Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регулирование активности митохондриальной АТР-синтазы нуклеотидами и ионами металлов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регулирование активности митохондриальной АТР-синтазы нуклеотидами и ионами металлов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА., ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНШЕРС'ЛТЕТ имени. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 577.152.6

БУЛЫГИН Владимир Владиславович

РЕГУЛИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ МИТОХОДЦРИАЛЬНОЙ АТР-синтазы НУКЛЕОТВДАШ И ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

/ 03.00.04 - Биологическая химия /

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1932 г.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических каук„ профессор

А„Д.ВИНОГРАДОВ.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕКГЬ!: доктор химических Наук А.А.БАЙКОВ»

доктор биологических наук А.А.ЮЩРАШН

ВЩЩЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии мм. А.Н.Гаха Российской Акадэмии Наук

Защита состоится " ¿ЗУ "вир&ЛЯ 1992 г. в часов

на заседании Специализированного Совета Д.053.05=32 при Московском государственном университете по адресу: 119899 г.Москва, Ленинские гори, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ьМАрТЬ 1992г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Ю.Н.ЛЕЙШН

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Процесс . окислительного

(Jo сформирования в тканях млекопитающих связан с функционированием нескольких полиферментных систем, локализованных во внутренней мембране митохондрий: а) ферментов дыхательной цепи, обеспечивающих окисление субстратов дыхания, последующий перенос электронов к молекулярному кислороду и образование трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Дцн+); б) Я^-АТР-синтазы (Р^Рд-АТРазы),, катализирующей -зависимый синтез АТР из ADP и неорганического фосфата; в) системы, обеспечивающей транспорт метаболитов в митохондрии. Механизм 4Хц+ -зависимого синтеза АТР в настоящее время не установлен. Большинство авторов, изучая гидролиз или синтез АТР, явно или неявно отовдествляют механизмы прямой и обратной реакции t Senior, 1988; Vignais & Satre,. 1984]. Однако целый ряд экспериментальных фактов, касающихся взаимодействия АТРазы с нуклеотидами и другими естественными лигвидами„ указывает на то, что механизмы сштеза и гидролиза АТР могут различаться CPedersen, 1975; Mlntov et al., 1980; Larson et al., 19891. В настоящее время известно, что АТР-синтаза способна связывать в общей сложности 6 молекул нуклеотидов, 1-2 молекулы неорганического фосфата и до 5 ионов двухвалентных штатов* В связи с этим возможно^ существование большого числа различных фермент-лигандных . комплексов. Установление функциональных проявлений связывания лигандов -субстратов (продуктов) синтеза АТР - необходимо для выяснения

механизма окислительного фосфорилирования. Эта задача и. составляет предмет настоящего исследования.

Цель работы. Около десяти лет назад в груше А.Д.Виноградова было показано, что преинкубация субмитохондриальных частиц с ADP в присутствии ионов приводит к гистерезисному поведению фермента в АТРазной реакции CFltin et al., 1979]. Связывание ADP в специфическом центре Н*"-АТР-синтазы с Кдкс~ 2-Ю-8 М блокирует гидролиз АТР, однако не влияет на окислительное фосфорилырование CMinkov et al.» 19803. Подробное изучение параметров (Mg^+)ADP- зависимого тормокэния АТРазной активности привело к возникновению гипотезы о различии путей синтеза и гидролиза АТР„ катализируемых митохондриальной Н^-АТР-синтазой. Согласно этой гипотезе, фермент может находиться в двух функционально различных состояниях: "синтетазном" и "гидролазном", а переход из одьой формы в другу» контролируется нуклеотидаш (ADP и ATP) tVasilyeva, et al.» 1980]. В ряде работ были описаны условия, при которых .моешо проследить взаимодействие высокоафЕинного центра связывания ADP и "каталитического центра" фермента' [Vasilyeva et al.„ 19301. Отдельные экспериментальные наблюдения указывали на то„ что взаимодействие АТРазы с адениновыш нуклеотидвми имеет весьма слоанув природу. В связи с зтач, первой задачей настоящего исследования было изучение роли ADP и АТР в регулировании АТРазной активности.

Известно, что ингабиругацэе действие ADP проявляется только в присутствии ионов . Поэтому значительная часть настоящей работы посвящена исследовании роли ионов Mg24 в ADP-зевисимом ингибировании АТРазы.

Таким образом, целью настоящей работа: было детальное изучение роли нуклеотидов и ионов металлов в регулировании активности митохондриальной Н^-АТР-синтазы. .

Научная новизна работы. Получены экспериментальные данные, показывающие функциональное взаимодействие трех

нуклеотидсвязывагадих центров митохондриальной АТРазы: двух центров связывания ADP (КдаС= 2-Ю"8 М и К^!С= 7-Ю-6 М) и каталитического центра фермента. Обнаружен центр связывания 'ионов Mg2"1" (Кдас= 2-Ю"6 М)„ быстрое рН зависимое насыщение которого приводит к медленной трансформации АТРазы, содержащей прочносвязанный АБР, из активной формы в неактивную.

)АВР-блокированная АГРаза медленно реактивируется в присутствии избытка ЭДТА (1сакт = 0,007 мин-1). Связывание с ферментом АТР (Н3= б'Ю-7 М) и неорганического фосфата (Кд= I-Ю-3 М) из растворов,, не содержащих двухвалентных катионов, существенно ускоряет процесс реактивации.

Практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные данные позволяют расширить представления о функциональном значении лиганд-связыванщих центров митохондриальной АТРазы. Результаты используются в лекциях по кинетике ферментативных рэакций для студентов - биохимиков. На основании работы предложено несколько демонстрационных задач для большого практикума по биоэнергетике на кафедре биохимии.

Апробация работы. Результаты исследования' были доложены на заседании кафедра биохимия Биологического факультета МГУ»' на Всесоюзной конференции "Энергетические аспекты клеточной физиологии1" (1988 и 1990 гг., Пущино), на V (1988 г., Эбериствит) и VI (I99D г., Амстердам) Европейских

ЗаьБ-145/еаф

биоэнергетических конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем работа. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов;, их обсуждения, выводов к списка цитируемой литературы. Работа изложена на А5~£ стр. машинописного текста, включая Ц табл. и ££. рис. Библиография включает 2Ы наименования, из них ¿32 иностранных работ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Митохондрии сердца бкка получали по методу Крейна и соввт. С Grane et al., 19561 с расслоением нь легкую и тяжелую фракции по методу Хатефи [Hatefl et al:, 1953].

Субмитохондриальни^ частицы <Cfi4): А-СМЧ получали из тяжелых митохондрий обработкой ультразвукам [Fassenden et al., 19661.

AS-СМЧ получали по методу Ракера, пропуская А-СМЧ через колонку с Свфадэксом G-5D (грубый) [Racker et al., 196Т1.

ASD-СМЧ получали из AS-СМЧ (10 от/мл), прэшкубируя их в среде, содержащей 0,25 Ы сахарозу, 10 мМ Нерэз, pH 7,4, I мМ MgGlg и 5 мкМ ADP. Затем в сроду инкубации добавляли 3 мМ ЭДТА и пропускали частицы через колошу с Сефадексом G-50 (грубый) в течение I ч при 20°С в растворе, содержащем 75 мМ сахарозу, 10 мМ Hepes, pH 7,4, 0,1 М KCL, 3 мМ ЭДТА. Элюат центрифугировали при 200000 g (17°С) в течение 45 мин. Осадок суспендировали в

среде» содержащей 0,25 М сахарозу, 20 мнЫ ЭДТА,и переосаждали при тех же режимах. Полученный препарат ASD-СМЧ суспендировали в 0,25 М сахарозе.

АТРпзную активность СМЧ измеряли спектрофотометрически при 340 нм (20°С) в 1,5 мл стандартной среда, содержащей 0,25 М сахарозу, 10 мМ Нерез, рН 7,4, 0,1-1 мМ АТР, 2 глМ MgCl2, 50 мкМ ЭДТА, 4 мкМ ротенон, 10 мкМ разобщитель (G1CCP), I мМ фосфоенолпируват, 0,16 мМ NADH, пируваткиназу (5,5 ед. акт./мл.) ' и лактатдегидрогеназу (5 ед. акт./мл.). Реакцию начинали внесением в среду 10-20 мкг белка частиц. Для точного измерения начальной скорости гидролиза АТР в ряде экспериментов в реакционную среду добавляли 0,1 м!,1 NaNg iVasilyeva et al., .1982].

