Картирование и анализ генов и функционально-значимых последовательностей генома человека

Климов, Евгений Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Картирование и анализ генов и функционально-значимых последовательностей генома человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование и анализ генов и функционально-значимых последовательностей генома человека"

КЛИМОВ ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНО-ЗНАЧИМЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.02.07 - «генетика»

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2010

2 1 0НТ 7010

004610754

Работа выполнена в лаборатории сравнительной генеггики животных Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Галина Ефимовна СУЛИМОВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Евгений Иванович РОГАЕВ

доктор биологических наук Наталия Николаевна МАЗУРЕНКО

доктор биологических наук Антон Александрович БУЗДИН

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится «21» октября 2010 г. в^К'^^часов на заседании диссертационного Совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

факс (499) 132-8962, электронная почта aspirantura@vigg.ru, http://www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, ул. Губкина, д.З.

Автореферат разослан

«Вт- С^АЛЦ 2010 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. Т.А. Синельщикова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АРОТ - амплификация онкогенных транскриптов вируса папилломы (Amplification of Papillomavirus Oncogenes Transcripts)

ВС - карцинома молочной железы (Breast Carcinoma)

CpG-островки — (G+Q-богатые участки генома, обогащенные динуклеотидами CG

EST - эксрессируюгциеся нуклеотидные последовательности (Expressed Sequence Tag)

FISH - флуоресцентная in situ гибридизация (Fluorescence ш sUu Hybridization) RCC - карцинома почки (Renal Cell Carcinoma) RH - радиационные гибриды (Radiation Hybrids)

SAGE — серийный анализ экспрессии генов (Serial Analysis of Gene Expression)

SNP - однонуклеотидный полиморфизм ДНК (Single Nucleotide Polymorphism)

STS - участки, идентифицируемые по нуклеотидным последовательностям (Sequence Tagged Site)

TSG - ген-супрессор опухолевого роста (Tumor Suppressor Gene)

YAC - искусственные хромосомы дрожжей (Yeast Artificial Chromosomes)

ВПЧ - вирус папилломы человека '

Danio rerio - рыбка, модельный объект в эмбриологии и генетике (рус. - Данио рерио, англ. - zebrafish)

МЧРА - метил-чувствительный рестрикционный анализ

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РВ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Картирование генома человека и локализация генов на хромосомах человека на протяжении последнего десятилетия XX века было одним из основных направлений геномики. К началу XXI века были построены интегрированные карты всех хромосом человека, картировано более 10000 генов. Тотальное секвенирование генома человека, казалось бы, снимало необходимость продолжения работ по картированию генома человека. Тем не менее, оставались задачи, которые быстрее и проще можно решить с помощью картирования: независимое подтверждение корректности геномных контигов, выявление мест локализации близкородственных генов (или псевдогенов), выявление мест возможной локализации новых генов человека с помощью универсальных маркеров генов.

Особый интерес представляет тонкое физическое картирование и последующий структурно-функциональный анализ участков хромосом человека, вовлеченных в развитие заболеваний. Несомненную важность представляют локусы хромосом и гены, вовлеченные в процессы канцерогенеза. В развитии злокачественной опухоли важную роль играют генетические и эпигенетические процессы, необходимость детального изучения которых является основным моментом для понимания механизмов канцерогенеза. При этом основной упор необходимо делать на изучение активности продуктов конкретных генов и их ансамблей в процессе канцерогенеза. Одним из основных подходов в выявлении онкогенов и может быть сравнение транскрипционной активности генов в нормальных и опухолевых тканях.

Особую нишу занимают опухоли, вызываемые внешними агентами. Для рака шейки матки известен основной трансформирующий агент - ДНК содержащий вирус папилломы человека, выявляемый в 99% опухолей данной локализации. В данном случае интерес представляет уже взаимодействие вирусного и клеточного геномов. Показано, что ДНК вируса может интегрировать в геном клетки хозяина, однако следствия этого процесса не были ясны: куда происходит интеграция? является ли она инициирующим опухоль

механизмом или нет? как происходит взаимодействие интегрированной ДНК вируса и ближайшего окружения генома клетки?

Основной задачей современной молекулярной генетики является изучение структуры и функции генов. На 2004 год было полностью охарактеризовано примерно 7000 генов человека, т.е. экспериментально не подтверждена функция около 70% кодирующих белок генов. Экспериментальное определение функций предсказанных генов является необходимым моментом и включает в себя подтверждение зкзон-интронной структуры, анализ тканеспецифичности экспрессии и проверку участия исследуемых генов в процессе развития заболеваний.

ЦЕЛЬЮ исследования являлось тонкое физическое картирование маркирующих гены человека последовательностей ДНК (NotI-STS-маркеры и EST, места интеграции экспрессирующейся ДНК ВПЧ тип 16) и анализ картированных генов и последовательностей генома человека, прилегающих к местам встраивания ВПЧ тип 16. В соответствии с поставленной целью основные задачи исследования заключались в следующем:

1. Картирование NotI-STS-маркеров хромосомы 3 человека и подтверждение возможности использования данного типа маркеров как универсальных маркеров генов млекопитающих (на примере человека).

2. Анализ транскрипционной активности картированных генов хромосомы 3 человека в опухолях.

3. Картирование и анализ мест интеграции вируса папилломы тип 16 в геном человека. Выявление механизмов терминации транскрипции интегрированной ДНК ВПЧ 16.

4. Картирование EST.

5. Анализ структуры и тканеспецифичности экспрессии картированных генов человека и их гомологов у модельных организмов.

6. Оценка частот аллелей генов человека ССК, CCK1R, CCK2R и CCR5 в российских популяциях. Создание адекватной тест-системы для выявления двух мутаций в гене CCR5.

ОБЪЕКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ были человек и модельные организмы: крыса, мышь и рыба йато гепо.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Физические ИоН-карты являются эффективным инструментом для верификации протяженных геномных контигов и идентификации новых генов человека. №)11-8Т8-маркеры следует рассматривать как универсальные маркеры генов.

2. Интеграция вируса папилломы человека происходит в любые участки генома клетки хозяина. Терминация транскрипции интегрированной ДНК вируса осуществляется за счет близлежащих сигналов полиаденилирования клетки-хозяина.

3. Изменение экспрессии генов ШОА, БЕМАЗВ, НАНВ, СРХ1, ОАО!, ИВЕАЫ, СКАР2, \V91914 и Н51703 в опухолях различной локализации является надежным тестом для определения их роли в процессах развития опухоли.

4. Картированные и охарактеризованные нами гены ЫВЕА12 и АВЫМ2 консервативны по своей структуре и функции у млекопитающих. Ген УУА5Р4 имеется только у человека и приматов, что свидетельствует о недавнем его появлении в геноме млекопитающих.

5. Созданная нами тест-система для одновременного определения мутаций СС115с1е132 и ССЯ5шЗОЗ в гене СС.Я5 человека является эффективным инструментом для определения генетической устойчивости к заражению М-тропным вариантом ВИЧ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В ходе выполнения данной работы впервые методом ЯН-картирования построена тонкая физическая карта области Зр21-р22 генома человека, включающая 60 №>Й-8Т8-маркеров.

Впервые проведено точное физическое картирование (ЯН- и т зШсо картирование) мест интеграции ДНК вируса папилломы человека тип 16. Показано, что интегрированный вирус использует сайты терминации траскрипции клетки-хозяина.

Впервые выявлены механизмы активации транскрипции онкогена КНОА в опухолях: за счет умножения копий гена и посредством деметилирования СрС-островков промоторного района.

Впервые показано снижение уровня транскрипции гена БЕМАЗВ при светлоклеточном почечноклеточном раке, а также при раке толстой кишки и эпителиальном раке яичников.

Впервые описана структура генов человека СКАР2, АВЫМ2, \VASF4 и гена ЫЬеа12 крысы. Для генов АЬИт2 и МЬеа12 крысы показана органоспецифичность экспрессии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

МоЙ-ЗТБ-маркеры можно с высокой эффективностью использовать в качестве универсальных маркеров генов. Применение данного типа маркеров эффективно при картировании еще не изученных геномов, а построенные с их помощью карты позволят не только с высокой вероятностью идентифицировать гены, но и проводить оценку корректности совмещения геномных контигов при секвенировании генома.

В качестве теста для выявления онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста эффективно оценивать изменения экспрессии генов в опухолях различной локализации. Использование данного подхода позволяет быстро отбирать гены, участвующие в развитии заболевания, не только при изучении молекулярных основ канцерогенеза, но и при других системных заболеваниях человека. Разработана эффективная тест-система для одновременного определения двух мутаций (СС115с1е132 и ССЯ5тЗОЗ) в гене С.СК5 человека и их цис- трансположения. Данные мутации обуславливают генетическую устойчивость

обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1).

СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000); на втором съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000); на международной конференции по геному человека (НОМ'2000) (Ванкувер, 2000); на итоговых конференциях «Геном человека» (Черноголовка, 1999, 2000; Москва, 2001); на Пущинских конференциях молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2001; 2002; 2003; 2004; 2005; 2006); на второй российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); на международной конференции

«Биоинформатика регуляции и структуры генома (ВСКЗ'2002)» (Новосибирск, 2002); на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); на международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2003; 2006); на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2006); «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006); на конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Киев, 2007); на Съезде генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009). Декларация личного участия автора. Экспериментальные материалы, использованные в диссертационной работе, получены автором лично. Автор самостоятельно осуществлял выделение РНК, постановку ПЦР, ОТ-ПЦР, электрофоретический анализ, обсчет полученных данных. Часть данных, представленных в разделах 1, 2, 4 и 6, получены коллективами исследователей, что указано в начале разделов. Суммарное личное участие автора составляет около 80%.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 244 страницах и иллюстрирована 35 таблицами и 52 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 295 источника, из них 27 на русском и 268 на английском языке. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 79 печатных работ, в том числе 1 патент и 17 работ в рецензируемых журналах (13 в отечественных и 4 в международных), из них два обзора в отечественных журналах. Работа выполнена при финансовой поддержке ПП ФЦНТП "Геном человека" (грант 89'99), а также РФФИ (грант 00-15-97777) и ФЦП "Интеграция" (проект 2.1-А0077), грантов Президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» (НШ-827.2003.4, НШ-10122.2006.4, НШ-3914.2008.4) и «Поддержка молодых ученых» (МК-963.2005.4), гранта ЮТА5 (03-51-4983), гранта программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Основные материалы. В работе использованы нуклеотидные последовательности Notl-клонов хромосомы 3 человека [Kashuba et al., 1999; Zabarovsky et al., 1994a; Zabarovsky et al., 1994b], зарегистрированных в GenBank. Картирование проводили с использованием коммерческой панели радиационных гибридов GeneBridge 4 RH-Panel («Research Genetics, Inc.», USA). Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Все опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г. [UICC TNM classification of malignant tumours, 2002]) и типированы гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [World Health Organization. International histological classification of tumours, 2003 & 2004]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы тканей хранили при -70°С. Образцы тотальной РНК из крови больных лейкозом: хронический лимфолейкоз, стадия 2 (XJIJI2); хронический лимфолейкоз, стадия 3 (ХЛЛЗ); острый миелоидный лейкоз, стадия 1 (OMJI1); миелодиспластический синдром, стадия 5 (МДС5); острый лимфолейкоз, ремиссия 1 (ОЛЛ рем1); острый миелоидный лейкоз, ремиссия 1 (OMJI рем1). В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови шести взрослых доноров. Образцы ДНК, выделенные из цельной крови условно-здоровых жителей Москвы (198 человек) любезно предоставлены лабораторией функциональной геномики ИОГен РАН. Образцы ДНК, использованные в работе по изучению мутаций в гене CCR5, получены в Институте иммунологии РАМН.

Основные методы. Выделение ДНК, выделение РНК из тканей, синтез кДНК, ПЦР, ОТ-ПЦР, полуколичественная ОТ-ПЦР, количественная РВ-ПЦР, ПЦР-ПДРФ, аллель-специфичная ПЦР, клонирование фрагментов ПЦР в ТА векторе, электрофорез в ПААГ и агарозном геле, компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, основные статистические методы. Для

оценки изменения экспрессии генов в опухоли по отношению к норме использовали «нормированный коэффициент» [(T-N)/N], где Т - уровень экспрессии гена в опухоли, а N - прилегающей в нормальной ткани (в единицах светимости продуктов ПЦР после разделения в агарозном геле с бромистым этидием измеренных с помощью программы ViTran (Biokom, Россия)).

результаты и их обсуждения

1. rh-картироваиие и анализ Notl-STS-MAPKEPOB хромосомы 3 человека, ассоциация Notl-STS с генами

(в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р., Компапийцев А.А., Мойсяк Е.В.

и Удина И.Г.)

1.1. Создание STS к Notl-клонам хромосомы 3 человека и их локализация На основе нуклеотидных последовательностей ДНК из Notl-прыжковых и связующих клонотек, специфичных для хромосомы 3 человека, созданы 94 NotI-STS-маркера к 72 индивидуальным Notl-ююнам. Праймеры подбирали к нуклеотидным последовательностям, прилегающим либо к 5'-, либо к 3'-концу Notl-участка. Условия амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, температуре и времени отжига.

Физическое картирование NotI-STS-маркеров проводили методом RH-картирования с использованием ПЦР-скринига RH-панели GeneBridge 4. Метод RH-картирования относится к методам физического картирования с высоким уровнем разрешения. Подробно принципы метода и его преимущество перед другими методами физического катирования рассмотрены в статье [Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Сулимова Г.Е. Методы картирования геномов млекопитающих // Успехи современной биологии. 2004. Т.124. №3. С.286-302].

1.2. Определение локализации маркеров на RH-карте Для получения информации о локализации маркера на RH-карте, результаты ПЦР-скрининга RH-панели отправляли по Internet в соответствии с формами, приведенными на сервере Whitehead Institute. Для всех

локализованных маркеров значение LOD score находилось в пределах от 0,00 до 2,56, т.е. не превысило значение 3, что свидетельствует о достоверности сцепления исследуемых маркеров с маркерами рабочей рамки, и, следовательно, о достоверности их локализации на RH-карте.

1.3. Совмещение RH-карты с другими типами карт и построение физической Notl-карты хромосомы 3 человека

Картированные NotI-STS-маркеры зарегистрированы как RH-маркеры в базе данных RHdb (Radiation Hybrid DataBase; http://www.ebi.ac.uk/RHdb/).

Цитогенетическая локализация NotI-STS-маркеров установлена ранее с использованием FISH [Protopopov et al., 1996; Kashuba et al., 1999; Protopopov et al., 2003]. Результаты локализации Notl-STS на цитогенетической карте, полученные с помощью FISH- и RH-картирования, как правило, хорошо совпадали.

Использование RH-картирования позволило при уточнении локализации NotI-STS-маркеров сопоставить результаты, полученные разными методами, и установить локализацию NotI-STS-маркеров по совокупности данных по RH-, контиг- [Kashuba et al., 1999; Kashuba et al., 1995], цитогенетическому картированию [Protopopov et al., 1996; Protopopov et al., 2003] и позиции геномных фрагментов, идентичных нуклеотидным последовательностям анализируемых Notl-STS (картирование in silico). Порядок расположения 72 NotI-STS-маркеров на хромосоме 3 человека представлен на рисунке 1.

Таким образом, возможность интеграции построенной Notl-карты и разнообразных физических карт хромосом человека (YAC-, RH-, EST-карты, карты локализации генов, геномных контигов и др.) обеспечивает наиболее эффективное использование предоставляемой ими информации.

Не выявлено гомологий двух Notl-STS (NL1-256 и NL3-005) с геномными ДНК хромосомы 3 человека. ДНК этих маркеров вообще не представлены в геномных контигах, хотя они входят в состав контига, перекрывающего область Зр21-р22 [Kashuba et al., 1999; Kashuba et al., 1995], и в международных базах данных зарегистрированы как Notl-клоны, так и Notl-STS,

созданные на их основе. Маркеры NL3-007 и NLM-084, согласно данным геномных контигов, локализованы на других хромосомах. Отмечена даже множественная локализация маркера NLM-084, но не на хромосоме 3. При этом локализация этого маркера на хромосоме 3 доказана нами методом RH-картирования. Клоны NL1-256, NL3-007 и NL3-005 входят в состав контига, перекрывающего область Зр21-р22 [Protopopov et al., 2003]. Локализация клона NL1-256 на хромосоме 3 подтверждена также с помощью RH-картирования.

Отсутствие фрагментов ДНК, идентичных маркерам NL1-256 HNL3-005, в аннотированной в январе 2005 г. нуклеотидной последовательности генома человека указывает на присутствие брешей в области локализации этих маркеров и позволяет установить точное расположение двух брешей на хромосоме 3. Более того, нуклеотидные последовательности NotI-STS-маркеров и ДНК контига Зр21-р22, которому они принадлежат, могут быть использованы для заполнения брешей и реконструкции непрерывной геномной последовательности хромосомы 3 человека.

Отсутствие на момент завершения нашей работы на хромосоме 3 человека фрагментов ДНК, идентичных маркерам NL3-007 и NLM-084, по-видимому, объясняется другой причиной. Согласно геномным контигам в базе данных эти маркеры локализованы на других хромосомах, однако их принадлежность хромосоме 3 доказана несколькими независимыми методами [Kashuba et al., 1999; Kashuba et al., 1995], что указывает на существование сегментных дупликаций в областях локализации маркеров NL3-007 и NLM-084. Фрагменты ДНК, идентичные маркеру NL3-007, присутствуют в геноме на двух хромосомах (3р22-21.33 и 12q). Маркер NLM-084, локализованный нами в области 3q28-q29, имеет множественную локализацию в геноме. В базе данных "Human Genome Resource" фрагменты ДНК, идентичные маркеру NLM-084, представлены в нескольких геномных контигах: NT_077402 (1р36.33), NT_022135 (2ql4.1), NT 035235 (15q26.3), NT_011255 (19pl3.3), а также в контиге NT_090211, не приписанном ни к одной из хромосом человека. Это можно объяснить тем, что полная реконструкция нуклеотидной

последовательности хромосомы 3 человека и аннотация генов на этой хромосоме еще не были завершены [International Human Genome Sequencing Consortium, 2004].

Ohr 3

WI-RH

GM99-GB4 3p2Z,l-|>2l.l locus

Gene density

AVrfl-site d№ilv

[

Рисунок 1. Интегрированная Notl-карта хромосомы 3 человека и корреляция насыщенности геналт и NotI-STS-маркерами. Слева направо: идеограмма (G-banding), WI-RH-карта, карта GM99-GB4 (расстояния выражены в cR), карта насыщения генами (NCBI, GeneMap'99), карта насыщения генами по данным [Caron et а/., 2001] и карта насыщения NotI-STS-маркерами (наши данные). Красным цветом выделены Notl-STS-маркеры, имеющие гомологии с генами человека, синим - с мРНК и кДНК. В квадратных скобках указана локализация гомологов (по данным FISH).

Таким образом, сравнение ДНК Notl-STS с геномными последовательностями человека выявило две бреши в областях 3р21.33 (маркер

NL1-256) и 3p21.31 (NL3-005) и сегментную дупликацию с локализацией идентичных фрагментов ДНК в областях 12q и 3р22-21.33 (маркер NL3-007). В области 3q28-q29 (маркер NLM-084) выявлен фрагмент, идентичные копии которого локализованы также на хромосомах 1, 2, 15 и 19. Полученные данные свидетельствуют о том, что NotI-STS-маркеры могут быть с успехом использованы для выявления брешей и сегментных дупликаций в геномной последовательности ДНК человека.

1.4. Поиск гомологии NotI-STS-маркеров с генами и EST человека

Как уже отмечалось ранее, сайты рестрикции эндонуклеазы NotI ассоциированы с CpG-островками, а, следовательно, и с 5'-областями генов (около 80 - 85% Notl-сайтов) [Kusuda et al., 1990; Allikmets et al., 1994; Забаровский и др., 1994; Plass et al., 1995; Домнинский и др., 1999], что позволяет предположить, что исследуемые Notl-ююны будут гомологичны известным генам человека. Поиск гомологий локализованных Notl-клонов проводили с нуклеотидными последовательностями, представленными в международных компьютерных базах данных (GenBank, EMBL, TIGR). Для поиска гомологий использовали геномные фрагменты, фланкирующие сайты рестрикции эндонуклеазы Notl с 5'- и 3'-конца, протяженностью 1000 п.н. с каждого конца и включающие в себя последовательность Notl-клонов. NotI-STS-маркеры признавались маркерами этих генов, только когда их локализация в геноме человека совпадала с локализацией в геноме соответствующих генов. Данные по гомологичным участкам ДНК с уровнем идентичности менее 90% не рассматривали.

Выявлены значимые гомологии 70 Notl-STS (более 97% исследованных маркеров) с генами или EST. В семи случаях обнаружена гомология двух Notl-STS к разным участкам одного гена. Еще одним доказательством ассоциации Notl-сайтов с генами, служит проведенный сравнительный анализ распределения генов и Notl-сайтов на хромосоме 3 человека. На основе результатов картирования NotI-STS-маркеров была построена карта насыщения Notl-сайтами хромосомы 3 (рис. 1). Видно, что наши данные о распределении Notl-сайтов

полностью коррелируют с данными о распределении генов на хромосоме 3 человека, что еще раз подтверждает ассоциацию Notl-сайтов с генами и перспективность применения NotI-STS-маркеров для поиска и локализации новых генов.

Для более широкого представления о роли генов, имеющих гомологию с локализованными Notl-клонами, была проведена классификация этих генов по функциям кодируемых ими белков. Белки были распределены на группы в зависимости от выполняемых ими функций. Эти результаты были сопоставлены с аналогичными данными, полученными на момент выполнения нашей работы для всего генома человека [Venter et al., 2001].

Наблюдается значительная корреляция наших данных и данных Вентера с соавторами. Помимо большого количества генов с неизвестной функцией (45,5%) выделяются группы генов, кодирующих ферменты (11,4%) и ДНК-связывающие белки (13,2%), куда можно отнести и факторы транскрипции. Следовательно, распределение генов разных семейств на хромосоме 3 человека примерно соответствует распределению генов в геноме в целом. Значительно отличается только количество протоонкогенов (11,4% - наши данные и 2,9% -данные Вентера с соавторами). Это объясняется тем, что область Зр21-р22 характеризуется высокой насыщенностью онкогенами [Shriver et al., 1998; Uzawa et al., 1998; Frost et al., 2000; Guo et al., 2001; Rao et al., 2002; Johansson et al., 2002; Kiss et al., 2002; Dave et al., 2002; Acevedo et al., 2002; Hoebeeck et al., 2007]. Таким образом, можно предположить, что NotI-STS-маркеры не являются специфичными для тех или иных групп генов и могут быть использованы для локализации генов из разных семейств.

Как показано в нашей работе, NotI-STS-маркеры можно рассматривать как универсальные маркеры генов. Они не специфичны по отношению к отдельным группам генов и могут быть применены для маркирования генов из разных семейств. Высокий консерватизм нуклеотидных последовательностей, прилегающих к Notl-сайтам, позволяет использовать их и для поиска генов у других организмов [Козырева и др., 2007], вплоть до таких отдаленных групп,

как микроорганизмы [гаЬагоуэку е£ а1., 2003]. МоИ^ТЯ-маркеры могут быть с успехом использованы не только в структурной, но и в функциональной геномике. Например, показана эффективность №>И-микропанелей для выявления в геноме человека нуклеотидных последовательностей, подвергшихся метилированию (или деметилированию) при различных онкологических заболеваниях [1л & а1., 2002; БшпуеП е1 а1., 2009; ОегазЬсЬепко е! а1., 2009]. Этот подход, на наш взгляд, может существенно облегчить поиск и локализацию новых онкогенов и генов-супрессоров и может найти широкое применение в будущем.

2. ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА В ОПУХОЛЯХ

(в работе принимали участие Каганова Н.Л. и сотрудники Лаборатории сравнительной и функциональной геномики ФГУП «ГосНИИ генетика»: Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С.)

Насыщенность хромосомы 3 человека онкогенами е1 а1., 2002;

Брага и др., 2004; СЬакгаЬоПу е! а1., 2003; НоеЬееск е! а1„ 2007; Брага и др., 2008], придает высокую значимость исследованиям по созданию и характеристике маркеров генов, локализованных на этой хромосоме.

Важную роль в предварительной идентификации на коротком плече хромосомы 3 районов, содержащих Т5С, сыграли работы по локализации участков, способных подавлять опухолевый рост. Для детального картирования районов Т8С на Зр проведен анализ потери гетерозиготности с использованием плотной панели полиморфных маркеров (20-30 локусов) в обширных коллекциях парных образцов ДНК из опухолевой и гистологически нормальной ткани (50100 пар). На Зр наблюдается перекрывание аллельных и гомозиготных делеций и участков, подавляющих рост опухолей [Брага и др., 2003].

В последнее время стало очевидным, что одним из основных механизмов инактивации ТБв является эпигенетическая модификация. Гиперметилирование Срв-островков может происходить на ранних этапах канцерогенеза и приводить к активации протоонкогенов и к инактивации ТЗй за

счет дерегуляции их экспрессии на уровне синтеза РНК. Это, в конечном счете, приводит к малигнизации клеток, к повышенной пролиферации опухолевых клеток, к инвазии и метастазированию. Для многих TSG обнаружено метилирование CpG-островков промоторных районов в эпителиальных опухолях разных локализаций [Киселев и др., 2005].

Накоплен огромный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о том, что анализ экспрессии генов в опухолевых клетках имеет решающее значение, как для верификации диагноза, так и для выбора правильной тактики лечения. Паттерн экспрессии генов может определять спектр чувствительности к различным химиопрепаратам и определять тактику лечения, проводить целенаправленный поиск новых ген-направленных противоопухолевых препаратов, верифицировать диагноз в сложных случаях, прогнозировать течение процесса.

В данной части работы нами проведен анализ транскрипционной активности в опухолевых и нормальных тканях следующих генов короткого плеча хромосомы 3 человека: RHOA, SEMA3B, RARB, GPX1 (изоформа 1 мРНК), DAG1, W91914 и Н51703. Наиболее подробно рассмотрены результаты анализа экспрессии генов RHO А и SEMA3B.

2.2. Транскрипционная активность, копийность и метилирование гена

RHOA в опухолях Ген RHOA (Ras homolog gene family, member А) кодирует белок, относящийся к известному суперсемейству Ras-зависимых малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФ-аз), активность которых зависит от связывания ГТФ или ГДФ [Etienne-Manneville & Hall, 2002; Sahai & Marshall, 2002]. Белок RHOA участвует в процессах, связанных с формированием актинового цитоскелета, с адгезией и подвижностью клеток, а также с регуляцией клеточного цикла [Hall, 1998; Vial et al., 2003; Liberto et al., 2002; Vidal et al., 2002].

Нам не удалось найти сообщений, касающихся метилирования этого участка и его роли в изменении транскрипции гена RHOA в опухолях. Это послужило предпосылкой для сравнения экспрессии данного гена с

метилированием его промоторной зоны. Согласно анализу клонотек SAGE для гена RHOA в опухолях характерно повышение транскрипции. Однако в опухолях кишечника и кожи можно видеть обратное - снижение уровня транскрипции этого гена.

Нами была изучена его экспрессия, копийность и метилирование CpG островков в 5'-области гена. Все это сделано на единой выборке парных образцов опухолевых и нормальных тканях молочной железы, почки и яичников. На рисунке 2 представлены результаты анализа экспрессии и копийности. Видно, что увеличение экспрессии коррелирует с увеличением числа копий гена.

Iii

Uli.

Экспрессия □ Копийность)

¥-Т

05 \ 0.JJ. 0 2! •

02 '

ел-

0.019 ■

2 3 4 5 6 7 8 9 IU II 12 13 14 IS 16 17 18 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 II 12 13 14 IS 16 17 18 19 I 2 3 4 5 h 7 8

ВС

RCC

КОС

Рисунок 2. Профиль относительного изменения уровня транскрипции гена ЯНОА и относительного изменения количества его геномных копий в образцах опухолей по сравнению с образцами ДИК нормальной ткани (для наглядности на оси абсцисс представлен логарифм соотношения ТШ-1, что позволяет оценивать порядок изменений экспрессии в опухоли по отношению к норме). Уровень транскрипции и уровень копийности гена ЯНОА в норме приняты за 1. Исследования проведены для образцов ВС (18 случаев), ЯСС (19 случаев) и ЕОС (8 случаев). Все ОТ-ПЦР и мультиплексные ПЦР повторены трижды и в расчетах учтены средние величины из трех определений.

На рисунке 3 представлены результаты анализа метилирования С'рСт

островков. Здесь также видна четкая закономерность между снижением плотности метилирования и увеличением экспрессии в опухоли по отношению к норме.

Опухоль_ _Норма

№ Образца НраЧ 6 сре Н1ш I 6 Срв ВЛ12361 2 Срй АсП 11 СрС НраЧ 6 Срв нш 6 Срб Вхк12361 2 Срв Ас/1 11 Срв Экспрессия

1 | и _ 68,7

2 —1 26,31

ВС 5 имкяик в ■ 8,2

7 ■М1МЯЯ ■ 3,4

в шмш шт 2,7

11 2,0

1 68,3

3 16,8

ЯСС 4 1 И вен 7,8

5 7,7

6 н 4,4

7 ■■1 3,4

8 \шт 3,2

ЕОС 2 ЯШ. ЯШ 4,8

3 шт 3,2

ВС 17 0,67

18 I 0,15

12 1 1 ■■■ 0,81

ЯСС 17 0,15

18 ■ ■ 0,11

19 ■щ 0,06

ЕОС 7 0,61

8 0,07

Рисунок 3. Паттерн метилирования фрагмента промоторной области гена КИОА (25 СрС-пар) в 23 парных образцах ДНК опухолей и соответствующих морфологически нормальных тканей, установленный методом МЧРА. Черный прямоугольник указывает на наличие продукта ПЦР после гидролиза данного образца ДНК соответствующей рестриктазой и на метилирование СрС-пар, содержащихся в участках рестрикции этого фермента; белый прямоугольник означает, что продукт ПЦР отсутствует и одна или более СрС-пара в составе участков узнавания данной рестриктазы не метилированы. Наверху сгруппированы 15 случаев, для которых методом МЧРА показано снижение частоты и плотности метилирования узучаемого фрагмента в опухолях. В нижней части рисунка представлены 8 случаев повышения уровня метилирования гена ЯНОА в опухолях. Справа приведены данные об изменении (повышении или понижении) транскрипционной активности гена ЯНОА в опухолях по сравнению с нормой.

Таким образом, нами впервые получены данные о возможных путях активации транскрипции протоонкогена ЯНОА в опухолях как за счет умножения копий гена, так и посредством деметилирования СрС-островков промоторного района.

2.2. Изменение экспрессии гена ЯНОА в крови больных лейкозом Так же была проанализирована экспрессия гена ЯНОА в крови больных лейкозом (6 образцов). Контроль - кровь 6 здоровых доноров. На рисунке 4 показан уровень экспрессии гена ЯНОА в образцах крови больных лейкозом и здоровых доноров (данные по здоровым индивидуумам усреднены).

Рисунок 4. Увеличение экспрессии гена ЯНОА в крови больных лейкозом (зеленый цвет, Т, п=6) при отсутствии таковой в крови здоровых людей (голубой цвет, N. п=6). Экспрессия гены йАРОН усреднена для всех проб. Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием).

Как видно из рисунка экспрессия у здоровых пациентов не обнаружена. Однако экспрессия гена в образцах ОМЛ и ХМЛ составляет 71% и 32% от экспрессии гена «домашнего хозяйства» САРйН. Полученные данные позволяют предположить, что ген ЯНОА может быть использован для ранней диагностики ОМЛ и ХМЛ.

2.3. Изменение уровня экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях Продукт гена SEMA3B относится к семафоринам - это обширное семейство цитоплазматических и мембраносвязанных белков, у мыши и человека насчитывающее до 20 членов (Yazdani U. & Terman J.R., 2006). Функции белка Sema3B связаны с подавлением онкогенеза. Он может ингибировать активацию онкобелков МЕТ и RON [Roche & Drabkin, 2001; Bateman et al., 1999]. Найдена положительная корреляция между частотой метилирования гена SEMA3B и прогрессией опухолей [Брага и др., 2004].

В связи с этим представлялось целесообразным оценить уровень экспрессии гена SEMA3B в опухолях разной локализации. Содержание мРНК гена SEMA3B в клеточных линиях и образцах первичных опухолей оценивали методом полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием в качестве контроля фрагмента гена В2М.

ИКХ1

Рисунок 5. Изменение содержания мРНК гена SEMA 3В в 51 парном образце первичных опухолей почки. По оси ординат (логарифмическая шкала) отложено соотношение интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B из ткани опухоли и гистологически нормальной ткани почки этого же больного. Значения интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР гена SEMA3B нормировали по интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР контрольной мРНК В2М.

Нами впервые показано изменение содержания мРНК гена БЕМАЗВ в пяти видах рака. Обнаруженное нами снижение уровня мРНК гена при раке почки (рис. 5), раке яичников и толстой кишки (рис. 6) косвенно указывает на его возможную супрессорную функцию.

100 г 100 г

Ют—

0.1 •

(1.01

ал.

Tin

0.1

0.01 -

N12 866 ЯМ 907 К] 1 811) 874 867 813 864 87(1 S49 902 788 841 853 875 877 809 403 939 892 805 'НО 869 941 938

Стадия ! II III III 1 II IV III II IV II IV

Степень 1 анаплачи» 3 3 1 2 3 3 2 2 1 3

IV 1 III II 1 III III III III IV II IV f-al ш IV

3 I 3 I 1 3 3 3 3| 3| 2 ß ? 1

Рисунок б. Изменение содержания мРНК гена SEMA3B в первичных опухолях толстой кишки (а) и яичника (б). По оси ординат (логарифмическая шкала) отложено соотношение интенсивностей полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B из ткани опухоли и гистологически нормальной ткани этого же больного. Значения интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B нормировали по интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК В2М.

Полученные нами данные расширяют спектр опухолей, в которых ген

SEMA3B может действовать как ген-супрессор.

2.4. Изменение экспрессии гена SEM A3 В в крови больных лейкозом Таким же образом была проанализирована экспрессия гена SEM43B в крови больных лейкозом (6 образцов). На рисунке 7 показан уровень экспрессии гена SEMA3B в образцах крови больных лейкозом и здоровых доноров, данные по которым усреднены (п=6).

ieo

140 120 100

20 :

GAPDH норма

ХЛЛ2

ХМЛЗ

ОМЛ1

МДС5 ОЛЛ рем! ОМЛ рем!

Рисунок 7. Увеличение экспрессии гена SEMA3B в крови больных лейкозом (зеленый цвет, Т, п=6) при минимальной экспрессии в крови здоровых людей (голубой цвет, N, п=6). Экспрессия гена GAPDH усреднена для всех проб. Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием).

Из рисунка 7 видно, что экспрессия гена у здоровых пациентов носит следовой характер. Однако экспрессия гена в образце ОМЛ больше, чем экспрессия гена «домашнего хозяйства» GAPDH. Полученные данные позволяют предположить, что ген SEMA3B может быть использован для ранней диагностики ОМЛ.

2.5. Изменение уровня экспрессии генов RARB, DAG1, изоформы 1 гена GPX1 и гена NBEAL2 в эпителиальных опухолях Ген RARB относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лиганд-активирующими транскрипционными факторами [Chambón, 1996]. Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды - витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим их используют для профилактики и терапии различных опухолей [Hong et al., 1995].

Имеется 2 изоформы гена GPX1: короткая - изоформа 1 (два экзона) и длинная - изоформа 2 (единственный интрон не удаляется из мРНК и транслируется) [NCBI GenelD: 2876]. Белок GPX1 защищает клетки от CD95-индуцированного апоптоза в культуре клеток опухоли молочной железы, его сверхэкспрессия задерживает эндотелиальный клеточный рост и увеличивает устойчивость к токсинам. Показано, что мутация в гене GPX1, приводящая к замене в а.к. последовательности (Prol98Leu), может служить молекулярным маркером для мониторинга повторного появлении рака мочевого пузыря [Zhao et al., 2005]. Также данная мутация ассоциирована с риском появления рака молочной железы и легких.

Кодирующая последовательность гена DAG1 представлена 2 экзонами, разделенными большим интроном (Ibraghimov-Beskrovnaya et al.,1993). Дистрогликан человека экспрессируется во множестве эмбриональных и взрослых тканей. DAG1 — высоко-полиморфный ген, являющийся кандидатом для локализации мутации при аутосомно-рецессивных мышечных дистрофиях. Уменьшение количества белка DAG1 наблюдалось в большинстве клеточных линий и опухолях толстой кишки и молочной железы и коррелировало со стадией опухоли.

Ген NBEAL2 (neurobeachin-like 2) человека картирован нами в области Зр21-22 насыщенной онкогенами и генами супрессорами опухолевого роста [Sulimova et al., 2002; Сулимова и др., 2005]. В настоящий момент в литературе о данном гене нет никакой информации.

Результаты. Содержание мРНК данных генов в парных образцах первичных опухолей и прилегающей нормальной ткани (молочная железа, п=18; почки, п=19; яичники, п=8) оценивали методом полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием в качестве контроля фрагмента гена GAPDH. Показано достоверное увеличение количества мРНК всех генов (кроме NBEAL2) в опухолях молочной железы. Результаты приведены в сводной таблице 1.

2.6. Анализ транскрипционной активности новых белок-некодирующих генов человека W91914 и Н51703 в опухолевых и нормальных тканях Во втором интроне гена DUTT1 обнаружены два новых гена: W91914 и Н51703. Оба имеют иолиА последовательности и небольшие открытые рамки считывания, которые не кодируют белки. Для новых последовательностей не было найдено гомологов или ортологов. Оба гена, расположенные в интроне гена DUTT1, транскрибируются в том же направлении, что и DUTT1. Была найдена связь между утратой генов W91914 и Н51703 и развитием рака. Для доказательства их участия в процессах онкогенеза необходимо было изучить экспрессию в биопсиях опухолей и в нормальной ткани. Оценку транскрипционной активности генов W91914 и Н51703 проводили методами полуколичественной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени в парных образцах опухолевых и прилегающих нормальных тканей человека: молочная железа (п=10), легкие (п=4) и почки (п=6). В качестве контроля оценивали экспрессию гена В2М. Транскрипционная активность гена Н51703 обнаружена нами только в четырех образцах. Дальнейшее исследование его экспрессии не проводилось. Продукт амплификации гена W91914 наблюдался во всех исследуемых образцах. Оценка уровня экспрессии гена W91914 методом количественной ПЦР в реальном времени проводилась на тех же образцах. В качестве контроля измеряли уровень мРНК гена В2М. Нами показано увеличение его экспрессии в опухолях легких и снижение в опухолях молочной железы. Таким образом, несомненно, что гены W9I914 и Н51703 причастны к развитию рака. Однако, для установления точного механизма их действия необходимы дальнейшие исследования.

2.7. Заключение

В данной части работы нами оценены изменения экспрессии в норме и опухоли 8 генов, локализованных на коротком плече хромосомы, в частности, в детально картированной нами области Зр21 {RHOA, SEMA3B, RARB, GPX1, DAG1, NBEAL2, W91914 и Н51703). В таблице 1 приведена обобщенная информация об изменениях экспрессии изучаемых генов.

Таблица 1. Значимые изменения экспрессии в опухолях относительно нормы («-» - экспрессия данных генов не анализировалась в данных тканях).

Опухолевая ткань RHOA SEMA3B RARB GPX1 DAG1 W91914 Н51703 NBEAL2 CKAP2-F CKAP2-S

Молочная железа и и И И tr fl

Яичники tr I Ü

Почка и 1 I tr

Толстая кишка - I - - - - - - - -

Легкие - - - - tr • - -

Только для одного гена — SEMA3B — нами показано снижение экспрессии в большинстве проанализированных опухолевых тканей. Это может служить косвенным свидетельством его роли как TSG в процессе канцерогенеза.

Для гена RHOA, наоборот, показано увеличение экспрессии во всех проанализированных опухолевых тканях. Это является подтверждением его предполагаемой голи онкогена или гена активно работающего в опухолях. Также нами впервые выявлены механизмы активации его экспрессии в опухолях путем амплификации гена и деметилирования его промоторного участка.

Для генов RARB, GPX1, DAG1 и NBEAL2 выявлено увеличение экспрессии в опухолях молочной железы. Однако наши данные не позволяют с уверенностью утверждать, что для данных генов характерна роль онкогенов.

Таким образом, оценка экспрессии генов в опухоли и норме при различных типах рака может служить начальным тестом для выявления онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста.

3. КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ МЕСТ ИНТЕГРАЦИИ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ В ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА

Вирус папилломы человека (ВПЧ) относится к ДНК содержащим вирусам. Известно около 100 представителей ВПЧ, из которых типы 16, 18 и им родственные ассоциированы с развитием рака шейки матки [De Villiers, 1994]. ВПЧ может существовать в клетке как в эписомальной, так и в интегрированной

форме. В случае интеграции вирус теряет собственный сайт полиаденилирования. До последнего времени оставалось неизвестным, где происходит терминация транскрипции ДНК вируса при ее интеграции в геном человека. Более подробно классификации вирусов папилломы, структура вирусного генома и механизмы трансформирующего действия вирусных онкогенов, а также роль интеграция ДНК вируса в геном клетки в прогрессии рака шейки матки рассмотрены в обзоре «Интеграции вирусов папилломы человека в геном клетки хозяина и патогенез рака шейки матки» [Климов Е. А. // Успехи современной биологии. 2010. Т.130. №4. С.381-389].

Физическое картирование на хромосомах человека мест интеграции ДНК вируса и их in silico анализ имеют большое значение для понимания того, как интегрированный вирусный геном может нарушать генетическую программу клетки. Целью данной части работы были точная физическая локализация мест встраивания ВПЧ16 в хромосомы человека и характеристика in silico геномных последовательностей, прилегающих к местам встраивания вирусной ДНК, транскрибируемой в клетках плоскоклеточного рака шейки матки.

Результаты и их обсуждение В работе были изучены последовательности генома человека, прилегающие к местам встраивания вируса папилломы человека тип 16 (ВПЧ16) с 3'-конца (маркеры INT). Эти последовательности были ранее выделены с помощью метода АРОТ и секвенированы в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина, РАМН. Локализацию маркеров INT проводили двумя методами: RH-картированием и картирование in silico.

В одном случае обнаружена множественная локализация INT-маркера, поиск по базе данных EST показал сходство с мРНК многокопийного гена рибосомапьного белка, копии которого представлены на разных хромосомах. Полученные результаты по локализации мест интеграции и их подробному анализу не выявили никаких закономерностей - вблизи сайтов интеграции не было обнаружено функциональных последовательностей (участков

прикрепления ДНК к ядерному матриксу, повторяющихся элементов генома) и только 3 места интеграции вируса из 12 расположены вблизи сайтов ломкости хромосом.

iiñ

íiS

ш!

»!В

sfl

-'ё

тП

'¿•Л!«

Рисунок 8. Физическая локализация маркеров INT (красные бенды на идиограммах) в районах хромосом, насыщенных генами. Слева направо: идиограмма (G-banding), транскрипционная карта, опубликованная в журнале «Science» [Carón et al., 2001], карта насыщения генами, размещенная на сервере GeneMap '99.

Однако если рассматривать транскрипционную активность локусов, в которые происходит интеграция видно, что все они содержат активно работающие гены и отличаются высоким уровнем транскрипционной активности (рис. 8). Это, по всей видимости, облегчает интеграцию ДНК вируса в деконденсированные участки хромосом и последующую транскрипционную активность интегрированного вирусного генома, что, в свою очередь, приводит к развитию опухоли.

При анализе мест интеграции выявлено, что в 75% процентах проанализированных нами случаев вирус встраивается в последовательности

генов, а в остальных 25% вблизи генов. Как видно из таблицы 2, места интеграции равномерно распределены между интронами и экзонами.

Таблица 2. Гомологии маркеров INT и прилегающих последовательностей с генами. Наличие сигнала полиаденилирования в геноме клетки-хозяина с 3'-конца от интегрированного вируса.

INT AccN db Ген в месте интеграции Присутствие и расположение сайта Локализация

POLYA SCAN поли(А) сигнал * локус геномны й контиг

254 AJ431608 Между генами 11А051Ы и НР1.12 Р7 -(+)** 638 14q23.2 NT 026437

259 AJ431609 АВЫМ2 (интрон 15) + 903 4р16.1 NT 006051

431 AJ431610 ШС387934 и ЮС647279 + 166 13q22.1 NT 024524

407 AJ431611 Между генами СЬТВ и иВХБ8 + 225 5q35.3 NT_023133

290 AJ431612 \VASF4 (терминальный экзон) 1612 Xpll.23 NT_079573

505 AJ431614 ГЕЯ/ЬЗ (терминальный экзон) + 1894 10q24 NT 030059

466 AJ431617 ГК'йСб (экзоны 4 и 5) + 3764 (1270)*** 3q22.3 NTJ05612

477 AJ431615 БЕМАЗА (интрон 4) + 1724 7р12.1 NT_007933

421 AJ431618 Между генами ЮС200583 и ЮС200583 + 1048 2q22.3 NT_005058

475 AJ431619 КШ41Р1 (интрон 4) + 839 6q21 NTJ25741

423 AJ431620 018 (терминальный экзон) + 2070 2q32.3 NTJ05403

* расстояние от точки встраивания вирусного генома до сигнала полиаденилирования генома хозяйской клетки, п.н.

** последовательности, способные терминировать транскрипцию, найдены визуально.

*** в скобках указан размер предполагаемой «слитой вирус-клеточной» РНК с учетом вырезания интрона 4 гена ЕАЮСб. Участок, терминирующий транскрипцию, найден в интроне 5 гена.

Все кДНК, гомологичные маркерам ГЫТ и прилегающим геномным последовательностям, представлены в базах данных в большом количестве (5-20 клонов), что указывает на высокий уровень их экспрессии, и получены из различных органов и тканей человека, как в норме, так и при патологиях (включая и опухолевые образования).

Мы считаем, что интеграция ДНК вируса в клеточный геном происходит случайно, но преимущественно в активно работающие деконденсированные участки хромосом. Результаты более поздних работ демонстрируют, что сама по

себе интеграция ДНК ВПЧ не является необходимым механизмом для развития РШМ и не приводит к геномной нестабильности или критическим мутациям [Wentzensen et al., 2002; Melsheimer et al., 2004; Wentzensen et al., 2004; Vinokurova et al., 2008]. Следует отметить, что за рамками анализа остались также нетранскрибируемые интегрированные вирусные последовательности, доля которых в клетке может варьировать [Van Tine et al., 2001]. Но поскольку решающим фактором для иммортализиции клеток является активность вирусных генов Еб и Е7, предполагается, что нетранскрибируемая интегрированная ДНК ВПЧ сама по себе не участвует в развитии опухоли [Zur Hausen, 1999; Szarka et al., 2000; Киселев и др., 2001].

Для ответа на вопрос где происходит терминация транскрипции интегрированной ДНК вируса были проанализированы прилегающие с 3'-конца к местам интеграции последовательности генома человека. С использованием соответствующих программ и визуальным анализом нуклеотидных последовательностей были выявлены сигналы полиаденилирования на расстоянии до 2000 п.н., причем в некоторых случаях данные поли-А сайты принадлежат генам, в которые произошла интеграция вируса (табл. 2).

Полученные данные показывают, что транскрипция интегрированной ДНК вируса продолжается до ближайшей последовательности генома клетки, способной терминировать транскрипцию. Таким образом, подтверждена гипотеза о возможности использования для терминации транскрипции интегрированной ДНК ВПЧ16 близлежащих сигналов полиаденилирования генома клетки-хозяина.

4. RH-КАРТИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

(в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р., Компанищев A.A., Мойсяк Е.В., Кунижева С. С. и Удина И.Г.)

Методом RH-картирования были достоверно картированы пять EST. Нами подтверждена локализация маркеров CLL-5 и Leul в области 13ql4.3 с помощью RH-картирования. Локализация в геноме человека трех EST В10164, 18F5R и S16R установлена впервые: в областях 5ql4, 11р15 и 1р36, соответственно.

Мозгоспецифическая последовательность Hfbl локализована нами на хромосоме 5 человека. Детальный анализ структуры последовательности геномного клона из космидной библиотеки хромосомы 5, а также исследование транскриптов мРНК мозга методом ОТ-ПЦР позволили установить, что данная последовательность — часть неописанного ранее экзона гена комплексина 2, кодирующего 3'- нетранслируемый конец соответствующей мРНК.

5. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ГОМОЛОГОВ У МОДЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ

Предпосылкой для инициации структурно-функционального анализа данных генов стало отсутствие на момент начала работ информации об их структуре и функции, в базах данных были представлены только неполные транскрипты этих генов. Функция их белковых продуктов оставалась не ясна, а для ее уточнения необходимо было провести детальное изучение структурной организации и транскрипционной активности. Появление черновых вариантов геномов модельных организмов (крыса, мышь и рыба Danio rerio) позволило провести поиск ортологов изучаемых генов и привлечь их для анализа тканеспецифичности экспрессии и выявления консервативности структурной организации.

5.1. Структура и органоспецифичностъ экспрессии гена !\Ъеа12 крысы Ген ИВЕАЫ (пеигоЬеасЫп-Нке 2) человека картирован нами в области Зр21-22 [8иПтоуа е1 а1., 2002; Сулимова и др., 2005]. В настоящий момент в литературе о данном гене нет никакой информации. Нами проведен анализ структуры и органоспецифичности экспрессии гена АгЬеа12 крысы.

GAPDH

печень 200

желудок 12-ти перстная кишка

прямая кишка скелетная мышца

костная ткань

кровь

сердце

аорта

семенники

селезенка

обонятельные луковицы

надпочечник

молочная железа

шейка матки

гипофиз фронтальная кора

спиной мозг

стриатум

промежуточный мозг мозжечок

Рисунок 9. Диаграмма, отображающая транскрипционную активность Nbeal2 крысы. В качестве контроля - средняя активность гена GAPDH во всех анализированных тканях.

Экзон-интронная структура гена Nbeal2 крысы построена путем выравнивания представленных в базе данных мРНК с геномной последовательностью. Нами идентифицировано 55 экзонов. С помощью программ предсказано 2 промотора и 1 сайт инициации транскрипции. Среди факторов транскрипции имеется NRSF (Neuron-restrictive silencer factor), ограничивающий экспрессию генов нейрональными клетками. Ближайший от стоп-кодона сайт полиаденилирования находится на расстоянии 6590 п.н. Доменная структура белка Nbeak2 крысы (3 домена: Neurobeach, Beach и WD40)

полностью сходна со структурой белков человека и мыши. Белки с подобной структурой обнаруживаются у собаки, коровы, курицы, рыбы Danio rerio и дрозофилы. Аналогичные домены имеет в своем строении и белок, участвующий в лизосомальном транспорте у всех эукариот.

Результаты определения тканеспецифичности экспрессии гена Nbeal2 представлены в виде диаграммы, где экспрессия данного гена отложена на шкале в единицах светимости пробы. Наибольшая экспрессия была выявлена в отделах мозга, органах половой системы, легких, надпочечниках, а также селезенке и глазе (рис. 9).

5.2. Структура гена СКАР2 человека и анализ его экспрессии в опухоли и

норме

(работа выполнена при участии Рахманалиева Э.Р.)

Ген СКАР2 (ранее LB1) был выявлен при детальном изучении области 13ql4, часто перестраиваемой при в клетках В-клеточных лимфом диффузного типа [Капанадзе и др., 1997; Баранова и др., 2004]. Картирован ген в области 13ql4.3 [Удина и др., 2001] Продуктом гена СКАР2 является цитоплазматический белок, который связывается с фибриллами цитоскелета (cytoskeleton associated protein 2) [Maouche-Chretien et. al., 1998]. Однако информации о точной структуре гена не было. В связи с этим нам представлялось необходимым детализировать экзон-интронную структуру и выявить промоторную область гена СКАР2. Ген содержит 9 экзонов, а также все структурные элементы, присущие генам эукариот. Структура гена СКАР2, установленная нами, зарегистрирована в базе данных EMBL под номером AJ429398. Полученные нами данные могут быть использованы при изучении экспрессии гена СКАР2 в норме и в различных опухолях с целью выяснения его роли в процессах онкогенеза.

Позднее другими авторами для гена СКАР2 было показано наличие двух изоформ мРНК короткой (S изоформа) и длинной (F изоформа). Разница в длине изоформ возникает за счет ранней терминации транскрипции (после 632

го экзона) в случае Б изоформы [СЬап§-Оае й а1., 2003]. В ранее проведенных работах [Маоис11е-С11гёйеп е! а]., 1998, Вае е1 а1., 2003] оценка экспрессии гена проводилась совместно для вир изоформы, поэтому для подтверждения участия гена СКАР2 в процессах развития опухолей нам представлялось необходимым изучение экспрессии каждой изоформы.

ОМЛ рем1

Рисунок 10. Изменение экспрессии изоформ и 5 мРНК гена СКАР2 в крови больных лейкозом (п=6) и здоровых людей (норма, данные усреднены, п=б). Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистьш этидием).

В опухолях молочной железы (п=10) и яичников (п=5) имеет место увеличение количества Р-изоформы мРНК гена, в опухолях почки (п=20) изменения, по-видимому, носят случайный характер. Статистически достоверных отличий в экспрессии 8-изоформы в норме и опухолях молочной железы, яичников и почки не обнаружено (табл. 1). По нашим данным

количество мРНК изоформы S значительно меньше, чем изоформы F. Это может быть связано с разной функциональной значимостью изоформ мРНК гена СКАР2. Также нами была проанализирована экспрессия гена в крови больных лейкозом и здоровых доноров (рис. 10).

В 5 (из 6) образцах крови больных лейкозом было показано наличие изоформы F мРНК гена СКАР2, тогда как в норме эта изоформа мРНК в крови отсутствует. Изоформа S, напротив, присутствует в образцах крови здоровых доноров, хотя и в значительно меньшем количестве, чем в крови больных. Таким образом, наличие изоформы F мРНК гена С КАР 2 в крови может служить одним из маркеров лейкоза.

5.3. Структура гена ABLIM2 человека и модельных организмов

Мы картировали сайт интеграции ВПЧ16 в первом интроне гипотетического гена человека KIAA1808 (ABLIM2) [Klimov et al., 2002]. Далее представлены результаты детального анализа экзон-интронной структуры и экспрессии гена ABLIM2 человека, крысы и мыши.

Построение экзон-интронной структуры проводили на основании имевшейся в базе данных мРНК гипотетического гена KIAA1808 (АВ058711) и геномного контига NT_006307. Проведенный нами детальный анализ позволил выявить 20 экзонов гена ABLIM2. Все экзоны гена фланкированы каноническими сайтами сплайсинга (...ag-exon-gX...). Экспериментальную проверку экзон-интронной структуры гена ABLIM2 проводили методом ОТ-ПЦР с праймерами к различным экзонам гена. Продукты амплификации секвенировали чтобы избежать возможных ошибок. Также было выявлено наличие двух изоформ мРНК гена ABLIM2. Изоформа а состоит из последовательностей 20 экзонов, а изоформа б — из последовательностей 18 экзонов (отсутствуют экзоны 16 и 17). Обе изоформы зарегистрированы в EMBL database (изоформа а - AJ748601, изоформа б — AJ748600). Промоторная область и содержащиеся в ней сайты связывания факторов транскрипции, были определены и проанализированы с помощью серии программ.

Поиск нуклеотидных последовательностей, гомологичных мРНК гена АВЫМ2 человека, позволил выявить сходные мРНК крысы, мыши и рыбы Вап'ю гепо. Экзон-интронная структура гена АЬИт2 крысы и мыши была построена и экспериментально проверена по той же схеме, что и для человека. В геноме мыши АЫ1т2 находится в области 5В2 (контиг 1чГГ_039302), а в геноме крысы в области 14ц21 (контиг N^4)47429).

Таблица 3. Количество и длина экзонов гена АВЫМ2 человека, грызунов и рыбы. Экзоны 16 и 17 отсутствуют в изоформе б. Отличающиеся по длине экзоны человека и грызунов выделены зеленым. Отличия длин экзонов у рыбы

выделены синим.

Экзоны Человек Крыса Мышь Рыба

S'-UTR 65 127 127 26*

1. 10 10 10 16

2. 144 144 144 156

3. 184 184 184 184

4. 116 116 116 113

5. 127 127 127 127

6. 94 94 94 94

7. 88 88 88 88

8. 59 59 59 59

9. 78 78 78 78

10. 147 150 150 144

11. 121 121 121 118

12. 102 102 102 102

13. 54 54 54 54

14. 53 53 53 44

15. 139 139 139 110

16. 62 62 62 0

17. 55 55 55 0

18. 8 8 8 28

19. 81 81 81 81

20. 114 114 114 114

З'-UTR 682 682 684 510*

* - размеры 5' и 3 '-UTR предсказаны с использованием компьютерных программ

Для крысы и мыши также было показано наличие альтернативного сплайсинга: две изоформы - а и б, как у человека. Последовательности гена зарегистрированы в EMBL database: мышь - AJ748602 (изоформа а) и AJ748603

(изоформа б), крысы - AJ703892 (изоформа а) и AJ703893 (изоформа б). Ген крысы зарегистрирован в Rat Genome Database под названием Ablim2 (RGD_ID:1298516). Обе изоформы гена крысы зарегистрированы в Rat Genome Database: изоформа а — RGD_ID:1298518 (Symbol: Ablim2_vl) и изоформа б -RGDJD: 1298519 (Symbol: Ablim2_v2).

Сравнение экзон-интронной структуры гена ABLIM2 человека, крысы и мыши показало значительное сходство. Как видно из таблицы 3, число и длина экзонов совпадают у всех трех организмов. Исключение составил экзон 10, одинаковый у крысы и мыши, но отличающийся у человека. Здесь произошла делеция одного триплета, по-видимому, не влияющая на функциональную активность белка. 5'-UTR гена была одинакова у крысы и мыши, но почти в 2 раза короче у человека. Для всех организмов было показано наличие сайта полиаденилирования на расстоянии 682 (684 для мыши) нуклеотида от стоп-кодона. Эти данные были подтверждены экспериментально. Старт транскрипции у крысы был подтвержден методом ОТ-ПЦР с использованием праймера к началу первого экзона.

Нуклеотидные отличия в длине экзонов у рыбы всегда кратны трем, то есть открытая рамка считывания не сбивается. Исключение составляют экзоны 15 и 18, однако в сумме разница их длины также кратна трем.

Промоторные области крысы и мыши имели гомологию 95%. Сравнение промоторных областей человека, крысы и мыши выявило сходное расположение сайтов связывания ТФ. У человека имелось два сайта связывания для NRSF (Neural-restrictive-silencer-factor), один из которых находился перед старт-кодоном. Данный ТФ ограничивает экспрессию нейрон-специфичных генов в других клетках. У крысы и мыши сайт связывания для NRSF один и он также находился перед старт-кодоном. Помимо NRSF у всех трех организмов имелся сайт связывания для ТФ WT1. Учитывая наличие сайтов связывания для двух репрессоров нейрональных генов, можно предположить, что экспрессия гена ABLIM2 ограничена нейронами.

Белок АВЫМ2 содержит четыре ЫМ-домена в 1\1-концевой области и С-коицевой УНР-домсн, что указывает на его участие в процессах развития и функционирования клеток. ЫМ-домен предположительно имеет ДНК связывающую функцию [Регег-А1уагас1о й а!., 1994]. УНР-домен участвует во взаимодействии с актином [Капа е1 а1., 1993; Doering е! а!., 1996].

1 100 200 300 «00 БОО 573

не

1ЛМ \ussm 1 им [ 1ЛМ

' ' ' ...... ■

■ ЧМЯЧиИ ■ЧМИЧЙИ

1 100 200 300 400 500

ММ : : ! 1 : _' '

им I им

д хуу ¿«и ОМУ ТУУ

ОН..... ...... 1 '

1ЛМ I 1_1М Ш 1ЛМ У ИМ

Рисунок 11. Доменная организация белков АВЫМ2 человека (7/5), крысы (ЯМ), мыши (ММ) и рыбы Пато гегю фЯ).

Аминокислотные последовательности белка АВЫМ2 человека, мыши, крысы и рыбы имеют высокий процент сходства, а доменная структура белков имеет полное сходство (рис. 11). Этот свидетельствует в пользу консервативности функции данного белка.

Для определения тканеспецифичности экспрессии была использована панель РНК, выделенной из различных органов и тканей крысы. Для ее скрининга использовали праймеры к 2 и 11 экзонам и праймеры к 13 и 20 экзонам. Наибольшая экспрессия гена АЬИт2 была обнаружена в отделах мозга и в глазу. В остальных тканях наблюдались следовые количества мРНК (рис. 12).

Во всех тканях крысы были обнаружены обе формы мРНК гена АЬИт2 (см. рис. 12 а и Ь). Таким образом, сделанные на основе анализа промоторной области выводы о нейрон-специфичности экспрессии гена полностью подтвердились (рис. 12 с). Исходя из полученных нами данных, можно утверждать, что белок АВ1ЛМ2 необходим для нормального функционирования нейронов.

>°ь * / у

Gapdh

pituitary gland

Gapdli

kidney

spinal cord

Oaprfft

heart skeletal muscle

lung

spleen

Рисунок 12. Электрофореграмма ОТ-ПЦР с праймерсши: А) к экзонам 13 и 20. (Видно наличие фрагмента длинной 552 п.н. - изоформа а, и фрагмента длинной 435 п.н. - изоформа б. В) к экзонам 2 и 11. Gapdh - контрольный ген. С) Диаграмма, отображающая транскрипционную активность АЬИт2 крысы. В качестве контроля - средняя активность гена GAPDH во всех анализированных тканях.

5.4. Ген WASF4 - новый член семейства генов WAS Ген WASF4 человека картирован нами на хромосоме X и принадлежит к семейству генов, кодирующих WAS-белки (Wiskott-Aldrich syndrome). Белки этого семейства играют важную роль в полимеризации актина и реорганизации цитоскелета. Данное семейство включает 5 генов человека: WASF1 (6q21-q22),

WASF2 (Ip36.11-p34.3), WASF3 (13ql2), WAS (Xpl 1.4-pl 1.21) и WASL (7q31.3). Все белки, кодируемые данными генами, имеют сходную доменную структуру.

С помощью компьютерных программ нами было выявлено 3 экзона гена WASF4 и промоторный участок, содержащий сайты связывания для основных факторов транскрипции, а также старт транскрипции. Все экзоны фланкированы каноническими сайтами сплайсинга (.. .ag-exon-gt...).

Предполагаемый аминокислотный продукт изучаемого гена (543 а.к.) имеет высокий уровень сходства (89%) с белком человека WASF2 (498 а.к.) и такую же доменную структуру, что позволяет считать эти белки гомологами, принадлежащими к одному семейству.

Выравнивание аминокислотных последовательностей WASF4 и трех белков WASF человека и мыши показывает, что WASF4 ближе всего к WASF2 человека, который, по всей видимости, и является его предшественником. В пользу этой гипотезы, свидетельствует отсутствие последовательности WASF4 в геномах рыб, грызунов, собаки и др. Однако, у шимпанзе и макаки обнаруживаются участки генома, гомологичные экзонам 2 и 3 гена WASF4 человека (табл. 4).

Таблица 4. Длина экзонов и интронов гена WASF4 человека и шимпанзе, процент гомологии.

Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3*

Человек 18 558 304 4391 1501

Шимпанзе 18 510 304 4378 1525

% сходства 25.9% 68.1% (фрагмент 314 п.н. - 99%) 99.1% 75.8%** 95.5%

* -до стоп-кодона включительно (ТАА)

** - в интроне шимпанзе имеется участок неизвестной последовательности (N507)

5'-[/77? не сравнивалась, у шимпанзе имеется участок неизвестной последовательности (N1239)

Наличие схожих последовательностей только в геноме приматов позволяет предположить, что последовательность гена \VASF4 появилась недавно. Её появление, скорее всего, может быть связано с интеграцией части процессированной кДНК гена \VASF2 в область Хр11.2.

Остается не выясненным вопрос о транскрипционной активности гена WASF4. Нам не удалось показать экспрессию гена WASF4 в тканях человека (молочная железа, почка, легкое, яичник, шейка матки, кровь). Возможно, его экспрессия ограничена определенным временным отрезком и/или тканями/клетками, которые мы не анализировали.

6. АНАЛИЗ ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ ССК, CCK1R, CCK2R И CCR5

Гены ССК и CCR5 локализованы на хромосоме 3 человека областях Зр22.1 3р21.31, соответственно. Наш интерес к этим генам обусловлен их участием в патогенезе двух социально значимых заболеваний: панические расстройства (ССК) и СПИД (CCR5).

6.1. Анализ частот аллелей генов ССК, CCK1R, CCK2R в случайной выборке

жителей Москвы

С тех пор как были обнаружены паникогенные свойства холецистокинина, гены нейропептида ССК и его рецепторов CCK1R, CCK2R, а также мутации в них, активно изучаются. Предполагается, что гены нейропептида холецистокинина (ССК) и его рецепторов (CCK1R и CCK2R), а также мутации в них вовлечены в развитие панических расстройств. Однако их роль в патогенезе этого заболевания до сих пор не ясна. Поэтому несомненный практический интерес представляет анализ частот аллелей генов холецистокининэргической системы человека у жителей мегаполисов.

Нами были оценены частоты встречаемости семи SNP, расположенных в генах холецистокинина и его рецепторов, методом ПЦР-ПДРФ на случайной выборке жителей Москвы, этническая принадлежность индивидуумов не учитывалась. Объем исследованной выборки 198 человек, выборка разнородна по половозрастному составу (107 женщин и 91 мужчина в возрасте от 18 до 57 лет). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Arlequin 3.11. Определенные нами частоты встречаемости полиморфных вариантов генов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Исследованные SNP в генах ХЦК-системы и полученные значения частот.

Ген (позиция) Замена Расположение в гене Регистрационный номер Частоты аллелей

ССК (-36) С Т промотор 11571842 0.43 0.57

ССК (-325) G А 5' регуляторная область 1799923 0.90 0.10

CCK1R (-81) А G промотор 1799723 0.95 0.05

CCK1R (-128) G Т промотор 1800908 0.97 0.03

CCK1R (984) С интрон 1 1800857 0.85 0.15

CCK2R (109) с т экзон 1 1805000 1.00 0.00

CCK2R (1550) G А экзон 2 1805002 0.88 0.12

Таким образом, нами впервые определены частоты семи SNP в генах ХЦК-системы человека в случайной выборке жителей Москвы. Полученные нами данные в дальнейшем будут использованы в качестве группы сравнения в ассоциативных исследованиях с привлечением выборки индивидуумов, страдающих паническими расстройствами для определения степени вовлеченности исследуемых замен в патогенез патологической тревожности.

6.2. Ген CCR5

(работа выполнена совместно с Апрятиным С.А. и Рахманачиевым Э.Р.)

Одним из факторов естественной резистентности к инфицированию М-тропным вариантом ВИЧ1 являются мутации CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека. Мутация CCR5del32 представляет собой делецию в 32 пары нуклеотидов (мутация CCR5del32) в позиции 794-825 открытой рамки считывания гена CCR5 (chemokine (С-С motif) receptor 5) [Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et al., 1996]. Мутация CCR5m303 является однонуклеотидной заменой тимина на аденин в позиции 303 открытой рамки считывания гена CCR5, которая приводит к появлению стоп-кодона и прекращению синтеза белка

[Quillent et al., 1998; Ometto et al, 1999; Voevodin et al, 1999; Beretta et al, 2000; Wang et al., 2003].

При наличии любой из этих мутаций, ВИЧ1 не может использовать рецептор CCR5 в качестве корецептора для проникновения в клетку, поскольку транслируется функционально неактивный рецептор. Случаи гомозиготного состояния мутаций CCR5del32 и CCR5m303, а также присутствие обеих мутаций у одного индивидуума в гетерозиготном состоянии в транс-положении обеспечивают защиту от инфицирования ВИЧ1 при половом пути передачи. Гетерозиготные по CCR5del32 индивидуумы не защищены от инфицирования ВИЧ, однако, по некоторым данным в случае заражения у таких пациентов ВИЧ-инфекция прогрессирует медленнее по сравнению с индивидуумами, не несущими мутаций CCR5del32 [Гришаев и др., 1999].

Информация о присутствии мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека позволяет прогнозировать течение заболевания и возможность заражения вирусом иммунодефицита человека в группах риска. 6.2.1. Сравнение частот мутации CCR5del32 в гене CCR5 человека у русских, тувинцев, а также в группах ВИЧ-инфицированных индивидуумов

Целью данной части работы было типирование инфицированных и здоровых индивидуумов, жителей Москвы, Мурманска и тувинцев на наличие мутации CCR5del32 и сравнение частот этой мутации у ВИЧ-серонегативных представителей разных этнических групп, а также у ВИЧ-серопозитивных пациентов, инфицированных половым (М-тропными вариантами ВИЧ-1) и парентеральным (Т-тропными вариантами ВИЧ-1) путями.

На основании полученных результатов был проведен сравнительный анализ частоты мутации CCR5del32 в исследуемых группах. Частота аллельного варианта CCR5del32 в гене CCR5 человека составила 7,8% в группе русских и 2,0% в группе тувинцев. Ни в одной из двух исследованных популяций не было обнаружено гомозигот по мутации CCR5del32. Примерно одинаковая частота аллеля CCR5del32 в группах ВИЧ-инфицированных и неинфицированных лиц (7,94% и 6,11%, соответственно) говорит о том, что гетерозиготный генотип не

является протективным при половом пути передачи ВИЧ-инфекции. В группе ВИЧ-серонегативных индивидуумов выявлено два гомозиготных образца СС115с1е132/ССН.5с1е132, тогда как в группе ВИЧ-позитивных ни одного гомозиготного образца обнаружено не было. Частота аллеля СС115с1е132 в группе индивидуумов инфицированных половым путем составила 6,45%, тогда как в группе инфицированных парентеральным путем - 8,73%. Однако, различия в частотах статистически недостоверны ('£=0,29, р=0,78). В группе с неопределенным путем инфицирования частота аллеля СС115(1е132 составила 7,69%. Ни в одной группе не было обнаружено гомозигот ССЯ5с1е132/ССК5с1е132.

Таким образом, гетерозиготный генотип, хотя, и снижает вероятность инфицирования, но не обеспечивает устойчивости к инфицированию. Полную защиту от инфицирования М-тропным вариантом ВИЧ-1 может обеспечить только наличие мутации СС115(1е132 в гомозиготном состоянии.

Необходимо отметить, что соотношение аллелей ССЯ5 дикого типа и ССЯ5с1е132 гена ССЯ5 находится в равновесии. Следовательно, можно предположить, что исследованная популяция находится в равновесии по данному локусу и, скорее всего, не оказывает негативного воздействия на человека, поскольку лиганды рецептора ССЯ5 могут использовать другие хемокиновые рецепторы. Проведенное исследование частоты мутации СС115(к132 в различных группах ВИЧ-инфицированных и неинфицированных индивидуумов является важным для понимания механизма заражения и патогенеза ВИЧ-инфекции, а также для назначения индивидуальной схемы антиретровирусной терапии для ВИЧ-инфицированных с учетом особенностей их генотипа.

6.2.2. Разработка тест-системы для одновременного определения двух мутаций в гене ССЯ5 (ССЯ5(1е132 и ССК5тЗОЗ) Нами разработан способ одновременного определения двух мутаций (СС115с1е132 и ССЯ5тЗОЗ), которые независимо друг от друга влияют на генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа. Достигается это тем, что используется

амплификация фрагмента гена CCR5 с использованием двух праймеров, комплементарных двум участкам гена CCR5, расположенным, соответственно, с 5' и 3' стороны выявляемых делеционной и однонуклеотидной мутаций, с последующей рестрикцией продуктов ПЦР эндонуклеазой Hincll (HindiI).

Возможные результаты генотипирования с использованием

разработанной нами тест-системы представлены в таблице 6.

Таблица 6. Длины фрагментов, получаемые при генотипировании аллельных вариантов CCR5del32 (А32) и CCR5m303 гена CCR5 человека методом ПЦР-ПДРФ с праймерами CCR5F и CCR5R и последующей обработкой продуктов ПЦР эндонуклеазой Hincll, и соответствующие им генотипы.

CCR5 wt/wt* wt/wt wt/wt wt/m303 wt/m303 wt/m303 Wt/m303 тЗОЗ/ тЗОЗ/ тЗОЗ/

Генотип (тЗОЗ) тЗОЗ тЗОЗ тЗОЗ

CCR5 (Д32) wt/wt «Л/Д32 Д32/Д32 wt/wt wt/fl32 (транс) wt/дзг (ЦИС) Д32/Д32 wt/wt wt/fl32 Д32/Д32

620 620 620 620

Длины 588 588 588 588

фрагментов (п.н.) 419 419 387 387 419 387 419 387

201 201 201 201 201 201 201

*wt — wild type (дикий тип, отсутствие мутации)

Таким образом, нами разработана новая, более эффективная тест-система, которая может найти применение в медицине при диагностике наследственной генетической устойчивости индивидуума к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) и быстрому прогрессированию к синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД).

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Построена интегрированная физическая Notl-карта хромосомы 3 человека на основе данных радиационного картирования, контиг-картирования области Зр21-р22 и картирования методом флуоресцентной гибридизации in situ, включающая 60 Notl-STS-маркеров. NotI-STS-маркеры и построенная на их основе Notl-карта эффективны для проверки совмещения и взаимного расположения геномных контигов человека.

NotI-STS-маркеры можно рассматривать как универсальные маркеры генов.

2. Активация транскрипции онкогена RHO А в опухолях происходит как за счет умножения копий гена, так и посредством деметилирования CpG-островков промоторного района.

3. Впервые показано изменение содержания мРНК гена SEMA3B в четырех видах рака (молочной железы, толстой кишки, светлоклеточный почечноклеточный, немелкоклеточный рак легкого и эпителиальный рак яичников). Снижение уровня транскрипции этого гена характерно для светлоклеточного почечноклеточного рака, а также рака толстой кишки и эпителиального рака яичников.

4. Экспрессия генов DAG1, RARB2, GPX1 (изоформа 1) достоверно увеличивается в опухолях молочной железы.

5. Впервые показано увеличение экспрессии генов RHOA, SEMA3B и СКАР2 в крови больных различными типами лейкозов.

6. Выявлена транскрипционная активность новых некодирующих белок генов W91914 (методом количественной ПЦР в реальном времени) и H5I703 (методом полуколичественной ПЦР) в опухолевых и нормальных тканях человека.

7. Описана экзон-интронная структура генов ABLIM2, СКАР2, WASF4 и NBEAL2 человека, выявлена крнсервативность генов ABLIM2 и NBEAL2 и их белковых продуктов у чаловека, мыши и крысы. Продемонстрирована органоспецифичность экспрессии генов Ablim2 и Nbeal2 у крысы.

8. Места интеграции транскрибируемой в клетках плоскоклеточного рака шейки матки ДНК вируса папилломы тип 16 локализованы в активно транскрибируемых областях генома.

9. Близлежащие с 3'-конца интегрированной ДНК ВПЧ16 участки полиаденилирования генома клетки-хозяина могут быть использованы для терминации транскрипции вируса.

10. Создана тест-система для одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ РАБОТ

1. Сулимова Г.Е., Компанийцев A.A., Кунижева С.С., Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Удина И.Г. Картирование в геноме человека EST- и STS-маркеров с использованием панели радиационных гибридов // Генетика. 2000. Т.36. № 7. С.900-907.

2. Сулимова Г.Е., Компанийцев A.A., Мойсяк Е.В., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Удина И.Г., Захаров И.А. Радиационное картирование как один из основных методов построения физических карт геномов человека и животных с высоким уровнем разрешения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т.40. №5. С.520-528.

3. Дергунова JI.B., Раевская Н.М., Владыченская И.П., Полтараус А.Б., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Лимборская С.А. Мозгоспецифическая последовательность Hfbl входит в состав протяженной 3'- нетранслируемой области гена комплексина 2 человека: новые данные in vitro и in silico экспериментов // Молекулярная биология. 2001. Т.35. № 5. С.778-786.

4. Eugene Klimov, Svetlana Vinokourova, Elena Moisjak, Elian Rakhmanaliev, Vera Kobseva, Laimonis Laimins, Fjodor Kisseljov, Galina Sulimova. Human papilloma viruses and cervical tumors: mapping of integration sites and analysis of adjacent cellular sequences // BMC Cancer. 2002. 2:24.

5. Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компанийцев А.А., СулимоваГ.Е.. Структура гена СКАР2 (LB1), вовлеченного в процессы онкогенеза человека // Молекулярная биология. 2002. Т.36. №6. С.985-989.

6. Sulimova G.E., Kutsenko A.S., Rakhmanaliev E.R., Udina I.G., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Human chromosome 3: integration of 60 Not\ clones into a physical and gene map // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.98. P.177-183.

7. Рахманалиев Э.Р., Апрятин C.A., Николаева И.А., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Способ одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) // Патент RU 2249619 С2. от 23.04.2003.

8. Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Сулимова Г.Е. Методы картирования геномов млекопитающих // Успехи современной биологии. 2004. Т.124. №3. С.286-302.

9. Сулимова Г.Е., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компанийцев А.А., Удина И.Г., Забаровский Е.Р., Киселев JI.JI. Notl-STS как маркеры генов хромосомы 3 человека // Молекулярная биология. 2005. Т.39. №4. С.687-701.

10. Eugene Klimov, Olga Rud'ko, Elian Rakhmanaliev, Galina Sulimova. Genomic organisation and tissue specific expression of ABLIM2 gene in human, mouse and rat // BBA - Gene Structure and Expression. 2005. V.1730/1. P.l-9.

11. Апрятин C.A., Рахманалиев Э.Р., Николаева И.А., Рубан С.В., Вазыхова Ф.Г., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Мутация CCR5del32 в гене CCR5 человека влияет на устойчивость к инфицированию М-тропным вариантом ВИЧ-1 // Генетика. 2005. Т.41. №11. С.1559-1562.

12. Debora Angeloni, Arja ter Elst, Ming Hui Wei, Anneke Y. van der Veen, Eleonora

A. Braga, Eugene A. Klimov, Tineke Timmer, Luba Korobeinikova, Michael I.

Lerman and Charles H.C.M. Buys. Analysis of a new homozygous deletion in the

tumor suppressor region at 3pl2.3 reveals two novel intronic non-coding RNA genes // Genes, Chromosomes & Cancer. 2006. V.45. №7. P.676-691.

13. Брага ЭЛ., Логинов В.И., Климов E.A., Килосанидзе Г., Ходырев Д.С., Каганова Н.Л., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Пронина И.В., Рудько О.И., Забаровский Е.Р., Сулимова Г.Е., Киселев Л.Л.. Транскрипция онкогена RHOA в эпителиальных опухолях активируется посредством умножения копий гена и/или деметилирования промоторного района // Молекулярная биология. 2006. Т.40. №5. С.865-877.

14. Е.А. Климов. Потенциальные сигналы терминации транскрипции интегрированной ДНК вируса папилломы человека: анализ in silico II Молекулярная биология. 2008. Т.42. №1. С.178-180.

15. Е.А. Климов, Э.Р. Рахманалиев, Г.Е. Сулимова. WASF4 - новый член семейства генов WAS // Молекулярная биология. 2008. Т.42. №4. С.625-628.

16. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Е.А. Климов, B.C. Прасолов, Д.С. Ходырев, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Т.Е. Сулимова, Э.А. Брага. Профили изменения экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях // Молекулярная биология. 2009. Т.43. №3. С.439-445.

17. Коробейникова Л.А., Климов Е.А. Полиморфизм генов ССК, CCK1R и CCK2R у жителей Москвы // Медицинская генетика. 2010. Т.9. №4. С.40-43

18. Е.А. Климов. Интеграции вирусов папилломы человека в геном клетки хозяина и патогенез рака шейки матки // Успехи современной биологии. 2010. Т. 130. №4. С.381-389.

Автор выражает глубокую благодарность проф. Г.Е. Сулимовой и член-корр. РАН И.А. Захарову-Гезехусу за постоянный интерес к данным исследованиям, их поддержку, за обсуждение результатов представленных в диссертационной работе, за полезные критические замечания, советы и помощь в подготовке диссертационной работы.

Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам, аспирантам и студентам, работавшим в лаборатории сравнительной генетики животных в период с 1998 по 2010 годы, а также всем коллегам, в сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: проф. Ф.Л. Киселеву, проф. Е.Р. Забаровскому, Э.А. Брага, В.И. Логинову, И.В. Прониной, Д.С. Ходыреву, С.А. Апрятину. А также О.И. Рудько за моральную поддержку в процессе работы и написании рукописи.

Подписано в печать 15 сентября 2010 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 198 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-кт, д.37

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Климов, Евгений Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. RH-КАРТИРОВАИИЕ И АНАЛИЗ Notl-STS-MAPKEPOB 14 ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА, АССОЦИАЦИЯ Notl-STS С ГЕНАМИ

1.1. ВВЕДЕНИЕ

1.2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

1.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.3.1. Создание STS к Notl-клонам хромосомы 3 человека и их локализации.

1.3.2. Определение локализации маркеров на RH-карте.

1.3.3. Совмещение RH-карты с другими типами карт и построение физической Notl-карты хромосомы 3 человека.

1.3.4. Поиск гомологий NotI-STS-маркеров с генами и EST человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Картирование и анализ генов и функционально-значимых последовательностей генома человека"

2.4.1.1. Ген RARB 94

2.4.1.2. Ген GPX1 97

2.4.1.3. Ген DAG 99

2.4.2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 101

2.4.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 103

2.4.3.1. Ген RARB 103

2.4.3.2. Ген GPX1 106

2.4.3.3. Ген DAG 109

2.5 АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ 111 НОВЫХ БЕЛОК-НЕКОДИРУЮЩИХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА W91914 И Н51703 В ОПУХОЛЕВЫХ И НОРМАЛЬНЫХ ТКАНЯХ

2.5.1 УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 114

2.5.2. РЕЗУЛЬТАТЫ 116

2.5.3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 122

2.6. СТРУКТУРА И ОРГАНОСПЕЦИФИЧНОСТЬ 125 ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Nbeal2 КРЫСЫ И ЭКСПРЕССИЯ ЕГО ГОМОЛОГА NBEAL2 В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

2.6.1. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 126

2.6.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 128

2.6.2.1. Анализ структуры-и тканеспецифичности 128 экспрессии у человека и модельных организмов

2.6.2.2. Анализ изменения уровня экспрессии гена КВЕАЬ2 129 человека в норме и опухоли

2:7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 131

3. КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ МЕСТ ИНТЕРРАЦИИ ВИРУСА 133 ПАПИЛЛОМЫ В ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА

3.1. ВВЕДЕНИЕ 133

3.2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 13 5

3.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 136

3.3.1. Локализация методом ЯН-картирования 136 последовательностей генома человека, прилегающих к местам встраивания вируса папиллом

3.3.2. Локализация т яШсо последовательностей, 143 прилегающих к местам встраивания ВПЧ16 в геноме человека

3.3.3. Поиск сходства последовательностей, прилегающих к 147 местам встраивания ВПЧ16, с экспрессирующимися последовательностями человека

3.3.4. Анализ нуклеотидных последовательностей генома 152 человека, прилегающих к местам встраивания ВПЧ16

3.4. Поиск последовательностей генома клетки-хозяина, способных 153 терминировать транскрипцию интегрированной ДНК вируса

3.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 156

4. ЯН-КАРТИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ 157 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

4.1. Картирование пяти Е8Т-маркеров в геноме человека 157

4.2. Картирование З'-нетранслируемой области гена комплексина 2 159 человека

5. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТИ 163 ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ГОМОЛОГОВ У МОДЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ

5.1. СТРУКТУРА ГЕНА СКАР2 ЧЕЛОВЕКА И АНАЛИЗ ЕГО 164 ЭКСПРЕССИИ В ОПУХОЛИ И НОРМЕ

5.1.1. ВВЕДЕНИЕ 164

5.1.2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 165

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Климов, Евгений Александрович

основные выводы

NotI-STS-маркеры можно рассматривать как универсальные маркеры генов.

4. Экспрессия генов DAG1, RARB2, GPX1 (изоформа 1) достоверно увеличивается в опухолях молочной железы.

5. Впервые показано увеличение экспрессии генов RHOA, SEMA3B и СКАР2 в крови больных различными типами лейкозов.

6. Выявлена транскрипционная активность новых некодирующих белок генов W91914 (методом количественной ПЦР в реальном времени) и Н51703 (методом полуколичественной ПЦР) в опухолевых и нормальных тканях человека.

7. Описана экзон-интронная структура генов АВЫМ2, СКАР2, ЖАБЕ4 и ЫВЕАЬ2 человека, выявлена крнсервативность генов АВЫМ2 и ИВЕАЬ2 и их белковых продуктов у чаловека, мыши и крысы. Продемонстрирована органоспецифичность экспрессии генов АЬИт2 и ЫЬеа12 у крысы.

10.Создана тест-система для одновременного определения мутаций ССЯ5с1е132 и ССЯ5т303 в гене ССЯ5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1). список опубликованых работ

Потеме работы имеется. 17 статей) в рецензируемых журналах, 1 патент и> около 60 тезисов и статей в сборниках конференций. Ниже приведен список статей в хронологическом порядке и с указанием разделов, в которых представлены опубликованные данные.

Статьи Раздел

1. Сулимова Г.Е., Компанийцев A.A., Кунижева С.С., Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Удина И.Г. Картирование в геноме человека EST- и STS- , . маркеров с использованием панели радиационных гибридов // Генетика. 2000. ' Т.36. № 7. С.900-907.

2. Сулимова Г.Е., Компанийцев A.A., Мойсяк Е.В., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Удина И.Г., Захаров И.А. Радиационное картирование как один из основных методов построения * физических карт геномов человека и 1,3,4 животных с высоким уровнем разрешения' // Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т.40. №5. С.520-528.

3. Дергунова JI.B., Раевская Н.М., Владыченская И.П., Полтараус А.Б., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Лимборская С.А. Мозгоспецифическая последовательность Hfbl входит в состав протяженной 3'- нетранслируемой 4 области гена комплексина 2 человека: новые данные in vitro и in silico экспериментов // Молекулярная биология. 2001. Т.35. № 5. С.778-786.

4. Eugene Klimov, Svetlana Vinokourova, Elena Moisjak, Elian Rakhmanaliev, Vera Kobseva, Laimonis Laimins, Fjodor Kisseljov, Galina Sulimova. Human -papilloma viruses and cervical tumors: mapping of integration sites and analysis of adjacent cellular sequences // BMC Cancer. 2002. 2:24.

5. Рахманалиев Э.Р., Климов E.A., Компанийцев A.A., Сулимова Г.Е. Структура гена СКАР2 (LB1), вовлеченного в процессы онкогенеза человека 5 //Молекулярная биология. 2002. Т.36. №6. С.985-989.

6. Sulimova G.E., Kutsenko A.S., Rakhmanaliev E.R., Udina LG., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.l., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Human 1 chromosome 3: integration of 60 Not\ clones into a physical and gene map // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.98. P.177-183.

7. Рахманалиев Э.Р., Апрятин С.А., Николаева И.А., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Способ одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека, обуславливающих ¿ генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) // Патент RU 2249619 С2. от 23.04.2003.

8. Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Сулимова Г.Е. Методы картирования j геномов млекопитающих // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. №3.

С.286-302.

9. Сулимова Г.Е., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компанийцев А.А., Удина И.Г., Забаровский Е.Р., Киселев JT.JI. Notl-STS как маркеры генов хромосомы 1 3 человека//Молекулярная биология. 2005. Т.39. №4. С.687-701.

10. Eugene Klimov, Olga Rud'ko, Elian Rakhmanaliev, Galina Sulimova. Genomic organisation and tissue specific expression of ABLIM2 gene in human, 5 mouse and rat // BBA - Gene Structure and Expression. 2005. V.1730/1. P.l-9.

11. Апрятин C.A., Рахманалиев Э.Р., Николаева И.А., Рубан С.В., Вазыхова Ф.Г., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Мутация CCR5del32 в g гене CCR5 человека влияет на устойчивость к инфицированию М-тропным вариантом ВИЧ-1 //Генетика. 2005. Т.41. №11. С.1559-1562.

12. Debora Angeloni, Arja ter Elst, Ming Hui Wei, Anneke Y. van der Veen, Eleonora A. Braga, Eugene A. Klimov, Tineke Timmer, Luba Korobeinikova, Michael I. Lerman and Charles H.C.M. Buys. Analysis of a new homozygous 2 deletion in the tumor suppressor region at 3pl2.3 reveals two novel intronic non-coding RNA genes // Genes, Chromosomes & Cancer. 2006. V.45. №7. P.676-691.

13. Брага Э.А., Логинов В.И., Климов E.A., Килосанидзе Г., Ходырев Д.С., Каганова Н.Л., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Пронина И.В., Рудько О.И., Забаровский Е.Р., Сулимова Г.Е., Киселев Л.Л. ^ Транскрипция онкогена RHOA в эпителиальных опухолях активируется посредством умножения копий гена и/или деметилирования промоторного района // Молекулярная биология. 2006. Т.40. №5. С.865-877.

14. Е.А. Климов. Потенциальные сигналы терминации транскрипции интегрированной ДНК вируса папилломы человека: анализ in silico // 3 Молекулярная биология. 2008. Т.42. №1. С. 178-180.

16. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Е.А. Климов, B.C. Прасолов, Д.С. Ходырев,

Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Г.Е. Сулимова, Э.А. Брага. Профили ~ изменения экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях // Молекулярная биология. 2009. Т.43. №3. С.439-445.

17. Коробейникова Л.А., Климов Е.А. Полиморфизм генов ССК, CCK1R и , CCK2R у жителей Москвы // Медицинская генетика. 2010. Т.9. №4. С.40-43.

18. Е.А. Климов. Интеграции вирусов папилломы человека в геном клетки хозяина и патогенез рака шейки матки // Успехи современной биологии. 2010. 3 Т. 130. №4. С.381-389.

315. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью метода КН-картирования была определена физическая локализация пяти геномных, последовательностей, прилегающих к местам встраивания транскрибируемой ДНК ВПЧ16 в хромосомы человека (маркеры ШТ) в клетках плоскоклеточного рака шейки матки. Повторная.локализация? т бШсо этих, маркеров подтвердила результаты КН-картирования. Семь других маркеров ШТ были локализованы только т бШсо, что стало возможным после появления в банках данных более полного варианта черновых последовательностей генома человека:

Анализ мест локализации маркеров ПЧТ и их сходства с экспрессирующимися последовательностями' генома человека позволил нам высказать предположение, о предпочтительном, встраивании ДНК вируса в районы хромосом, характеризующиеся активной транскрипцией. Необходимо иметь в виду, что предположение о предпочтительном встраивании ДНК ВПЧ16 в активно транскрибируемые области генома человека правомочно только для транскрибируемой ДНК вируса папилломы. Этот феномен можно объяснить тем, что активно транскрибируемые последовательности находятся в деконденсированном состоянии, облегчающем интеграцию чужеродного генетического материала и последующею его транскрипцию.

Анализ т бШсо клеточных последовательностей, расположенных с 3'-конца далее от места интеграции, показал наличие в них сигнала терминации транскрипции (содержащего сайт полиаденилирования). Это позволяет предположить, что транскрипция интегрированной ДНК вируса происходит до ближайшего с З'-конца сигнала терминации транскрипции генома клетки.

Результаты анализа мест интеграции ДНК вируса и прилегающих к ним последовательностей генома человека позволяют лучше понять, как происходит взаимодействие вирусного и клеточного геномов, приводящее к возникновению рака шейки матки.

4. rh-картироваиие экспрессирующихся последовательностей генома человека в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р., Компанийцев A.A., Мойсяк Е.В., Кунижееа С. С. и Удина И.Г.)

4.1. Картирование пяти EST-маркеров в геноме человека

Особый интерес представляют ДНК-маркеры, связанные с развитием онкологических заболеваний человека. Методом RH-картирования были достоверно картированы (lod>3,0) пять EST-маркеров. Среди картированных EST-маркеров два (CLL-5 и Leul) созданы на основе нуклеотидных последовательностей, локализованных методом FISH-гибридизации в области 13ql4, для которой описаны множественные делеции у больных B-клеточным хроническим лимфолейкозом [Liu et al., 1997].

RH-картирование. Проводили ПЦР скрининг панели радиационных гибридов соматических клеток (человек-хомяк) GeneBridge 4 RH-Panel ("Research Genetics Inc.", США). Реакцию ПЦР проводили на термоциклере "РТС-100™ MJ Research Inc." (США) в рабочем объеме 12,5 мкл с использованием "горячего старта" и другими модификациями, предложенными изготовителями набора Maxi-Taq™ (фирма "Биоком", Москва). Использованные в работе праймеры и условия ПЦР представлены в таблице 4.1. Продукты ПЦР разделяли электрофоретически в 6%-ном ПААГ и анализировали в ультрафиолете после окрашивания бромистым этидием.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Климов, Евгений Александрович, Москва

1. Александровский ЮА. Пограничные психические расстройства. Учебное пособие 3-е издание М".: Медицина. 2000. 496С.

2. Баранова A.B., Иванов Д.В., Тяжлова Т.В:, Янковский Н.К. Структурно-функциональная характеристика области 13ql4 генома-человека и поиск в ней потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста // Молекулярная биология. 2004. Т.38. Р.203-212

3. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей // Молекулярная биология. 2004. Т.38. С.179-190.

4. Буякова О.И., Баринова Е.И., Дергунова Л.В., Хаспеков Г.Л., Чивилев И.В., Лимборская С.А. // Генетика. 1992. Т. 28. С.40-46.

5. Васильев Ю.М. Цитоскелетные механизмы диссеминации опухолевых клеток. Вопросы онкологии. 2005. Т.51. №1. С.9-14.

6. Гришаев М.П., Гришаева О.Н. Генетически обусловленная устойчивость к ВИЧ-инфицированию //Новости "Вектор-Бест". 1999. Т. 12. №2. С.3-5.

7. Дергунова Л.В., Владыченская И.П., Полукарова Л.Г., Раевская Н.М., Леликова Г.П., Лимборская С.А. // Молекулярная биология. 1998. Т.32. С.249-254.

8. Е.Р.Имянитов, К.П.Хансон. Фундаментальная онкология: наиболее примечательные события 2004 года // Практическая онкология. 2005 Т.6. №1. С.1-5.

9. П.Зборовская И.Б. Молекулярно-биологические исследования онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста в клинической практике // Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. М. 2000.

10. Эвердинк В., ван ден Берг А., Бауш Ч., Коркоран М., Чапмэн Б., Янковский' Н.К. Космидный контиг и карта кДНК области 13ql4, часто утрачиваемой' при B-клеточном хроническом лимфолейкозе у человека, // Молекулярная биология. 1997. Т.31. С.515-519.

11. Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина П.Ю.', Брага Э.А., Забаровский! Е.Р. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека//Молекулярная медицина: 2005. Т.З. С. 17-28.

12. Н.Киселев Ф.Л., Киселева Н.П., Кобзева В.К., Грицко. T.Mi, Семенова- Л.А., Павлова Л.С., Клэс Р., фон Кнебель Деборитц М. Статус ДНК вируса папиллом человека в опухолях шейки матки // Молекулярная биология. 2001. Т.35. С.470-476.

13. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. 2005. Т.70. С.900-911.

14. Козырева A.A., Трухина A.B., Сазанова А.Л., Смирнов А.Ф. Локализация Notl клонов из хромосомы 3 человека на микрохромосомах перепела // Генетика. 2007. Т.43. С.734-741.

15. Копанцев Е.П., Нестерова Т.Б., Бородин A.M., Закиян С.М. // Генетика. 1993. Т.29. С.1440-1451.

16. Рокицкий П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов // Минск: БГУ, 1961. 223С.

17. Сарафанов А.Г., Кондратов Р.В., Захарьев В.М., Прасолов B.C., Козлов Ю.В. //Молекулярная биология. 1999. Т.ЗЗ. С.413-422.

18. Сломинский П.А., Шадрина М.И., Лимборская С.А., Свердлов Е.Д. Способ определения генетической устойчивости обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) // Патент Российской Федерации RU 2 126 048 С1. 10.02.1999г.

19. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Кунижева С.С., Компанийцев А.А. Создание NotI-STS-маркеров хромосомы 3 человека // Молекулярная-биология. 1999. Т.ЗЗ. С.791-796.

20. Татосян А.Г. Онкогены // Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. М. 2000. С.57-74.

21. Удина И.Г., Баранова А.В., Компанийцев А.А., Сулимова Г.Е. Эволюционно-консервативный ген СКАР2 (LB1) расположен в области генома человека 13ql4.3, часто перестраеваемой в различных опухолях // Генетика. 2001. Т.37. С.120-123.

22. Ходырев Д.С., Логинов« В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников // Генетика. 2008. №44. Т.8. С.1126-1132.

23. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V.215. P.403-410

24. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct. Genomic Proteomic // 2007. V.6. P.19-39.

25. Ashmarin I.P., Danilova R.A., Obukhova M.F., Rud'ko O.I., Andreeva L.A. Long-lasting Changes of Albino Rats Behavior and Brain Bioamines Content After Immunization Against Cholecystokinin-3 and -4 // Neurochem Res. 2007. V.32. P.395-399.

26. Avraham H., Weinberg R.A. Characterization and expression of the human rhoH12 gene product // Mol. Cell Biol. 1989. V.9. P.2058-2066.

27. Bae C.D., Sung Y.S., Jeon S.M., Suh Y., Yang H.K., Kim Y.I., Park K.H., Choi J., Ahn G., Park J. Up-regulation of cytoskeletal-associated protein 2 in primary human gastric adenocarcinomas // J Cancer Res Clin Oncol. 2003. V.129. P.621-630.

28. Baker, C.C., Phelps, W.C., Lindgren, V., Braun, M.J., Gonda, M.A., Howley, P.M. Structural and transcriptional analysis of human papillomavirus type 16 sequences in cervical carcinoma cell lines // J. Virol. 1987. V.61. P.962-971.

29. Bateman A., Birney E., Durbin R., Eddy S.R., Finn»R.D., Sonnhammer E.L. Pfam 1313 multiple alignments and profile HMMs match the majority of proteins // Nucl. Acids Res. 1999. V.27. P.260-262.

30. Beretta A., Quillent C., Arenzana S., Braun J. Human.immunodeficiency virus co-receptor variants associated with resistance to virus infection // United States Patent 6,153,431. November 28, 2000.

31. Berger E.A., Murphy P.M., Farber J.M. Chemokine receptors as HIY-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease // Annu Rev. Immunol. 1999. V.17. P.657-700.

32. Biesova Z., Piccoli C., Wong W.T. Isolation and characterization of e3Bl, an eps8 binding protein that regulates cell growth // Oncogene. 1997. V.14. P.233-241.

33. Bird A.P. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus // Trends Genet.1987. V.3. P.342-347.

34. Brand N., Petkovich M., Krust A., Chambon P., de The H., Marchio A., Tiollais P., Dejean A. Identification of a second human retinoic acid receptor (Letter) // Nature. 1988. V.332. P.850-853.

35. Caceres M, Guerrero J, Martinez J. Overexpression of RhoA-GTP induces activation of the Epidermal Growth Factor Receptor, dephosphorylation of focal adhesion kinase and increased motility in breast cancer cells // Exp Cell Res. 2005. V.309. P.229-238.

36. Cannizzaro L.A., Durst M., Mendez M.J., Hecht B.K., Hecht F. Regional chromosome localization of human papillomavirus integration sites near fragile sites, oncogenes, and cancer chromosome breakpoints // Cancer Genet. Cytogenet.1988. V.33. P.93-98.

37. Carmody, M.W., Jones, M., Tarraza, H., and Vary, C.P. Use of the polymerase chain reaction to specifically amplify integrated HPV-16 DNA by virtue of its linkage to interspersed repetitive DNA // Mol. Cell. Probes. 1996. V.10. P. 107116.

38. Carninci P. et al., Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes // Genome Res. 2000. V.10. P.1617-1630.

39. Castro-Rivera E., Ran S., Thorpe P., Minna J.D. Semaphorin 3B (SEMA3B) induces apoptosis in lung and breast cancer, whereas VEGF165 antagonizes this effect// Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101. P.l 1432-11437.

40. Chada S., Le Beau M.M., Casey L., Newburger P.E. Isolation and chromosomal localization of the human glutathione peroxidase gene // Genomics. 1990. V.6. P.268-271.

41. Chambon P. A decade of molecular biology of retinoic acid receptors // FASEB J. 1996. V.10. P.940-954.

42. Chromczynski P., Sacchi N. Single-step method' of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Analyt. Biochem. 1987. V.162. P.156-159.

43. Cooper M.D., Chae H.P., Lowman J.T., Krivit W., Good R.A. Wiskott-Aldrich syndrome: an immunologic deficiency disease involving the afferent limb of immunity // Am. J. Med. 1968. V.44. P.499-513.

44. Derry J.M.J., Ochs H.D., Francke U. Isolation of a novel gene mutated in Wiskott-Aldrich syndrome // Cell. 1994. V.78. P.635-644.

45. Doering D.S., Matsudaira P., Cysteine scanning mutagenesis at 40 of 76 positions in villin headpiece maps the F-actin binding site and structural features of the domain//Biochemistry. 1996. V.35. P.12677-12685.

46. Dong J-M., Leung T., Manser E., Lim L. cAMP-induced Morphological Changes Are Counteracted by the Activated RhoA Small GTPase and the Rho Kinase ROKa // J. Biol. Chem. 1998. Y.273. P.22554-22562.

47. Doven S.E., Neutze D.M., Pett M.R., Cottage A., Stern P., Coleman N. Stanley M.A. Amplification of chromosome 5p correlates with increased expression- of Skp2 in HPV-immortalized keratinocytes // Oncogene. 2003. V.22. P.2531-2540.

48. Du J., Jiang B., Coffey R.J., Barnard J. Raf and RhoA cooperate to transform intestinal epithelial cells and induce growth resistance to transforming growth factor beta// Mol. Cancer Res. 2004. V.2. P.233-241.

49. Dunwell TL, Hesson LB, Pavlova T, Zabarovska V, Kashuba V, Catchpoole D, Chiaramonte R, Brini AT, Griffiths M, Maher ER, Zabarovsky E, Latif F. Epigenetic analysis of childhood acute lymphoblastic leukemia // Epigenetics. 2009 V.4. P.185-193

50. Eastwood S.L., Burnet P.W., Harrison P.J. Expression of complexin I and II mRNAs and their regulation by antipsychotic drugs in the rat forebrain // Synapse. 2000. V.36. P. 167-177.

51. Erkman L. et al., A POU domain transcription factor-dependent program regulates ■ axon pathfinding in the vertebrate visual system //Neuron: 2000. Y.28. P.779-792.

52. Esteller M., Herman J.G. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours // J Pathol. 2002. V.196. P. 1-7.

53. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology // Nature. 2002. V.420. P.629-635.

54. Fonseca R., Oken M.M., Harrington D. et al. Deletions of chromosome 13 in multiple myeloma identified by interphase FISH usually denote large deletions of the q arm or monosomy // Leukemia. 2001. V.15. P.981-986.

55. Fritz G., Brachetti C., Bahlmann F., Schmidt M., Kaina B. Rho GTPases in human breast tumours: expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters // Br. J. Cancer. 2002. V.87. P.635-644.

56. Fritz G., Just I., Kaina B. Rho GTPases are over-expressed in human tumors // Int. J. Cancer. 1999. V.819. P.682-687.

57. Fu L., Benchimol S. Participation of the human p53 3'UTR in translational repression and activation following gamma-irradiation // EMBO J. 1997. V.6. P.4117-4125.

58. Fujisawa H., Kitsukawa T. Receptors for colapsin/semaphorins // Current Opin. Neurobiol. 1998. V.8. P.587-592.

59. Fukuoka M., Suetsugu S., Miki H., Fukami K., Endo T. et al. A novel neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) binding protein, WISH, induces Arp2/3 complex activation independent of Cdc42 // J. Cell Biol. 2001. V.152. P.471-482.

60. Gilles C., Piette J., Ploton D., Doco-Fenzy M., Foidart J.M.Viral integration sites in human papilloma virus-33-immortalized cervical keratinocyte cell lines // Cancer Genet. Cytogenet. 1996. V.90. P.63-69.

61. Gitai Z. et al., The netrin receptor UNC-40/DCC stimulates axon attraction and outgrowth through enabled and, in parallel, Rac and UNC-115/AbLIM // Neuron. 2003. V.37. P.53-65.

62. Goelden U., Ukena S.N., Pfoertner S., Holmann R., Buer J., Schräder A.J. RAR-beta(l) overexpression in.chromophobe renal cell carcinoma: a novel target for therapeutic intervention // Exp. Oncol. 2005. V.27. P.220-224.

63. Goldman J.G., Goetz C.G., Berry-Kravis E., Leurgans S., Zhou> L. Genetic polymorphisms in Parkinson disease subjects with and1 without hallucinations: an analysis of the cholecystokinin< system//Arch. Neurol. 2004. Y.61. P.1280-1284.

64. Gupta V.K., Schmidt A.P., Pashia M.E. et al. 1999. Multiple regions of deletion on chromosome arm 13q in head-and-neck squamous-cell carcinoma // Int. J. Cancer. V.84. P.453-457.

65. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton // Science. 1998. V.279. P.509-514.

66. Hansen T.O, Rehfeld J.F., Nielsen F.C. Function of the C-36 to T polymorphism in the human cholecystokinin gene promoter // Mol. Psychiatry. 2000. V.5. P.443-447.

67. Hansen T.O. Cholecystokinin gene transcription: promoter elements, transcription factors and signalling pathways // Peptides. 2001. Y.22. P.1201-1211.

68. Harrison P.J.,Eastwood S.L. Preferential involvement of excitatory neurons in medial temporal lobe in schizophrenia // Lancet. 1998. V.352. P.1669-1673.

69. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster // Oncogene. 2007. V.26. P.7283-7301.

70. Hong W.K., Lippman S.M., Hittelmann W.N., Lotan R. Retinoid chemoprevention of aerodigestive cancer: From basic research to the clinic // Clin. Cancer Res. 1995. V.l. P.677-686.

71. Horiuchi A., Imai T., Wang C., Ohira S., Feng Y., Nikaido T., Konishi I. Up-regulation of small GTPases, RhoA and. RhoC, is associated with tumor progression in ovarian carcinoma // Lab. Invest. 2003. V.83. P.861-870.

72. Ibraghimov-Beskrovnaja O., Ervasti J.M., Leveille C.J., Slaughter C.A., Sernett S.W., Campbell K.P. Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix //Nature. 1992. Y.355. P.696-702.

73. Ibraghimov-Beskrovnaja O., Milatovich A., Ozcelik T., Yang B., Francke U., Campbell K.P. Dystroglycan: tissue distribution, human muscle cDNA, genomic structure and chromosome mapping // Am.J.Hum.Genet. 1992. Y.51 (suppl). A130 only.

74. Imperiali M., Thoma C. Pavoni E., Brancaccio A., Callewaert N., Oxenius A. O mannosylation of alpha-dystroglycan in essential for lymphocityc choriomeningitis virus receptor function//J. Virol. 2005. V.79. P. 14297-14308.

75. International Human Genome Sequencing Consortium. 2004. Finishing the euchromatic sequence of the human genome // Nature. V.431. P.931-945.

76. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of human genom //Nature. 2001. V.409. P.860-922.

77. Ise K., Akiyoshi J, Horinouchi Y., Tsutshimi T., Isogava K., Nagayva H. Association between the CCK-A receptor gene and panic disorder // Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2003. V. 118. P.29-31.

78. Ishiguro H., Saito T., Shibuya H., Toru M., Arinami T. No association between C-45T polymorphism in the Spl binding site of the promoter region of the cholecystokinin gene and alcoholism // Psyhiatry Res. 1999. V.85. P.209-213.

79. Ishizuka T., Saisu H., Odani S.s Abe T. Synaphin: a protein associated with the docking/fusion complex in presynaptic terminals // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.213. P.l 107-1104.

80. Ishizuka T., Saisu H., Odani S., Kumanishi T., Abe T. Distinct regional distribution in the brain of messenger RNAs for the two isoforms of synaphin associated with the docking/fusion complex // Neuroscience. 1999. V.88. P.295-306.

81. Ishizuka T., Saisu H., Suzuki T., KirinoV., Abe T. Molecular cloning of synaphins/complexins, cytosolic proteins involved in transmitter release, in the electric organ-of an electric ray (Narke japonica) // Neurosci. Lett. 1997. V.232. P.107-110

82. Itakura M., Misawa- H., Sekiguchi M., Takahashi S., Takahashi* M. Transfection analysis of functional roles of complexin I and II in the exocytosis of two different types of secretory vesicles // Biochem. Biophys. Res. Com. 1999. V.265. P.691-696.

83. Ivanova T., Petrenko A., Gritsko T., Vinokourova S., Eshilev E., Kobzeva V., Kisseljov F., Kisseljova N. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta 2 gene in cervical cancer // BMC Cancer. 2002. 2:4.

84. Johannsmann R., Hellkuhl B., Grzeschik K.-H. Regional assignment of a gene for glutathione peroxidase on human chromosome 3 // Cytogenet. Cell Genet. 1979. V.25. P.167only.

85. Kadonaga J.T., Briggs M.R., Bell S.P., Tjian R. Purification and biochemical characterization of the promoter-specific transcription factor, Spl // Science. 1986. V.234. P.47-52.

86. Kadonaga J.T., Carner K.R., Masiarz F.R., Tjian R. Isolation of a cDNA encoding transcription factor Spl and functional analysis of the DNA binding domain//Cell. 1987. V.51. P. 1079-1090.

87. Kamai T., Arai K., Tsujii T., Honda M., Yoshida K. Overexpression of RhoA mRNA is associated with advanced stage in testicular germ cell tumor // BJU Int. 2001. V.87. P.227—231.

88. Kamai T., Kawakami S., Koga F., Arai G., Takagi K., Arai K., Tsujii T., Yoshida K.I. RhoA is associated with invasion and lymph node metastasis in upper urinary tract cancer // BJU Int. 2003. V.91. P.234-238.

89. Kamai T., Tsujii T., Arai K., Takagi K., Asami H., Ito Y., Oshima H. Significant association of Rho/ROCK pathway with invasion and metastasis of bladder cancer // Clin. Cancer Res. 2003. V.9. P.2632-2641.

90. Kamai T., Yamanishi T., Shirataki H., Takagi K., Asami H., Ito Y., Yoshida K. Overexpression of RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer // Clin. Cancer Res. 2004. V.10. P.4799-4805.

91. Kang W.K., Lee I., Ko U., Park C. Differential effects of RhoA signaling on anticancer agent-induced cell death // Oncol. Rep. 2005. V.13. P.299-304.

92. Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Li J., Vorobieva N.V., Fedorova L., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Kost-Alimova M., Domninsky

93. Kawai J. et al., Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection//Nature. 2001. V.409. P.685-690.

94. Keith R.L., Miller Y.E., Gemmill R.M., Drabkin H.A., Dempsey E.C., Kennedy T.C., Prindiville S., Franklin W.A. Angiogenic squamous dysplasia in bronchi of individuals at high risk for lung cancer // Clin. Cancer Res. 2000. V.6. P.1616-1625.

95. Kim A.C. et al., Limatin (LIMAB1), an actin-binding LIM protein, maps to mouse chromosome 19 and human chromosome 10q25, a region frequently deleted in human cancers // Genomics. 1997. V.46. P!291-293.

96. Kok K., Naylor S.L., Buys C.H.C.M. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes // Cancer Res. 1997. V.71 P.27-92.

97. Kolchanov N.A., Ponomarenko M.P., Kel A.E. et al. // International conference Intelligent System in Molecular Biology. Novosibirsk. Russia. Abstract book. 1998. P.95-104.

98. Kristelly R., Gao G., Tesmer J.J.G. Structural determinants of RhoA binding and nucleotide exchange in leukemia-associated Rho guanine-nucleotide exchange factor //J.Biol. Chem. 2004. V.279: P.47352-47362.

99. Krugmann S., Jordens I., Gevaert K., Driessens M., Van-dekerckhove J. et al. Cdc42 induces filopodia by promoting the formation of an IRSp53:Mena complex//Curr. Biol. 2001. V.ll. P:1645-1655.

100. Kumar A., Kaur J., Chattopadhyay T.K., Mathur M., Ralhan R. Differential expression of retinoic acid receptors in normal and malignant esophageal tissues // J. Exp. Ther. Oncol. 2004. V.4. P. 1-8.

101. Kuroki T., Trapasso F., Yendamuri S., Matsuyama A., Alder H., Williams N.N., Kaiser L.R., Croce C.M. Allelic loss on chromosome 3p21.3 and promoter hypermethylation of Semaphorin 3B in non-small cell lung cancer // Cancer Res. 2003. V.63. P.3352-3355.

102. Larsen F., Gundersen G., Lopez R., Prydz H. CpG islands as gene markers in the human genome // Genomics. 1992. V.13. P.1095-1107.

103. Lash A.E., Tolstoshev C.M., Wagner L., Schuler G.D., Strausberg R.L., Riggins G.J., and Altschul S.F. SAGEmap: a public gene expression resource // Genome Res. 2000. V.10. P. 1051-1060.

104. Le Beau M.M., Chada S., Casey L., Newburger P.E. Chromosomal sublocalization of the human glutathione peroxidase gene // Cytogenet. Cell. Genet. 1989. V.51. P. 1030 only.

105. Leabu M., Uniyal S., Xie J., Xu Y.Q., Vladau C., Morris V.L., Chan B.M. Integrin alpha2betal modulates EGF stimulation of Rho GTPase-dependent morphological changes in adherent human rhabdomyosarcoma RD cells // J Cell Physiol. 2005. V.202. P.754-66.

106. Lengauer C., Riethman H., Cremer T. Painting of human chromosomes with probes generated from hybrid cell lines by PCR with Alu and LI primers // Hum Genet. 1990. V.86. P.l-6.

107. Lens D., Matutes E., Catovsky D., Coignet L.J. Frequent deletions at 1 lq23 and 13ql4 in B cell prolymphocyte leukemia (B-PLL) // Leukemia. 2000. V.14. P.427-430.

108. Leonoudakis D. et al., Protein trafficking and anchoring complexes revealed by proteomic analysis of inward rectifier potassium' channel (Kir2.x)-associated proteins, J BioltChem. 2004. V.279. P.22331-22346.

109. Lerman M.I., Minna J.D. The 630-kb lung cancer homozygous deletion* region on human chromosome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes // Cancer Res. 2000.- V.60. P.6116-6133.

110. Liberto M., Cobrinik D., Minden A. Rho regulates p21(CIPl), cyclin Dl, and checkpoint control in mammary epithelial cells // Oncogene. 2002. V.21. P.1590-1599.

111. Liu N., Bi F., Pan Y., Sun L., Xue Y., Shi Y., Yao X., Zheng Y., Fan D. Reversal of the malignant phenotype of gastric cancer cells by inhibition of RhoA expression and activity // Clin. Cancer Res. 2004. V.10. P.6239-6247.

112. Liu Y., Corcoran, M., Rasool O., et al. Cloning of two candidate tumor suppressor genes within a 10 kb region on chromosome 13ql4, frequently deleted in chronic lymphocytic leukemia // Oncogene. 1997. V.15. P.2463 -2473.

113. Lotan R., Xu X.C., Lippman S.M., Ro J.Y., Lee J.S., Lee J.J., Hong W.K. Suppression of retinoic acid receptor-beta in premalignant oral lesions and its up-regulation by isotretinoin //New Engl J Med. 1995. V.332. P. 1405-1410.

114. Lu C. et al., Normal retinal development and retinofugal projections in mice lacking the retina-specific variant of actin-binding LIM domain protein // Neuroscience. 2003. V.120. P. 121-131.

115. Lundquist E.A., Herman R.K., Shaw J.E., Bargmann C.I. UNC-115, a conserved protein with predicted LIM and actin-binding domains, mediates axon guidance in C. elegans // Neuron. 1998. V.21. P.385-392.

116. MacCarthy-Morrogh L., Gaspar H.B., Wang Y.C., Katz F., Thompson.L. et al. Absence of expression of the Wiskott-Aldrich syndrome protein in peripheral blood cells of Wiskott-Aldrich syndrome patients // Clin. Immunol. Immunopathol. 1998. V.88. P.22-27.

117. Maekawa* M, Ishizaki T, Boku S, Watanabe N, Fujita A, Iwamatsu A, Obinata T, Ohashi K, Mizuno K, Narumiya S. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and' LIM-kinase // Science. 1999. V.285. P.895-898.

118. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook I. Molecular cloning: A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Lab Press. N.Y. 1989.

119. Maron E., Nikopensius T., Kôks S., Lang A., Vasar V., Shlik J. Association study of 90 candidate gene polymorphisms in panic disorder // Psychiatr Genet. 2005. V. 15. P. 17-24.

120. Marsit C.J., Wiencke J.K., Liu M., Kelsey K.T. The race associated allele of Semaphorin 3B (SEMA3B) T415I and its role in lung cancer in African-Americans and Latino-Americans // Cancerogenesis. 2005. V.26. P. 1446-1449.

121. Matsumura K., Nonaka I., Campbell K.P. Abnormal expression ofdystrophin-associated proteins in Fukuyama-type congenital muscular dystrophy //Lancet. 1993. V.341. P.521-522.

122. McBride O.W., Mitchell A., Lee B.J., Mullenbach G., Hatfield D. Gene for selenium-dependent glutathione peroxidase maps to human chromosome 3.21 and X // BioFactors. 1988. V.l. P.285-292.

123. McMahon H.T., Missler M., Li C., Sudhof T.C. // Cell. 1995. V.83. P.l 11119.

124. Melsheimer P., Vinokurova S., Wentzensen N., Bastert G., von Knebel Doeberitz M. // Clin. Cancer Res. 2004. T.10. P.3059.

125. Migliazza A., Bosch F., Komatsu H. et al. 2001. Nucleotide sequence, transcription map, and mutation analysis of the 13ql4 chromosomal region deleted in B-cell chronic lymphocytic leukemia // Blood. V.7. P.2098-2104.

126. Miki H., SuetsuguS., Takenawa T. WAVE, a novel WASP-family protein involved in actin reorganization induced'by Rac // EMBO J. 1998. V.17. P.6932-6941.

127. Miki H., Takenawa T. WAVE2 serves a functional partner of IRSp53 by regulating its interaction> with Rac // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V.293. P.93-99.

128. Mitchison T.J., Cramer L.P. Actin-based cell motility and cell locomotion // Cell. 1996. V.84. P.371-379.

129. Miyamoto K., Fukutomi T., Akashi-Tanaka S., Hasegava T., Asahara T., Sugimura T., Ushijima T. Identification of 20 genes aberrantly methylated in human breast cancers // Int. J. Cancer. 2005. V.l 16. P.407-414.

130. Miyasaka K., Yoshida Y., Matsushita S., Higuchi S., Shirakawa O., Shimokata H., Funakoshi A. Association of cholecystokinin-A receptor gene polymorphisms and panic disorder in Japanise // Am. J. Med. Genetics. 2004a. V.127B. P.78-80.

131. Moscow J.A., He R., Gnarra J.R., Knutsen T., Weng Y., Zhao W.P., Whang-Peng J., Linehan W.M., Cowan K.H. Examination of human tumors for rhoA mutations // Oncogene. 1994. V.9. P.l89-194.

132. Mosevitsky M.I., Capony J.P., Skladchikova G. Yu. et al. The BASP1 family of myristoylated proteins in axonal termini. Primary structure analysis and physico-chemical properties // Biochemie. 1997. V.79. P.373-384.

133. Nagase T. et al., Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XX. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro // DNA Res. 2001. V.8. P.85-95.

134. Nakamoto M., Teramoto H., Matsumoto S., Igishi T., Shimizu E. K-ras and rho A mutations in malignant pleural effusion // Int. J. Oncol. 2001. V.19. P.971-976.

135. Nakayama T., Watanabe M., Yamanaka M., Hirokawa Y., Suzuki H., Ito \ H., Yatani R., Shiraishi T. The role of epigenetic modifications in retinoic acidreceptor beta2 gene expression in human prostate cancers // Lab Invest. 2001. V.81. P.1049-1057.

136. Noble F., Wang S., Crawley J.N., Bradwejn J., Seroogy K.B., Hamon M., Roques B.P. International Union of Pharmacology. XXL. Structure, distribution, and functions of cholecystokinin receptors // Pharmacol. Rev. 1999. V.51. P.745-781.

137. Ochi K., Mori T., Toyama Y., Nakamura Y., Arakawa H. Identification of semaphorin3B as a direct target of p53 //Neoplasia. 2002. V.4. P.82-87.

138. Ometto L., Bertorelle R., Mainardi M., Giurisato M., Chieco-Bianchi L., De Rossi A. Analysis of the CC chemokine receptor 5 m303 mutation in infants born to HIV-1-seropositive mothers // AIDS. 1999. V.13. P.871-872.

139. Ota T. et al., Complete sequencing and* characterization of 21,243 full-length human cDNAs // Nat Genet. 2004. V.36. P.40-45.

140. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin. W., Sudhov T.C., Jahn R„ Rizo J., Fasshauer D. //J. Biol.Chem. 2000. V.275. P.19808-19818.

141. Pan Y., Bi F., Liu N., Xue Y., Yao X., Zheng Y., Fan D. Expression of seven main Rho family members in gastric carcinoma»// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V.315. P.686-691.

142. Paterson H.F., Self A.J., Garrett M.D., Just I., Aktories K., Hall A. Microinjection of recombinant-p21 rho induces rapid changes in cell morphology // J. Cell Biol. 1990. V.l 11. P.1001-1007.

143. Perez-Alvarado G.C. et al., Structure of the carboxy-terminal LIM domain from the cysteine rich protein CRP //Nat Struct Biol. 1994. V.l. P.388-398:

144. Petty W.J., Li N., Biddle A., Bounds R., Nitkin C., Ma Y., Dragnev K.H., Freemantle S.J:, Dmitrovsky E. A novel retinoic acid receptor beta isoform and retinoid resistance in lung carcinogenesis // J. Natl. Cancer Inst. 2005. V.97. P.1645-1651.

145. Pudovkin A.I., Zaykin D.V., Hedgecock D. On the potential,for estimating the effective number of breeders from heterozygote-excess in progeny // Genetics. 1996. V.144. P.383-387.

146. Que F.G., Sarmiento J.M., Nagorney D.M. Hepatic surgery for metastatic gastrointestinal neuroendocrine tumors // Cancer Control. 2002. V.9. P.67-79.

147. Rana A.P. et al., Cloning of human erythroid dematin reveals another member of the villin family // Proc Natl Acad Sci. 1993. V.90. P.6651-6655.

148. Rehfeld J.F., Van Solinge W.W. Co-transcription of the gastrin and cholecystokinin genes with selective translation of gastrin mRNA in a human gastric carcinoma cell line // FEBS Letters. 1992. V.309. P.47-50.

149. Rihet S., Vielh P., Camonis J., Goud B., Chevillard S., de Gunzburg J. Mutation status of genes encoding RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases in a panel of invasive human colorectal and breast tumors // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. V.127. P.733-738.

150. Roche J., Drabkin H.A. The role of semaphorins in lung' cancer // Clin. Lung Cancer. 2001. V.3. P. 145-150.

151. Rohatgi R., Nollau P., Ho Hy H., Kirschner M.W., Mayer B.J. Nek and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate synergistically activate actin polymerization through the N-WASP-Arp2/3 pathway // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.26448-26452.

152. Roof D.J. et al., Molecular characterization of abLIM, a novel actin-binding and double zinc finger protein // J Cell Biol. 1997.V.138. P.575-588.

153. Rowland-Jones S., Sutton J., Ariyoshi K., Dong T., Gotch F., McAdam S., Whitby D., Sabally S., Gallimore A., Corrah T., et al. HIV-specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women // Nat Med. 1995. V.l. P.59-64.

154. Sahai E., Marshall C.J. Rho-GTPases and cancer // Nature Rev. 2002. V.2. P.133-142.

155. Sahai E., Olson M.F., Marshall C.J. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility. // EMBO J. 2001. V. 20. P.755-766.

156. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // ColdSpring Harbor Laboratory 13rd edition. 2001. 999P.

157. Schneider-Gadicke, A., and Schwarz, E. Different human cervical-carcinoma cell-lines show similar transcription,patterns of human papillomavirus type 18 early genes // EMBO J. 1986. V.5. P.2285-2292.

158. Sauzeau V., Rolli-Derkinderen M., Marionneau C., Loirand G., Pacaud P. RhoA expression is controlled by nitric oxide through cGMP-dependent protein kinase activation. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P. 9472-9480.

159. Ivanova T., Petrenko A., Gritsko T., Vinokourova S., Eshilev E., Kobzeva V., Kisseljov F., Kisseljova N. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta 2 gene in cervical cancer // BMC Cancer. 2002. 2:4.

160. Sauzeau V., Rolli-Derkinderen M., Marionneau C., Loirand G., Pacaud P. 2003. RhoA expression is controlled by nitric oxide through cGMP-dependent protein kinase activation. J. Biol. Chem. 278, 9472-9480.

161. Schoenherr C.J., Paquette A.J., Anderson D.J., Identification of potential target genes for the neuron-restrictive silencer factor // Proc Natl Acad Sci. 1996. V.93. P.9881-9886.

162. Schuler G.D., Boguski M.S., Stewart E.A., Stein L.D., Gyapay G., Rice K., White R.E., Rodriguez-Tome P., Aggarwal A., Bajorek E et al. 1996. A gene map of the human genome // Science. V.274. P.540-546.

163. Schwarz E., Freese U.K., Gissmann L., Mayer W., Roggenbuck B., Stremlau A., zur Hausen H. Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma cells //Nature. 1985. V .314. P.lll-114.

164. Schwarz, E., Freese, U. K., Gissmann, L., Mayer, W., Roggenbuck, B., Stremlau, A., zur Hausen, H. Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma cells //Nature. 1985. V.314. P.lll-114.

165. Shera K.A., Shera C.A., McDougall J.K. Small tumor virus genomes are integrated near nuclear matrix attachment regions in transformed cells // J. Virol. 2001. V.75. P.12339-12346.

166. Shimokata H., Ando F., Nino N., Miyasaka K., Funakoshi A. Cholecystokinin A Receptor Gene Promoter Polymorphism and Intelligence // Ann Epidemiol. 2005. V.15. P. 196-201.

167. Shindo S., Yoshioka N. Polymorphisms of the cholecystokinin gene promoter region in suicide victims in Japan // Forensic Sci Int. 2005. V.150. P.85-90.

168. Sirchia S.M., Ren M., Pili R., Sironi E., Somenzi G., Ghidoni R., Toma S., Nicolo G., Sacchi N. Endogenous reactivation of the RARbeta2 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast cancer // Cancer Res. 2002. V.62. P.2455-2461.

169. Sossey-Alaoui K., Head K.N., Nowak N., Cowell J.K. Genomic organization and expression profile of the human and mouse WAVE gene family // Mamm. Genome. 2003. V.14. P.314-322.

170. Strausberg R.L., Feingold E.A., Grouse L.H., Derge J.G., Klausner R.D.2002. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. V.24. P.16899-16903.

171. Struckhoff E.C., Lundquist E.A., The actin-binding protein UNC-115 is an effector of Rac signaling during axon pathfinding in C. elegans // Development.2003. V.130. P.693-704.

172. Suetsugu S., Miki H., Takenawa T. Identification of two human WAVE/SCAR homologues as general actinrregulatory molecules which associate with the Arp2/3 complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Y.260. P.296-302.

173. Sukenaga Y., Ishida K., Takeda T., Takagi K. cDNA sequence coding for human glutathione peroxidase //Nucleic Acids Res. 1987. V.15. P.7178 only.

174. Szarka K., Veress G., Juhasz A., Konya J., Sapy T., Soos G., Hernadi Z., Gergely L. Integration status of virus DNA and p53 codon 72 polymorphism in human papillomavirus type 16 positive cervical cancers // Anticancer Res. 2000. V.20. P.2161-2167.

175. Tachikawa H., Harada S., Kawanishi Y., Okubo T., Shiraishi H. Novel polymorphism in the promoter and coding regions of the human cholecystokinin B receptor gene: an association analysis with schizophrenia // Am J Med Genet. 1999. V.88. P.700-704.

176. Tachikawa H., Harada S., Kawanishi Y., Okubo T., Shiraishi H. Novel polymorphism of the cholecystokinin A receptor gene: an association analysis with schizophrenia//Am J Med Genet. 2000. V.96. P.141-145.

177. Tachikawa H., Harada S., Kawanishi Y., Okubo T., Suzuki T. Linked polymorphisms (-333G>T and -286A>G) in the promoter region of the CCK-A receptor gene may be associated with schizophrenia // Psychiatry Res. 2001. V.103. P. 147-55.

178. Takahashi S., Ujihara H., Huang G.Z., Yagyu K., Sanbo M., Kaba H., Yagi T.// Eur. J. Neurosci. 1999. V.l 1. P.2359-2366.

179. Takahashi S., Yamamoto H., Matsuda Z., Ogawa M., Yagyu K. // FEBS lett. 1995. V.368. P.455-460.

180. Takenawa T., Miki H. WASP and WAVE family proteins: key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments and cell movement // J. Cell Sci. 2001. V.114. P.1801-1809.

181. Thorland E., Myers S., Persing D., Sarkar G., McGovern R., Gostout B., Smith D. Human papillomavirus type 16 integrations in cervical tumors frequently occur in common fragile sites // Cancer Researsch. 2000. V.60. P.5916-5921.

182. Tischoff I., Markwarth A., Witzigmann H., Uhlmann D., Hauss J., Mirmohammadsadegh A., Wittekind C., Hengge U.R., Tannapfel A. Allele loss and epigenetic inactivation of 3p21.3 in malignant liver tumors // Int. J. Cancer. 2005. V.l 15. P.684-689.

183. Trusolino L., Comoglio-P.M. Scatter-factor and semaphoring receptors: cell signaling for invasive growth // Nature Rev. Cancer. 2002. V.2. P.289-300.

184. Tse C., Xiang- R.H., Bracht T., Naylor S.L. Human. Semaphorih 3B1 (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor' formation in an adenocarcinoma cell line // Cancer Res. 2002. V.62. P.542-546.

185. Ueda T., Emi M., Suzuki H. et al. 1999. Identification of a I-cM region of common deletion on 13ql4 associated with human prostate cancer // Genes Chrom. Cancer. V.24. P.83-90.

186. UICC TNM classification of malignant tumours. Sobin LY and Wittekind Ch (ed.) Sixth ed. Wiley-Liss INC Publ. New York. 2002.

187. Van Tine B., Knops J., Broker T., Chow L., Moen Jr. P. In situ analysis of the transcriptional activity of integrated viral DNA using tyramide-FISH // Dev Biol. 2001. V.106. P.381-385.

188. Vanakoski J., Virkkunen M., Naukkarinen H., Goldman D. No association of CCK and CCK(B) receptor polymorphisms with alcohol dependence // Psychiatry Res. 2001. V.102. P. 1-7.

189. Varella-Garcia M, Gemmill RM, Rabenhorst SH, Lotto A, Drabkin HA, Archer PA, Franklin WA. Chromosomal duplication accompanies allelic loss in non-small cell lung carcinoma// Cancer Res. 1998. V.58. P.4701-4707.

190. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K.W. 1995. Serial analysis of gene expression. Science. 270, 484-487.

191. Vial E., Sahai E., Marshall C.J. ERK-MAPK signaling coordinately regulates activity of Racl and RhoA for tumor cell motility // Cancer Cell. 2003. V.4. P.67-69.

192. Vidal A., Millard S.S., Miller J.P., Koff A. Rho activity can alter the translation of p27 mRNA and is important for RasV12-induced transformation in a manner dependent on p27 status // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P. 16433-16440.

193. Virmani A.K., Muller C., Rathi A., Zoechbauer-Mueller S., Mathis M., Gazdar A.F. Aberrant methylation during cervical carcinogenesis // Clin Cancer Res. 2001. V.7. P.584-589.

194. Walter M.A., Spillett D.J., Thomas P., Weissenbach J., Goodfellow P.N. // Nature Genetics. 1994. V.7. P.22-28

195. Wang J.W., Howson J., Haller E., Kerr W.G. Identification of a Novel Lipopolysaccharide-Inducible Gene with Key Features of Both a Kinase Anchor Proteins and chsl/beige Proteins // The Journal of Immunology. 2001'. V.l66. P.4586-4595.

196. Wang Z., Valdes J., Noyes R., Zoega T. and Crowe R.R. Possible association of a cholecystokinin promoter polymorphism (CCK-36CT) with panic disorder // Am J Med Genet. 1998. V.81. P.228-234.

197. Wang Z., Wassink T., Andreansen N.C., Crowe R.R. Possible Association of Cholecystokinin Promoter Variant to Schizophrenia // Am J Med Genet. 2001. V.l 14. P.479-482.

198. Wei J., Hemmings G.P. The CCK-A receptor gene possibly associated with auditory gallucinations in schizophrenia // Eur. Psychiatry. 1999. V.14. P.67-70.

199. Wentzensen N., Ridder R., Klaes R, Vinokurova S., Schaefer U., von Knebel Doeberitz M. Characterization of viral-cellular fusion transcripts in a large series of HPV16 and 18 positive anogenital lesions // Oncogene 2002. V.21. P.419-426.

200. Wentzensen N., Vinokurova S., von Knebel Doeberitz M. Systematic review of genomic integration sites of human papillomavirus genomes in epithelial dysplasia and invasive cancer of the female lower genital tract // Cancer Res. 2004. V.64. P.3878.

201. Widschwendter M., Berger J., Muller H.M., Zeimet A.G., Marth C. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor-beta2 gene in breast cancer //J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2001. V.6. P. 193-201.

202. Wijnen L.M., Monteba-van Heuvel M., Pearson P.L., Meera Khan P. Assignment of a gene for glutathione peroxidase (GPX-1) to human chromosome 3 // Cytogenet. Cell Genet. 1978. V.22. P.232-238.

203. WolfS., Mertens D., Schaffner C. et al. 2001. B-cell neoplasia associated gene with multiple splicing (BCMS): the candidate B-CLL gene on 13ql4 comprises more than 560 kb covering all critical regions // Hum. Mol. Genet. V.10. P.1275-1285.

204. World Health Organization. International histological classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. Tavassoli FA and Devilee P (ed.): IARCPress. Lyon. 2003.

205. World Health Organization. International histological classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. Tavassoli FA and Devilee P (ed.): IARCPress. Lyon. 2003.

206. World Health Organization. International histological classification of tumours. Pathology and genetics. Tumours of the urinary system and male genital organs. Eble JN, Sauter GS, Epsten JI and Sisterhenn IA (ed.). IARCPress. Lyon. 2004

207. Yang H., Jeffrey P.D., Miller J., Kinnucan E., Sun Y., Thoma N.H., Zheng N., Chen P.L., Lee W.H., Pavletich N.P. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSSl-ssDNA structure // Science. 2002. V.297. P.1837-1848.

208. Yang Q., Yoshimura G., Mori I., Sakurai T., Kakudo K. Chromosome 3p and breast cancer // J. Hum. Genet. 2002. V.47. P.453-459.

209. Yazdani U., Terman J.R. The semaphorins // Genome Biol. 2006. V.7. P.211.

210. Zabarovsky E.R., Petrenko L., Protopopov A., Vorontsova O., Kutsenko A.S., Zhao Y., Kilosanidze G., Zabarovska V., Rakhmanaliev E., Pettersson B., Kashuba V.I., Ljungqvist O., Norin E., Midtvedt T., Mollby R., Winberg G.,

211. Ernberg I. Restriction site tagged (RST) microarrays: a novel technique to study the species composition of complex microbial systems // Nucleic Acids Res. 2003. V.31, e95.

212. Zhao H., Liang D., Grossman H.B., Wu X. Glutathione peroxidase 1 gene polymorphism and risk of recurrence in patients with superficial bladder cancer // Urology. 2005. V.66. P.769-774.

213. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Virmani A.K., Geradts J., Gazdar A.F., Minna J.D. Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers // Cancer Res. 2001. V.61. P.249-255.

Информация о работе

Климов, Евгений Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Картирование и анализ генов и функционально-значимых последовательностей генома человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы