Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АТР-синаза зеленой несерной фотосинтетической бактерии Chloroflexus aurantiacus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АТР-синаза зеленой несерной фотосинтетической бактерии Chloroflexus aurantiacus"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи УДК 577.152.361

ЯНЮ1ИН Михаил Филиппович

АТР-синтаза ЗЕЛЕНОЙ НЕСЕРНОЙ ФОТОСИНТЁТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ СЫогоОехиэ аигаШласиэ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 19ЭЗ

Работа выполнена в Институте почвоведения и Фотосинтеза РАН

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

В.К. Акименко

Доктор биологических наук Ю.Б. Евтодиенко

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический Факультет.

Защита состоитсяЩ/июня 1993 г. в _ часов на заседании

Специализированного совета Д.200.29.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биохимия" при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (Пудино).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и Фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан/^ мая 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Исследованию АТР-синтазы посвящено огромное количество работ. Фермент занимает центральное место в энергетическом метаболизме и обладает многими замечательными свойствами, которые после тридцатилетнего изучения еще далеки от объяснения.

Исторически сложилось, что наиболее полно изученными оказались АТР-синтазы из термофильной бактерии PS3, энтеробактерии Е. coli и хлоропластов, принадлежащих соответственно трем верхним ветвям эубактерий: ветви грамположительных бактерий, ветви протеобактерий и ветви цианобактерий-хлоропластов. К настоящему времени выделено в чистом и активном виде около десяти АТР-синтаз, но все они принадлежат организмам из указанных ветвей эубактерий. Сходство этих АТР-синтаз, состоящих из каталитической части Fl (5 видов субъединиц) и мембранного протонного канала Fo (3 или 4 вида субъединиц, в зависимости от наличия двойной субъединицы Ь или двух родственных - Ь и Ь") создает впечатление о необходимости всех субъединиц для синтеза АТР. Однако здесь возникает вопрос: как мог образоваться такой сложный фермент? Какие из субъединиц могли составить фермент, уже способный синтезировать АТР, а какие принесли с собой увеличение каталитической эффективности и регулируемую гибкость? Исследование АТР-синтаз из дальнеродствен-ных ветвей бактерий обещало обнаружить существенные различия в их строении и каталитических свойствах. Это могло пролить свет на изменение АТР-синтаз в ходе эволюции и способствовать пониманию работы АТР-синтазы. Автор поставил перед собой задачу определить субъединичный состав АТР-синтазы из Chloroflexus aurantiacus, представителя одной из нижних ветвей эубактерий, надеясь, что исследования АТР-синтаз из отдаленных таксономических групп будут предприняты и в других лабораториях.

В конце восьмидесятых годов возрос интерес к эволюции АТР-синтаз в связи с исследованием вакуолярных АТРаз эукариот и АТР-синтаз архебактерий, оказавшимися более родственными друг другу, чем АТР-синтаэам эубактерий. Однако до сих пор ни из одной архебактерии не выделена активная АТР-синтаза и эволюционные

Сокращения: АТР - аденозин-трифосфат (аналогично - остальные нуклеотиды), Pi - неорганический фосфг F - пирофосфат, . ; -дициколгексилкарбодиимид, F1 - каталитическая часть АТР-синтазы, сопрягающий Фактор, Fo - мембранная часть АТР-синтазы, протонный канал, ПААГ - полиакриламидный гель, SDS - додецилсульфат Na, U -единица каталитической активности, мкмоль продукта в мин.

построения основаны на аминокислотных последовательностях двух больших субъединиц Fl-фактора и ДЦКД-связывающего белка.

Совсем мало исследований посвящено АТР-синтазам из нижних ветвей эубактерий. Выделена Fl-АТРаза из Thermus therjiophilus, представителя ветви Deinococcus-Thermus, одной из нижних на дереве эубактерий. Фермент неожиданно оказался более близким АТР-синтазам архебактерий, чем эубактерий. Однако, представитель самой нижней ветви эубактерий, Thermotoga maritima, попадает по аминокислотной последовательности каталитической (уб) субъединицы Fl-фактора в свой класс, а не в класс архебактерий. В представленной работе выделена активная АТР-синтаза Chloroflexus aurantiacus, представителя ветви, отделившейся от ствола эубактерий сразу вслед за Т. maritima.

Целью данной работы был поиск отличий АТР-синтазы Chloroflexus aurantiacus, представителя нижней ветви эубактерий от АТР-синтаз верхних ветвей эубактерий. Для этого были поставлены следующие задачи: 1. Выделение каталитической части АТР-синтазы (АТРазы). 2. Выделение полной АТР-синтазы. 3. Выделение собственных липидов бактерии. 4. Приготовление протеолипосом и проверка функциональной компетентности АТР-синтазы. 5. Выяснение особенностей субъединичного состава.

Научная новизна работы. Впервые выделена и характеризована АТР-синтаза из бактерии, принадлежащей нижней ветви эубактерий. Фермент встроен в липосомы из собственных липидов бактерии и показана его Функциональная компетентность. Показано, что АТР-синтаза Chloroflexus auranticus имеет необычный субъединичный состав. Фермент содержит девять типов субъединиц с молекулярными массами 60(3), 50(3), 33(1), 19(1), 16,5(4), 15,5(1), 14,5(1), 13(1) и 8(>6) кДа (в скобках дана стехиметрия субъединиц). Только три первых и последняя субъединицы легко могут быть отнесены к субъединицам оС, ß, ^ и ДЦКД-свяэывающему белку известных АТР син-таз, тогда как остальные имеют какую-либо особенность, отличающую их от возможных двойников. Так взамен полипептида соответствующего по массе а-субъединице АТР-синтаз верхних ветвей эубактерий присутствует гетеродимер полипептидов 14,5 и 13 кДа соединенных дисульфидной связью. Субъединица 16,5 кДа представлена числом копий большим, чем ее возможный двойник - Ь-субъединица Е. coli и PS3. Показаны особенности в характере связи каталитической и мембранной частей. Отделенная каталитическая часть содержала четыре первых субъединицы АТР-синтазы.

Практическое значение работы. Выделенный фермент показал себя стабильным как в изолированном состоянии так и в составе протео-липосом. Протеолипосомы со встроенной первичной протонной помпой (например бактериородопсином или фотосинтетическим реакционным центром) могут быть использованы в биотехнологических системах, где требуется регенерация АТР. Разработан простой способ приготовления протеолипосом, не требующий ультразуковой обработки липидов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюз-яых совещаниях "Энергетические аспекты клеточного метаболизма" (Пущино, 1988 и 1990) и на семинаре кафедры Биохимии Биологического факультета МГУ (1992).

Публикации. По материалам исследования опубликовано две статьи. Эдна статья направлена в печать.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы и культивирование. В работе использованы два штамма 'ЫогоГ 1ехиз аигапМасиэ из коллекции каф. Микробиологии Биологи-?еского факультета МГУ-, штамм А, исходно полученный от проф. 5>уллера из Университета штата Массачусетс (США), и штамм ВЗ, зыделенный из горячего источника оз. Байкал. Среда культивирования одержала на 1 л: 0,1 г НеБО^^Н^О, 0,04 г СаС1^(0,4 г (ИН^^О^, 5,125 г КС1, 0,25 г НаС1, 0,08 г К^РОу, 1 г глицилглицина, 2 г 1Рожжевого экстракта, и 1 мл раствора микроэлементов Б1,8 (рН 8,3). Слетки выращивал анаэробно, при температуре 58оС, освещенности 20000 люкс с двух сторон, в сериях из 6 - 8 периодов по 12 часов. 5 конце каждого периода 1 л свежей среды инокулировал примерно ГО-тью мл выросшей культуры. Плотность культуры задавалась при ;тартовой инокуляции в первом периоде. В сериях в начале работ ¡летки выращивал до плотности 2,5 - 3 г сырого веса на 1 л среды, 5 последних сериях использовались более молодые культуры - не >олее 1,5 г/л.

Выделение мембран. Клетки дважды промывал в трис-сукцинатном >уфере (10 мМ, рН 7.8), суспендировал в том же буфере (50 мМ) с :0Х глицерина до 0,2 - 0,3 г/мл и хранил замороженными при ! ряде случаев в суспензию добалял на льду лизоцим до 0,5 мг/мл и >ДТА ДО 4 мМ.

В вариантах с использованием лизоцима размороженные клетки шдерживал при температуре 37 С в течении 20 мин. Затем в суспен-1ИЮ добавлял ДНКазу до 0,1 мг/мл и МаБО^ до 6 мМ. Через 10 мин :успензию разводил в тройном объеме холодного (4 С) трис-НС1 (50 ¡М, рН 8,0) и осахдал мембраны центрифугированием (15000 й, 15

мин). Осадок промывал в трис-НС1 <50 мМ, рН 8,0). В первом выделении АТРазы осадок был дополнительно обработан ультразвуком (30 сек,

1 - 4 С) и после отмывки мембраны осаждены при 200000 g (45 мин).

В последних выделениях АТР-синтазы и АТРазы были использованы молодые клетки, которые после размораживания и добавления MgSíty до

2 мМ и ДНКазы до 0.1 мг/мл разрушал непосредственно короткой обработкой ультразвуком (2*20 сек). После пятикратного разведения и удаления неразрушенных клеток (3000 g, 10 мин), мембраны осаждал при 70000 g (30 мин) и дважды промывал в 10 мМ трис-HCl (рН 8.0).

Выделение каталитической части АТР-синтазы (АТРазы).

1-е выделение. Мембраны, дополнительно промытые в 3.5 мМ трис-1 мМ ЭДТА (рН 7.4), суспендировал в этом же буфере до 5 мг белка в мл и обработал ультразвуком 3*2 мин при 2 - 8°С в трех порциях по 10 мл. После осаждения мембран (250000 g, 1 час) к супернатанту добавил насыщенный сульфат аммония до 55% от насыщения. Осажденный преципитат растворил в 50 мМ трис-HCl (рН 8.0) и центрифугированием освободился от нерастворившейся части. Очистка фермента включала в себя ионобменную хроматографию на колонке ДЭАЭ-сефарозы (5*1.5 см, уравновешенную 50 мМ трис-HCl (рН 8.0); элюция градиентом кокдентрации сульфата аммония 75-200 мМ в трис-НС1 50 мМ, рН 8,0), концентрирование на маленькой колонке ДЭАЭ-сефарозы (1*0.8 см) и гель-фильтрацию на колонке сефакрила S300 (48*0,9 см, уравновешено« 50 мМ трис-HCl (рН 8.0), 75 мМ (HH^O^SO^/).

2-е выделение. Мембраны суспендировал в 10 мМ трис-1 мМ ЭДТА (РН 7.9) до 3 мг белка в мл. Добавил четверть объема хлороформа и встряхивал смесь в течение 30 сек при комнатной температуре. Смесь затем центрифугировал (20000 g, 5 мин) и верхнюю фазу - еще 20 мин при той же скорости. К супернатанту добавил трис-HCl (рН 8,0} до 4< мМ и сульфат аммония до 50 мМ. Очистка включала колонку ДЭАЭ-сеФа-цела (5*1 см, 40 мМ трис-HCl (рН 8.0), градиент концентации суль-

— фата аммония 50-200 мМ), концетрирование на колонке Фенил-сефаро-зы (1*0.8 см, элюция в 5 мМ трис-HCl (рН 8,0), глицерин 10Х) и колонку сефакрила S-300 (67*0.9 см, 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)).

Выделение АТР-синтазы. Перед солюбилизацией Фермента мембраны были промыты в среде: 0.8Х На-холат, 2мМ MgSO , 100 мМ сульфат аммония, 50 мМ трис-HCl (рН 8.0).

1-е выделение. Солюбилизация фермента из мембран проведена при комнатной температуре в течение 30 мин при концентрации мембран 6 мг белка в мл в среде следующего состава: 1,2% охтилглюкоэид, 0,52 холат натрия, 2 ММ HgSO^í, 0,4 М сульфат аммония, 50 мМ трис-сукци-нат (рН 7,7). После центрифугирования (lOOOOOg, 20 мин)

_ _ _____________________ " 5

фермент^из надосадочной жидкости высолил сульфатом аммония во Фракции между 38 и 48% от насыщения. Преципитат растворил в 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 0,3* тритон Х100, 2 мМ и 50 мМ На^Оу.

Смесь наслоил на линейно-ступенчатый градиент плотности сахарозы <12 - 30%, 20 ступеней) в 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0) с 0,2% тритона ХЮ0. 2 мМ НйБО^. и 50 мМ ^¿БО^ и центрифугировал 3 часа при 60000 об/мин, 20 С в роторе ТЭТ 60.4. Отобранные фракции сконцентрировал ■ набуханием сефадекса 6-10 и нанес на колонку сефакрила Б-ЗОО (67*0,9 см) уравновешенную 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 0,1% тритон Х100, 2 мМ МяЭО50 тН йа^ЭО^. Отобранные Фракции сконцентрировал как описано выше, добавил глицерин до 20% и хранил в жидком азоте.

2-е выделение. Солюбилизацию проводил в течение 1 часа на льду при концентрации мембран 5 мг белка в мл в среде: 0.23% Тритон Х100, 2 мМ МяБО^, 50 мМ сульфат аммония, 50 мМ трис-НС1 <рН 8.0). Несолюбилизированный материал осадил при 250000 8(1 час). Очистка включала колонку ДЭАЭ-сефацела (5*1 см, 40 мМ трис-НС1 (рН 8.0), 0.2% тритон Х100, градиент сульфата аммония 50-200 мм), концентрирование набуханием сефадекса 010 и колонку Сефакрила-ЭЗОО (87*0,9 см, 20 мМ трис-НС1 (рН 8.0), 0.05% тритон Х100).

Выделение липидов. Липиды экстрагировал в однофазной системе, образованной из 24 мл суспензии клеток (8 г) в 1 М МаС1 и 90 мл смеси метанол:хлороформ 2:1. Осадок отделил центрифугированием <5000 об/мин, 10 мин) и дополнительно экстрагировал 30 мл смеси метанол:хлороформ 2:1. К объединенным экстрактам добавил хлороформ и 1 М ИаС1 до окончательного соотношения вода:метанол:хлороформ 0,9:1:1. Расслоение фаз было ускорено центрифугированием. Нижнюю хлороформную фазу дважды промыл равным объемом смеси 1 М НаС1: метанол 2:1 и затем упарил до постоянного веса на роторном испарителе. .Липиды растворил в 10 мл хлороформа и Фракционировал на колонке силикагеля <5*0,8,см) последовательно 20-ю мл хлороформа, 20-ю мл хлороформа с 0,4% уксусной кислоты, 20-ю мл смеси хлороформ:метанол: уксусная кислота 87:3:0,4 и 15-ю мл смеси хлороформ:метанол:уксусная кислота 50:50:0,4. Фракции анализировал тонкослойной хроматографией на пластине силикагеля в системе хлороформ:метанол:уксусная кислота:вода 85:15:10:3,5. В первых двух Фракциях сходили пигменты, в третьей - моногалактолипиды, в четвертой - все остальные липиды. После испарения растворителей четвертая фракция липидов (25 мг) была суспендирована в 0,5 мл 10 мМ трицин-НаОН (рН 7,8) при 50^С под атмосферой аргона. Полученная суспензия набухших липидов была устойчивой и хранилась при -120С.

Приготовление протеолипосом проводил разведением белок-липид-детергентной смеси при 50°С, температуре естественной для С. aurantiaeus. К 20 мкл смеси с концентрацией компонентов: липиды -2%, октилглюхозид - 1,5%, белок 0,8-1 мг/мд), инкубированной 5 мин при температуре 52®С, добавлял при той же температуре 180 мкл 100 мИ трицин-НаОН СрН 7,8) с 5 мМ K^SO^ и 2 MM HgSOy порциями по 20 мхл. После охлаждения до комнатной температуры часть препарата липосом дополнительно освобождал от детергентов на центрифугируемой колонке сефадекса G-50, уравновешенной указанным буфером.

Аналитические процедуры

3^Pi-ATP обмен. Реакцию проводил при 52°С. Смешивал 40 мкл протеолипосом и 10 мкл субстратной смеси (конечные концентрации компонентов: 100 мМ трицин-НаОН, 5 MM MgATP, 5 мМ KzSOy, 10 мМ Pi 5-10 МБк/мл, рН 7,8). Через фиксированные промежутки времени отбирал аликвоты по 3 мкл и отделял АТР от Pi тонкослойной хроматографией на силуфоле. При подсчете скорости обмена брал отношение активности в пятне АТР к активности в соответствующем пятне Pi. Этот прием компенсировал неточность в отборе аликвоты, которая была велика из-за разности температур воздуха и реакционной среды.

АТРазную активность измерял по отщеплению Pi в реакционной среде: 50 мМ трис-HCl (рН 8.0), 2 мМ АТР, 1 мМ MgSO^, или по окислению HADH в сопряженной АТР-генерирующей системе в среде: 20 мМ трицин-NaOH, 25 мМ K^SOf, 1 мИ АТР, 2 MM HgSOf, 1 мМ фосфоенолпируват, 0,2 мМ NADH, 5 U/мл лактатдегидрогеназы и 3 U/мл пируваткиназы (рН 7,8). Активность во фракциях на стадиях очистки измерял при 37°С в присутствии IX октилглюкозида, активность Фермента в липосомах - при 52"с.■

SDS-электроФорез проводил в буферной системе Лэммли или в буферной системе Шэггера и Фон Ягова в присутствии 6 М мочевины. Состав гелей указан в подписях к рисункам. Образцы готовил в смеси 100 мМ трис-HCl, 1* SDS, 2% меркаптоэтанола (пропущен в указанных случаях) и 10% глицерина рН 6,8. Нативный электрофорез проводил в градиентном геле (4 - 12%) в системе Орнстейна и Дэвиса, но без концентрирующего геля. Насыщающее окрашивание гелей с минимальным фоном проводил в 0,1% коллоидном растворе кумасси G-250 в смеси 2% ортофосфорной кислоты, 10% сульфата аммония и 20% метанола.

Белок определял по модифицированной методике Лоури.

_______ . - - ----------------------------7

РЕЗУЛЬТАТЫ.

К1-Фактор АТР-синтаз предствителей верхних ветвей эубактерий легко отделяется от Го-фактора в средах с низкой ионной силой в присутствии ЭДТА. Однако оказалось, что в этих условиях каталитическая часть АТР-синтазы С. аигап^сиэ практически не отделяется от мембран. АТРазу удалось отделить при помощи обработки ультразвуком в течение 6 мин в среде с низкой ионной силой. Далее она была очищена до гомогенного состояния. На рис. 1 представлена последняя стадия очистки - гель-фильтрация на колонке сефакрила 3300. Выделенный Фермент содержал четыре субъединицы 63, 54, 36 и 1в кДа (Рис. 2). Площади под пиками денситограммы (590 нм), отнесенные к соответствующей молекулярной массе субъединицы, относились между собой как 2,9:3,0:1,0:0,86, что хорошо укладывалось в принятую стехиометрию о(> Ц> 8 и £. субъединиц Р1-АТРаз. Молекулярная масса комплекса составила примерно 400 кДа (рис. 16). Сумма масс субъединиц, из расчета стехиометрии 3:3:1:1, равнялась 405 кДа.

А в

Нфракиии

Рис. 1. Гель-фильтрация на колонке сефакрила 3-300 (48*0.9 см), а - профиль элюции (А2$д) и активность во Фракциях (столбики),

б - определение молекулярной массы АТРазы 1 - уреаза, 2 - Ферритин, 3 - каталаза, 4 - бычий сывороточный альбумин.

Рис. 2. Электрофорез препарата АТРазы: А. электрофорез в-недиссоциирующих условиях (градиент акриламида 4-122), В - в присутствии ЬЮЭ (градиент акриламида 12-18Х)

Характерной чертой Fl-АТРаз является подавление АТРазной активности избытком Mg2+ по отношению к АТР, что обусловлено ингибируюдим связыванием комплекса образующегося ADP с Kg2+ с нуклеотид-связывающими местами фермента. Ингибирование снимается активаторами АТРазной реакции - детергентом октилглюкозидом и сульфитом. Подобное наблюдалось и для выделенного фермента. Максимальная АТРазная активность достигалась при соотношении Mg2+ к АТР 0,3-0,5. Увеличение концентрации Са2+ до 8 мМ монотонно увеличивало АТРазную активность (рис. 3). Октилглюкозид, добавленный в среду реакции, стимулировал Mg-АТРазную активность фермента и снимал ингибирующее действие высоких концентраций Mg2+. Са-АТРазная реакция мало стимулировалась октилглюкозидом. Сульфит подобно октилглюклзиду, но в меньшей степени, стимулировал Mg-АТРазную активность, и почти не стимулировал Са-АТРазную активность.

Фермент был весьма специфичен по отношению к субстратам. Только Mg-GTPa3HaH активность достигала 30Х от Mg-АТРазной, однако в отличие от последней она не стимулировалась октилглюкозидом. Скорости гидролиза GTP в присуствии Са2+, а также СТР, UTP, ADP и пирофосфата в присутствии как Са2+ так и Mg2+ не превышали 4S! от скорости гидролиза АТР с соответствующим ионом.

Таким образом выделенный фермент по исследованным свойствам походил на Fl-АТРазы представителей верхних ветвей эубактерий, за исключением того, что с трудом отделялся от Fo и содержал четыре субъединицы вместо пяти.

. Рис. 3. Зависимость скорости гидролиза АТР (2 мМ) препаратом АТРа'зы от концентрациии двухвалентных катионов. 1, 3 (а,б) - Hg2+; 2, 4 (а,б) - Са2+;

1, 2 (б) 30 мМ октилглюкозид; 3, 4 (б) - 50 мМ сульфит На.

Следующим шагом было выделение полной АТР-синтазы. Фермент был солюбилизирован смесью октилглюкозид-холат и очищен фракционированием сульфатом аммония и центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Для полной очистки потребовалась еще одна стадия -гельфильтрация на колонке сефакрила вЗОО. Для сравнения была еще раз выделена АТРаза по прежней методике, фермент содержал те же четыре субъединицы, что и в первый раз, с той же стехиометрией 3:3:1:1.

Результаты БОБ-электроФореза в буферной системе Лэммли представлены на рис. 7. АТР-синтаэа помимо полос с{, и ¿'содержала три полосы с приблизительными молекулярными массами 17,5, 16,5 и 15,5 кДа, которые по насыщающему окрашиванию кумасси 0-250 можно считать стехиометрическими ^-субъединице. Отношения площадей под пиками денситограммы к соответствующим молекулярным массам относились к этой величине для ^-субьединицы соответственно как 3,1:1,0: 1,1. Кроме этого присутствовали еще три полосы: 17, 16 и 10 кДа, которые слабо окрашивались кумасси. Полосы 17 и 16 кДа слабо окрашивались и серебром, и поэтому их трудно принять зквимолярныки ¿¡'-субъединице. Тем не менее они были максимальными в тех Фракциях гель-Фильтрации, в которых были максимальными остальные полосы и АТРазная активность. Полоса 10 кДа интенсивно окрашивалась серебром, что характерно для ДЦКД-связывющего белка известных "АТР-син-таз. Кроме того позднее обнаружилось, что эта субъединица образует агрегаты при стандартном нагревании образцов для электрофореза до 100 С (Рис. 7Б). Агрегаты располагались на старте, образуя шлейф, и только малая доля субъединицы 10 кДа находилась в соответствующем месте. Четвертая субъединица АТРазы, хотя и являлась эквимоляр-ной -субьединице, по положению на электроФореграмме не соответствовала ни одной из субъединиц, которые тем же методом определялись как эквимолярные ^-субьединице в полном ферменте. Она примерно соответсвовала нижней из двух тонких полос АТР-синтазы.

Функциональная активность препарата АТР-синтазы проверена по реакции -АТР обмена на протеолипосомах. Протеолипосомы были приготовлены методом разведения смеси Фермент-липид-детергент при 52 С. Собственные липиды бактерии использованы для того, чтобы проводить реакции при естественной для этого Фермента температуре. Суспензия липидов, освобожденных от пигментов и моногалактолипида, при нагревании до 50°С и встряхивании становилась равномерно дисперсной и в таком виде, т.е. без расслоения, сохранялась при хранении при комнаткой температуре и при замораживании. При добавлении к такой суспензии раствора октилглюкоэида до весового

122 1 12

■ I -*»- I _ и -

д ?

Я^Ир!

т

МИШ

Рис. 7. Бог-электрофорез препарата АТР-синтазы (буферная система Лэммли, градиент ПААГ 13-18Х)

А. 1 - АТР-синтаза, 2 - АТРаза, М - маркеры. Образцы нагреты 1 мин при ЮО^С.

Б. Образование агрегатов субъединицы 10 кДа при нагревании образца для ЭРг-электроФореза 1 мин 100аС (2). 1 - без нагревания.

Рис. 5. Кинетика -^Ч-АТР-обмена встроенной в липосомы АТР-синтазой. В отмеченный стрелкой момент времени в отдельные сосуды добавлены ДЦКД до 50 мкМ (1> и грамицидин до 1 мкМ (2). Ингибиторы добавлены из метанольных растворов, конечная коцентрация метанола не превышала 2%.

15 пин

___________ 11

соотношения детергент-лилия от 0,5 до 1 она становилась прозрачной при температуре 50 - 53 С уже в течение первой минуты. К указанной прозрачной смеси добавлялся препарат АТР-синтазы, смесь выдерживалась еще 5 минут и разводилась десятикратно при той же температуре (состав смеси и буфера указан в Методах). Протеолипосомы оказались устойчивыми при комнатной температуре, что позволило, не прибегая к ухищрениям, дополнительно освободить препарат липосом от детергентов элюцией на центрифугируемой колонке Сефадэкса G-5G.

аз

Этот прием значительно увеличивая скорость Pi-ATP обмена. На

рис. 5 представлена кинетика ^Pi-ATP обмена. Скорость обмена

достигала 0,2 - 0,22 U/мг фермента. Удовлетворены традиционные

тесты на "сопряженность" и блокирование протонного канала ДЦКД.

д2

Разобщитель грамицидин ингибировал ^ Pi-АТР обмен и стимулировал гидролиз АТР протеолипосомами от 1,3 до 2,8 U/мг Фермента. ДЦКД

А}

подавлял как гидролиз АТР так и Pi-ATP обмен. Степень подавления гидролиза АТР при концентрациях ДЦКД 10 - 100 мкМ была примерно одинаковой - от 85 до 90%, однако различалось время достижения максимального ингибирования - от 3 до 0,5 мин.

Итак выделенная АТР-синтаза Chloroflexus aurantiacus была функционально активной, но имела некоторые сомнительные свойства: наличие тонких полос, которые нельзя было с уверенностью отнести к субъединицам фермента, и несовпадение четвертой субъедккицы каталитической части с какой-либо из стехиометрических субъединиц полного фермента. Поэтому были предприняты попытки выделить как АТР-синтазу, так и ее каталитическую часть другими способами.

На этот раз каталитическая часть АТР-синтазы была отделена от мембранной части обработкой хлороформом. При первом выделении эта традиционная методика была отвергнута из-за возможности потери S-субъединицы, что описано в литературе. Очистка включала те же стадии, что и в первом случае, за исключением того, что не использовалось осаждение сульфатом аммония и на промежуточной стадии Фермент был сконцентрирован на маленькой колонке Фенил-сефарозы. Выделение было произведено как из штамма А, того же, что и в первом случае, так к из штамма ВЗ. В обоих случаях фермен? содержал четыре субъединицы, как и первом выделении. Однако на этот раз четвертая субъединица была несколько большего молекулярного веса (рис В) и, как показано ниже, совпадала с одной из стехиометрических субъединиц АТР-синтазы (рис. 7). Таким образом, при отделении каталитической части АТР-синтазы С. aurantiacus от мембранной части как с помощью ультразвука, так и с помощью обработки хлороформом в итоге очистки получаются препараты

Фермента, содержащие четыре субъдиницы. Однако в первом случае четвертая субъединица имеет меньшую молекулярную массу, теряя по-видимому небольшой Фрагмент при этой жесткой процедуре.

Рис. 6. Сравнение препаратов АТРазы полученных при отделении Фермента от мембраны ультразвуком (1) и обработкой хлороформом (2;3). 1;2 - штамм А, 3 - штамм БЗ. БББ-элехтрофорез в системе Лэммли (15% ПААГ).

Во втором выделении АТР-синтаза солюбили-зирована тритоном Х100. Очищенный препарат АТР-синтазы был функционально активен, также как и Фермент, солюбилизированным смесь» октилгюкозид-холат. Однако теперь, чтобы добиться хорошего сопряжения и высокой скорости ^Pi-ATP обмена, пришлось несколько изменить условия приготовления протеолипосом. Концентрация октилглюкозида в смеси липид-детергент-белок была увеличена с 1,51 до 22 и в состав буфера для разведения был введен БСА до 0.2%. Очевидно, тот детергент, который первично садится на гидрофобные участки фермента, уже не обменивается с окружающим детергентом и именно он является критическим местом в образовании сопряженных протеолипосом. Заменить октилглюкозид в гидрофобных участках АТР-синтазы на липиды легче, чем тритон Х100. Скорость ^Pi-ATP обмена достигала 0.16 U/мг. Скорость гидролиза АТР протеолипосомами составляла 0.33 U/мг и стимулировалась грамицидином (1 мкЮ в 2.8 раза.

Электрофорез в буферной системе Лэммли выявил восемь полос. Однако электрофорез в трис-трициновой буферной системе в присутствии 6 М мочевины (Schagger, von Jagow 1987), разработанной для низкомолекулярных полипептидов разделил АТР-синтазу С. aurantiacus уже на девять позипептидов (рис. 7) Три верхних полосы в обеих системах можно легко идентифицировать с Ы, ß и ^-субъединицами АТР синтаз верхних ветвей эубактерий. Следующая полоса на электрофорезе с мочевиной совпадает с четвертой полосой каталитической части. Поскольку все.полосы, дополнительные к полосам АТРазы распологаются ниже, можно идентифицировать ее с $-субъединицей. Остальные полосы обозначены предварительно 1, 2, 3, 4 и 5.

/ 2 3

кОа .

35 — 29"»

20.1® 17.8«» 14-2»

Рис. 7. Электрофорез препаратов ЛТРазы и АТР-синтазы в буферных системах Лэммли (А 15Х ПААГ) и Шэггера-фон Ягова в присутствии 6 М мочевины" (В 121 ПААГ). Треки: 1 - АТРаза; 2 - АТР-синтаза; 3 - как (2), но в образце пропущен меркаптозтанол; 4 - меченный [/^СЗДЦКД препарат АТР-синтазы, трек высушен; 5 - радиавтограф трека (4).

^■wat^t! i! "if 111« III

Р i1 "•lb

M^fes S'SM, I ' if.1

!гЧу »

! a

Рис. 8. Двумерный электрофорез препарата АТР-синтазы. Первое направление - в буферной системе Лэммли (15% ПААГ), второе - в системе Иэггера-фон Ягова в присутствии 6 М мочевины (12% ПААГ). Пятна окрашены серебром.

«

Двумерный электрофорез (рис 8) подтвердил наличие девяти полипептидов и показал, почему в системе Лэммли обнаруживается только восемь полос - субъединица 3 движется в этой системе вместе с субъединицей 1. Кроме того, относительные позиции полос дельта, 1, 2, 3 и 4 различались в этих двух системах. Молекулярные массы субъединиц относительно глобулярных белков-маркеров в двух системах представлены в таблице.

Здесь же представлена стехиометрия субъединиц. Способ определения стехиометрии по окрашиванию кумасси не совсем адекватен, поскольку разные белки могут окрашиваться в разной степени. Однако в данном случае экспериментальные данные близки к целым цифрам и, кроме того, отношение окрашивания для (£> ß и ^субединиц очень близко к 3:3:1 - величине, Твердо установленной для АТР-синтаз. Поэтому субъединицы (5, 2, 3 и 4 можно считать эквимолярными Субъединица 1 по данной оценке содержится в 4 копиях. По массе она примерно соответствует субъединице b E.coli и PS3, которая представлена двумя копиями. Хотя надежность точного определения числа копий уменьшается с увеличением этого числа, в данном случае оно очевидно превышает 2 и это является еще одной особенностью АТР синтазы С. aurantiacus.

Таблица. Молекулярные массы АТР-синтазы С. auantiacus определены при помощи SDS-электрофореза в буферных системах Лэммли (1) и Шэггера и фон Ягова в присутствии 6 М мочевины (2). Для определения стехиометрии треки 2 и 3 на рис. 4В были денситометри-рованы при 590 нм и площади под пиками разделены на соответствующие молекулярные массы, представленные в колонке (2).

субъединица молекулярная масса стехиометрия

(1) (2) эксперимент целое

альфа ' 63 60 2. 9 3

бета 54 50 3, 0 3

гамма 36 33 1, 0* 1

дельта 17 19 1, 2 1

1 17,5 16, 5 4, 4 4

2 15,5 15, 5 1, 3 1

3 17,5 14, 5 Р. 95 1

4 16,5 13 1. 2 1

5 10 8 6, 4 >6

гетеродимер 3-4 28 25 1,1 1

* принята за 1,0

----------- ------------------------------------------------------------------15

Чтобы определить субъединицу, связывающую ДЦКД, препарат АТР синтазы (1 мг/мл = 2 мкМ) был инкубирован с С^СЗДЦКД (20 мкМ, 55 MCi/ммоль) в течение двух часов при комнатной температуре и затем был непосредственно смешан с солюбилизирующим буфером и подвергнут электрофорезу. Трек с меченным ферментом был высушен и с него был снят радиоавтограф. Широкая полоса радиоактивности, которая, располагалась сразу за Фронтом отнесена к несвязанному ДЦКД, движущемуся в массе мицелл SDS. Узкая полоса радиоактивной метки располагалась непосредственно за полосой 5, окрашенной кумасси, но не совпадала с ней. Объяснения этому расхождению не найдено, тем не менее вывод был сделан, что именно субъединица 5 связывает ДЦКД. Этот вывод подтверждается совпадением этой субъединицы по молекулярной массы с ДЦКД-свяывающими белками известных АТР-синтаз, а также большим числом копий субъединицы 5.

Если солюбилизирующий буфер, в котором обрабатывался образец АТР-синтазы не содержал меркаптоэтанола, то полосы субъединиц 3 и 4 пропадали. Вместо них появлялась полоса примерно соответствующая сумме их масс. Вырезанная и обработанная солюбилизирующим буфером с меркатоэтанолом, эта полоса при электрофорезе вновь диссоциировала на полосы 14,5 и 13 кДа. Таким образом полипептиды 3 и 4 содержатся в нативном Ферменте в виде гетеродимера, соединенного дисульфидной связью (связями). По своей массе этот гетеродимер примерно соответствует а-субъединице Fo АТР-синтаз верхних ветвей эубакерий.

Заметим, что в этом случае по картине электрофореза АТР-син-таза С. aurantiacus становится похожей на восьмисубъединичную АТР-синтазу Е. coli с той разницей, что место а-субъединицы занимает гетеродимер, а место двойной b-субъединицы занимает субъединица с большим числом копий. Для сходства следует еще предположить, что каталитическая часть АТР-синтазы С. aurantiacus состоит, как и Fl верхних ветвей эубактерий, из пяти субъединиц. В таком случае в процессе отделения или очистки Fl-фактор С. aurantiacus теряет субъединицу 2, которая является его наименьшей субъединицей. Это обстоятельство будет еще одной особенностью АТР-синтазы С. aurantiacus, поскольку Fl-фактор представителей верхних ветвей эубактерий иногда в процессе выделения теряет Ъ-субъединицу, но не &.

16

Выводы:

1. АТР-синтаза из представителя одной из нижних ветвей эубактерий, зеленой несерной бактерии Chloroflexus aurantiaeus принадлежит к классу FlFo-АТРаз, но имеет отличия в субгединичном составе от АТР-синтаз представителей верхних ветвей эубактерий. Выделение АТР-синтазы из представителя нижней ветви эубактерий осуществлено впервые.

2. Функциональная активность АТР-синтазы потверждена реакцией Pi-ATP обмена, проводимой Ферментом встроенным в липосомы из

собственных липидов бактерии. Реакция подавлялась ингибитором протоного канала ДЦКД и разобщителем грамицидином. Гидролиз АТР протеолипосомами подавлялся ДЦКД и стимулировался грамицидином.

3. Фермент состоит из девяти различных полипептидов с молекулярными массами 60, 50, 33, 19, 16,5, 15,5, 14,5, 13 и 8 кДа, определенными с помощью SDS-электрофореза в присутствии мочевины, В стехиометрии 3 : 3 : 1 : 1 : 4 : 1 : 1 : 1 : >6, определенной насыщающим окрашиванием в коллоидном растворе кумасси G 250.

4. Полипептиды 14,5 и 13 кДа соединены дису1Ьфидной связью (связями) в гетеродимер, который по массе соответствует а-субъеди-нице Fo-фактора АТР-синтаз верхних ветвей эубактерий.

5. Субъединица с молекулярной массой 16,5, соответствующей двухкопийной Ь-субъединице Fo-фактора АТР-синтаз Е. coli и термофильной бактерии PS3, представлена числом копий, превышающим 2.

6. Каталитическая часть АТР-синтазы Chloroflexus aurantiaeus не отделяется от мебранной части в среде с низкой ионной силой в присутствии ЭДТА, но может быть отделена обработкой ультразвуком или хлороформом. В обоих случаях очищенный фермент состоит из четырех первых по молекулярной массе субъединиц АТР-синтазы.

7. По Функциональным характеристикам каталитическая часть АТР-синтазы Chloroflexus aurantiaeus похожа на Fl-АТРазы верхних ветвей эубактерий.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Янюшин М.Ф., Выделение и характеристика Fl-АТРазы из зеленой несерной фотосинтезирующей бактерии Chloroflexus aurantiaeus.

Биохимия 1988, т. 53, вып. 8, 1288-1294.

2. Янюшин М.Ф. , АТР-синтаза зеленой несерной фотосинтетической бактерии Chloroflexus aurantiaeus.

Биохимия 1991, т. 56, вып. 6, 1131-1139.