Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila"

на правах рукописи

Ашихмин Александр Александрович

Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии ЕсШЫог\юс1о$рка Иа1оа1каПрИИа

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 МДП 2СМ

Пущино - 2014

005549309

005549309

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Москаленко Андрей Анатольевич

Официальные оппоненты: Разживин Андрей Павлович,

доктор физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, заведующий отделом фотосинтеза и флуоресцентных методов

Стадничук Игорь Николаевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Российской академии наук

Защита состоится «17» июля 2014 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе ИФПБ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://www.ibbp.psn.ru/).

Автореферат разослан « мая 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Назарова

Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосинтез - это глобальный биосферный процесс, в ходе которого происходит преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей органических соединений, от которых зависит большинство живых форм на Земле. Фотосинтезирующие бактерии обладают одной из наиболее простых и стабильных систем для сбора и эффективной трансформации солнечной энергии по сравнению с другими фотосинтезирующими организмами (растения, водоросли и др.). Основой фотосинтетического аппарата бактерий являются светособирающие комплексы, которые поглощают энергию квантов солнечного света и переводят ее в энергию электронного возбуждения с последующей передачей этой энергии на реакционные центры (RC), где происходит первичное запасание энергии в виде энергии разделенных зарядов [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Gabrieisen et al., 2009].

Выделяют две группы светособирающих комплексов, согласно расположению относительно RC: периферийные антенные комплексы (LH2) и прицентровые антенные комплексы (LH1) [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Sturgis and Niederman, 2009]. RC расположен внутри структуры комплекса LH1 и образует с ним ядерный (core) комплекс LH1-RC [Zuber and Cogdell, 1995], вокруг которого в мембране располагаются комплексы LH2 [Bahatyrova et al., 2004]. Для комплексов LH2 и LH1-RC определена пространственная структура с высоким разрешением [McDermott et al., 1995; Koepke et al., 1996; Hu and Schulten, 1997; Roszak et al., 2003]. Установлено, что эти комплексы построены по универсальному модульному принципу из одинаковых субъединиц, каждая из которых состоит из двух низкомолекулярных полипептидов (а и ß), БХл и каротиноидов [Zuber and Cogdell, 1995; McDermott et al., 1995; Roszak et al., 2003]. В комплексе LH2 из Rbl. acidophilus 10050 казвдый a/ß-гетеродимер связывает 3 молекулы БХл и 1 молекулу каротиноида (родопин-глюкозид) [Papiz et al., 2003; Prince et al., 2003]. Основными функциями каротиноидов являются светособирающая, защитная и структурная [Москаленко и Ерохин, 1981; Moskalenko and Karapetyan, 1996; Cogdell et al., 2006; Scheer, 2006; Поляков и Лёшина, 2006; Theiss et al., 2008; Telfer et al., 2008; Frank and Polivka, 2009]. В настоящее время проблемой является получение бескаротиноидных комплексов LH2. Установлено, что комплексы LH2 не собираются в бескаротиноидных мутантах несерных пурпурных бактерий, полученных классическим мутагенезом или транспозоновым методом [Jones et al., 1992; Lang and Hunter, 1994]. Единственный на сегодняшний день метод для получения бескаротиноидных комплексов LH2 - это ингибирование биосинтеза каротиноидов в клетках бактерий при их выращивании [Goodwin and Osman, 1953; Bramley, 1993; Moskalenko and Makhneva, 2012]. К настоящему времени найдены только две пурпурные серные бактерии Ale. vinosum и Ale. minutissimum, у которых биосинтез каротиноидов можно ингибировать на 95-99% и сохранить полный набор светособирающих комплексов [Cohen-Bazire and Stanier, 1958; Brill, 1963; Moskalenko and Makhneva, 2012; Большаков, 2012]. Попытки

подавить синтез каротиноидов у несерных бактерий не дали положительного результата: клетки или прекращали рост в присутствии ингибитора или синтез каротиноидов подавлялся на 30-45% [Gall et al., 2005]. Бескаротиноидный комплекс LH2 был выделен только из пурпурной серной бактерии Ale. minutissimum [Москаленко, 1993; Москаленко и др., 2001; Makhneva et al., 2008; Moskalenko and Makhneva, 2012]. Особенностью комплексов LH2 из Ale. minutissimum является гетерогенность полосы поглощения БХл800 [Москаленко, 1993]. Предполагается, что именно эта гетерогенная полоса определяет способность указанного комплекса собираться без каротиноидов [Cogdell et al., 2006]. Аналогичные комплексы LH2 из несерных бактерий имеют гомогенную полосу поглощения БХл800 и, по общему мнению, не могут собираться без каротиноидов. Поэтому представляло интерес изучить бактерию, которая содержит комплекс LH2 с гомогенной полосой при 800 нм, и исследовать в ее клетках взаимосвязь биосинтеза каротиноидов и сборки светособирающих комплексов.

Цели работы: 1) получить бескаротиноидный комплекс LH2 и комплексы LH2 с разным составом каротиноидов из пурпурной серной бактерии Ect. haloalkaliphila и изучить их свойства; 2) исследовать встраивание каротиноидов in vivo и in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila.

Были поставлены следующие задачи:

1. Вырастить клетки Ect. haloalkaliphila с различным уровнем ингибирования биосинтеза каротиноидов, используя разные концентрации дифениламина. Выделить из них светособирающие комплексы и изучить распределение в них каротиноидов. Выделить бескаротиноидный комплекс LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучить его свойства.

2. Изучить встраивание разных каротиноидов in vivo в светособирающие комплексы в ходе восстановления биосинтеза каротиноидов в клетках Ect. haloalkaliphila.

3. Провести встраивание in vitro разных каротиноидов в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila и изучить свойства комплексов LH2 со встроенными каротиноидами.

Научная новизна работы. Получены клетки и светособирающие комплексы с разным качественным и количественным составом каротиноидов при выращивании клеток Ect. haloalkaliphila в присутствии различных концентраций дифениламина (ДФА). Показано, что ингибитор подавляет активность фитоинсинтетазы или ферментов из более ранних стадий биосинтеза каротиноидов. Изменение состава и количества каротиноидов не влияет на сборку ПБК. Впервые получен бескаротиноидный комплекс (ДФА-комплекс) LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучены его свойства. Показано, что каротиноиды не являются обязательным компонентом для сборки комплексов LH2. Установлено, что структура ДФА-комплекса LH2 менее

устойчива к действию различных повреждающих факторов (температуры, синглетного кислорода, детергентов и органических растворителей) по сравнению с контрольным комплексом. Показано, что при восстановлении биосинтеза каротиноидов in vivo спириллоксантин преимущественно встраивается в комплекс LH1-RC, а ангидрородовибрин, спириллоксантин, ликопин и родопин - в комплекс LH2. Выяснено, что скорость восстановления биосинтеза каротиноидов опережает скорость роста культуры клеток. Установлено, что после встраивания разных каротиноидов in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila они восстанавливают свои свойства. Эффективность встраивания каротиноидов составляет от 80 до 100%. Показано, что процессы встраивания каротиноидов в клетке и in vitro отличаются.

Практическая значимость. Полученные данные вносят существенный вклад в фундаментальные знания об организации ПБК, функционировании и свойствах каротиноидов в этих комплексах и могут быть полезны для разработки искусственных систем сбора и преобразования солнечной энергии на основе ПБК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XVII, XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2012); XIV, XV, XVI, XVII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012, 2013); всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); VI съезде Российского фотобиологического общества (Краснодарский край, пос. Шепси, 2011); XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); школе-конференции молодых ученых на базе ИФПБ РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 2012, 2013); международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012, 2013).

Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих статьях и разделах диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статьи: 3 статьи в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 14 в материалах конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация .состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и

их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 10 таблиц и иллюстрирована 56 рисунками. Список литературы содержит 215 источников (из них 183 на английском языке).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы отражает современные представления о классификации и функционировании бактериального фотосинтетического аппарата, строении, биосинтезе и функциях БХл и каротиноидов, функционировании и сборке ПБК, а также получению бескаротиноидных клеток бактерий.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была пурпурная серная бактерия Ect. haloalkaliphila. Бактерии Ale. minutissimum и Rba. sphaeroides использовали для выделения каротиноидов. Все культуры выращивали фотогетеротрофно в анаэробных условиях при температуре 26±2°С и средней интенсивности освещения 1200 люкс. Ect. haloalkaliphila культивировали на модифицированной среде Пфеннинга [Imhoff, 1988], Ale. minutissimum на среде Ларсена [Кондратьева, 1963], a Rba. sphaeroides на модифицированной среде Хатнера [De Klerk et al., 1965].

Для ингибирования биосинтеза каротиноидов в клетках Ect. haloalkaliphila к среде выращивания вносили водно-спиртовой (1:1) раствор ДФА в концентрациях 17,75; 35,5; 53,25 и 71 цМ. Клетки выращивали в течение 4-6 дней. Для восстановления биосинтеза каротиноидов in vivo активные ДФА-клетки (71 цМ ДФА) Ect. haloalkaliphila дважды отмывали стерильной средой и пересевали на обычную среду Пфеннинга. Образцы отбирали при изменении оптической плотности клеток при 650 нм после их пересева. Всего было получено 10 образцов (в скобках указано время роста каждого образца в часах до отбора): №1 (0 ч), №2 (2 ч), №3 (4 ч), №4 (5 ч), №5 (10 ч), №6 (17 ч), №7 (25 ч), №8 (54 ч), №9 (110 ч) и №10 (контроль). Полученные клетки сразу использовали в экспериментах или хранили при -20°С.

Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 (22 кГц, 0,4 А) и полученные мембраны осаждали методом дифференциального центрифугирования. ПБК выделяли с помощью препаративного ПАГЭ в системе Maison [Maison, 1965] на приборе, сконструированном в нашей лаборатории [Москаленко и Ерохин, 1974].

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах: Сагу 50 (Varían, Австралия), Sintra 3030 с интегрирующей сферой (GBC, Австралия), UV-160 (Schimadzu, Япония). Спектры возбуждения флуоресценции (область возбуждения 300-650 нм) записывали на спектрофлуориметре Сагу Eclips (Varían, Австралия). Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре Chirascan (Applied Photophysics, Великобритания). Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM 100В (JEOL, Япония) при увеличении 60000 по методике, описанной работах [Ладыгин и Семёнова, 1993; Смолов и др., 2013].

Анализ пигментов проводили методом ВЭЖХ на колонке Agilent Zorbax SB-С18 5 мкм 4,6 X 250 мм (Agilent, США) с помошью программы LC-solution (Shimadzu, Япония). Расчет содержания каротиноидов проводили методом, учитывающим содержание «свободных» каротиноидных карманов [Moskalenko and Makhneva, 2012].

Для встраивания in vitro раствор каротиноидов в смеси ацетона и метанола (7:2) последовательно (по 100-250 мкл) добавляли к ДФА-мембранам Ect. haloalkaliphila. Для удаления растворителя после каждого добавления каротиноидов проводили диализ мембран в 0,05М Трис-HCl буфере (pH 8,0) с 0,1% ДМ в течение 20 мин.

Сине-зеленый свет (интенсивность 0,3 Вт/см2) получали с помощью светофильтров СЗС-22 и ЖС-12. Действие синглетного кислорода изучали, облучая образец зеленым светом (светофильтры СЗС-22 и ОС-13, интенсивность 0,002 Вт/см2) при добавлении 25 цМ бенгальского розового. В качестве источника света использовали диапроектор ЛЭТИ-60 (Россия) с галогеновой лампой 500 Вт.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 3.1 Получение образцов Ect. haloalkaliphila с ингибированным биосинтезом каротиноидов.

Ранее бескаротиноидные комплексы LH2 были выделены только из пурпурной серной бактерии Ale. minutissimum [Москаленко, 1993; Moskalenko and Makhneva, 2012; Большаков, 2012]. У этой бактерии основным каротиноидом является родопин (11 СДС). Представляло интерес провести скрининг других бактерий, чтобы найти культуру, которая соответствует следующим трем требованиям: (1) у бактерии преобладают каротиноиды с отличным от родопина количеством СДС и другими боковыми группами, поскольку изменения в хромофоре каротиноидов приводят к значительным изменениям их свойств [Бриттон, 1986]; (2) в ее клетках можно полностью ингибировать биосинтез каротиноидов с помощью ДФА; (3) при полном ингибировании биосинтеза каротиноидов происходит сборка комплексов LH2. Среди отобранных для скрининга несерных и серных пурпурных фотосинтезирующих бактерий (Rbl. acidophilus, Rps. palustris, Rba. sphaeroides, Rba. capsulatus, Ect. shaposhnikovii, Ect. haloalkaliphila и др.) указанные требования оказались выполнимы только для серной бактерии Ect. haloalkaliphila, в клетках которой преобладают спириллоксантин (13 СДС) и ангидрородовибрин (12 СДС). Поэтому она была выбрана в качестве объекта данного исследования.

На рисунке 1 А показаны спектры поглощения мембран, которые были получены из клеток Ect. haloalkaliphila, выращенных в присутствии разных концентраций ДФА. В спектре поглощения контрольных мембран в каротиноидной области присутствуют полосы поглощения с максимумами при 486, 515 и 554 нм. Увеличение концентрации ДФА в среде выращивания до 17,75 - 35,5 цМ приводит к изменению соотношения максимумов полос поглощения каротиноидов и значительному уменьшению их более длинноволновых максимумов. Данные изменения свидетельствуют о том, что уже при 17,75 цМ ДФА нарушается синтез каротиноидов конечных стадий биосинтеза (ангидрородовибрин и спириллоксантин),

а при концентрации 53,25 цМ ДФА эти каротиноиды практически не образуются. В спектре поглощения мембран с максимальным уровнем ингибирования биосинтеза каротиноидов (ДФА-мембраны, 71 цМ ДФА) полосы поглощения каротиноидов отсутствуют (Рис. 1 А, спектр 1). Анализ каротиноидной области спектров поглощения всех изученных мембран показал, что добавление 17,75; 35,5; 53,25 и 71 цМ ДФА приводит к снижению общего содержания каротиноидов в мембранах на ~33, ~60, ~82 и ~99% по сравнению с контролем, в котором присутствует полный набор (100%) каротиноидов.

Вопрос о том, сколько фитоина (предшественник окрашенных каротиноидов) должно присутствовать в мембранах бактерий, выращенных с ДФА, до сих пор остается открытым. Существует распространенное мнение о том, что ДФА подавляет активность фермента фитоиндесатуразы, и поэтому количество фитоина должно быть эквивалентно количеству ингибированных каротиноидов [Bramley, 1993]. Это мнение основано на работах по изучению последовательности стадий биосинтеза каротиноидов в клетках пурпурных бактерий с использованием ингибитора [Goodwin and Osman, 1953; Rilling, 1965; Davis, 1970; Britton et al, 1977; Goodwin, 1980; Schwerzmann and Bachofen, 1989; Bramley, 1993]. Нами установлено, что в мембранах из Ect. haloalkaliphila при всех использованных концентрациях ДФА фитоин не синтезируется в количестве эквивалентном содержанию окрашенных каротиноидов в контроле. Аналогичные результаты были получены ранее для ДФА-клеток Ale. mimitissimum [Moskalenko and Makhneva, 2012]. Суммируя данные, полученные для Ect. haloalkaliphila, можно предположить, что у этой бактерии, как и у Ale. minutissimum, ДФА влияет не на фитоиндесатуразу, как считалось ранее [Bramley, 1993], а на фитоинсинтетазу или ферменты из более ранних этапов биосинтеза каротиноидов.

Из описанных выше мембран Ect. haloalkaliphila с помощью препаративного ПАГЭ были выделены ПБК. Спектры поглощения комплексов LH2 приведены на рисунке 1 Б. Поскольку комплекс LH2 является основным комплексом в мембране, то изменение его каротиноидного состава коррелирует с таковым в мембранах (Табл. 1).

Для того чтобы понять, как каротиноиды влияют на структуру и свойства комплексов LH2 и сравнить полученные результаты с имеющимися данными для

400 500 600 700 800 МО Длина волны (им)

400 S00 600 700 >00 >00 Длина волны (им)

Рис. 1. Спектры поглощения мембран (А) и комплексов ЬН2 (Б), выделенных из клеток Ес1. кЫоЫкаНркПа, выращенных в присутствии разных концентраций ДФА. Спектры нормированы по полосе БХл (590 нм). Идентификация спектров: 1-71 цМ ДФА, 2 - 53,25 цМ ДФА, 3 -35,5 цМ ДФА, 4 - 17,75 цМ ДФА, 5 - контроль.

Ale. minutissimum, было проведено сравнение характеристик контрольного и ДФА-комплексов LH2 из Ect. haloalkaliphila (спектры возбуждения флуоресценции, КД, изучена термостабильность, фотоустойчивость и т.д.).

Установлено, что в контрольном комплексе LH2 из Ed. haloalkaliphila эффективность переноса энергии от каротиноидов на БХл составляет 25-30%. В ДФА-комплексе LH2 (71 цМ ДФА) перенос энергии не зарегистрирован. В спектре КД контрольного комплекса LH2 присутствуют положительные сигналы в области -498580 нм и отрицательные сигналы в области -406-498 нм, которые принадлежат каротиноидам. В ДФА-комплексе LH2 описанные сигналы отсутствуют, что указывает на отсутствие в нем каротиноидов. Установлено, что стабильность комплексов LH2 прямо зависела от количества каротиноидов. Она снижалась с уменьшением содержания каротиноидов. Наиболее лабильным оказался ДФА-комплекс LH2. Он был в 7-8 раз менее устойчивым по сравнению с контрольным комплексом LH2 и уже после 10 минут нагревания при 80°С разрушался на 80%. При этом ДФА-комплекс LH2 из Ect. haloalkaliphila более устойчив по сравнению с аналогичным бескаротиноидным комплексом из Ale. minutissimum, который практически полностью разрушается при нагревании при 80°С в течение 0,5 мин [Большаков, 2012].

Таблица 1. Состав каротиноидов (%) в комплексах LH2, выделенных из клеток Ect. haloalkaliphila, выращенных в присутствии разных концентраций ДФА.

Каротиноид Уровень ^^^^ ингибирования Контроль 17,75 цМ ДФА 35,5 цМ ДФА 53,25 цМ ДФА 71 цМ ДФА

0% -33% -60% -82% >99%

Ç-каротин - 0,7 2,8 9,5 1,0

нейроспорин следы 0,8 0,8 1,9 -

ОН-нейроспорин 0,2 26,8 29,2 3,6 следы

ликопин 17,2 6,4 1,3 0,5 -

родопин 13,5 7,7 1,3 0,2 -

дидегидрородопин 2,2 1,3 0,4 - -

ангидрородовибрин 37,1 10,7 3,0 1,7 -

спириллоксантин 29,8 12,6 1,2 0,6 -

«свободные» каротиноидные карманы 0 -33 -60 -82 -99

каротиноиды+«свободные» каротиноидные карманы 100 100 100 100 100

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что каротиноиды в клетках (мембранах) и комплексах LH2 пурпурной серной бактерии Ale. minutissimum (основной каротиноид - родопин, 11 СДС) способны при их облучении сине-зеленым светом сенсибилизировать образование активных форм кислорода [Махнева и др.,

2007, 2009; Большаков, 2012]. Представляло интерес выяснить, является ли этот процесс уникальным для Ale. minutissimum или он может наблюдаться и у других бактерий, в частности, комплексах LH2 из Ect. haloalkaliphila с другим составом каротиноидов.. Установлено, что этот процесс происходит и в комплексах LH2 из Ect. haloalkaliphila. В контрольном комплексе LH2 за 30 минут облучения сине-зеленым светом зарегистрировано избирательное фотоокисление полосы БХл850 (до 60%), и ее максимум смещался в «синюю» область спектра на 5-10 нм. При этом в спектре поглощения появлялся пик с максимумом при 703 нм, характерный для 3-ацетил хлорофилла (продукт окисления БХл). Поскольку в указанном процессе фотоокисления БХл850 может участвовать синглетный кислород [Большаков, 2012; Кленина и др., 2013], то было изучено влияние внешнего синглетного кислорода на комплексы LH2 in vitro. В качестве источника синглетного кислорода был взят бенгальский розовый - краситель, поглощающий в области 550-600 нм. Установлено, что ДФА-комплекс оказался более лабильным к воздействию синглетного кислорода по сравнению с контрольным комплексом LH2. Быстрое окисление ДФА-комплекса LH2, вероятно, может быть связано с ослаблением структуры этого комплекса из-за отсутствия каротиноидов и, как следствие, с увеличением доступности БХл для воздействия синглетного кислорода. Устойчивость контрольного комплекса LH2 можно объяснить тем, что присутствующие в нем каротиноиды выполняют не только защитную функцию, нейтрализуя синглетный кислород, но и стабилизируют его структуру.

Для сравнения устойчивости контрольного и ДФА-комплекса LH2 из Ect. haloalkaliphila к обработке различными агентами, было изучено действие на них тритона Х-100 и ацетона. Было показано, что потеря каротиноидов комплексами LH2 приводит к уменьшению стабильности их структуры, и они легко разрушаются при действии повреждающих факторов.

Раздел 3.2 Встраивание каротиноидов в комплексы LH2 и LH1-RC in vivo при восстановлении их биосинтеза в клетках Ect. haloalkaliphila.

В данном разделе решалась обратная ингибированию задача - восстановить биосинтез каротиноидов в ДФА-клетках Ect. haloalkaliphila и проследить, как происходит накопление и распределение каротиноидов в ПБК.

На рисунке 2 А показано изменение окраски ДФА-клеток Ect. haloalkaliphila.

Рис. 2. Изменение окраски ДФА-клеток при восстановлении биосинтеза каротиноидов (А) и ПАГЭ мембран (Б) Ect. haloalkaliphila. Цифрами показано время роста образцов в часах.

№1 №4 №5 Ш №8 Л«9 .Vs. 10

Ч ц *

II

0 5 10 17 54 110 контроль --—------ LH1-RC

ДФА-клетки имели серо-голубую окраску. Цвет окраски в этом случае определяется только БХл, который поглощает в видимой части спектра в области Qx перехода при 590 им. Биосинтез каротиноидов начинал восстанавливаться при росте ДФА-клеток после пересева на среду без ингибитора. Окраска клеток, в которую основной вклад вносят каротиноиды, постепенно менялась с серо-голубой до пурпурно-красной.

На рисунке 3 приведены кривые роста контрольных и ДФА-клеток Ect. haloalkaliphila. Хорошо видно, что в начале роста обоих типов клеток наблюдается одинаковая лаг-фаза, которая составляет -12-14 часов. Затем начинается рост контрольных клеток. Рост ДФА-клеток замедлен по сравнению с контролем, и они достигают стационарной фазы роста на -42-46 часов позже контрольных клеток. Это замедление роста ДФА-клеток, возможно, связано с влиянием ингибитора, который в следовом количестве мог остаться в этих клетках, несмотря на их отмывание перед началом опыта.

Рис. 3. Кривые роста контрольных (1) и ДФА-клеток (2) Ect. haloalkaliphila при их инкубации на среде без ингибитора.

Из каждого отобранного образца клеток были выделены мембраны. Их спектры поглощения были практически идентичны в области 360-400 и 580-900 нм (поглощение БХл). В области 400-570 нм в образцах №4-5 (5 и 10 ч /лаг-фаза/) обнаружены характерные для каротиноидов полосы поглощения с максимумами при 423, 443 и 473 нм. В данной фазе роста процесс восстановления биосинтеза каротиноидов существенно опережает процесс роста клеток. Это, по-видимому, связано с быстрой активацией ансамбля ферментов, который осуществляет биосинтез каротиноидов. В спектрах мембран образцов №6-7 (17 и 25 ч) полосы поглощения каротиноидов постепенно увеличиваются, а их максимумы смещаются в длинноволновую область. В образце №9 (110 ч) появляются хорошо выраженные полосы поглощения каротиноидов с максимумами при 441, 472, 503 и 535 нм, которые соответствуют максимумам полос поглощения каротиноидов в контроле, что указывает на практически полное восстановление биосинтеза каротиноидов.

Из мембран Ect. haloalkaliphila с разным уровнем восстановления биосинтеза каротиноидов были выделены ПБК (Рис. 2 Б). Спектры поглощения некоторых комплексов LH1-RC и LH2 представлены на рисунке 4. Следует отметить, что позиция полос поглощения полосы комплексов LH1-RC и LH2 не зависела ни от состава каротиноидов в них, ни от их количества. Этот факт был отмечен у бактерий с ингибированным биосинтезом каротиноидов [Москаленко и др., 1991; Москаленко и

36 48 60 72 Время (час)

др., 1997; Махнева и Москаленко, 2004]. Изменение каротиноидного состава комплексов LH1-RC и LH2 представлено в таблицах 2 и 3.

Рис. 4. Спектры поглощения комплексов LH1-RC (А) и комплексов LH2 (Б), выделенных из мембран Ect. haloalkaliphila с разным уровнем восстановления биосинтеза каротиноидов. 1 -образец №1 (0 ч); 2 - образец №4 (5 ч); 3 - образец №5 (10 ч); 4 - образец №6 (17 ч); 5 -образец №8 (54 ч); 6 - образец №9 (110 ч); 7 - образец №10 (контроль). Спектры нормированы по Qx полосе БХл (590 нм).

Таблица 2. Состав каротиноидов (%) в комплексах LH1-RC, выделенных из клеток Ect. haloalkaliphila в процессе восстановления in vivo биосинтеза каротиноидов.

