Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu

Маценко, Наталья Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu"

На правах рукописи

Маценко Наталья Юрьевна

КАРТИРОВАНИЕ ГРАНИЦ ФРАГМЕНТОВ ДНК В РАЙОНЕ ХРОМОСОМЫ \lql2-qll В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕЙ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА С УВЕЛИЧЕННОЙ ДОЗОЙ

ГЕНА НЕ ¡и/пей

Специальность 03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о о 412000

Новосибирск - 2008

003451399

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск, Россия)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Сергей Петрович Коваленко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Александр Алексеевич Ильичев

доктор биологических наук

Анатолий Борисович Беклемишев

Ведущая организация:

Институт Цитологии и Генетики Сибирского Отделения Российской академии наук.

Защита состоится « 28 » ноября 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: п. Кольцово Новосибирской области, 630559, тел: (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « » октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^АлЛ Л.И. Карпенко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. По данным ВОЗ, в мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев РМЖ. По данным РОНЦ, ежегодно в России около 50 тыс. женщин ставится диагноз РМЖ, смертность составляет около 24 тыс. женщин. По данным ежегодной отчетной конференции онкологов в 2006 году в г. Новосибирске частота встречаемости РМЖ составила 81.6 случаев на 100 тысяч женского населения.

Значительным прогрессом в диагностике и лечении РМЖ стало открытие молекулярных маркеров, которые имеют прогностическое и предсказательное значение при определении их статуса у пациенток с РМЖ. В настоящее время одним из наиболее изученных молекулярных маркеров является рецептор эпидермального фактора роста человека второго типа, HER2 (Yang-FengТ. etal, 1985;Di FioreP.etal., 1987).

Увеличенное количество рецептора HER2 на поверхности опухолевых клеток встречается в 20-30% случаев РМЖ (Slamon D. et al., 1989; Meric F. et al., 2002). Избыточное наличие HER2 рецептора свидетельствует о наиболее агрессивной форме РМЖ, которая характеризуется быстрым ростом опухоли, высокой вероятностью метастазирования, снижением эффективности химио-, гормональной и лучевой терапии (Имянитов Е.Н. с соавт., 1992; Masood S. et al., 2002). Только с помощью своевременной диагностики НЕ112-статуса опухоли можно назначить адекватное и эффективное лечение РМЖ всех стадий.

В подавляющем большинстве случаев в основе увеличенной экспрессии лежит увеличение дозы гена HER2/neu (Couturier J. et al., 1999; Jacobs T. et al., 1999). Амплификация - один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли. В ряде случаев амплификация затрагивает целые фрагменты хромосом (Hyman Е. et al., 2002). В литературе описано несколько механизмов амплификации, предложенных для объяснения активации онкогенов в клеточных линиях опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ (Savelyeva L. и Schwab М., 2001; Albertson D., 2006). Однако предложенные модели амплификации не дают ответа на вопрос о причинах возникновения амплификации. Если существуют закономерности и общие механизмы возникновения увеличения дозы онкогенов, то их открытие может послужить основой для разработки новых целевых препаратов для анти-раковой терапии, которые позволят контролировать и даже предотвращать развитие раковых опухолей у человека. В свете постоянного увеличения заболеваемости злокачественными новообразованиями актуальность данной темы не вызывает сомнений.

Цель н задачи исследования.

Целью настоящей работы является картирование границ фрагмента ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21 в клетках опухолей РМЖ человека с увеличенной дозой гена HER2/neu и выявление структурных особенностей ДНК на данных границах.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ чувствительности, воспроизводимости и диапазона измерений двух протоколов ПЦР-РВ (SYBR Green и TaqMari) для определения дозы гена HER2/neu в клетках опухолей РМЖ.

2. Провести сравнительный анализ результатов определения дозы гена HER2/neu методом ПЦР-РВ с результатами методов ИГХ и FISH определения НЕЯ2-статуса опухолей РМЖ.

3. Определить дозу гена HER2/neu в панели образцов опухолей РМЖ человека методом ПЦР-РВ.

4. Провести определение дозы ряда соседних с HER2/neu генов.

5. Установить длину и границы амплифицированных районов ДНК, содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21.

6. Выявить возможные структурные особенности нуклеотидной последовательности ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21, вокруг гена HER2/neu.

7. Сопоставить взаимное расположение структурных особенностей нуклеотидной последовательности ДНК вокруг гена HER2/neu и границ амплифицированных районов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu.

Научная новизна.

- Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для анализа дозы гена HER2/neu;

- Установлена высокая корреляция результатов (г=0.8,р<0.005), полученных с использованием предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu, с результатами определения HER2-статуса опухолей РМЖ с помощью методов ИГХ и FISH;

- Впервые продемонстрирована возможность использования TaqMan ПЦР-РВ для оценки длины амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu;

- Установлено наличие амплифицированных фрагментов ДНК разной длины (от 40 т.п.н. до более чем 1 м.п.н.), содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21, в разных образцах опухолей РМЖ;

- Впервые продемонстрировано наличие сайтов высокой флексибиль-ности в районе хромосомы 17ql2-q21;

- Впервые продемонстрировано, что в ряде опухолей РМЖ с увеличенной дозой гена HER2/neu границы амплифицированных фрагментов ДНК хромосомы 17ql2-q21 находятся в пределах одной из обнаруженных областей высокой флексибильности FlexZNF-2;

- На основе полученных данных выдвинуто предположение об участии районов высокой флексибильности в процессах инициации внутри-хромосомной амплификации ДНК в клетках опухолей РМЖ.

Научно-практическая значимость.

По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование, позволившее говорить о том, что амплификация фрагмента хромосомы 17ql2-q21, содержащего ген HER2/neu, по крайней мере, в некоторых точках ассоциирована с наличием районов высокой флексибильности ДНК. Данные о связи сайтов высокой флексибильности с границами амплифицированных районов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, могут оказаться полезными для изучения механизмов амплификации данного онкогена в клетках РМЖ, а также для выявления общих закономерностей процессов амплификации онкогенов в опухолевых клетках. Кроме того, дальнейшее исследование подобных взаимосвязей, возможно, окажется полезным для поиска новых подходов при разработке таргетной терапии РМЖ.

Прикладное применение данной работы связано с возможностью выбора рациональных схем терапии при РМЖ в зависимости от длины амплифицированных фрагментов хромосомы 17q, содержащих ген HER2/neu. В ходе работы был предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ, на основе которого был создан прототип набора для определения дозы гена HER2/neu в опухолевой ткани РМЖ с дальнейшей возможностью применения его в клинической практике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ обладает более высокой чувствительностью (1 нг геномной ДНК), воспроизводимостью (КВ<5%) и более широким диапазон измерений (1-100 нг геномной ДНК), по сравнению с параллельно разработанным в данной работе, протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

2. Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с данными методов ИГХ и FISH определения НЕ112-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8, р<0.005).

3. Увеличение дозы гена HER2/neu выявлено в 34.5% исследованных опухолей РМЖ.

4. В различных образцах опухолей РМЖ в районе хромосомы 17ql2-q21 обнаружены различные по протяженности амплифицированные фрагменты хромосомы, содержащие ген HER2/neu.

5. В районе хромосомы 17ql2-q21 (NT.0107555 (1722059...1731701) Gene Bank), прилегающем к гену HER2/neu, располагаются нуклеотидные последовательности ДНК с высокой флексибильностью.

б. Расположение границ ряда амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, совпадает с локализацией одного из сайтов высокой флексибильности FlexZNF-2 в районе хромосомы 17ql2-q21, что свидетельствует об его возможном участии в процессах внутри-хромосомной амплификации.

Апробация работы.

Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2004); на I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005); на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, 2006); на XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); на 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); на 14-й Европейской конференции по Онкологии, ЕСС014 (Barcelona, Spain, 2007); на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации имеется 11 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 8 таблиц, 31 рисунок, и состоит из 8 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 186 ссылок, и 3 приложения.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали сто двадцать восемь образцов свежезамороженной опухолевой ткани РМЖ. В дополнение к этому тридцать четыре образца опухоли РМЖ были получены в виде архивных срезов. Контролем служила ДНК, выделенная из образцов ткани молочной железы от восьми женщин, не имеющих злокачественных патологий молочной железы, и пять образцов условно нормальной ткани молочной железы, взятых из прилегающей к опухоли ткани. На проведение работ с клиническим материалом было получено разрешение от этического комитета ГУ НИИМББ СО РАМН от 8 июня 2005 г.

Процедуру выделения ДНК из архивных образцов опухолей РМЖ производили методом фенол-хлороформной экстракции ДНК в соответствие с протоколом, предложенным Cao W. с соавт. (2003).

Выделение геномной ДНК из замороженных образцов ткани проводили при помощи набора «Animal Tissue Genomic DNA Isolation kit» фирмы V-gene Biotechnology (КНР). Выделенную ДНК растворяли в 50-100 мкл элюата (2.5 мМ Трис-HCl, pH 8.5).

Перед началом исследования нормирование концентрации растворов исследуемых ДНК проводили методом калибровочных прямых с помощью ПЦР-РВ на приборе iQ Cycler (Bio-Rad, США). В качестве нормировочного гена был использован ген UBC (Persson К et al. 1999).

Нуклеотидная последовательность специфических праймеров и флуоресцентных TaqMan зондов подбирали с использованием программного обеспечения Primer Express Software v2.0 (Applied Biosystems, США).

Для подтверждения специфичности праймеров, отсутствия формирования праймер-димеров и неспецифических ампликонов при проведении SYBR Green ПЦР-РВ были построены кривые плавления для каждой пары соответствующих праймеров.

SYBR Green ПЦР-РВ проводили на приборе ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США). 2 мкл раствора исследуемой ■ ~ геномной ДНК (10 нг/мкл) добавляли в реакционную смесь с конечным объемом 25 мкл. Реакционная смесь содержала 1* буфер для Taq ДНК- -полимеразы (67 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16 мМ (NH^SC^, 0.01% Tween-20), 3.5 мМ (для HERl/neu) / 2.5 мМ (для UBQ MgCl2, по 0.2 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ; 0.3 мкМ каждого праймера, 1:80000 SYBR Green I, 0.5 мкМ TAMRA и 1.0 ед. акт. Smart Taq ДНК-полимеразы. Температурные условия включали на начальном этапе 1 цикл при 95°С в течение 3 мин, 64°С в течение 20 сек, 72°С в течение 32 сек, 84°С в течение 32 с. Затем 35 циклов .-?. при 95°С - 9 с, 64°С - 15 с, 72°С - 30 с, 84°С - 32 с.

TaqMan ПЦР-РВ проводили на приборе ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США) и iQ™5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). 2 мкл раствора исследуемой геномной ДНК (5 нг/мкл) добавляли в реакционную смесь с конечным объемом 25 мкл. Реакционная смесь содержала Iх буфер для Taq ДНК-полимеразы (67 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16 мМ (NH4)2S04, 0.01% Tween-20), 4.5 - 5.5 мМ MgCl (индивидуально для каждой пары праймеров), 0.3 мМ дАТФ, дЦТФ, dlTO и dTT®, 0.3 мкМ каждого прямого и обратного праймеров, 0.1-0.35 мкМ (индивидуально для каждого исследуемого гена) флуоресцентно-меченного гибридизационного TaqMan зонда, 0.025 ед/мкл Smart Taq ДНК-полимеразы.

Для достижения максимальной эффективности реакции была проведена оптимизация условий ПЦР-РВ путем подбора концентрации йонов Mg2+ и концентрации TaqMan зонда.

Реакцию амплификации методом TaqMan ПЦР-РВ для исследуемых генов HER2/neu, PPARBP, ZNFN1A3, ТОР2А и нормировочного гена UBC проводили при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 сек. и

60°С в течение 45 сек. Значение флуоресценции измерялось автоматически в конце каждого цикла элонгации при температуре 60 °С.

Определение дозы исследуемого гена НЕЯ2/пеи и нормировочного гена иВС в опухолевой и контрольной ткани молочной железы проводили в отдельных лунках в ходе одного раунда ПЦР-РВ.

Калибровочные прямые строили по результатам амплификации серийных двукратных разведений контрольной геномной ДНК человека (2.5, 5, 10, 20 и 40 нг/мкл контрольной геномной ДНК). В реакцию брали 1 мкл раствора ДНК. Каждый раунд ПЦР-РВ включал калибровочные прямые для фрагмента гена 1/ВС и для фрагмента исследуемого гена.

Для относительного определения дозы исследуемых генов в опухолевой ДНК был использован метод предложенный М. (2001).

Для определения диапазона изменения значений дозы исследуемых генов в нормальной ткани молочной железы, значение Мисс1е1\!с,ш для исследуемых генов определяли в 13 образцах контрольной ДНК (таб. 1).

Таблица 1. Определение диапазона изменения значений дозы исследуемых генов в контрольной ДНК, выделенной из нормальной ткани молочной железы

Название гена Интервал изменения значений TV исслМ.та В 13-ТИ КОНТРОЛЬНЫХ образцах Среднее (М), Стандартное отклонение (SD) (Mean ±3SD)

PPARBP 0.73-1.32 0.96; 0.179 (0.43 : 1.49)

HEIU/neu 0.75-1.29 0.95; 0.141 (0.29 : 1.37)

ZNFN1A3 end 0.9-1.15 1.02; 0.165 (0.53 : 1.51)

ZNFNJA3 start 0.8-1.33 0.97; 0.163 (0.49 : 1.45)

ZNFNIA3 lei 0.86-1.29 1.04; 0.173 (0.52 : 1.56)

ZNFN1A3 centr 0.82-1,17 0.89; 0.133 (0.49 : 1.29)

TOP2A 0.89-1.21 1.01; 0.102 (0.71 : 1.31)

В качестве порогового для увеличенной дозы гена считали значение 1.5 (M+3SD).

Чистоту и специфичность продуктов ПЦР проверяли методом горизонтального электрофореза в 1.5 - 2% агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и сканировали в УФ-свете с помощью видеосистемы "DNA Analyzer" (Lytech, Россия) и Gel Imager (Россия).

Флексибильность нуклеотидной последовательности фрагмента TBC1D3 - HER2/neu - ТОР2А в районе хромосомы 17ql2-q21 анализировали при помощи программы TwistFlex (http://margalit.huji.ac.il). Нуклео-тидная последовательность проанализированного района была взята из базы данных GeneBank (NTJ10755 <Л878...3989047>).

С помощью программы Clustal W2 (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) анализировали гомологию нуклеотидных последовательностей флекси-

бильных районов в фрагменте хромосомы 17ql2-q21 и сайтов флекси-бильности в известных 4CJI и PCJI (Chenna Т. et al., 2003).

С помощью программы Mfold (GCG Wisconsin Package™) анализировали способность ДНК в местах пиков флексибильности формировать вторичные структуры.

Статистическую обработку полученных данных проводили по критериям Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова при помощи программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, Швеция). Значение р < 0.01 было использовано для определения достоверности различий полученных значений. Для оценки корреляции результатов анализа дозы гена, полученных с помощью TaqMan ПЦР-РВ и результатов ИГХ и FISH диагностики HER2-статуса опухолей РМЖ использовали непараметрический коэффициент Спирмена (г, р<0.005).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для решения поставленных задач работа была разделена на три этапа. На первом этапе проводили определение дозы гена HER2/neu в образцах :: РМЖ. В образцах с увеличенной дозой гена HER2/neu проводили определение дозы ряда соседних HER2/neu генов. На основании данных об амплификации соседних генов говорили об амплификации всего фрагмента хромосомы, фланкированного данными генами. В качестве границы амплификации фрагмента хромосомы принимали точку между соседними генами с увеличенной и неувеличенной дозой. Определение дозы генов проводили с помощью метода ПЦР-РВ. Для выбора оптимальной ПЦР-РВ технологии для анализа дозы генов, в рамках первого этапа было проведено сравнительное исследование предложенных протоколов TaqMan и . SYBR Green ПЦР - РВ.

На втором этапе работы был проведен компьютерный анализ структурных особенностей нуклеотидной последовательности ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21.

На третьем этапе взаимосвязь между местоположением границ амплификации и локализацией специфических нуклеотидных последовательностей, которые могут участвовать в процессе амплификации фрагментов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu.

3.1. Сравнение предложенных для определения дозы гена HER2/neu протоколов SYBR Green и TaqMan ПЦР-РВ

Границы у всех известных на сегодняшний день ампликонов, открытых с помощью методов FISH и CGH, не имеют описания на нуклеотид-ном уровне. Между тем, анализ нуклеотидного состава границ ампликонов может выявить роль определенных нуклеотидных последовательностей в появлении амплифицированных районов ДНК на хромосомах. Метод ПЦР-РВ обладает подходящей разрешающей способностью для решения поставленной задачи. Однако для получения верифицируемых результатов

немаловажным является правильный выбор технологии ПЦР-РВ. В связи с этим в первой части работы было проведено сравнение двух протоколов ПЦР-РВ: с применением интеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I и специфичных флуоресцентных TaqMan зондов.

3.1.1. Оценка эффективности реакции и воспроизводимости результатов измерения дозы гена HER2/neu при использовании SYBR Green и

TaqMan пцр-рв

Чувствительность реакции определяли путем амплификации фрагментов генов HER2/neu и UBC в серии пятикратных разведений геномной ДНК человека из здоровой ткани молочной железы. На основании полученных результатов были построены калибровочные кривые для генов HER2/neu и ИБС.

Рисунок ]. Кривые интенсивности флуОрСС UCFI Ц|[И для ПЦР-II роду КТО в фрагмента геня VBC в серии двухкратных разведений начального коли честна ДНК-матрицы дли SYBR Green ПЦР-РВ.

(Л) Кривые интенсивности флуоресценции для серийных двукратных разведений от 5 до 40 нг на реакцию геномной ДНК человека из здоровой ткани молочной железы: Чем больше количество ДНК том раньше кривые пересекают заданный порог флуоресценции. (Б.) Калибровочная прямая для ПЦР-фрагмента гена UBC: у=-3.35х+29.25, Е=99%, RM.996.

Предложенный протокол SYBR Green формата ПЦР-РВ позволял строить калибровочные кривые с эффективностью реакции более 95% только в интервале концентрации 2.5-50 нг/реакцию раствора геномной ДНК человека. Таким образом, линейный диапазон измерения количества ДНК для SYBR Green формата ПЦР-РВ составил 2.5-50 нг на реакцию, чувствительность реакции составила 2.5 нг геномной ДНК {рис. 1).

Линейный диапазон измерения количества геномной ДНК человека для TaqMan формата ПЦР-РВ при эффективности реакции 92-100% составил от 1-100 нг геномной ДНК на реакцию (рис. 2). Чувствительность реакции составила 1 нг геномной ДНК.

Рисунок 1. Кривые интенсивности флуоресценции для ПЦР-продуктов фрагмента гена UBC в серии двухкратных разведен вП начального количества ДШС-матрнпы для TaqMan ПЦР-РВ. (А) Кривые интенсивности флуоресценции для серийных двукратных разведений от I до 64 нг на реакцию геномной ДНК человека из здоровой ткани молочной железы. Чем больше количество ДНК rest раньше кривые пересекают заданный порог флуоресценции, (li) Калибровочная прямая для ПЦР-фрагмета гена UBC: у=-3.33х+3!.89, Е=99-5%, 997.

Для определения внутриэкспериментальной воспроизводимости (сходимости) реакции использовали коэффициента вариации (КВвн). Межэкспериментальную воспроизводимость результатов (КВмеж) определяли для серии экспериментов в течение двух дней. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2. Воспроизводимость и эффективность реакций для SYBR Green и Tag Man ПЦР-РВ______

Формат пцр-рв КВвн 1-й день, % КВвн 2-й день, % КВмеж, % Эффективность реакции, %

SYBR Green HER2SG 4,3 5.1 15,3 87-99

UBC sc; 2.15 7.Ü1 12.3

TaqMan her: 5.01 2.81 4.75 92-100

t liC 4.47 4.75 4.1

Из данных таблицы 2 видно, что обе системы обладают хорошей виут-риэкспериментальной воспроизводимостью. Однако в системе SYBR Green межэкспериментальная воспроизводимость результатов имела более высокую степень вариабельности по сравнению с системой TaqMan (межэкспериментальный KB SYBR Green > межэксперименталькый KB TaqMan),

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что использование предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ позволяет более корректно сравнивать внутри- и межэкспериментальные данные, обладает более широким диапазоном измерений, высокой эффективностью и чувствительностью реакции по сравнению с предложенным протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

3.1.2 Определение дозы гена HER2/neu в опухолевой ткани молочной железы с применением SYBR Green и TaqMan ПЦР-РВ

Определение дозы гена HER2/neu проводили в двадцати четырех образцах геномной ДНК, выделенной из ткани опухоли молочной железы человека. Методом SYBR Green было показано увеличение дозы гена HER2/neu у шести образцов. У восемнадцати образцов доза гена HER2/neit находилась в пределах нормы. TaqMan ПЦР-РВ анализ опухолевых образцов подтвердил увеличение дозы гена HER2/neu у тех же шести образцов ткани РМЖ и отсутствие увеличения дозы гена HER2/neu у восемнадцати образцов.

Регистрируемая кратность увеличения дозы гена HER2/neu зависела от формата ПЦР-РВ. Использование предложенного протокола SYBR Green формата ПЦР-РВ, в ряде случаев, приводила к занижению получаемых данных, что существенно ограничивает применение данной технологии при анализе увеличения дозы гена HER2/neu в опухолях РМЖ (рис. 3).

Рисунок 3. Кривые интенсивности флуоресценции увеличения цоты гш л HERl/ueu в опухолевой ДНК в методах SYBR Green и TaqMan ПЦР-РВ, {Л) Максимальное увеличение дозы гена HER2/neu зарегистрированное с помощью предложенного протокола SYBR Green ПЦР-РВ составило 5.5 раза в опухолевой ДНК по сравнению с контрольной ДНК. Образец опухолевой ДНК № 173. (Б) Максимальное увеличение дозы гена HER2Aieu, зарегистрированное с помощь ¡о предложенного протокола TaqMan ПЦР -PB, составило 10.4 раза в опухолевой ДНК по сравнению с контрольной ДНК. Образец опухолевой ДИК № 173 (Маценко H с еоавт., 2008).

Таким образом, в данной части работы было установлено, что предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ позволяет работать в более широком диапазоне начального количества ДНК. В дальнейшей работе при анализе дозы генов к опухолях РМЖ был использован предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ.

3.1.3. Сравнение результатов определения дозы гена HER2/neu предложенным протоколом TaqMan ПЦР-РВ с результатами ИГХ и FISH определения НЕЛ2-статуса опухолей РМЖ

Для вал и да ци и предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu, было проведено сравнение результатов ПЦР-

u = 'X1

/ / / v- ,tt«

;

■ - / si

J ~Ш-¡- -f"ï! ii—

t' w /1

- . w ■ » i

L / ' sä

; - jp /

: /' f 'fi

1 M g

iî • m j. II 1

4 *

РВ с данными ИГХ и FISH, которые на сегодняшний день являются основными методами определения НЕЯ2-статуса больных РМЖ в клинической практике.

Определение дозы гена HER2/neu методом TaqMan ПЦР-РВ проводили для 34 образцов РМЖ с известными результатами ИГХ анализа. Сравнение полученных результатов представлено в таблице 3.

Таблица 3. Сравнение результатов определения НЕЯ2-статуса опухолей РМЖ методом ТадМап ПЦР-РВ с результатами ИГХ анализа

Доза гена HER2/nen по данным TaqMan пцр-рв Данные игх анализа экспрессии HER2/neu

игх 3+ игх 2+ игх 1+ игх0

увеличенная 9 4 2 7**

пеувеличенная 0 6 3 8

Наличие амплифицированного гена HER2/neu было показано для всех девяти образцов опухоли РМЖ с ИГХ (3+).

Для десяти образцов с ИГХ 2+ статусом амплификация гена HER2/neu была выявлена в четырех образцах, в то время как метод FISH зарегистрировал амплификацию только в трех образцах. Невысокий уровень амплификации, выявленный TaqMan ПЦР-РВ в одном образце, объясняет небольшое количество рецептора HER2 на поверхности клеток, зарегистрированное ИГХ методом как (2+). В то же время, отрицательный результат FISH определения дозы гена HER2/neu в данном образце может быть объяснен присутствием в клетках анеусомии хромосомы 17, которое методом FISH не регистрируется как увеличение дозы гена HER2/neu. Подобное увеличение экспрессии и одновременное отсутствие амплификации гена HER2/neu описано в ряде публикаций (Ма Y. et а!., 2005; Hofmann М. et al., 2008). Для данной группы больных показана хорошая корреляция результатов определения дозы гена HER2/neu с помощью TaqMan ПЦР-РВ и результатов ИГХ и FISH диагностики НЕИ2-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8, ¿><0,005).

При анализе образцов со статусом опухоли ИГХ (1+) метод TaqMan ПЦР-РВ выявил амплификацию в двух случаях из пяти (40 %). Результаты FISH диагностики НЕ112-статуса опухолей РМЖ в данной группе образцов отсутствуют.

При анализе опухолей с ИГХ статусом (0), отсутствие амплификации было подтверждено для восьми образцов. У двух образцов было зарегистрировано увеличение дозы гена HER2/neu. Возможным объяснением этого факта является то, что в клетках данных опухолей амплификация гена HER2/neu не достаточна для увеличения экспрессии белка. Причинами, влияющими на данное событие, могут являться отсутствие промотора в

амплифицированном районе или то, что амплификация гена HER2/neu является ранним событием, предшествующим увеличенной экспрессии, С другой стороны отрицательный результат ИГХ анализа и одновременное присутствие амплифйцированного гена HER2/neti может быть результатом того, что на поверхности опухолевых клеток в данном образце присутствует укороченная форма HER2 рецептора с увеличенной тирозинкиназной активностью. Такая форма рецептора не содержит внеклеточного домена, с которым связываются антитела при ИГХ анализе. Однако рецептор сохраняет способность к гетер од и м еризации с другими рецепторами HER-семейства за счет сохранения внутримембранного сегмента и способен к передачи константного сигнала внутрь клетки (Christaason Т. et al., 1998; Molina M.eí al., 2002).

На основании полученных данных был создан прототип набора для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ с помощью TaqMan ПЦР-РВ. Набор прошел апробацию в ООО «Лаборатория Медиген».

Таким образом, в данном разделе работы было показано, что предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu обладает хорошей корреляцией с результатами методов ИГХ и FISH диагностики HER2-статуса опухолей РМЖ, которые на сегодняшний день рутинно используются в клинической практике.

3.2. Картирование границ амплификации в районе хромосомы 17ql2-q2I с помощью метода TaqMan ПЦР-РВ

3.2.1. Оценка минимальной длины амплкконов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, с помощью определения дозы соседних генов в образцах ткани опухоли РМЖ

Для оценки длины района амплификации вокруг HER2/neu с помощью определения дозы соседних генов в образцах ткани опухоли РМЖ было выбрано несколько генов-мишеней: PPPARBP, ZNFN1A3, CASC3 и ТОР2А (рис, 4). Дозу указанных генов определяли с помощью TaqMan ПЦР-РВ (рис. 5). На основании данных об амплификации соседних генов говорили

Рисунок 4. Схематичное расположение исследуемых генои

PPPARBP, HER2/neu, ZNFN1A3, CASC3 И ТОР2А в районе хромосомы J7q!2q2J.

Б.

И'.-ШУ'-опуколъ

I I I

- ИУШ'-коитр.

.г ж

згг Ь I -¡1

шш

I_ЦТ

1П|

| I I

- ТОР1А-хшщ>.

Р1 ж М1

й I

ш!

Рисунок 5. Кривые 1|цтеиснв|]осл1 ф. II оресценшш увеличения дозы исследовя п-ных генов в одном обризие опухолевое ткаин РМ'Ж .\n763 с помощью метода ТацМап ГЩР-Р!!. (Д) Увеличение дозы гена НЕШ/пеи и 3.9-1 раза в опухолевом образце по сравнению с контрольным образом ДНК. Кривые интенсивности флуоресценции для нормировочного гена и ВС в контрольном и опухолевом образцах совпадают (Г>) Увеличение дозы гена РРАНВР в 2,55 раза в опухолевом образно по сравнению с контрольным образцом. Кривые интенсивности флуоресценции лля нормировочного гена 11 ВС в контрольном и опухолевом образцах практическим совпадают и располагаются па графике справа {В} Увеличение дезы гена САЗСЗ в 4.43 раза в опухолевом образце но сравне-ншо е контрольны л образном. Кривые интенсивности флуоресценции для нормировочного гена 11ВС в контрольном и опухолевом образцах совпадают Кривая интенсивности флуоресценции для САЗСЗ в контроле Практически совпадает с кривыми иве (Г) Увеличение дозы гена ТОР2А в 3.11 раза п опухолевом образце но сравнению с контрольным образцом. Кривые интенсивности флуоресценции для нормировочного гена ОВС в контрольном и опухолевом образцах совпадают. Кривая интенсивности флуоресценции для ТОР2А в контроле практически совпадает с кривыми ОВС. (А) - опухоль, (■) - контроль.

об амплификации всего фрагмента хромосомы фланкированного данными генами. В качестве границы амплификации района хромосомы принимали точку между соседними генами с увеличенной и не увеличенной дозой. Из 162-х образцов опухолей РМЖ у 56-ти образцов (34.5%) была зарегистрирована увеличенная доза гена НЕШ/пеи (Мнш пен - 1 -5), в то время как у оставшихся 106-ти образцов, доза гена НЕШ/пеи лежала в пределах нормы (рис. 6).

fr H LT. Jfr Л 36 4J 4ft SI ifl «1

ОбрОЦЫ

Рисунок б. Диаграмма изменения дозы гена НЕЯ2/пеи в 56-ти образцах с диагнозом РМЖ но сравнению с контролем.

(черный) - доза гена НЕИ2/пе и в опухолях РМЖ; (серый) - доза гена И ЕЮ/пен у здоровых людей; (белым) - нормировочный ген иВС.

Полученные результаты согласовываются и даже несколько превышают данные зарубежных и российских исследований (25-30%) (Slamon D. et ей. 1989, Имянитов Е.Н, с соавт, 1992). Превышение среднемирового и среднероссийского значения процента больных с увеличенной дозой гена HER2/neu среди пациенток с диагнозом РМЖ в настоящем исследовании может отражать неблагоприятную картину данного заболевания по Новосибирской области. Настоящая работа является первым подобным исследованием дозы гена HER2/nea у больных РМЖ в г. Новосибирске и Новосибирской области России.

Дозу оставшихся генов определяли у данных пятидесяти шести образцов РМЖ. По результатам анализа дозы всех выбранных генов образцы с амплификацией в районе PPARBP - HER2/neu - ТОР2А, были поделены на б групп. Группа (1) - увеличена доза всех генов-мишеней (17 образцов, 30.4%). Наиболее простым объяснением служит то, что все эти гены располагаются в едином ампликоне. Различный уровень амплификации генов внутри одного ампликона может отражать наличие сложных вторичиых перестроек в данном районе, которые являются частым событием в раковых клетках (Jacobson К. et al., 2004). Существующие на сегодняшний день в литературе описания моделей внурихромосомной амплификации также подтверждают возможное существование подобных перестроек внутри единого ампликона (McClintock В. 1954, Savelyeva L. et al. 2001). Другим объяснением одновременного увеличения дозы всех исследованных генов может являться следствием анеусомии хромосомы 17, которая является довольно частым событием и показана в 24-54% случаев РМЖ (Watters А. et al. 2003, Merola R. et al., 2006).

Группа (11) - увеличена доза HER2/neu и одного или более соседних генов (18 образцов, 32.1%). Различная длина ампликонов, установленная в образцах, сформировавших группу II, согласуется с моделью внутрихро-мосомной амплификации по типу BFB цикла, которая предполагает нали-

чие потенциальных сайтов ломкости на теломерном конце амплифициро-ванного фрагмента (McClintock В., 1954).

Группа (III) - увеличена доза HER2/neu и одного или более генов-мишеней с прерыванием генами-мишенями с неувеличенной дозой (12 образцов, 21.4%).

Группа (IV) увеличена доза только гена HER2/neu. Присутствие амплификации только гена HER2/neu было показано только для двух образцов из 56-ти (3.5 %). Это свидетельствует о том, что амплификация единственного гена является достаточно редким событием в геноме опухолевых клеток.

Группа (V) недостаточное количество ДНК для полного анализа (7 образцов).

Группа (VI) доза гена HER2/neu не увеличена (106 образцов).

На основе полученных результатов в районе хромосомы 17ql2-q21 было выявлено несколько типов ампликонов отличающихся по длине, которые содержат ген HER2/neu (рис. 7).

Рисунок 7. Схематичное изображение ампликонов разной длины в районе хромосомы 17ql2-q21, содержащих увеличенную дозу гена HER2/neu. Сверху показано взаимное расположение исследованных генов в районе хромосомы 17ql2-q21. Справа указан размер амплифи-цированных фрагментов хромосомы, которые содержат ген HER2/neu. Слева указано количество образцов, которые входят в состав каждой из четырех групп (I-IV).

PPARBP HER2/neu ZNFN1A3 CASC3

ф.1 " I

rp.ll

-455 т.п. н. -322 т.п.«.

: б

rp.lll з 3

rp.lvl 2

□ 40т.п.н.

Таким образом, в данном разделе работы было показано, что в подавляющем большинстве случаев (96%) увеличение дозы гена НЕК2/пеи происходит сцеплено с рядом соседних генов: 2ЫЕЫ1АЗ, САБСЗ, ТОР2А и РРАРВР.

3.3. Компьютерный анализ структурных особенностей нуклеотидной последовательности ДНК в районе хромосомы \lq\2-q2\

Процесс амплификации часто инициирован возникновением двуцепо-чечного разрыва ДНК. Из литературы известно о специфических нуклео-тидных последовательностях, которые способны промотировать двуцепо-чечные разрывы ДНК и последующие геномные перестройки. Сайты лом-

кости являются одним из наиболее характерных примеров таких нуклео-тидных последовательностей (Hewett D. et al., 1998; Mishmar D. et al., 1999). Характерной особенностью известных сайтов ломкости является высокая флексибильность нуклеотидной последовательности, обусловленная их богатым АТ-динуклеотидным составом, а также способность таких нуклеотидных последовательностей формировать устойчивые вторичные структуры, которые затрудняют работу репликативного комплекса (Zlotorynski Е. et al., 2003). В литературе показано участие сайтов ломкости в различных хромосомных перестройках и в частности в процессе инициирования BFB-цикла внутрихромосомной амплификации.

Принимая во внимание вышесказанное, на данном этапе работы был проведен анализ флексибильности нуклеотидной последовательности фрагмента хромосомы 17ql2-q21 вокруг гена HER2/neu.

3.3.1. Район TBC1D3 — HER2/neu — ТОР2Л содержит последовательности ДНК с высокой флексибильностью

Фрагмент хромосомы 17ql2-q21 длиной 4.0 м.п.н. вокруг гена HER2/neu содержал 58 сайтов флексибильности, включая 23 сайта (39%) в кодирующих последовательностях и 35 (61%) сайтов - в некодирующих областях (рис. 8). Для дальнейшей работы были выбраны сайты с наибольшим значением флексибильности и наибольшей протяженности, зарегистрированные в генах SOCS7, FBX047, PLXDC1, ZNFN1A3. Остальные сайты, вследствие невысокого значения флексибильности и небольшой протяженности, в дальнейшей работе не рассматривали.

3.3.2. Нуклеотидные последовательности флексибильных районов

FlexFBX047, FlexZNF-1, FlexZNF-2 высоко гомологичны с АТ-богатыми последовательностями редких и частых сайтах ломкости По результатам, полученным из термодинамических вычислений программы TwistFlex, сайты с высокой флексибильностью, обнаруженные внутри генов SOCS7, FBX047, PLXDC1 и ZNFN1A3 обладали повышенным содержанием А/Т-нуклеотидов (79% ± 6.7%). Эти данные превышали аналогичные показатели для фланкирующих нефлексибильных последовательностей той же длины (55% ± 2.8%, р< 0.01). Кроме того, было установлено, что данные флексибильные сайты были значительно более обогащены содержанием АТ/ТА-динуклеотидов (23% ± 3.3%, и 25% ± 5.0%, соответственно) по сравнению с нефлексибильными районами (5.66% ± 0.49% и 5.38% ± 1.56%, соответственно,р< 0.01).

Для того чтобы выяснить имеют ли данные флексибильные сайты сходство с островками флексибильности в редких и частых сайтах ломкости (PCJI, 4CJI) был проведен множественный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей (рис. 9). Для сравнительного анализа использовали нуклеотидные последовательности из флексибильных районов

I 1 II I il I !

Рисунок 8. Схема взаимного расположения флекенбяльных сайтов и исследуемых генов в последовательности района хромосомы I7ql2-q21. Анализ флексибильносш производили с помощью программы TwistFIex. График демонстрирует распределение сайтов флекенбильности внутри 4.0 м.п.н. района хромосомы. (•) - сайты с наибольшим значением флексибильности, зарегистрированные в генах SOCS7. FBXQ47, PLXDCS, ZNFN1A3 и некодирующеЙ последовательности (—) - гены, дозу которых Определяли с помощью метода TaqMan ПЦР-Р13. Для обозначения сайтов высокой флексибильностм использовали название гена, в котором данный сайт был обнаружен, с приставкой «F/ex».

РСЛ: FRA10В (Hewelt D„ et al., 1998); ЧСЛ: FRA7G и FRA7E (Mîshmar D. et al., 1999) и двух произвольных нефлексибильных последовательностей ДНК.

Наибольшей гомологией с островками флексибильности из известных сайтов ломкости обладали нуклеотидные последовательности флекси-бильных сайтов FlexFBX047, FlexZNF-1, FlexZNF-2. Флексибильные нуклеотидные последовательности в генах SOCS7 и PLXDC1 обладали низкой гомологией с островками флексибильности из известных сайтов ломкости.

Таким образом, для дальнейшего исследования были отобраны флексибильные сайты в генах FBX047 и ZNFN1A3.

Рисунок 9, Диаграмма множесiвенного сравнительного анализа флекенбнльных и у кл еотнд] I ы я послело в а гол ы i остей

F!exFBX047, FtexZNF-l, FlexZNF-2, Fiex-SOCS7-1, FtexSOCS7-2, FlexSOCS7-3 и FlexPLXDCI с флекенбилъпымн островками в сайтах ломкости IRAIOB. TKAIG, FltA7E и одним неф леке обильным районом. Данные о степени гомологии последовательностей поаучены путем попарного сравнения последовательностей программе» Clialal W2.

IHAWB HU70 FRAt mvFU-IX

нстриаьл ф."К1аибммастп • ЧСЛ и ГСЛ

3.3.3. Нуклеотвдные последовательности флексибильных сайтов F¡exZNF-l п Шех2И¥-2 обладают предрасположенностью к формированию устойчивых вторичных структур

По результатам анализа компьютерной программы МРоИ нуклеотид-ные последовательности флексибильных районов ШехРВХ047, Р1ех2ИР-] и Р1ахХЫР-2 способны формировать разнообразные вторичные структуры ДНК. Все полученные вторичные структуры характеризовались наличием одной или нескольких удлиненных и сложно-разветвленных шпилек, в образовании которых участвовало более чем 85%, а в случае FlexZNF-2 более чем 95% его нуклеотидной последовательности (рис. 10).

Рисунок 10, Вторичные структуры образованные флекснбнльными районами

Р1ех2ЫР-2 и Р1ехРВХ047. (Л) Вторичная структура, образованная последовательностью Р!ех2ЫГ-!, длина 292 пл., сЮ=- 46.5 кк ал/моль (Б) Вторичная структура, образованная последовательностью Р\ех1Ш-2, длина 1133 п.и,, ¡йЗ=-205.5 ккал/моль. (В) Вторичная структура, образованная последовательностью Р1ехРВХ047, длина 1278 п.н., (Ю=-152.11 ккал/моль. Стрелкой указано начало последовательности.

Вторичные структуры, образованные нуклеотидными последовательностями указанных флексибильных сайтов, обладали гораздо большей устойчивостью, по сравнению с вторичными структурами искусственно сгенерированных последовательностей идентичного нуклеотидпого состава (р < 0.01).

Кроме того, только вторичные структуры, образованные нуклеотидными последовательностями флексибильных сайтов Fle.xZ.NF-1 н F!exZNF-2 обладали большей устойчивостью по сравнению с вторичными структурами, образованными фланкирующими нуклеотидными последовательностями равной длины, для которых отсутствие флексибильности было подтверждено программой Т"т51р]ех. Для флексибильного сайта РкхРВХ047 МГоШ анализ выявил, что вторичная структура, сформированная нуклеотидной последовательностью, фланкирующей сайт с теломерной стороны, имела значение с10 в два раза ниже, по сравнению со значением йС для вторичной структуры, сформированной нуклеотидной последовательностью самого флексибильного сайта.

Таким образом, только нуклеотидные последовательности флекси-бильных сайтов FlexZNF-1 и FlexZNF-2 способны формировать устойчивые вторичные структуры, которые обладают большей свободной энергией образования по сравнению с произвольными нуклеотидными последовательностями аналогичной длины, и степень устойчивости вторичных структур зависит от организации нуклеотидного состава последовательностей. Именно нуклеотидные последовательности флексибильных сайтов FlexZNF-1 и FlexZNF-2 были выбраны для дальнейшего исследования в качестве потенциальных мест расположения границ района амплификации.

3.4. Анализ взаимосвязи между местоположением границ амплификации и локализацией специфических нуклеотидных последовательностей в районе хромосомы 17ql2-q21

3.4.1. Амплификация фрагментов гена ZNFN1A3, локализованных

«до» и «после» сайтов высокой флексибильности FlexZNF-1 и

FlexZNF-2

В связи с тем, что в нуклеотидной последовательности гена ZNFN1A3 были установлены сайты высокой флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2, которые по нашему предположению могут являться местами возникновения двуцепочечных разрывов, и, соответственно, границей ампликонов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, анализ амплификации фрагментов гена ZNFN1A3 проводили в двух точках, вокруг данной флексибильной области. Для этого были подобраны районы для гибридизации двух пар праймеров и флуоресцентных зондов, которые фланкировали участок гена с флексибильными сайтами FlexZNF-1 и FlexZNF-2 с двух сторон на расстоянии 32 т.п.н. (рис. 11).

В случае расположения границы ампликонов хромосомы в данной области — амплификация фрагментов гена ZNFN1A3, выбранных вокруг флексибильного района, будет различной - присутствовать с проксимальной стороны (ближе к гену HER2/neu) и отсутствовать с дистальной стороны.

В первой части работы у девяти образцов РМЖ из группы III была показана амплификация фрагмента фланкированного праймерами ZNFNlA3end и отсутствие амплификации фрагмента фланкированного праймерами ZNFNlA3start (рис. 7). Это подтверждает нашу гипотезу о том, что внутри района, длиной 32 т.п.н., который фланкирован вышеуказанными праймерами, располагаются нуклеотидные последовательности, чувствительные к возникновению двуцепочечных разрывов хромосомы, которые могут являться границами ампликонов хромосомы, содержащих ген HER2/neu.

а ■ 1111 ii

Рисунок 11. Схематичное расположение мест гибридизации праймеров ¿ЛУяЛзг/ и 2ЫРепс1 внутри гена 2№Ы1АЗ. Праймеры фланкируют флексибильные сайты Р1ех2Ш-1 и Иех2№-2 на расстоянии 32 т.п.н.

Для уточнения границ предполагаемого места разрыва ДНК был проведен дополнительный анализ уровня амплификации фрагментов гена ZNFN1A3, которые фланкируют районы флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2 внутри вышеописанного фрагмента, длиной 32 т.п.н. Для этого были выбраны районы нуклеотидной последовательности гена ZNFN1A3 для гибридизации двух дополнительных пар праймеров ZNFcentr и ZNFtel. Расположение всех пар праймеров относительно флексибильных районов представлено на рис. 12.

С помощью праймеров ZNFcentr и ZNFtel методом TaqMan ПЦР-РВ была проанализирована амплификация фрагментов, фланкированных данными праймерами у девяти образцов из группы III, для которых был продемонстрирован увеличенный уровень амплификации фрагмента с использованием пары праймеров ZNFNlA3end и неувеличенный уровень амплификации фрагмента для пары праймеров ZNFNlA3start (рис. 13)

Из данных рис. 13 видно, что у шести образцов из группы III продемонстрирована амплификация ПЦР-фрагмента, фланкированного праймерами ZNFcentr и отсутствие амплификации ПЦР-фрагмента, фланкированного праймерами ZNFtel. Эти данные поддерживают нашу гипотезу о том, что флексибильный сайт FlexZNF-2 обладает повышенной чувствительностью к возникновению двуцепочечного разрыва ДНК и может являться точкой инициации процесса внутрихромосомной амплификации района хромосомы 17ql2-q21, содержащей ген HER2/neu.

У одного образца продемонстрировано отсутствие амплификации обоих ПЦР-фрагментов, фланкированных праймерами: ZNFtel и ZNFcentr. Это свидетельствует о том, что граница амплифицированного района лежит в 12 т.п.н. районе между праймерами ZNFend и ZNFcent. И, наоборот, у одного образца анализ показал амплификацию фрагментов, фланкированных праймерами ZNFtel и ZNFcentr. Это свидетельствует о том, что в данном случае граница амплификации лежит дистальнее флексибильного сайта FlexZNF-2 на участке длиной 10 т.п.н. между участками

ч 4.77 Т.п К

экэ.З экз.2 ЭК3.1

т т 1 т * т.

У//У//Ш////?7У///УХ7Л Л II

л А А

1г. J 12.0 т.п.н. 7ЫРеп(] •« ► гИРсетг 4 «■6 Т.П.Н. ^ 2МПе| ч 10.3 т.п.н.

Рисунок 12. Расположение праймеров во фрагменте последовательности гена ZЛгF^V//li содержащего сайты повышенной флекснбильности ДНК. (стрелка вверх) -обозначено расположение праймеров. (стрелка вниз) - указано расположение экзонов в последовательности гена 2ИРИ1АЗ. (серый цвет) - сайты повышенной флекснбильности, Р1ех2ИР-2 (1133 п.н.) и Р1ех2Ш-1 (292 п.н.). (штрих) - фрагмент гена ШРШАЗ с увеличенным уровнем амплификации в 6-ти образцах РМЖ (гр. III). Длина изображенного фрагмента последовательности гена 2ЫРМ1АЗ составляет ~32 т.п.н. Праймеры 2ИРсеМг располагаются на 12 т.п.н. ближе к району флекснбильности Р\ех2Ш-2 по сравнению с праймерами 2ЫРепс!, а праймеры 2ЫР1е1 гибридизуются на конец флексибильного района Р1ех2ЫР-2, и таким образом разграничивают сайты флекснбильности FIexZNF-l и Р1ех2ЫР-2.

Рисунок 13. Схема амплн-РРАПВР НЕИ2/пеи гЦРШАЗ С/ЯСЗ Т0Р2А фнкации фрагментов гена

ZNFN1AЗ вокруг района повышенной флекснбильности Пех2^Р-2. На схеме изображено взаимное расположение праймеров 2Ш7епс1, 2ЫРсеп1г, 2ЫР1е\ и 2Ш$1аг1 в последовательности гена 2ЫРИ1АЗ относительно флексибильных сайтов Р1ех2ЫР-1 и Р1ех2ИР-2. Внизу заштрихованными прямоугольниками изображены амплифицированные фрагменты хромосомы 17ч12-^21 относительно указанных праймеров. Слева указано количество образцов ткани РМЖ у которых выявлен подобный тип амплификации.

гибридизации праймеров 2Л7г/е/ и 2А7г5,/а/*Л Учитывая, что в данном районе находится флексибильный сайт Пех2МЕ-1, можно с достаточными основаниями предполагать, что именно он может играть значимую роль при возникновении двуцепочечного разрыва, определяющего теломерную границу амплифицированного района у данного образца.

Таким образом, с помощью определения методом ТадМап ПЦР-РВ амплификации фрагментов гена 2ЫРМ1АЗ в образцах РМЖ с увеличенной дозой гена НЕК2/пеи, в данной части работы было установлено, что в ряде случаев границы ампликонов, содержащих повышенную дозу гена НЕЯ2/пеи, располагаются внутри нуклеотидной последовательности гена

ZNFN1A3 в области сайтов высокой флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2. Это подтверждает выдвинутую в данном исследовании гипотезу о том, что районы высокой флексибильности могут принимать участие в процессах внутрихромосомной амплификации в опухолевых клетках при РМЖ.

Полученные нами данные об увеличении дозы ряда генов вокруг гена HER2/neu отражают сложность и многообразие вариантов амплификации даже на таком небольшом участке длиной 1 м.п.н. в геноме опухолевых клеток. Определение точных границ ампликонов может дать исследователям дополнительные сведения об особенностях процессов амплификации и возможно выявить роль нуклеотидной последовательности ДНК в механизмах инициации данного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ, который обеспечивает более высокие чувствительность (1 нг геномной ДНК), воспроизводимость реакции (КВ<5%) и позволяет работать с большим диапазоном концентраций ДНК (1-100 нг геномной ДНК) по сравнению с протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

2. Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с результатами ИГХ и FISH методов определения НЕ112-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8, р<0.005).

3. Среди 162 образцов опухолевой ткани РМЖ увеличение дозы гена HER2/neu было зарегистрировано в 56-ти образцах (34.5%).

4. Продемонстрировано наличие амплифицированных районов хромосомы разной длины (от 40 т.п.н. до 1 м.п.н. и более), содержащих ген HER2/neu в районе хромосомы 17ql2-q21 в разных образцах опухолей РМЖ.

5. Фрагмент хромосомы 17ql2-q21 включающий ген HER2/neu, содержит районы высокой флексибильности FlexZNF-1 (292 п.н.) и FlexZNF-2 (1133 п.н.), которые обладают способностью формировать устойчивые вторичные структуры.

6. Границы амплифицированных районов в районе хромосомы 17ql2-q21 в ряде опухолей с увеличенной дозой гена HER2/neu, находятся в пределах области высокой флексибильности, длиной 9.6 т.п.н. (NT_0107555 (1722059...1731701) Gene Bank). Предположено участие сайтов высокой флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2 в процессах внутрихромосомной амплификации в клетках опухолей РМЖ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Маценко Н.Ю., Коваленко С.П. Анализ дозы гена her2 методом ПЦР с использованием внутреннего стандарта в образцах ткани опухоли молочной железы человека // Материалы VIII Российского онкологического конгресса. - Москва: Издательская группа РОНЦ им. H.H. Блохина. -2004.-С. 198.

2. Маценко Н.Ю., Коваленко С.П. Анализ дозы гена her! в образцах ткани опухоли молочной железы человека методом ПЦР // Труды I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология». - 2005. -С. 114.

3. Коваленко С.П., Маценко НЛО. Гиперэкспрессия онкогена HER2/neu в опухолевых клетках - молекулярные механизмы, технологии анализа, прогностическая значимость. Учебно-методическое пособие. -Новосибирск: Изд. РИЦ НГУ. - 2006. - С. 48.

4. Маценко НЛО., Коваленко С.П. Анализ дозы гена her-2 методом ПЦР с использованием внутреннего стандарта в образцах опухолей молочной железы человека // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2006. -№1. - СС. 34-37.

5. Маценко Н.Ю., Коваленко С.П. Анализ границ амплификации района, содержащего ген ERBB2, при раке молочной железы // Вопросы онкологии - 2006. - Т. 52 (1). Приложение. - С. 23.

6. Маценко Н.Ю., Коваленко С.П. Анализ фрагильных сайтов в перестройках хромосомы 17, ведущих к амплификации гена HER-2/neu при раке молочной железы // Вопросы онкологии - 2007. - Т. 53 (1). - СС. 1920.

7. Коваленко С.П., Маценко Н.Ю. Анализ хромосомных перестроек, приводящих к гиперэкспрессии онкогена HER2/neu при раке молочной железы // Тез. XI Российский онкологический конгресс. Москва - 2007. -С. 58.

8. Matsenko N.Y., Kovalenko S.P. Possible participation of fragile sites in her2/neu gene amplification on 17ql2-21 chromosome in breast cancer // Eur. J. Cancer (Supplements) - 2007 - V. 5 (4). - P. 102.

9. Маценко Н.Ю., Рыжикова B.C., Коваленко С.П. Сравнение SYBR Green I и TaqMan форматов ПЦР-РВ для анализа дозы гена her2 в опухолях молочной железы человека // Бюл. экспер. биол. мед. - 2008. - Т. 145. - № 2. - СС. 201-205.

10. Маценко Н.Ю. Роль сайтов ломкости ДНК в амплификации HER2/neu при раке молочной Железы //Вестник РАМН. - Т. 6. (Приложение) - 2008. - СС. 280-281.

11. С. П. Коваленко, О.Б. Часовникова, Д.В. Митрофанов, Маценко НЛО., Сидоров С.В., Францкевич О.З., Ляхович В.В. Молекулярно-генетический анализ как инструмент современной онкологии // Бюл. экспер. биол. мед. - №2. - СС. 29-35.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

CGH - comparative genomic hybridization, сравнительная геномная гибридизация;

FISH - fluorescent in situ hybridization, флуоресцентная in situ гибридизация;

ИГХ - иммуногистохимический анализ;

м.п.н. - миллион пар нуклеотидных оснований,

РМЖ - рак молочной железы;

РОНЦ - Российский онкологический научный центр;

п.н. - пара нуклеотидных оснований.

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в формате реального времени;

PCJI - редкий сайт ломкости;

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидных оснований;

4CJI - частый сайт ломкости.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит ближайших коллег, оказавших помощь к подготовке данной работы, и, персонально, выражает благодарность зав. 3-го онкологического отделения МУЗ ГКБ №1, д.м.н., профессору Сидорову С.В. и онкологу-маммологу Францкевич О.З. (МУЗ ГКБ №1) за помощь в организации сбора клинического материала для исследования, д.б.н., профессору Гуляевой Л.Ф. (ГУ НИИМББ СО РАМН) за моральную поддержку и дружеское участие при работе над диссертацией, д.м.н. Дубине М.В. (Институт онкологии им. Петрова, Санкт Петербург) за помощь в проведении части экспериментальной работы, к.б.н., доценту Коваленко С.П. (ГУ НИИМББ СО РАМН) за научное руководство работой.

Подписано в печать 10.10.2008 г. Формат бумаги 60x84/16, Усл.печ.л. 1,6 Уч.-изд. л. 1.5, тираж 100 экз.; заказ 1271

Отпечатано «Документ-Сервис» 630090,г.Новосибирск, ул. Институтская 4/1 Тел. 335 66 00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маценко, Наталья Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Рецептор HER2 - член семейства рецепторов эпидермального фактора роста.

1.1.1. Семейство рецепторов EGF.

1.1.2. Факторы роста - лиганды семейства рецепторов EGF.

1.1.3. Особенности строения рецептора НЕЮ.

1.2. Молекулярные механизмы увеличения экспрессии гена рецептора HER

1.2.1. Хромосомные перестройки.

1.2.2. Анеусомия.

1.2.3. Регуляция экспрессии гена HER2/neu транскрипционными факторами

1.2.4. Амплификация гена HER2/neu.22

1.3. Роль рецептора HER2 в неопластической трансформации клеток.

1.4. Особенности изменения клинических показателей у пациенток с повышенным уровнем экспрессии гена HER2/neu в клетках злокачественных опухолей различного типа.

1.5. Прогностическая значимость увеличения экспрессии и дозы гена HER2/neu.

1.6. Рецептор HER2 - мишень для противоопухолевой терапии.

1.7. Технологии анализа НЕК2-статуса опухоли.

1.7.1. Диагностика методом ИГХ.

1.7.2. Диагностика методом ИФА.

1.7.3. Диагностика методом FISH.

1.7.4. Метод ПЦР диагностики.

1.7.4.1. ПЦР-РВ.

1.8. Модели механизмов амплификации генов и фрагментов хромосом.

1.8.1. Амплификация является частым событием в опухолевых клетках.

1.8.2. Причины инициации амплификации.

1.8.2.1. Репликация ДНК.

1.8.2.2. Дисфункция теломеров.

1.8.2.3. Сайты ломкости.

1.8.3. Механизмы амплификации.

1.8.3.1. Внутрихромосомная амплификация по модели BFB цикла.

1.8.3.2. Внехромосомная амплификация фрагментов хромосом.

1.8.3.3. Альтернативный механизм амплификации онкогенов в районе хромосомы 17q21.

1.9. Доза генов, располагающихся вокруг гена HER2/neu, их функции и описанные случаи изменения активности в опухолях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu"

На сегодняшний день во всем мире продолжает увеличиваться заболеваемость злокачественными новообразованиями. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. По данным ВОЗ, в мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев РМЖ, а к 2010 г. прогнозируется до 12.5 млн. заболевших РМЖ.

По последним данным, опубликованным Российским Онкологическим Научным Центром, ежегодно в России около 50 тыс. женщин ставится диагноз РМЖ, при этом отмечается снижение возраста заболевших. В настоящее время под наблюдением находятся около 500 тыс. женщин с диагнозом РМЖ. Статистика смертности от этого заболевания также неутешительна — около 24 тыс. женщин в год. Первый пик заболеваемости приходится на репродуктивный период от 30 до 40 лет. Число заболевших за этот период составляет 80-100 человек на сто тысяч женщин. В последующие годы жизни отмечается увеличение частоты РМЖ, в частности, если в 50 лет регистрируется 180 случаев, то после 65 лет - 250 случаев на сто тысяч женщин.

Новосибирск по заболеваемости злокачественными новообразованиями входит в десять самых неблагополучных регионов РФ. По данным ежегодной отчетной конференции онкологов в 2006 году в Новосибирске количество больных РМЖ составило 81.6 больных РМЖ на 100 тысяч женского населения. Только в 2006 году в Новосибирске диагностированы новые случаи РМЖ у 622 больных. Большинству пациенток выполнены калечащие операции - полное удаление молочной железы.

Yang-Feng Т. et al, 1985; Di Fiore P. et al, 1987). Из общего числа пациенток страдающих РМЖ, увеличенная экспрессия гена HER2/neu, кодирующего рецептор HER2, в клетках опухоли встречается в 20-30% случаев (Slamon D. et al., 1987; 1989). Избыточное наличие этого рецептора на поверхности опухолевых клеток свидетельствует о наиболее агрессивной форме РМЖ, которая характеризуется быстрым ростом опухоли, высокой вероятностью метаста-зирования, снижением эффективности химио-, гормональной и лучевой терапии (Имянитов Е.Н с соавт., 1992; Masood S. и Bui М., 2002). В подавляющем большинстве случаев в основе увеличенной экспрессии рецептора лежит амплификация гена HER2/neu (Couturier J. et al, 1999; Jacobs T. et al, 1999a). Своевременная диагностика НЕ112-статуса опухоли позволяет назначить адекватное и эффективное лечение РМЖ.

На данный момент в России существуют проблемы с диагностикой РМЖ в целом и с определением НЕЯ2-статуса опухолей в частности, связанные как с плохим оснащением по всей стране диагностических лабораторий, так и с несовершенностью применяемых методов диагностики: иммуногистохими-ческого (ИГХ) анализа и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). На сегодняшний день, проблема отсутствия быстрого, точного и доступного для большинства диагностических лабораторий метода определения HER2-статуса пациенток с РМЖ имеет острую социальную важность. Знание НЕБ12-статуса пациенток и использование анти-НЕЯ2-направленной терапии - Герцептина® - позволяет назначить индивидуальное и оптимизированное лечение больных РМЖ, исключив назначение заведомо неэффективной терапии. Таким образом, поиск нового подхода к определению НЕЯ2-статуса опухолей РМЖ, который учитывал бы недостатки ныне использующихся методик определения и был доступен для большинства диагностических лабораторий в качестве рутинного анализа, является одной из актуальных проблем современной онкологии.

Амплификация генов — один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли. В большинстве случаев амплификация является не уникальным событием для одного гена и затрагивает целые фрагменты хромосом (Hyman Е. et al, 2002). В литературе описано несколько механизмов амплификации, предложенных для объяснения активации онкогенов в клеточных линиях опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ (Savelyeva L. и Schwab М., 2001; Albertson D., 2006). Однако предложенные модели амплификации не дают ответа на вопрос о причинах ее возникновения. В каком случае этот процесс случайный, а в каком случае - селективное событие? Почему амплификация возникает в определенных локусах на хромосоме? Существуют ли закономерности амплификации, общие молекулярные основы и механизмы ее инициации? Если подобные закономерности и общие механизмы возникновения амплификации онкогенов существуют, то их открытие может послужить основой для разработки новых препаратов направленного действия для анти-раковой терапии, которые позволят контролировать и даже предотвращать развитие раковых опухолей у человека. В свете постоянного увеличения заболеваемости злокачественными новообразованиями актуальность данной темы не вызывает сомнений.

Изложенное выше, определило цель настоящей работы:

Картирование границ фрагмента ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21 в клетках опухолей РМЖ человека с увеличенной дозой гена HER2/neu и выявление структурных особенностей ДНК на данных границах.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

2. Провести сравнительный анализ результатов определения дозы гена HER2/neu методом ПЦР-РВ с результатами методов ИГХ и FISH определения НЕК2-статуса опухолей РМЖ.

3. Определить дозу гена HER2/neu в панели образцов опухолей РМЖ человека методом ПЦР-РВ.

4. Провести определение дозы ряда соседних с HER2/neu генов.

5. Установить длину и границы амплифицированных районов ДНК, содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21.

Научная новизна работы.

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые были получены следующие данные:

- Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для анализа дозы гена HER2/neu\

- Установлена высокая корреляция результатов (>=0.8, р<0,005), полученных с использованием предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu, с результатами определения НЕК2-статуса опухолей РМЖ с помощью методов ИГХ и FISH;

- Установлено наличие амплифицированных фрагментов ДНК разной длины (от 40 т.п.н. до 1 м.п.н и более), содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21, в разных образцах опухолей РМЖ;

- Впервые продемонстрировано наличие сайтов высокой флексибильно-сти в районе хромосомы 17ql2-q21;

- На основе полученных данных выдвинуто предположение об участии районов высокой флексибильности в процессах инициации внутрихромо-сомной амплификации ДНК в клетках опухолей РМЖ.

Научно-практическая значимость.

По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование, позволяющее говорить о том, что амплификация фрагментов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu, по крайней мере, в некоторых точках ассоциирована с наличием районов высокой флексибильности ДНК. Данные о связи сайтов высокой флексибильности с границами амплифицированных районов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, могут оказаться полезными для изучения механизмов амплификации данного онкогена в клетках РМЖ, а также для выявления общих закономерностей процессов амплификации онкогенов в опухолевых клетках. Кроме того, дальнейшее исследование подобных взаимосвязей, возможно, окажется полезным для поиска новых подходов при разработке таргетной терапии РМЖ.

Прикладное применение данной работы связано с возможностью выбора рациональных схем терапии при РМЖ в зависимости от длины амплифицированных фрагментов хромосомы 17q, содержащих ген HER2/neu. В ходе работы был предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ, на основе которого был создан прототип набора для определения дозы гена HER2/nen в опухолевой ткани РМЖ с дальнейшей возможностью применения его в диагностической практике (см. приложение 1).

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с данными методов ИГХ и FISH определения НЕЯЗ-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8,р<0.005).

3. Увеличение дозы гена HER2/neu выявлено в 34.5% исследованных опухолей РМЖ.

5. В районе хромосомы 17ql2-q21 (NT0107555 (1722059.1731701) Gene Bank), прилегающем к гену HER2/neu, располагаются нуклеотидные последовательности ДНК с высокой флексибильностью.

6. Расположение границ ряда амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, совпадает с локализацией одного из сайтов высокой флексибильности FlexZNF-2 в районе хромосомы 17ql2-q21, что свидетельствует об его возможном участии в процессах внутрихромосомной амплификации.

Апробация работы.

Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, Россия, 2004); на I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, Россия, 2005); на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006); на XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); на 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); на 14-й Европейской конференции по Онкологии, ЕСС014 (Barcelona, Spain, 2007); на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Маценко, Наталья Юрьевна

Выводы

1. Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ, который обеспечивает более высокие чувствительность (1 нг геномной ДНК), воспроизводимость реакции (КВ<5%) и позволяет работать с большим диапазоном концентраций ДНК (1100 нг геномной ДНК) по сравнению с протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

3. Среди 162 образцов опухолевой ткани РМЖ увеличение дозы гена HER2/neu было зарегистрировано в 56-ти образцах (34.5%).

6. Границы амплифицированных районов в районе хромосомы 17ql2-q21 в ряде опухолей с увеличенной дозой гена HER2/neu, находятся в пределах области высокой флексибильности, длиной 9.6 т.п.н. {NT0107555 (1722059.1731701) Gene Bank). Предположено участие сайтов высокой флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2 в процессах внутрихромосомной амплификации в клетках опухолей РМЖ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Понимание биологической роли HER2 в нормальной физиологии клетки и при опухолевом росте произвело переворот представлений в научной и медицинской среде. Амплификация онкогена HER2/neu оказывает сильное влияние на развитие и прогрессию опухолевых клеток РМЖ. Одним из крупнейших достижений последнего десятилетия стало создание принципиально нового лекарственного препарата Герцептин для таргетной терапии опухолей РМЖ с НЕБ12-положительным статусом.

На сегодняшний день установлено, что амплификация HER2/nen является не уникальным, а комплексным событием и затрагивает целый ряд генов, располагающихся в районе хромосомы 17ql2-q21. Влияние ко-амплификации на развитие, биологию и поведение опухолевых клеток при ответе на различные виды противоопухолевого лечения является одной из актуальных проблем в современной онкологии и терапии. Однако природа механизма амплификации онкогена HER2/neu до сих пор не ясна. Несмотря на различные модели амплификации, описанные в литературе, общим для всех моделей начальным событием является двуцепочечный разрыв молекулы ДНК, фланкирующий одну из границ будущего ампликона неподалёку от исследуемого гена. Большую роль в понимании механизма возникновения двуцепочечных разрывов внесло открытие сайтов ломкости ДНК - определенных районов нуклеотидной последовательности, обладающих повышенной способностью к образованию разрывов, под воздействием ингибиторов репликации. Однако, возникновение разрывов ДНК в тех местах, где сайты ломкости не обнаружены, до сих пор не имеет однозначного объяснения.

Возможно, в подобных местах располагаются сайты ломкости, для которых исследователи еще не установили индукторов их экспрессии либо существуют другие причины, как то особенности нуклеотидного состава, вторичная структура ДНК в подобных местах. Установление причин возникновения разрывов ДНК в подобных районах поможет глубже понять природу ампли-фикационных событий в опухолевых клетках и, возможно, выявить некие общие закономерности процессов инициации амплификации в опухолевых клетках. Это, в свою очередь, может раскрыть новые перспективы в разработке подходов к таргетной терапии опухолей в онкологии.

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Материалы

В работе были использованы следующие материалы и реактивы:

Этиловый спирт, изоамиловый спирт, хлороформ, фенол, ксилол, ацетат натрия (CH3COONa), хлорид магния (MgC^) - отечественного производства категории ОСЧ.

Трис, додецилсульфат натрия (SDS), ксиленцианол, бромфеноловый синий- «Sigma», США

Tween-20 — «Amresco», США.

Сульфат аммония (NtL^SO^ диметилсульфоксид (ДМСО) - «MP Biomedicals», США.

Флуоресцентный краситель тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), флуоресцентный интеркалирующий краситель SYBR Green I — «Molecular probes», США.

Агароза, - «BIORON», Германия.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), TEMED, акриламид, N,N'-метилен бисакриламид, этидий бромистый - «Serva», Германия.

Протеиназа К - «Мегск», Германия

Линейный полиакрил-амид (ЛПАА), Smart Taq ДНК-полимераза, буфер для Taq ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) - "Лаборатория Медиген", Россия.

Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды были синтезированы в компаниях «Syntol» и «Лаборатории Медиген», Россия.

РНКаза А — «V-gene Biotechnology Limited», КНР.

2.2. Методы 2.2.1. Образцы ткани опухоли РМЖ

Образцы опухолевой ткани молочной железы были получены из операционного материала в ходе операции по удалению молочной железы от ста двадцати восьми женщин (возраст 39-77, средний возраст 59) с 2-й и 3-й степенью злокачественности РМЖ. Немедленно после мастэктомии, свежий образец ткани опухоли РМЖ помещали в емкость с жидким азотом до процедуры выделения ДНК. Тридцать четыре образца опухоли РМЖ были получены в виде архивных срезов.

Образец считали пригодным для исследования, если количество опухолевых клеток в образце превышало 60%. По гистологической структуре опухоли в 90% случаев имели место аденокарциномы молочной железы.

Контролем служила ДНК из образцов ткани молочной железы от восьми женщин, не имеющих злокачественных патологий молочной железы и пять образцов условно нормальной ткани молочной железы, взятых из прилегающей к опухоли ткани.

На проведение работ с клиническим материалом было получено разрешение от этического комитета ГУ НИИМББ СО РАМН от 8 июня 2005 г. (см. Приложение 2).

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.2.1. Выделение ДНК из архивных срезов методом экстракции смесью фенол-хлороформ

Процедуру выделения ДНК производили в соответствие с протоколом, предложенным Сао с соавт. (2003).

Депарафинизация ткани. 50-100 мг образца опухолевой ткани измельчали ножницами и помещали в 1.5 мл пробирку Эппендорф с 500 мкл ксилола на 30 мин. при комнатной температуре. Затем ксилол аккуратно удаляли. При необходимости процедуру повторяли дважды. В пробирку к образцу ткани добавляли 500 мкл 96% этилового спирта, содержимое пробирки тщательно перемешивали в течение 15 мин. при комнатной температуре, этанол тщательно удаляли.

Фенол-хлороформная экстракция ДНК. Лизис депарафинизированно-го образца ткани проводили с помощью протеиназы К в 500 мл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 10% SDS, 500 мг/мл протеиназы К) в течение ночи при 60°С до полного растворения ткани. Полученный гомогенный раствор перемешивали на вортексе в течение 30 сек. Очистку ДНК от белков проводили с помощью добавления к содержимому пробирки равного объема смеси фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1). Содержимое пробирки тщательно перемешивали в течение 5-10 мин и затем центрифугировали при 12000 g на центрифуге «Эппендорф» (Merck, Германия) в течение 20 мин. Верхнюю водную фазу отбирали в чистую 1.5 мл пробирку и добавляли равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Содержимое пробирки тщательно перемешивали и центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин. Супернатант, содержащий нуклеиновые кислоты, переносили в чистую пробирку. Осаждение нуклеиновых кислот производили путем добавления к супернатанту 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, 5 мкл ЛПАА и 3 объема 96% этилового спирта и инкубировании при -20 °С в течение не менее двух часов. Далее раствор центрифугировали при 12000 g в течение 20 минут. Супернатант тщательно удаляли. Осадок промывали 75 % раствором этилового спирта и снова центрифугировали при 12000 g в течение 20 минут. Супернатант тщательно удаляли и осадок ДНК подсушивали при комнатной температуре в течение 10 минут. ДНК растворяли в 50-100 мкл элюата (2.5 мМ Трис-HCl, рН 8.5) или стерильной воде.

2.2.2.2. Выделение ДНК из свежезамороженных образцов опухоли

Выделение геномной ДНК из свежих образцов ткани проводили при помощи набора «Animal Tissue Genomic DNA Isolation kit» фирмы V-gene

Biotechnology (Китай). 20-30 мкг ткани помещали в стеклянный гомогенизатор и тщательно суспендировали, добавив 200 мкл буфера G-A и 0,9 мкл РНКазы А. Затем, гомогенизированную ткань переносили в 1,5 мл пробирку, предварительно добавив 200 буфера G-A. Смесь инкубировали в течение 5 мин при 65°С в водном термостате, после чего добавляли 400 мкл буфера G-В и перемешивали на вортексе в течение 15 с. Затем добавляли 650 мкл буфера Р2 и центрифугировали 1 мин при 12000 g для разделения фаз. Убирали верхнюю фазу (содержащую белки, липиды и полисахариды) и переносили нижнюю (содержащую геномную ДНК) на фильтр, помещенный в 1.5 мл пробирку. Центрифугировали 1 мин при 12000 g, после чего фильтр убирали и к раствору добавляли 650 мкл буфера В. Раствор хорошо перемешивали, переносили на мембрану, помещенную в 2.0 мл пробирку, и центрифугировали в течение 1 мин при 3600 g для осаждения геномной ДНК на мембране. Затем добавляли 500 мкл буфера W1 и центрифугировали в течение 1 мин при 3600 g. Профильтрованную жидкость убирали и дважды промывали мембрану 700 мкл буфера W2, центрифугируя после каждого раза 1 мин при 3600 g. Мембрану переносили в 1.5 мкл пробирку и добавляли 60 мкл элюа-та (2.5 мМ Трис-HCl, рН 8.5). Оставляли на 3 мин при комнатной температуре и затем центрифугировали в течение 1 мин при 12000 g. Профильтрованный раствор содержал геномную ДНК, которую использовали в дальнейшей работе.

2.2.3. Определение концентрации ДНК в растворе

2.2.3.1. Оценка концентрации раствора нуклеиновых кислот по оптической плотности

Для оценки качества выделенной геномной ДНК измеряли оптическую плотность раствора (D) на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония) при длинах волн 260, 230 и 280 нм. О степени загрязненности смеси ДНК/РНК белками судили по величине отношения D26(/D2so■ Приемлемой степенью очистки считали D26(/D28o ~ 1.6 — 1.8. О степени загрязненности смеси

ДНК/РНК полисахаридами судили по величине отношения D26(/D23o• Приемлемой степенью очистки считали D260/D230 — 1.8. При соответствующей степени очистки концентрацию смеси ДНК/РНК в образце рассчитывали, исходя из значения оптической плотности раствора, измеренной при 260 нм. Оптическая плотность D260 = 1 о.е. соответствует 50 мкг/мл смеси ДНК/РНК. Оптическую плотность измеренных образцов пересчитывали в концентрацию по следующей формуле:

С (мкг/мл) = D260 х 50 (мкг/мл)

2.2.3.2. Определение концентрации растворов ДНК с помощью калибровочной прямой TaqMan ПЦР-РВ

Перед началом исследования образцов нормирование концентрации исследуемых растворов ДНК проводили методом калибровочных прямых. В основе данного способа определения концентрации ДНК в растворе лежит раститровка исследуемой матрицы и вычисление исходной концентрации ДНК на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной прямой. Интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР. В качестве прибора для ПЦР-РВ использовали iQ Cycler (Bio-Rad, США).

Для построения калибровочных прямых использовали серию двукратных разведений контрольного раствора ДНК с известной концентрацией (от 1.25 до 80 нг/мкл начального раствора ДНК). Каждая точка была повторена трижды. В качестве нормировочного гена был использован ген UBC.

Для определения концентрации исследуемых растворов ДНК использовали 1 и 2 мкл стокового раствора исследуемого образца ДНК с неизвестной концентрацией. В отдельных лунках проводили реакцию амплификации фрагмента гена UBC для исследуемых образцов ДНК и амплификацию фрагмента гена UBC для серийных разведений раствора контрольной ДНК с заведомо известной концентрацией для построения калибровочной прямой. Начальную концентрацию ДНК в исследуемом образце высчитывали путем экстраполяции полученных значений Ct (точка в которой кривая интенсивности флуоресценции для данного образца пересекает заданное пороговое значение флуоресценции) для исследуемого образца на калибровочную кривую, построенную в координатах «значение Ct - Log начальной концентрации ДНК» (рис. 10). По полученным данным все образцы исследуемой ДНК разводили до концентрации 5 нг/мкл. Полученные рабочие растворы геномной ДНК из опухолевой ткани использовали в дальнейшей работе для определения дозы исследуемых генов.

А.

В. trz-— Ij--1 —

P'l'"

T/tf .

- — e t itr h w

- — — & t ~ 3 r" f -" iZ", ь 4-L л. --

----

L. ~

Б. г. ----;

No образца

Т 2 3 "4

5" ~6~

Log начального кол-ва ДНК "1.35 1.14 1.1 ' 1.07" 0.63~

0,44 начальная концентрация ДНК(нг/мкп) 22.7 14 12.7 11,9 9,62

4,27 2.77

Рисунок 10. Определение концентрации образцов исследуемой ДНК с помощью калибровочной прямой для фрагмента гена UBC методом TaqMan ПЦР-РВ. (А) Кривые интенсивности флуоресценции для серийных двукратных разведений раствора контрольной ДНК с известной концентрацией: слева-направо от 2.5 до 40 нг/мкл: в реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл из каждого разведения. (Б) График калибровочной прямой в координатах «значение Ct - log начальной концентрации контрольной ДНК»: (•) - значения Ct для кривых интенсивности флуоресценции из пункта 12.А.; (х) - значения Ct для кривых интенсивности флуоресценции для 7-ми образцов исследуемой ДНК с неизвестной концентрацией в растворе из п. 12.В. (В) Кривые интенсивности флуоресценции для 7-ми образцов исследуемой ДНК с неизвестной концентрацией: в реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл раствора исследуемой ДНК. (Г) Таблица со значениями концентраций 7-ми образцов исследуемой ДНК, полученных по результатам обсчета данных из графика 12.Б. программой Bio-Rad iQ5 Standard Edition v. 2.0.

2.2.4. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные TaqMan зонды

Последовательность специфических праймеров и флуоресцентных TaqMan зондов подбирали с использованием программного обеспечения Primer Express Software v2.0 (Applied Biosystems, США) (таб. 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маценко, Наталья Юрьевна, Новосибирск

1. Akiyama Т., Sudo С., Ogawara Н., Toyoshima К., Yamamoto Т. The product of the human cerbB-2 gene: A 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity. // Science. — 1986. — V. 232. — PP. 1644 1646.

2. Albertson D. Gene amplification in cancer. // Trends in Genetics. — 2006.1. V. 22.—PP. 447-454.

3. Albertson D., Collins C., McCormick F., Gray J. Chromosome aberrations in solid tumors. // Nat. Genet. — 2003. — V. 34. — PP. 369 376.

4. Anderson S., Gilkerson E., Klein P. Concordance between local labs and a central lab using FISH and IHC for HER2 testing. // Program and abstracts of the 25th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium. — 2002. — Abstract 235.

5. Arlt M., Miller D., Beer D., Glover T. Molecular characterization of FRAXB and comparative common fragil site instability in cancer cells. // Genes Chromosomes Cancer. — 2002. — V. 33(1). — PP. 82 92.

6. Bargmann C., Hung M., Weinberg R. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. // Nature. — 1986. — V. 319 — PP. 226 230.

7. Baselga J. // Slide presentation at the 43rd ASCO Annual Meeting. 2007.

8. Baulida J., Kraus M., Alimandi M., Di Fiore P., Carpenter G. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired. // Biological Chemistry. — 1996. — V. 271. PP. 5251 - 5257.

9. Beverley S., Coderre J., Santi D., Schimke R. Unstable DNA amplifications in methotrexate-resistant leishmania consist of extrachromosomal circles which relocalize during stabilization. // Cell. — 1984. — V. 38. — PP. 431 439.

10. Bianco M., Vasef M. HER-2 gene amplification in Paget disease of the nipple and extramammary site: a chromogenic in situ hybridization study. // Diagn. Mol. Pathol. —2006. —V. 15(3). —PP. 131 135.

11. Bieche I., Tomasetto C., Regnier С. H., Moog—Lutz C., Rio M. C., Lidereau R. Two distinct amplified regions at 17ql l-q21 involved in human primary breast cancer. // Cancer Res. — 1996 — V. 56. — PP. 3886 3890.

12. Bishop J. Molecular themes in oncogenesis. // Cell. — 1991. — V. 64. — PP. 235 248.

13. Boldog F., Gemmill R., West J., Robinson M., Robinson L., Li E. Chromosome 3pl4 homozygous deletions and sequence analysis of FRA3B. // Hum. Mol. Genet. — 1997. — V. 6(2) — PP. 193 203.

14. Burden S., Yarden Y., Neuregulins and their receptors: a versatile signaling module in organogenesis and oncogenesis. // Neuron. — 1997. — V. 18. — PP. 847-855.

15. Cao W., Hashibe M., Rao J. Comparison of methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues and buccal cells. // Cancer Detect Prev. — 2003.1. V. 27. —PP. 397-404.

16. Carraway K. and Cantlley L. A neu acqintance for erb-B3 and erb-B4: role for receptor heterodimerization in growth signaling. // Cell. — 1994. — V. 78.1. PP. 5-8.

17. Chang S. Modeling chromosomal instability and epithelial carcinogenesis in the telomerase-deficient mouse. // Cancer Biol. — 2001. — V. 11. — PP. 227 -239.

18. Chenna Т., Ramu N., Sugawara G., Hideaki H., Koike L., Tadashi A. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. — 2003. — V. 31. — PP. 3497 500.

19. Cohen S., Ushiro H., Stoscheck C., Chinkers M. A native 170.000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. // J. of Biological Chemistry. — 1982. — V. 257. — PP. 1523 1531.

20. Coquelle A. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. // Cell. — 1997. — V. 89. —PP. 215-225

21. Couturier J., Beuzeboc P., Vincent-Salomon A. High correlation between erbB2 amplification detected by FISH and gene overexpression. // Modern Pathology. — 1999. — V. 12. — PP. 186 199.

22. Di Fiore P., Pierce J., Kraus M., Segatto O., King C., Aaronson S. ErbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. // Science. — 1987.1. V. 237. —PP. 178- 182.

23. Dia J. Clinical utility of an automated serum HER-2/пеи assay in monitoring patients with metastatic breast cancer. // Amer. Assoc. Clin. Chem. — 1998.1. Abstract 208.

24. Downward. J., Yarden Y., Mayes E., Scrace G., Totty N., Stockwell P., Ullrich A. Close similarity of epidermal growth factor receptor and v-erb-B oncogene protein sequences // Nature. — 1984. — V. 307. — PP. 521 527.

25. Fakharzadeh S., Rosenblum-Vos L., Murphy M., Hoffman E., George D. Structure and organization of amplified DNA on double minutes containing the mdm2 oncogene. // Genomics. — 1993. —V. 15. — PP. 283 290.

26. Franklin M., Carey K., Vajdos F., Leahy D., de Vos A., Sliwkowski M. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2 pertuzumab complex. // Cancer Cell. — 2004. — V. 5(4). — PP. 317 - 328.

27. Gellibolian R., Bacolla A., Wells R., Triplet repeat instability and DNA topology: an expansion model based on statistical mechanics. // J. Biol. Chem. — 1997. — V. 272(27) — PP. 16793 16780.

28. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H. F. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. // Proc. National Academy of Science. — 1990. — V. 87. — PP. 2725 -2729.

29. Gisselsson D. and Hoglund M. Connecting mitotic instability and chromosome aberrations in cancer can telomeres bridge the gap? // Semin. Cancer Biol. —2005. —V. 15. —PP. 13-23.

30. Glover T. and Stein C. Chromosome breakage and recombination at fragile sites. // Am. J. Hum. Genet. — 1988 — V. 43. — PP. 265 273.

31. Glover T. and Stein C. Induction of sister chromatid exchanges at common fragile sites. // Am. J. Hum. Genet. — 1987. — V. 41. — PP. 882 890.

32. Gorlick R., Huvos A.G., Heller G. Expression of HER2/erbB-2 correlates with survival in osteosarcoma. // Clinical Oncology. — 1999. — V. 17. — PP. 2781 2788.

33. Graus-Porta D., Beerli R., Daly J., Hynes N. ErbB-2, the preferred het-erodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling. // EMBO Journal. — 1997. —V. 16. — PP. 1655 1659.

34. Graziano C. HER-2 breast assay, linked to Herceptin. wins FDA's okay // CAP Today. — 1998. — V. 12. — PP. 13 16.

35. Hahn P. Molecular biology of double-minute chromosomes. // Bioessays. — 1993. V. — 15. — PP. 477 484.

36. Han D. and Guan J. Association of focal adhesion kinase with Grb7 and its role in cell migration. // J. Biol. Chem. — 1999. — V. 274. — PP. 24425 -24430.

37. Hellman A., Zlotorynski E., Scherer S.W., Cheung J., Vincent J.B., Smith D.I. A role for common fragile site induction in amplification of human oncogenes. // Cancer Cell. — 2002. — V. 1 — PP. 89 97.

38. Hewett D.R., Handt O., Hobson L., Mangelsdorf M., Eyre H.J., Baker E. FRA10B structure reveals common elements in repeat expansion and hromosomal fragile site genesis. // Mol. Cell. — 1998. — V. 1. — PP. 773 781.

39. Hubbard S., Till J. Protein tyrosine kinase structure and function: Annual review. // Biochemistry. — 2000. — V. 69. — PP. 373 398.

40. Hudziak R., Schlessinger J., Ullrich A. Increased expression of the putative growth factor receptor pl85HER-2 causes transformation and tumorigenesis of NIH 3T3 cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. — 1987. — V. 84. — PP. 7159 -7163.

41. Hyman E., Kauraniemi P., Hautaniemi S., Wolf M., Mousses S., Rozen-blum E. Impact of DNA amplification on gene expression patterns in breast cancer. // Cancer Res. — 2002. — V. 62. — PP. 6240 6245.

42. Hyun C., Lee H., Kim K., Kim S., Kim J., Choe G., Park S. The effect of chromosome 17 polysomy on HER2/neu status in breast cancer. // J. Clin. Pathol. — 2008. — V. 61. — PP. 317 321.

43. Isola J., Tanner M., Holli K. Amplification of topoisomerase II alpha is a strong predictor of response to epirubicin-based chemotherapy in HER-2/пеи positive metastatic breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat. — 2000. — V! 64. — P. 31.

44. Izumi Y., Xu L., di Tomaso E. Tumor biology. Herceptin acts as an anti-angiogenic cocktail. // Nature. — 2002. — V. 416 — PP. 279 280.

45. Jacobs Т., Barnes M., Yaziji H., Gown A., Scnitt S. Comparison of fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry (IHC) for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. // Modern Pathology. — 1999a. — V. 12. —PP. 230-244.

46. Jacobs Т., Gown A., Yaziji H. Specificity of HercepTest in determining HER-2/пги status of breast cancers using United States food and Drug administration-approved scoring system. // J. Clin. Oncol. — 1999b. — V. 17(7). — PP. 1983- 1987.

47. Jacobson К., Morrison L., Henderson В., Blondin В., Wilber K., Legator M. Gene copy mapping of the ERBB2/TOP2A region in breast cancer. // Genes Chromosomes Cancer. — 2004. — V. 40. — PP. 19 31.

48. Jarvinen Т., Liu E. Simultaneous amplification of HER2 (ERBB2) and topoisomerase Ilalpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in cancer. // Curr. Cancer Drug Targets. — 2006. — V. 6(7). — PP. 579 -602.

49. Kaptain S. Lee K., Chen B. Her-2/neu and breast cancer. // Diagnostic Molecular Pathology. —2001. —V. 10. —PP. 139- 152.

50. Katoh M. and Katoh M. MGC9753 gene, located within PPP1R1B-STARD3-ERBB2-GRB7 amplicon on human chromosome 17ql2, encodes seven-transmembrane receptor with extracellular six-cystein domain. // Int. J. Oncol. — 2003. —V. 22. —PP. 1369- 1374.

51. Kauraniemi P., Barlund M., Monni O., Kallioniemi A. New amplified and highly expressed genes discovered in the ERBB2 amplicon in breast cancer by cDNA microarrays. // Cancer Res. — 2001. — V. 61. — PP. 8235 8240.

52. Kim Y., Choi J., Song K., Chong W., Lee H. Evaluation of HER2/neu status by real-time quantitative PCR in breast cancer. // Yonsei Medical Journal. — 2002. — V. 43. — PP. 335 340.

53. Klapper L., Glathe S., Vaisman N. The ErbB-2/HER2 oncoprotein of human carcinomas may function solely as a shared co-receptor for multiple stroma-derived growth factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1999. — V. 96 — PP. 4995 5000.

54. Klapper L., Waterman H., Sela M., Yarden J. Tumor-inhibitory antibodies to HER-2 / ErbB-2 may act by recruiting c-Cbl and enhancing ubiquitination of HER-2. // Cancer Res. — 2000. — V. 60. — PP. 3384 3388.

55. Klein B. Soluble cerbB-2 (pi85) in breast cancer patients in relation to prognosis. // Oncology Reports. — 1995. — V. 2(5). — PP. 759 761.

56. Ко Т., Kelly E., Pines J. CrkRS: a novel conserved Cdc2-related protein kinase that colocalises with SC35 speckles. // J. Cell. Sci. — 2001. — V. 114. — PP. 2591 2603.

57. Krajewski W. Alterations in the internucleosomal DNA helical twist in chromatin of human erythroleukemia cells in vivo influences the chromatin higher-order folding. // FEBS Lett. — 1995. — V. 361(2-3) — PP. 149 152.

58. Kuwahara Y. Alternative mechanisms of gene amplification in human cancers. // Genes, Chromosomes Cancer. — 2004. — V. 41. — PP. 125 132.

59. Lafage M., Pedeutour F., Marchetto S., Simonetti J., Prosperi M., Gaudray P. et al. Fusion and amplification of two originally nonsyntenic chromosomal regions in a mammary carcinoma cell line. // Genes Chromosomes Cancer.1992. — V. 5. — PP. 40 49.

60. Lai P., Salazar P., Ladanyi M., Chen B. Impact of polysomy 17 on HER-2/neu immunohistochemistry in breast carcinomas without HER-2/пеи gene amplification. // J. Mol. Diagn. — 2003. — V.5. — PP. 155 159.

61. Lastowska M., Van Roy N., Bown N., Speleman F., Lunec J., Strachan T. et al. Molecular cytogenetic delineation of 17q translocation breakpoints in neuroblastoma cell lines. // Genes Chromosomes Cancer. — 1998. — V. 23. — PP. 116-22.

62. Lax I., Bellot F., Howk R., Ullrich A., Givol D., Schlessinger J. Functional analysis of the ligand binding site of EGF-receptor utilizing chicken/human receptor molecules. // EMBO Journal. — 1989. — V. 8. — PP. 421 427.

63. Lenzini E., Leszl A., Artifoni L., Casellato R., Tenconi R., Baccichetti C. Partial duplication of 17 long arm. // Ann. Genet. — 1988. — V. 31. — PP. 175 -180.

64. Livasy C., Reading F., Moore D., Boggess J., Lininger R.A. EGFR expression and HER2/neu overexpression/amplification in endometrial carcinosarcoma.//Gynecol. Oncol. — 2006. — V. 100(1). —PP. 101 106.

65. Ma Y., Lespagnard L., Durbecq V., Paesmans M., Desmedt C., Gomez-Galdon M. et al. Polysomy 17 in HER-2/neu status elaboration in breast cancer: effect on daily practice. // Clin. Cancer Res. — 2005. — V. 11(12). — PP. 4393 -4399.

66. Maitra A., Wanzer D., Weinberg A.G., Ashfaq R. Amplification of the HER-2/neu oncogene is uncommon in pediatric osteosarcomas. // Cancer. — 2001.1. V. 92. —PP. 677-83.

67. Martins M., Sabatier L., Ricoul M., Pinton A., Dutrillaux B. Specific chromosome instability induced by heavy ions: a step towards transformation of human fibroblasts? // Mutat. Res. — 1993. — V. 285. — PP. 229 237.

68. Masood S., Bui M. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in breast cancer. // Microsc. Res. Tech. — 2002. — V. 59. — PP. 102 108.

69. Masood S., Bui M. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in breast cancer. // Microsc. Res. Tech. — 2002. — V. 59. — PP. 102 108.

70. Maurer В., Lai E., Hamkalo В., Hood L., Attardi G. Novel submicro-scopic extrachromosomic elements containing amplified genes in human cells. // 1987. — Nature. — V. 327. — PP. 434 437.

71. McClintock B. Chromosome organization and genie expression. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. — 1954. — V. 16. — PP. 13 47.

72. McClintock B. The fusion of broken ends of chromosomes following nuclear fusion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1942. — V. 28. — PP. 458 463.

73. McKeage K. and Репу С. Trastuzumab: a review of its use in the treatment of metastatic breast cancer overexpressing HER2. // Drugs. — 2002. — V. 62(1).—PP. 209-243.

74. Meric F., Hung M., Hortobagyi G., Hunt K. HER2/neu in the management of invasive breast cancer. 11 J. Am Coll. Surg. — 2002. — V. 194. — PP. 488 -501.

75. Miller C. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. // Oncogene. — 2006. — V. 25. — PP. 409 418.

76. Mishmar D., Mandel-Gutfreund Y., Margalit H., Kerem B. Common fragile sites: G-Band characteristics within an R—band. // Am. J. Hum. Genet. — 1999. — V. 64. — PP. 908 910.

77. Mitra A., Murty V., Pratap M., Sodhani P., Chaganti R. ERBB2 (HER2/neu) oncogene is frequently amplified in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. // Cancer Res. — 1994. — V. 54(3). — PP. 637 639.

78. Molina R., Jo J., Filella X., Zanon G., Pahisa J., Munoz M., Farms В., Latre M.L., Gimenez N., Hage M. c-erbB-2 oncoprotein in the sera and tissue of patients with breast cancer. Utility in prognosis. // Anticancer Research. — 1996.

79. V. 16(4B). — PP. 2295 2300.

80. Mrozkowiak A., Olszewski W., Piascik A., Olszewski W. HER2 status in breast cancer determined by IHC and FISH: comparison of the results. // Pol. J. Pathol. — 2004. — V. 55. — PP. 165 171.

81. Muleris M. Almeida A., Gerbault-Seureau M., Malfoy В., Dutrillaux B. Identification of amplified DNA sequences in breast cancer and their organization within homogeneously staining regions. // Genes Chromosomes Cancer. — 1995.1. V.14.—PP. 155 163.

82. Murnane J., Sabatier L. Chromosome rearrangements resulting from telomere dysfunction and their role in cancer. // Bioessays. — 2004. — V. 26. — PP. 1164- 1174.

83. Murray J., Przepiorka D., Ioannides C. Clinical trials of HER-2/neu-specific vaccines. // Semin. Oncol. — 2000. — V. 27. — PP. 71-75.

84. Muss H., Thor A., Berry D., Kute Т., Liu E., Koerner F. et al. C-erbB-2 expression and response to adjuvant therapy in women with node-positive early breast cancer. // New England J. of Medicine. — 1994. — V. 330(18). — PP. 1260 1266.

85. Nathanson D., Culliford A., Shia J., Chen В., D'Alessio M., Zeng Z., Nash et al. HER 2/neu expression and gene amplification in colon cancer. // Int. J. Cancer. — 2003. — V. 20. — PP. 796 802.

86. Park K., Han S., Gwak G., Kim H., Kim J., Kim K. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. — 2006. — V. 98(3). — PP. 337 342.

87. Paulson Т., Almasan A., Brody L., Wahl G. Gene amplification in a p53-deficient cell line requires cell cycle progression under conditions that generate DNA breakage.//Mol. Cell. Biol. — 1998. — V. 18. —PP. 3089-3100.

88. Pearson C. and Sinden R. Trinucleotide repeat DNA structures: dynamic mutations from dynamic DNA. // Curr. Opin. Struct. Biol. — 1998. — V. 8(3). — PP.321 330.

89. Pfaffl M. A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR. // Nucleic Acids Res. — 2001 V. 29(9). — PP. 45.

90. Pinkas-Kramarski R., Lenferink A., Bacus S., Lyass L., van de Poll M., Klapper L. The oncogenic ErbB-2 / ErbB-3 heterodimer is a surrogate receptor of the epidermal growth factor and betacellulin. // Oncogene. — 1998. — V. 16. — PP. 1249 1258.

91. Pipiras E., Coquelle A., Bieth A., Debatisse M. Interstitial deletions and intrachromosomal amplification initiated from a double-strand break targeted to a mammalian chromosome. // EMBO J. — 1998 — V. 17. — PP. 325 333.

92. Plowman G., Culouscou J., Whitney G., Green J., Carlton G., Foy L. Ligand-specific activation of HER4/pl80erbB4, a fourth member of the epidermial growth factor receptor family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — V. 90. — PP. 1746- 1750.

93. Portera C. Poster 1028 presented at the 43rd ASCO Annual Meeting. — 2007.

94. Press M. Bernstein L., Thomas P., Meisner L., Zhou J., Ma Y. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node negative breast carcinomas. // Clinical Oncology. — 1997. — Vol. 15. —PP. 2894-2904.

95. Rebollo A., Schmitt C. Ikaros, Aiolos and Helios: transcription regulators and lymphoid malignancies. // Immunol. Cell Biol. — 2003. — V. 81. — PP. 171 -175.

96. Riese II D., Stern D. Specificity within the EGF/ErbB receptor family signaling network. // BioEssays. — 1998. — V. 20. — PP. 41 48.

97. Rogalla P., Helbig R., Drieschner N., Flohr A.M., Krohn M., Bullerdiek J. Molecular-cytogenetic analysis of fragmentation of chromosome 17 in the breast cancer cell line EFM-19. // Anticancer Res. — 2002. — V. 22. — PP. 1987 1992.

98. Ross J., Fletcher J. The HER-2/пеи oncogene: prognostic factor, predictive factor and target for therapy. // Semin. Cancer Biol. — 1999. — V. 9. — PP. 125 138.

99. Sabatier L. Ricoul M., Pottier G., Murnane J. The loss of a single telomere can result in instability of multiple chromosomes in a human tumor cell line. // Mol. Cancer Res. — 2005. — V. 3. — PP. 139 150.

100. Saltman D., Morgan R., Cleary M., Lange T. Telomeric structure in cells with chromosome end associations. // Chromosoma. — 1993. — V. 102. — PP. 121 128.

101. Santin A., Bellone S., Van Stedum S., Bushen W., Palmieri M., Siegel E. et al. Amplification of c-erbB2 oncogene: a major prognostic indicator in uterine serous papillary carcinoma. I I Cancer. — 2005. — V. 104(7). — PP. 1391 1397.

102. Sauer Т., Wiedswang G., Boudjema G., Christensen H., Karesen R. Assessment of HER-2/пеи overexpression and/or gene amplification in breast carcinomas: should in situ hybridization be the method of choice? // APMIS. — 2003.1. V. 111(3). — PP. 444 450.

103. Savelyeva L. and Schwab M. Amplification of oncogenes revisited: from expression profiling to clinical application. // Cancer Lett. — 2001. — V. 167. — PP. 115-123.

104. Schimke R., Sherwood S., Hill A., Johnston R. Overreplication and recombination of DNA in higher eukaryotes: potential consequences and biological implications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — V. 83. — PP. 2157 2161.

105. Schwartz M., Zlotorynski E., Kerem B. The molecular basis of common and rare fragile sites. // Cancer Lett. — 2006. — V. 232. — PP. 13 26.

106. Segatto O., Lonardo F., Pierce J. The role of autoposphorylation in modulation of erbB-2 transforming function. // New Biol. — 1990. — V. 2. — PP. 187- 195.

107. Shih C., Padhy L., Murray M., Weinberg R. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. //Nature. — 1981.1. V. 290. —PP. 261 -431.

108. Singer M., Mesner L., Friedman C., Trask В., Hamlin J. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 2000. — V. 97. — PP. 7921 7926.

109. Slamon D., Clark G., Wong S., Levin W., Ullrich A., McGuire W. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/пеи oncogene. // Science. — 1987. — V. 235. — PP. 177 182.

110. Slamon D., Godolphin W., Jones L., Holt J., Wong S., Keith D. et al. Studies of the HER-2/пеи proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. // Science. — 1989—V. 244. — PP. 707 712.

111. Sliwkowski M. Schaefer G., Akita R., Lofgren J., Fitzpatrick V., Nuijens A. et al. Coexpression of erbB2 and егЬВЗ proteins reconstitutes a high affinity receptor for heregulin // Biological Chemistry. — 1994. — V. 269. — PP. 14661— 14665.

112. Sliwkowski M., Lofgren J., Lewis G., Hotaling Т., Fendly В., Fox J. Nonclinical studies addressing the mechanism of action of Trastuzumab. // Seminars in Oncology. — 1999. — V. 26. — PP. 60 70.

113. Stahl O., Sullivan S., Wingren S. C-erbB2 expression and benefit from adjuvant chemotherapy and radiotherapy of breast cancer. // Eur. J. Cancer. — 1995. —V. 31. —PP. 2185 -2190.

114. Stark G., Debatisse M., Giulotto E., Wahl G. Recent progress in understanding mechanisms of mammalian DNA amplification. // Cell. — 1989. — V. 57. —PP. 901 -908.

115. Stark G. and Wahl G. Gene amplification. // Annu. Rev. Biochem. — 1984. — V. 53. — PP. 447 491.

116. Stein D., Wu J., Fuqua S., Roonprapunt C.: The SH2 domain protein GRB-7 is co-amplified, overexpressed and in a tight complex with HER2 in breast cancer. //EMBO J. — 1994. — V. 13—PP. 1331 1340.

117. Sutherland G., Baker E., Seshadri R., Heritable fragile sites on human chromosomes V. A new class of fragile site requiring BrdU for expression. // Am. J. Hum. Genet. — 1980. — V. 32 (4). — PP. 542 548.

118. Takanashi M., Yagi Т., Imamura T. Expression of the Ikaros gene family in childhood acute lymphoblastic leukemia. // Br. J. Haematol. — 2002. — V. 117. — PP. 523 -530.

119. Tanaka S., Mori M., Akiyoshi Т., Tanaka Y., Mafune K., Wands J.R. et al. Novel variant of human Grb7 is associated with invasive esophageal carcinoma. // J. Clin. Investig. — 1998. — V. 102. — PP. 821 827.

120. Tanaka S., Mori M., Akiyoshi Т., Tanaka Y., Mafune K., Wands J.R. et al. Coexpression of Grb7 with epidermal growth factor receptor or Her2/erbB2 in human advanced esophageal carcinoma. // Cancer Res. — 1997. — V. 57. — PP. 28-31.

121. Thor A., Berry D., Budman D., Muss H., Kute Т., Henderson I. et al. ErbB-2 p53 and efficacy of adjuvant therapy in lymph node-positive breast cancer. // National Cancer Institute. — 1998. — V. 90. — PP. 1346 1360.

122. Toledo F., Buttin G., Debatisse M. The origin of chromosome rearrangements at early stages of AMPD2 gene amplification in Chinese hamster cells. // Curr. Biol. — 1993. — V. 3. — PP. 255 264.

123. Tower J. Developmental gene amplification and origin regulation. // Annu. Rev. Genet. — 2004. — V. 38. — PP. 273 304.

124. Tsugawa K., Fushida S., Yonemura Y. Amplification of the c-erbB-2 gene in gastric carcinoma: correlation with survival. // Oncology. — 1993. — V. 50(6). —PP. 418-425.

125. Varshavsky A. On the possibility of metabolic control of replicon 'misfiring': relationship to emergence of malignant phenotypes in mammalian cell lineages. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981. — V. 78. — PP. 3673 3677.

126. Villman K., Sjostrom J., Heikkila R., Hultborn R., Malmstrom P., Bengtsson N. et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. // Blomqvist Acta Oncol. — 2006. — V. 45(5).—PP. 590-596.

127. Von Hoff D., Needham-Van Devanter D., Yucel J., Windle В., Wahl G. Amplified human MYC oncogenes localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1988. — V. 85. — PP. 4804 -4808.

128. Wahl G. Effect of chromosomal position on amplification of transfected genes in animal cells. // Nature. — 1984. — V. 307. — PP. 516 520.

129. Wang N., Testa J., Smith D. Determination of the specificity of aphidi-colin-induced breakage of the human 3pl4.2 fragile site. // Genomics. — 1993. — V. 17. —PP. 341 -347.

130. Wang S., Hung M. Transcriptional targeting of the HER-2/пеи oncogene. // Drugs Today (Bare). — 2000. — V. 36(12). — PP. 835 843.

131. Wang Y.-H., Gellibolian R., Shimizu M., Wells R, Griffith J. Long CCG triplet repeat blocks exclude nucleosomes: a possible mechanism for the nature of fragile sites in chromosomes. // J. Mol. Biol. — 1996. — V. 263(4). — PP. 511 -516.

132. Watters A., Going J., Cooke Т., Bartlett J. Chromosome 17 aneusomy is associated with poor prognostic factors in invasive breast carcinoma. // Breast Cancer Res. Treat. — 2003. — V. 77. — PP. 109 114.

133. Willis S., Hutchins A., Hammet F., Ciciulla J., Soo W., White D. et al. Detailed gene copy number and RNA expression analysis of the 17ql2—23 region in primary breast cancers. // Genes Chromosomes Cancer. — 2003. — V. 36. — PP. 382-392.

134. Windle В., Draper В., Yin Y., O'Gorman S., Wahl G. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation and amplicon integration. // Genes Dev. — 1991. — V. 5. — PP. 160 174.

135. Witton C. Structure of HER receptors and intracellular localisation of downstream effector elements gives insight into mechanism of tumor growth promotion. // Breast Cancer Res. — 2003. — V. 5. — PP. 206 207.

136. Wright M., Grim J., Deshane J., Kim M., Strong Т., Siegal G. et al. An intracellular anti-erbB-2 single-chain antibody is specifically cytotoxic to human breast carcinoma cells overexpressing erbB-2. // Gene Ther. — 1997. — V. 4. — PP. 317-322.

137. Young S., Liu W., Brock J., Smith S. ERBB2 and chromosome 17 centromere studies of ovarian cancer by fluorescence in situ hybridization. // Genes, Chromosomes Cancer. — 1996. —V. 16(2). — PP. 130 137.

138. Yu D., Hung M. Overexpression of ErbB2 in cancer and ErbB2-targeting strategies. // Oncogene. — 2000. — V. 19. — PP. 6115 6121.

139. Yu S., Mangelsdorf M., Hewett D., Hobson L., Baker E., Eyre H. Human chromosomal fragile site FRA16B is an amplified AT-rich minisatellite repeat. // Cell. — 1997. —V. 88(3) — PP. 367 374.

140. Zabrecky J., Lam Т., McKenzie S., Carney W. The extracellular domain of pl85/neu is released from the surface of human breast carcinoma cells, SK-BR03. // Journal of Biological Chemistiy. — 1991. — V. 266(3). — PP. 1716 -1720.

141. Zhang L., Chang C., Bacus S., Hung M. Suppressed transformation and induced differentiation of HER-2/neu-overexpress'mg breast cancer cells by emodin. // Cancer Res. — 1995. — V. 55. — PP. 3890 3896.

142. Zhang Y., Xia W., Shao R., Sorgi F., Hortobagyi G., Huang L. et al. The tumor suppression activity of El A in HER-2/nea-ovQrexprQss'mg breast cancer.// Oncogene. —1997. —V. 14.—PP. 561 568.

143. Zlotorynski E.} Rahat A., Sakaug J., Ben-Porat N., Ozeri E.} Herschberg R. Molecular basis for expression of common and rare fragile sites. // Mol. Cell. Biol. — 2003. — V. 23. — PP. 7143 7151.

144. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. //Nucleic Acids Res. — 2003. — V. 31. — PP. 3406 3415.

145. Имянитов E.H., Черница О.И., Иванова О.А. Амплификация онкогена ERBB-2 (.HER-2/пеи) в опухолях молочной железы прогностический маркер вероятности рецидива. // Экспер. онкол. — 1992. — Т. 14 (4). — СС. 25 -29.

146. Личиницер М., Степанова Е., Перевощиков А., Яншин А. Избыточная экспрессия HER-2/пеи и новые лечебные возможности герцептина. // Ме-ждунар. журн. мед. практики. — 2000. — № 9.

147. Маценко Н., Рыжикова В., Коваленко С. Сравнение SYBR Green I и TaqMan форматов ПЦР в реальном времени для анализа дозы гена her2 в опухолях молочной железы человека. // Бюлл. экспер. биол. и мед. — 2008. -Т. 145(2). —СС. 201 -205.

Информация о работе

Маценко, Наталья Юрьевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы