона Mg2* за Me2*-связывающий центр. Показано, что свободный ADP тормозит начальные скорости АТРазной реакции по конкурентному механизму. Впервые показано, что стабилизированная азидом неактивная АТРаза способна катализировать синтез АТР. Предложена гипотеза о сопряжении реакции гидролиза АТР и начальных стадий векторного переноса протона, где ключевая роль отводится взаимодействию Fj-F0 АТРазы со свободным ионом магния.

Практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные данные о кинетическом механизме реакции гидролиза АТР необходимы для решения основного вопроса биоэнергетики - механизма сопряжения процессов векторного переноса заряженной частицы (протона) и скалярной реакции образования фосфоангидридной связи в молекуле АТР. Полученные результаты расширяют фундаментальные представления о механизме катализа реакций гистерезисными ферментами. Результаты работы используются в лекциях для студентов биологического факультета и на занятиях по ферментативной кинетике со студентами-биохимиками.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на заседаниях кафедры биохимии биологического факультета МГУ в 1993 и 1994 годах , на российско-германском симпозиуме по мембранной биологии (1994 г., Оснабрюк, ФРГ) и на международной конференции по мембранной биоэнергетике (1995 г., Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на ... стр. машинописного текста, включая 20 рис. и 3 схемы. Библиография включает 2.. наименований .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве препарата F,-F0 АТРазы использовали субмитохондри-альные частицы (AS-СМЧ), полученные по принятому в нашей лаборатории методу [Kotlyar A.B. and Vinogradov A.D., 1990].

Для регистрации начальных скоростей реакции (активация АТРазы) AS-СМЧ (5-10 мг/мл) перед началом всех опытов инкубировали в среде, содержащей (конечные концентрации): 0.25 М сахарозу; 100 мМ KCl; 10 мМ HEPES/K0H, рН=7.4; 5 мМ фосфат калия; 50 мкМ ЭДТА в течении 1 часа при комнатной температуре [Yalamova M.V. et al., 1982; Bitlygin V.V. and Vinogradov A.D., 1991]. Для измерения скоростей "сопряженной" АТРазы или синтеза АТР среда преинкубации AS-СМЧ содержала дополнительно следующие компоненты: 1 мМ малонат (для активации сук-цинатдегидрогеназы), бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) и олиго-мицин (0.25 нмоль/мг белка СМЧ).

Измерение АТРазной активности AS-СМЧ. При высоких концентрация) иона Мд2 + (100 мкМ и выше) реакцию гидролиза регистрировали спект-рофотометрически по убыли концентрации NADH (£340=6.22 мМ'^см"1), АТРазную активность определяли при t=25°C. Стандартная среда содержала следующие компонентны: 0.25 M сахарозу; 100 мМ КС1; 10 Mf Hepes/KOH, рН=7.4; 1,5 мМ фосфоенолпируват; 200 мкМ NADH; МдС12; АТР; пируваткиназу (12 ФЕ/мл); лактатдегидрогеназу (10 ФЕ/мл); мкМ ротенон; 4 мкМ С1ССР. Реакцию начинали добавлением AS-СМЧ (15 -25 мкг/мл). При концентрации свободного Mg2 + в среде менее 100 мк> АТРазную активность измеряли по выделению "стехиометрического" протона [Chance В., Nishimura M., 1968] используя рН-индикатор феноловый красный [Е.А. Васильева и соавт., 1989]: Среда измерения активности содержала те же компоненты (+ 30 мкМ феноловый красный), чтс и в первом варианте, за исключением пируваткинаэы и лактатдегидро-геназы. Реакцию начинали добавлением AS-СМЧ (30 - 50 мкг/мл). Регистрировали уменьшение оптической плотности в двуволновом режиме, ^5 51 • Гидролиз АТР прекращали добавлением олигомицина (1;

нМ). АТРазная активность во всех опытах была чувствительна к олиго-мицину более, чем на 90%. Шкалу прибора титровали стандартным раствором НС1. В каждой пробе определяли коэффициент А[Н+]/A[ADP [Chance В., Nishimura M., 1968]. Для этого меняли режим измерения ( двуволнового на двулучевой (Х,= 340 нм), в кювету вносили избыто! МдС12, пируваткиназу и лактатдегидрогеназу. По убыли концентрацт NADH определяли концентрацию образовавшегося в пробе ADP.

Определение аналитических и равновесных концентраций ионов маг ния и АТР. В работе оперировали величинами как аналитических кон центраций АТР и Mgz + ([ATP]t и [Mg2+]t) так и равновесных концент раций свободного Mg2 +([Мд2*]f), комплекса иона магния с ATI

([Мд:АТР]) и свободного АТР ([ATP]f), Используя значения анали

тических концентраций компонентов и констант диссоциации комплексо] Мд:АТР и Mg:ADP, рассчитывали равновесные концентрации всех компо нентов. Концентрацию исходного (концентрированного) раствора ATI определяли спектрофотометрически либо по поглощению при Хтах=25' нм, Етах=15.4 мМ"'*см"', либо по количеству NADPH, образованного системе, содержащей 5 мМ глюкозу, 1.5 мМ NADP*, 30 ФЕ/мл гексокина зы и 10 ФЕ/мл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Концентрацию раствор. МдС1г определяли методом комплексонометрического титрования в ще лочных условиях (рН>10) в присутствии мегаллохромного индикатора Эриохрома черного Т.

Константу диссоциации комплекса Мд:АТР определяли в условиях, использованных для измерения АТРазной активности (температура, рН, ионная сила), с помощью Mgz*-специфичного металлохромного индикатора Эриохрома голубого (Плазмокорин В) [Scarpa А., 1974]. Полученная величина оказалась равной 1*10"4 М, что совпадает с данными других авторов, проводивших определение в сходных по ионной силе (0.1 мМ) и температуре (25°С) условиях [Bock R.M., I960; Shikama R., 1971; Frey С.M. et al., 1972].

При проведении ряда опытов среда содержала помимо АТР второй комплексон для иона магния: ЭДТА или цитрат. Расчет равновесных концентраций в этом случае проводили на персональном компьютере, применяя численный метод решения уравнений (программа GIM, Version 2.0, copyright by A.Drachev):

K<3*x/([ATP]t-X) + X + [L]t/(1+ KL*([ATP]t"X)/(Kd*X)) - [Mg2t ]t=0,

где x=[Mg:ATP], [L]t - аналитическая концентрация комплексона, a KL - константа диссоциации комплекса Mgz+ с данным лигандом. Значения

о +

констант диссоциации комплексов Мд с ЭДТА и цитратом принимали равными (при рН=7.4) 0.0016 мМ и 0.25 мМ, соответственно [Р. Досон и соавт., 1991]. Описанный подход применяли и для расчета равновесных концентраций в системе, содержащей ATP, ADP и Мд2+. Константу диссоциации комплекса Mg:ADP принимали равной 1 нМ [Shikama R., 1971].

Удаление из реактивов примесных двухвалентных катионов. Очистку концентрированного раствора АТР и реакционной среды в тех экспериментах, когда отсутствовал ЭДТА- или цитратный буфер по Мд2+, проводили с помощью комплексообразующего катионообменника CHELEX-100. Смолу предварительно переводили в калиевую форму.

Концентрацию белка в препарате СМЧ определяли с биуретовым реактивом [Cornall et al., 1949], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Комплекс Мд:АТР - истинный субстрат АТРазной реакции.

В исследованиях прошлых лет механизма гидролиза АТР, катализируемой изолированным фактором Ft было показано, что свободный Mg2 + в миллимолярных концентрациях является ингибитором реакции [Selwyn

r*mt, «к

Рисунок 1.

Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от: (1-А) концентрации добавленного АТР; (1-В) от концентрации комплекса Mg:ATP: (1-С) от концентрации свободного АТР; при различной постоянной аналитической концентрации Мд2*. Состав среды инкубации препарата AS-СМЧ и среды измерения АТРаз-ной активности указаны в разделе "Методы исследования" . Графики 1-В и 1-е получены из графика 1-А расчетом равновесных концентраций иэ значений аналитических концентраций, ф - (Мд2*)! ■ 2 О -(Mg2*)i - 5 мМ; +0 - tМд2*]t - 10 мМ.

M.0., 1967; В.К. Акименко и соавт., 1972; И.А. Козлов и соавт.,

1975; Fleury В. et al., 1980]. Наши результаты, представленные на

? +

рис. 1 противоречат этому выводу. Видно, что Мд в концентрациях от 2 мМ до 10 мМ практически не влияет на максимальные начальные скорости и константу Михаэлиса по [ATP]t (рис. 1-А) и по комплексу Мд:АТР (рис. 1-В). Высокие концентрации комплекса Мд:АТР также не ингибируют реакцию. Хотя по данным рентгеноструктурного анализа группы Уокера в быстрообмениваемых центрах связан комплекс иона магния с ATP [Abrahams а.P. et al., 1994], кинетически не исключалась возможность последовательного связывания иона магния и АТР с образованием координационных связей на молекуле фермента. В некоторых работах [Berger G. et al., 1994, Pezennec S. et al., 1995] предполагалось, что гидролизуемым субстратом является свободный АТР. Наши данные, свидетельствуют о том, что АТРаза связывает из раствора комплекс Мд:АТР. Скорость реакции гидролиза АТР гиперболически зависит и от концентрации добавленного АТР, и от концентрации комплекса Мд:АТР. Более того, Vmax и Kg по добавленному АТР полностью совпадает с таковыми по комплексу (рис. 1-В) и составляют 6.7 мкмоль/(мин*мг) и 0.155 мМ, соответственно. Кажущаяся же константа Михаэлиса по свободному АТР, напротив, уменьшается при увеличении концентрации добавленного Нд2+ (рис. 1-е) и стремится к нулю при [Mg2+]t -» Таким образом, можно считать, что свободный АТР не принимает участие в реакции, а субстратом гидролиза является комплекс Ид:АТР.

2. Свободный ион магния - активатор АТРазной реакции.

Мы показали, что АТРазная активность уменьшается при избытке АТР, если добавленная концентрация Мд24 была меньше, чем !<„, по истинному субстрату (Мд:АТР) (160 мкМ), что указывает на участие Мд2* в реакции гидролиза. Для дальнейшего анализа этого явления мы использовали системы, забуференные по иону Мд2*. Для этого в стандартную реакционную смесь, содержащую АТР и Мд2* вводили дополнительный комплексон иона магния (ЭДТА или цитрат) в концентрациях, позволяющих поддерживать постоянной величину [Mgz+]f при варьировании добавленной [ATP]t (а, следовательно, и [Мд:АТР]). Так, например, если среда содержит 1.65 мМ ЭДТА и 1 мМ МдС12, то при увеличении концентрации добавленного АТР от 0.2 до 1 мМ концентрация комплекса Мд:АТР возрастает от 4.7 мкМ до 22.6 мкМ, тогда как концент-

2-А

1/tlÇATn. M'1

2-В

10,

obs^dlg^m.

2-С

l/tHg^lf, и*"1

Рисунок 2.

2-А: Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от кон-центрации комплекса Мд:АТР при различных постоянных значениях концентрации свободного Мд2*. Состав среды инкубации препарата AS-CM4 и среды измерения АТРазноЙ активности,а также иетод расчета равновесных концентраций в среде с двумя лигандами к иону магния описаны в разделе "Методы исследования". О - [Mg2*]f - 2.4 ккМ; 4. -(«9®* If ■ 5 икм; ф - [Mg**]f - 12 мкм.

2-В: Соотношения кажущихся констант Михаэлиса и максимальных ско-ростей по комплексу мд:АТР, полученные из зависимостей (1/v) от (l/tMg:ATP]) при [Mg2*]f«Const (образец представлен на рис. 2-А). Обозначение экспериментальных точек квадратами (О) соответствует системе, где мы использовали ЭДТА-буфер по Mg2*, квадратами с крестом (В) " цитратный буфер по мд2* , обозначение звездочкой (£ ) соответствует системе, в которой (Mg**]r - 0.2 мМ или 4 мМ (п ЭДТА и цитрат, по 2 мМ каждого).

2-С: Зависимость кажуцейся максимальной скорости по комплексу Mg:АТР от концентрации свободного Mg2*, представленная в обратных координатах. Результаты для данной графика получены из зависимостей, образец которых представлен на на рис. 2-А. Обозначение экспе-

[Arat."H

Рисунок 3. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от концентрации добавленного АТР при постоянной аналитической концентрации Мд2* (при условии, что [Мд24, ]t<Mg: АТРКга ).

Состав среды инкубации препарата AS-СМЧ и среды измерения АТРазной активности указаны в разделе "Методы исследования". Непрерывные линии получены методом моделирования: Принимается, что начальная скорость АТРазной реакции зависит от концентраций комплекса Мд:АТР и свободного Мд2* следующим образом:

v = Vraax / (1 + Mg: АТРК|л/[Мд:АТР] + *EKm/[Mg2t ]f ) , где Vraax = 6 мкмоль/(мин»мг); МкКга = 20 мкМ (рис. 2-С); Mg:ATPK^100 мкМ. а равновесные концентрации рассчитываются из значений аналитических концентраций ATR. и Мд2* . Экспериментальные точки и теоретические зависимости v ([АТР ] t) (0 - [Мд2* It = 0.05; □ - [Мд2*]t = 0.1 мМ) в одной системе координат с помощью программы GIM (см. "Методы исследования").

рация свободного Mg2+ остается почти постоянной ([Mg2+]f= 2.4 мкМ). Было обнаружено, что при уменьшении [Mg2 +]f уменьшаются значения Кт по комплексу Мд:АТР и Vmax . При этом прямые в координатах (1/v) от (1/[Мд:АТР]), полученные при разных постоянных концентрациях [Mg2+]f, параллельны друг другу (рис. 2-А). Зависимость кажущейся максимальной скорости от кажущейся Кт по комплексу Мд:АТР является прямой, проходящей через начало координат (рис. 2-В). Кажущаяся vmax гиперболически зависит от концентрации [Ид2*]г, и Кт по иону магния составляет в данных условиях (рН=7.4; 25° С) 20 мкМ (рис. 2-С). Данные показанные на рис. 2-В суммируют результаты опытов, в которых мы использовали в качестве лиганда-буфера как ЭДТА, так и цитрат (заштрихованные точки).

Поведение системы, показанное на на рис. 2-А и 2-В, соответствует кинетическому механизму би-би, пинг-понг. Причем в координатах (1/v) vs (l/[Mg2<_ ]f), полученные при разных постоянных концентрациях [Мд:АТР], также параллельны друг другу, а зависимость кажущейся Vmax по свободному Мдг* от концентрации комплекса Мд:АТР линеаризуется в обратных координатах, и Km по Мд:АТР составляет около 100 мкМ.

Кинетическое уравнение АТРазной реакции для такого механизма имеет следующий вид:

v = vmax / (1 + Me:ATPKm/[„g:ATP] + MeKm/[Mg2*]fь

где Vmax = 6 мкмоль/(МИН*МГ) (рис. 2-С); MgKm = 20 мкМ (рис. 2-С); Me'ATFKm = 100 мкМ. Используя эти параметры можно построить теоретическую кривую, описывающую зависимость начальной скорости АТРазной реакции от концентрации добавленного АТР при постоянной концентрации добавленного МдС12. Оказалось, что теоретическая кривая полностью совпадает с экспериментальными результатами (рис. 3). Другими словами, торможение АТРазы избытком АТР полностью объясняется в рамках модели кинетического механизма реакции по типу "би-би, пинг-понг", где свободный Мд2+ служит необходимым участником реакции гидролиза комплекса Мд:АТР.

3. Влияние рН и ДДН+ НА скорость АТРазной реакции.

Известно, что скорость реакции гидролиза АТР, катализируемой митохондриальной Fj-F0 АТРазой, очень слабо зависит от рН в интервале значений 6.5-8.5. Установление роли свободного иона магния в

Б. 8

7.2

7.6 I 8.4

г

н «

t х i

-1—■—I—■—I—■—г-

0 50 tOO ISO 200 250 l/lMg^f , «Н"1

4-C

[^f = 5 .И

4-o

i z

I

I v

I J

С »

I

[tflf : 5.S KN

1ЛК|:А1П. «И"1

1ЛИд:*1И. «1Г1

Рисунок 4.

4-А: Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от рН при высокой и низкой концентрации свободного Мд2* (соответственно, 5 нм -верхняя кривая и 5 ккМ - нижняя кривая). (Mg:ATP) - 0.1 мМ » Const.

4-В: Зависимость начальной скорости АТРазной реакции от концентрации свободного Mg2* при различных значениях рН. Зависимость представлена в обратных координатах. [Мд:АГР] - 0.1 мМ - Const. □ - рН-7.0; jf -рН-7.4; р - рН-7.8.

4-С: Зависимость начальной скорости АТРазной реакции от концентрации комплекса мд:лтр при значениях рН 7.0 и в.СГ и при условии, что [Нд2' ), - 5 мм. Зависимость представлена в обратных координатах. □ - рН-7.0; ф - рн-а.о.

4-D: зависимость аналогична изображенной на рис. 4-С, только концентрация свободного мд2* составляет 5.5 мкМ. Для поддержания условия [Hg2*)f-Const использовали систему с цнтратнын буфером по иону магния (сн. подписи к рис. 2).

Состав среды инкубации препарата AS-СМЧ и среды измерения АТРазной активности указаны в разделе "Негоды исследования".

качестве необходимого активатора привело нас к необходимости изме рения pH-зависимостей ферментативной активности в условиях, отлич ных от полного насыщения обоих субстрат- и активатор-связывающи центров. Оказалось, что в условиях неполного насыщения по [Mg2*] скорость АТРазной реакции сильно зависит от pH (рис.4-А). Кривая описывающая эту зависимость почти идеально соответствует теорети ческой кривой титрования одноосновной кислоты с рКа=7.4. При избыт ке Mg2* такая зависимость от pH практически отсутствует (рис.4-А верхняя кривая). Оказалось, что Н* кинетически является конкурент ным (по отношению к [Mg2+]r) ингибитором АТРазы (рис.4-В). Измене ние pH от 7 до 8 практически не влияет на Кт по комплексу Mg:AT при условии избытка иона магния (рис. 4-С). При тысячекратном сни жении концентрации свободного Ид2 + протон является бесконкурентны ингибитором по комплексу (рис. 4-D). Последнее находится в полно соответствии с кинетическим механизмом взаимодействия АТРазы субстратом и активатором по типу пинг-понг.

Для исследования влияния Ajlfj + на кинетические параметры гидро лиза АТР мы использовали препарат AS-СМЧ, искусственно "сопряжен ный" добавлением субстехиометрических количеств олигомицина (Le С.-Р. and Ernster L., 1967). Состав среды измерения активности бы немного изменен для достижения наилучшего сопряжения на мембран СМЧ (см. подписи к рис. 5). Скорость реакции гидролиза АТР, катали зируемая таким сопряженным олигомицином препаратом, увеличиваете при добавлении разобщителя (грамицидина) в 2-3 раза. Степень стиму ляции разобщителем "сопряженной" АТРазной реакции не зависит о концентрации комплекса Мд:АТР (рис. 5-А). Внесение в реакционну среду 15 мМ сукцината не усиливало торможения АТРазы на всем интер вале концентраций комплекса Mg:АТР. Оказалось, что кажущееся бес конкурентное торможение градиентом протонов АТРазы наблюдается при варьировании активатора - свободного Мд2 + (рис. 5-В). Стимуля ция реакции гидролиза разобщителем не зависит от pH. Протон являет ся конкурентным ингибитором (по отношению к [Mg2+]f ), как "сопряженной", так и "разобщенной" АТРазы. Таким образом, торможени АТРазной реакции скалярным протоном происходит независимо от тормо жения векторным.

5-а

1.5,

а. 5

5-в

-10 О 10 20 30 40 50

МНд:*1Л, nit

1

50 IX ISO 208 . Mtflf, «К

Рисунок 5.

5-А: Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от концентрации комплекса Мд:АТР в отсутствие и присутствии (+G) разобщителя -грамицидина D.

5-3: Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от концентрации свободного магния в отсутствие и присутствии (+G) разобщителя при значениях рН 7.0 и 8.0. Обозначение экспериментальных точек - следующее: ромбы (ф) соответствуюот условиям при рН*8.0, квадраты (□) « при рНО.О. Значки с крестом (ф. В) означают присутствие в среде грамицидина.

Состав среды преинкубации AS-СМЧ описан в разделе "Методу исследования". в среду измерения активности (см. "Методы.."), не содержавауо разобщитель С1ССР, дополнительно бил внесем БОА до концентрации 1 мг/мл. Конечная концентрация грамицидина D - 0.12 мхг/мл.

4. Ион Мд2* и медленное "спонтанное" торможение АТРааной реакции.

Много лет назад в нашей лаборатории было показано, что АИР -продукт реакции гидролиза АТР - вызывает необычное торможение АТРазной активности, по ряду параметров принципиально отличающееся от обычного "равновесного" торможения ферментов [А.Д. Виноградов, 1986]. Торможение реакции гидролиза АТР в присутствии АТР-регенери-рующей системы и М3~ вызвано изомеризацией интермедиата реакции (Е:АОР) в неактивный фермент-продуктный комплекс.

Мы показали, что торможение АТРазы в ходе реакции гидролиза развивается значительно медленнее, если в реакционной среде уменьшена концентрация свободного Мд2*. На рисунке 6 представлен образец регистрации АТРазной реакции. Видно, что при избытке свободного

р +

Мд (кривая 1) скорость реакции уменьшается во времени. Если же концентрация свободного Мд2* составляет около 20 мкМ (кривая 2), то торможения на данной временной развертке практически не наблюдается .

Константа скорости торможения АТРазы, развивающегося в ходе реакции в среде с азидом и АТР-регенерирующей системой зависит от концентрации свободного Мд2* Эта зависимость описывается гиперболой с полунасыщением при концентрации свободного магния - 0.045 мМ (рис. 7).

5. Торможение начальных скоростей реакции гидролиза АТР аденозинди-фосфатом.

Считалось общепризнанным, хотя и без достаточных экспериментальных доказательств, что комплекс Мд:А0Р является конкурентным ингибитором растворимой АТРазы с К^ =0.3 мМ. Обнаружение роли Мдг* в реакции гидролиза комплекса Мд:АТР и его участие в медленной деактивации АТРазы заставило нас пересмотреть этот вопрос.

На рис. 8-А представлена зависимость начальной скорости АТРазной реакции от концентрации комплекса [Мд:АТР] при различных значениях [А0Р]1. Измерение проводили при избытке добавленного АТР ([АТР][=2 мМ). Варьируемым параметром была концентрация добавленного Мд2* . Константы диссоциации для комплексов Мд2* с АТР и АОР различаются на порядок, поэтому в использованных условиях [АОР]ь = [АОР]( (с точностью до ЪХ при [Мд2*][<0.75 мМ). Концентрация же комплекса Мд:АОР не является постоянной (например, при [А0Р](= 2 мМ [Мд:А0Р] изменяется от 8 до 65 мкМ при изменении [Мд:АТР] от 0.08 до 0.5 мМ). Полученные данные показывают, что именно свободный АОР является конкурентным (по отношению к Мд:АТР) ингибитором АТРа-

аэ-снч, о.оггмг

1

\\

АА 557-620 = 1.0012 (ЦииИЛИП

1

5 я*

[А17]1 : 0.16 Ш

0.5 мин.

\ 1Идг*1ь = 0.25 мй \ 1Ш. = 1.г «И

Рисунок 6. Образец регистрации реакции гидролиза V и

\ТР « услориях избытха свободного Мд2* \ (Г Мд2 * 1 г >*- кривая 1) или в условиях, когда \ 1М<з£*)( равна ^ по мд2^ (кривая 2). Условия \ регистрация АТРазной реакции с помощью фемолово- V го красного описаны в разделе "Методы исследова- \

ния". Аналитические концентрации АТР и МдС1г \

указаны на рисуик«. Равновесны* концентрации А

следующие: кривая 1 - мМ,

IМд:АТР) »0.15 мМ ; кривая 2 - 1Мд2*]г-0.02 кМ,

[Мд:АТР]-0.2 3 мМ. Начальная скорость реакции составила для обоих случаев 3,1 мкяоль/(мин*нг)

lrtMg2tlf, «И"1

Рисунок 7. Зависимость в обратных координатах константы скорости торможения реакции гидролиза АТР ОТ концентрации свободного Mg2* .

Концентрация комплекса Mg:АТР составляла 1 мм. Реакционная среда содержала АТР-регеиеркрующую сист^ну (сн. "Кетой* исследования"), э которой концентрация пируэаткинаэы составляла зоо фе/мл, а также бил добавлен аэид натрия до концентрации 200 мкМ. Реакцию начинали внесением в реакционную среду препарата емч (конеч. конц. 3-10 «кг/мл) и регистрировали реакцию гидролиза АТР по убыли NACH, как описано в разделе "Методы"■ Константу скорости торможения реакции определяли из графика зависимости ln(V/Vt) от t, где V - стационарная скорость реакции гидролиза АТР, vx - скорость гидролиза в момент времени t. Принимали t»0 в момент окончания небольшой лас-фазы (<1 мин.), вызванной запаздыванием пируъаткиназной реакции из-за низких .концентраций свободного иона магния.

зы. Если бы ингибитором, был комплекс Mg:ADP, то зависимость скорости реакции от концентрации Мд:АТР при [ADP]t=Const не линеаризовалась бы в обратных координатах.

На рисунке 8-В представлена зависимость в полуобратных координатах начальной скорости реакции гидролиза АТР от концентрации свободного ADP. Из этого графика кажущаяся константа ингибирования свободным ADP АТРазной реакции составляет 0.9 мМ. Детальный анализ экспериментальных результатов в рамках модели, в которой кинетическое уравнение АТРазной реакции имеет вид, описанный в разделе 2. , а свободный ADP является конкурентным (по отношению к Мд:ЛТР) ингибиторам, показал хорошее совпадение экспериментальных и теоретических величин скоростей реакции, при величине истинной AD1>K1=0.33 мМ.

6. Кинетическая схема реакции гидролиза АТР, катализируемой Fj-f0 АТРазой.

Как следует из представленных результатов наиболее приемлемым вариантом феноменологического описания бисубстратной АТРазной реакции является механизм би-би пинг-понг. Кинетическая схема для такого механизма предполагает связывание на ферменте одного из субстратов, затем стадию необратимого (в стационарной фазе) перехода, и последующее равновесное связывания второго субстрата (или активатора) с дальнейшей регенерацией свободного фермента. При этом естественно возникает вопрос о последовательности взаимодействия субстрата и активатора с ферментом.

Так как связывание чонов магния с Fj в нуклеотид-зависимой реакции [Daggett S.G. et al., 1985; Bulygin V.V. et al., 1991], разумно предположить, что первая стадия механизма пинг-понг - связывание комплекса MgrATP (см. схему, часть 1), а второй стадией является связывание формы Е" со свободным ионом Мд2*. В рамках такой модели необратимый (в стационарной фазе реакции) переход

Е:(Мд:АТР) -> Е" обусловлен гидролизом АТР и, следовательно,

высвобождением фосфата. Сгановигся понятным, почему фосфат не инги-бирует АТРазу в концентрациях вплоть до 10 мМ [Yalamova M.V. et al., 1982].

Как мы уже упоминали механизм торможения АТРазы в ходе реакции гидролиза заключается в медленной (по сравнению с числом оборота АТРазы) необратимой изомеризации промежуточного интермедиата реакции, содержащего ADP, в каталитически неактивную форму фермента

Рисунок 8. 8-А: Зависимость начальной скорости, реакции

гидролиза АТР от концентрации комплекса [Мд:АТР] при различных значениях [ADP]t«Const. Концентрация добавленного АТР постоянна и составляет во всех пробах - 2 мМ.

8-а: Зависимость начальной скорости реакции гидролиза АТР от концентрации свободного ADP при различных значениях [Mg:АТР]»Const. Состав среды инкубации препарата AS-СМЧ и среды измерения АТРазной активности указаны в разделе "Методы исследования". Во всех пробах [ATP]f=1.4 мМ-Const.

(см. схему, часть 2). Константа скорости инактивации гиперболически зависит от концентрации комплекса Мд:АТР, причем концентрация полунасыщения совпадает с К„ по Mg:ATP [Vasilyeva Е.А. et al. , 1980]. Сравнивая эти данные и результаты настоящей работы, мы полагаем, что необратимой изомеризации подвергается интермедиат Mg:E" = Mg:E:ADP, так как константа скорости ADP-зависимой инактива ции АТРазы гиперболически возрастает при увеличении концентрации свободного Mg2* (рис. 7), причем К0 5 очень близка по величине к

Mf4-

Связывание свободного магния с интермедиатом E:ADP в ходе катализа аналогична первой стадии взаимодействия ионов магния с АТРазой так называемых ASD-субмитохондриальных частиц [Bulygin V.V. et al., 1991]. Интермедиат Hg:E:ADP может подвергаться медленной изомеризации в неактивный комплекс, и это соответствует второй (почти необратимой) стадии реакции ингибирования АТРазы ASD-СМЧ (схема, часть 4). Идентичность мест связывания "ингибиторного" иона магния и Mg2*-активатора подтверждается следующими фактами:

а) Значения К^ и Ки сравнимы по величине; К„-20 мкМ [настоящая работа], Kt=2 мкМ [Bulygin V.V. et al., 1991] (и возрастает до 70 мкМ, в зависимости от насыщения ADP-связывающих центров [Bulygin V.V. et al., 1993]).

б) Величины Кщ и для Мд2+ очень сильно зависят от рН в интервале от 7 до 8 [настоящая работа и Bulygin V.V. et al., 1993].

Ингибирование начальных скоростей АТРаэной реакции свободным ADP (рис. 8) позволяет предположить, что в интермедиате Mg:E:ADP ADP связан в свободном виде.

Представляется важным обозначить на кинетической схеме реакции стадии, сопряженные с векторным переносом протона. Из графиков, представленных на рисунке 5 видно, что Д|1ц + тормозит АТРазу бесконкурентно по отношению как к субстрату гидролиза, так и к активатору. Может быть несколько объяснений феноменологии бесконкурентного ингибирования. Однако, при любом из них, нужно иметь в виду следу-щее. Если бы потенциал вызывал изменение стационарной концентрации одного из промежуточных интермедиатов до или после освобождения фосфата (см. схему ), то, в силу механизма би-би пинг-понг, не наблюдалось бы бесконкурентного торможения по обоим участникам катализа. Следовательно, можно утверждать, что реакция векторного переноса протона сопряжена со стадией трансформации Mg2 +:E:ADP интермеди-ата в исходную форму фермента (Е) и отщепления продукта (ADP) и активатора (Мд2+).

СХЕМА

НфАТР Нд 2+

-<+абр>

На2+

(настоящая работа) ^

АТР Р;

2. Е ч^-Е'Атр Ч-^Е'АСР-ь- Е + АОР

£ ^„гО-бвСкин."1)

XX

Е-АВР

(А. П. Виноградов, 1986) X - неахглвиая

АТРаза

Нд: АТР Нд2+ \Н+/

3 £ АТР) -¿Ч^Е'Ш -^^лср Л^-Е+АОР

Ид

V* и

(Резине)

* нд

(чин."1)

Е-аор

2+

4. Е'АЙР >» Е'АВР СВи1уд1п V. V.,

¿д2+ УшодЫоу А. О. ,1991)

0.007 | ) 0.85

(мин."') X ' Т (МИН."'1

Е-АОР

Ид*

Перечисленные соображения позволяют резюмировать результаты кинетического исследования в виде схемы (часть 3), в которой показаны субстрат реакции гидролиза, активатор и последовательность их связы вания в ходе каталитического цикла.

7. Проблема обратимости АТРазиой реакции.

Представленный механизм АТРазной реакции содержит необратимую стадию освобождения фосфата. Гипотетическое обращение такой последовательности реакции (синтез АТР) требует предположения об очень низком сродстве фермента к Pj в ходе реакции синтеза АТР. Однако, для различных препаратов Fj-F0 АТРазы значение К,,, для Pt при окислительном фосфорилировании составляет примерно 1 мМ по данным, полученным в нашей лаборатории (см. также [Mitchell Р. et al., 1971; Perez O.A. et. al., 1990; Zhou J.-M., Boyer P.D., 1992]). По данным нашей группы и результатам, полученным на CFj-F0 [Zhou О.-М., Boyer P.D., 1992], субстратом для ÄJljj +-зависимого фосфорилирования является комплекс Mg:ADP. Ингибируется же АТРаза свободным ADP.

Эти результаты хорошо согласуются с представлениями о различии механизмов синтеза и гидролиза АТР. Для развития данной гипотезы мы провели исследование прямо показывающее способность к синтезу препаратов AS-СМЧ, содержащих деактивированную АТРазу. Для этого мы регистрировали реакции синтеза и гидролиза АТР в идентичных (с точностью до нуклеотида) условиях, используя азид в качестве стабилизатора деактивкроваи{!ой АТРазы [Vasilyeva Е.А. et al., 1982]. Как видно из результатов.. представленных на рис. 9, СМЧ, преинкубиро-ванные с ADP и Mg2* , не катализировали гидролиз АТР, при полном сохранении способности к синтезу АТР (в присутствии азида). Мы показали также, что торможение АТРазной активности сопровождается ин-гибированием АТР-зависимой генерации + . Последняя была измерена по способности СМЧ катализировать АТР-зависимый, олигомицин-чувс-твительный обратный перенос электронов от сукцината к NAD* и по АТР-зависимому, олигомицин- и грамицидин-чувствительному спектральному ответу оксонола-Vl. Последнее наблюдение снимает одно основных возражений к постановке эксперимента по одностороннему торможение АТРазной реакции, заключавшееся в том, что при преинкубации СМЧ с ADP и Мд2+ происходит ингибирование только фракции АТРазы, не сопряженной с трансмембранным переносом протонов.

т

Л А557-62О=0 °°5<32 М(Н ADP) i

1 ИНН.

I-Ч

Рисунок 9. Образец регистрации реакции гидролиза АТР (верхние кривые) и синтеза АТР (нижние кривые), катализируемые AS-СМЧ, активированными фосфатом (А) (см. раздел "Методы...", подготовка препарата "сопряженных" СМЧ) и AS-СМЧ, преинкубированными в стандартной среде без фосфата, но с 2 МкМ ADP, 2.4 мМ МдС12 и 100 мкМ NaN3 (В) (AS-CM4,j ) . Э среде преинкубации АЭ-СМЧд препарат частиц инкубировали 10 мин. перед измерением активностей. АТРазную (АТРсинтетазную) реакция регистрировали по выделение (поглощению) "стехиометрического" протона с помощью индикатора фенолового красного по методике, аналогичной описанной в разделе "Методы исследования". Реакционная среда содержала 0.25 М сахарозу, 100 мМ КС1, 10 мМ фосфат калия (рН=7.4), 16 нМ сукцинат калия, 100 мкМ ЭДТА, 30 мкМ феноловый красный, 1 мг/мл БСА и нуклеотид (либо 1 мМ АТР, либо 1 мМ ADP). Когда реакции гидролиза или синтеза АТР катализировались препаратом АБ-СМЧд , в реакционная среда содержала 100 мкМ азид натрия. Индекс "+G" означает, что в среде измерения присутствовал грамицидин D (0.12 мкг/мл). Над каждой кривой указана скорость реакции в мкмолях гидролизованного или синтезированного АТР за 1 мин. на мг белка СМЧ.

Описанный кинетический механизм реакции гидролиза АТР и представленные результаты по одностороннему торможению АТРаэы подтверждают развиваемую в нашей лаборатории концепцию о неидентичности элементарных стадий при катализе реакций синтеза и гидролиза АТР митохрондриальной F(-F0 АТРазой.

8. О механизме сопряжения реакции гидролиза АТР и начальных стадий векторного переноса протона.

В заключение мы хотели бы высказать ряд соображений о механизме сопряжения реакции гидролиза АТР и векторного переноса протона. Ин-термедиат реакции гидролиза АТР Mg:E:ADP (см. схему, часть 3) термодинамически нестабилен (константа скорости спонтанной инактивации превышает константу ЭДТА-зависимой реактивации в 100 раз LB.B. Бу-лыгин, А.Д. Виноградов , 1989; Bulygin V.V. et al., 1991]), и при инкубации АТРазы с ADP и Mg2* фермент переходит в неактивную (в реакции гидролиза) форму [Fitin A.F. et al., 1979]. Это означает что, свободная энергия гидролиза АТР на молекуле фермента расходуется на образование интермедиата с высоким запасом энергии. Связывание каталитически активного иона магния сильно зависит от рН. Протон среды является конкурентным ингибитором по отношению к иону Кд2 +. Можно предположить, что механизм инициации векторного переноса протона

? + +

состоит в конкуренции Мд с Н за нуклеофильные группы остатков аминокислот Fj-F0 АТРазы, и Мд2* "проталкивет" протон в канал F0. При этом внутренняя энергия интермедиата Mg:E:ADP расходуется на преодоление энергетического барьера реакции "входа" Н* в устье F0 или/и направленный внутримолекулярный перенос иона магния. Рассуждение о направленном внутримолекулярном переносе магния представляется нам важным, так как для инициации реакции векторной транслокации Н+ необходимо существование предшествующего векторного процесса

(правило Кюри). В этой связи полезно отметить возможное существова-

2 +

ние двух структурно разделенных местах связывания Мд на F, [Senior А.Е. et al., 1980].

+ 2 +

Впервые гипотетическое предположение о роли Н /Мд -обмена в механизме сопряжения переноса протона комплексом Ft-F0 с синтоэом АТР было высказано Э. Ракером в 1977 году [Racker Е., 1977]. Первые конкретные предпосылки к развитию этих представлений были получены в нашей группе при изучении Н+/нуклеотид-зависимого изменения сродства АТРазы к иону магния [Bulygin V.V. et al1991; Bulygin

V.V. et al., 1993]. Развиваемая в настоящей работе модель механизма реакции гидролиза АТР на наш взгляд полезна для понимания возможности сопряжения скалярной реакции гидролиза ковалентной связи с направленным переносом заряженной частицы (Н* или Na+).

Выполнение работы частично финансировалось Российским фондом фундаментальных исследований (РФФИ), грант N 93-04-20214, Международным научным фондом (МНФ), грант MR-2000 и программой "Университеты России" .

ВЫВОДЫ

1) Измерены начальные скорости азид-нечувствпгельной реакции гидролиза АТР, катализируемые комплексом Ff-F0 АТРазы (AS-субмито-хондриальные частицы) в широком диапазоне концентраций свободных АТР, ионов Мд2+ и их комплекса.

2) Зависимости начальных скоростей от концентраций лиган-дов-субстратов хорошо соответствуют модели, в которой истинным субстратом служит комплекс Мд:АТР, а в качестве второго необходимого субстрата-активатора реакции гидролиза служит ион Mg2*. Кт по иону Мд2 + составляет 20 мкМ (рН=7.4; ионная сила - 0.1 мМ; 25°С).

3) Установлено, что реакция с участием комплекса Мд:АТР и свободного Mgz + протекает по упорядоченному механизму "пинг-понг", в котором свободный Мд2 + вступает в реакцию в качестве активатора после освобождения одного из продуктов гидролиза.

4) Обнаружена сильная рН-зависимость скорости гидролиза АТР F)-F0 АТРазой с кажущейся рКа около 7.4 в условиях, когда Мд2+-связывающий центр не насыщен катионом-активатором. Н+ конкурирует с

2 +

Мд за центр связывания двухвалентного катиона.

5) Ингибирование реакции ADP соответствует модели, в которой свободный ADP является конкурентным (по отношению к комплексу Мд:АТР) ингибитором АТРазы с Kj=0.33 мМ.

6) Установлено, что преинкубация AS-СМЧ с ADP, MgZt и N3~ приводит к потере протонтранслоцирующей АТРазной активности при полном сохранении способности препарата синтезировать АТР.

7) Предложена гипотеза о механизме сопряжении реакции гидролиза АТР с начальными стадиями векторного переноса протона, где ключевая роль отводится взаимодействию Fj-F0 АТРазы со свободным ионом магния .

- 24 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bulygin V.V., Syroeshkin A.V., Vinogradov A.D. Nucleotide/H*-dependent change in Mg2+ affinity at the ATPase inhibitory site of the mitichondrial F,-F0 ATP synthase. - FEBS letters. 1993. V. 328. P. 193-196.

2. Syroeshkin A.V., Vasylieva E.A., Vinogradov A.D. ATP synthase catalysed by the mitochondrial Fj-F0 ATP synthase is not a reversal of its ATPase activity. - FEBS letters. 1995. V. 366. P. 29-32 .

3. Syroeshkin A.V., Vinogradov A.D. Kinetic mechanism of Fj-F0 mitochondrial ATPase: Mgz+ requirement for Mg:ATP hydrolysis. Biochem. J. (сдано в печать).

\