Регистрацию АТРазной активности при помощи установки для быстрого смешивания проводили на спектрофотометре "Hitachi-557". Шприцы смесителя заполняли 5 'мл среды инкубации различного состава, содержащей субмитохондриальные частицы в концентрации 0,25 мг/мл, и 5 мл среда измерения АТРазной активности, включающей следу гадив основные компоненты: 0,25 М сахарозу, 10 мМ Hepes, рН 7,4, 4 мМ MgClg, 0,1 мГ,1 ЭДТА, 6 мкМ ротенон, 10 мкМ 01GCP, 4 мМ фосфоенолпируват, 0,6 мМ NADH, пируваткиназу (60 ед. акт./мл.), лактатдегидрогеназу (60-70 ед. акт./мл.) и АТР в таких количествах, чтобы после смешивания его конечная концентрация была равна 0,1 или I ММ. За ходом реакции следили спектрофотометрически при 340 нм по убыли концентрации NADH.

Концентрации белка в препаратах СМЧ определяли с биуретовым ■ реактивом tComall et al.], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Концентрацию растворов MgClg определяли методом 'комп-

ЗаьБ-143/Э5ф

лексонметрического титрования при щелочных рН в присутствии металлохромного индикатора - Эриохрома черного Т.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Функциональные проявления взаимодействия трех нуклеотидсвязываюцих центров штохондриальной АТРазы.

Как Оыло показано ранее IVaallyeva et al., 19803, ADP является сильным ингибитором АТРазной активности СМЧ и растворимого фактора Р.,. Инкубация фермента в присутствии ионов с низкими (0,5-1 мкМ) концентрациями ADP приводит к полному торможении начальной скорости гидролиза АТР в результате связывания нуклеотида в высокоспецифнчном центре с Кдисс = 2-Ю-8 М. ADF-Олокированныг фермент моаэт медленно (по сравнению с числом оборотов) активироваться ДТР-зависиммм путем в присутствии компонентов АТР-регенерирукщей системы (пируваткиназа, лактатдегидрогеназа и их субстраты: фосфоенолпируват и HASH). При та!зк условиях АТРазноя реакция протекает с ярко выракенной лаг-фазой. В настоящей работе мы установили, что продолжительность этой лаг-фазы зависит от концентрации ADP в среде инкубации (рис.1). При этом начальная скорость гидролиза АТР частицами, проинкубированными как с шзкими (0,5-1 мкМ), так и с высоким! (20-200 ш.Ч) ■концентрациями ADP, остается равной нулю. В обоих случаях процесс активации описывается кинетикой реакции псевдо-первого порядка (рис.1,6).

Рис.I. Кинетика АТР-зависимой активации АТРазы субмитохондриаль-______

а) AS-CM4 (0,25 мг/мл) проинкубировали в течение 5 мин. при 25 °С в шприце приставки для быстрого смешивания реагентов. Инкубационная среда содержала 0,25 М сахарозу, 10 м1-.( Нерез, рН

7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 3 мкМ 01ССР, 2 мМ Mg012 и АБР в концентрациях:

0,5 (кривые 2, 5), 20 (кривая 3) и 200 (кривые 4, 6) мкМ. Кривая Н I - в среду инкубации не добавляли Mgolg и ADP. Второй шприц

заполняли стандартной средой измерения АТРазной активности. В пробах 5 и 6 в реакционную среду добавляли 0,2 м№ NaNg.

Реакцию начинали быстрым смешиванием ( \ул< 6 мсек.) равных

объемов содержимого обоих шприцев. Коночная концентрация АТР' была равна 0,1 мМ.

б) Линейные анаморфозы кривых 2 и 4. За значение V» принимали скорость гидролиза АТР частицами, проинкубированными без ADP и MgCl2.

о >

20 -

Рис.2. Зависимость начальной скорости гидролиза АТР и константы

скорости активация АТРазы от концентрации ADP.

Кривая N I. AS-СМЧ (I мг/мл) преинкубировали в течение 5 мин. при 25 °С в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 10 г.Ч

Нереа, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 3 мкМ С1ССР, 2 мМ MgClg, а также

ADP в концентрациях, указанных на рисунке. Начальные скорости гидролиза АТР измеряли в стандартной реакционной среде,

содержащей 0,1 мМ АТР и 0,1 мМ NaNg. АТРазная активность

частиц, преинкубкрованных без Mg012 и ADP, принята за 100 % и

равна 2,6 мкМ АТР, гкдролизованного за I мин. в расчете на I мг белка.

Кривые NN 2 и 3. Прекнкубацшо AS-СМЧ к измерение АТРазной активности проводили при помощи аппарате для быстрого смешивания в условиях, аналогичных указанным в подписи к рис.1. Среда измерения активности содержала 0,1 мМ (2) и I мМ (3) АТР.

Величины определяли при помощи построения линейных

анаморфоз кривых, описывающих гидролиз АТР, как показано на рис.

Как показано на рис. 2, значение измеренное в присутствии

IOO мкМ A'iP, изменяется от минимального (~0,2 мин-1) до максимального ("0,8 мин-1) в узком интервале концентраций ADP (2-20 мкМ). Характер кривой титрования позволяет предположить, что увеличение скорости активации обусловлено насыщением ADP второго нуклоотидсвязываэдего центра Н^-АТР-синтазы с Кдас= 7« 10""® Ы. Мы показали, что характер зависимости ^^л от концентрации ADP сохраняется и в присутствии насыщающих (I мМ) концентраций АТР (рис.2, кривая 3). При этом все экспериментальные значения увеличиваются приблизительно в

1,5 - 1,7 раза. Такое сотношение величин говорит о том,

что при АТР-зввисимой активации АТРазы, блокированной как высокими, так и низкими концентрациями ADP, субстрат гидролиза вероятнее всего связывается в одном и том аэ центре фермента. Возможная идентичность этого центра "АТР-гидролазному" обсуадалась ранее [Уав11уета et ai.„ 19801 и основывается на данных о равенстве значений н К^, определенных ' для

процесса активации и собственно АТРазной реакции. Полученные результаты, на наш взгляд, могут быть описаны следующей кинетической схемой:

. активная А^Раза

ADP

WU*

ATP

•Е-ADP-^—^E-ADP

ьакт

"набл. (I)

Kg ATP

.ADP

ATP

3 3 ADP'E-ADP-^-ADP-E-ADP

Kg ATP

^блЛг)

Зак.Б-145/82ф

K1 - 2-I0"8 M; K2 - 7-I0-6 M; K3 = 1-1СГ4 M Сбл.(2) " ^ C.(I) " °'37 ИИ"1

Согласно схеме, АТРаза частиц, измеренная в условиях необратимой диссоциации продукта, может быть в трех состояниях: активный ■фермент (I), неактивный - медленно активируемый (2) и неактивный - быстро активируемый (3).

2. Роль ионов Mg21" в ADP-зависшом торможениии АТРазы.

2.1. М£Г+-зависимое ингибирование АТРазшй активности.

Ранее было показано, что ADP-зависимое ингибирование АТРазы наблюдается только в присутствии ионов liloyle & Mitchell, 1975; Pitin et al., 19791. Простейшее объяснение роли ионов Mg24 в АБР-зависимом тормоненйи АТРазы заключалось в том, что только комплекс металл - нуклеотид способен связываться в "ингибиторном" центре фермента. Известно» что реактивировать

) АБР-блокированную' АТРазу монно не только, необратимо удаляя ADP в присутствии АЮГ-утилмзкру вдей системы, но и с помощи ЭДТА Шоу1е & Mitchell, 1975]. Ш решили проверить, является ли результатом ЭДТА-зависимой реактивации выход в раствор Kg2+ADP из ингибиторного центра, или ш имеет место только диссоциация Для этого AS-СМЧ инкубировали с АБР и

MgClg в условиях насыщения единственного АБР-связыващего. центра, добавляли к ним избыток ЭДТА и проводили гель-фильтрацн» в ЭДТА-соддржащвм буфере для удаления носвязагшхся лигандов (подробнаа см. раздел: "Получение ASD-СЫЧ"). Оказалось, что

обработанные таким образок частицы (АЯВ-СМЧ) по своим кинетическим характеристикам близки к, исходным АБ-СМЧ за исключением того, что их АТРвзная активность в значительно большей степени (на 86Ж) ингабируется после преинкубацш с I мМ й&012 в отсутствие экзогенного АИР (см.. Табл.1).

Таблица I. (/£^+)АБР- зависимое ингибирование АТРазной активности различных препаратов субмитохондриальннх частиц.

АТРазная активность (мкмоль/мин-мг)

Препарат Условия преинкубации r; ндбл

частиц ЭДТА(3 мМ) MgCl2 (I мМ) MgClg (I мМ) ADP (I MKM) мин-1

AS-СМЧ 1,64 (100Ж) 0,85 (62%) 0,08 (5%) 0,26

ASD-СМЧ 1,75 (10056) Oj25 (14Я) 0,09 (5%) 0,26

Субмитохондриалыше частицы (1 мг/мл) преинкубировалн 5 мин. при 20 °С в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 10 мМ Нерез, рН 7,4, 50 мкМ ЭДТА и компоненты* указанные в таблице. Начальные скорости гидролиза АТР регистрировали в стандартной среде измерения активности, содержащей 0,1 мМ АТР и 0,1 мМ NaNg.

Величины определяли как показано на рис.1,

предварительно преинкубировав AS-СМЧ с 1мМ MgCl2 и I мкМ ADP, а

ASD-CM4 - только с 1мМ MgClg.

Учитывая, что ингибирущий эффект Mg012 полностью снимается после инкубации ASD-СМЧ с пируваткиназой и фосфоенолпируватом, мн сделали вывод о том, что большая часть Р0-комплексов этих частиц (86%) содержит прочносвязанный ADP в единственном центре, с высоким сродством. Причем ингибирующее действие ADP проявляется только после связывания ферментом иона

2.2. Кинетика И£^+-зависимой деактивации АТРазы.

На рис.3 'показана кинетика М^+-зависнмой деактиващт АТРазной активности АББ-СМЧ. Видно, что скорость деактивации тем выше, чем больше концентрация в инкубационной среде, а

сам процесс является реакцией псэвдо-первого порядка (рис.3,6).

t , мин

Рис.3. Кинетика торможения АТРазной активности в присутствии ионов :

а) ASD-CM4 (0,8 мг/мл) проинкубировали при 20 °С в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, ИГ мМ Hepes, рН 7,4, 3 мМ ЭДГА (4) или 10 (I), 20 (2) и 100 (3) мкМ Mg012.

Начальные скорости гидролиза АТР измерял;! через указанные на рисунке интервалы времени в стандартной среде, содеркащей 0,1 мМ АТР и 0,1 мм KaNg. 100 % АТРазной активности соответствуют 1,9

мкмоль / мин. мг.

б) Линейные анаморфозы кривых NN I, 2 и 3. За значение V° принимали скорость гидролиза АТР частицами, проинкубированными с 3 ММ ЭДТА. Vt=e> определяли как остаточную азид- нечувствительную

скорость гидролиза АТР, измеренную после преинкубации ASD-СМЧ с 1мм Mgl„ в течение 30 мин.

Из зависимости от концентрации

ми определили

максимальную величину 0,65 11 значение

, 1,1«10"4 М (рис.4).

О 0,02 0,04 0,1 1 / [Мз2+] / мкМ"1

200 300

[Ы821, мкМ

Рис.4. Зависимость константы скорости торможения АТРазы от

концентрации свободного :

ХБВ-СМЧ разводили до концентрации белка 0,8 мг/мл средой, содержащей 0,25 М сахарозу, 10 мМ Нерва, рН 7,4. К аликвотам частиц добавляли М£С1-, до конечной концентрации 10 - 400 мкМ и

определяли величины в условиях, указанных в подписи к

предыдущему рисунку.

0). Та же зависимость, изображенная в двойных - обратных координатах.

Папучвющэ результаты показали, что И^+-зависимое торможение АТРазы обусловлено связыванием катиона с единственным Ие2+-отещфршым центром фермента, содержащего прочносвяввнный АБР, после чего происходит медленная трансформация активного АВР-Е<М^+ комплекса в неактивный -

1акт __абл

АБР-Е- —АВР• Е<МЙ2+ ..* АБР• Е*<Ы^+

к к3«"1.

Ка = 1,1-10"4 М; 0,65 мин"1.

3.?,. Равновесное титрование АТРазноЙ активности ионами

В связи с предложенной схемой нам представлялось важным исследовать М^+-зависимое ингибирование в условиях, когда временными факторами мокно пренебречь, а именно-определить величину константы равновесия процесса: Е- •+ 1 —

Для этого частицы инкубировали в течение трех - четырех часов в присутствии низких концентраций свободного Ыё2* (1-20 мкМ) и затем регистрировали начальные скорости гидролиза АТР. Зависимость • степени ннгибирования АТРазы от концентрации свободного представленная в двойных - обратных координатах

(рис.5), позволяет определить численное значение и

рВВН

оказавшееся равны?,1 2-Ю-6 Ы.

[И521,МКМ

Рис.5. Равновесное титрование АТРазной активности 'ионами.

АБЮ-СМТ (0,6 ж Алл) проинкубировали 3 (о) и 4 (О) 4 ДР1

20 °0 в - ЗДТА буфере, содэрнашвм 0,25 М сахарозу, 10 мМ

Нерез, рН 7,4, I Ш ЭДГА и МзС12 в таких количествах, чтобы

концентрация свободного Мб2*,,в среде изменялась от I до 20.мкМ. (Концентрацию свободного Н£г рассчитывали, принимая во внимание,

что значение Кдао комплекса Мй2+ЭДТА при рН 7,4 равно 1«Ю-6 М.)

Начальные скорости гидролиза АТР измеряли в стандартной среде, содеркащей 0,1 мМ АТР и 0,1 мМ №3. 100 % АТРазной активности

соответствуют 1,3 шсмоль / мин. №.

б). Линейная анаморфоза кривой титрования. 100 % иягибирования равны остаточной (15 %) активности АТРазы, преинкубированной с I мМ Г^012.

4.2.ЭДТА-индуцируемая реактивация {^блокированной АТРазы.

Поскольку из кинетической схемы процесса прямо следует, что: Краш . Iактивная ДРаааИЦ*! _ К^«^ /

[неактивная АТРаза]

а численные значения Краш> 1!набдТ и известны, мы рассчитали величину 2с^ддл - 1,1 • 10~2 мин-1, а затем измерили ее экспериментально, регистрируя скорость активации АТРазы, блокированной низкими (20 мкМ) концентрациями в

присутствии 5 мМ избытка ЭДТА. Полученное значение равно

о _г

7-10 мин , то есть оказалось близким к рассчитанному теоретически. Поскольку соотношение «1 .то при

концентрации свободного М£2+>> К^ имеет место практически необратимая деактивация ферментов, содеркащих прочносвязанный АИР. — ' .

5.2. Влияние рН на кинетику (Mg2"*")А1)Р-зависимого торможения.

Известно, что ионы И*". наряду с ADP и неорганическим фосфатом являются субстратом окислительного фосфорилирования, причем Н*-АТР-синтвза осуществляет их трансмембранный перенос. В 'связи с этим, нам показалось интересным исследовать влияние рН на параметры (Mg2"1")ADP-зависимого перехода АТРазы из активной формы в неактивную. Оказалось, что закисление инкубационной среда от рН 7,5 до 6,5 приводит к значительному (~в 2 раза) уменьшению степени Mg^-зависимой деактивации, однако не влияет ■На параметры реактивации ¡¿¿^-блокированного фермента в присутствии ЭДТА. Полученные результаты говорят о том, что

рН-зависпмой является стадия равновесного связывания с ферментом иона за которой следует нечувстительная к изменению рН

стадия изомеризации активного комплекса ADP • Р1 < Ь!£р+ в неактивный.

6.2. Влияние АТР, неорганического фосфата и сульфита на кинетические параметры ЭДТА-зависимой реактивации АТРазы.

Крайне медленная ЭДГА-зависимая реактивация представляет собой удобную модельную систему ' для качественного и количественного анализа действия специфических' лигандов митохондриальной Е+-АТР-синтазы. В качестве таких лигандов мы выбрали субстрат и продукты АТРазной реакции: АТР, ADP и неорганический фосфат, а также эффектор АТРазы - сульфит. Согласно полученным в нашей лаборатории данным, сульфит предотвращает переход активного ADP • Р.|< Mg^"1" - комплекса в неактивный [V'asilysva et al., 1982].

Мы показали, что в присутствии 5 мМ Р^, 5 .мМ сульфита, илй I мкМ АТР скорость ЭДГА-зависимой реактивации (Mg24)АОР-блокированной АТРазы существенно возрастает (рис.6). Примечательно, что действие этих 'лигандсв проявляется в условиях, когда в инкубационной среде практически отсутствует свободный Mg^4. В специальных экспериментах мы определили

о

величины констант связывания Р^ и АТР; они равны I • ЮМ и

5»10 М соответственно (см. Табл.2). Необходимо отметить,

р р

.что полученная нами величина K^i близка к значению K^i, измеренному для реакции окислительного фосфорилирования [Kayalar et al., 1977]. Кроме того, ряд дополнительных фактов

указывает на то, что неорганический фосфат и АТР связываются в различных 'центрах АТРазы.

t , мин

Рис.6. Влияние АТР, неорганического фосфата и сульфита на

скорость реактивации АТРазы в присутствии ЭДТА.

ASD-CM4 (0.6 nt/мл) преинкубировали о 5 мМ ЭДТА (контроль), или 20 мкМ Mg012 при рН 7,4 в условиях, указанных в подписи к

рис.3. Через 40 мин. к частицам, преинкубированным с HgOlg,

добавляли 5 мМ ЭДТА (показано стрелкой), а затем:Б мМ KHgPO^, 5

мМ K1ÍS03 , или I мкМ АТР. Начальные скорости гидролиза АТР

регистрировали в стандартной среде измерения активности, содержащей 0,1 мМ АТР и 0,1 Ш HaN3. АТРазная активность частиц,

проинкубированных в течение. 40 мин. с 5 мМ ЭДТА и KHgP04,

принята- за 100 % и равна 1,6 мкмоль / мин. мг.

Таблица II. Кинетический параметры реактивации (М^+)АБР-блокированной АТРазы.

Уелобия реактивации Кд (М) С.»®''1»

для активирущего

лиганда

I. ЭДТА - 0,007

2. ЭДТА + Р1 1-Ю"3 0,25

3. ЭДТА + АТР 5-ПГ7 0,06

7.2. Влияние АВР на скорость ЭДТА-зависимой реактивации.

Мы показали, что А1)Р в отличие от Р^ и АТР проявляет активирующий аффект только в присутствии свободного поскольку скорость ЭДТА-зависимой реактивации практически не изменяется, если АКР (50 мкМ) добавлен в среду преинкубации до, или Еместе с 3 мМ ЭДТА. Однако изменение последовательности добавок (сначала АБР, затем ЭДТА) приводит к многократному ускорению процесса (рис.7)„ Как было показано в первой части данной работы, в присутствии 20-200 мкМ АБР и избытка М§С12 подавляющая часть молекул АТРазы находится в виде тройного фермэнт-ингибиторного'комплекса: АБР «Е-АБР и содергшт ион специфическом Ме -связывающем центре. В связи с этим вашо было понять, в чем заключается результат активирующего эффекта еысоких концентраций АВР.

Рис.7. ADP-зависКмая реактивация М^2+-блокированной АТРазы.

ASD-CM4 (0,5 мг/мл) преинкубщювали 20 мин. при 20 °С- в среде, содержащей 0,25 м сахарозу, 10 мМ Нереа, рН 7,4 и 0,5 мМ MgClg. Затем в среду преинкубации вносили 50 мкМ ADP и 3 мМ

ЭДТА. Последовательность добавок:

I). 'ЭДТА вносили через I мин. после добавки ADF; . 2). ADP и ЭДТА добавляли одновременно;

3). ADP вносили через I мин. после ЭДТА.

4). АДР и ЭДТА в среде преинкубации отсутствовали. Началыше скорости гидролиза АТР регистрировали в стандартной среде измерения активности, содержащей 0,1 мМ АТР и 0,1 гМ HaN3.

100 % АТРазной активности равны 1,8 мкмоль / мин. мг.

Выяснилось, что преинкубация AS-СМЧ в условиях насыщения двух-ADP-связывапцих центров (100 мкМ ADP, I мМ MgClg) и последующая гель-фильтрация в ЭДТА-содерэкащем буфере, (подробнее: см. ^.раздел: "Методы исследования") приводит к получению частиц,

идентичных ASD-СМЧ. Таким образом,, наиболее вероятно, что результатом ЭДГА-зависимой активации комплексе АБР•Е• ADP является: во-первых, быстрая диссоциация "янгибиторного" иона Hg2"1' и,во-вторых, освобождение одной из двух молекул связанного AJ5P. По нашему, мнению, Солов вероятна доссоцдация АБР из центра с Кдас = 7 • ICTG М. По-видимому, АБР связывается в этом центре в виде комплекса с . В случае активации Е ° ADP комплекса происходит значительно более медленный выход в раствор только "ингибиторного" Mg2+. Это показано на следугацей схеме :

Kg^ADP

-—=-АБР-Е- MS^ADP

ад* „ tig24

эдтл ^

МЗ^ЭДТА

ADP'E*

M^+ADP

f эдта

ч м32+здга

-adp•е•hg^+adp

Необходимо отметать, что выход в раствор "ингибиторного" должен происходить прежде, чем К^^АБР. Если бы имела место обратная ситуация, то образовывался бн комплекс Мё2+>Е*• АБР, который, как мы показали, крайне медленно реактивируется в присутствии ЭДТА.

22

ВЫВОДЫ

1). Изучена кинетика активации митохоцдриальной АТРазы, блокированной АБР в присутствии ионов Мб2*. Показано, что скорость АТР-зависимой активации растет при увеличении концентрации АБР от I до 20 мкМ„ Полученные результаты показывают наличие трех функционально значимых нуклеотидсвязыващих центров фермента: двух центров связывания АБР (КдаС= 2'Ю-8 М и КдаС= 7'Ю-6 Ы) и центра« ответственного ва гидролиз АТР.

2). Показано, что для торможения АТРазной активности фермента, содержащего прочносвязанный АДР„ необходимо насыщение

единственного центра с Кдас= 2-Ю-6 М.

3). Медленная деактивация АТРазы в присутствии ионов обусловлена быстрым рН-зависимым связыванием, данного катиона и последующей изомеризацией комплекса фермент - металл - нуклеотид из активной формы в неактивную.

4). Неактивная АТРаза, • полученная в результате

специфического блокирования фермента АБР и может быть ■

—7

реактивирована при связывании АТР (К3= 5 • 10 М) и неорганического . фосфата (Кд= I • Ю-3 М) из растворов, не содержащих дауххалентных катионов.

5). В присутствии свободного АБР-деактивированная АТРаза способна связывать вторую молекулу АБР; это приводит к существенному ускорению диссоциации из "ингибиторного" центра.

СПИСОК-РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТРМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

' I. Bulygin V.V„ & Vinogradov A.D. Evidence ior participation of three nucleotide binding sites in presteady-3tate kinetics of ATP hydrolysis by submitochondrial particles. // 6th European Bioenergetic Conference Reports: V. 5. - Aberystwyth, 1988. - P. 234.

2. Булыгш B.B., Виноградов А.Д. Кинетические проявления взаимодействия трех нуклеотидсвязываодих центров митохондриаль-ной АТР-синтетазы. // Биохимия - 1989. - Т. 54, J». 8. - С. 1359-136?=

3. Eulygin V.V. & Vinogradov A.D. Tiirse adenine nucleotide binding sites in Pq-Pj mitochondrial ATPase аз revealed by presteady-state and steady-state kinetics of ATP hydrolysis. // PEES Lett. - 1989. - V. 236, JS. 2. - P. 497-500.'

A. Vinogradov A. & Bulygin V. M^+-specific - adenine nucleotide dependent Inhibitory site in Pq-P^-ATPase . of sub-

A-y.

mitochondrial particles. // б European Bioenergetic Conference Reports: V. 6.- Amsterdam, 1990. - P. 62.

5. Bulygin V.V. & Vinogradov A.D. Interactibn of Mg£+ with PqF1 mitochondrial ATPase аз related' to its slow actIva / inactive transition. // Biochem.J. - 1991. - V, 276 p 1. - P. 149-156.