Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах

Алехина, Ольга Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах"

005002597

На правах рукописи

Алехина Ольга Михайловна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва-2011

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, академик

кандидат физико-математических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН

доктор биологических паук, профессор Ведущая организация:

Спирин Александр Сергеевич Василенко Константин Станиславович

Донцова Ольга Анатольевна Морозов Сергей Юрьевич

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 9 декабря 2011 года в II00 часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Лабораторный корпус «А», аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «8_» ноября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инициация- трансляции является важнейшим этапом биосинтеза белка у эукарнот, именно на этой стадии действуют основные механизмы регуляции белкового синтеза в клетке. Основным механизмом эукариотической инициации является так называемая 5'-концсвая инициация, при которой 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированным 5'-коицом мРНК, а затем сканирует нуклсотидную последовательность до тех пор, пока не встретит инициаторный кодон в подходящем контексте. Далее на инициаторном кодоне происходит присоединение большой рибосомной субчастицы и формируется 80S рибосома, готовая к процессу элонгации. Предложенная более 30-ти лет назад М. Козак, эта простая и изящная модель позволила свести воедино большое количество накопленных экспериментальных данных и выдержала множество попыток опровержения. Однако, до последнего времени эта модель являлась не более чем гипотезой. Оставалось неясным, какие молекулярные процессы являются движущей силой инициации. Не удавалось получить прямые экспериментальные доказательства существования процесса сканирования - измерить его кинетические параметры или охарактеризовать промежуточные состояния.

В настоящее время существуют две наиболее общие модели поиска инициаторного кодона путем сканирования 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК, основанные на том факте, что этот процесс является АТФ-зависимым. Согласно первой, широко распространенной модели, считается, что энергия АТФ необходима лишь для функционирования РНК-хеликаз, расплетающих шпильки структурированных 5'-НТО перед рибосомой и таким образом освобождающих дорогу для движущихся 43 S преинициаторных комплексов. В этом случае поиск инициаторного кодона рибосомной субчастицей происходит посредством АТФ-независимой одномерной диффузии, так называемого «бесфазного блуждания» по цепи мРНК.

Согласно альтернативной модели, 40S рибосомные субчастицы осуществляют более или менее равномерное, 5'—*3' направленное движение вдоль 5'-нетранслируемой области мРНК, которое требует энергии само rio себе, независимо от проблемы расплетания вторичной структуры, так как энергонезависимое однонаправленное движение даже вдоль неструктурированных (или расплавленных) участков мРНК нарушает второй закон термодинамики. До недавнего времени существовали лишь косвенные экспериментальные данные, не позволяющие сделать определенный выбор в пользу той или иной модели сканирования.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было получение новых знаний о механизмах инициации трансляции у эукариот. Первой задачей работы было получение ответа на вопрос: каким образом осуществляется поиск инициаторного кодона рибосомой в процессе сканирования? Является ли сканирование однонаправленным, энергетически зависимым движением

инициаторного комплекса вдоль цепи мРНК, или же поиск инициаторного кодона происходит путем стохастического случайного блуждания 40S субчастицы?

Чтобы убедиться в правильности той или иной модели, необходимо было установить взаимосвязь между длиной 5'-НТО и временем, необходимым для ее сканирования. В случае механизма случайного блуждания время сканирования должно быть пропорционально квадрату длины 5'-НТО, тогда как . в случае однонаправленного движения эта зависимость должна быть линейной. В нашей работе мы анализировали время инициации как часть общей продолжительности эпицикла трансляции. Для этого был применен уникальный метод in situ мониторинга синтеза люциферазы в бесклеточных системах трансляции, позволяющий получать гладкие кинетические кривые и определять время одного раунда трансляции с высокой точностью. Мы использовали набор конструкций мРНК люциферазы с различными длинами 5'-НТО, являющихся производными очень длинного природного лидера из мРНК ретротранспозона LINE-1 человека, для нахождения зависимости между временем сканирования и длиной 5'-нетранслируемой области мРНК.

При трансляции некоторых некэппироваяных мРНК люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы нами был обнаружен интересный эффект - при высоких концентрациях мРНК скорость белкового синтеза заметно увеличивалась в процессе работы системы. Это проявлялось в виде четкого «излома» на кинетической кривой, который наблюдался примерно через 2 полных раунда трансляции. Второй задачей данной работы было попытаться установить, связано ли наблюдаемое увеличение скорости трансляции с включением некоего альтернативного механизма инициации в процессе работы бесклеточной системы, или же оно определяется какими-то другими внутренними изменениями в трансляционной системе.

Научная новизна работы. Для детального исследования кинетических параметров процесса эукариотической инициации трансляции нами был предложен и опробован метод точного измерения продолжительности синтеза белковой цепи in vitro, основанный на комплексной математической обработке кинетических кривых, полученных с помощью непрерывного мониторинга синтеза люциферазы в бесклеточных системах трансляции. С помощью данного метода, позволяющего оценивать время одного раунда трансляции с недостижимой ранее точностью порядка 5 секунд, было показано, что время сканирования в процессе кзп-зависимой инициации трансляции прямо пропорционально длине 5-нетранслируемой области мРНК как в растительной бесклеточной системе, так и в системе из клеток млекопитающих. Эти результаты убедительно свидетельствуют в пользу того, что поиск инициаторного кодона в процессе 5-концевой инициации трансляции происходит путем однонаправленного движения сканирующей рибосомной субчастицы вдоль цепи мРНК, а не стохастического случайного блуждания.

Также было обнаружено, что при трансляции некэпиированпых мРНК люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы может происходить значительное увеличение скорости белкового синтеза приблизительно через один полный раунд трансляции. Было показано, что способность к ускорению трансляции определяется главным образом 5'-лидерной последовательностью мРНК, а также сильно зависит от концентрации мРНК в системе трансляции. Оказалось, что эффект ускорения трансляции определяется увеличением скорости инициации на мРНК при участии фактора инициации eIF4F. На основании этих данных была предложена модель альтернативных способов инициации, основанная на циклизации полисом в процессе белкового синтеза и постепенном включении более эффективного механизма реинициации трансляции.

Основные результаты работы не имеют аналогов в мировой литературе и вносят значительный вклад в понимание процессов, происходящих на стадии инициации белкового синтеза. В данной работе впервые были получены прямые экспериментальные доказательства, подтверждающие модель сканирования 5'-нетраислируемой области мРНК в ходе эукариотической инициации трансляции.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах. Результаты исследований были представлены на российских и международных конференциях: «Конференция, посвященная 40-летию Института белка: Биосинтез, структура и функция белка» (Пущино, 2007 год), «Ежегодная научная конференция Института белка» (Пущино, 2002, 2004, 2007-2010 годы), «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008 год), «13th Annual Meeting of the RNA Society» (Berlin, 2008 год), «EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control» (Heidelberg, 2009, 2011 годы).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы из 243 ссылок. Работа содержит 30 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Часть 1. Исследование кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции в эукариотических бесклеточных

системах

1.1 Метод точного определения продолжительности синтеза одной белковой цепи

Общепринятой процедурой измерения кинетических параметров синтеза белка в бесклеточной системе является отбор проб в различных временных точках с последующим определением концентрации синтезированного белка по активности, либо по включению радиоактивной аминокислоты. Однако, недостаточная точность такого подхода не позволяет получать гладкие кинетические кривые с высоким информационным содержанием.

Рис. 1. Процедура измерения времени трансляции, (а) Кинетика накопления активной люаиферазы в бесклеточной системе, измеренная с помощью in situ мониторинга синтеза белка. 25 нМ mLlOOFluc мРНК транслировали в системе из зародышей пшеницы при 25"С. (б) Первая производная по времени кривой (а) отражает скорость накопления активной люциферазы. Область плато соответствует равновесной скорости синтеза, (в) Аппроксимация второй производной кривой (а) нормальным распределением Гаусса. Отмеченное положение гауссиана на оси абсцисс соответствует среднему времени трансляции мРНК, т. е. суммарному времени инициации, элонгации и терминации.

Ранее в нашей лаборатории был разработан уникальный метод in situ мониторинга синтеза фермента люциферазы из светлячка Photinus pyralis в бесклеточных системах трансляции (Kolb et al., EMBO J., 1994, 13:3631), основанный на том факте, что люцифераза катализирует реакцию превращения субстата люциферина в оксилюциферин в присутствии АТФ и молекулярного кислорода с излучением кванта света. Субстраты люциферазной реакции добавляются непосредственно в реакционную смесь, и количество синтезированного белка измеряется с помощью счетчика фотонов -люминометра - прямо в ходе работы бесклеточной системы трансляции. Данный метод позволяет получать гладкие кривые накопления активной

люциферазы с низким соотношением сигнал/шум, которые позволяют с высокой точностью оценивать кинетические параметры процесса трансляции (Рис. 1а).

Как было показано ранее в нашей лаборатории, сворачивание люциферазы происходит котрансляциопио, и фермент проявляет свою активность сразу же после схода с рибосомы, то есть время появления первого активного продукта на кинетической кривой соответствует времени синтеза одной полноразмерной цепи белка, или, другими словами, суммарному времени инициации, элонгации и терминации трансляции. Точная оценка этого параметра затруднена, поскольку излом кривой в этой точке несколько размыт. Так как вторая производная кинетической кривой хорошо описывается функцией Гаусса, то это размытие отражает статистический разброс времен синтеза цепи белка, в этом случае положение пика гауссиана должно соответствовать среднему времени трансляции мРНК (Рис. 1в). Применив подобный математический подход, мы получили возможность измерять время, требующееся для одного раунда трансляции, с очень высокой точностью порядка 5 секунд.

1.2 Зависимость полного времени трансляции от длины 5-НТО мРНК

Для того чтобы исследовать зависимость полного времени трансляции от длины 5'-нетранслируемой области мРНК, был выбран длинный природный лидер из мРНК человеческого ретротранспозона ЬШЕ-1, полная длина которого составляла 913 нуклеотидов. Ранее было показано, что инициация трансляции на этом лидере осуществляется по кэп-зависимому механизму, и не

mL8 Htfuc ml52SF/titf mL386F/uc mL250Fiuc niL200Ffuc mLSFiuc mLSMFluc mU76F/це mt777F1uc mL67ZF/uc

913 814

52S 383 250 200 5 629 77S 777 672

mL526EMCVFftiC 1016 mL336EMCYF.fue 376 mL200EMCVF/uc £90 mEMCVFfuc 430

MCTZ!

-■era

f«CV«£S <7«r>№

-сиз -ca

-СГЗ

— mL813FJuc | |

— mL62SF/iie | |

----mLlSiFIuc • j

--mL20CF/ue I !

---mLSF/uc j j

6 8 10 Время реакции, к

Рис. 2. (а) Схемы мРНК люциферазы с 5'-НТО различной длины. mL9I3Flue, включающая полную последовательность лидера мРНК ретротранспозона LINE-l человека, и 10 конструкций с делециями в 5'-НТО содержат одинаковые рамки считывания светлячковой люциферазы и З'-НТО. Конструкции 12-15 были созданы путем вставки активного фрагмента IRES последовательности EMCV в соответствующие делеционные конструкции перед AUG кодоном. (б) Пример определения полного времени трансляции для мРНК с разной длиной 5'-НТО. Приведены кинетические кривые синтеза люциферазы в пшеничной системе, транслирующей указанные мРНК. Тонкие линии отражают аппроксимацию вторых производных по времени соответствующих кривых функцией Гаусса.

было обнаружено каких-либо указаний на существование сайтов внутренней посадки рибосом (IRES) (Dmitriev et al, Mol. Cell. Biol., 2007, 27:4685). Было сконструировано 10 различных делеционных мутантов таким образом,, что делеции более или менее случайным образом перекрывали всю последовательность исходного лидера (Рис. 2а). Полученные с данных конструкций кэппированные мРНК люциферазы транслировали в двух бесклеточных системах - растительной (на основе экстракта из зародышей пшеницы) и из клеток млекопитающих (на основе лизата из клеток асцитов мыши Кребс-2).

Оказалось, что время трансляции действительно увеличивается с увеличением длины 5'-нетранслируемой области мРНК (Рис. 26). Как и ожидалось, максимальная задержка появления люциферазной активности после начала трансляции наблюдалась для мРНК с полноразмерным лидером в 913 нуклеотидов, причем разница во временах трансляции в сравнении с матрицей с самой короткой 5'-НТО составила примерно 2 и 2.5 минуты в пшеничной и асцитной бесклеточных системах, соответственно, что существенно превышает ошибку эксперимента.

На рисунке 3 приведены зависимости полного времени трансляции от длины 5'-нетранслируемой области мРНК в обеих использованных бесклеточных системах. Для всех проанализированных случаев полное время трансляции обнаружило положительную корреляцию с длиной 5'-лидера, и эта

0 200 400 600 800 Длина 5' НТО, нт

Рис. 3. Линейная зависимость полного времени трансляции от длины 5'-НТО. (а) мРНК люциферазы с 5'-НТО различной длины транслировали в системе из зародышей пшеницы при 25°С и концентрации К+ 35 мМ (о) или 75 мМ (•). (й) Те же мРНК транслировали в системе из асцита мыши Кребс-2 при 30°С (о). В той же системе транслировали мРНК со вставкой IRES поледовательности EMCV перед AUG кодоном (■).

зависимость была близка к линейной. Так как кодирующая последовательность и З'-НТО были одинаковыми для всех используемых матриц, то различия в полных временах трансляции, по-видимому, должны объясняться разницей во временах инициации. Также было продемонстрировано, что линейная зависимость времени трансляции от длины лидера является характерным свойством именно кэп-зависимой инициации трансляции. При переключении инициации трансляции с 5'-концевой на внутреннюю путем вставки IRES последовательности из вируса энцефаломиокардита (EMCV) в 5'-НТО мРНК перед стартовым кодоном (конструкции 12-15 на Рис. 2а), было обнаружено; что время трансляции пе зависит от длины последовательности лидера, предшествующей IRES (Рис. 36).

1.3Доказательство влияния длины 5'-НТО мРНК на продолжительность стадии инициации

Для того чтобы подтвердить, что наблюдаемые различия во временах трансляции для мРНК с разной длиной 5'-НТО определяются изменением времени инициации, а не какими-либо изменениями на стадии/элонгации, мы воспользовались тем фактом, что концентрация ионов Кь влияет на скорость эукариотической элонгации. Действительно, в наших экспериментах увеличение концентрация калия в бесклеточной системе трансляции приводило к уменьшению полного времени трансляции для всех проверенных конструкций мРНК люциферазы (Рис. ..За)! При этом характер зависимости времени трансляции от длины 5'-НТО не изменялся при увеличении концентрации ионов калия. Вероятно, эта зависимость определялась процессом, слабо чувствительным к изменению концентрации моновалентных катионов.

Для того чтобы идентифицировать этот процесс, две мРНК люциферазы -с самой короткой и самой длинной из исследованных 5-НТО - начинали транслировать в бесклеточной системе из зародышей пшеницы при низкой концентрации калия, а затем в порции трансляционной смеси добавляли дополнительный К+ с интервалом в 30 секунд в ходе реакции трансляции. В результате, было обнаружено, что зависимость полного времени трансляции от времени добавления К+ в систему для мРНК с самой короткой 5-НТО в 5 нуклеотидов оказалась линейной на протяжении всего процесса биосинтеза белка. Совсем другая ситуация наблюдалась для мРНК с полноразмерным LINE-1 лидером в 913 нуклеотидов: на протяжении первых 2-х минут работы системы увеличение концентрации калия одинаково влияло на полное время трансляции, что отражено в плато на графике (Рис., 4), Следовательно, трансляция мРНК с длинной 5'-НТО начиналась со стадии, нечувствительной к концентрации К+, по-видимому, стадии инициации. Продолжительность этой стадии (примерно 100 секунд) практически совпала с разницей в полных временах трансляции, измеренных для мРНК люциферазы с самой короткой 5'-НТО и матрицы с самым длинным полноразмерным лидером. Этот результат подтверждает предположение, что влияние длины 5'-нетранслируемой области

11 11 I I I I U M I

0 2 4 6 8 10 Время добавления KOAc, мин

Добавление здеива Эффект эдеина

Время реакции, мин

Рис.4, (а) Зависимость полного времени трансляции от времени добавления К+ в систему. В различные моменты времени после начала реакции в систему из зародышей пшеницы, транслирующую 25 нМ указанной мРНК, добавляли КОАс, повышая конечную концентрацию К+ с 35 мМ до 75 мМ. (б) Доказательство постоянства суммарного времени элонгации и терминации при трансляции мРНК с 5'-НТО различной длины. В указанный момент времени с систему, транслирующую 25 нМ соответствующей мРНК, был добавлен эдеин до конечной концентрации 3 мкМ (жирные линии) или деионизованная вода (тонкие линии). Вертикальной линией отмечено совпадение моментов отклика системы на добавление антибиотика доя всех мРНК.

на полное время трансляции осуществляется именно на уровне инициации трансляции и, вероятнее всего, на стадии сканирования.

В дополнение к этому, отсутствие влияния длины 5'-НТО на стадию элонгации было проверено прямым измерением так называемого transit time, то есть суммарного времени элонгации и терминации трансляции, для данных конструкций мРНК люциферазы. Для этого мы использовали метод ингибирования стадии инициации трансляции антибиотиком эдеином, который действует на поздней стадии эукариотической инициации, предотвращая формирование 80S инициаторных комплексов на AUG кодоне. Мы добавляли эдеин в бесклеточную систему из зародышей пшеницы, транслирующую мРНК люциферазы с различными длинами 5-НТО, через 4 минуты после начала трансляционной реакции. Несмотря на то, что полные времена трансляции различались для используемых лтоциферазных матриц, ответ на добавление антибиотика происходил практически в один и тот же момент (Рис. 46). Поскольку эта задержка реакции системы на добавление эдеина и соответствует transit time, то было доказано, что оно не зависит от длины 5'-Лидерной последовательности мРНК. Таким образом, было подтверждено, что изменение длины 5-НТО влияет только на продолжительность стадии инициации трансляции.

1.4Влияние элементов вторичной структуры 5-НТО на скорость сканирования

Считается, что в процессе сканирования рибосомный инициаторный комплекс может наталкиваться на различные элементы вторичной структуры, которые могут замедлять или даже блокировать его дальнейшее продвижение вдоль 5'-НТО при инициации трансляции. Однако наши эксперименты показали, что скорость сканирования была практически одинакова на всех исследованных 5'-лидерах из ретротранспозона LINE-1, которые обладали разным содержанием и стабильностью вторичной структуры. При этом необходимо отметить, что в использованных 5'-нетранслируемых областях нет предсказанных шпилек или других двуспиральных элементов с термодинамической стабильностью более -20 кКал/моль.

Для того чтобы исследовать возможное влияние стабильных элементов вторичной структуры на трансляцию в in vitro системах, в предположительно неструктурированный З'-участок полноразмерного лидера из LINE-1 мы вставили 2 варианта шпилек с разной термодинамической стабильностью на небольшом расстоянии от инициаторного кодона. Последовательности обеих шпилек были взяты из работы М. Козак (Kozak М., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1986, 83:2850).

В результате, было обнаружено, что вставка шпильки средней стабильности (около -30 кКал/моль) в 5'-нетранслируемую область мРНК практически не влияла на полное время трансляции и скорость белкового синтеза в сравнении с исходной матрицей без шпильки как в пшеничной, так и

Время реакции, мин Время реакции, мин

Рис. 5. Влияние стабильных элементов вторичной структуры на кинетические параметры трансляции, (я) Кинетические кривые трансляции к системе из зародышей пшеницы мРНК с полноразмерным лидером ЬШЕ-1, а также вариантов с добавлением в 5'-НТО шпилек указанной стабильности, (б) Трансляция тех же конструкций в системе из клеток асцита мыши.

в асцитной бесклеточных системах (Рис. 5), что полностью согласуется с данными Козак, полученными в COS клетках млекопитающих. Этот результат дает объяснение том}' факту, что время сканирования 5'-НТО на основе LINE-1 зависело главным образом от длины, а не от локальной вторичной структуры данных лидеров. Иная ситуация наблюдалась, когда в 5'-НТО была добавлена более стабильная шпилька со свободной энергией плавления около -50 кКал/моль. В этом случае кинетика белкового синтеза изменялась по-разному в зависимости от бесклеточной системы трансляции. Так, в системе трансляции из зародышей пшеницы время инициации не менялось при добавлении шпильки, уменьшалась лишь скорость накопления активной люциферазы, отражающая эффективность инициации (Рис. 5а). Это можно объяснить уменьшением процессивности сканирования при наличии стабильной шпильки в лидерной последовательности мРНК. В системе трансляции из клеток асцитов мыши вставка стабильной шпильки в 5-НТО заметно увеличивала время инициации, но не изменяла скорость накопления люциферазы. То есть, при наличии шпильки люциферазная активность в бесклеточной системе появлялась позже по сравнению с исходной мРНК, однако затем кинетические кривые трансляции шли параллельно друг другу' (Рис. 56).

Эти результаты свидетельствуют о том, что в природе могут существовать различные механизмы преодоления стерических препятствий в процессе сканирования 5'-НТО мРНК. В растительной системе скорость сканирования поддерживается на постоянном высоком уровне, при этом часть рибосом, наталкиваясь на стабильную шпильку, просто уходит с мРНК, и таким образом происходит уменьшение процессивности сканирования. В системе из клеток млекопитающих инициирующие рибосомные субчастицы, встречая на своем пути шпильку высокой стабильности, не соскакивают с матрицы, а лишь замедляют свое движение с тем, чтобы рано или поздно преодолеть это препятствие и продолжить процесс трансляции.

1.S Определение скоростей сканирования 5-НТО и элонгации в эукариотических бесклеточных системах трансляции

Скорость рибосомного сканирования можно оценить из наклона линейных зависимостей полного времени трансляции от длины 5'-НТО, представленных на рисунке 3. Так, было определено, что скорости сканирования 5'-лидерной последовательности мРНК в бесклеточных системах трансляции из зародышей пшеницы (при 25°С) и из асцитов мыши (при 30°С) составляли приблизительно 8 и 6 нуклеотидов в секунду, соответственно.

Ранее было показано, что полное время трансляции мРНК люциферазы с очень коротким лидером в 5 нуклеотидов практически совпадает со значением transit time, которое является преимущественно мерой продолжительности стадии элонгации (Рис. 46). Это позволило определить скорость движения транслирующей рибосомы в процессе элонгации из полного времени трансляции «безлидерной» люциферазной матрицы в двух бесклеточных системах трансляции. Оказалось, что скорость элонгации составляла примерно

3 нуклеотида в секунду в Кребс-2 системе (при 30°С) и 3 или 4.5 нуклеотида в секунду (при концентрации К+ 35 мМ и 75 мМ, соответственно) в бесклеточной системе из зародышей пшеницы (при 25^С). Таким образом, было обнаружено, что скорости движения сканирующих и транслирующих рибосом являются величинами одного порядка. Это означает, что инициация трансляции является довольно сложным процессом, который может вносить существенный вклад в общую продолжительность белкового синтеза.

1.6 Модель однонаправленного движения инициирующей рибосомной субчастицы в процессе сканирования

Полученная в наших экспериментах линейная зависимость между временем сканирования и длиной 5'-НТО мРНК позволяет сделать однозначный вывод о том, что миграция сканирующей рибосомной субчастицы вдоль лидерной последовательности представляет собой однонаправленное движение, а не стохастическое случайное блуждание. Это определенно указывает на существование специального, энергетически зависимого механизма. Такой механизм может быть реализован на молекулярном уровне в виде АТФ-зависимого устройства типа Броуновского храповика, который был предложен и для других двигающихся молекулярных машин, таких как миозин, динеин, кинезин, РНК-полимераза, а также транслирующая рибосома. Принципиальным моментом в таких молекулярных наномашинах является энергетически зависимое ограничение обратных диффузионных движений, тогда как диффузия вперед разрешена.

При обсуждении возможных механизмов сканирования 5'-НТО следует учитывать, что случайное плавление вторичной структуры мРНК АТФ-зависимыми хеликазами, не связанными с рибосомами, вряд ли может обеспечивать однонаправленное движение сканирующей субчастицы. Весьма привлекательной может быть модель, состоящая в том, что хеликаза, присоединенная впереди движущейся рибосомной субчастицы, расплетает вторичную структуру РНК и облегчает сканирование, тогда как позади субчастицы происходит быстрое восстановление спиралей, предотвращающее ее обратную диффузию. Однако недостатком этой модели является строгая необходимость хорошо развитой вторичной структуры вдоль 5'-нетранслирусмой области мРНК.

Согласно другой модели, сканирующая 408 субчастица продвигается вдоль более или менее развернутой цепи РНК под воздействием Броуновского движения, а ее возможное обратное перемещение периодически блокируется благодаря АТФ-зависимому взаимодействию связанных с рибосомой факторов инициации е1Р4А и е№4В с участками мРНК, то есть, эти два белка играют роли «пружины» и «собачки», соответственно, в механизме храповика Фейнмановского типа (Яршп Л.Э., ВюсИгтШгу, 2009, 48:10688). Так или иначе, обе вышеупомянутые модели принципиально согласуются с парадигмой АТФ-

зависимого однонаправленного движения сканирующей рибосомной субчастицы.

Часть 2. Исследование эффекта увеличения скорости белкового синтеза при трансляции некэппированных мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

Применив метод in situ мониторинга для исследования трансляции некзппированиых мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, мы обнаружили интересный эффект. При трансляции мРНК люциферазы с очень короткой 5-НТО в 4 нуклеотида (GGGA) происходило заметное увеличение скорости белкового синтеза в ходе работы бесклеточной системы. Это проявлялось в виде характерного «излома» на кинетической кривой накопления активной люциферазы (Рис. 6а). Причем наблюдаемое ускорение трансляции

2.5-

х 2.0-

5 1.5-

1.0-

0.5-

10 20 30 40 50 Время реакции, мин

: 200-

■ 150-

100-

Каптированная мРНК

• Начальная скорость О Максимальная скорость

,.о......-о..

р Некэплированная мРНК

.0'-

~i—i—i—I—i—

400 800 1200 Концентрация мРНК [GGGa/uc], нМ

Максимальная скорость " симтеза".......

[mGGGA/uc) 0,25) iM 0.75!iM

-1-1-1-Г

10 20 30 40 50 60 Время реакций, мин

Рис. 6. Эффект «разгона» белкового синтеза. (а) Кинетические кривые трансляции указанных концентраций некэппированной мРНК люциферазы с короткой 5'-НТО (ОООА) в системе из зародышей пшеницы. (6) Производные тех же кривых по времени. Пунктирные линии определяют начальную и максимальную скорости синтеза, («г) Зависимость начальной (•) и максимальной' (о) скоростей синтеза белка от концентрации мРНК в системе трансляции.

начиналось приблизительно через 2 времени полного прочтения мРНК рибосомами и достигало своего максимума через 20 - 25 минут работы системы, превышая начальную скорость трансляции в 2.5 раза.

Также оказалось, что этот так называемый «разгон» белкового синтеза происходил только при высоких концентрациях мРНК, добавленной в систему (> 300 нМ), а при низких концентрациях кинетические кривые имели классический мономодальный вид. Это хорошо заметно на графиках, отражающих зависимости начальной и максимальной скоростей белкового синтеза от концентрации мРНК в системе трансляции (Рис. 6в). За начальную скорость синтеза принимали среднюю скорость накопления люциферазы в течение первых 5 минут после появления активного продукта. Максимальную скорость трансляции определяли из максимального наклона кинетической кривой. Совпадение кривых начальной и максимальной скоростей при низких концентрациях мРНК означает отсутствие эффекта ускорения трансляции, а расхождение при более высоких концентрациях матрицы определяет степень выраженности разгона белкового синтеза.

2.1 Влияние 5'-НТО на эффект ускорения трансляции

Чтобы проверить, является ли эффект ускорения трансляции, обнаруженный на «безлидерной» мРНК люциферазы, специфическим свойством данной мРНК, или же он характерен и для других матриц, мы провели трансляцию нескольких различных некэппированных конструкций мРНК люциферазы. Все проверенные мРНК имели одинаковую З'-НТО и различные 5'-лидеры природного или искусственного происхождения. Оказалось, что эффект разгона реализуется в большинстве рассмотренных случаев, однако имеет разную степень выраженности.

Так, в случае мРНК люциферазы с р-глобиновым лидером эффект ускорения в процессе трансляции был очень похож на поведение «безлидерной» матрицы. То есть, начальная скорость трансляции была довольно низкой, однако ускорение при высоких концентрациях мРНК было очень четко выражено и достигало своего максимума при концентрации матрицы в 1000 нМ, после чего несколько снижалось за счет эффекта самоингибирования (Рис. 7а).

Несколько другой случай наблюдался при трансляции мРНК люциферазы с «псевдослучайным» лидером, взятым из последовательности коммерческой конструкции рОЕМ/ис, где эффект разгона был наиболее резко выражен при любых концентрациях матрицы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. При этом синтез люциферазы начинался с очень низкой начальной скоростью, однако примерно через 2 раунда слабой трансляции происходило сильное ускорение даже при низких концентрациях мРНК в системе. В итоге, несмотря на слабый старт, конечный выход люциферазы был

* 2-1

.О

—I-1-1-1-1-1—

400 800 1200

Концентрация мРНК (¡Ыис], м!И

2 60

20-

• Начальная скорость О Максимальная скорость

—--

'•■о

•......» •

400 800 1200 Концентрация мРНК [йЕМ/ис], нМ

5 «Н

134

Рис. 7. Зависимость начально?! (•) и максимальной (о) скоростей синтеза белка от концентрации матрицы при трансляции кекэппированных мРНК с ¡3-глобиновым (л), «псевдослучайным» (6) и прокариотическим (е) лидерами в системе из зародышей пшеницы.

-т-1-|-1-1-1—

400 800 1200 Концентрация мРНК [РР.О-/ис], нМ

сравним с выходом, полученным при трансляции других мРНК с эффективными лидерами (Рис. 76).

Лишь одна из проверенных конструкций мРНК люциферазы, несущая прокариотический 5'-лидер, не выявила эффекта увеличения скорости белкового синтеза в ходе работы бесклеточной системы трансляции. То есть, при трансляций данной мРНК максимальная скорость синтеза достигалась сразу же после начала работы системы и уже далее не изменялась независимо

от концентрации матрицы (Рис. 7в).

Таким образом, было выявлено два типа трансляции некэппированных мРНК в бесклеточной системе - это трансляция с постоянной скоростью при любых концентрациях матрицы или же трансляция с ускорением, которое достигает максимума при некоторых оптимальных количествах мРНК. Тот или

иной тип трансляции определяется структурой 5-нетранслируемой области мРНК.

2.2 Установление постоянства скорости элонгации в течение работы бесклеточной системы из зародышей пшеницы

Одним из возможных объяснений наблюдаемого нами эффекта увеличения скорости белкового синтеза может быть уменьшение продолжительности стадии элонгации в процессе работы бесклеточной

Рис. 8. Определение суммарного времени элонгации и терминации (transit time) через 4 (о) и 18 (•) минут трансляции 500 пМ мРНК люциферазы с коротким лидером (GGGA) в системе из зародышей пшеницы. Приведена кинетика накопления радиоактивности в полноразмерном белке после быстрого разбавления системы радиоактивной аминокислоты. Пунктирными линиями отмечены найденные значения transit time.

О 2 4 б]] 8 10

Transit time

Время релаксации, мин

системы трансляции. Чтобы исключить такую возможность, необходимо было проверить, изменяется ли transit time, то есть суммарное время элонгации и терминации трансляции, в ходе белкового синтеза или же остается постоянным. Для этого мы использовали классический метод импульсной метки, разработанный ранее для in vivo систем, который был слегка модифицирован для нашей in vitro системы. В трансляционную смесь через 4 и 18 минут инкубации добавляли высокомеченый [14С]-лейцин и через 2 минуты систему разбавляли большим избытком немеченого лейцина. В течение последующей инкубации бесклеточной системы из зародышей пшеницы определяли кинетику накопления радиоактивного полноразмерного белка. Временную точку, в которой радиоактивная метка достигает плато, следует интерпретировать как суммарное время элонгации и терминации, то есть transit time. Было обнаружено, что значения transit time, измеренные через 4 и 18 минут работы системы, практически одинаковы и составляют около 6 минут (Рис. 8). Из этих данных следует, что время элонгации остается постоянным в течение работы бесклеточной системы из зародышей пшеницы, и, таким образом, изменение скорости белкового синтеза (эффект ускорения) следует объяснять процессами, происходящими на стадии инициации трансляции.

3000 -

га х s

ZS «

ф ц

2000

1000

2.3 Анализ распределения размеров полисом в ходе работы бесклеточной системы трансляции

Так как скорость элонгации постоянна в ходе экспериментов по трансляции, наблюдаемое ускорение белкового синтеза может объясняться как вовлечением в трансляцию новых молекул мРНК, в пользу чего свидетельствует зависимость наблюдаемых явлений от концентрации мРНК, так и увеличением эффективности инициации трансляции на одних и тех же матрицах. Анализ кинетических кривых не позволяет различить эти две возможности. Для того чтобы проверить оба предположения, мы проанализировали профили распределения размеров полисом в транслирующей системе в разные моменты времени. При условии постоянства скорости элонгации, которое мы подтвердили, размер полисом должен коррелировать со скоростью инициации трансляции на отдельной матрице.

Для анализа распределения полисом реакционные смеси, транслирующие мРНК люциферазы с коротким 5-лидером в высокой и низкой концентрации, фракционировали методом ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы через 10 и 30 минут работы бесклеточной системы трансляции, то есть до и после разгона. В результате было обнаружено, что при трансляции мРНК люциферазы в низкой концентрации в ходе работы бесклеточной системы большая часть транслирующих рибосом находилась в составе ди- и трисом, и накопление полисом более высокого порядка было довольно слабым (Рис. 9а). В случае высокой концентрации матрицы, то есть в условиях ускорения белкового синтеза, в . процессе работы трансляционной системы наблюдалось перераспределение значительной части рибосом в более крупные полисомы, состоящие из 6 - 8 рибосом на мРНК (Рис. 96).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что

Рис. 9. Формирование полирибосом в системе из зародышей пшеницы при трансляции 750 нМ (а) и 250 нМ (б) мРНК люциферазы с короткой (ОООА) 5'-НТО. Через 10 (пунктирные кривые) или 30 (сплошные кривые) минут трансляции аликвоты реакционной смеси фракционировали путем центрифугирования в 15-45% градиенте сахарозы. Цифрами обозначен размер полисом в соответствующем пике.

наблюдаемый эффект увеличения скорости белкового синтеза в ходе работы бесклеточной системы трансляции объясняется увеличением скорости инициации на одних и тех же матрицах, а не вовлечением новых свободных мРИК в процесс трансляции. Концентрационная зависимость обнаруженных явлений может объясняться тем, что избыток матрицы специфически связывает какие-то факторы в системе трансляции, препятствующие увеличению скорости синтеза белка в ходе работы бесклеточной системы.

2.4 Влияние добавления юп-аналога на эффект ускорения белкового синтеза

Считается, что добавление кэп-аналога в эукариотическую бесклеточную систему трансляции блокирует фактор инициации е1Г4Р и таким образом ингибирует инициацию трансляции на копированных матрицах. Мы решили проверить, требуется ли этот белковый фактор для инициации на некэппированных мРНК люциферазы с различными лидерами. Для этого в систему из зародышей пшеницы до начала трансляции добавляли различные количества кэп-аналога т'ОрррОт и из полученных в результате кинетических кривых определяли начальную и максимальную скорости белкового синтеза.

На рисунке 10 приведены зависимости начальной и максимальной скоростей трансляции двух конструкций мРНК люциферазы от количества добавленного в систему кэп-аналога. В случае матрицы с коротким 5'-лидером влияние кэп-аналога на начальную скорость синтеза люциферазы было довольно слабым (Рис. 10а). Даже при самой высокой концентрации ш7СрррСтт начальная скорость трансляции уменьшалась не более чем на 15 - 20% по сравнению с трансляцией мРНК без добавления кэп-аналога. Напротив, подавление максимальной скорости белкового синтеза было весьма

| 49

I 3

в>

® 2

Начальная скорость -О- Максимальная скорость

" 1

0.6

0.4-

Ь»«

0.2-

;'-=0

—I— 100

—I— 300

—I—

400

200 300 400 500

Концентрация т7Срррв, мкМ

-1-1-1-1 1—

100 200 300 400 500

Концентрация т7СрррС, шМ

Рис. 10. Влияние кэп-аналога (ш7СрррОш) на начальную (•) и максимальную (о) скорости синтеза белка при трансляции 500 нМ некэппнрованной мРНК люциферазы с короткой (а) или прокариотической (6) 5'-НТО.

значительным - при высокой концентрации m7GpppGm она становилась равна начальной, и, таким образом, полностью выключался эффект ускорения трансляции. На трансляцию мРНК с прокариотическим лидером, которая имела только медленную фазу трансляции и не проявляла эффекта ускорения белкового синтеза, кэп-аналог действовал довольно слабо - форма кинетической кривой не изменялась, а скорость трансляции сокращалась лишь на 20% при самой высокой концентрации m'GpppGm (Рис. 106).

Таким образом, было показано, что добавление кэп-аналога ингибирует именно стадию ускорения белкового синтеза и почти не влияет на первую медленную фазу трансляции. Эти результаты свидетельствуют о том, что при трансляции некоторых некэппированных мРНК могут сосуществовать или даже частично перекрываться два механизма инициации - е1Р4Р-независимый путь, осуществляющийся с самого начала белкового синтеза, и более эффективная инициация с участием фактора eIF4F, включающаяся на более поздней стадии после прочтения мРНК многими рибосомами.

2.5 Модель альтернативных механизмов инициации трансляции на некэппированных мРНК в эукариотической бесклеточиой системе

На основании всех вышеизложенных данных можно сформулировать вероятную модель инициации трансляции на некэппированных мРНК в эукариотических бесклеточных системах. По-видимому, трансляция некэппированных мРНК начинается с е1Р4Р-независимой инициации на 5'-НТО, а затем, по мере образования нагруженных полисом, происходит сближение 5'- и 3'-концов мРНК и тесное взаимодействие между ними посредством субъединицы eIF4G фактора инициации eIF4F. Этот процесс запускает второй механизм инициации - реинициацию транслирующих рибосом на тех же самых матрицах. Таким образом, начиная с этой более поздней стадии трансляции, начинают сосуществовать два перекрывающихся способа инициации. Постепенное включение механизма реинициации проявляется как увеличение суммарной скорости инициации в ходе работы эукариотической in vitro системы трансляции, что и отражается в виде «излома» на кинетической кривой белкового синтеза.

Существенное наблюдение, сделанное из наших экспериментов, состоит в том, что для эффекта ускорения белкового синтеза требуется высокая концентрация мРНК в системе, большая часть которой, по-видимому, не транслируется. Это может объясняться тем, что эукариотические экстракты содержат большое количество мРНК-связывающих белков, которые могут формировать кооперативные комплексы с экзогенными матрицами, добавленными в экстракт. Образование таких комплексов с транслирующейся матрицей может предотвращать вышеупомянутую перестройку полисом и препятствовать ускорению трансляции, тогда как частичное депонирование мРНК-связывающих белков на избытке экзогенной матрицы и обеспечивает наблюдаемый нами эффект «разгона» белкового синтеза.

выводы

1. Разработан метод точного измерения продолжительности синтеза полипептидной цепи белка на рибосоме.

2. В эукариотических системах трансляции показана линейная зависимость времени сканирования 5'-нетранслируемой области мРНК от ее длины в процессе кэп-зависимой инициации трансляции. Впервые экспериментально доказана однонаправленность движения инициирующей рибосомной субчастицы.

3. Показано, что скорость рибосомного сканирования 5-нетранслируемой области мРНК сравнима со скоростью процесса элонгации белковой цепи.

4. Исследовано влияние вторичной структуры мРНК на процесс сканирования. Показано, что шпильки высокой стабильности уменьшают процессивность сканирования в растительной системе и уменьшают среднюю скорость сканирования в системе из клеток млекопитающих.

5. Обнаружено увеличение скорости синтеза белка в процессе трансляции некэппированных мРНК («эффект разгона»),

6. Предложена модель механизма реинициации после одного раунда трансляции, основанная на циклизации транслирующих полирибосом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В рецензируемых журналах:

1. Vassilenko K.S., Alekhina О.М., Dmitriev S.E., Shatsky I.N., Spirin A.S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation // Nucleic Acids Res. 2011. V. 39. P. 55555567.

2. Shirokikh N.E., Alkalaeva E.Z., Vassilenko K.S., Afonina Zh.A., Alekhina O.M., Kisselev L.L., Spirin A.S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages // Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. P. el5.

3. Alekhina O.M., Vassilenko K.S., Spirin A.S. Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell-free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 65476559.

В сборниках тезисов докладов конференций:

4. Alekhina О.М., Vassilenko K.S., Spirin A.S. Precise evaluation of temporal parameters of eukaryotic translation initiation И EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control, EMBL, Heidelberg, Германия, Abstract book, 2011. P. 73.

5. Vassilenko K.S., Alekhina O.M., Dmitriev S.E., Shatsky I.N., Spirin A.S. Eukaryotic translation initiation: Net-unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle // EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control, EMBE, Heidelberg, Германия, Abstract book, 2011. P. 277.

6. Алехина O.M., Василенко K.C., Дмитриев C.E., Спирин А.С. Влияние структуры 5'-нетранслируемой области мРНК на инициацию трансляции у эукариот // Ежегодная научная конференция Института белка РАН, Институт белка РАН, Пущино, Московская область, Россия, Сборник тезисов, 2010. Р. 6.

7. Shirokikh N.E., Alkalaeva E.Z., Vassilenko K.S., Afonina Z.A., Alekhina O.M., Kiselev L.L., Spirin A.S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages // EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control, EMBL, Heidelberg, Германия, Abstract book, 2009. P. 236.

8. Alekhina O.M., Vassilenko K.S., Spirin A.S. In situ monitoring of protein synthesis in a cell-free system: an approach to the study of eukaryotic translation initiation // 13th Annual Meeting of the RNA Society, Berlin, Германия, Program and abstracts book, 2008. P. 613.

9. Vassilenko K.S., Alekhina O.M., Spirin A.S. Translation of non-capped mRNAs in a cell-free system: two concurrent initiation pathways // 13th Annual Meeting of the RNA Society, Berlin, Германия, Program and abstracts book, 2008. P. 685.

Ю.Алехина О.M., Василенко К.С, Спирин А.С. Мониторинг синтеза белка in situ как метод анализа параметров эукариотической трансляции // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, Сборник тезисов, 2008. Р. 108.

П.Василенко К.С., Широков В.А., Алехина О.М., Копеина Г.С., Афонина Ж.А., Громова К.В., Васильев В.Д., Спирин А.С. Инициация, формирование полирибосом и циркулярная трансляция в эукариотической бесклеточной белоксинтезирующей системе // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, Сборник тезисов, 2008. Р. 157.

12.Alekhina О.М., Vassilenko K.S., Spirin A.S. Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation // 40th Anniversary of the Institute of Protein Research meeting: Protein Biosynthesis, Structure and Function, Институт белка РАН, Пущино, Московская область, Россия, Conference abstracts book, 2007. P. 12.

Подписано в печать:

26.10.2011

Заказ № 6203 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алехина, Ольга Михайловна

Список сокращений

I. Введение

II. Обзор литературы

1. Основные механизмы инициации трансляции

2. Особенности эукариотических мРНК

Кэп-структура

5'-нетранслируемая область мРНК

З'-нетранслируемая область мРНК

Инициаторный кодон и консенсусная последовательность

Альтернативные инициаторные кодоны

3. Механизм 5-концевой инициации трансляции

Формирование 43 S преинициаторного комплекса

Присоединение 43 S комплексов к мРНК

Сканирование 5'-НТО мРНК

Узнавание инициаторного кодона

Блокирование рибосомы на инициаторном кодоне

Присоединение 60S рибосомной субчастицы

4. Механизм внутренней инициации трансляции

Структура IRES

IRES-связывающие белки eIF-независимые IRES

5. Регуляция инициации трансляции

Регуляция активности факторов инициации мРНК-специфическая регуляция инициации

Регуляция инициации 5'-НТО-связывающими белками

Регуляция инициации З'-НТО-связывающими белками

Стимуляция трансляции поли(А)-связывающим белком

Регуляция трансляции с помощью микроРНК

III. Материалы и методы

1. Материалы

1.1 Реактивы и ферменты

1.2Плазмиды

2. Экспериментальные процедуры

2.1 Конструирование и выделение плазмид

Полимеразная цепная реакция

Рестрикция плазмид

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

Лигирование

Трансформация Е. coli

Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3 Транскрипция in vitro

2.4 Котранскрипционное кэппирование мРНК

2.5 Электрофорез РНК в агарозном геле в денатурирующих условиях

2.6 Определение концентраций ДНК и РНК

2.7 Трансляция in vitro

Трансляция в системе из зародышей пшеницы

Трансляция в бесклеточной системе Кребс

2.8 Вычисление полного времени трансляции

2.9 Определение transit time методом импульсной метки

2.10 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.11 Анализ полисом методом скоростного зонального ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы

IV. Результаты

1. Исследование кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции в эукариотических бесклеточных системах

1.1 Мониторинг синтеза люциферазы в бесклеточных системах трансляции в реальном времени

1.2 Метод точного определения продолжительности синтеза одной белковой цепи

1.3 Конструирование мРНК люциферазы с 5'-НТО различной длины на основе лидера из ретротранспозона LINE-1 человека

1.4 Зависимость полного времени трансляции от длины 5'-нетранслируемой области мРНК

1.5 Определение вклада разных этапов трансляции в изменение времени синтеза белковой цепи

1.6 Установление постоянства скорости элонгации для мРНК люциферазы с 5-НТО различной длины

1.7Влияние вставки 1RES последовательности в 5'-НТО различной длины на время трансляции мРНК

1.8 Влияние элементов вторичной структуры 5-НТО на скорость сканирования

1.9 Определение скоростей сканирования 5'-НТО и процесса элонгации в эукариотических бесклеточных системах трансляции

2. Исследование инициации трансляции на некэппированных мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.1 Эффект увеличения скорости белкового синтеза в ходе трансляции мРНК люциферазы с очень короткой 5'-НТО

2.2 Влияние 5-НТО на эффект ускорения трансляции

2.3 Влияние длины З'-НТО на эффект ускорения белкового синтеза

2.4 Влияние кэппирования и полиаденилирования мРНК на эффект ускорения трансляции

2.5 Измерение transit time в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.6 Анализ полирибосом в бесклеточной системе трансляции

2.7 Влияние добавления кэп-аналога на эффект ускорения белкового синтеза

2.8мРНК, усиливающие трансляцию других матриц в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.9 Стимуляция синтеза GFP мутантными мРНК люциферазы в пробирке (batch) и CECF системе

V. Обсуждение результатов

VI. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах"

Инициация трансляции является важнейшим этапом биосинтеза белка у эукариот, именно на этой стадии действуют основные механизмы регуляции белкового синтеза в клетке. Основным механизмом эукариотической инициации является так называемая 5'-концевая инициация, при которой 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированным 5-концом мРНК, а затем сканирует нуклеотидную последовательность до тех пор, пока не встретит инициаторный кодон в подходящем контексте. Далее на инициаторном кодоне происходит присоединение большой рибосомной субчастицы и формируется 80S рибосома, готовая к процессу элонгации. Предложенная более 30-ти лет назад М. Козак, эта простая и изящная модель позволила свести воедино большое количество накопленных экспериментальных данных и выдержала множество попыток опровержения. Однако, до последнего времени эта модель являлась не более чем гипотезой. Оставалось неясным, какие молекулярные процессы являются движущей силой инициации. Не удавалось получить прямые экспериментальные доказательства существования процесса сканирования - измерить его кинетические параметры или охарактеризовать промежуточные состояния.

В настоящее время существуют две наиболее общие модели поиска инициаторного кодона путем сканирования 5-НТО мРНК, основанные на том факте, что этот процесс является АТФ-зависимым. Согласно первой, широко распространенной модели, считается, что энергия АТФ необходима лишь для функционирования РНК-хеликаз, расплетающих шпильки структурированных 5'-НТО перед рибосомой и таким образом освобождающих дорогу для движущихся 43 S преинициаторных комплексов. В этом случае поиск инициаторного кодона происходит посредством АТФ-независимой одномерной диффузии, так называемого «бесфазного блуждания» рибосомы по цепи мРНК.

Согласно альтернативной модели, 40S субчастицы осуществляют более или ' менее равномерное, 5'—>3' направленное движение вдоль 5-IITO мРНК, которое требует энергии само по себе, независимо от проблемы расплетания вторичной структуры, так как энергонезависимое однонаправленное движение даже вдоль неструктурированных (или расплавленных) участков мРНК нарушает второй закон термодинамики. До недавнего времени существовали лишь косвенные экспериментальные данные, не позволяющие сделать определенный выбор в пользу той или иной модели сканирования.

В данной работе мы попытались установить механизм поиска инициаторного кодона, определив взаимосвязь между длиной 5'-нетранслируемой области мРНК и временем, необходимым для ее сканирования. В случае механизма случайного блуждания время сканирования должно быть пропорционально квадрату длины 5-НТО, тогда как в случае однонаправленного движения эта зависимость должна быть линейной. Применив уникальный метод in situ мониторинга синтеза люциферазы в эукариотических бесклеточных системах, мы получили возможность оценивать продолжительность одного цикла трансляции (включающую времена инициации, элонгации и терминации) с недостижимой ранее точностью порядка 5 секунд. Это позволило провести точный анализ кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции.

Кроме того, исследуя трансляцию некэппированных мРНК люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, мы обнаружили интересный эффект - при высоких концентрациях мРНК скорость белкового синтеза заметно увеличивалась в процессе работы системы. В данной работе мы попытались установить, связано ли наблюдаемое ускорение трансляции с включением некоего альтернативного механизма инициации в процессе работы бесклеточной системы, или же оно определяется какими-то другими внутренними изменениями в трансляционной системе.

II. Обзор литературы

Инициация трансляции у эукариот

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Алехина, Ольга Михайловна

VI. Выводы

1. Разработан метод точного измерения продолжительности синтеза полипептидной цепи белка на рибосоме.

2. В эукариотических системах трансляции показана линейная зависимость времени сканирования 5-нетранслируемой области мРНК от ее длины в процессе кэп-зависимой инициации трансляции. Впервые экспериментально доказана однонаправленность движения инициирующей рибосомной субчастицы.

3. Показано, что скорость рибосомного сканирования 5'-нетранслируемой области мРНК сравнима со скоростью процесса элонгации белковой цепи.

5. Обнаружено увеличение скорости синтеза белка в процессе трансляции некэппированных мРНК («эффект разгона»).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алехина, Ольга Михайловна, Пущино

1. Hinnebusch, A.G. (2011) Molecular mechanism of scanning and start codon selection in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev, 75, 434-467.

2. Jackson, R.J., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 113127.

3. Kozak, M. (1989) The scanning model for translation: an update. J Cell Biol, 108, 229-241.

4. Abramson, R.D., Dever, T.E. and Merrick, W.C. (1988) Biochemical evidence supporting a mechanism for cap-independent and internal initiation of eukaryotic mRNA. J Biol Chem, 263, 6016-6019.

5. Macejak, D.G. and Sarnow, P. (1991) Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature, 353, 90-94.

6. Pyronnet, S., Pradayrol, L. and Sonenberg, N. (2000) A cell cycle-dependent internal ribosome entry site. Mol Cell, 5, 607-616.

7. Bag, J. (1991) mRNA and mRNP. In Trachsel, H. (ed.), Translation in Eukaryotes. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston, London, pp. 71-96.

8. Spirin, A.S. (1996) Masked and translatable messenger ribonucleoproteins in higher eukaryotes. In Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N. (eds.), Translational Control Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 319-334.

9. Furuichi, Y. and Miura, K. (1975) A blocked structure at the 5' terminus of mRNA from cytoplasmic polyhedrosis virus. Nature, 253, 374-375.

10. Marcotrigiano, J., Gingras, A.C., Sonenberg, N. and Burley, S.K. (1997) Cocrystal structure of the messenger RNA 5' cap-binding protein (eIF4E) bound to 7-methyl-GDP. Cell, 89, 951-961.

11. Lo, H.J., Huang, H.K. and Donahue, T.F. (1998) RNA polymerase I-promoted HIS4 expression yields uncapped, polyadenylated mRNA that is unstable and inefficiently translated in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 18, 665-675.

12. Kozak, M. (1979) Inability of circular mRNA to attach to eukaryotic ribosomes. Nature, 280, 82-85.

13. Kozak, M. (1986) Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 83,2850-2854.

14. Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1985) Insertion mutagenesis to increase secondary structure within the 5' noncoding region of a eukaryotic mRNA reduces translational efficiency. Cell, 40, 515-526.

15. Baim, S.B. and Sherman, F. (1988) mRNA structures influencing translation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mo I Cell Biol, 8, 1591-1601.

16. Cigan, A.M. and Donahue, T.F. (1987) Sequence and structural features associated with translational initiator regions in yeast. Gene, 59, 1-18.

17. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J. and McCarthy, J.E. (2004) Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Mol Microbiol, 51, 987-1001.

18. Kozak, M. (1991) A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes. Gene Expr, 1, 111-115.

19. Pestova, T.V. and Kolupaeva, V.G. (2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev, 16, 2906-2922.

20. Kozak, M. (1991) Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem, 266, 19867-19870.

21. Vassilenko, K.S., Alekhina, O.M., Dmitriev, S.E., Shatsky, I.N. and Spirin, A.S. (2011) Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Res, 39, 5555-5567.

22. Standart, N., Dale, M., Stewart, E. and Hunt, T. (1990) Maternal mRNA from clam oocytes can be specifically unmasked in vitro by antisense RNA complementary to the 3'-untranslated region. Genes Dev, 4, 2157-2168.

23. Shaw, G. and Kamen, R. (1986) A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Cell, 46, 659667.

24. Savant-Bhonsale, S. and Cleveland, D.W. (1992) Evidence for instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent assembly of a > 20S degradation complex. Genes Dev, 6, 1927-1939.

25. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K.M. and Christofori, G. (1991) Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBOJ, 10, 4241-4249.

26. Zhao, J., I-Iyman, L. and Moore, C. (1999) Formation of mRNA 3' ends in eukaryotes: mechanism, regulation, and interrelationships with other steps in mRNA synthesis. Microbiol Mol Biol Rev, 63, 405-445.

27. Sachs, A.B. and Kornberg, R.D. (1985) Nuclear polyadenylate-binding protein. Mol Cell Biol, 5, 1993-1996.

28. Adam, S.A., Nakagawa, Т., Swanson, M.S., Woodruff, Т.К. and Dreyfiiss, G. (1986) mRNA polyadenylate-binding protein: gene isolation and sequencing and identification of a ribonucleoprotein consensus sequence. Mol Cell Biol, 6, 29322943.

29. Sachs, A.B., Bond, M.W. and Kornberg, R.D. (1986) A single gene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins: domain structure and expression. Cell, 45, 827-835.

30. Sachs, A.B., Davis, R.W. and Kornberg, R.D. (1987) A single domain of yeast poly(A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability. Mol Cell Biol, 7, 3268-3276.

31. Kozak, M. and Shatkin, A.J. (1978) Migration of 40 S ribosomal subunits on messenger RNA in the presence of edeine. J Biol Chem, 253, 6568-6577.

32. Kozak, M. (1987) An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res, 15, 8125-8148.

33. Kozak, M. (1984) Selection of initiation sites by eukaryotic ribosomes: effect of inserting AUG triplets upstream from the coding sequence for preproinsulin. Nucleic Acids Res, 12,3873-3893.

34. Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell, 44, 283-292.

35. Kozak, M. (1997) Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBOJ, 16, 2482-2492.

36. Shabalina, S.A., Ogurtsov, A.Y., Rogozin, I.B., Koonin, E.V. and Lipman, D.J. (2004) Comparative analysis of orthologous eukaryotic mRNAs: potential hidden functional signals. Nucleic Acids Res, 32, 1774-1782.

37. Cigan, A.M., Pabich, E.K. and Donahue, T.F. (1988) Mutational analysis of the IIIS4 translational initiator region in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 8, 2964-2975.

38. Yun, D.F., Laz, T.M., Clements, J.M. and Sherman, P. (1996) mRNA sequences influencing translation and the selection of AUG initiator codons in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol, 19, 1225-1239.

39. Chen, S.J., Lin, G., Chang, K.J., Yeh, L.S. and Wang, C.C. (2008) Translational efficiency of a non-AUG initiation codon is significantly affected by its sequence context in yeast. J Biol Chem, 283, 3173-3180.

40. Clements, J.M., Laz, T.M. and Sherman, F. (1988) Efficiency of translation initiation by non-AUG codons in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 8, 45334536.

41. Peabody, D.S. (1989) Translation initiation at non-AUG triplets in mammalian cells. J Biol Chem, 264, 5031-5035.

42. Ingolia, N.T., Ghaemmaghami, S., Newman, J.R. and Weissman, J.S. (2009) Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science, 324, 218-223.

43. Pisarev, A.V., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2007) Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell, 131, 286-299.

44. Fraser, C.S., Berry, K.E., Hershey, J.W. and Doudna, J.A. (2007) eIF3j is located in the decoding center of the human 40S ribosomal subunit. Mol Cell, 26, 811-819.

45. Spahn, C.M., Beckmann, R., Eswar, N., Penczek, P.A., Sali, A., Blobel, G. and Frank, J. (2001) Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae -tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell, 107, 373-386.

46. Ben-Shem, A., Jenner, L., Yusupova, G. and Yusupov, M. (2010) Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Science, 330, 1203-1209.

47. Siridechadilok, B., Fraser, C.S., Hall, R.J., Doudna, J.A. and Nogales, E. (2005) Structural roles for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis. Science, 310, 1513-1515.

48. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S. and Schmitt, E. (2007) Structure of an archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP and the GDP states. Proc Natl Acad Sci USA, 104, 18445-18450.

49. Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O. and Klaholz, B.P. (2008) Structure of the 30S translation initiation complex. Nature, 455, 416-420.

50. Allen, G.S., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M. and Frank, J. (2005) The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell, 121, 703-712.

51. Lomakin, I.B., Kolupaeva, V.G., Marintchev, A., Wagner, G. and Pestova, T.V. (2003) Position of eukaryotic initiation factor elFl on the 40S ribosomal subunit determined by directed hydroxyl radical probing. Genes Dev, 17, 2786-2797.

52. Nielsen, K.H., Behrens, M.A., He, Y., Oliveira, C.L., Jensen, L.S., Hoffmann, S.V., Pedersen, J.S. and Andersen, G.R. (2011) Synergistic activation of eIF4A by eIF4B and eIF4G. Nucleic Acids Res, 39, 2678-2689.

53. Rozovsky, N., Butterworth, A.C. and Moore, M.J. (2008) Interactions between eIF4AI and its accessory factors eIF4B and eIF4H. RNA, 14, 2136-2148.

54. Gross, J.D., Moerke, N.J., von der Haar, T., Lugovskoy, A.A., Sachs, A.B., McCarthy, J.E. and Wagner, G. (2003) Ribosome loading onto the mRNA cap is driven by conformational coupling between eIF4G and eIF4E. Cell, 115, 739-750.

55. Volpon, L., Osborne, M.J., Topisirovic, I., Siddiqui, N. and Borden, K.L. (2006) Cap-free structure of eIF4E suggests a basis for conformational regulation by its ligands. EMBOJ, 25, 5138-5149.

56. Rogers, G.W., Jr., Richter, N.J., Lima, W.F. and Merrick, W.C. (2001) Modulation of the helicase activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. J Biol Chem, 276, 30914-30922.

57. Neff, C.L. and Sachs, A.B. (1999) Eukaryotic translation initiation factors 4G and 4A from Saccharomyces cerevisiae interact physically and functionally. Mol Cell Biol, 19, 5557-5564.

58. LeFebvre, A.K., Korneeva, N.L., Trutschl, M., Cvek, U., Duzan, R.D., Bradley, C.A., I-Iershey, J.W. and Rhoads, R.E. (2006) Translation initiation factor eIF4G-l binds to eIF3 through the eIF3e subunit. J Biol Chem, 281, 22917-22932.

59. Shirokikh, N.E. and Spirin, A.S. (2008) Poly(A) leader of eukaryotic mRNA bypasses the dependence of translation on initiation factors. Proc Natl Acad Sci USA, 105, 10738-10743.

60. Pisarev, A.V., Kolupaeva, Y.G., Yusupov, M.M., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2008) Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes. EMBO J, 27, 1609-1621.

61. Jackson, R.J. (1991) The ATP requirement for initiation of eukaryotic translation varies according to the mRNA species. Eur JBiochem, 200, 285-294.

62. Spirin, A.S. (2009) How does a scanning ribosomal particle move along the 5'-untranslated region of eukaryotic mRNA? Brownian Ratchet model. Biochemistry, 48, 10688-10692.

63. Feynman, R., Leighton, R. and Sands, M. (1963) The Feynman Lectures on Physics. Addison-Wesley Publishing Company, Reading, MA.

64. Pisareva, V.P., Pisarev, A.V., Komar, A.A., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2008) Translation initiation on mammalian mRNAs with structured 5'UTRs requires DExH-box protein DHX29. Cell, 135, 1237-1250.

65. Matsuda, D. and Dreher, T.W. (2006) Close spacing of AUG initiation codons confers dicistronic character on a eukaiyotic mRNA. RNA, 12, 1338-1349.

66. Marsden, S., Nardelli, M., Linder, P. and McCarthy, J.E. (2006) Unwinding single RNA molecules using helicases involved in eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 361, 327-335.

67. Tarn, W.Y. and Chang, T.H. (2009) The current understanding of Dedlp/DDX3 homologs from yeast to human. RNA Biol, 6, 17-20.

68. Abaeva, I.S., Marintchev, A., Pisareva, V.P., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2011) Bypassing of stems versus linear base-by-base inspection of mammalian mRNAs during ribosomal scanning. EMBOJ, 30, 115-129.

69. Pestova, T.V., Borukhov, S.I. and Hellen, C.U. (1998) Eukaiyotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature, 394, 854-859.

70. Yoon, H.J. and Donahue, T.F. (1992) The suil suppressor locus in Saccharomyces cerevisiae encodes a translation factor that functions during tRNA(iMet) recognition of the start codon. Mol Cell Biol, 12, 248-260.

71. Maag, D., Algire, M.A. and Lorsch, J.R. (2006) Communication between eukaryotic translation initiation factors 5 and 1A within the ribosomal pre-initiation complex plays a role in start site selection. J Mol Biol, 356, 724-737.

72. Maag, D., Fekete, C.A., Gryczynski, Z. and Lorsch, J.R. (2005) A conformational change in the eukaryotic translation preinitiation complex and release of elFl signal recognition of the start codon. Mol Cell, 17, 265-275.

73. Paulin, F.E., Campbell, L.E., O'Brien, K., Loughlin, J. and Proud, C.G. (2001) Eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr Biol, 11, 55-59.

74. Marintchev, A. and Wagner, G. (2004) Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q Rev Biophys, 37, 197-284.

75. Algire, M.A., Maag, D. and Lorsch, J.R. (2005) Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Mol Cell, 20, 251-262.

76. Kolitz, S.E., Takacs, J.E. and Lorsch, J.R. (2009) Kinetic and thermodynamic analysis of the role of start codon/anticodon base pairing during eukaryotic translation initiation. RNA, 15, 138-152.

77. Nanda, J.S., Cheung, Y.N., Takacs, J.E., Martin-Marcos, P., Saini, A.K., Hinnebusch, A.G. and Lorsch, J.R. (2009) elFl controls multiple steps in start codon recognition during eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 394, 268-285.

78. Conte, M.R., Kelly, G., Babon, J., Sanfelice, D., Youell, J., Smerdon, S.J. and Proud, C.G. (2006) Structure of the eukaryotic initiation factor (elF) 5 reveals a fold common to several translation factors. Biochemistry, 45, 4550-4558.

79. Fletcher, C.M., Pestova, T.V., Hellen, C.U. and Wagner, G. (1999) Structure and interactions of the translation initiation factor elFl. EMBOJ, 18, 2631-2637.

80. Kapp, L.D. and Lorsch, J.R. (2004) GTP-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor eIF2. J Mol Biol, 335, 923-936.

81. Pestova, T.V., Lomakin, I.B., Lee, J.H., Choi, S.K., Dever, T.E. and Hellen, C.U. (2000) The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature, 403, 332-335.

82. Unbehaun, A., Marintchev, A., Lomakin, I.B., Didenko, T., Wagner, G., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2007) Position of eukaryotic initiation factor eIF5B on the 80S ribosome mapped by directed hydroxyl radical probing. EMBO J, 26, 31093123.

83. Olsen, D.S., Savner, E.M., Mathew, A., Zhang, F., Krishnamoorthy, T., Phan, L. and Hinnebusch, A.G. (2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBOJ, 22, 193-204.

84. Marintchev, A., Kolupaeva, V.G., Pestova, T.V. and Wagner, G. (2003) Mapping the binding interface between human eukaryotic initiation factors 1A and 5B: a new interaction between old partners. Proc Natl Acad Sei USA, 100, 1535-1540.

85. Acker, M.G., Shin, B.S., Dever, T.E. and Lorsch, J.R. (2006) Interaction between eukaryotic initiation factors 1A and 5B is required for efficient ribosomal subunit joining. J Biol Chem, 281, 8469-8475.

86. Acker, M.G., Shin, B.S., Nanda, J.S., Saini, A.K., Dever, T.E. and Lorsch, J.R. (2009) Kinetic analysis of late steps of eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 385, 491-506.

87. Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1988) Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, 334, 320-325.

88. Hellen, C.U. and Sarnow, P. (2001) Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev, 15, 1593-1612.

89. Jackson, R.J., Howell, M.T. and Kaminski, A. (1990) The novel mechanism of initiation of Picornavirus RNA translation. Trends Biochem Sei, 15, 477-483.

90. Hellen, C.U., Pestova, T.V. and Wimmer, E. (1994) Effect of mutations downstream of the internal ribosome entry site on initiation of poliovirus protein synthesis. J Virol, 68, 6312-6322.

91. Kaminski, A., Howell, M.T. and Jackson, R.J. (1990) Initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation: the authentic initiation site is not selected by a scanning mechanism. EMBOJ, 9, 3753-3759.

92. Pestova, T.V., Hellen, C.U. and Shatsky, I.N. (1996) Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Mol Cell Biol, 16, 6859-6869.

93. Jackson, R.J. (2005) Alternative mechanisms of initiating translation of mammalian mRNAs. Biochem Soc Trans, 33, 1231-1241.

94. Sasaki, J. and Nakashima, N. (1999) Translation initiation at the CUU codon is mediated by the internal ribosome entry site of an insect picorna-like virus in vitro. J Virol, 73, 1219-1226.

95. Pestova, T.V. and Hellen, C.U. (2003) Translation elongation after assembly of ribosomes on the Cricket paralysis virus internal ribosomal entry site without initiation factors or initiator tRNA. Genes Dev, 17, 181-186.

96. Hershey, J.W. (1991) Translational control in mammalian cells. Annu Rev Biochem, 60, 717-755.

97. Berlanga, J. J., Santoyo, J. and De Haro, C. (1999) Characterization of a mammalian homolog of the GCN2 eukaryotic initiation factor 2 alpha kinase. Eur J Biochem, 265, 754-762.

98. Morley, S.J. and Traugh, J.A. (1990) Differential stimulation of phosphorylation of initiation factors eIF-4F, eIF-4B, eIF-3, and ribosomal protein S6 by insulin and phorbol esters. J Biol Chem, 265, 10611-10616.

99. Tuazon, P.T., Merrick, W.C. and Traugh, J.A. (1989) Comparative analysis of phosphorylation of translational initiation and elongation factors by seven protein kinases. J Biol Chem, 264, 2773-2777.

100. Cohen, P. (1985) The coordinated control of metabolic pathways by broad-specificity protein kinases and phosphatases. Curr Top Cell Regul, 27, 23-37.

101. Lachance, P.E., Miron, M., Raught, B., Sonenberg, N. and Lasko, P. (2002) Phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 4E is critical for growth. Mol Cell Biol, 22, 1656-1663.

102. Raught, B., Gingras, A.C., Gygi, S.P., Imataka, H., Morino, S., Gradi, A., Aebersold, R. and Sonenberg, N. (2000) Serum-stimulated, rapamycin-sensitive phosphorylation sites in the eukaryotic translation initiation factor 4GI. EMBOJ, 19, 434-444.

103. Bolster, D.R., Vary, T.C., Kimball, S.R. and Jefferson, L.S. (2004) Leucine regulates translation initiation in rat skeletal muscle via enhanced eIF4G phosphorylation. JNutr, 134, 1704-1710.

104. Duncan, R., Milburn, S.C. and Hershey, J.W. (1987) Regulated phosphorylation and low abundance of HeLa cell initiation factor eIF-4F suggest a role in translational control. Heat shock effects on eIF-4F. J Biol Chem, 262, 380-388.

105. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A. and Sonenberg, N. (1995) Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E .EMBOJ, 14, 5701-5709.

106. Pause, A., Belsham, G.J., Gingras, A.C., Donzc, O., Lin, T.A., Lawrence, J.C., Jr. and Sonenberg, N. (1994) Insulin-dependent stimulation of protein synthesis by phosphorylation of a regulator of 5'-cap function. Nature, 371, 762-767.

107. Stebbins-Boaz, B., Cao, Q., de Moor, C.H., Mendez, R. and Richter, J.D. (1999) Maskin is a CPEB-associated factor that transiently interacts with elF-4E. Mol Cell, 4, 1017-1027.

108. Gebauer, F. and Flentze, M.W. (2004) Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 827-835.

109. Muckenthaler, M., Gray, N.K. and Hentze, M.W. (1998) IRP-1 binding to ferritin mRNA prevents the recruitment of the small ribosomal subunit by the cap-bindingcomplex eIF4F. Mol Cell, 2,383-388.

110. Hamilton, T.L., Stoneley, M., Spriggs, K.A. and Bushell, M. (2006) TOPs and their regulation. Biochem Soc Trans, 34, 12-16.

111. Kleene, K.C. (1989) Poly(A) shortening accompanies the activation of translation of five mRNAs during spermiogenesis in the mouse. Development, 106, 367-373.

112. Sonenberg, N. and Hinnebusch, A.G. (2009) Regulation of translation initiation in eukaiyotes: mechanisms and biological targets. Cell, 136, 731-745.

113. Minshall, N., Reiter, M.IL, Weil, D. and Standart, N. (2007) CPEB interacts with an ovary-specific eIF4E and 4E-T in early Xenopus oocytes. J Biol Chem, 282, 3738937401.

114. Villaescusa, J.C., Buratti, C., Penkov, D., Mathiasen, L., Planaguma, J., Ferretti, E. and Blasi, F. (2009) Cytoplasmic Prepl interacts with 4EHP inhibiting Hoxb4 translation. PLoS One, 4, e5213.

115. Chekulaeva, M., Hentze, M.W. and Ephrussi, A. (2006) Bruno acts as a dual repressor of oskar translation, promoting mRNA oligomerization and formation of silencing particles. Cell, 124, 521-533.

116. Minshall, N. and Standart, N. (2004) The active form of Xp54 RNA helicase in translational repression is an RNA-mediated oligomer. Nucleic Acids Res, 32, 13251334.

117. Tanaka, K.J., Ogawa, K., Takagi, M., Imamoto, N., Matsumoto, K. and Tsujimoto, M. (2006) RAP55, a cytoplasmic mRNP component, represses translation in Xenopus oocytes. J Biol Chem, 281, 40096-40106.

118. Coller, J. and Parker, R. (2005) General translational repression by activators of mRNA decapping. Cell, 122, 875-886.

119. Huttelmaier, S., Zenklusen, D., Lederer, M., Dictenberg, J., Lorenz, M., Meng, X., Bassell, G.J., Condeelis, J. and Singer, R.H. (2005) Spatial regulation of beta-actin translation by Src-dependent phosphorylation ofZBPl. Nature, 438, 512-515.

120. Johnstone, O. and Lasko, P. (2004) Interaction with eIF5B is essential for Vasa function during development. Development, 131, 4167-4178.

121. Kahvejian, A., Svitkin, Y.V., Sukarieh, R., M'Boutchou, M.N. and Sonenberg, N. (2005) Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms. Genes Dev, 19, 104-113.

122. Sachs, A.B. and Davis, R;W. (1989) The poly(A) binding protein is required for poly(A) shortening and 60S ribosomal subunit-dependent translation initiation. Cell, 58, 857-867.

123. Proweller, A. and Butler, J.S. (1997) Ribosome concentration contributes to discrimination against poly(A)-mRNA during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 272, 6004-6010.

124. Tarun, S.Z., Jr. and Sachs, A.B. (1996) Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G. EMBOJ, 15, 7168-7177.

125. Gallie, D.R. (1991) The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency. Genes Dev, 5, 2108-2116.

126. Jacobson, A. (1996) Poly(A) metabolism and translation: The closed-loop model. In Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N. (eds.), Translational Control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 451-480.

127. Wells, S.E., Hillner, P.E., Vale, R.D. and Sachs, A.B. (1998) Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol Cell, 2, 135-140.

128. Shelton, E. and Kuff, E.L. (1966) Substructure and configuration of ribosomes isolated from mammalian cells. J Mol Biol, 22, 23-31.

129. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K. and Miura, K. (1997) Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J Electron Microsc (Tokyo), 46, 503-506.

130. Christensen, A.K. and Bourne, C.M. (1999) Shape of large bound polysomes in cultured fibroblasts and thyroid epithelial cells. AnatRec, 255, 116-129.

131. Philipps, G.R. (1965) Haemoglobin synthesis and polysomes in intact reticulocytes. Nature, 205, 567-570.

132. Baglioni, C., Vesco, C. and Jacobs-Lorena, M. (1969) The role of ribosomal subunits in mammalian cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 34, 555-565.

133. Gray, N.K., Coller, J.M., Dickson, K.S. and Wickens, M. (2000) Multiple portions of poly(A)-binding protein stimulate translation in vivo. EMBO J, 19,4723-4733.

134. Cakmakci, N.G., Lerner, R.S., Wagner, E.J., Zheng, L. and Marzluff, W.F. (2008) SLIP1, a factor required for activation of histone mRNA translation by the stem-loop binding protein. Mol Cell Biol, 28, 1182-1194.

135. Caponigro, G. and Parker, R. (1995) Multiple functions for the poly(A)-binding protein in mRNA decapping and deadenylation in yeast. Genes Dev, 9, 2421-2432.

136. Copeland, P.R. and Wormington, M. (2001) The mechanism and regulation of deadenylation: identification and characterization of Xenopus PARN. RNA, 1, 875886.

137. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 281-297.

138. Macrae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.Z., Adams, P.D. and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science, 311, 195-198.

139. Gregoiy, R.I., Chendrimada, T.P., Cooch, N. and Shiekhattar, R. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell, 123, 631-640.

140. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M. and Benning, C. (1998) AGOl defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J, 17, 170-180.

141. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P. and Bartel, D.P. (2004) The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev, 18, 1187-1197.

142. Pillai, R.S., Bhattacharyya, S.N. and Filipowicz, W. (2007) Repression of protein synthesis by miRNAs: how many mechanisms? Trends Cell Biol, 17, 118-126.

143. Richter, J.D. (2008) Think you know how miRNAs work? Think again. Nat Struct MolBiol, 15, 334-336.

144. Pillai, R.S., Bhattacharyya, S.N., Artus, C.G., Zoller, T„ Cougot, N., Basyuk, E., Bertrand, E. and Filipowicz, W. (2005) Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science, 309, 1573-1576.

145. Eulalio, A., Huntzinger, E. and Izaurralde, E. (2008) GW182 interaction with Argonaute is essential for miRNA-mediated translational repression and mRNA decay. Nat Struct Mol Biol, 15, 346-353.

146. Chendrimada, T.P., Finn, K.J., Ji, X., Baillat, D., Gregory, R.I., Liebhaber, S.A., Pasquinelli, A.E. and Shiekhattar, R. (2007) MicroRNA silencing through RISC recruitment of eIF6. Nature, 447, 823-828.

147. Eulalio, A., Tritschler, F. and Izaurralde, E. (2009) The GW182 protein family in animal cells: new insights into domains required for miRNA-mediated gene silencing. RNA, 15, 1433-1442.

148. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Doerks, T., Stark, A., Bork, P. and Izaurralde, E. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev, 20, 1885-1898.

149. Nottrott, S., Simard, M.J. and Richter, J.D. (2006) Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nat Struct Mol Biol, 13, 1108-1114.

150. Vasudevan, S., Tong, Y. and Steitz, J.A. (2007) Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science, 318, 1931-1934.

151. Evstafieva, A.G., Ugarova, T.Y., Chernov, B.K. and Shatsky, I.N. (1991) A complex RNA sequence determines the internal initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation. Nucleic Acids Res, 19, 665-671.

152. Kolb, V.A., Makeyev, E.V. and Spirin, A.S. (2000) Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system. J Biol Chem, 275, 16597-16601.

153. Wakiyama, M., Futami, T. and Miura, K. (1997) Poly(A) dependent translation in rabbit reticulocyte lysate. Biochimie, 79, 781-785.

154. Zeyenko, V.V., Ryabova, L.A., Gallie, D.R. and Spirin, A.S. (1994) Enhancing effect of the 3-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA on protein synthesis in vitro. FEBS Lett, 354, 271-273.

155. Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V. (1994) In vitro transcription: preparative RNA yields in analytical scale reactions. Anal Biochem, 220,420-423.

156. Gurevich, V.V., Pokrovskaya, I.D., Obukhova; T.A. and Zozulya, S.A. (1991) Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. Anal Biochem, 195, 207-213.

157. Erickson, A.H. and Blobel, G. (1983) Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods Enzymol, 96, 38-50.

158. Sorensen, M.A. and Pedersen, S. (1998) Determination of the peptide elongation rate in vivo. In Martin, R. (ed.), Protein Synthesis, Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 129-142.

159. Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 166, 368-379.

160. Kolb, V.A., Makeyev, E.V. and Spirin, A.S. (1994) Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. EMBOJ, 13, 3631-3637.

161. Cahn, F. and Lubin, M. (1978) Inhibition of elongation steps of protein synthesis at reduced potassium concentrations in reticulocytes and reticulocyte lysate. J Biol Chem, 253, 7798-7803.

162. Spirin, A.S. and Ryazanov, A.G. (1991) Regulation of elongation rate. In Trachsel, H. (ed.), Translation in Eukaryotes. CRC Press, Roca Raton, FL, pp. 325-350.

163. Hunt, T. (1974) The control of globin synthesis in rabbit reticulocytes. Ann N Y AcadSci, 241, 223-231.

164. Kopeina, G.S., Afonina, Z.A., Gromova, K.V., Shirokov, V.A., Vasiliev, V.D. and Spirin, A.S. (2008) Step-wise formation of eukaiyotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA. Nucleic Acids Res, 36, 2476-2488.

165. Gallie, D.R. (2002) The 5'-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F. Nucleic Acids Res, 30, 3401-3411.

166. Gallie, D.R. and Tanguay, R. (1994) Poly (A) binds to initiation factors and increases cap-dependent translation in vitro. J Biol Chem, 269, 17166-17173.

167. Matveev, S.V., Illarionov, B.A., Vysotski, E.S., Bondar, V.S., Markova, S.V. and Alakhov, Y.B. (1995) Obelin mRNA a new tool for studies of translation in cellfree systems. Anal Bio chem, 231, 34-39.

168. Matthews, J.C., Hori, K. and Cormier, MJ. (1977) Purification and properties of Renilla reniformis luciferase. Biochemistry, 16, 85-91.

169. Conti, E., Lloyd, L.F., Akins, J., Franks, N.P. and Brick, P. (1996) Ciystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr D Biol Oystallogr, 52, 876-878.

170. Kajiyama, N. and Nakano, E. (1993) Thermostabilization of firefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. Biochemistry, 32, 13795-13799.

171. Kozak, M. (1980) Role of ATP in binding and migration of 40S ribosomal subunits. Cell, 22, 459-467.

172. Sarabhai, A. and Brenner, S. (1967) A mutant which reinitiates the polypeptide chain after chain termination. JMol Biol, 27, 145-162.

173. Adhin, M.R. and van Duin, J. (1990) Scanning model for translational reinitiation in eubacteria. JMol Biol, 213, 811-818.

174. Alekhina, O.M., Vassilenko, K.S. and Spirin, A.S. (2007) Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell-free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation. Nucleic Acids Res, 35, 6547-6559.

175. Cordova, N.J., Ermentrout, B. and^Oster, G.F. (1992) Dynamics of single-motor molecules: the thermal ratchet model. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 339-343.

176. Gelles, J. and Landick, R. (1998) RNA polymerase as a molecular motor. Cell, 93, 13-16.

177. Yanagida, T., Ueda, M., Murata, T., Esaki, S. and Ishii, Y. (2007) Brownian motion, fluctuation and life. Biosysterns, 88, 228-242.

178. Spirin, A.S. (2002) Ribosome as a molecular machine. FEBSLett, 514, 2-10.

179. Spirin, A.S. (2004) The ribosome as an RNA-based molecular machine. RNA Biol, I, 3-9.

180. Spirin, A.S. (2009) The ribosome as a conveying thermal ratchet machine. J Biol Chem, 284,21103-21119.

181. Nishiyama, M., Higuchi, H., Ishii, Y., Taniguchi, Y. and Yanagida, T. (2003) Single molecule processes on the stepwise movement of ATP-driven molecular motors. Biosystems, 71, 145-156.

182. Kitamura, K. and Yanagida, T. (2003) Stochastic properties of actomyosin motor. Biosystems, 71, 101-110.

183. Tarun, S.Z., Jr. and Sachs, A.B. (1995) A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes Dev, 9, 2997-3007.

184. Munroe, D. and Jacobson, A. (1990) mRNA poly(A) tail, a 3' enhancer of translational initiation. Mol Cell Biol, 10, 3441-3455.

185. Jackson, R.J., Hunt, S.L., Reynolds, J.E. and Kaminski, A. (1995) Cap-dependent and cap-independent translation: operational distinctions and mechanistic interpretations. Curr Top Microbiol Immunol, 203, 1-29.

186. Adamson, S.D., Howard, G.A. and Herbert, E. (1969) The ribosome cycle in a reconstituted cell-free system from reticulocytes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 34, 547-554.

187. Preiss, T. and Hentze, M.W. (1999) From factors to mechanisms: translation and translational control in eukaryotes. Curr Opin Genet Dev, 9, 515-521.

188. Madin, K., Sawasaki, T., Kamura, N., Takai, K., Ogasawara, T., Yazaki, K., Takei, T., Miura, K. and Endo, Y. (2004) Formation of circular polyribosomes in wheat germ cell-free protein synthesis system. FEBS Lett, 562, 155-159.

189. Spirin, A.S. (1969) The second Sir Hans Krebs Lecture. Informosomes. Eur J Biochem, 10, 20-35.

190. Skabkin, M.A., Kiselyova, O.I., Chernov, K.G., Sorokin, A.V., Dubrovin, E.V., Yaminsky, I.V., Yasiliev, V.D. and Ovchinnikov, L.P. (2004) Structuralorganization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1. Nucleic Acids Res, 32, 5621-5635.

191. Еще хочется поблагодарить свою семью родителей, мужа и дочку - за выдающееся терпение и всяческую поддержку в процессе написания и подготовки защиты диссертации.

Информация о работе

Алехина, Ольга Михайловна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы