Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval"

На правах рукописи

МЯКОШИНА Юлия Анатольевна

Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval.

03.00.05. - «Ботаника»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 200«

Работа выполнена в лаборатории биосистематики и цитологии Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской Академии наук

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Лунина Елизавета Ольгердовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Бадаева Екатерина Дмитриевна кандидат биологических наук,

Попова Тамара Никитична

Ведущая организация: Всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Защита состоится « 5" » апреля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.211.01 при Ботаническом институте им. В.Л.Комарова РАН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 2. Факс (812) 234-45-12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН

Автореферат разослан " 4 " марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Юдина О.С.

ЯРО С ft

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение проблемы организации и эволюции геномов и хромосом цветковых растений в настоящее время является одним из магистральных направлений исследований в ботанике, генетике, а также новой дисциплине, сложившейся на рубеже XX-XXI веков - сравнительной геномике. Результаты подобных исследований, в частности, имеют важное значение для понимания закономерностей эволюции, решения задач систематики и филогении. Сравнительно-кариологинеские исследования отдельных таксонов являются лишь начальной, но абсолютно необходимой базой для решения этого круга проблем.

Семейство однодольных цветковых растений Trilliaceae Cheval., включающее в себя как диплоидные, так и полиплоидные виды с самыми крупными среди эукариот хромосомами, до сих пор недостаточно полно исследовано с точки зрения кариологии. Между тем, сравнительно-кариологические данные зачастую имеют большое значение для систематики и филогении растений. Изучение кариотипов включает в себя исследования числа, размеров, морфологии и центромерного индекса хромосом, а также рисунка дифференциальной исчерченности (паттерна), получаемого при помощи различных методов дифференциального окрашивания хромосом.

Данная работа посвящена кариосистематическому исследованию представителей семейства Trilliaceae.

Дели я задачи работы. Целью нашей работы было сравнительное кариологическое исследование представителей сем. Trilliaceae, установление систематических связей между ними. Для этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Выявление гетерохроматиновых сегментов хромосом с разным нуклеотидным составом при помощи метода дифференциального окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами. Построение цитологических карт хромосом.

2) Сравнительный анализ расположения ядрышковых организаторов, выявляемых методом окрашивания нитратом серебра и в некоторых случаях при помощи FISH (флуоресцентной гибридизации in situ), у разных видов Trilliaceae.

3) Анализ геномного состава полиплоидных видов на основании цитологических карт хромосом.

4) Исследование нуклеотидного состава гетерохроматиновых районов хромосом, выявляющихся после прижизненного воздействия холодом (CSR-сегментов).

5) Анализ эволюционно изменчивых ITS последовательностей кластеров рРНК-генов у разных представителей сем Trilliaceae.

6) Совокупный анализ кариологических данных и данных молекулярной систематики.

Научная новизна работы При помощи метода окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами впервые изучены кариотипы и построены цитологические карты хромосом Trillium tschonoskii Maxim., межвидового гибрида Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki (Trillium camschatcense Ker -Gawl. x Trillium tschonoskit), Trillium rhombifolium Кош., Trillium erectum L, Trillium grandiflorum (Michx.) Salisb., Trillium recurvatum Beck, París incompleta Bieb., París quadrifolia L, Daiswa hainanensis (Merrill) Takht.

Впервые исследован геномный состав гексаплоидного вида Trillium rhombifolium, введена номенклатура его генома. Впервые на основании кариологического анализа показано, что гексаплоидный российский вид Trillium rhombifolium неидентичен гексаплоидному японскому виду Trillium hagae. Внесено предложение об изменении номенклатуры геномов Trillium tschonoskii и Trillium х hagae. Впервые показано, что роды París, Daiswa, Trillium демонстрируют различные и, предположительно, родоспецифичные типы дифференциальной исчерченности хромосом. Впервые показано, что у вида Trillium tschonoskii тип дифференциальной исчерченности хромосом наиболее приближен к типу исчерченности, характерному для рода París, что является дополнительным аргументом в пользу вывода молекулярно-филогенетических исследований о межродовом гибридном происхождении этого вида.

Прикладное значение. Материалы диссертации являются вкладом в изучение вопроса о закономерностях изменения дифференциальной исчерченности хромосом и локализации кластеров рибосомных генов в ходе эволюции диплоидных и полиплоидных геномов цветковых растений, а также имеют значение для систематики цветковых растений.

Полученные сведения могут быть использованы при чтении курсов лекций по систематике цветковых растений, и ряда спецкурсов, цитологические карты хромосом могут быть учтены при дальнейших систематических исследованиях как внутри семейства ТпШасеае, так и близких к ним таксонов. Результаты также могут представлять интерес для садоводов, поскольку отдельные виды Trilliaceae являются декоративными растениями.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены в виде устных докладов и стендовых сообщений на IV Всероссийском совещании по кариологии и кариосистематике растений (С.-Петербург, 1999), VII Молодежной конференции ботаников (С.-Петербург, 2000); Ш Европейской цитогенетической конференции (Париж, 2001), XIV Всероссийиском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (С.-Петербург, 2002), научной конференции БИН РАН "Молодые ученые -победители конкурса научных работ 2002 г." (17 февраля 2003 г.), XVII Международном Ботаническом конгрессе (Вена, 2005), V Международном совещании по кариологии, кариосистематике, молекулярной систематике растений (С. -Петербург, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах и сборниках и 8 тезисов в сборниках научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на •¿¿¿'страницах, содержит 35 рисунков, 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, полученным результатам и обсуждению, выводов. Прилагаемый список литературы включае^^гаимеиований, из которых-/#на иностранных языках.

1. Обзор литературы.

Обзор литературы состоит из 8 глав (2.1 - 2.8) В главе 2.1 приводится исторический обзор систематических исследований внутри семейства. Главы 2.2 - 2.3 посвящены Триллиевым на территории России и их морфологической характеристике. В главах 2.4 - 2.7 изложены история кариосистематического изучения представителей семейства Trilliaceae, исследование полиморфизма гетерохроматиновых сегментов хромосом и применение различных методов дифференциального окрашивания хромосом. В главе 2.8 приводится обзор работ, посвященных молекулярно-филогенетическим исследованиям Триллиевых.

Сем Trilliaceae является реликтовым семейством однодольных растений и состоят из 4 родов (Тахтаджян, 1982,1983):

1) p. Kinugasa Tatew.& Sato - представлен единственным видом К. japonica, произрастает на о-ве Хонсю в Японии;

2) p. Daiswa Raf. - 15 видов, произрастают в умеренной зоне Гималаев, на северо-востоке Индии, севере Бирмы, в пределах континентального Китая, во Вьетнаме;

3) p. Paris L sensu stricto - 5-6 видов, распространенных в Евразии: Средиземноморье, Западной Европе, на Кавказе (включая Закавказье и северо-восток Турции), в Сибири, Восточной Азии, включая Дальний Восток России;

4) p. Trillium L.- около 40 видов. Род Trillium - самый большой в семействе, включает в себя 2 подрода: 1) подрод Trillium, представлен видами с цветком на цветоножке ("pedicellate-flowered"), делится в свою очередь на 2 группы видов: виды с прямой цветоножкой ("erect") и виды с наклоненной цветоножкой ("declinate"), и 2) подрод Phyllantherum Raf., представлен сидячецветковыми видами, без цветоножки ("sessile-flowered"). Род Trillium имеет два очага распространения: Восточная Азия (от Западных Гималаев до Камчатки и Японии), где произрастают 5 видов и предположительно 3 межвидовых гибрида из подрода Trillium и Северная Америка, где распространено большинство (36) видов из обоих подродов. В Восточной Азии произрастают полиплоидные (тетра- и гексаплоидные) виды, за исключением диплоидного Т. camschatcense, в Северной Америке все виды - диплоиды.

Евразийские роды Paris sensu stricto и Daiswa различными авторами рассматриваются либо как самостоятельные (Takhtajan, 1982, 1983), либо вместе с родом Kinugasa объединяются в один род Paris sensu lato (Farmer, Schilling, 2002).

В последнее время на основании данных молекулярной систематики из рода Trillium два вида были выделены в самостоятельные роды: Pseudotrillium S. В. Farmer, gen. nov. (состоит из единственног вида Pseudotrillium rivale (S. Watson) S В. Fanner,

comb. nov.) и Trillidium Kunth (состоит из единственного вида Trillidium govanianum Kunth (Farmer, Shilling, 2002)).

Во флоре России встречается род Triílium (5 видов и 1 межвидовой гибрид) и род París (5 видов) (Черепанов, 1995).

Род Trillium представлен видами: Т. camschatcense, распространенным на Камчатке, Курильских островах, Сахалине и в Хабаровском крае, Т. tschonoskii, встречающимся только на острове Сахалин и образующим триплоидные природные гибриды Т. х hagae с предыдущим видом, Т. rhombifolium, встречающимся в Приморье и морфологически сходным с японским видом Т. hagae Miyabe et Tatewaki, а также Т. apetalon Makino (встречается в пределах южного Сахалина и южной и центральной части Курил) и Т smallii Maxim, (южный Сахалин) (Харкевич, 1988; Черепанов, 1995). Все российские виды относятся к восточноазиатской группе.

Род París на территории России представлен видами: Р. quadrifolia, Р. incompleta, Р. verticillata Bieb, Р manshurica Кот., Р. setchuensis (Franch.) Barcalov. В Европейской часта России произрастает Р. quadrifolia, который также распространен на территории Сибири и Кавказа. На Северном Кавказе и части Закавказья, а также на северо-востоке Турции (в районах, граничащих с Аджарией) произрастает субэндемичный вид Р. incompleta. Р. verticillata встречается на территории восточной Сибири и Дальнего Востока. На Дальнем Востоке также растут Р. manschurica (Приморье, Амур), Р. setchuensis (Mili, 1984; Харкевич, 1988; Черепанов, 1995; Байков, 2005).

Все представители сем Trilliaceae обладают исключительно большими размерами хромосом среди эукариот (средняя длина хромосом Т. camschatcense в метафазе превышает 50 мкм, а содержание ДНК на гаплоидный геном - 45 пг.) (Ingle et al., 1975; Гриф и др., 1980). Расчеты показывают, что содержание ДНК на одну хромосому у этого вида составляет около 9 млрд пар нуклеотидов, что в 3 раза превышает содержание ДНК всего гаплоидного генома человека. Эти характеристики делают хромосомы Триллиевых удобным объектом для цитогенетики.

Все Триллиевые имеют единый план строения кариотипа, состоящего из большой метацентрической, средней метацентрической, субметацентрической, субакроцентрической и малой метацентрической хромосом, или хромосомы А. В. С, D, E-типа соответственно (Haga, 1934; Агапова, Гриф, 1981). Вместе с тем, рисунок исчерченности, получаемый при дифференциальном окрашивании хромосом видов сем. Trilliaceae, богат и разнообразен. Он видоспецифичен и является своеобразным паспортом вида.

Существует много методов дифференциального окрашивания хромосом. Ранее, когда традиционно использовали CSR-бэндинг (т. е. бэндинг, основанный на прижизненном воздействии холодом на корневую меристему растений), была выявлена высокая межвидовая и внутривидовая изменчивость по распределению и размерам гетерохроматиновых CSR-блоков в сем Trilliaceae (Fukuda, Kozuka, 1958; Fukuda, Grant, 1980; Miyamoto et al., 1992 и др.). Однако этот метод выявляет только крупные блоки и в ряде случаев трудно применим.

Наиболее информативным оказался метод дифференциального окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами (<3-бэндинг), так как при таком окрашивании можно не только узнавать распределение гетерохроматиновых блоков, но и их нуклеотидный состав.

3. Методы и материалы.

Материалом для исследований послужили растения следующих видов (см. табл.1):

Таблица 1. Происхождение исследованных нами представителей сем. ТпШасеае.

Вид Происхождение

Trillium camschatcense Ker-Gawl о. Сахалин, п-ов Камчатка

Т. tschonoskii Maxim. о. Сахалин

Т. x hagae Miyabe et Tatewaki о. Сахалин

T. rhombifolium Kom. Приморский край

T. erectum L. коллекция БИН РАН

T. grandifíorum Michx. коллекция БИН РАН

T. recurvatum Beck. коллекция БИН РАН

París quadrifolia L. окр. пос. Лемболово, Ленинградская обл.

P. incompleta Bieb. Северный Кавказ, окр. г. Владикавказа

Daiswa hajnanensis (Merril) Takht. оранжереи БИН РАН, привезены из Южного Вьетнама (исследованы 2 растения - Ш823 и ОЬ751)*

* - ивентаризационные номера этих растений № 263823 и №263751, соответственно этим растениям даны обозначения Dh823 и Dh751.

Для приготовления препаратов хромосом использовали меристематические зоны молодых корней взрослых растений. После предобработки 0.2% раствором колхицина в течение 5 часов материал фиксировали в смеси этанол-ледяная уксусная кислота (3:1) в течение 16-24 часов, после смены фиксатора хранили в холодильнике. Затем по общепринятой методике приготовляли неокрашенные давленые препараты.

При окрашивании препаратов хромосом по методу Швайцера и Амброса (Schweizer, Ambros, 1994) использовали следующие флуоресцирующие красители (флуорохромы):

DAPI - флуорохром, связывающийся с АТ-парами оснований,

СМА (хромомицин A3) - флуорохром, связывающийся с GC-парами оснований, ACMD (актиномицин D)- нефлуоресцирующий агент в дополнение к DAPI, связывающийся с GC-парами оснований,

DA (дистамицин А) - нефлуоресцирующий агент в дополнение к СМА, связывающийся с АТ-парами оснований.

Для анализа полученной Q-исчерченности кариотипов использовали компьютерную программу хромосомного анализа VideoTest-Kario 1.3 (Muravenko et al., 1998; Лунина и др., 1999).

g

Расположение ядрьплковых организаторов на хромосомах изучали с помощью Ag-NOR-окрашивания (окрашивание нитратом серебра AgNCb) и в некоторых случаях с помощью FISH (флуоресцентной гибридизации in situ).

Ag-NOR окрашивание препаратов хромосом проводили по методу Хауэлла и Блэка (Howell, Black, 1980).

FISH-гибридизацию проводили по общепринятой методике Лейча с незначительными модификациями (Leitch et at., 1994).

CSR-окрашивание проводили по общепринятому методу с некоторыми модификациями. Молодые корни помещали в воду, охлажденную до 0°С на 72 часа. Затем фиксировали в 0,5% колхицине в течение 3 часов и помещали в фиксатор, состоящий из 3 частей спирта и 1 части ледяной уксусной кислоты. Потом материал окрашивали ацето кармином, а также по Фельгену и приготовляли давленые препараты, которые сразу же просматривали. Для последующего окрашивания препаратов флуорохромами Н33258, DAPI, СМА с окрашенных ацетокармином препаратов при помощи жидкого азота снимали покровные стекла, и препараты высушивали при комнатной температуре в течение двух суток.

4. Результаты и обсуждение.

В кариотипах всех исследованных нами представителей сем. Trilliaceae можно было различить базовый кариотип, представленный пятью хорошо различающимися между собой по длине и/или по центромерному индексу хромосом: А, В, С, D, Е.

4.1. Анализ кариотипа Т. camschatcense (2п=10).

Дифференциальное окрашивание хромосом этого вида флуорохромами Н33258 или DAPI выявляет многочисленные ярко флуоресцирующие АТ-обогащенные сегменты гетерохроматина с разнообразной локализацией и размерами. При окрашивании тех же препаратов флуорохромом СМА эти районы затухали, и выявлялось несколько мелких ярко флуоресцирующих блоков, расположенных преимущественно в теломерных районах хромосом. Расположение этих блоков соответствует расположению ядрышкообразующих локусов (NOR), выявленных нами при окраске хромосом Т. camschatcense азотнокислым серебром (Мякошина и др., 2002). Характерная особенность дифференциальной исчерченности хромосом Trillium, связанная с их огромными размерами, - наличие гетерохроматиновых блоков двух типов: широких, имеющих вид полосы, и точковидных, размеры которых меньше диаметра хроматиды. Эти два типа блоков схематически отражены нами на рис. 1.

Контрастирование препаратов AMD и DA не выявило никаких дополнительных блоков на хромосомах Т. camschatcense.

Дифференциальная исчерченность хромосом Т. camschatcense ранее была изучена при помощи CSR- и С-окрашивания хромосом. Японскими исследователями был отмечен внутри- и межвидовой полиморфизм, а также гетероморфизм гомологичных хромосом по размерам и характеру распределения гетерохроматиновых CSR-сегментов, была введена номенклатура геномов полиплоидных триллиумов, и

геномная композиция единственного ныне существующего диплоидного азиатского вида Т camschatcense была обозначена как K1K1 (Haga, Kurabayashi, 1953, 1954; Fukuda, Kozuka, 1958; Haga, 1969; Samejima, Samejima, 1991 и др.). В нашей работе мы сохраняем обозначение генома Т camschatcense, как KiK|.

20 mkm

мч Г

"Hin

Геном К1К1.

20 mkm

А В С О Е

Рис. 1. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом Т. сатясИа/сепзе. Здесь и далее - сплошной заливкой обозначены АТ-обогащениые гетерохроматиновые районы хромосом, штриховкой - (ЗС-обогащенные. Показаны наиболее часто встречающиеся варианты полиморфизма гетерохроматиновых сегментов. Буквами А, В, С, Э, Е здесь и далее обозначены типы хромосом.

4.2. Анализ карвотипа Т. tschonoskii (2п=20).

У этого вида многочисленные ярко флуоресцирующие АТ-обогащенные сегменты гетерохроматина имеют разнообразную локализацию. GC-обогащенные блоки мелкие, расположены преимущественно в теломерных районах хромосом.

Некоторые сегменты ярко флуоресцировали при обоих способах окрашивания, что вероятнее всего указывает на чередование коротких AT- и GC-обогащенных треков ДНК в таких гетерохроматиновых районах. Контрастирование препаратов AMD и DA не выявляет каких-либо дополнительных блоков на хромосомах Т. tschonoskii.

В нашем исследовании не было отмечено сколько-нибудь заметного полиморфизма по распределению гетерохроматиновых сегментов хромосом у Т. tschonoskii. Цитологическая карта хромосом Т. tschonoskii представлена на рис. 2.

Ядрышкообразукмцие районы (NOR) на этой схеме показаны в соответствии с результатами окрашивания хромосом азотнокислым серебром (Мякошина и др., 2002). Все эти районы демонстрируют яр1^к> флуоресценцию при окрашивании СМА. Японскими цитологами на основании анализа поведения хромосом в первом мейотическом делении геном Т. tschonoskii был обозначен как К2К2ТТ (Haga, 1937; Haga, Kurabayashi, 1953, 1954), т.е. один из субгеномов Т. tschonoskii более близок к геному Т camschatcense, чем к другому субгеному.

Наши исследования показали, что оба субгенома Т. tschonoskii содержат заметно меньше гетерохроматина, чем геном Т camschatcense, и сходства между геномами Т. tschonoskii и геномом Т. camschatcense по рисунку распределения гетерохроматиновых сегментов практически нет, за исключением одной из пар хромосом D-типа (рис. 1 и 2). Кроме того, оба субгенома Т tschonoskii очень сходны между собой. Исходя из вышеизложенного, нами предложена другая номенклатура генома Т. tschonoskii - Т1Т1Т2Т2.

20 mkm

NOR NOR NOR NOR NOR NOR

20 mkm

T

T

та

т

та

«2 Tl

T

та

А В С О Е

Рис. 2.. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом Т. НсИопозкИ. Внизу: первая строка - буквенные обозначения геномов, принятые ранее, вторая -обозначения, предлагаемые нами.

4.3. Анализ кариотипа природного гибрида Т. х hagae (Т. Ьскоы№ки х Т. сашскМсеше) (2п=15). В России гибридные формы Т. х hagae с промежуточными морфологическими признаками встречаются на о. Сахалин в смешанных популяциях Т. 15сЬопозкИ и Т салюсйа/се/ие. В наших исследованиях задействовано, к сожалению, только одно растение. Результаты окрашивания хромосом флуорохромом Н33258 в виде цитологической карты представлены на рис. 3.

20 mkm

20 mkm

f

«1 Т1 тг к, т2 К1 п т2 К., т, тг к, т, т,

А В С О Е

Рис. 3. Цитологическая карта триплоидного набора хромосом гибрида Т. х hagae. Внизу: первая строка - введенные нами буквенные обозначения геномов.

В кариотипе хорошо идентифицируются 5 хромосом гаплоидного генома Т. camschatcense и 10 хромосом обоих геномов Т. tschonoskii. Это доказывает, что данное растение произошло в результате межвидовой гибридизации Т tschonoskii и Т. camschatcense, следовательно, его можно идентифицировать как гибрид Т х hagae Геном Т. х hagae японскими цитологами на основании распределения CSR-сегментов был обозначен как К1К2Т, т.е. состоящий из гаплоидного генома Ki Т. camschatcense и диплоидного генома К2Т Т. tschonoskii. (Haga, Kurabayashi, 1953; Haga, 1956). В нашей работе для генома Т camschatcense мы сохраняем символ К|К|; геном Т. tschonoskii. обозначаем Т1Т1Т2Т2, следовательно, геномная композиция исследованного нами триплодного гибрида Т.х hagae будет К1Т1Т2 (рис. 3).

Локализация NOR и окрашивание хромосом флуорохромом СМА на этом объекте нами не проводились.

4.4. Анализ кариотнпа Т. rhombifolium (2п=30).

У этого вида АТ-обогащенные гетерохроматиновые блоки имеют разнообразные размеры и локализацию. Количество GC-обогащенных сегментов невелико, почти все они мелкие, точечные, расположены прителомерно и совпадают с локализацией ядрышкообразукмцих районов (NOR), выявленных методами окрашивания AgNG3 и FISH (Мякошина и др.,2002). Единственный интеркалярный GC-обогащенный блок обнаружен на одной из пар хромосом A-типа. Контрастирование препаратов AMD и DA не выявляет каких-либо дополнительных блоков на хромосомах Т rhombifolium. Сколько-нибудь существенного полиморфизма в рисунке распределения гетерохроматиновых сегментов хромосом у этого вида нами не отмечено.

Т rhombifolium морфологически сходен с японским гексаплоидным видом Т. hagae (Гриф и др., 1977). Следовательно, можно ожидать, что геном Т rhombifolium по характеру распределения и размерам гетерохроматиновых сегментов будет идентичен геному Т hagae, т. е. являться удвоенным геномом триплоидного гибрида Т. х hagae (К,К,Т,Т,Т2Т2).

39 гтйян

NO* NMt

К1

NMt

т т»

NOR

т

ig'L'U

ц.п

в

К1

•л? та? к< v п ni TiT тгт

А В С D Е

Рнс. 4. Цитологическая карта гексаплоидного набора хромосом Т rhombifolium. Внизу: первая строка - буквенные обозначения геномов, введенные нами.

Анализ цитологической карты хромосом Т rhombifolium (рис. 4) показывает, что геном этого гексаплоида не является результатом прямого удвоения хромосомного

набора триплоидного гибрида T. х hagae. Хорошо идентифицируются четыре пары хромосом типов А, С, D и Е из генома К] T. camschatcense (обозначены К|) и одна пара D-хромосом одного из геномов Т tschonoskii (обозначена Т|). Еще четыре пары хромосом С- и E-типов и одна пара A-типа сходны, но не идентичны с соответствующими хромосомами Т tschonosldi (обозначены T?, Ti?, Т2?). Не удается определить геномную принадлежность пяти пар хромосом: одной пары A-типа, всех трех пар В-типа и одной пары D-типа (обозначены «?»). Таким образом, в геноме T rhombifolium достаточно хорошо прослеживается субгеном К|, а наличие субгеномов Т] и Тг представляется спорным.

При этом географически эти виды достаточно изолированы друг от друга. T. rhombifolium произрастает в Южном Приморье (Россия), а T. hagae - в Японии на о. Хоккайдо. T hagae обнаруживается в смешанных популяциях вместе с T. camschatcense, T tschonoskii и их триплоидными гибридами T х hagae (Haga, 1937; Kurabayashi, 1958; Гриф и др., 1977; 1985 и др). На о. Сахалин, где T camschatcense произрастает вместе с T tschonoskii и иногда встречается их триплоидный гибрид Т. х hagae, гексаплоиды, которые можно было бы идентифицировать как T. rhombifolium или же T hagae, неизвестны. Мы полагаем, что T. rhombifolium и T hagae - это два отдельных вида, возникших на базе предковых геномов Ki, Ti и Тг, независимо и разновременно в разных географических точках. При этом вероятно, что T. rhombifolium сформировался намного раньше, и его субгеномы уже успели претерпеть существенные преобразования, либо до, либо уже после их объединения в аллогексаплоиде, тогда как T. hagae, по-видимому, является более молодым видом.

Мы предлагаем обозначить субгеномы T. rhombifolium Kir, Tir и Tîr. Таким образом, геномная композиция этого вида будет обозначаться как KirKirTirTirTirTîr.

4.5. Анализ кариотипа Trillium erectum (2n=10).

У Trillium erectum окрашивание хромосом флуорохромом Н33258 без применения контрастирующих агентов выявляет многочисленные ярко флуоресцирующие блоки АТ-обогащенного гетерохроматина. Размеры и локализация их очень разнообразны (рис. 5).

-ÜW-1

А В С D Е

Рис. 5. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом Т. erectum.

Особенно крупные блоки локализованы на концах коротких плеч В-, С- и Е-пар хромосом. Отмечен полиморфизм рисунка гетерохроматиновых сегментов у С-пары хромосом. GC-обогащенные блоки мелкие, точечные, прителомерные, выявляются на А-, В-, С- и D-парах хромосом.

Мы предполагаем, что именно эти районы могут быть ассоциированы с NOR (как это наблюдается у ранее изученного нами Т camschatcense). При сопоставлении паттернов распределения гетерохроматиновых сегментов у Т. erectum и ближайшего к нему вида Т. camschatcense видно, что хромосомы А- и D-типов у этих видов сходны, но.хромосомы В-, С- и Е-типов у Т erectum несут крупные дистапьные АТ-блоки, чего никогда не отмечалось у Т. camschatcense (рис. 1 и 5).

4.6. Анализ кариотипа Т. grandiflorum (2п=10).

АТ-обогащенные сегменты у Т. grandiflorum выявляются без применения контрастирующих агентов, они многочисленны, имеют разнообразные размеры и локализацию (рис. 6). На коротких плечах С-пары хромосом расположены крупные концевые блоки. Окрашивание СМА хромосом этого объекта нами не проводилось, но, поскольку каких-либо затухающих районов хромосом у Т. grandiflorum при окраске Н33258 не наблюдалось, то можно предположить, что крупных GC-обогащенных гетерохроматиновых сегментов на хромосомах этого объекта нет. Окраска азотнокислым серебром препаратов хромосом Т. grandiflorum нами также не проводилась.

А В С D Е

Рис. 6. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом Т. grandiflorum.

4.7. Анализ кариотипа T. recurvatum (2п=10).

Этот американский вид относится к группе сидячецветковых Триллиумов, объединяемых в подрод Phyliantherum (Freeman, 1975; Fanner, Schilling, 2002). АТ-обогащенные блоки гетрохроматина выявляются при контрастировании окрашенных H33258(DAPI) препаратов GC-специфичным агентом AMD (рис. 7). Крупные прителомерные АТ-блоки наблюдаются на одном из плечей В- и Е- пары, коротком плече С-пары. Мелкие GC-обогащенные сегменты локализованы в прителомерных районах хромосом В-, С- и D-типов (в последнем случае - на обоих плечах). Окрашивание препаратов азотнокислым серебром выявляет в интерфазных ядрах

Рис. 7. Цитологическая карта диплоидного набора " хромосом Т. recurvatum.

ABC DE

Т. recurvatum от 5 до 8 ядрышек; поэтому мы предполагаем, что именно эти прителомерные GC-обогащенные участки сопряжены с районами NOR. Кроме того, в середине коротких плеч хромосом С-пары также проявляется небольшой затухающий GC-богатый блок. Отмечен полиморфизм рисунка гетерохроматина на В-паре хромосом.

Сравнивая результаты Q-бэндинга у разных видов Trillium, можно подытожить, что у североамериканских видов триллиумов крупные гетерохроматиновые АТ-обогащенные сегменты могут располагаться в дистальных районах хромосом, чего не наблюдается у азиатских видов (ср. рис. 1, 2, 3, 4 и рис. 5, 6, 7). Наиболее сходны между собой рисунки распределения гетерохроматиновых Q-сегментов у Т. camschatcense и Т. erectum (хромосомы А- и D-типа).

Сравнивая Q-паттерны хромосом Т. recurvatum (подрод Phyllantherum) и исследованных нами триллиумов подрода Trillium, можно отметихь, во-первых, меньшее количество блоков, в первую очередь мелких и точечных у Т. recurvatum, а, во-вторых, иной состав гетерохроматина, в котором АТ-обогащенные зоны перемежаются достаточно протяженными GC-обогащенными треками, вследствие чего яркую флуоресценцию АТ-обогащенных блоков можно наблюдать только после применения контрастирующего агента AMD.

4.8. Анализ кариотипа Paris quadrifolia (2n=20).

Кариотип P. quadrifolia также соответствует базовому: в нем можно выделить 5 морфологических типов хромосом (А, В, С, D, Е) в соответствии с общепринятой классификацией. АТ-специфичные гетерохроматиновые сегменты выявляются только после контрастирования агентом AMD в теломерных, прицентромерных и интеркалярных районах хромосом (рис. 8). GC-обогащенные блоки малочисленные, локализованы в прицентромерном и интеркалярном районах хромосом Al и в коротком плече и спутнике у хромосомы D2. Использование контрастирующего АТ-специфического нефлуоресцирующего агента DA не выявило каких-либо дополнительных GC-обогащенных блоков. Все выявленные гетерохроматиновые блоки очень мелкие и представляют собой точки, лежащие в теле хроматиды. Часть блоков выявляется постоянно, а часть удается наблюдать только на некоторых

Метафазных пластинках. За исключением района короткого плеча и спутника 02-пары хромосом (которые ярко флуоресцируют как при СМА-, так и при ОАР1/АМО-окрашивании), все остальные гетерохроматиновые блоки обнаруживались только при одном из двух способов окрашивания.

Окрашивание азотнокислым серебром А^Оз и РКН-гибридизация показали, что у Р. диас1п/оНа содержится лишь два кластера рибосомных генов, лежащих в спутничном районе хромосомы Э2. При окрашивании AgNOз выявляется не более 2-х ядрышек в интерфазном ядре. Из вышеизложенного следует, что район рибосомных 188-268 рРНК генов у Р. дисиЫрНа (ЗС-обогащен, однако содержит относительно много коротких (ЛА+<1Т)п последовательностей длиной не менее 4 пн. Прилежащий к району рибосомных генов гетерохроматиновый участок, занимающий почти все короткое плечо хромосомы 02, также неоднороден по молекулярному составу - его внутренняя часть ярко флуоресцирует при окраске как СМА, так и ОАР1/АМЛ.

амкм 1 23 4 9 в 78 >10

А С В D Е

• АТ-обогэщенный гетерохроматин

• GC-обогащенный гетерохроматин

Рис. 8. Вверху: цитологическая карта диплоидного набора хромосом Р. quadrifolia. Внизу: схема взаиморасположения разных по составу гетерохроматиновых районов (1 и 2) и кластера 18S-26S-pPHK генов на коротком плече хромосомы D2 (3).

В пределах каждого типа хромосом у Р. quadrifolia выявлялись небольшие отличия в морфологии и рисунке дифференциальной исчерченности у гомеологичных пар хромосом. Только одна пара хромосом (D2) имеет спутники, располагающиеся на коротком плече. Можно предположить, что эти небольшие отличия, а также наличие кластеров рибосомных генов только на одной паре из четырех гомеологичных хромосом, свидетельствуют о том, что Р. quadrifolia, по-видимому, является сегментным аллополиплоидом, т.е. произошел в результате гибридизации разных рас или подвидов какого-то древнего представителя рода París.

4.9. Анализ кариотипа París incompleta (2n=10).

У этого вида выявленные АТ-обогащенные блоки гетерохроматина многочисленны, с разнообразной локализацией, имеют вид небольших парных точек.

Отмечается высокий полиморфизм рисунка: варьирует как количество выявляемых сегментов, так и положение сегментов на плече хромосомы, поэтому на схеме показаны только наиболее крупные и часто наблюдавшиеся блоки (рис. 9).

Окрашивание СМА выявляет только необычайно длинные спутничные нити на коротких плечах D-пары хромосом, соответствующие районам ядрышковых организаторов (NOR). При окрашивании интерфазных ядер AgNÜ3 у этого объекта выявлялось не более 2-х ядрышек (Мякошина и др., 2002). Длина спутничных нитей варьировала у разных особей и могла достигать размеров всей хромосомы, при этом сам спутник никогда морфологически не был выражен. В целом паттерн дифференциального окрашивания хромосом у Р. incompleta близок паттернам обоих субгеномов Р. quadrifolia (см. Пунина и др., 2000), но в отличие от последнего, у Р. incompleta АТ-обогащенные гетерохроматиновые блоки, даже миниатюрные, выявляются без применения контрастирующих агентов типа AMD, что свидетельствует об их большей обогащенности АТ-парами нуклеотидов.

20 mflcni.

I

А1 А2 В1 В2 С1 С2 ММ Е

Рис. 9. Цитологическя карта диплоидного набора хромосом Р. incompleta. На коротком плече D-пары хромосом флуорохромом СМА интенсивно выкрашивается спутник и спутничная нить.

Сравнение у разных видов количества и расположения ядрышковых организаторов (NOR), выявленных при помощи окрашивания AgNOj и FISH, показало следующие результаты. Для диплоидных и тетраплоидных видов París характерно наличие только двух NOR на гомологичных хромосомах D-типа. В интерфазном ядре выявляется не более 2-х ядрышек. У видов Trillium в интерфазных ядрах наблюдается иная картина. У Т. camschatcense окрашивается 5-12 ядрышек, у Т. tschonoskii - 7-12 ядрышек, а у Т. rhombifolium - 6-14 ядрышек. При этом на хромосомах у изученных нами видов рода Trillium выявляются 8-22 интенсивно окрашенных NOR в виде мелких парных точек на теломерных районах хромосом A-, B-, C-, D- и Е-типов (Мякошина и др., 2002).

Таким образом, нами показано, что в геномах видов Trillium, в отличие от видов Paris, значительно больше кластеров рРНК генов с разнообразной локализацией. По-

видимому, количество и расположение ЖЖ-ов является родоспецифичным признаком. При этом большинство этих кластеров транскрипционно активны. Нам представляется интересным дальнейшее сравнительное исследование количества, расположения и степени транскрипционной активности 188-268 рРНК генов в геномах представителей разных видов и родов сем. ТпШасеае.

4.10. Анализ кариотипа ЛоЬш НаЫанетЬ

Кариотип Д Лошапелгм (2п=10) в целом соответствует базовому кариотипу, типичному для всех ТпШасеае. Мы исследовали кариотипы двух экземпляров этого вида из живой коллекции закрытого грунта БИН РАН, обозначенных нами как И1823 и ОЬ751. Кариотипы этих растений оказались различны.

зш»

1334 133«

1334 1334

1334

\ш

1334 1334

1234 1334

А В С1 С2 Ю Е

Рис. 10а. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом В. Шпапетгз (ОИ823). 1 - расположение ОЗЯ-сегментов гетерохроматина, 2 - 4 - расположение сегментов гетерохроматина, окрашенных Н33258 (2), Н33258/АМ1} (3), СМА (4).

Рис. 106. Цитологическая карта диплоидного набора хромосом Д. Аатапепт (ВИ751). 1 - располжение СЗЯ-сегментов гетерохроматина, 2, 3-расположение сегментов гетерохроматина, окрашенных ЭАР1 (2) и СМАЗ (3). Светлой штриховкой показаны менее ярко флуоресцирующие блоки.

У растения ВЬ823 (рис. 10а) С-пара хромосом резко гетероморфна: у одного из гомологов произошла, по-видимому, транслокация большей части короткого плеча на

короткое плечо другого гомолога. У растения Dh751 гетероморфизм С-пары при рутинном окрашивании хромосом не выражен и проявляется только в расположении гетерохроматинового блока в коротком плече при дифференциальном окрашивании хромосом. В кариотнпе этого растения присутствует добавочная акроцентрическая Ь-хромосома (рис. 106). У этих двух растений обе гомологичные хромосомы Е-типа имели маленький спутник, что свидетельствует о локализации NOR в этом районе.

Крупные АТ-обогащенные сегменты у обоих растений выявлялись на С-, D-парах хромосом и небольшие сегменты на Е-парах хромосом.. У растения Dh823 прицентромерные АТ-обогащенные блоки наблюдались на B-паре хромосом, тогда как у растения Dh751 на B-паре хромосом не удалось обнаружить каких-либо сегментов. GC-обогащенные блоки у обоих растений также выявлялись на С-, D-, Е-парах хромосом, некоторые из которых либо перекрывались, либо совпадали по расположению с АТ-обогащенными блоками. Это свидетельствует о чередовании относительно коротких треков AT- и GC-обогащенной ДНК в этих районах (рис. 10а, б). На хромосомах А-типа у обоих растений иногда удавалось обнаружить единичные небольшие интеркалярные блоки, флуоресцирующие при обоих способах окрашивания. Добавочная b-хромосома растения Dh751 не имела ни AT- , ни GC-обогащенных блоков гетерохроматвна.

Мы полагаем, что различия рисунков дифференциальной исчерченности хромосом даже у двух разных растений D. haiananensis, могут указывать на высокую степень внутривидового полиморфизма у этого вида, что подтверждается также зафиксированной нами крупной хромосомной перестройкой у экземпляра Dh823 (Коцеруба, Мякошина, 1999), которая привела к радикальному изменению морфологии обеих гомологичных хромосом С-типа. Примечательно, что данная хромосомная перестройка затронула центромерный индекс хромосомы. Мы полагаем, что это свидетельствует об интенсивности микроэволюционных процессов у данного вида.

Сопоставляя паттерн дифференциальной исчерченности хромосом D. hainanensis с таковыми у исследованных нами представителей родов Paris sensu stricto и Trillium, можно отметить в целом, меньшее количество гетерохроматиновых блоков, отсутствие точечных, наличие крупных GC-обогащенных блоков, не сопряженных с NOR и блоков смешанного нуклеотидного состава.

4.11. Сопоставление паттернов Q- и CSR-дифференциальной исчерченности хромосом у D. hainanensis.

CSR-сегменты у обоих исследованных экземпляров при окрашивании как ацетокармином, так и по Фельгену были выявлены на хромосомах С- и D-типов (рис. 10а, б). Их локализация стабильна. У растения Dh823 на С1-хромосоме три лежащих рядом CSR-сегмента занимают более половины длины короткого плеча (рис. 10а) На длинном плече этой хромосомы CSR-сегмент расположен вблизи центромеры. Такой же сегмент выявляется и на длинном плече С2-гомолога. На обеих D-хромосомах на

длинном плече вблизи центромеры расположен CSR-сегмент, часто разделенный узким участком конденсированного гетерохроматина. В других районах С- и D-хромосом и на А-, В- и Е-хромосомах CSR-сегментов не выявлено.

У растения Dh751 CSR-сегменты выявляются у обоих С-гомологов, однако у одного из них CSR-сегмент на коротком плече занимает дистальное положение и выглядит как более узкий участок хромосомы. У другого С-гомолога соответствующий сегмент расположен интеркалярно и окрашивается несколько светлее. Расположение остальных CSR-сегментов такое же, как и у растения Dh823. На Ъ-хромосоме CSR-сегментов не выявлено (рис. 106).

Окрашивание препаратов АТ-специфичными флуорохромами H33258(DAPI) показало, что на хромосомах обоих растений все районы, соответствующие выявленным CSR-сегментам, флуоресцируют ярко, т. е. обогащены АТ-парами оснований. Кроме того, было обнаружено несколько мелких дополнительных гетерохроматиновых сегментов. При окрашивании хромосом GC-специфичным СМА у обоих растений наблюдалось почти полное затухание флуоресценции в районах, соответствующих CSR-блокам (рис. 10а, б). Исключение составил блок на коротком плече С1-хромосомы растения Dh751, которыйфлуоресцировал как при окрашивании СМА, так DAPI (рис. 106). Предполагается, что в составе этого блока присутствуют как относительно протяженные деконденсируемые холодом АТ-обогащенные последовательности, так и недеконденсируемые GC-богатые последовательности. После контрастирования окрашенных Н33258/СМА препаратов хромосом растения Dh823 нефлуоресцирующим GC-специфичным агентом AMD затухания каких-либо ранее выявленных блоков не наблюдалось, а выявлялись дополнительные мелкие Н33258-блоки на длинном плече у обоих С-гомологов, а также спутники у Е-хромосом и прилегающие к ним теломерные районы. У растения Dh751 после контрастирования препаратов AMD рисунок дифференциальной исчерченности не изменялся.

Мелкие блоки гетерохроматина, флуоресцирующие как при СМА, так и при H33258(DAPI)-окрашивании, не выявлялись после холодового воздействия (Лунина и др., 2000). В нашей работе мы делаем вывод, что регулярность и контрастность выявления гетерохроматиновых CSR-сегментов зависит от двух условий: во-первых, от их размеров, и, во-вторых, от соотношения в их составе AT- и GC-nap нуклеотидов.

4.12. Результаты молекулярно-филогенетических исследований представителей Триллиевых и их сравнение с кариосистематическими данными.

I Исследованные нами представители Триллиевых обладают весьма характерными

видо- и родоспецифичными рисунками дифференциальной исчерченности хромосом. Для того, чтобы исследовать, как формировались видоспецифичные рисунки дифференциальной исчерченности хромосом Триллиевых, мы сопоставили данные кариологического и молекулярно-филогенетического анализа. Для этого были проанализированы последовательности ДНК внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) и гена 5.8S рРНК ряда представителей Триллиевых. Выбор участка для секвенирования определялся тем, что ITS-последовательности

эволюционно изменчивы и потому информативны в геносистематических исследованиях, в то время как центральный участок последовательности - ген 5.8S рРНК - напротив, достаточно консервативен, что значительно облегчает предшествующее построению деревьев выравнивание анализируемых последовательностей (White et al., 1990; Wang et al., 2000; Родионов и др., 2005).

На основании анализа последовательностей ITS и генов рРНК были построены наиболее вероятные филогенетические деревья, отражающие эволюцию Триллиевых (рис. 11). К сожалению, мы не располагали данными об ITS1-5.8S-ITS2 последовательности T. rhombifolium, поэтому этот вид не был в данном случае включен в анализ.

KtMCMaJapeidca rflHnm_t*ch(mo«ldi Dal) walhrge ttf

i nolvuhvDa T>aism_TiolBcea Parlsincompleta *

I-Trffltamcamfchatcenjie

100 Trffltam_canuchatceiue *

Tiflllnm_prn ctmn

"Peeudotrflliijm_rtvalii Ml

Рис.11. Филогенетическое дерево представителей сем Trilliaceae по данным молекулярно —генетического анализа нуклеотидных последовательостей ITS1, ITS2 и генов 5,8S рРНК, построенное по методу Фитча-Марголиаша. Знаком (*) обозначены виды, ITS которых секвенированы в вашей лаборатории.

Результаты, полученные в нашей лаборатории, хорошо согласуются с данными других исследователей, показавших, что ITS-последовательности и даже консервативный ген 5.8S рРНК Триллиевых обладают яркими родоспецифичными чертами (Kazempour Ozaloo, Kawano; 1999).

По результатам наших исследований видно противоречивое положение на филогенетическом дереве Т. tschonoskii. Последовательности ITS1 и ITS2 этого вида, секвенированные в нашей лаборатории, по многим позициям отличались от консенсусной последовательности, характерной для рода Trillium, но при этом имели все родоспецифические инсерции и делеции (индели) и однонуклеотидные замены, характерные для представителей рода Paris sensu stricto. На филогенетических деревьях, построенных по разным критериям, вид Т. tschonoskii с высокой

¡

í

21

достоверностью образует единые клады с представителями рода Paris (рис. 11). Между тем, если судить по морфологии (Saroejima, Samejima, 1987, Farmer, Schilling, 2002) и последовательностям хлоропластного гена matK (Kazcmpour Osaloo et al., 1999), T tschonoskii - типичный представитель подрода Trillium, близкий к Т. camschatcense.

На этом рисунке показан еще один вид Г. tschonoskii, который образует единую кладу с представителями рода Daiswa. Этот зид был определен группой китайских исследователей из Сычуаньского университета (Tang X., Yao L. and Tang R., - локус AY192541; - см.: www.ncbi.nlm.nih.gov) и отличался по последовательностям ITS1 и ITS2 от рода Trillium, образуя единую кладу с Daiswa fargesii. Обращает на себя внимание факт, что китайский Т tschonoskii - диплоид (Wang, 1989), в то время, как сахалинские и японские популяции Т tschonoskii - тетраплоиды (2п=20). Мы полагаем, что континентальные популяции этого вида могут иметь иное происхождение и поэтому требуют специального исследования.

Сопоставление данных секвенироваяия ДНК и анализа хромосомных карт изученных нами видов позволяет выявить основные закономерности в эволюции дифференциальной исчерченности хромосом Триллиевых. Для филогенетической ветви представителей рода Paris sensu strick) по-видимому, характерен «точечный бэндинг» - многочисленные очень маленькие АТ-обогащенные гетерохроматиновые блоки. Представители рода Paris на молекулярно-филогенетических деревьях формируют высокодостоверную кладу (bootstrap index - 98-100), отличную от Daiswa (рис. 11).

Среди представителей рода Daiswa исследована дифференциальная исчерченность пока только одного вида - Daiswa hainanensis (Лунина и др., 2001). др.). Если рисунок Q- и СМА-исчерченности D hajnanensis типичен для хромосом этой ветви Триллиевых, то для рода Daiswa характерны крупные как AT-, так и GC-богатые блоки гетерохроматина, т. е. паттерн исчерченности хромосом отличается от паттерна, характерного для Paris sensu stricto. Совокупный анализ молекулярно-филогенетических исследований и карт дифференциальной исчерченности хромосом позволяет сделать вывод в поддержку классификации AJI. Тахтаджяна и М.Н. Тамуры, выделявших в сем Trilliaceae самостоятельные роды Paris s. s.h Daiswa (Takhtajan, 1983,1987; Tamura, 1998).

Для ветви Триллиумов характерны крупные блоки только АТ-богатого J гетерохроматина, выявляемые при флуорохромировании хромосом. Здесь следует

отметить отличие Т. tschonoskii-. для этого в-ида характерны мелкие точечные АТ-богатые блоки. В целом, юс рисунок гораздо более сходен с рисунком гетерохроматиновых сегментов представителей рода Peáis, чем Trillium.

Как уже было отмечено выше, по данным морфологии и секвенироваяия последовательностей гена matK хлоропластного генома Т tschonoskii близок к диплоидному Т. camschatcense. Такой парадокс мы попытались объяснить тем, что дальневосточный тетраплоидный вид Т. Tschonoskii может являться древним межродовым гибридом, в формировании которого участвовали ныне не

существующие виды Paris и Trillium. В пользу этого предположения говорит способность представителей этих родов скрещиваться (Felsenstein, 1985). Наряду с этим нельзя не отметить такой противоречивый факт, как сходство двух субгеномов (Т| и Т2) T. tschonoskii по паттерну дифференциальной исчерченности хромосом. Можно предположить, что геномы предковых видов, когда-то участвовавших в гибридизации, претерпели весьма существенные изменения в ходе дальнейшей эволюции гибрида, что в результате привело к унификации их паттернов хромосомной исчерченности. Очевидно, что для окончательного выяснения этого вопроса требуются дальнейшие исследования.

5. Выводы.

1. Для кариосистемэтических исследований представителей сем. Trilliaceae наиболее информативным методом дифференциального окрашивания хромосом является Q-метод (окрашивание АТ-нуклеотидспецифичными флуорохромами). В некоторых случаях дополнительно требуется применение контрастирующего агента актиномицииа D и GC-специфичного флуорохромиого красителя хромомицияа А3. Этот метод позволяет выявлять как крупные, так и мелкие (точечные) блоки гетерохроматина, а также делать вывод об их молекулярной композиции.

2. При помощи метода окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами впервые изучены кариотипы и построены цитологические карты хромосом Trillium tschonoskii Maxim., межвидового гибрида Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki {Trillium camschatcense x Trillium tschonoskii), Trillium rhombifolium Kom., Trillium erectum L., Trillium grandiflorum (Michx.) Salisb, Trillium recurvatum Beck, Paris incompleta Bieb., Paris quadrifolia L, Daiswa hainanensis (Merrill) Takht

3. На основе цитологических карт хромосом исследованы геномные составы гексаплоидного Т. rhombifolium, тетраплоидного Т. tschonoskii и триплоидного гибрида T. x hagae. Показано, что геном T. x hagae состоит из одного субгенома Т. camschatcense и обоих субгеномов T. tschonoskii. В то же время в геноме гексаплоидного российского вида Т. rhombifolium не вполне однозначно прослеживаются субгеномы Т. camschatcense и Т tschonoskii, которых мы также считаем родительскими видами этого гексаплоида, что может свидетельствовать о межгеномных перестройках, сопутствовавших формированию этого вида.

4. Показано, что Т. rhombifolium, несмотря на морфологическое сходство, неидентичен гексаплоидному японскому виду Т hagae, возникшему на базе тех же геномов, что может свидетельствовать о неоднократном временном и пространственном возникновении таких гексаплоидов.

5. Предложена измененная номенклатура геномов исследованных нами азиатских полиплоидных Триллиумов: геном Trillium tschonoskii предлагается обозначить как TiTiT2T2, T.xhagae - KiTiT2, T. rhombifolium - K1rKirTirTirT2rT2r.

6. Представители родов Paris, Daiswa и Trillium демонстрируют различные и, предположительно, родоспецифичные типы дифференциальной исчерченности хромосом. Это свидетельствует в пользу самостоятельности родов Paris и Daiswa.

7. На примере Daiswa hainanensis исследован нуклеотидный состав гетерохроматина, способного переходить в деконденсированное состояние после продолжительного прижизненного воздействия низкой температурой. Показано, что CSR-блоки гетерохроматина всегда обогащены АТ-парами нуклеотидов, что, по-видимому, является общей закономерностью для этого феномена у цветковых растений.

8. Показано, что количество и локализация кластеров генов ядрышкового организатора (NOR) у исследованных представителей Триллиевых по-видимому, также является родоспецифичным признаком.

9. У T. tschonoskii тип дифференциальной исчерченности хромосом наиболее приближен к типу, характерному для рода Paris. На молекулярно-филогенетическом древе этот вид занимает парадоксальное положение, образуя единую кладу с представителями p. Paris.

10. Результаты исследования дифференциальной исчерченности хромосом и результаты молекулярно-филогенетического анализа последовательностей ITS1 и ITS2 и генов 5,8S рРНК у Триллиевых хорошо соответствуют друг другу, что свидетельствует о возможно наиболее адекватной картине эволюционных преобразований внутри семейства Trilliaceae, предложенной в нашей работе.

По материалам диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Лунина Е.О., Мякошина Ю.А., Ефимов A.M., Родионов A.B. Карты хромосом

Paris quadrifolia L.: QFH/AMD- и СМА-исчерченность и картирование 18S + 28S-рРНК-генов. Цитология. 1999. Т. 39. №12. С. 1078. Тез IV совещания по кариологии и кариосистематике растений (С.-Петербург, 1999).

2. Коцеруба В.В., Мякошина Ю.А. Кариологическое исследование Daiswa hainanensis (Мегг.) Takht. при помощи нуклеотид-специфичных флуорохромов // Цитология, 1999. Т. 41. № 12. С. 1066-1067. Тез IV совещания по кариологии и кариосистематике растений (С.-Петербург, 1999).

3. МякотинаЮ.А., Дегтярев В.В. Выявление гетерохроматиновых сегментов хромосом при помощи нуклеотидспецифичных флуорохромов на примере сем. Trilliaceae. Тез. VII молодежной конференция ботаников (С.-Петербург, 15-19 мая, 2000).

4. Пунина Е.О., Мякошина Ю.А., Ефимов A.M., Родионов A.B. Карты хромосом

растений семейства Trilliaceae: Нуклеотидный состав гетерохроматина и локализация 18S-26S рРНК-генов париса четырехлистного (Paris quadrifolia L.) II Генетика. 2000. T. 36. № 5. С. 673-677.

5. Пунина Е.О., Родионов A.B., Мякошина Ю.А., Гриф В.Г. Нуклеотидный состав

чувствительных к холодовому воздействию гетерохроматиновых районов хромосом у Paris hainanensis Meirill. II Генетика, 2001. T. 37. № 7. С. 939-946.

6. Punina E.O., Rodionov A.V„ Myakoshina Yu.A., Grif V.G. Nucleotide base composition of the cold-sensitive heterochromatic chromosome regions of Paris

hainanensis. Ann. de Genetíque. 2001. V. 44. Suppl. 1. P. 93. (Third European Cytogenetics Conference, jule, 7-10,2001. Paris, France).

7. Мякошина Ю.А., Лунина E.O, Родионов A.B. Выявление транскрипционио-активных ядрышковых организаторов в кариотнпах растений сем. Trilliaceae с помощью Ag-NOR окрашивания // Цитология, 2002. Т. 44. №9. С. 894-895. Тез XIV Всероссийского симпозиума «Структура и функция клеточного ядра» (С.Петербург, 2002).

8. Мякошина Ю.А., Пунина Е.О., Гриф В.Г., Родионов A.B. Изучение геномного состава полиплоидных видов рода Ttrillium (Trilliaceae) при помощи флуоресцентного нуклеотид-специфичного окрашивания гетерохроматиновых районов хромосом. Актуальные проблемы генетики. Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. Москва, 2021 февраля 2003 г. Т. 2. М.. 2003. С. 315-316.

9. Мякошина ЮЛ, Пунина Е.О., Гриф В.Г., Родионов A.B. Кариосистематическое

изучение некоторых представителей сем. Trilliaceae. Ботанические исследования в Азиатской России. Т. 1. Барнаул, 2003. С. 308-309.

10. Мякошина Ю.А., Пуннва Е. О., Гриф В.Г., Родионов А. В. Карты хромосом растений семейства Trilliaceae (П):изучение геномного состава полиплоидных видов рода Trillium при помощи флуоресцентного нуклеотидспецифичного окрашивания гетерохроматиновых районов хромосом. // Генетика, 2004. Т. 40. №8. С.1081-1092.

11.Пунина Е.О., Мяче Э.М., Ким Е.С., Мякошина Ю.А, Родионов A.B.

Кариосистематика и молекулярная филогения представителей семейства Trilliaceae // Биологические мембраны, 2005. Т.22. №3, с. 249-257. 12. Ponina Е.О., Machs ЕЖ, Kim E.S., Myakoshina Y.A., Chupov V.S., Rodionov A.V. Karyosystematics and molecular phytogeny of Trilliaceae. XVII International Botanical Congress. Vienna, Austria, Europe. Austria Center, Vienna 17-23 July 2005. P. 344.

13. Пунина E.O., Мяче Э.Мм Ким Е.С., Мякошина ЮЛ., Родионов A.B.

Кариология и молекулярная филогения некоторых видов сем. Trilliaceae Кариология, кариосистематика и молкулярная филогения растений: Тезисы докладов и стендовых сообщений V Международного совещания и Школы молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений. Санкт-Петербург, 12-15 октября 2005 г. С. 90-91.

2Ш>А

5 &84562Г

Подписано в печать 02.03.06. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 15.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мякошина, Юлия Анатольевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Сематикам. Trilliaceae Cheval

2.2. Семево Trilliaceae на территории Рии

2.3. Морфологичие характерики преавителейм. Trilliaceae

2.3.1. Морфологичие характерики Trillium camschatcense Ker.-Gawl

2.3.2. Морфологичие характерики Trillium tschonoskii Maxim

2.3.3. Морфологические характеристики природного гибрида

Trillium х hagae Miyabe et Tatewaki

2.3.4. Морфологичие характерики Trillium rhombifolium Кош

2.3.5. Морфологичие характерики Trillium erectum L

2.3.6. Морфологичие характерики Trillium recurvatum Beck

2.3.7. Морфологичие характерики Trillium grandiflorum Michaux

2.3.8. Морфологичие характерики Paris quadrifolia L

2.3.9. Морфологичие характерики Paris incompleta Bieb

2.3.10. Морфологические характеристики Daiswa hainanensis (Merrill)

Takht

2.4. Начальные этапы кариосистематического и цитогенетического изучениямева Trilliaceae. Cheval

2.5. Методы дифференциального окрашивания хромм рений

2.5.1. Метод холодового окрашивания хромм - CSR-метод

2.5.2. Дифференциальное окрашивание хроммпомощью С-метода

2.5.3. Дифференциальное окрашивание хромосом с помощью флуорентных нуклеотиецифичных кртелей (Q-окрашивание)

2.5.4. Выявление ядрышковых организаторов (NOR) при помощи окрашивания хромм азотнокымребром

2.6. Роль CSR-метода в каристематикем. Trilliaceae

2.6.1. Полиморфизм CSRгментов Т. camschatcense Ker.-Gawl. (KiKi)

2.6.2. Полиморфизм CSR-гментов у Т. rhombifolium Кот

2.6.3. Полиморфизм CSRгментов Т. tschonoskii Maxim. (К2К2ТТ)

2.6.4. Полиморфизм CSR-сегментов Т. х hagae (Зх) Miyabe et Tatewaki (К1К2Т) и Т. hagae (6х) Miyabe et Tatewaki (KiKiK2K2TT)

2.6.5. Полиморфизм CSR-сегментов Т. apetalon Makino (SSUU), Т. smallii Maximowicz (K1K1SSUU или K2K2SSUU),

T. xyezoense Tatewaki (KjSU),

T. x miyabeanum Tatewaki (K2TSU).c.

2.6.6. Полиморфизм CSRгментоввероамерикаих видов Trillium

2.7. Использование С- и Q- методов дифференциального окрашивания в кариосистематикем. Trilliaceae.

2.7.1. Полиморфизм С- и Q-гментов у видов рода Trillium

2.7.2. Полиморфизм Сгментов у видов рода Paris

2.7.3. Полиморфизм гетерохроматиновых сегментов, выявляемых различными методами дифференциального окрашивания, у видов Daiswa Raf

2.8. Молекулярнаястематикам. Trilliaceae Cheval

3. Методы и материалы

3.1. Проождение материала

3.2. Приготовление препаратов

3.3. Окрашивание препаратов

3.4. FISH-гибридизация

3.5. Проение филогенетичих деревьев

4. Результаты и ождение

4.1. Анализ кариотипа Т. camschatcense

4.2. Анализ кариотипа Т. tschonoskii

4.3. Анализ кариотипа природного гибрида

Т. tschonoskii х camschatcense (=Т. х hagae)

4.4. Анализ кариотипа Т. rhombifolium

4.5. Анализ кариотипа Trillium erectum

4.6 Анализ кариотипа Т. grandijlorum

4.7. Анализ кариотипа Т. recurvatum

4.8. Сравнительный анализ рисунков дифференциальной исчерченности хромм у преавителей рода Trillium

4.9. Анализ кариотипа Paris quadrifolia

4.10. Анализ кариотипа Paris incompleta

4.11. Анализ кариотипа Daiswa hainanensis.

4.12. Сопоставление паттернов Q- и CSR-дифференциальной ерченни хромм у D. hainanensis

4.13. Результаты молекулярно-филогенетических исследований представителей сем. Trilliaceae и их сравнение с каристематичими данными

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кариосистематическое изучение представителей семейства Trilliaceae Cheval"

Актуальность темы. Исследование проблемы организации и эволюции геномов и хромосом цветковых растений в настоящее время является одним из магистральных направлений исследований в ботанике, генетике, а также новой дисциплине, сложившейся на рубеже XX-XXI веков - сравнительной геномике. Результаты подобных исследований, в частности, имеют важное значение для понимания закономерностей эволюции, решения задач систематики и филогении. Сравнительно-кариологические исследования отдельных таксонов являются лишь начальной, но абсолютно необходимой базой для решения этого круга проблем.

Сем. Trilliaceae, включающее в себя как диплоидные, так и полиплоидные виды с самыми крупными среди эукариот хромосомами, до сих пор недостаточно полно исследовано с точки зрения кариологии. Между тем, сравнительно-кариологические данные зачастую имеют большое значение для систематики и филогении растений. Изучение кариотипов включает в себя исследования числа, размеров, морфологии и центромерного индекса хромосом, а также рисунка дифференциальной исчерченности (паттерна), получаемого при помощи различных методов дифференциального окрашивания хромосом.

Данная работа посвящена кариосистематическому исследованию представителей семейства Trilliaceae (Trilliaceae Cheval.).

Триллиевые - это хорошо обособленное олиготипное семейство однодольных, систематическое положение которого до сих пор неясно. Наиболее яркой чертой всех представителей этого таксона являются рекордные не только для цветковых растений, но и для всех эукариот размеры геномов, что делает это семейство в данном смысле уникальным. Так, средняя длина хромосом T. camschatcense в метафазе превышает 50 мкм, а содержание ДНК на гаплоидный геном - 45 пг. Расчеты показывают, что содержание ДНК на одну хромосому у этого вида составляет около 9 ООО ООО ООО пар нуклеотидов, что в 3 раза превышает содержание ДНК всего гаплоидного генома человека (Ingle et al., 1975; Гриф и др., 1980). Организация таких мегагеномов пока неизвестна, можно предполагать, что они насыщены разнообразными повторяющимися последовательностями ДНК.

Уникальные размеры хромосом Триллиевых давно сделали представителей этого семейства привлекательными модельными объектами для исследования структурно-функциональной организации хромосом эукариот (Matsuura, 1934, 1937а, б, в, 1938а,б,в,

1941а, б; Darlington, La Cour,. 1938; Shaw, 1959; Dyer, 1964; Gri£ 2000; Пунина E.O. и др., 2001). Закономерно, что один из видов Триллиевых - Trillium erectum L. - был одним из первых объектов, на которых Т. Касперсоном был открыт феномен линейной неоднородности хромосом высших эукариот, выявляемой при окрашивании хромосом акрихин-ипритом, так называемая Q-исчерченность (Casperson et al., 1968).

Кариотипы всех Триллиевых, с одной стороны, удивительно консервативны по морфологическим параметрам хромосом (длина, центромерный индекс), а, с другой стороны, крайне разнообразны и полиморфны по рисунку распределения гетерохроматиновых сегментов, выявляемых при помощи различных методов дифференциального окрашивания хромосом.

ДНК гетерохроматина является одной из фракций ДНК генома и в самом общем случае она представляет собой многократно повторенные, генетически инертные последовательности ДНК, которые большую часть митотического цикла находятся в конденсированном состоянии (см. напр., Прокофьева-Бельговская, 1986). Одной из особенностей гетерохроматина является его способность окрашиваться на цитологических препаратах иначе, чем прилегающие участки эухроматина, т.е. дифференциально. Рисунок (паттерн) распределения получаемых при этом полос (бэндов, сегментов, блоков) очень часто хромосомо- и видоспецифичен, поэтому различные методы дифференциальной окраски хромосом уже давно являются надежным инструментом в сравнительно-кариологических исследованиях.

Одним из таких методов является окрашивание хромосом нуклеотидспецифичными флуорохромными агентами, что позволяет не только выявить гетерохроматиновый участок хромосомы, но и сделать заключение о его нуклеотидном составе.

Дополнительным признаком при сравнительном изучении кариотипов является расположение ядрышковых организаторов (NOR) на хромосомах изучаемых растений. Традиционно методом выявления транскрипционно активных в интерфазе ядрышковых организаторов является окрашивание метафазных хромосом нитратом серебра AgNÛ3, который связывается с аргентофильными белками, расположенными преимущественно в этих районах хромосом. Выявить все ядрышковые организаторы помогает метод FISH-гибридизации хромосом с кластерами рибосомных генов (5,8S -18S -28SpPHK). Картина расположения ядрышковых организаторов может быть разная у разных видов или групп видов, поэтому этот признак заслуживает пристального внимания.

Несмотря на информативность вышеуказанных методов, кариотипы представителей Trilliaceae таким способом ранее практически не изучались.

Цель и задачи работы. Целью нашей работы было сравнительное кариологическое исследование представителей сем. Trilliaceae, установление систематических связей между ними. Для этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Выявление гетерохроматиновых сегментов хромосом с разным нуклеотидным составом при помощи метода дифференциального окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами. Построение цитологических карт хромосом.

2) Сравнительный анализ расположения ядрышковых организаторов, выявляемых методом окрашивания нитратом серебра и в некоторых случаях при помощи FISH-гибридизации, у разных видов.

3) Анализ геномного состава полиплоидных видов на основании цитологических карт хромосом.

4) Исследование нуклеотидного состава гетерохроматиновых районов хромосом, выявляющихся после прижизненного воздействия холодом (CSR-сегментов).

5) Анализ эволюционно. изменчивых последовательностей ITS кластеров генов рРНК у разных представителей сем Trilliaceae.

6) Совокупный анализ кариологических данных и данных молекулярной систематики.

Научная новизна работы. При помощи метода окрашивания нуклеотидспецифичными флуорохромами впервые изучены кариотипы и построены цитологические карты хромосом Trillium tschonoskii Maxim., межвидового гибрида Trillium X hagae Miyabe et Tatewaki (Trillium camschatcense x Trillium tschonoskii), Trillium rhombifolium Kom., Trillium erectum L., Trillium grandiflorum (Michx.) Salisb., Trillium recurvatum Beck, Paris incompleta Bieb., Paris quadrifolia L., Daiswa hainanensis (Merrill) Takht.

Впервые исследован геномный состав гексаплоидного вида Trillium rhombifolium, введена номенклатура его генома. Впервые на основании кариологического анализа показано, что гексаплоидный российский вид Trillium rhombifolium неидентичен гексаплоидному японскому виду Trillium hagae. Внесено предложение об изменении номенклатуры геномов Trillium tschonoskii и Trillium x hagae. Впервые показано, что роды Paris, Daiswa, Trillium демонстрируют различные и, предположительно, родоспецифичные типы дифференциальной исчерченности хромосом. Впервые показано, что у вида Trillium tschonoskii тип дифференциальной исчерченности хромосом наиболее приближен к типу исчерченности, характерному для рода Paris, что является дополнительным аргументом в пользу вывода молекулярио-филогенетических исследований о межродовом гибридном происхождении этого вида.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены в виде устных и стендовых сообщений на IV Всероссийском совещании по кариологии и кариосистематике растений (С.-Петербург, 1999), VII Молодежной конференции ботаников (С.-Петербург, 2000); III Европейской цитогенетической конференции (Париж, 2001), XIV Всероссийиском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (С.-Петербург, 2002), научной конференции БИН РАН "Молодые ученые -победители конкурса научных работ 2002 г." (17 февраля 2003 г.), XVII Ботаническом конгрессе (Вена, 2005), V международном совещании по кариологии, кариосистематике, молекулярной систематике растений (С. Петербург, 2005).

Прикладное значение. Материалы диссертации являются вкладом в изучение вопроса о строении и эволюции полиплоидных геномов цветковых растений, о локализации кластера рибосомных генов в ходе эволюции растительных видов, а также имеют значение для систематики растений.

Полученные сведения могут быть использованы при чтении курсов лекций по кариосистематике цветковых растений, цитологические карты хромосом могут быть учтены при систематических исследованиях как внутри семейства Trilliaceae, так и о местоположении этого семейства среди других семейств и таксонов. Полученные результаты также могут представлять интерес для садоводов, поскольку отдельные виды Trilliaceae являются декоративными растениями.

Объем работы. Диссертация представлена на 130 страницах, содержит 35 рисунков, 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, полученным результатам и обсуждению, выводов. Прилагаемый список литературы включает 225 наименований, из которых 175 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Мякошина, Юлия Анатольевна

10. Результаты исследования дифференциальной исчерченности хромосом и результаты молекулярно-филогепетического анализа последовательностей ITS1 и ITS2 и генов 5,8S рРНК у Триллиевых хорошо соответствуют друг другу, что свидетельствует о возможно наиболее адекватной картине эволюционных преобразований внутри семейства Trilliaceae, предложенной в нашей работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мякошина, Юлия Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Бадаева Е.Д. Эволюция геномов пшениц и их дикорастущих сородичей: молекулярно-цитогенетическое исследование. Автореферат дисс... докт. биол. наук. М., 2000.48с. Байков К.С. Конспект Флоры Сибири. Сосудистые растения. Новосибирск, 2

2. Беляев А.А., Беляева Н.Н. Цитогенетический анализ хромосом Trillium camschatcense (Trilliaceae; //Ботан. жури., 1991. Т. 76. 6. 900-

3. Беляев А.А., Беляева Н.Н. К вопросу о нуклеотидном составе гетерохроматина у Trillium camschatcense (Trilliaceae; //Ботан. журн., 1991а. Т. 76. 12. 17331

4. Быстрова В.И. Некоторые данные о кариотипе Paris incompleta Bieb. Ботан. журн., 1968. Т.53. 369-

5. Ворошилов В.Н. Флора советского Далыгего Востока. 1966а. 126-

6. Ворошилов В.Н. В кн.: Д.П. Воробьев, В.Н. Ворошилов, П.Г. Горовой, А.И. Шретер. Определитель растений Нриморья и Приамурья. 19666. 124 с. Грант В. Видообразование у растений. М., Мир, 1984. 528 с. Гриф В.Г. О гетерохроматине у растений Цитология, 1963. Т. 5. Ш 6. 615-

7. Гриф В.Г. О возможности синтеза нуклеиновых кислот и белка при низких температурах Цитология, 1966. Т.8. №5. 659-

8. Гриф В.Г. Цитофотометрическое изучение изменения количества ДНК у растений при низкой температуре Цитология, 1980. Т. 22. №.10. С 1185-1

9. Гриф В.Г., Валович Е.М. К вопросу о механизме выявления гетерохроматиновых сегментов холодом //Цитология, 1977. Т. 19. №2. 141-

10. Гриф В.Г., Валович Е.М. Механизм выявления гетерохроматиновых сегментов при низких температурах. Докл. АН СССР Цитология, 1978. Т. 243. №2. 493

11. Гриф В.Г., Валович Е.М., Лебедева Н.В. Параметры митотического цикла у двух видов рода Trillium L. Цитология, 1980. Т. 22. №11. 1331-1338. 112

12. Гриф В.Г., хромосом Свешникова Л.И. Закономерности изменения линейных растений при различной степени спирализации (на размеров примере Т. camschatcense Ker-Gawl.) Ботан.. журн., 1975. Т.60. М 5. 636-

13. Гриф В.Г., Черепанов К., Валович Е.М., Беляева Н.Н. Биосистематика некоторых видов рода Trillium (Trilliaceae), произрастающих в СССР Ботан. журп., 1985. Т. 70. 9 1177-1

14. Гриф В.Г., Александрова Т.В., Валович Е.М. Действие низких температур на хроматин интерфазного ядра клеток корневой меристемы у Trillium Цитология, 1987. Т.29.№3. 295-

15. Кахидзе Н.Г. Строение хромосом Crepis capillaris//Докл. АН СССР. 1939. Т. 22. №7. 451-

16. Комаров В. Л. Флора СССР. 1935. Т. 4. 748-

17. Козлова А.А. Кариологическое исследование Paris quadrifolia var. genuina из нескольких природных популяций Приобья. В кн.: Материалы I конференции молодых ученых ТГУ. Томск, 1974. Вып. 2. 24-

18. Козлова А.А. Кариотипическая структура полиплоидного комплекса Paris quadrifolia L. (сем. Liliaceae) Автореф. дисс. канд.биол. наук. Новосибирск, 1

19. Козлова А. А., Малахова Л.А., Карташова Н. Н. Полиморфизм по числу хромосом Paris quadrifolia в Приобье Ботан. журн., 1976а. Т.61. JNro2. 249-

20. Козлова А. А., Малахова Л.А., Картащова Н. Н. Полиплоидия и структурные перестройки хромосом у растений Paris quadrifolia L. из нескольких естественных популяций Среднего Приобья Генетика, 19766. Т. 12. №9. 22-

21. Коцеруба В.В., Мякошина Ю.А. Кариологическое исследование Daiswa hainanensis (Merr.) Takht. при помощи нуклеотид-специфичных флуорохромов Цитология, 1999. Т. 41. 12. 1066-1

22. Малахова Л.А., Воронова О.А., Козлова А.А. Числа хромосом некоторых представителей флоры сибирских липняков (Кузнецкий Алатау). В кн.: Черневая тайга и проблема реликтов. Томск. 1979. 47-51. 113

23. Мякошина Ю.А., Пунина Е. О., Гриф В.Г., Родионов А. В. Карты хромосом растений семейства Trilliaceae (11):изучение геномного состава полинлоидных видов рода Trillium нри помощи флуоресцентного пуклеотидспецифичного окрашивания гетерохроматпновых районов хромосом Генетика, 2004. Т.40. №8. 1081-1092. Ней М., Кумар Молекулярная эволюция и филогения. Под ред. проф. В. И. Глазко. Киев, 2

24. Оганезова Г. Г. Систематическое положение семейств Trilliaceae, Smilacaceae, Herreriaceae, Tecophilaeaceae, Dioscoreaceae и объем и филогения порядка Asparagales (по данным структуры семян) Ботан. журн., 2000. Т. 85. №

25. Прокофьева-Бсльговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М. 1986. 432 с. Пунипа Е.О., Муравенко О.В., Беляев А.А. Разработка и применение компьютерных программ хромосомного анализа Цитология, 1999. Т. 41. №12. СЛ 077-1

26. Пунина Е.О., Мякошина Ю.А., Ефимов A.M., Родионов А.В. Карты хромосом растений семейства Trilliaceae: Нуклеотидный состав гетерохроматина и локализация 18S-26S рРНК-гепов париса четырехлистного {Paris quadrifolia L.) Генетика, 2000. Т. 36. 5. 673-

27. Пунина Е.О., Родионов А.В., Мякошипа Ю.А., Гриф В,Г. Нуклеотидный состав чувствительных к холодовому воздействию гетерохроматиновых районов хромосом у Paris hainanensis Merrill. Генетика, 2001. Т. 37. 7. 939-

28. Пунина Е.О., Мачс и Э.М., Ким Е.С., Мякошина Ю.А, Родионов А.В. Кариосистематика молекулярная филогения представителей семейства Trilliaceae Биологические мембраны, 2005. Т.22. №3. 249-

29. Раскина О.М., Родионов А.В. G/R-подобная исчерченность митотических хромосом овсяницы луговой Festuca pratensis и райграса пастбищного Lolium регеппе, индуцированная низкой температурой Цитология, 1992. Т. 34. J b 10. 59-64. V Родионов А.В., Пунина Е.О, Ефимов A.M. Картирование 18S, 5.8S и 26S рРНК генов растений методом FISH-гибридизации Цитология, 1999. Т. 41. Х212. 10791080. 114

30. Свешникова Л.И., Гриф В.Г. Использование методов выявления гетерохроматиновых сегментов хромосом в сравнительной кариологии растений Ботан. журн., 1981. Т.66.№4. 494-

31. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Под ред. Н.К. Янковского. Москва, 1998. Т.

32. Соколовская А.П. Географическое распространение полиплоидных видов растений. Исследование флоры Приморского края. В кн.: Вестн. ЛГУ, 1966. Сер.Биол. Т.1. }оЗ. 92-

33. Тахтаджян А. Л. Жизнь растений. М., 1982. Т.6. 50-

34. Тахтаджян А. Л. Система магнолиофитов. Л., «Наука», 1987. 438 с. Харкевич С. (глав. ред.). Сосудистые растения Советского Дальнего Востока. Л., 1988. Т.

35. Шкутипа Ф. М. Мейоз у отдаленных гибридов и амфидиплоидов Цитология и генетика мейоза, М., «Наука», 1975. 292-

36. Шмаргонь Е.Н. Анализ хромомерных структур митотических хромосом ржи Докл. АН СССР, 1938. Т. 21. Хо5. 259-

37. Цвелев Н. Н. Вороний глаз Paris L. В кн.: Флора Европейской части СССР. Под ред. А. А. Федорова. 1979. 355 с. Черепанов К. Сосудистые растения России и сопредельпых государств. Петербург, 1995.989 с. Bailey Р. А further study of the chroniosome morphology of some species of Trillium И Bui. Torrey Hot. Club., 1954. V. 81. P. 68-

38. Baumann T.W. Heterochromatin und DNS- Replikation bei Scilla sibirica II Exp. Cell Res., 1971. V.64. P.

39. Belyayev A.A. Banding of G- or R-type in profase/prometaphase in the M-chromosome of Viciafaba L. Caryologya, 1993. Vol. 46. 4. P. 301-

40. Belyayev A.A., Punina E.O., Grif V.G. Intrapopulation and individual polymoфhism of 115

41. Bentham G., Hooker J.D. Genera plantarum. London: Reeve Co. 1

42. Berg C Greilhuber J. Cold-sensitive chromosome region and their relation to constitutive heterochromatin in Cestrum parqui (Solanaceae) II Genome. 1992. Vol. 185. 3-4. P. 259

43. Berg C Greilhuber J. Cold-sensitive chromosome region and heterochromatin in Cestrum aurantiacum {Solanaceae) II PI. Syst. Evol., 1993a. Vol. 185. 3-4. P.259-

44. Berg C Greilhuber J. Cold-sensitive chromosome region and heterochromatin in Cestrum {Solanaceae): C. strigillatum, С fasciculatum and С Elegans //PI. Syst. Evol., 19936. Vol. 185.Xol-2. P.133-

45. Bootrhroyd E. R., Lima-de-Faria A. DNA synthesis and differential reactivity in the chromosomes of Trillium at low temperature Hereditas, 1964. Vol.52. Ш 1. P. 122-

46. Callan H.G. Chromosomes and nucleoli of the axo\ot\, Ambystoma mexicanum//J.CQW Sci.. 1966. Vol.1. P. 85-

47. Caspersson Т., Farber S., Foley G.E. Chemical differentiation along metaphase chromosomes //Exp.Cell. Res., 1968. Vol. 49. P.219-

48. Chase M.W., Duvall M.R., Hills H.G. Molecular phylogenetics of Lilianae. In: P.J.Rudall, P.J.Cribb, D.F.Cutler, C.J.Humphries. Monocotyledons: Systematics and Evolution, Royal Botanical Gardens, Kew, 1995. P. 109-

49. Chinnappa C.C.; Morton J.K. Heterochromatic banding patterns in two species of Trillium: Trillium grandijlorum, Trillium erectum Canadian J. Genetics Vol. 20.2 4. P. 475-

50. Dahlgren R.M.T. A system of classification to be used to demonstrate the distribution of characters Bot. Not., 1975. Vol. 128. P. 119-

51. Dahlgren R.M.T., Clifford H.T., Yeo P.F. The families of the monocotyledons: structure, evolution, and taxonomy. Springer-Verlag, Berlin. 1985. 520 p. Darlington C D Polyploidy, crossing-over, and heterochromatin in Paris /I Ann. Botany, 1941.Vol. 5. P. 203-

52. Darlington CD., La Cour L. Differential Reactivity of the Chromosomes Annals of Botany, 1938. Vol. 2. 7. P. 615-

54. Darlington CD., Shaw G.W. Parallel ро1утофЫ8т in the heterochromatin of Trillium species //Heredity, 1959. Vol.13. Ш 1. P. 89-121. De Jusseau A.L. Genera plantarum secundum ordines naturales disposita. Paris: Viduam Herissant. 1

55. Dumortier P. B.-C. Analyse des Families des Plantes avec lindicaton des principaus cenres que sy battachent. 1

56. Dyer A.F. Allocyclic segments of chromosomes and the structural heterozygosity that they reveal. Chromosoma (Berl.), 1963. Vol.13. P. 545-

57. Dyer A.F. Heterochromatin in American and Japanese species of Trillium. I, Fusion chromocentres and the distribution of H-segments Cytologia, 1964. Vol. 29. P. 155

58. Endlicher S. Genera Plantarum secundum Ordines Naturales diposita Vindobonae. Apud fr Beck Universitatis Bibliopolam. 1836-1

59. Engler A. Liliaceae. In: Nat. Pflanzenfam II. 1888. Vol.5. P. 10-

60. Fanner S. В., Schilling E. E. Phylogenetic Analyses of Trilliaceae based on Morfological and Molecular Data Systematic Botany, 2002. Vol. 27. 4. P. 674-

61. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap Evolution, 1985. Vol. 39. P. 783-

62. Filion G.W., Vosa G.C Quinacrine fluorescence studies in Paris poliphylla Can. J. Genet. Cytol., 1980. Vol. 22. P.417-

63. Frame D. Chromosome studies in Schoenocaulon (Liliaceace: Melanthieae) a relict genus Anales del Instituto de Biologia Univ. Nacional Autonoma de Mexico. Ser. Botanica, 2001. Vol. 72. P. 123-

64. Freeman J.D. A revisionary study of sessile-flowered Trillium L. (Liliaceae). Ph.D. Dissertation. Vanderbilt University, 1

65. Freeman J. D. Revision of Trillium subgenus phyllantherum (Liliaceae) Brittonia, 1975. Vol 27. 1 P. 1-

66. Fukuda I. Variation and evolution in natural populations of Trillium kamtschalicum Pall. Essays and studies Tokyo Womens college, 1962. Vol. 13. P. 91-108. 117

67. Fukuda I. Chromosome compositions of the southern population in Trillium kamtschaticum. Sci. Rep. Tokyo Womans Christ. Col. 1970. Vol. 12. 14. P. 159-

68. Fukuda I. Comparitive study of chromosome variation in the Japanese and American Trillium species Science Reports of Tokyo Womans Christian Univ., 1973. Vol. 29. 3 1 P. 361-

69. Fukuda I. Chromosome composition of natural population in Trillim erectum Science Rep. of Tokyo Womans Christ. Univ., 1988. Vol. 76. 79. P. 943-

70. Fukuda I. Evolutionary relationships between the asian and north american Trillium species Science reports of Tokyo Woman s Christian University, 1989. Vol. 87.

71. Fukuda I. The Origin and Evolution in Trillium.

72. Chromosome Variation of Trillium undulatum in North America Cytologia, 2001a. Vol. 66. 3. P.319-

73. Fukuda I. The Origin and Evolution in Trillium. 1. The Origin of the Himalayan Trillium govanianum//Cytologia, 20016. Vol. 66. P.105-

74. Fukuda I., Channell R B. Distribution and evolutionary significance of chromosome variation in Trillium ovatum//Evolution, 1975. Vol. 29. 2. P. 257-

75. Fukuda I., Freeman J.D., Itou M. Trillium channellii, sp.nov. (Trilliaceae), in Japan, and T. camschatcense Ker Gawler, correct name for the asiatic diploid Trillium Novon (J. Bot. Nomenclature), 1996. Vol. 6. 2. P. 164-

76. Fukuda I., Grant W.F. Chromosome variation and evolution i Trillium grandiflorum //Can. J. Genet. CytoL, 1980. Vol. 22. P. 81-

77. Fukuda I.; Kozuka Y. Evolution and variation in Trillium 5. A list of chromosome composition in natural poulations of Trillium kamtschaticum Hokkaido.University, 1958. Vol. 5. 6. P. 273-

78. Gerlach W.L., Bedbrook J.R. Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from wheat and barley //Nucl. Acids Res. 1979.Vol. 1. P. 1869-1

79. Chevalier F.F. Flore generate des environs de Paris. Paris, 1827. Vol. 2. 297 p. Pall. J. Fac. Sci., 118

80. Gotoh K. Karyologische Studien an Paris und Trillium II Jpn. J. Genet., 1933. Vol. 8. P. 197-

81. Geitler L. Temperaturbedingte ausbildung von spezialsegmenten von Chromosomenenden Chromosoma, 1940. Vol. 1. 5. P. 554-561. W Greilhuber J. C-band distribution, DNA content and base composition in Adoxa moschatellina (Adoxaceae), a plant with cold-sensitive chromosome segments Plant Syst. Evol., 1979. Vol. 131. P. 243-

82. Grif V.G. Some aspects of plant karyology and karyosystematics Int. Rev. Cyt., 2000. Vol. 196. P. 131-175. Gu Z., Li H. Cytotaxonomic study on the genus Paris Acta Bot. Yunnan., 1988. Vol. 10. P. 125-

83. Haga T. The comparative morphology of the chromosome complement in the Tribe Parideae //Jour. Fac. Sci. Hokkaido University Sen, 1934. Vol. 3. P.1-

84. Haga T. Genom and polyploidy in the genus Trillium: I. Chromosome affinity between the genoms//Jap. J. Genet., 1937. Vol. 13. №3-4. P. 135-

85. Haga T. Karyotypic polymorphism in Paris hexaphylla Cham, with special reference to its origin and to the meiotic chromosome behavior Cytologia, 1937a. Fujii Jubilei volumen, P.

86. Haga T. Geographical distribution of Trilliaceous plants in relation to polyploidy Jap. J. Genet., 1942. Vol. 18. 3-4. P. 168-

87. Haga T. Genom and polyploidy in the genus Trillium III. Origin of the polyploid species Cytologia, 1951. Vol. 16. 3. P.242-

88. Haga T. Studies on karyotypes and geographical distribution in the genus Trillium Rep Kihara Inst. Biol. Res., 1953. Vol. 6. P.I 1-

89. Haga T. Genom and polyploidy in the genus Trillium VI. Hybridisation and speciation by chromosome doubling in nature Heredity, 1956. Vol. 10. 1. P.85-

90. Haga T. Structure and dynamics of natural populations of a diploid 7>/7/шт//Chromosome Today, 1969. Vol. 2. P. 207-

91. Haga T. Trilliums in Hokkaido. Evolution and cytogenetics of population of Japanese Trilliums II Kromosomo, 1974. Vol. 96. 97. P. 2974-2994. 119

92. Haga Т., Kurabayashi M. Genom and polyploidy in the genus Trillium IV: Genom analysis by means of differential reaction of chromosome segments to low temperature Cytologia, 1953. Vol.18. 1. P.13-

93. Haga Т., Kurabayashi M. Genome and polyploidy in the genus Trillium V. Chromosomal variation in natural populations of Trillium kamtschaticum Pall. Memoirs of the Faculty of Science, Kyushu University, 1954. Ser. E. (Biology). Vol. 1. P. 159-

94. Haga Т.; Watanabe H.; Uchino A. Chromosomal polymorphism in the SU genome complex of polyploid Trilliums И Jap J Genet., 1974a. Vol.49. 6. P. 413-

95. Haga Т.; Watanabe H.; Kanazawa H.. Hybridization in natural populations of Japanese Trilliums. Jap J. Genet., 19746. Vol. 49. 6. P. 399-

96. Haga Т., Uchino A., Watanabe H. Structure and dynamics of natural populations of polyploid Trillums I: A tetraploid species Trillium apetalon II Jap. J. Genet., 1984. Vol. 59. .5. P. 473-

97. Hara H., Stearn W.T., Williams L.H.J. An enumeration of the flowering plants of Nepal. British Museum (Natural History), London, 1978. 80p. Hiraizumi Y. Evolution and variation in Trillium. I. Random genetic drift in natural population o Trillium kamtschaticum Pall. Jap. J. Genet 1956. Vol. 31. P. 33-

98. Howell W. M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer, a one step method Experientia, 1980. Vol. 36. P.10141

99. Hsiao C Chatterton N.J., Asay K.H. Molecular phylogeny of the Pooideae (Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences Theor. Appl. Genet., 1995. Vol. 90. P. 389

100. Huber H. Die samenmerkmale und verwandtschaftsverhaltnisse Bot. Staatssamml. Munchen, 1969. Vol. 8. P. 219-

101. Hutchinson J. The families of flowering plants. Vol.

102. Monocotyledons. Clarendon Press, London, 1926.243 р. der LiliiOoren Mitteil. 120

103. Monocotyledons. Oxford, 1973. 986 p. Ihara M. Some seed isozymes in the Japanese Parideae, Paris and Trillium, organic evolution J. Phytogeography and Taxonomy,.1981. Vol. 29. 2. P. 81-

104. Ihara M., Ihara K. A biosystematic study of the pedicellate-flowered species of North American Trillium (1) Geographical distribution of major Groups and their gynoecium Norms. Joum. Geobot., 1978. Vol.25. .4. P.139-

105. Ihara K.; Ihara M. A biosystematic study of the pedicellate-flowered species of North American Trillium. 2. An inter specific relationship shown by karyotypes and mode of microsporogenesis J. Phytogeography Taxon, 1982. Vol.30. JT .2. P. 74-82. So Ingle J., Timmis J.N., Sinclair J. Relationship between satellite deoxyribonucleic acid, ribosomal ribonucleic acid gene redundancy, and genome size in plants Plant Physiology. 1975. Vol. 55. P. 496-

106. Kazempour Osaloo S., Kawano S. Molecular systematics of Trilliaceae. II. Phylogenetic analyses of Trillium and its allies using sequences of rbcL and matK genes of cpDNA and internal transcribed spacers of 18s-26s nrDNA Plant Species Biology. 1999. Vol. 14. P. 75-

107. Kazempour Osaloo S., Utech F. H., Ohara M., Kawano S. Molecular systematics of Trilliaceae I. Phylogenetic analyses of Trillium using matK genes sequences Journal of Plant Research. 1999. Vol. 112. P. 35-

108. Kurabayashi M. Effect of temperature upon the differential reaction of chromosomes Teion-Kagaku (Low Temp.Sci.), 1948. Vol. 4. P. 97-

109. Kurabayashi M. Denaturation of chromatin and its related phenomena observed in somatic tissues under low temperature Jpn. J. Bot., 1954. Vol. 14. P. 349-

110. Kurabayashi M. Evolution and variation in Trillium. IV. Chromosomal variation in natural population of Trillium kamtschaticum Pall. Jap. J. Bot., 1957. Vol.16. M 1. P. 1-

111. Kurabayashi M. Evolution and variation in Japanese species of Trillium //Evolution, 1958. Vol. 3..№ 12. P. 286-

112. Kurabayashi M. Karyotype differentiation in Trillium sessile and Tovatum in the western United States Evolution, 1963. Vol.17. 3. P. 296-306. 121

113. Laane M.M., Lie T. Fremstilling av kromosompreparater medenkle metoder Blyttia, 1985. P. 7-

114. Lavania W. Differential staining and plant chromosomes a process in genetics Curr. Sci., 1978. Vol. 47. P. 255-259. LaCour L.F., Chayen J., Gahan P.B. Phospholipids and the chromosomes Ann. Rept. John Innes Hort. Inst., 1956. Vol. 47. P. 28-

115. Leitch A.R., Schwarzacher Т., Jackson D., Leitch I.J. In situ hybridization. A Practical guide. Royal Microscopical Society, Microscopy Handbooks. Oxford:Bios Ltd., 1994. Vol. 27. 118 p. Li H. The phylogeny of the genus Paris L. Acta Botanica Yunnanica, 1984. Vol. 6. P. 351-362. Li H. A study of taxonomy of the genus Paris L. Bull. Bot. Res., 1986. Vol. 6. P. 109-149. Li H., Gu Z., Na H. Cytographic study of the genus Paris Acta Phytotaxonomica Sinica, 1988. Vol. 26. 1 P. 1-

116. Lindley J. The Vegetable Kingdom, 3rd. edition. Bradley and Evans, London, 1846. (Trilliaccae-p.218). Matsuura H. On the number of spiral gyres in the chromonemata Jap. J. Genetii_1934. Vol. 9. P. 143-

117. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamischaticum Pall. 3. The mode of chromatid disjunction at the first meiotic metaphase of the PMC Cytologia, 1937a. Vol. 8. P. 142-

118. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall

119. Further studies on the direction of coiling of the chromonema within the first meiotic chromosome Cytologia, 19376. Vol. 8. P. 178-

120. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall.

121. Abnormal meiotic division, due to high temp Cytologia, Fujii Jub. 1937B. Vol. 7. P. 20-34. 122

122. Matsuura, H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall.

123. Additional evidence for the Neo-two-plane theory of bivalent constitution Cytologia, 19386. P. 78-

124. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall.l 1. A simple new method for the demonstration of spiral stricture in chromosomes //Cytologia, 1938B. Vol. 9. P. 243-

125. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall

126. Primary and secondary chiasmata// Cytologia, 1941a. Vol. 11. P. 380-

127. Matsuura H. Chromosome studies on Trillium kamtschaticum Pall. 15. A contribution to the present status of knowledge on the mechanism of chromonema coiling Cytologia, 19416 Vol. 11. P. 407-

128. Mill R.R. Flora Turkey. 1984. Vol. 8. P.

129. Miyabe K., Tatewaki M. Contributions to the flora of Northern Japan Trans. Sapporo Nat. Hist. Soc, 1936. Vol. 7. P. 189-

130. Miyamoto J., Kurita S. C-band polymorphism in the karyotype o Paris tetraphylla A. Gray (Liliaceae) Cytologia, 1990. Vol. 55. X» 2. P. 301-

131. Miyamoto J., Kurita S., Gu Z., Li H. C-banding pattern in eithteen taxa of the genus Paris sensu Li, Liliaceae Cytologia, 1992. Vol. 57. Xo 2. P. 191-

132. Miyamoto J., Ohmido N., Fukui K. Physical mapping of 18S rDNA by fluorescence in situ hybrydization (FISH) in the three speies of the Genus Paris L., Liliaceae Cytologia, 1999. Vol.64. P. 175-

133. Muravenko 0., Fedotov A., Punina E. et al. Comparison of BrdU-Hoechst-Giemsa Chromosome Banding Patterns of Al and AbDb Cotton Genomes Genome, 1998. Vol. 41. P. 616-625. 123

134. Ohara M. Life history evolution in the genus Trillium PI. Sp. Biol., 1989. Vol. 4. P. 1-

135. Ohara M.; Kawano S. Life history study on the genus Trillium Liliaceae

136. Reproductive biology of four Japanese species Pi. Sp. BioL, 1986a. Vol. 1. P. 35-

137. Ohara M., Kawano S. Life history study on the genus Trillium Liliaceae

138. Stage class structures and spatial distribution of four Japanese species PI. Sp. Biol., 19866. Vol. 1. P. 147-

139. Ohara M., Kawano K. Breeding and pollination systems of four Japanese Trillium species //Acta. Phytotax. Geobot,, 1987. Vol. 38. P. 75-

140. Polya L. Chromosome numbers of Hungarial plants Ann. Biol. Univ. Debreceniensis, 1950. Vol. 1. P. 46-

141. Pelc S.R., La Cour L.F. Some aspects of replication in chromosomes. In: The cell Nucleus. 1960.232 р. Rutishauser A., La Cour L.F. Spontaneous chromosome breakage in hybrid endosperm. Chromosoma, 1956. Vol. 8. .3. P.317-

142. Saho Т., Kurabayashi M. Genome affinity and the process of speciation in the genus Trillium//Organic Evolution, 1956. Vol. 3. P. 74-

143. Saho T. Analysis of chromosome variation in a populaton of Trillium apetalon Makino with reference to the breeding system J. Fac. Sci. Hokkaido Univ. Ser V Bot., 1974a. Vol.lO.№2. P. 122-

144. Saho T. The chromosome variation in Trillium apetalon Makino J. Fac. Sci._Hokkaido Univ. Ser V Bot., 19746. Vol.10. 2 P. 113-

145. Samejima K. Evolution and variation in Trillium.

146. Variation in some external characters observed in naturals populations of Trillium kamtschaticum Pall. Evolution, 1958. Vol. 12. P. 63-

147. Samejima J., Samejima K. Studies on the eastern Asiatic Trillium {Liliaceae) II Acta Horti Gotoburgensis, 1962. Vol. 25. P. 157-

148. Samejima K.; Samejima J. Trillium genus illustrated. Hokkaido U. Press, Sapporo. 1987. 124

149. Schweizer D. Differential staining of plant chromosome with Giemsa Chromosoma, 1973. Vol. 40. 3. P.

150. Schweizer D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI Chromosoma, 1976. Vol. 58. P. 307-

151. Schweizer D., Ambros P.F., Andrle m., Rett A., Fiedler W. Demonstration of specific heterochromatic segments in the orangutan {Pongo pygmaeus) by a distamycin/DAPI double staining technique Cytogenet. Cell Genet., 1979. Vol. 24. P. 7-

152. Schweizer D. Counterstain-enhanced chromosome banding Hum. Genet., 1981. Vol. 57. P. 1-

153. Schweizer D., Ambros P.F. Chromosome banding. In: Methods in Molecular Biology. Chromosome Analysis Protocols. Ed. by J.R. Gosden, N.Y Totowa. Humana Press Inc., 1994. Vol. 29. P. 97-

154. Shaw G. W. The nature of differential reactivity in the heterochromatin of Trillium and Paris spp. Cytologia, 1959. Vol. 24. P. 50-

155. Smith M.C., Ingram R. Heterochromatin banding in the genus Paris Genetica, 1986. Vol. 71. P. 141-

156. Soltis P. S., Soltis D. E. The role of genomic attributes in the success of polyploids Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000. Vol. 97. P. 7051-7

157. Sumner A.T. Chromosome banding. London, 1990. 434 p. Suzuki K. Variation of external morphology in natural populations of Trillium Organic Evolution, 1954. Vol. l.P.45-

158. Takahashi M. Pollen moфhoIogy in North American species of Trillium. Taxonomic relationships Am. J. Bot 1982. Vol. 69. P. 1185-1

159. Takahashi M. Pollen morphology in Asiatic species of Trillium II Botanical Mag 1983. Vol. 96. M l 044. P. 377-384. 125

160. Takhtajan A. Outline of the classification of flowering plants. The Botanical rewiew, 1980. Vol. 46. P. 225-

161. Takhtajan A.L A revision of Daiswa (Trilliaceae) II Brittonia, 1983. Vol. 35. 2 3. P. 255

162. Takhtajan A.L. Systems magniolophytorum. Leningrad, 1987. 438 p. Takhtajan A.L. Diversity and classification of flowering plants. Columbia University of Press, New York, 1

163. Tamura M.N. The families and Genera of Vascular Plants. Berlin, 1998. Vol. 3. P. 444-

164. Tatewaki M., Suto T. On the new genus Kinugasa Trans. Sapporo Nat. History Society, 1935. Vol. 14. P. 34-37. The Angiosperm Phylogeny Group Botanical J. of the Linnean Soc, 2003. Vol. 141. P. 399-

165. Thome R.F. Proposed new realignments in the angiosperms Nordic J. Bot., 1983. Vol. 3. P. 85-

166. Thome R.F. An update phylogenetic classification of the flowering plants Aliso, 1992. Vol. 13.№2. P. 365-

167. Tischler G. Die Bedeutungen der Polyploidie fur die Verbreitung der Angiospermen erlautert an den Arten Schleswig-Hosteins, mit Ausblicken auf andere Florengebiete Bot. Jahrb., 1934. Vol. 67. P. 1-

168. Torre Dalla K.W., Harms H. Genera siphonogamarum ad systems Englerianum conscripta. Lipsidae. G. Engelmann, 1

169. Uchino A. A spontaneous haploid plant of Trillium smallii Jpn. J. Genet. 1973. Vol. 48. P. 65-

170. Uchino A. Structure and dynamics of natural populations of polyploid Trilliums.

171. Trillium apetalon-T. smallii association//Nucleus, 1980a. Vol. 23. P. 127-140. 126

172. Uchino A. Structure and dynamics of natural populations of polyploid Trilliums III: A tetraploid species Trillium tschonoskii Maximowicz Japan. J. Genet., 1985. Vol. 60. J T S» 6. P.545-

173. Uchino A. Chromosomal variation in the K2T genome complex of polypoid Trillium Japan. J. Genet., 1985a. Vol. 60. M 6. P. 557-

174. Uchino A.; Kanazawa H. Structure and dynamics of natural populations of polyploid TrilliumsA. Predominant self-pollination in the tetraploid spQciQS,Trillium apetalon Makino//Bot. Mag. Tokyo, 1988. Vol. 101. P. 121-

175. Uchino A., Kanazawa H.; Watanabe H.. Structure and dynamics of natural populations of polyploid Trilliums.

176. Predominant self pollination in Trillium apetalon-T.smallii association PI. Sp. BioL 1987. Vol. 2. P. 101-

177. Uchino A., Watanabe H., Iwai Y. Chromosomal constitution and breeding system in the Haguro population of a tetraploid species, Trillium apetalon Makino bCromosomo, Tokyo. 1986. Vol. 2. 41. P. 1275-1

178. Uchino A; Wang L. Comparison of cold-sensitive and C-banded segments of chromosomes in Trilliums//Cylologia, 1996. Vol.61. .4. P. 415-

179. Uchino A; Wang L. C-band poIymoфhism on Paris tetraphylla chromosomes in four population of Kumamoto prefecture Cytologia. 1997. Vol. 62. P.I81-

180. Utsumi S., Takehisa S. Heterochromatin differentiation in Trillium kamtschaticum ammoniacal silver reaction Exp. Cell Res., 1974. Vol. 86. P. 398-401. by Vosa G.C. Chromosome variation in Tulbagia II Heredity, 1966. Vol. 21. P. 305-

181. Vosa G.C. Heterochromatin recognition with fluorochromes Chromosoma, 1970. Vol. 30. P.366-

182. Vosa G.C. Quinacrine fluorescence analysis of chromosome variation in the plant Tulbaghia leucantha//Chromosomes today, 1973. Vol. 4. P.345-

183. Vosa C.G., Marchi P. Quinacrine fluorescence and Giemsa staining in plants Nature New Biol., 1972. Vol. 237. P.191-192. 127

184. Wang S. Karyotypc uniformity of Paris and Trillium tschonoskii Acta Bot. Yunnanica, 1989. Vol.11. №10. P. 75-

185. Wang J.B., Wang C Shi S.H., Zhong Y. ITS regions in diploids of Aegilops (Poaceae) and their phylogenetic implications Hereditas, 2000. Vol. 132. P. 209-

186. Watanabe H.., Kayano H. Karyotype analysis of natural population of Trillium tschonoskii Jpn. J. Genet., 1971. Vol. 46. P.231-

187. Watson S. Contributions to American botany. I. Revision of the North American Liliaceae. Proc. Am. Acad. Arts Sci. 1879. Vol. 14. P. 213-

188. Wilson G.B.,Boothroyd E.R. Studies in differential reactivity I. The rate and degree of differentiation in the somatic chromosomes of Trillium erectum L. Can. Jour. Res. Ser. С (Bot. Sci.), 1941. Vol. 19. P.400-

189. Wilson G.B., Boothroyd E.R. Temperature-induced differential contraction in the somatic chromosomes of Trillium erectim L. Canad. J. Res. Ser. С (Bot. Sci.), 1944. Vol. 22. P. 105-

190. White T.J., Bruns Т., Lee S., Taylor J. PCR protocol: A guide to methods and applications. Ed. Innis M., Gelfand M., Sninsky J., White T. San Diego, Academic Press., 1990. P.315-

191. Woodart J., Swift II. The DNA content of cold-treated chromosomes Exp. Cell. Res., 1964. Vol. 34. 1 P. 131-137. Xia X., Xie Z. DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution J. Heredity, 2001. Vol. 92. P. 371-

192. Yakura K.; Kato A., Tanifuji S. Structural organization of ribosomal DNA in four Trillium species and Paris verticillata II Plant Cell Physiology, 1983. Vol. 24. №.7. P. 12311240.. 128