Образцы — _______——" Каротиноид №1 (0ч) №2 (2ч) lis №4 (5ч) №5 (10ч) №6 (17ч) №7 (25ч) №8 (54ч) №9 (110ч) №10 (К)

^-каротин 1,0 9,5 11,9 10,7 8,1 3,0 0,2 0,6 - -

нейроспорин - 4,9 10,5 13,0 15,1 10,5 5,8 5,4 - -

ОН-нейроспорин следы следы 2,7 3,1 6,7 3,7 1,6 0,3 - -

ликопин - 0,3 3,1 4,3 9,7 7,7 6,7 5,6 2,4 1,7

родопин - следы 0,6 0,9 12,3 23,9 31,8 19,7 4,6 1,0

дидегидрородопин - следы 0,1 0,1 2,8 3,7 2,2 2,0 - -

ангидрородовибрин - следы 0,5 2,2 14,6 37,0 40,9 40,9 14,3 8,6

спириллоксантин - 0,3 0,6 0,7 0,7 10,4 10,8 25,5 78,7 88,7

«свободные» каротиноидные карманы -99 -85 -70 -65 -30 - - - - -

каротиноиды+«свободные» каротиноидные карманы 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Выявлена диспропорция во встраивании разных каротиноидов в комплексы Ы-П-ЯС и ЬН2, которая особенно проявляется на последнем этапе эксперимента (54110 ч), когда комплекс ЬШ-ИС резко обогащается спириллоксантином. Эти данные могут свидетельствовать о двух фактах. Во-первых, каротиноиды не могут встраиваться в комплексы из одного общего пула. В этом случае их каротиноидные составы, хотя бы на первых стадиях восстановления биосинтеза, когда еще не проявляется специфичность мест связывания каротиноидов в комплексах, должны

совпадать. Во-вторых, на последнем этапе происходит резкое повышение концентрации спириллоксантина в комплексе LH1-RC по сравнению с комплексом LH2. По-видимому, в процессе сборки комплексов они получают каротиноиды от разных ферментных ансамблей каротиногенеза. Синтез каротиноидов в этих ансамблях, очевидно, активируется (управляется) по-разному. Поэтому ансамбль ферментов комплекса LH1-RC обеспечивает резкое повышение синтеза спириллоксантина в конце опыта, в то время как ансамбль ферментов каротиногенеза комплекса LH2 синтезирует четыре разных каротиноида (Табл. 2 и 3).

Таблица 3. Состав каротиноидов (%) в комплексах LH2, выделенных из клеток Ect. haloalkaliphila в процессе восстановления in vivo биосинтеза каротиноидов.

Образцы —~~~~ __------Каротиноид №1 (0ч) №2 (2ч) №3 (4ч) №4 (5ч) №5 (10ч) №6 (17ч) №7 (25ч) №8 (54ч) №9 (110ч) №10 (К)

¡¡-каротин 1,0 16,2 17,6 17,9 23,1 19,7 10,9 9,7 - -

нейроспорин - 4,4 8,5 11,3 19,4 14,9 11,5 6,1 1,4 -

ОН-нейроспорин следы 1,7 3,3 4,5 7,1 10,8 10,5 10,2 6,1 0,3

ликопин - 1,2 2,9 3,2 5,3 16,9 17,3 18,6 21,7 17,2

родопин - 0,7 1,4 1,5 1,5 6,2 12,5 15,9 16,1 13,4

аидегидрородопин - - следы 0,2 1,7 2,0 3,7 6,5 3,5 2,2

ангидрородовибрин - 0,6 0,8 0,8 1,0 7,0 14,9 16,6 24,8 37,1

спириллоксаптин - 0,2 0,5 0,6 0,9 2,5 3,7 6,4 16,4 29,8

«свободные» каротиноидные карманы -99 -75 -65 -60 -40 -20 -15 -10 -10 -

каротиноиды+«свободиые» каротиноидные карманы 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Для того чтобы сопоставить свойства комплексов LH2 со встроенными in vivo каротиноидами и свойства ДФА-комплексов LH2 была изучена термостабильность и фотоустойчивость семи образцов (0, 2, 5, 10, 17 и 110 ч роста и контроль).

По мере заполнения каротиноидных карманов термостабильность комплексов LH2 увеличивалась. Комплекс LH2 с содержанием каротиноидов -60% (17 ч) разрушался на 50% при нагревании в течение 60 мин. Очевидно, что термостабильность комплексов LH2 находится в прямой зависимости от содержания в них каротиноидов, т.е. чем больше каротиноидов встраивается в структуру комплексов in vivo, тем выше их термостабильность. Эти результаты являются прямым доказательством структурной роли каротиноидов (стабилизация структуры комплексов LH2). Полученные данные согласуются с имеющимися результатами по термостабильности комплексов LH2, выделенных из клеток Ect. haloalkaliphila, выращенных в присутствии ДФА и также с результатами по нагреванию контрольных и ДФА-комплексов LH2 аз Ale. minutissimum [Москаленко, 1993; Большаков, 2012].

Наиболее фотоустойчивым к облучению сине-зеленым светом был ДФА-комплекс LH2 (<1% каротиноидов). У других комплексов способность к фотоокислению БХл850 увеличивалась по мере заполнения каротиноидных карманов. В комплексах LH2 (заполнение каротиноидами на 6% (2 ч), 40% (5 ч), 65% (17 ч) и 90% (110 ч)) полоса БХл850 выцветала на 30% (2 ч), 37% (5 ч), 49% (17 ч) и 50% (110 ч), соответственно. Таким образом, наблюдается прямая зависимость между скоростью фотоокисления полосы БХл850 и количеством каротиноидов в комплексах LH2, т.е. чем больше каротиноидов присутствует в комплексах LH2, тем быстрее окисляется БХл850. Эти данные находятся в хорошем согласии с полученными ранее результатами по влиянию сине-зеленого света на каротиноиды комплексов LH2 из Ale. minutissimum [Махнева и др., 2007, 2009; Большаков, 2012].

На основании полученных результатов следует подчеркнуть, что в клетках Ect. haloalkaliphila сборка комплекса LH2 может происходить или совсем без каротиноидов или в присутствии разных каротиноидов с концентрацией от 0 до 100 % от контроля. Таким образом, каротиноиды у данной бактерии не являются компонентом, который необходим для начала сборки комплексов LH2 или требуется для их правильной сборки. Эти результаты противоречат общепринятому мнению о том, что каротиноиды необходимы для сборки комплексов LH2 [Cogdell et al., 2006; Gabrielsen et al., 2009], но хорошо согласуются с результатами, полученными ранее на Ale. vinosum и Ale. minutissimum [Cohen-Bazire and Stanier, 1958; Brill, 1963; Москаленко и др., 1991; Москаленко, 1993; Moskalenko and Makhneva, 2012].

Раздел 3.3 Встраивание каротиноидов in vitro в ДФА-комплексы Ect. haloalkaliphila.

В заключительном разделе исследовалась возможность встраивания каротиноидов in vitro в ДФА-комплексы из Ect. haloalkaliphila и проводилось сравнение их свойств со свойствами контрольных ПБК. В качестве объекта для встраивания каротиноидов были использованы ДФА-мембраны Ect. haloalkaliphila. Это позволяет, во-первых, сразу встраивать каротиноиды как в комплекс LH1-RC, так и в комплекс LH2, которые находятся в полностью нативном окружении и состоянии, а, во-вторых, - исключить процедуру выделения комплексов на этом этапе. Для встраивания использовали экстракты каротиноидов из трех бактерий: Ect. haloalkaliphila (экстракт №1), Ale. minutissimum (экстракт №2) и Rba. sphaeroides (экстракт №3). В экстракте №1 основными каротиноидами являются ангидрородовибрин (33,5%), ликопин (30%), спириллоксантин (18,9%) и родопин (14,3%), экстракт №2 был обогащен родопином (73,7%), а экстракт №3 -сфероиденом (89,7%), соответственно. Кратность добавлений и количество внесенных каротиноидов было следующим: семь порций экстракта каротиноидов №1 (в сумме 0,18 рМ); пять порций экстракта каротиноидов №2 (в сумме 0,77 цМ); три порции экстракта каротиноидов №3 (в сумме 0,85 рМ). Эффективность встраивания каротиноидов в ПБК составляла 100% для экстракта №1, ~90-100% для экстракта №2 и ~80-100% для экстракта №3. Варьирование эффективности встраивания

каротиноидов в комплексы LH1-RC и LH2 из Ect. haloalkaliphila можно, по-видимому, объяснить специфичностью каротиноидных карманов в разных ПБК. Например, в комплексе LH2 каротиноиды взаимодействуют не только с молекулами БХл, но и с 15 аминокислотными остатками a/p-гетеродимеров [Freer et al., 1996; Prince etal., 1997].

Ha рисунках 5-7 показаны спектры поглощения комплексов LH1-RC и LH2 со встроенными in vitro каротиноидами. ВЭЖХ анализ показал, что все каротиноиды из экстракта №1 присутствуют в комплексах LH1-RC и LH2. Следует отметить несколько меньшее встраивание спириллоксантина в комплекс LH2 (7%) по сравнению с комплексом LH1-RC (18,7%). После добавления каротиноидов из экстракта №2, отмечено преимущественное встраивание родопина как в комплекс LH1-RC (53,4%), так и в комплекс LH2 (75%). В обоих ПБК со встроенными каротиноидами из экстракта №3 сфероиден хорошо встраивался в оба типа ПБК (77,787,3%). В совокупности все это указывает на то, что встраивание in vitro каротиноидов в ДФА-ПБК из Ect. haloalkaliphila происходит неизбирательно.

Рис. 5. Спектры поглощения комплексов LH1-RC (А) и LH2 (Б) из Ect. haloalkaliphila после встраивания in vitro каротиноидов из экстракта №1 (пунктирная линия) и спектры поглощения контрольных комплексов (сплошная линия). Спектры нормированы по Q* полосе БХл (590 нм).

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

Рис. 6. Спектры поглощения комплексов LH1-RC (А) и LH2 (Б) из Ect. haloalkaliphila после встраивания in vitro каротиноидов из экстракта №2 (пунктирная линия) и спектры поглощения контрольных комплексов (сплошная линия). Спектры нормированы по Qx полосе БХл (590 нм).

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

Рис. 7. Спектры поглощения комплексов LH1-RC (А) и LH2 (Б) из Ect. haloalkaliphila после встраивания in vitro каротиноидов из экстракта №3 (пунктирная линия) и спектры поглощения контрольных комплексов (сплошная линия). Спектры нормированы по Qx полосе БХл (590 нм).

Метод КД эффективен для определения корректности связывания каротиноидов в ПБК. Во всех описанных выше комплексах LH2 восстанавливалась оптическая активность каротиноидов. Спектры КД комплексов LH2 со встроенными каротиноидами из экстрактов №1 и №2 похожи как между собой, так и контрольными комплексами LH2 из Ect. haloalkaliphila. Это, вероятно, связано с тем, что в этих экстрактах каротиноидов содержались в основном похожие каротиноиды с небольшим количеством СДС (11-12). В спектре КД комплекса LH2 со встроенными каротиноидами из смеси №3, обогащенной сфероиденом, отмечены положительные сигналы каротиноидов в области ~465-550 нм и отрицательные - при -367-464 нм. По этому показателю они отличаются от описанных выше комплексов. В тоже время эти сигналы спектров КД в каротиноидной области похожи на сигналы спектров КД контрольных комплексов LH2 из Rba. sphaeroides, содержащие сфероиден [Cogdell and Scheer, 1985]. Это указывает на то, что хромофор каротиноида влияет на форму сигнала КД.

Установлено, что по сравнению с ДФА-комплексами LH2 в аналогичных комплексах со встроенными каротиноидами происходило восстановление переноса энергии от каротиноидов на БХл. Эффективность этого переноса энергии была различной в зависимости от состава каротиноидов. Она составила ~25-30% для комплексов LH2 со встроенными каротиноидами из экстрактов №1 и №2, что соответствует значениям переноса энергии от каротиноидов на БХл для контрольных комплексов LH2 из Ect. haloalkaliphila. Для комплексов LH2 со встроенным сфероиденом (экстракт №3) эффективность этого переноса энергии находится на уровне -40-45%.

Также представляло интерес выяснить, восстановится ли в комплексах LH2 после встраивания каротиноидов их способность сенсибилизировать образование активных форм кислорода при облучении сине-зеленым светом. На рисунке 8 показаны результаты этого эксперимента. В комплексе LH2 со встроенными каротиноидам из экстракта №1, в котором основными являются родопин (11 СДС),

ангидрородовибрин (12 СДС) и ликопин (11 СДС) отмечается снижение поглощения полосы БХл850 на -36% (Рис. 8 А). Эта же полоса уменьшается на -26% в комплексе ЬН2 со встроенными каротиноидами из экстракта №2, где преобладает родопин (Рис. 8 Б). В обоих этих комплексах образуется продукт окисления БХл, с максимумом поглощения при -703 нм (3-ацетил хлорофилл). Таким образом, наблюдается зависимость между скоростью фотоокисления полосы БХл850 в комплексах ЬН2 и качественным составом встроенных каротиноидов в этих комплексах.

При облучении комплекса ЬН2 со встроенными каротиноидами из экстракта №3 (основной сфероиден, 10 СДС) процесс разрушения его полос поглощения БХл в ИК-области протекает несколько по-другому (Рис. 8 В). Отмечено более быстрое фотоокисление обеих полос БХл850 и БХл800 на -75 и 36%, соответственно.

Длим волны (ни) дЛИН, волны (нм)

Длина волны (мм) Длина волны (нм)

Рис. 8. Изменения в спектрах поглощения комплексов 1>Н2 из Ес1. 1га1оа1каИрЫ1а со встроенными каротиноидами (А - каротиноидный экстракт №1, Б — каротиноидный экстракт №2, В - каротиноидный экстракт №3) и комплекса ЬН2 из КЬа. зрЬаегогс^еэ дикого типа (Г) при их облучении сине-зеленым светом в течение 0-30 минут.

При этом, также как и в двух других комплексах ЬН2, но с большей интенсивностью, происходит образование 3-ацетил хлорофилла. По-видимому, сфероиден (10 СДС) наиболее эффективен в этом процессе по сравнению с родопином (11 СДС) и ангидрородовибрином (12 СДС), что, вероятно, связано с наименьшим количеством

СДС в хромофоре сфероидена. Облучение сине-зеленым светом сфероидена в контрольном комплексе LH2 из Rba. sphaeroides не приводит к описанным выше изменениям в спектре поглощения этого комплекса (Рис. 8 Г). Это, вероятно, связано с влиянием ближайшего окружения на молекулы каротиноидов и на их свойства, а также с недоступностью молекул БХл для окисления из-за структурных особенностей комплекса LH2 из Rba. sphaeroides.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У пурпурной серной бактерии Ее t. haloalkaliphila с помощью ингибитора каротиногенеза, ДФА, были получены клетки с практически полностью подавленным биосинтезом каротиноидов (ДФА-клетки), но с сохраненными нативными формами БХл. Показано, что в ДФА-клетках ингибитор не оказывает существенного влияния на формирование их мембранных структур. При ингибировании биосинтеза каротиноидов в ДФА-клетках сохраняется полный набор светособирающих ПБК (LH1-RC и LH2). Впервые у Ее t. haloalkaliphila был получен бескаротиноидный комплекс (ДФА-комплекс) LH2 с гомогенной полосой поглощения БХл800, который по своим спектральным характеристикам в ИК-области похож как на контрольный комплекс LH2 из этой же бактерии, так и на комплексы LH2 из несерных бактерий. Спектроскопический и хроматографический анализы этого ДФА-комплекса LH2 подтверждают, что он может собираться при практически полном отсутствии каротиноидов. Это указывает на то, что каротиноиды не являются обязательными компонентами для сборки комплексов LH2.

Установлено, что при ингибировании биосинтеза каротиноидов с помощью ДФА фитоин не накапливается в клетках Eet. haloalkaliphila и не замещает собой каротиноиды в структуре ПБК, как считалось ранее [Bramley, 1993]. Высказана гипотеза о том, что мишенью для ДФА является не фитоиндесатураза, как считалось ранее [Rilling, 1965; Goodwin, 1980; Bramley, 1993; Gall et al., 2005], a фитоинсинтетаза или ферменты из более ранних стадий биосинтеза каротиноидов.

Изучено встраивание каротиноидов в комплексы LH1-RC и LH2 при восстановлении биосинтеза каротиноидов in vivo в ДФА-клетках Eet. haloalkaliphila. Установлено, что в лаг-фазе скорость восстановления биосинтеза каротиноидов значительно опережает скорость роста культуры клеток. Выявлена диспропорция во встраивании разных каротиноидов в комплексы LH1-RC и LH2, которая особенно проявляется на последнем этапе эксперимента, когда комплекс LH1-RC резко обогащается спириллоксантином. Эти данные могут свидетельствовать о двух фактах. Во-первых, каротиноиды не могут встраиваться в комплексы in vivo из одного общего пула. Во-вторых, при сборке комплексов они получают каротиноиды от разных ферментных ансамблей каротиногенеза. Синтез каротиноидов в этих ансамблях, очевидно, активируется (управляется) по-разному. Поэтому в конце опыта ансамбль ферментов комплекса LH1-RC обеспечивает резкое повышение синтеза

спириллоксантина, в то время как ансамбль ферментов каротиногенеза комплекса LH2 синтезирует четыре разных каротиноида.

Кроме того, изучено встраивание in vitro смеси различных каротиноидов из разных видов бактерий в ДФА-комплексы LH1-RC и LH2 из Ect. haloalkaliphila. По нашим оценкам эффективность встраивания каротиноидов составила 80-100%. Установлено, что каротиноиды неизбирательно встраиваются в структуру ПБК in vitro по сравнению с аналогичными процессами in vivo. Показано, что устойчивость комплексов со встроенными каротиноидами по сравнению с ДФА-комплексами повышается, что является прямым доказательством важной роли каротиноидов в стабилизации структуры ПБК. В полученных комплексах восстанавливаются их спектры поглощения, сигналы спектров КД, перенос энергии от каротиноидов на БХл, что указывает на их правильное встраивание в места связывания в ПБК.

ВЫВОДЫ

1. Получены клетки и светособирающие комплексы с разным качественным и количественным составом каротиноидов при выращивании клеток Ect. haloalkaliphila в присутствии различных концентраций дифениламина (ДФА). Показано, что ингибитор подавляет активность фитоинсинтетазы или ферментов из более ранних стадий биосинтеза каротиноидов. Изменение состава и количества каротиноидов не влияет на сборку ПБК.

2. Впервые получен бескаротиноидный комплекс (ДФА-комплекс) LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучены его свойства. Показано, что каротиноиды не являются обязательным компонентом для сборки комплексов LH2. Установлено, что структура ДФА-комплекса LH2 менее устойчива к действию различных повреждающих факторов (температуры, синглетного кислорода, детергентов и органических растворителей) по сравнению с контрольным комплексом.

3. Показано, что при восстановлении биосинтеза каротиноидов in vivo спириллоксантин преимущественно встраивается в комплекс LH1-RC, а ангидрородовибрин, спириллоксантин, ликопин и родопин - в комплекс LH2. Выяснено, что скорость восстановления биосинтеза каротиноидов опережает скорость роста культуры клеток.

4. Установлено, что после встраивания разных каротиноидов in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila они восстанавливают свои свойства. Эффективность встраивания каротиноидов составляет от 80 до 100%. Показано, что процессы встраивания каротиноидов в клетке и in vitro отличаются.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Aleksandr Ashikhmin. Zoya Makhneva, Andrey Moskalenko (2014) The LH2 complexes are assembled in the cells of purple sulfur bacterium Ectothiorhodospira haloalkaliphila with inhibition of carotenoid biosynthesis. Photosynth. Res., V. 119, pp. 291-303.

2. Ашихмин A.A.. Махнева 3.K., Ерохин Ю.Е., Москаленко A.A. (2014) Взаимосвязь биосинтеза каротиноидов и сборки пигмент-белковых комплексов в клетках Ectothiorhodospira haloalkaliphila. Доклады Академии Наук, Т. 454, №5 С. 599-602.

3. Ашихмин A.A.. Ерохин Ю.Е., Махнева З.К., Москаленко A.A. (2013) Бескаротиноидные пигмент-белковые комплексы серной фотосинтезирующей бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila. Доклады Академии Наук, Т. 453, №5 С. 563-566.

4. Махнева З.К., Большаков М.А., Ашихмин A.A.. Ерохин Ю.Е., Москаленко A.A. (2009) Влияние синего света на стабильность структуры антенных комплексов из Allochromatium minutissimum с разным содержанием каротиноидов. Биологические мембраны, Т. 26, №3 С. 188-193.

Материалы конференций и тезисы докладов:

1. Ашихмин A.A. Светособирающий комплекс LH2 из серной фотосинтезирующей бактерии Ect. haloalkaliphyla. XVII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010». Москва, 12-15 апреля 2010 г., Тезисы докладов, С. 42.

2. Ашихмин A.A. Встраивание каротиноидов в светособирающий комплекс В800-850 из серной бактерии Ect. haloalkaliphyla. XIV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 19-23 апреля 2010 г., Тезисы докладов, Том 2, С. 310.

3. Москаленко A.A., Махнева З.К., Большаков М.А., Ашихмин A.A.. Ерохин Ю.Е. Каротиноиды в бактериальном фотосинтезе. Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные микроорганизмы». Москва, 23-26 декабря

2010 г., Тезисы докладов, С. 73.

4. Ашихмин A.A. Встраивание каротиноидов в светособирающие комплексы из Ectothiorhodospira haloalkaliphila. XV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 18-22 апреля

2011 г., Тезисы докладов, С. 425^426.

5. Александр Ашихмин. Максим Большаков, Зоя Махнева, Андрей Москаленко Встраивание каротиноидов в пигмент-белковые комплексы серных фотосинтезирующих бактерий. VI Съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-22 сентября 2011 г., Материалы съезда, С. 9.

6. Александр Ашихмин Действие активных форм кислорода на комплекс LH2 из серной фотосинтезирующей бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila. XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012». Москва, 9-13 апреля 2012 г., Тезисы докладов, С. 37-38.

7. Александр Ашихмин Восстановление биосинтеза каротиноидов в клетках Ectothiorhodospira haloalkaliphila. XVI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 16-21 апреля 2012 г., Тезисы докладов, С. 456-457.

8. Ашихмин A.A.. Махнева З.К., Москаленко A.A., Ерохин Ю.Е. Светособирающие комплексы в клетках Ectothiorodospira haloalkaliphila собираются в отсутствии каротиноидов. XX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе». Пущино, 17-22 июня 2012 г., Тезисы докладов, С. 11.

9. Ашихмин A.A.. Махнева З.К., Москаленко A.A., Ерохин Ю.Е. Светособирающие комплексы LH2 с разным каротиноидным составом у пурпурных фотосинтезирующих бактерий. IV Съезд биофизиков России. Нижний Новгород, 2026 августа 2012 г., Тезисы докладов. Том V, С. 10.

10. Ашихмин A.A.. Махнева З.К., Москаленко A.A., Ерохин Ю.Е. Необходимы ли каротиноиды для нормальной самосборки пигмент-белковых комплексов LH1 и LH2 в пурпурных серных фотосинтезирующих бактериях? Школа-конференция молодых учёных на базе ИФПБ РАН, Пущино, 4-5 октября 2012 г. Тезисы докладов, С. 8.

11. Ашихмин A.A.. Махнева З.К., Москаленко A.A., Ерохин Ю.Е. Каротиноиды не нужны для сборки светособирающего комплекса LH2 в клетках Ectothiorodospira haloalkaliphila. Международная конференция молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика». Пущино, 22-24 октября 2012 г. Тезисы докладов, С. 132.

12. Ашихмин A.A. Исследование роли каротиноидов в организации структуры комплексов LH2 Ectothiorodospira haloalkaliphila с разным составом каротиноидов. XVII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века». Пущино, 22-26 апреля 2013 г., Тезисы докладов, С. 480^}81.

13. Ашихмин A.A.. Махнева З.К., Москаленко A.A. Встраивание каротиноидов сфероиденового ряда в пигмент-белковые комплексы LH1-RC и LH2 из пурпурных серных бактерий. Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика». Пущино. 21-23 октября 2013 г., Тезисы докладов, С. 135.

14. Ашихмин A.A. Встраивание каротиноидов сфероиденового ряда в пигмент-белковые комплексы LH1-RC и LH2 из фотосинтезирующей бактерии Ectothiorodospira haloalkaliphila. Школа-конференция молодых ученых «Биосистема: от теории к практике». Пущино, 24-25 октября 2013 г., Тезисы докладов, С. 8.

Список сокращений:

LH1 - прицентровый светособирающий комплекс 1 LH2 - периферический светособирающий комплекс 2 RC - реакционный центр

LH1-RC - «соге»-комплекс или комплекс LH1-RC ПБК - пигмент-белковый комплекс БХл - бактериохлорофилл

БХл800 - бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 800 нм БХл850 — бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 850 нм КД - круговой дихроизм

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ПАГЭ - электрофорез в полиакриламидном геле ДФА - дифениламин

ДФА-образец - образец, выделенный из клеток, выращенных с 71 цМ ДФА

СДС - сопряженная двойная связь

Ale. - Allochromatium

Ect. - Ectothiorhodospira

Rba. - Rhodobacter

Rbl. - Rhodoblastus

Rps. — Rhodopseudomonas

Подписано 8 печать 15.05.2014 г. Печать лазерная

Заказ № 4792 Тираж: 100 экз. Объём: 1 печатный лист

Типография «ПхРпМ» ИНН503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 759784 www.fix-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ашихмин, Александр Александрович, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи 04201460072 / г

АШИХМИН АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

КАРОТИНОИДЫ СВЕТОСОБИРАЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ ПУРПУРНОЙ СЕРНОЙ БАКТЕРИИ ЕСТОТНЮКНОООЗРЖА НАЬОАЬКАПРШЬА

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук А.А. Москаленко

ПУЩИНО - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.....................................................4

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................9

1.1 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОТРОФНЫХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ...........9

1.2 ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТЫ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ: БХЛ И КАРОТИНОИДЫ..............................................................................................11

1.2.1 БХл а: структура, функции и биосинтез.......................................................12

1.2.2 Каротиноиды: структура, функции и биосинтез.............................................16

1.3 ПБК ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ........................................................................23

1.3.1 Реакционный центр...................................................................................25

1.3.2 Комплекс ЬШ-ЯС.....................................................................................26

1.3.3 Комплекс ЬН2...........................................................................................29

1.3.4 Сборка ПБК у пурпурных бактерий...............................................................31

1.3.5 Получение бескаротиноидных ПБК...............................................................33

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................35

2.1 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ....................................................................35

2.2 ВЫДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН И ПБК......................................................................36

2.3 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................37

2.4 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ....................................................................37

2.5 АНАЛИЗ ПИГМЕНТНОГО СОСТАВА...............................................................38

2.6 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ В ДФА-КОМПЛЕКСЫ ИЗ Ес1. Ьа1оа1каНрЫ1а.......41

2.7 НАГРЕВАНИЕ...............................................................................................43

2.8 ОБЛУЧЕНИЕ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫМ СВЕТОМ..........................................................43

2.9 ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА НА КОМПЛЕКСЫ ЬН2.............................................................................................44

2.10 ОБРАБОТКА КОМПЛЕКСОВ ТРИТОНОМ Х-100, ДС-ЫА И АЦЕТОНОМ................45

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................46

3.1 ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Ес1 Ыоа1каИрМ1а С ИНГИБИРОВАННЫМ БИОСИНТЕЗОМ КАРОТИНОИДОВ......................................................................46

3.1.1 Клетки Ее!. На1оа1каИрЫ1а с ингибированным биосинтезом каротиноидов.............46

3.1.2 Мембраны Ес1 Иа1оа1каИрЫ1а с разным составом каротиноидов.........................48

3.1.3 Комплексы ЬН2 из Ес1 Иа1оа1каИрЫ1а с разным составом каротиноидов...............54

3.1.4 Свойства ДФА-комплекса ЬН2 из ЕсХ. Иа1оа1каИрЫ1а........................................57

3.2 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ В КОМПЛЕКСЫ LH2 И LH1-RC IN VIVO

ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ИХ БИОСИНТЕЗА В КЛЕТКАХ Ect. haloalkaliphila...............68

3.2.1 Восстановленные биосинтеза каротиноидов в ДФА-клетках

(мембранах) Ect. haloalkaliphila..........................................................................68

3.2.2 ПБК из клеток Ect. haloalkaliphila с восстановленным биосинтезом каротиноидов................................................................................................73

3.2.3 Свойства комплексов LH2 со встроенными in vivo каротиноидами.....................76

3.3 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ IN VITRO В ДФА-КОМПЛЕКСЫ

ИЗ Ect. haloalkaliphila..........................................................................................80

3.3.1 ДФА-комплексы из Ect. haloalkaliphila со встроенными in vitro каротиноидами......80

3.3.2 Свойства комплексов LH2 из Ect. haloalkaliphila со встроенными

in vitro каротиноидами....................................................................................85

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................93

ВЫВОДЫ........................................................................................................95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

LH1 - прицентровый светособирающий комплекс 1 LH2 - периферический светособирающий комплекс 2 RC - реакционный центр

LH1-RC - «соге»-комплекс или комплекс LH1-RC ПБК - пигмент-белковый комплекс БХл - бактериохлорофилл

БХл800 - бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 800 нм БХл850 - бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 850 нм ФЕ - фотосинтетическая единица ИК-область - инфракрасная область спектра КД - круговой дихроизм

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ПАГЭ - электрофорез в полиакриламидном геле ДФА - дифениламин

ДФА-образец - образец, выделенный из клеток, выращенных с 71 цМ ДФА

СДС - сопряженная двойная связь

ДМ - п-Додецил ß-D-мальтопиранозид

МБА - N-N'-метилен-бис-акриламид

ПСА - Персульфат аммония

ТЕМЭД - 1Ч,М,Н',>Г-Тетраметилэтилендиамин

Трис - Трис(гидроксиметил)аминометан

Дс-Na- Додецилсульфат натрия

Ale. — Allochromatium

Ect. - Ectothiorhodospira

Ph. - Phaeospirillum

R. - Rhodovulum

Rb. — Rubrivivax

Rba. - Rhodobacter

Rbl. - Rhodoblastus

Rps. - Rhodopseudomonas

Rsp. - Rhodospirillum

T. - Thiocapsa

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Фотосинтез - это глобальный биосферный процесс, в ходе которого происходит преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей органических соединений, от которых зависит большинство живых форм на Земле. Фотосинтезирующие бактерии обладают одной из наиболее простых и стабильных систем для сбора и эффективной трансформации солнечной энергии по сравнению с другими фотосинтезирующими организмами (растения, водоросли и др.). Основой фотосинтетического аппарата бактерий являются светособирающие комплексы, которые поглощают энергию квантов солнечного света и переводят ее в энергию электронного возбуждения с последующей передачей этой энергии на реакционные центры (RC), где происходит первичное запасание энергии в виде энергии разделенных зарядов [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Gabrielsen et al., 2009].

Выделяют две группы светособирающих комплексов, согласно расположению относительно RC: периферийные антенные комплексы (LH2) и прицентровые антенные комплексы (LH1) [Zuber and Cogdell, 1995; Cogdell et al., 2006; Sturgis and Niederman, 2009]. RC расположен внутри структуры комплекса LH1 и образует с ним ядерный (core) комплекс LH1-RC [Zuber and Cogdell, 1995], вокруг которого в мембране располагаются комплексы LH2 [Bahatyrova et al., 2004]. Для комплексов LH2 и LH1-RC определена пространственная структура с высоким разрешением [McDermott et al., 1995; Koepke et al., 1996; Hu and Schulten, 1997; Roszak et al., 2003]. Установлено, что эти комплексы построены по универсальному модульному принципу из одинаковых субъединиц, каждая из которых состоит из двух низкомолекулярных полипептидов (а и ß), БХл и каротиноидов [Zuber and Cogdell, 1995; McDermott et al., 1995; Roszak et al., 2003]. В комплексе LH2 из Rbl. acidophilus 10050 каждый a/ß-гетеродимер связывает 3 молекулы БХл и 1 молекулу каротиноида (родопин-глюкозид) [Papiz et al., 2003; Prince et al., 2003]. Основными функциями каротиноидов являются светособирающая, защитная и структурная [Москаленко и Ерохин, 1981; Moskalenko and Karapetyan, 1996; Cogdell et al., 2006; Scheer, 2006; Поляков и Лёшина, 2006; Theiss et al., 2008; Telfer et al., 2008; Frank and Polivka, 2009]. В настоящее время проблемой является получение бескаротиноидных комплексов LH2. Установлено, что комплексы LH2 не собираются в бескаротиноидных мутантах несерных пурпурных бактерий, полученных классическим мутагенезом или транспозоновым методом [Jones et al., 1992; Lang and Hunter, 1994]. Единственный на сегодняшний день метод для получения бескаротиноидных комплексов LH2

- это ингибирование биосинтеза каротиноидов в клетках бактерий при их выращивании [Goodwin and Osman, 1953; Bramley, 1993; Moskalenko and Makhneva, 2012]. К настоящему времени найдены только две пурпурные серные бактерии Ale. vinosum и Ale. minutissimum, у которых биосинтез каротиноидов можно ингибировать на 95-99% и сохранить полный набор светособирающих комплексов [Cohen-Bazire and Stanier, 1958; Brill, 1963; Moskalenko and Makhneva, 2012; Большаков, 2012]. Попытки подавить синтез каротиноидов у несерных бактерий не дали положительного результата: клетки или прекращали рост в присутствии ингибитора или синтез каротиноидов подавлялся на 30-45% [Gall et al., 2005]. Бескаротиноидный комплекс LH2 был выделен только из пурпурной серной бактерии Ale. minutissimum [Москаленко, 1993; Москаленко и др., 2001; Makhneva et al., 2008; Moskalenko and Makhneva, 2012]. Особенностью комплексов LH2 из Ale. minutissimum является гетерогенность полосы поглощения БХл800 [Москаленко, 1993]. Предполагается, что именно эта гетерогенная полоса определяет способность указанного комплекса собираться без каротиноидов [Cogdell et al., 2006]. Аналогичные комплексы LH2 из несерных бактерий имеют гомогенную полосу поглощения БХл800 и, по общему мнению, не могут собираться без каротиноидов. Поэтому представляло интерес изучить бактерию, которая содержит комплекс LH2 с гомогенной полосой при 800 нм, и исследовать в ее клетках взаимосвязь биосинтеза каротиноидов и сборки светособирающих комплексов.

Цели и задачи исследования

Цели данной работы: 1) получить бескаротиноидный комплекс LH2 и комплексы LH2 с разным составом каротиноидов из пурпурной серной бактерии Eet. haloalkaliphila и изучить их свойства; 2) исследовать встраивание каротиноидов in vivo и in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila.

Были поставлены следующие задачи:

1. Вырастить клетки Ect. haloalkaliphila с различным уровнем ингибирования биосинтеза каротиноидов, используя разные концентрации дифениламина. Выделить из них светособирающие комплексы и изучить распределение в них каротиноидов. Выделить бескаротиноидный комплекс LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучить его свойства.

2. Изучить встраивание разных каротиноидов in vivo в светособирающие комплексы в ходе восстановления биосинтеза каротиноидов в клетках Ect. haloalkaliphila.

3. Провести встраивание in vitro разных каротиноидов в светособирающие комплексы из

Ect. haloalkaliphila и изучить свойства комплексов LH2 со встроенными каротиноидами.

Научная новизна и практическая значимость работы

Получены клетки и светособирающие комплексы с разным качественным и количественным составом каротиноидов при выращивании клеток Ect. haloalkaliphila в присутствии различных концентраций дифениламина (ДФА). Показано, что ингибитор подавляет активность фитоинсинтетазы или ферментов из более ранних стадий биосинтеза каротиноидов. Изменение состава и количества каротиноидов не влияет на сборку ПБК.

Впервые получен бескаротиноидный комплекс (ДФА-комплекс) LH2 из Ect. haloalkaliphila и изучены его свойства. Показано, что каротиноиды не являются обязательным компонентом для сборки комплексов LH2. Установлено, что структура ДФА-комплекса LH2 менее устойчива к действию различных повреждающих факторов (температуры, синглетного кислорода, детергентов и органических растворителей) по сравнению с контрольным комплексом.

Показано, что при восстановлении биосинтеза каротиноидов in vivo спириллоксантин преимущественно встраивается в комплекс LH1-RC, а ангидрородовибрин, спириллоксантин, ликопин и родопин - в комплекс LH2. Выяснено, что скорость восстановления биосинтеза каротиноидов опережает скорость роста культуры клеток.

Установлено, что после встраивания разных каротиноидов in vitro в светособирающие комплексы из Ect. haloalkaliphila они восстанавливают свои свойства. Эффективность встраивания каротиноидов составляет от 80 до 100%. Показано, что процессы встраивания каротиноидов в клетках и in vitro отличаются.

Полученные данные вносят существенный вклад в фундаментальные знания об организации ПБК, функционировании и свойствах каротиноидов в этих комплексах и могут быть полезны для разработки искусственных систем сбора и преобразования солнечной энергии на основе ПБК.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XVII, XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2012); XIV, XV, XVI,

XVII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012, 2013); всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); VI съезде Российского фотобиологического общества (Краснодарский край, пос. Шепси, 2011); XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); школе-конференции молодых ученых на базе ИФПБ РАН «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 2012, 2013); международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012, 2013).

Личный вклад соискателя

Диссертация выполнена самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих статьях и разделах диссертации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статьи: 3 статьи в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 14 в материалах конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, иллюстрирована 56 рисунками. Список литературы содержит 215 источников (из них 183 на английском языке).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОТРОФНЫХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

Пурпурные бактерии представляют собой группу аноксигенных фототрофов с весьма универсальным метаболизмом [Drews and Imhoff, 1991; Imhoff, 1995]. Они могут существовать за счет фотоавтотрофного или фотогетеротрофного способов питания, используя при этом микроаэробное или анаэробное дыхание [Blankenship, 2002]. Благоприятными природными средами для роста и размножения пурпурных бактерий являются озера, пруды, устья рек и другие анаэробные водные среды с большим разнообразием соединений-восстановителей, которые можно использовать в качестве доноров электронов (H2S, S°, S2O32", Н2, Fe2+ и др.). Биоразнообразие видов бактерий зависит от рН, солености среды, интенсивности света и температуры [Pfennig, 1967, 1978а, 1989; Madigan, 1988; Madigan and Jung, 2009].

Пурпурные бактерии отличаются большим морфологическим разнообразием, как форм клеток, так и их фотосинтезирующих структур. Показано, что в клетках этих организмов присутствуют мембранные структуры нескольких типов [Кондратьева, 1972; Drews and Golecki, 1995]:

1. многочисленные пузырьки, называемые хроматофорами (рисунок 1 a) (Rsp. rubrum, Rba. capsulatus, Ale. vinosum, T. roseopersicina и др.);

2. отдельные стопки ламелл (представители рода Ectothiorhodospira, например, Ect. shaposhnikovii, Ect. haloalkaliphila и др., а также Ph. molischianum) или ламеллы, расположенные по периферии клеток (Rps. palustris, Rbl. acidophilus и др.) (рисунок 1 б);

3. отдельные довольно редкие сложные выросты цитоплазматической мембраны (рисунок 1 в) (Rps. gelatinosa и Rsp. tenue);

4. ветвящиеся или параллельные трубочки (рисунок 1 г) (Т. pfennigii).

Для пурпурных бактерий существует две основные классификации. Первая основана на их физиологических особенностях, а именно на их толерантности к использованию сульфида [Hansen and van Gemerden, 1972; Bruñe, 1995; Madigan and Jung, 2009]. По этому признаку пурпурные бактерии разделяют на пурпурные серные и пурпурные несерные бактерии. Вторая базируется на сравнительном секвенировании генома пурпурных бактерий по 16S рРНК [Woese and Fox, 1977; Weisburg et al., 1991; Imhoff, 2001; Coenye and Vandamme, 2003; Imhoff et al., 2005; Madigan and Jung, 2009]. По этой классификации пурпурные серные бактерии относят к гаммапротеобактериям, а пурпурные несерные бактерии - к альфа- или бета-протеобактериям.

Рисунок 1. Типы фотосинтезирующего аппарата у пурпурных бактерий [модификация по Кондратьевой, 1972]. Обозначения: кс - клеточная стенка, цм - цитоплазматическая мембрана, ф - фотосинтезирующие структуры.

Arhadomonas aqmeofci

Thioflavtcmcus mohilis Л ТСС' 10MS91 Thiacystts

gelatinosa

IbitKixcuspfemngn DSM 226 v \ DSM 215' Thioalkalkacots linmaeus ЛТСС BAA32rN

ИтЫосарш halo/Ma OSM 6210', Halochrtmalium g/yrohcum ßSM 11080! Hatochromamim salexigens t>SM 4395'"

liuchromatliim hinten DSM 176''

Thiorhadavihrio Mnogradskyt "SM 6702'

RhaMixhromainim mar mum DSM 526I1

('fhiocystis violatedts DSM 168T

, Chrimauum okenn DSM 1691

¡Alloi-/in>matiitm mintinssrmum DSM 1376 | A^llochromattum vwosvm DSM ISO'' 1

- Ihitxrapsapendens DSM 236' ' Ihtvcapsa rosea DSM 235'

¡¡Инн «¡>4i m\eoper\n inu DSM 217' " IhtorhodtxiKiUS minor DSM 115I8T

* Marlihromanum ^rati/t'DSM 203r ' Manchrnmattum purpuralum DSM 159)'

/.wAtricftiu toh

. Kclothiorhotlotpira haloalkahphüa ATCC 51935 '

* IxmlhiorhoJospira mohihs DSM 23 7' hxlathiorhodtispira \hapo\hntko\'ii DSM 243'

Thmrhodosptra sibinai ATCC 700588 '

Halarhodospira litilophila DSM 244 1

Halorhodospira halachlons DSM 10591 Halorhodospira abdclmakkii DSM 2110 1

Рисунок 2. Филогенетическое дерево видов пурпурных серных бактерий, основанное на их сравнительном анализе по 16S рРНК [Imhoff, 2001]. Прямоугольниками отмечены наиболее изученные виды фотосинтезирующих бактерий.

В настоящее время известно более 25 родов серных и более 20 родов несерных пурпурных бактерий [Madigan and Jung, 2009]. Филогенетическое дерево серных бактерий

показано на рисунке 2. Пурпурные серные бактерии включают как виды, накапливающие серу во внутриклеточном пространстве (например, Chromatiaceae), так и виды, образующие скопления серы вне клетки (Ectothiorhodospiraceae). Большинство лабораторных исследований пурпурных серных бактерий проводятся на таких видах как Allochromatium и Thiocapsa, так как их легче всего культивировать в лабораторных условиях [Madigan and Jung, 2009]. Многие виды пурпурных серных бактерий являются «экстремофилами», включая в частности ви