Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины

Сташевская, Кира Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

Сташевская Кира Сергеевна

КАПСУЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В МАТРИЦЫ НА ОСНОВЕ БИОСОВМЕСТИМЫХ ПОЛИМЕРОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНЫ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

003067030

Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Института биоорганической химии РАН и межфакультетском центре биоматериалов Университета г. Льеж, Бельгия.

Научные руководители:

доктор химических наук

профессор Университета г. Льеж, Бельгия

Марквичева Елена Арнольдовна Грандфис Кристиан

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Клячко Наталья Львовна

Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация:

ФГУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится "17" января 2007 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова ИБХ РАН.

Автореферат разослан: "_" декабря 2006 г.

Ученый секретарь

специализированного совета < /

доктор химических наук, профессор

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем фундаментальной биохимии и современной биомедицины является репарация тканей. Среди прочих биологически активных веществ, способных ускорить процесс заживления ран, повышенное внимание в последнее время уделяется белкам и пептидам (гормонам, различным факторам роста др.). Особое место среди них занимает тромбин (сериновая протеаза семейства трипсина), который, являясь фактором роста, не только регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, но также включается в воспалительную и пролиферативную фазы ранозаживления, при этом стимулируя пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и продукцию последними коллагена. Однако применение тромбина ограничено его высокой лабильностью и высокой стоимостью. Для стабилизации тромбина ранее в ИБХ РАН был разработан метод инкапсулирования этого фермента в пленки биосовместимого гидрогеля и продемонстрировано ускоренияе процесса заживление наружных ран под этими покрытиями в моделях in vivo. Кроме того, возможно еще одно решение данной проблемы. Некоторые синтетические пептиды могут имитировать действие тромбина в процессе регенерации ткани. Являясь более дешевыми по сравнению с тромбином, пептиды, однако, очень быстро расщепляются пептидазами в организме. Инкапсулирование пептидов в биосовместимые полимерные матрицы позволяет, как защитить пептиды от разрушения, так и направленно регулировать скорость их выхода in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы. Использование полиэфиров на основе молочной и гликолевой кислот позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены и для лечения внутренних ран (раны после хирургических вмешательств, язвы и др.). Целью работы, являлось капсулирование биологически активных веществ, в частности, пептида-агониста тромбинового рецептора TRAP-6 (thrombin receptor agonist peptide) и его аналога TRAP-6(M) в биосовмесгимые биодеградируемые

микрочастицы на основе сополимера (сЦ)-молочной и гликолевой кислот (PLGA) и исследование возможности применения этих пептидов для репарации тканей. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить биологическую активность пептидов in vitro.

2. Разработать и оптимизировать метод инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(M) в PLGA микрочастицы.

3. Исследовать некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (распределение микрочастиц по размерам, морфологию поверхности и: скорость их деструкции in vitro).

4. Исследовать кинетику выхода пептидов из микрочастиц, а также их адсорбцию на поверхность микрочастиц in vitro.

5. Исследовать ранозаживляющие эффекты инкапсулированных пептидов на процесс репарации тканей как в случае наружных резаных ран, так и для модели язвы желудка (мыши, крысы).

Научная новизна. Впервые TRAP-6 и TRAP-6(M) были инкапсулированы в PLGA микрочастицы. Были изучены характеристики полученных микрочастиц (распределение микрочастиц по размерам, морфология поверхности и др.). Был исследован характер кинетики выхода пептидов и их адсорбции на поверхности PLGA микрочастиц. Впервые была проведена оценка биологической активности TRAP-6(M) и продемонстрирован положительный эффект этого пептида на процесс репарации тканей. Впервые в моделях in vivo (мыши, крысы) было показано, что пептиды TRAP-6 и TRAP-6(M), инкапсулированные в PLGA микрочастицы, ускоряют заживление как наружных ран, так и способствуют ускоренному заживлению язвы желудка. Практическая значимость работы. На основе полученных в работе инкапсулированных пептидов могут быть разработаны новые перспективные препараты пролонгированного действия для терапии наружных и внутренних ран. Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на следующих конференциях: XVII Коллоквиум по биоматералам (Аахен, Германия, 2004), XII Международный симпозиум по биокапсулированию (Витория, Испания, 2004),

Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004), Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (Москва, 2005), XIII Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, билогии и экологии (Гурзуф, Украина, 2005), XIII Международный симпозиум по биокапсулированию (Кингстон, Канада, 2005), Европейский полимерный конгресс (Москва, 2005), ежегодная Международная конференция Немецкого общества клеточной биологии (Брауншвейг, 2006).

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, а также списка литературы, включающего наименований. Диссертация изложена на/^^страницах машинописного текста, включая таблицы (.г?..) и рисунки (S8).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выбор биологически активных пептидов для репарации тканей

Для предотвращения нежелательного провоспалительного эффекта тромбина и решения проблем, связанных с нестабильностью фермента, в представленной работе было предложено заменить тромбин пептидами, способными имитировать эффект тромбина в процессе репарации тканей. Известно, что действие тромбина на клетки реализуется через мембранные рецепторы семейства PAR (protease activated receptors). Механизм активации рецепторов семейства PAR заключается в расщеплении протеазами (в частности, PAR-1, PAR-2 и PAR-4 активируются тромбином) пептидной связи в рецепторе. Укороченный протеазой новый N-концевой фрагмент рецептора, который называют "привязанным лигандом", активирует рецептор, взаимодействуя с участками его второй внеклеточной петли (аминокислотными остатками 244-268) и/или с N-концевым экзодоменом (аминокислотные остатки 7693). Известно, что пептиды, повторяющие аминокислотную последовательность освобождавшихся при действии протеаз новых N-концевых фрагментов PAR, могут

имитировать механизм действия тромбина. Например, пептиды-агонисты тромбинового рецептора PAR-1 (TRAPbi) могут вызывать освобождение внутриклеточного кальция, агрегацию тромбоцитов, стимулировать синтез ДНК и ингибироватъ аденилатциклазу, а также активировать МАР-киназы. Таким образом, с помощью таких пептидов, в частности, используя синтетический пептид TRAP-6 (agonist PAR-1), можно индуцировать весь каскад биологических событий, связанных с процессом репарации тканей, минуя стадию протеолиза рецепторов тромбином.

TRAP-6 является низкомолекулярным гексапептидом с аминокислотной последовательностью Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn (SFLLRN). Arg5 определяет высокое значение изоэлектрической точки пептида (pi 11.04). Особенностью первичной структуры, определяющей амфифильность молекулы TRAP-6, является гидрофобное ядро, состоящее из 3 аминокислот Phe2 Leu3, Leu4, и концевые гидрофильные аминокислоты Ser1, Arg5 Asn6.

Различные исследования структурной организации пептида выявили основные параметры, влияющие на его биологическую активность. Так, гидрофобное взаимодействие между Phe2 и Leu4 является ключевым моментом для сохранения активности пептида. В частности, замена Phe2 на Ala приводит к полной потере способности активировать рецептор. Важным параметром, определяющим взаимодействие TRAP-6 с PAR-1, является также электростатическое взаимодействие протонированной гуанидиновой группы Arg5.

И, напротив, замена Ser1, Leu3 и Asn6 на неполярные гидрофобные аминокислоты (аланин, пролин) не влияет на активность пептида. Для сохранения активности пептида аминокислота, земещаюшая Ser1, не должна быть стерически объемной, тогда как Leu3 и Asn6 могут быть замещены любой аминокислотой, что существенно не влияет на активность полученного пептида.

Таким образом, изменение значения изоэлектрической точки пептида при замещении Leu3 и/или Asn' другой (или другими) аминокислотой (аминокислотами), может позволить получить новые пептиды с другими свойствами, при этом сохранив их биологическую активность, необходимую для стимулирования процесса репарации

тканей. С учетом всего вышесказанного, нами было предложено синтезировать новый пептид, названный нами модифицированным, а именно ТЯАР-б(М), отличающийся от ТРАР-6 одной аминокислотой. Эта замена одной аминокислоты привела к снижению величины изоэлектрической точки с р1 11.04 (для Т11АР-6) до р1 6.78 (для Т11АР-6(М)). Такое снижение р1, как будет показано далее, существенно меняет поведение пептида после его выхода из РЬвА микрочастиц. В частности, можно предположить, что более заряженный пептид может легче сорбироваться на поверхность микрочастиц. Пептиды ТКЛР-6 и ТЯАР-б(М) были синтезированы в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН. Следующим этапом работы было исследование биологической активности этих пептидов.

1.1. Исследование биологической активности пептидов

Биологическая активность пептидов была исследована методом агрегации тромбоцитов (рис. 1). Зависимости степени агрегации тромбоцитов (Д8агр) от концентраций пептидов (калибровочная кривая) представлены на рисунке 2.

— I. |,.Г- » ТГ.М ........-»и.-:

„ [КМ ; <Л| ;

.Ul:lVkl|im\l>

Рисунок 1. Параметр ASarp - разность Рисунок 2. Кривые зависимостей ASarp от площадей пиков контроля (фосфатный концентраций пептидов. Приведены буфер (PBS)) и TRAP-6 (20цМ) (площадь средние значения 4 независимых под интегральной кривой, заштрихованная экспериментов, синим цветом).

Очевидно, что при одинаковых концентрациях пептидов, TRAP-6 является более эффективным индуктором агрегации тромбоцитов, чем TRAP-6(M), так как его полумаксимальная стимулирующая концентрация равна ~ 1 рМ. Однако, эта величина

—♦— TRAP-6(M) -»-TRAP-6

только на один порядок ниже полумаксимальной стимулирующей концентрации TRAP-6 (М), составляющей ~ 12 цМ.

Таким образом, как и ожидалось, биологическая активность TRAP-6(M) незначительно отличается от TRAP-6. Следующим этапом работы был выбор полимерной матрицы для капсулирования пептидов и метода капсулирования.

2. Получение инкапсулированных пептидов методом двойной эмульсии

Метод двойной эмульсии, выбранный нами для капсулирования пептидов, достаточно широко применяется для капсулирования различных гидрофильных биомолекул, в том числе белков (включая ферменты) и пептидов. Микрочастицы с инкапсулированными пептидами были получены совместно с Межфакультетским центром биоматериалов (CEIB) университета г. Льеж, Бельгия. Схема получения микрочастиц с инкапсулированными пептидами представлена на рисунке 3.

Для получения микрочастиц водный раствор пептида добавляли к раствору желатина и гомогенизировали 30 с при 40°С. К полученной дисперсии водной фазы, не прекращая перемешивания, добавляли раствор PLGA в метилен хлориде. Затем увеличивали скорость перемешивания и продолжали процесс еще 30 с. Полученную первичную эмульсию (bi/m) добавляли к водному раствору ПВС (15°С) при его перемешивании. Процесс перемешивания продолжали 15 мин при 15°С для получения вторичной эмульсии (bj/m/b2). Затем температуру увеличивали до 30°С и продолжали перемешивание еще 30 мин до полного испарения растворителя. К полученной суспензии микрочастиц добавляли воду milliQ комнатной температуры, останавливали процесс через 1 мин, а полученные микрочастицы собирали на бумажном фильтре, промывали и лиофильно сушили. Выход микрочастиц, определяемый как процентное отношение массы полученных микрочастиц к суммарной массе полимера и пептида, составил 80%.

Рисунок 3. Схема получения микрочастиц с инкапсулированными пептидами методом двойной

ЭМуЛЬСИИ (В1/М/В2).

3. Исследование некоторых физико-химических свойств микрочастиц с инкапсулированными пептидами

3.1. Исследование распределения по размерам микрочастиц

Результаты изучения микрочастиц с помощью светового микроскопа, оснащенного программным обеспечением для вычисления распределения частиц по размерам, представлены на рисунке 4.

Диаметр Фере* (цт)

-Контрольные частицы -Частицы с ТКАР-6

-Частицы с ТЛАР-б(М)

Рисунок 4. Распределение по размерам контрольных микрочастиц (без пептида) и микрочастиц с ТЯАР-6 и ТКАР-б(М) (синяя, зеленая и красная линии соответственно). "Диаметр Фере — максимальный диаметр частицы.

Из рисунка 4 видно, что с помощью метода двойной эмульсии нам удалось получить микрочастицы с распределением по размерам в интервале -50-400 мкм. Очевидно, что при капсулировании ТИАР-б происходит сдвиг суммарного объема частиц в сторону увеличения диаметра. Это можно объяснить тем, что, возможно, присутствие пептида снижает межфазное натяжение на границе раздела фаз.

3.2. Исследование скорости деструкции РЬОА микрочастиц

Морфологию поверхности и скорость деструкции микрочастиц определяли методом сканирующей электронной микроскопии. Микрофотографии контрольных частиц (без пептидов) и частиц с инкапсулированными пептидами представлены на рисунке 5. Исследование деструкции микрочастиц на макро- и микро- уровне показало: -Морфология поверхности всех образцов представлена микропорами, субмикропорами и микротрещинами. Капсулирование ТЯАР-б заметно усиливает пористость микрочастиц.

-Спустя 24 часа после инкубации существенно увеличивается пористость поверхности микрочастиц, а также наблюдается увеличение их размера.

- На второй день инкубации, когда пористость поверхности достигает критического уровня, начинается процесс деструкции микрочастиц в объеме, сопровождающийся их агрегацией.

- На пятый день инкубации наблюдается достаточно сильное разрушение структуры микрочастиц во всех образцах;

- На пятнадцатый день инкубации структура микрочастиц всех образцов полностью разрушена, и можно наблюдать лишь отдельные фрагменты полимерной матрицы.

Таким образом, можно предположить, что выход пептида из РЬвА микрочастиц может происходить за счет набухания полимера и диффузии пептида из полимерной матрицы, имеющей пористую структуру, а также за счет деструкции самой полимерной матрицы в зависимости от времени. Исследование кинетики выхода пептидов их РЬОА представлено в следующей главе.

Микрочастицы с ТКАР-б Микрочастицы с ТКЛР-б(М)

День „

„ Контрольные

ипкуоанн

микрочастицы

Рисунок 5. Микрофотографии контрольны! частиц и частиц с пептидами до инкубации и спустя 1 день, 2 дня, 5 дней и 15 дней инкубации в буферном растворе (5 мМ НЕРЕ8; рН 7,5;

37"С), Масштаб линейки 100 мкм

4. Исследование кинетики выхода пептидов из РЬСА микрочастиц

Микрочастицы с пептидами инкубировали в буферном растворе (5 мМ НЕРЕБ, рН 7,5). Концентрацию пептидов в супернатанте определяли методом ВЭЖХ. Выход пептидов происходит в два этапа (рис. 6). Первый этап характеризуется резким увеличением концентрации пептидов в растворе (так называемый ЬиШ эффект), затем происходит постепенный выход оставшихся в микрочастицах пептидов.

Рисунок 6. Кинетика выхода "ГОАР-б и Т11АР-6(М) из РЬОЛ микрочастиц в буферном растворе (5 мМ НЕРЕБ, рН 7,5; при37°С).

Существенное увеличение концентрации ТЯАР-б и Т11АР-6(М) в супернатанте на первом этапе можно объяснить следующим образом:

• во-первых, наблюдается диффузия пептида, локализованного в приповерхностных слоях;

• во-вторых, при набухании полимерной матрицы происходит высвобождение пептида через заполненные водой поры и трещины, сформированные в процессе получения микрочастиц.

В пределах чувствительности метода было установлено, что суммарное количество пептидов, обнаруженное в супернатанте в течение 24 часов инкубации, составило соответственно 23.2% и 16.6% от инкапсулированного количества ТЯАР-6 и ТИАР-6(М). Однако как было упомянуто ранее, (см. гл. 1), наряду с процессом выхода пептидов из микрочастиц, можно было ожидать их адсорбцию на поверхности последних.

0.08 0.5 1 4 8

Врем? (ч)

4.1. Исследование адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности РЬСЛ

микрочастиц

Для исследования возможности адсорбции пептидов на поверхности РЬСА микрочастиц, контрольные микрочастицы (без пептида) инкубировали с ТЯАР-б и ТКАР-6 (М) в буферном растворе (Нерев ]Ч!а 5 мМ, рН 7.5) при 37°С. Концентрацию пептидов в супернатанте определяли методом ВЭЖХ.

Рисунок 7. Адсорбция TRAP-6 и TRAP-6(М) ш раствора на поверхности контрольных PLGA микрочастиц (5 мМ HEPES, рН 7,5; 371,С) Начальная концентрация пептидов в буфере составляла 200 цМ (100%).

Профили адсорбции ТРАР-6 и ТКАР-б(М) на поверхности контрольных микрочастиц существенно отличаются (рис. 7). Адсорбцию пептидов рассчитывали как разность их начальных и текущих концентраций в растворе в данный момент времени (5 мин. 30 мин, 60 мин и т.д.). Наблюдали адсорбцию обоих пептидов на поверхности контрольных микрочастиц в течение первых 5 минут (0,08 час) инкубации. Затем происходила десорбция ТЕАР-6(М) обратно в раствор, и концентрация его на поверхности микрочастиц падала до 5% к 24-му часу инкубации. Адсорбция же ТКАР-б, напротив, существенно увеличивалась и составляла 85% через 24 часа инкубации Через 96 часов пептид ТЯА Р-6 полностью десорбировался с поверхности микрочастиц в раствор

Известно, что максимальная адсорбция белков и пептидов происходит в области рН, близкой к значению р1. Это подтверждает полученные нами результаты, гак как ТЯАР-б (р! 11.05) при рН 7.5 несет положительный заряд и адсорбируется к

поверхности микрочастиц в значительно большей степени, чем отрицательно заряженный TRAP-6(M) (pl 6.78).

Таким образом, было показано, что регулировать скорость выхода пептидов можно не только за счет варьирования свойств и структуры полимерной матрицы, но и за счет свойств инкапсулированного вещества.

Так как для всех последующих экспериментов in vivo нужно было использовать микроколичества пептидов, необходимо было оценить возможные потери пептидов в процессе микрокапсулиронания.

5. Исследование некоторых факторов, влияющих на потери пептидов в процессе

капсулирования

Следует отметить, что выбранный нами метод капсулирования предполагает использование органических растворителей (см. рис. 3), которые могли повлиять на биологическую активность пептидов, поэтому представлялось важным оценить биологическую активность пептидов при взаимодействии последних с органической фазой. Кроме того, важным моментом было исследование поведения (возможности адсорбции) пептидов на твердых поверхностях (стенки пробирок).

Анализ фракций супернатанта, полученных за 24 часа для исследования кинетики выхода пептидов, показал, что концентрации пептидов, определенные методом агрегации тромбоцитов, существенно ниже тех же показателей, определенных методом ВЭЖХ.

Известно, что в процессе микрокапсулирования граница раздела фаз вода/органический растворитель является фактором, снижающим биологическую активность белков за счет конформационных изменений последних. Снижение же биологической активности пептидов в данных условиях на сегодняшний день мало изучено. Тем не менее, некоторые исследования показали, что органические растворители могут влиять на конформацию, растворимость и биологическую активность пептидов.

5.1. Исследование влияния межфазнои поверхности вода/органический растворитель на биологическую активность TRAP-6

Для данного эксперимента был выбран TRAP-6 Использовали следующие растворители: толуол, этил ацетат, метилен хлорид, DMSO, ацетон, ацетонитрил, THF. Выбор растворителей был обусловлен тем, что все они способны диспергировать или растворять пептид, растворять PLGA. а также формировать эмульсию вода/масло. Для получения опытных образцов, TRAP-6 в твердом состоянии либо в виде водного раствора смешивали с органическими растворителями, которые затем испаряли. При этом использовали 2 контроля: контроль 1 - для образцов TRAP-6 в тв. состоянии/органический растворитель; контроль 2 - дяя образцов водный раствор TRAP-6/органический растворитель. Контрольные образцы были получены из исходного водного раствора пептида: контроль 1 - лиофилизацией исходного раствора, контроль 2 - лиофилизацией исходного раствора, повторным растворением пептида в воде и последующей лиофилизацией. Во все полученные образцы, включая контроли, добавляли фосфатный буфер (PBS) и исследовали активность TRAP-6 методом агрегации тромбоцитов.

Рисунок 8, Остаточная активность пептида после контакта с органическими растворите леи и в твердом виде и в виде водного раствора. Начальная концентрация пептида 25 рМ (100%), Приведены данные 3 независимых экспериментов (И) - контроль 1; (■} - контроль 2

Диспергирование TRAP-6 в большинстве растворителей в твердом виде не приводило к снижению его биологической активности, за исключением толуола и смеси метилен хлорид/ацетон (рис. 8). Однако при контакте ТИАР-б в виде водного

раствора со всеми растворителями происходило снижете его активности более чем на 50%, в том числе и для контроля. Таким образом, снижение активности пептида зависело от того, в каком виде пептид вносили в растворитель (в растворе либо в твердом состоянии).

Можно предположить, что снижение биологической активности обусловлено адсорбцией пептида на поверхности стеклянной пробирки. Для проверки этой гипотезы концентрацию пептида после его контакта с толуолом и смесью метилен хлорид/ацетон в виде водного раствора определяли параллельно методами ВЭЖХ и агрегации тромбоцитов.

5.2. Исследование влияния межфазной поверхности вода/органический растворитель на адсорбцию TRAP-6

Концентрацию TRAP-6 после взаимодействия в виде водного раствора с толуолом и смесью метилен хлорид/ацетон (90/10%) определяли методами ВЭЖХ и агрегации тромбоцитов (табл. 1). Толуол был выбран по результатам предыдущего эксперимента, поскольку снижает биологическую активность TRAP-6 как в твердом состоянии, так и в виде водного раствора. Смесь метилен хлорид/ацетон, как было показано ранее, способствует снижению межфазного натяжения между водой и органическим растворителем.

Таблица 1. Изменение концентрации TRAP-й при контакте с растворителями в виде водного раствора. Начальная концентрация TRAP-6 250 цМ. Контрольный образец идентичен контролю 2 предыдущего эксперимента (см. гл. 5.1.)

Растворитель ВЭЖХ М-д агрегации тромбоцитов

TRAP-6 (дМ) TRAP-6 (дМ)

Контроль 211.7 149.3

Толуол 206.3 72.9

Метилен хлорид/ацетон (90/10%) 265.2 112

Анализируя результаты, полученные с помощью ВЭЖХ, снижение концентрации пептида в контроле и после контакта с толуолом (-15%) можно объяснить незначительной адсорбцией пептида к поверхности стеклянной пробирки. При использовании смеси метилен хлорид/ацетон адсорбцию пептида не наблюдали. Подобную адсорбцию коротких амфифильных пептидов на поверхности стекла могут

определять электростатические взаимодействия. Вместе с тем, очевидно, что, при контакте водного раствора TRAP-6 с органическими растворителями, помимо адсорбции, происходит существенное снижение его биологической активности, поскольку концентрации пептида в образцах, определенные методом агрегации тромбоцитов, существенно ниже концентраций, определенных ВЭЖХ. Таким образом, можно заключить, что при диспергировании TRAP-6 в виде водного раствора в большинстве растворителей имела место незначительная адсорбция пептида к поверхности стекла, в то же время наблюдали довольно значительное снижение биологической активности пептида в условиях определения последней методом агрегации тромбоцитов.

Поскольку было установлено, что биологическая активность пептида снижается при взаимодействии TRAP-6 в виде раствора с органическими растворителями, а также имеет место его адсорбция при использовании стеклянных пробирок, было решено изучить поведение пептида при взаимодействии с растворителями в полипропиленовых пробирках. Было показано, что контакт пептида в виде водного раствора с ацетоном и смесью метилен хлорид/ацетон приводил к увеличению адсорбции пептида на поверхности полипропиленовой пробирки. В остальных образцах адсорбция пептида не зависела от его физического состояния. Контакт пептида со всеми растворителями в виде водного раствора приводил к снижению биологической активности TRAP-6 в полипропиленовых пробирках.

Необходимо отметить, что метод агрегации тромбоцитов может рассматриваться как оценочный метод из-за его низкой точности. Разница между результатами экспериментов может быть обусловлена различной чувствительностью к TRAP-6 образцов плазмы крови, полученных от различных доноров. Тем не менее, очевидно, что диспергирование TRAP-6 в твердом виде в большинстве органических растворителей позволяет существенно уменьшить адсорбцию пептида к поверхности лабораторной посуды и, таким образом, уменьшить потери пептида в процессе микрокапсулироваиия. На основе полученных результатов мы решили оптимизировать

метод капсулирования TRAP-6 для сохранения биологической активности пептида и снижения его адсорбции на поверхности лабораторной посуды.

6. Получение инкапсулированных пептидов методом простой эмульсии

Как показано ранее, растворение TRAP-6 в твердом виде в органическом растворителе (без его предварительного растворения в воде), позволяет избежать снижения его биологической активности. С учетом ранее полученных результатов, было предложено замегагть метод двойной эмульсии методом простой эмульсии. Капсулирование проводили в стеклянной пробирке с использованием этилацетата и смеси метилен хлорид/ацетон. Метод заключался в диспергировании пептида в твердом виде непосредственно в органическом растворителе, содержащем PLGA, а последовательность всех последующих операций соответствовала методу двойной эмульсии (см. гл. 2).

Ранозаживляющие свойства инкапсулированных пептидов, полученных методами простой эмульсии (в/м) и двойной эмульсии (в^м/вг), исследовали в моделях кожных резаных ран (мыши) и язвы желудка (крысы).

7. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс репарации

тканей ш vivo

Для исследования ранозаживляющих эффектов инкапсулированных пептидов были проведены эксперименты in vivo, в частности в моделях на мышах (кожные резаные раны) и на крысах (модель ацетатной язва желудка). Все эксперименты были выполнены совместно с группой проф.С.М.Струковой (Кафедра физиологии человека и животных Биофака МГУ). Степень заживления ран определяли:

• по изменению площади раны;

• с помощью гистологического анализа срезов образцов грануляционной ткани, взятой в области раны/язвы на 3 и 7 сутки после ранения.

Процесс репарации тканей и, в частности, заживления ран, включает три фазы: воспаление, пролиферацию, и созревание грануляционной ткани. Фаза воспаления, которая обычно длится около трех дней, характеризуется присутствием большого

количества макрофагов и других клеток, принимающих участие в остром адаптивном ответе организма в ране. Для фазы пролиферации характерно резкое увеличение количества пролиферирующих фибробластов, продуцирующих коллаген и другие структурные компоненты, участвующие в процессе репарации ткани, а также образование сосудов в грануляционной ткани (ангиогенез). Фибробласты можно наблюдать в ране уже на 3-ий день после ранения; однако, на 7-ой день их количество достигает максимального значения.

7.1 Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления кожных ран

В экспериментах in vivo использовали инкапсулированные пептиды, полученными обоими вышеописанными методами (двойной и простой эмульсии). Для изучения эффектов микрочастицы с инкапсулированными пептидами апплицировали группе опытных животных (мышей) на полнослойную кожную резаную рану размером 1x1 см2 непосредственно после ранения. Контрольные группы имели либо открытые раны, либо закрытые микрочастицами без пептидов. Для проведения гистологических исследований брали срезы образцов грануляционной ткани либо отпечатки из области раны на 3 и 7 дни после ранения.

Как видно из рисунков 9а и 9Ь, на 7 день репарации наружных ран на срезах грануляционной ткани открытой раны наблюдалось только 4-5 слоев эпителия, большое количество макрофагов, нейтрофилов, но мало фибробластов. В то же время на срезах грануляционной ткани раны, закрытой микрочастицами с TRAP-6, наблюдали 7-8 слоев эпителия, под которыми видна хорошо развитая соединительная ткань и многочисленные веретенообразные фибробласты, локализованные в матриксе (рис. 9с, 9d). Это свидетельствовало о сокращении фазы воспаления в области раны под действием высвобождающегося из микрочастиц TRAP-6. Исследование динамики ранозаживления в модели на мышах на 3 и 7 день (рис. 10, И) выявило сокращение количества макрофагов по сравнению с первым контролем (рана под микрочастицами без пептида) и вторым контролем (открытая рана). Количество же фибробластов в исследуемых образцах грануляционной ткани напротив увеличилось.

Была выявлен^ одинаковая тенденция в изменении клеточного состава в процессе заживления на отпечатках и срезах (рис. К). 11), поэтому, в дальнейшем, для экспресс-агностики было предложено использовать отпечатки, а для более детального гистологического исследования приводить анализ срезов.

йг ^ ^ м г

Щшг- ^ - •**•« V

* 4 *

Рисунок У. Микрофотографии образцов срезов гр ануЛяциойной ткани, взятой из раны на 7 день после ранения, а. к - открытая рана (х 200; \ 1000). с. с! - рана закрыта РШЛ микрочастицами с инкапсулированным ТКАР-6 (\ 200; х 1000).

отпечлткн

сре

ма^фофдгн фньробласгы макрофаги фнброЬтзасты « контрольные ° мкрочастицы и открытая микрочастицы с ТНАР-б рана

отечапл]

CjliibI

ыщерофагн фHбробласть! макрофаги ф>|6р область]

I контрольные а микрочастицы а открыли микрочастицы cTRAP-й рана

Рисунок 10. Влияние и н капсулир ованного TRAP-® на коли нести о макрофагов и фнбробластов в грануляционной ткани, взятой из области резаной раны (модель на мышах) на 3-ий день после ранения

Рисунок I!. Влияние Инкапсулированного ТКАР-б на количество макрофагов и фнбробластов в грануляционной ткани, взятой из области резаной раны (модель на мышах) на 7-ой день после ранении

Анализ размеров ран показал, что на 7-ой день средний размер раны у опытных животных (покрытой микрочастицами с ТКЛР-6) был вдвое меньше, чем в случае

контроля (раны закрыты микрочастицами без пептида) и составлял 8,5% и 15,6 %, соответственно, от исходного, взятого за 100 %. В то же время для открытой раны этот размер составлял 28 % от исходного (рис. 12), Было также показано, что на 7-ой день средний размер ран, покрытых микрочастицами с Т'КАР-б(М), был практически в 3 раза меньше, чем в случае контроля (открытые раны).

Рисунок 12. Влияние инкапсулированного ТЛАР-6 на размер наружной раны. Исходный размер раны принят на 100%. Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов

Таким образом, было показано, что пептиды, инкапсулированные в PLGA микрочастицы действительно вовлечены в воспалительную и пролиферативную фазы репарации тканей и могут ускорять процесс заживления наружньгх ран,

7.2. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления язвы желудка

Эксперименты по заживлению язвы проводили на 25 самцах беспородных крыс. Животным под эфирным наркозом апплицировали ледяную уксусную кислоту на серозную оболочку желудка (1x1 см"). Через 2 часа после операции опытным животным (п=9) в желудок через зонд вводили 5 мг микрочастиц, содержащих TRAP-6, в 300 мкл 0.5% раствора алытшата Na. Контрольным животным 1-ой группы вводили физиологический раствор (500 мкл/200 г. веса животного) (п=6), а 2-ой группы - частицы без пептида (п=10) Образцы ткани желудка в области язвы, взятые на 3 и 7 сутки опыта, исследовали морфометрическим анализом.

Картина эксу дативного слоя язвы желудка у опытных животных на 3 день существенно отличается от контрольных групп, V животных контрольных групп среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы (более 70%) и макрофаги, процентное

120 - ¡¡Г тоо J 5 60, £60' 6 ад -^ 20 -ä Пл

а с ■ 1 день 3 день 7 день

о микрочастицы ■ контрольные в открытая с TRAP-6 микрочастицы рана

содержание которых составило у 1-й контрольной группы животных (введение физиологического раствора) - 24,9 %. а у 2-й (введение частиц без пептида) - 23%. На фоне массивной инфильтраций нейтрофилое и моноцитов/макрофагов, отека, неравномерного полнокровия сосудов, в о беи л контрольных группах были выявлены единичные йибробласты (рисунок 13Д), Достоверные различий показателей клеточного состава подсдизистого слоя желудка в этих контрольных группах выявлено не было.

'¿ЗВВЭ!

Рисунок 13. Морфологические изменения подели чистой оболочки желудка у крыс на 3 сутки эксперимента (п=11). Окраска гематоксилином и эозином (х 400). А -Контрольная группа - микрочастицы без Т1*ЛР-6. Среди клеточных элементов преобладают нейгрофилы, встречаются единичные макрофаги. Ь - Опытная группа (микрочастицы с ТДАР-б). Преобладают фибробласты, много макрофагов, встречаются единичные нейтрофилы. В -Содержание клеток (в %) на 3 сутки язвообразования в контрольных и опытной группах. Контрольная группа 1 - фиЗ. раствор; контрольная группа 2 микрочастицы оез ТКАР-б, опытная группа 3 - микрочастицы с ТКЛР-6; *р<0.05 по сравнению с контролем I; #р<0,05 по сравнению с контролем 2.

Вместе с тем у животных опытной группы, которым вводили микрочастицы с ТКЛР-6, уже на 3 сутки заживления воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контрольными животными. Мы наблюдали существенное увеличение (но сравнению с коптролями) клеток с типичными признаками фибробласгической

I 60

и Нейтрофилы [зМоно^тъЛмакрскргн »сЬьвробласп

дифференцировки, что может свидетельствовать об ускоренном созревании фибробластических предшественников, мигрирующих в раневую зону (рис. 13Б). В опытной группе содержание нейтрофилов было в 5-6 раз ниже, а макрофагов в 3 раза выше, чем в контрольных. Процентное содержание фибробласгов составило 23.9 %, что было более чем в 10 раг выше по сравнению с контрольными группами (рис. 13В). Таким образом, у животных, получавших микрочастицы с ТКЛР-6, отмечено ускорение ранней фазы заживления вследствие усиленной концентрации фибробласгов в область регенерации и их пролиферации.

На 7 день картины восстановительного процесса в подслизнсгом слое желудка у крыс опытной и контрольных групп также различаются. В грануляционной ткани опытных животных преобладают четко ориентированные фиброб ласхические элементы, около которых выявляется рыхлая сеть межклеточного матрикса.

Рясуко 14. Содержание клеток (в %) на 7 сутки заживления язв в контрольные и опытной группах.

Контрольная группа 1 - физиологический раствор, контрольная группа 2 микрочастицы без ТКАР-6, опытная группа 3 - микрочастицы с ТЯЛР-б); *р<0.05 по сравнению с контролем 1; # р<0.05 по сравнению с контролем 2.

Наблюдали обогащение зоны раны (по сравнению с контролем) оформленными тонкостенными капиллярами. В опытной группе мы отмечали статистически достоверное (по сравнению с контрольными группами) снижение количества макрофаг ов 20%) и увеличение количества фибробластов 10%) (рис, 14).

Из рисунка. 15 следует, что ТРАР-б(М), инкапсулированный в РЬСгА. микрочастицы методом двойной эмульсии, также ускоряет заживление ран,

3 день 7 день

Рисунок 15. Содержании клеток (в %) на 3 и 7 сутки язвообразования в конгро.тькых и опытной группах, контрольная группа - микрочастицы без ТКАР-б(М); опытная группа -микрочастицы с ТКАР-б(М).

МкфО'СйстацыМлкрочисгниы Микрочастицы Микрочастицы кошртль сТКЛР-«М) KrmipoJib с IMf-ttil

У животных контрольной группы на 3 день я зво обр аз о ванн я среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы (-70%) и макрофаги (-25%), а у животных опытной группы - макрофаги (-35%) и фибробласты (-55%). На 7 день заживления в опытной группе (микрочастицы с ТКАР-б(М)) количество макрофагов уменьшилось, а фибробластов увеличилось.

Таким образом, полученные данные исследования клеточного состава поде лизис то го слоя желудка крыс свидетельствуют о том, что использование микрочастиц с ТЯАР-б и ТКАР-б(М) на модели экспериментальной язвы активирует миграцию и пролиферацию фибробластов и клеток эндотелия. При этом происходило сокращение фазы воспаления и сдвиг фазы пролиферации на более ранние сроки, что приводило к ускорению процесса заживления экспериментальных язв желудка у крыс. Мы полагаем, что на основе инкапсулированных пептидов могут быть созданы новые эффективные препараты с контролируемым выходом пептидов для терапии наружных и внутренних ран.

1. Синтезирован новый пептид TRAP-6(M) и изучена его биологическая активность методом агрегации тромбоцитов. Показано, что замещение одной аминокислоты в агонисте тромбинового рецептора TRAP-6 (agonist PAR-1) позволяет сохранить способностью TRAP-6 (М) активировать рецептор PAR-1.

ВЫВОДЫ

2. Разработаны и оптимизированы методы (двойной и простой эмульсии) инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(M) в биодеградируемые биосовместимые PLGA микрочастицы.

3. Исследованы некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (в частности, распределение их по размерам, морфология поверхности и скорость деструкции in vitro).

4. Исследована кинетика выхода пептидов из микрочастиц. Показано, что параллельно с выходом пептидов происходят процессы адсорбции/десорбции на/с поверхности PLGA микрочастиц, причем характер этой адсорбции зависит от типа пептида.

6. Впервые продемонстрирован положительный эффект TRAP-6(M) на процесс репарации тканей.

7. Показано, что инкапсулированные пептиды TRAP-6 и TRAP-6(M) ускоряют заживление кожных резаных ран и язвы желудка в моделях на мышах и крысах.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Сташевская К.С., Марквичева Е.А., Струкова С.М., Русанова А.В., Макарова A.M., Горбачева JI.P., Прудченко И.А., Зубов В.П., Грандфис К. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. Биомедицинская химия, 2006, 52(1): 83-94.

2. Русанова А.В., Макарова A.M., Струкова С.М., Марквичева Е.А., Горбачева Л.Р., Сташевская К.С., Васильева Т.В., Сидорова Е.И., Беспалова Ж.Д., Грандфис К. Пептид-агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процессы на модели язвы желудка у крыс. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2006, 142(7): 42-46.

3. Markvicheva Е., Stashevskaya К., Strukova S., Prudchenko I., Rusanova A., Makarova A., Vasilieva Т., Bespalova J., Grandfils Ch. Biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide for gastric ulcer treatment in rats. J. Drug Del. Sci. Tech. 2006, 16(4): 321-325.

4. Markvicheva E., Stashevskaya K., Strukova S., Grandfils Ch. Microparticles loaded with PAR-1 agonist peptide for tissue repair, Proceedings of the Annual Meeting of German Society for Cell Biology (29 March -1 April 2006, Braunschweig, Germany), Eur. J. Cell. Biol. (2006), V. 85 SI, Suppl 56, p. 38.

5. Markvicheva E., Selina O., Stashevskaya K., Svirshchevskaya E., Grandfils Ch., Sukhorukov G. Microcapsules/microparticles loaded with biologically active molecules for medicine. The 1st South East European Congress on Chemical Engineering (Belgrade, Sept. 25-28,2005). Proceedings, p. 70.

6. Markvicheva E., Stashevskaya K., Grandfils Ch. Bioencapsulated peptides: preparation and application for wound healing, XIII International workshop on Bioencapsulaiton (Kingston, Canada, 24-26 June, 2005), Proceedings, pp. 19-20.

7. Rumsh L.D., Kaliberda E.N., Novikova N.I., Stashevskaya K.S.. Murashev A.N., Markvicheva E.A., Akopova T.A., Zelenski A.N., Vorozhtsov G.N., Feldman B.M., Plotnikova N.M., Kosacheva T.P. Development and study of matrix-based formulations w ith entrapped biologically active compounds for skin repair. XIII International conference "New Information Technologies in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology" (Gurzuf, Ukraine, May 31-9 June, 2005) Proceedings, p. 273-274.

8. Акопова T.A., Марквичева E.A., Сташевская K.C., Чернышенко А.О., Жорин В.А., Румш Л.Д., Зеленский А.Н. Механохимический синтез систем с пролонгированным выделением терапевтических агентов для лечения ран. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (Щелково, 26-27 мая 2005 г.), Тезисы докладов стр. 502-506.

9. Сташевская К.С., Марквичева Е.А., Грандфис К., Зубов В.П. с иммобилизованным пептидом для ранозаживления, XVII зимняя молодежная научная школа. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 7-10 февраля 2005). Тезисы докладов, стр. 26.

10 Markvicheva Е., Dugina Т., Grandfils Ch., Lange М., Stashevskaya К., Vasilieva Т., Rumsh L., Strukova S., Application of bioencapsulated proteinases and peptides for wound healing. Charter 12, In: Advanced Biomaterials for Medical Applications, Series II Mathematics, Physics and Chemistry, Thomas D.W. (Ed.), Kluwer Academic Publishers: Dordrecht-Boston-London, 2004, pp. 165-176.

11. Сташевская K.C., Марквичева E.A., Дугина Т.Н., Струкова С М., Грандфис К. Биосовместимые биодеградируемые полимерные микрочастицы с иммобилизованным пептидом для терапии ран". Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова. (Москва, 4-7 октября 2004). Тезисы стендовых сообщений, стр.43.

12. Stashevskaya К., Grandfils Ch., E.Markvicheva, S.Strukova, In vitro study of thrombin receptor agonist peptide release from PLGA microbeads, XII International workshop on bioencapsulation (24-26 September, 2004, Vitoria, Spain), abstracts, p. 295-298.

13. Stashevskaya K., Markvicheva E., Dugina Т., Strukova S., Grandfils Ch., Optimization of the encapsulation of Thrombin Receptor Agonist Peptide in PLGA microbeads, XVIIth Aachen Colloquium on Biomaterials (Aachen, Germany, 4-5 March, 2004), abstracts, p. 26.

Принято в печать 13 декабря 2006

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 25120632

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912У772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2. Тел. 740-76-47,125-22-73. