Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛОЧНОЙ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ И РАЗРАБОТКА ФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ АНОРМАЛЬНОГО МОЛОКА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛОЧНОЙ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ И РАЗРАБОТКА ФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ АНОРМАЛЬНОГО МОЛОКА"

V * МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО

СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи ■ Ф Для служебного пользования

' Экз. № Г ',

— ... 1о о

ЛЕБЕДЕВ Александр Борисович

УДК 577.157.087.5:637.12.04/.07

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛОЧНОЙ ЛИПОПРОТЕИДЛИЛАЗЫ И РАЗРАБОТКА ФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ АНОРМАЛЬНОГО МОЛОКА

специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

>

Москва — 1985

Работа выполнена во Всесоюзном и а у ч н о -и сследо в а тел ьс к о М институте маслодельной и сыродельной промышленности НПО «Углич».

Научный руководитель:

кандидат технических наук, старший научны» сотрудник ЛЛ. С. У м а н с к и н.

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор М. П. Попов,

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Г. Б, Браво в а.

Ведущее предприятие — Ярославское производственное объединение молочной промышленности.

заседании специализир' рдея а Тру-

дового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности, шифр К 063,51.06.

Ваш отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направить в специализированный совет института по адресу: 125080, г, Москва, Волоколамское шоссе, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан -г 1986 Г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук, доцент Н. В. 3 о т ч и к.

Защита состоится

. - І -

ДАТТальяость темы. Выполнение задач во увеличению производства молочных продуктов/ изложенных в Продовольственной программе СССР, во многом определяется успешным решением пройдеш сохранения исходных Зиэлко-химических и органолеитических свойств молока. К широко распространенным порокам молока относится лшгалити-ческая прогорклость, возникающая как следствие -гидролиза молочного жира липопротеиджипазой /ЛИЛ//КФ 3.1.1.34/ - ферментом, оцреде-ляишм процесс липолнза в иолоке. Однако до' настоящего времени практически отсутствуют сведения о влиянии технологических факторов первичной переработки молока на активность ШЯ и ее специфичности по отношении к молочному жару. Установление указанных закономерностей может явиться основой для направленного управлення качеством молока в части предотвращения пороков, связанных с гидролизом молочного хира*

Другая причина неудовлетворительного качества молока - повышенное содержание в нем соматических клеток вследствие нарушений процесса лактации в результате заболеваний животных маститом, приводящее к ухудшению технологических свойств молока. Существующие методы оценки количества соматических клеток не позволяют с необходимой точностью диагностировать анормальное молоко. Поэтому возникает необходимость в разработке более точных и надежных методов контроля качества молока, соответствующих.требованиям современного производства молочных продуктов.

Гидролиз лишенных эмульсий линопротешившазой является гетерогенной реакцией, где непосредственному каталитическому акту предшествует сорбция молекула фериента на поверхность раздела фаз масло/вода. Известно, что кинетика линолитяческиг реакций подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментеп, однако интерпретация водучае- , мых значений кинетических параметров весьма затруднена, так как • физический смысл . Нт и Кя щдцес-

кменн К, А. Тимирязева

ЦНЬ нменк Н.И. Железное* нау^ный лктературы

К?

----------1Г1

ауяный лктератуї

сов гидролиза лигшдов недостаточно определен. Открытии остается также ряд ьопросов иехаказда взаимодействия ЛИЛ с жировой глобулой субстрата и модификации активности фермента сывороткой крови я компонентами анормального молока, Исследование данных закономерностей представляет не только теоретический интерес ДЛЯ СОД80 полного понимания механизма гетерогенной реакгош расщепления ли-пидов молочной ЛИД« во я имеет практическое значение для установлены роли фермента в формировании качества молока.

Рабочая гяцоте?а. Низкий внкод и малая стабильность шсоко-очищенного препарата ШІД делает постановку эксперимента о ферментом весьма проблематичной, Однако в настоящее время является доказанным, что ШШ - единственный лшюлитическнй фермент вор-шального молока. Биохимическими л иммунологическими исследованиями установлено, что ранее обнаруживаемая в молоке молочная липа-; аа структурно я по своим свойствам полностью идентична ЛШ /Хой-ено и.,1973; Каотберг X.,1975; Дауш В.,1975; Олнвекрона Т.,1975, 1979/. Этот факт позволяет полагать, что полученные.кинетические характеристики для препарата ЛЕШ невисокої очистка но Байеру а І98велу^І970^) буду* принадлежать именно и только ЛИД.

Константа Михаэлиеа для гомогенних ферментативных реакций, хотя и не строго идентична И% , в раде случаев "" может ~ служить мерой сродства между ферментом в субстратом. Принимая во внимание схему лнполитичеокой реакции, предложенную Брокерхофоц/1978/

у * л

А/ £.} ^<рч /I/.

а также допуская, что отличия в скорости расщепления эмульсий различных лвпидов молочной ЖПЛ обусловлены только отличиями в скорости протекания каталитического акта гидролиза отдельной мо~ л в худи ацвлглиоерола на поверхности раздела, можно предположить, что для гетерогенного липолитического процесса является кон-

стантой диееокиаши фермента о поверхности лщшдяой глобулн, то есть passa . Дня' подтверждения данной концепции необходи-

мо исследование изменений основных кинетических характеристик ЛИЛ - Н„ èga„, в fan? различных липидшяс субстратов в за-

висимости от. физико-химических параметров реакционной среды /температура, jif, присутствие активаторов и ингибиторов/.

Известно« что активность некоторых ферментов является показателей для оценки качества молока. Участие ЛИЛ в биосинтезе молочного жира, а также глубокие изменения лщшдяого состава-молока при заболевании животных маститом являются предпосылкой для установление ; взаимосвязи мевду активность» феріента в количеством соматических клеток в молоке с целью разработки ферментного метода диагностикианормального молока. -

■ Пель и задачи исследования. Целы» настоящей работы являлось определение характера изменений и значения кинетических характе- -ристикмолочной липопротеидлипазы как: фермента, ответотвенного за лшкдагеическкв процессы в молоке, и разработка ферментного метода определения количества соматических клеток. - -

. Для достижения поставленной цели ставились оледущие задачи:

- исследовать кинетические закоиомервоста действия ЛИЛ молока на эмульсии различных лилидцшх субстратов; : .

- изучить температурную и рй-зашсимостя действия ЛЕШ;

- определить специфичность ЛПЛ по отношению к молочному жиру;

- изучить влияние основных технологических факторов первичной де, ре работки молола на активность ЯПЯ и ее вклад в процесс липолдэа;

- исследовать возможность определения количества соматических клеток в молоке по активности ЛИЛ. '■ ■ .

ручная нова?рз. В результате исследования кинетики гидролиза эмульсий лшщдвых субстратов молочной ЛИЛ показано, что константа Михаэлиса соответствует константе диссоциации фермента с

поверхности раздала фаз. Установлено, что гидролиз высоко- и низ-яомолекулярных субстратов-протекает в одном к том ле активном центре ШЛ. В реакции гидролиза липидных эмульсий принимают участие каталитически важные ионогенные и </. -аминогруппы. Доказано, что субстрат и активирующие компоненты сыворотки крови вза-имодействута независимо с различными участками молекулы ЛИ. Ик-гийирование фермента хлоридом натрия имеет обратимый характер, при ртом ингибитор блокирует поверхность раздела фаз, препятствуя адсорбции ДПЛ на поверхность лтшдяой капли.

Установлено.что ЛИЛ спешфгчна к первичным эфирным связям ахщлгллперолов и гидролизует молочный жир с преимущественный накоплением тарных кислот, участвующих в образовании органолепти-ческлх пороков молока. Ыа активность фермента и степень липолиза молока наибольшее влияние оказывает массовая доля жара в молоке, далее вдут время резервирования молока, температура и концентрация хлорида калышя. Определено, что активность ЛВД уменьшается в обратно пропорцаопальной зависимости о ..увеличением содержания соматических клеток в молоке. На основании полученных результатов ■ разработан метод диагностики анормального молока по активности ЛПЛ. Научная новизна работы подтверждена авторским свидетельством № 1010946 "Способ определения количества соматических клеток в молоке".

Поэтическая пекнг^.ть работ«. Предложенный метод определения содержания соматических клеток в молоке по активности ЛИЛ рекомендуется для использования в производственных лабораториях предприятие молочной промышленности и сельского хозяйства, Ферментный метод до точности в 2-3 раза превышает метод по действующему. ГОСТ 23453-79. Ожидаемый экономический эффект от внедрения предложенного метода составит 13,84 руб на I тонну сыра.

, • Результаты работы частично доложены аа XXI Международном молочном коагрессе /Москве.,1982/. Диссертация в-делом доложена, обсуждена и одобрена на заседании' секшш Ученого совета ШЙИМС Ш0"УГЛIГЇ,, во $жзико-хииичоской биологии и биотехнологии.

Птблд-кашя. По матариадал диссертанта опубликовало 5 статей я I авторское свидетельство.

Объды ттаботн. Диссертаций состоят аз введения, обзора литератур«, 8 глав, выводов, ига ска использованной литература, вкшча-юцего 176 литературных источников, и Б приложений. Основное содержание работы изложено на 114 страницах машинописного текста, вшютая 13 таблиц и 23 рисунка.

\ : СОДЕРЕАШБ РАБОТЫ

Бо введения обоснованы актуальность теш г направление исследований - изучение кинетических закономерностей действия молочной 'лмяопротеидошнязы на лншодше субстраты г установление взаимосвязи «евду-,активностью фермента и количеством соматических клеток с целью разработки метода диагностики анормального молока. Кратко изложены положения, определяющие новизну работы, и положения, выносимые на защиту,- соответствие, константы Михаэлиса для гетерогенной реаюши гидролиза фертентом липаднш:. адульснй константе дис сони алии ферлента о повероюсти раздела фаз; гидролиз ферментом молочного жира протекает е накоплением свободных жирных кислот, обуславливающее возникновение органолептических воромов молока; возможность использования активности ЛШ дія определения количества соматических клеток в молока. Согласно выбранному направлению исследований проведен анализ ллтерзтурыых'данных, касающихся физико-Хкмнческих свойств молочной ДШ, взаимосвязи, активности ЛПЛ и качества молока, характеристики технологически анормального wo-

дока и пето сов его диагностики. Сфорлула ро валы цель и задачи исследования.

Общая методика исследования

1.Ввдвлекие молочной ЛПК - до методу Байера я Хе&вела /1970/ . из цельного непастеризованного молока, соответствующего ГОСТ 13204-70. Удельная активность препарата составляла 0,68 нкат-мг белка с использованием в качестве субстрата оливкового масла.

2.Субстраты - трибутирилглицерол »молочный жир, оливковое маоло.

3.Дктивность ЛИЛ - на реакционной среде, содержащей 0,6 ид -IQÍ-ноЙ литцшой эмульсии, 0,16 ил 3£-ной лиоЗялиьированноЙ говя-

жей сыворотки крови, 0,16 мл 0,ал трис-HCI буфера.рН 8,65, 0,08 мл ХМ СаС12 и I мл препарата фермента. Свободные жирнне кислоты экст pampo вали по Доулу /1956/ в определяли тптриметричаски раствором КОИ в этаноле.

■4,Кинетический анадаз - методами стационарной кинетики.

5 ,Жи рнокислотная специфичность - газохроматограЗическим раэде-л в шеи свободных жирата кислот в виде метиловых вфпров на хроматографе "Хром-4".

6.Лшпдаше компоненты - методом тонкослойной хроматографии на силикагеле /Кейтс,1975/.

7.Количество соматических клеток в молоке - согласно ГОСТ 23453-79 я методом Пресхоттаг-Брида.

в.Ыатемагическая обработка результатов - на программируемом, калькуляторе "Тек-Э1"/СШ/ с использованием стандартных программ. Кинетические:закономерности гидролиза лилопротеаддипаэой

эмульсий лепидных субстратов На рис Л представлен гранях двойных обратных величин для -гидролиза ЛОЛ молока высокомолекулярного субстрата - оливкового масла, низкоиолекудяршго - трябутирялглнцерояа, и ыолотаого жара^ состав которого входят и высоко- и яиэкомолекуляркые ашиг-

в

, , 2 . -1 //s «чо , ка* мг

ряс. lv Графив Лайнтжвера-Бэрка для гидролиза ыолочяои ШЩ выульсяв ояявяозого ыасха/а/, и блочного mpa/ö/, тряоу тири-глицарола/*/ х сиесаввои емульела - ошвкоаое иаею: тряоутгрнлглвцеро* - i

рхо.г.Влвякае на актавиость

ЛИЛ снворогы кїовж/о - 2,6 иг/ил/ л хлорида ватрия/в -0,Ш + 2,6 иг/ыл сывороткш/. а - вормальяая реакция.

12 3

с кверотка, кт/ы я

Р «о.''3. Граф л к Диксояа для акт«-вацжя ЛПД сывороткой кровх. ковцеятрацвя- оивкоеого квела, иг/ил: а-ЗО, 6-Є0, в-іго.

ряс. 4.' рЯ-заввсвиость параметра y¡»/Hm рвакк«и гвдроліза , .. виульсяи оіїбхового нас«а

холочко а ляп."

глняероиш. Федоєят гидролизует оливковое масло, молочный жир и трибутирилглицерол с практически рдяными значениями Нт .составляющими 66,7±7,2; 69Д±4,В и 71,4^3,4 мг эмульгированного лидада в I мл реакционной среды соответственно. Vm соответственно равна . 0,54*0,02 -ІО-9, 2,04*0,01 -Ю-9 и 5,91*0,02 «Ю-9 Ы.оек"1 .Близкие значения величин Нт я широкая, примерно десятикратная, вариация свидэтельствует о том, что А"« в ут полностью; разделены и отражают два независимых, не связанных меаду собою процесса; изменение реакционной сиособности фермента в ряду различных субстратов обусловлено факторами, не зависящими от сорбционного взаимодействия фермента о субстратами /Березин И.В.,1979/. "

Полученные даяние позволяют иятертретировать Н^ sas коастан-ту диссоциации фермента с поверхности раздела фаз« на которую не . о называют влияние молекулярная масса, длина цени s степень насыщенности остатков жирных кислот, входящих в состав ацилглице ролов* Этот вывод подтверждает характер гидролиза ферментом сметанной емульсин, состоящей из эмульсий конкурирующих субстратов - оливкового масла и т ра бутирилглицерола /рас.1/, свидетельствуиций о неупорядоченном механизме взаимодействия ЖИ с липидкыми глобулами, что предполагают равенство констант дассодаагош комплекса фераелта с эмульгированными лклидами. Блокирование поверхности лишшшх глобул ионами натри и хлора и, следовательно,уменьшение возможности для взаимодействия фермента с поверхне тью субстрата приводит к увеличению Нт ,что является очередным доказательством соответствия константы Михаэлиса отношегат /рис.2 »схема I/.

Активация нЙПЛ сывороткой крови относится к чисто неконкурентному типу /рис.2/. Согласно этим данным- и принимая во внимание концепцию о идентичности Н„ и константы диссоциации фермента с поверхности раздела фаз, сыворотка крови не оказывает никакого влияния на процесс адсорбции фермента на поверхность лшгадной кап-

ли.Неконкуре нтный тип активации предполагает связывание субстрата и компонентов сыворотки крови о различными участками молекулы ЛИД. Невозможность линеаризации значений начальной ^скорости гидролиза лшгадов при активации фермента сывороткой крош в координатах Диксона /рис.з/ свидетельствует о сильном сдшго равновесия в системе фермент-активазор в сторону образования комплекса между ними.

Из pH-зависимости параметра (^¡Кт активность ЛЯ регулируется ионогекннми группами с рК около 7,7 и 8,6 /рис.4/.Теплота ионизации первой группы равна 96 кДж/моль, второй группы -

. 24 яДя/моль .Исходя из значений рК ионогеппых групп и теплот их ионизации, принимающую участие в катализе функциональную группу с рК~7,7 можно иденти^яцаровать как «С-аминогруппу, группу с рК~8,6 - как сульфгидрильную группу /йерог Э.-, 1980/.

, ' Для выяснения роли SH-грушх в катализе проведены исследования по действия некоторых специфических реагентов-окислителей на активности ЛИЛ /рис.5/.Все реагенты уменьшает активность фермента, причем на графике наблвдается выход.кривых на плато с потерей 557055 активности ЛПЛ..Этот факт указывает на то,что сульфгадршгьаые группы входят в состав сорбвдошюго участка молекулы фермента, но не принимал непосредственное участие в каталитическом акте гидролиза ацилглицеролов /Торчлнский В.М.Д977/. Значения рК сульф-гидрильных групп белков в зависимости от их пространственного расположения в белковой глобуле варьируют в пределах, примерно, от 8 до 10, при атом группы, находящиеся в гидрофобном окружении внутри молекулы и не имеющие.контакта с растворителем, характеризуются более высокими значениями.{К /Горчинский В.И.,1977/.Сыворэтка крош вызывает смещение рК ионогеняшс групп, в кислую сторону, /рис,6/. Можно предположить» что сывороточные,компоненты облегчают ионизацию ионогешшх грушшрошк, изменяя конфорташш молекулы

- Ю -

ido

8 &

so

to 20 33 40 время, ыии

Ínc¿5.i2£?KTвводи ЛИЛ полок» ,ooai % ,рп «.в/о/; o,ooai

,pH i,&/»/•, o,su uto¡, pfi в,5/г/.'

a. ялтявячй ферыеят

РЯОЗб.ВлИЯИІв сивороткі крови на рН-зввиоииооть скорости гидролиза едг я» и и ojjib-ноэогонасда ШШ молока;! в » Oes выворотки крови б - а сиворотко» кров», б мг/мд

100 1« 260 -лЗ'.Дк/молв.К

рво.Т.'Иэокяяетячвскы за віст ость онтроші я аитальшії автивацяя Гідро нэп ляохдвнх віітяьсха ЛПЛ ^іояокд,Субстрат: г-о «вковов мело, £-моло«вна іхр, З-тряиїтяряя-гмцеро*.

і г з 4

соматические вдетвя,кіш/ил

Sic,<е.Зависвиость активності ПЛ от содарханля соматвчое-кях клоток в йолопе.

лпя.

Учитывая возможное участив ЛПЛ в формировании органолепги-ческнх пороков молока, исследована жиркокнслотная и позиционная СПеЦИфЯЧНОСТЬ фермента но отиошекию к аДЕЛГЛИЦерОЛШ молочного жира. Показано, что ЛПЛ гидролиаует все а^ирныо, связи, образованные остатками жиуашх ни слот с числом углеродных атомов от 8 до 20, причем наблпдаетея преимущественное накопление свободных паль--иитиновой, олеиновой, стеариновой, миристиновой и лаурнноьой кислот, что соответствует их повышенному содержанию в составе адал-гляцеролов молочного жира. Эти кислоты играют ведущую роль в образования прогорклого и "мыльного" вкуса молока и молочных продуктов.

Таблица I.

Изменение содержания лияидашс компонентов в молочном жире при действия ЛЕЯ молока

Длшадгые компоненты, мкг контроль опыт

мояоащлгдицеролы 1,8*0,2

1,2/2, ЗАдиацилглицеролы 4,ЗІР,2 5,5ір,3

X ,3-днщщлглицеролн 5,7іР,І 2,7*0,І

. свободные жирине кислоти б.Іір.О , ІЗ,0ір,І

триацилглице ролы 84,8^0,3 . ?5,4ір,5

При гидролизе молочного жира ЛПЛ молока наСлвдается уменьшение содержания триадалглшдеролов а увеличение содержания свободных жирных кислот /таблД/.Количество моноацялглицеролов щіакти-чески не изменяется. Повышение содэржашш 1,2/2,3/-лиашшміЩеро-дов и уменьшение содержания 1,3-диащилглпцвродов позволяет предположить,что ЛПЛ более специфична к первичнкы сложноз^іршої свя-. зям,та есть находящимся в полоханнях I и 3 молекулы ацилглицерола.

Широкая жнрнокисдотпая специфичность ЛІІЛ и еа способность

гидролиэовать эмульсии как низко-,так.и высокомолекулярных субстратов послужила основанием для выдвижения гипотезы о существовании в молекуле фермента нескольких активных центров с различным сродством к тем или иным субстратам /Фшщшг,1976/. При изучении зависимости ^матот температуры установлено, что для гидролиза ферментом эмульсий оливкового масла, молочного жира и трибутирил-глицерола между изменениями энтальпии и энтропии анривапии наблюдается линейная зависимость при переходе от субстрата к субстрату /рис.7/.Подобные зависимости имеют место в тех случаях, когда изменения в структуре реагентов, возникавшие при переходе от одной реакции к другой, не затрагивают их реакционные центры /Бхтен-фельд 1.А. ,1974/. Обнаруженный компенсационный эффект свидетельствует в пользу положения о гидролизе различных по молекулярной массе литщных субстратов в одном активном центре ЛПЛ. ° ■ *

Таким образом, на основании полученных результатов можно полагать, что Ит для гетерогенного гнлролиэа липопротеидпипазой эмульсий литшшх' субстратов, при анализе реакции,исходя из основного уравнения Михаэлиса-Ментен, соответствует константе диссоциации комплекса фермента о поверхностью раздела фаз. Действие на ферлент спеадфяческого активатора ЛПЛ - сыворотки крови — необратимо и вызывает изменение конформации молекулы ЯШ, приводя ее в более активное состояние. Широкая субстратная специфичность ЛПЛ объясняется,по-видимому, значительной лабильностью структуры активного центра, что позволяет ферменту осуществлять гидролиз различных по молекулярной глас се липидных субстратов.

Гйшшие технологических факторов на активность ли понрот еидшшаэн и процесс липолкза в молоко С целью оценки роли ЛПЛ в процессе липолиза молока методами планирования эксперимента исследовали влияние некоторых техноло- , гическях факторов перскчной переработки молока - температуры, со-

держащая жира в молоке, концентрации СаИд »времени резервирования молока, а также концентрации сыворотки крови как фактора, оказывающего непосредственное аативирушщее действие на ЛИД,- на скорость гидролиза молочного жира лнпопрот еидлипазой и степень ли-полиза молока. Уравнение формальной кинетики дня скорости гидролиза модочногр жара имеет вид: «ЛД?

6 $ "¿>7"

V" г,б2-ю с( сг- е ,

где V - скорость гидролиза.мл 0,02М КСЩ/час; С1- концентрация сыворотки крош,0+3? об.; С2- содержание дара в молоке, 0,5+3$. Энергия активации процесса гидролиза молочного жира в молоке равна 45,9 кДе/моль и хорошо совпадает о энтальпией активации & Н^ => » 54,0 кДж/ноль, определенной при исследовании гидролиза молочного жира лшюпротевдлипазой в модельной реакционной среде. Ско-' рость гидролиза для заданного факторного пространства прямопро-порционалша концентрации сыворотки крош и имеет четвертый порядок по массовой доле жира, что можно объяснить широкой специфичностью ЛИЛ к ацилглицеролам молочного жира и многостадийным процессом гидролиза суботрата, Учитывая результаты исследования специфичности фермента, можно утверждать, что оба эти явления в данном случае имеют место.

Зависимость степени лидолиза молока от технологических факторов описывается следующим уравнением регрессии:

у » 0,150 + 0,0691^+ 0,01512+ 0,019Х3+ 0,037Х4 , где у - степень липолиза.мл 0,02М КОН/мл молока; Х^- концентрация сыворотки,0+5^ об.; концентрация СаС13,0+0,06£; Х3- температура молока,Ю+20°С; Х^- время резервирования,8*24 час. Повышение величины всех изученных факторов приводит к увеличению степени липолиэа молока. Наибольшее влияние на параметр оптимизации оказывает концентрация сыворотки крош - активатора Л0Л, далее идут продолжительность резервирования молока, температура и

концентрация CoCIg. При видержка молока в течение 8 чао при Ю°С добавление 5% об.сыворотки крови, что 5-кратно увеличивает активность ЛИЯ, приводит к повышению степени липолиза молока примерно в 18 раз. Этот факт свидетельствует о способности'ЛОТ в значительной степени пщролиэоъать молочный жир даже в неоптимальных для ее активности условия* хранения молока на производстве. Принимая во внимание накопление при гидролизе молочного жира ферментом жирных кислот, обуславливающих органолептические пороки молока, можно утверждать, что ЛВД играет основную роль в возникновении лнполи-тической прогорклости молочных продуктов.

Разработка метода определения количества соматических

клеток в молоке Зависимость скорости продуцирования свободных жирных кислот в технологически анормальном молоке от количества соматических клеток выражается И-образной кривой, имеющей минимум, примерно при 4 млн соматических клеток в I мл молока. На основании »тих данных было предположено, что процесс ляполига npj увеличении содержания соматических клеток до 4 млц/мл замедляется в результате уменьшения в молоке активности ЛИЯ. .

Исследовано 76 образцов молока на активность.ЛШЕ, определяемой на составленной коми реакционной среде, и количество соматических клеток. Во всех образцах молока активность фермента уменьшалась с возрастанием содержания соматических клеток независимо от вида анормального молока - маститное, стародойное, молозиво, сборное или полученное из отдельных четвертей молочной железы, причем активность не обнаруживалась при числе соматических клеток более 4 млн/мл. Б результате аппроксимации экспериментально полученных данных рушащей у = а»х"' получено соотношение у = (0,127^0,018):х, где у - количество соматических клеток, млн/мл; х - активность ДІЛ, млО.ОІМ КОН/кл молока-час, Коэ£<1жци-

«вт корреляции между количеством соматических клеток и величиной, обратной активности ЛШГ, равен 0,80.

На ооновании проведенных исследований был разработав метод диагностика технологически анормального молока по активности ЛИЛ. В основу метода положена обратно" пропорпяональвая зависимость между активностью федаента и количеством соматических клеток в молоке. Активность ЛШГ определяется Ери 37°С на реакционной среде,состоящей из 0,6 мл 10£-ной эмульсии оливкового масла, 0,16 мл 0,9М трис-HCI буфера,jH 8,65t 0,16 мл 3$-ноЙ лиофилизированной говяжьей сыворотки крою, 0,08 шг IM СаС12 и I мл молока, Образующиеся в результате гидролиза жирные кислоты экстрагируются вэ реакционной среди системой органических растворителей по Доуяу /1956/ и титруются раствором КОН. Активность ДЕД выражается в мл 0.0ІМ КОЫ/мл молока-час. Область определения количества соматических клеток предложенным методом находится в интервале от 0 до 4 млн/ил. Молоко с активности) ЛОЛ менее 0,25 ил 0,01М КОН/мл молока-час содержит более 0,5 млн соматических клеток в I мл я является технологически анормальным /рио.8/.

Производственная проверка показала, что ферментный метод диагностики анормального молока может использоваться в производственных условиях молочных заводов, животноводческих комплексов и молочно-товарных ферм и по точности s 2-3 раза превышает пробу на мастонркм по действующему ГОСТ 23453-79.

■ ■ швсщу ■

'і.Кинетический анализ гетерогенной реакции гидролиза эмульсий дшгадных субстратов липопротендлиназой молока показал, что

' ■ . ' ■ л

константа Мих&элиса соответствует константа диссоцяаигд комплекса фермента о поверхность» раздела фаз. .

2.Ннгд0ирование молочной лияопротеидшшазн хлоридом натрия

имеет обратимый характер, причем ионы ингибитора блокируют поверхность раздела фаз, препятствуя адсорбции фермента на поверхность липивной капли.

3.Установлено, что субстрат и компоненты сыворотки крови взаимодействуют независимо с различными участками молекулы липопротв-ндлапазы. Взаимодействие фермента с компонентами сыворотки необратимо и вызывает изменение конформации молекулы липопротеидлипазы, приводя ее в более активное состояние.

4.Показано .что в реакции гидролиза липидных эмульсий липопро-теидлипаэой принимают участие каталитически важные ионогешше сульфтацряльная и «£ -аминогруппа. Сульфгідрильная группа принимает участие в процессе связывания ферментом ацилглицеролов,

5.Установлено, что гидролиз высоко- и низкомолегсулярньк ашл-глиперолов протекает в одном и том же активном центре ійпопротепд-липаэы. Липопротеидлипаза специфична к первичным эфирным связям ацялглицеролов и гидродизует молочный жир с накоплением свооодкнх жирных кислот, участвующих в образовании органоледтическюс пороков молока. На активность фермонта и степень липолиза молока наибольшее влияние оказывает массовая доля жира, далее идут время резервирования молока, температура и концентрация хлорида кальция.

6.Установлено,что активность липопротеидлипазы уменьшается в обратно' пропорциональной зависимости с увеличением количества соматических клеток в,молоке. .

V.Разработан метод определения количества соматических клеток в молоке по активности липопротеидлипазы, превышающий по точности в 2-3 раза пробу на мастоприм по ГОСТ 23453-79, Ожидаемый экономический эффект от использования ферментного метода составит ТЗ .84 шб. на I тонну сыра.

Основное содержание диссертация опубликовано в следующих работах

Х.Лебедев А.Б.,Уманский М.С. Тепловая инактивация липопроте-идлипазы молока.- Прикладная биохимия и микробиология,1979,т.ХУ,

* 5, с. 740-743.

2.Лебедев А.Б. .Уманский М.С. Изучение влияния некоторых факторов на активность липопротеидлипазы молока.- Углич, 1960,-5 с. Рукопись представлена ВНИИ маслодельной и сыродельной промышленности. Дед. в ЦНИИТЭИ 4 октября 1980 г., Ü 8-19-3221.

3.Лебедев A.B.,Уманский М.С. Воздействие некоторых физико-химических факторов на степень лидолиза молока.- Труды ВНШМС "Повышение эффективности н качества в сыроделии*,1980, вып. 32, С »19-22»

4.Лебедев A.B.Дманский М.С. Изучение гидролиза молочного жира лисопротеидлппааой молока.- Молочная промышленность, 1981,

# 9, с. 13-14.

' 5.Лебедев А.Б,.Уманский М.С. Интенсивность и специфичность гидролиза молочного жира нативной липопротеидлидааой.- В кн.: XXI Международный молочный конгресс. Краткие сообщения.- М: 1982, т.1, кн.2, с. 376.

б. A.C. 1010946 /СССР/. Способ определения количества соматических клеток б молоке /Лебедев А. Б., Уманский М.С., Скобеле в В.И,, Титов А.Г.,Перфильев Г.Д./.- Опубл. не подлежит.

.........

Подписано в печать 17,12.85. Формат 60х84*/К. " ; Бумага газетная.Офсетная печать. Печ.л. I. Тираж 100. Бесплатно. Заказ 45. ■ Типография Ярославского политехнического института. Яроолавль,ул.Советская,14а.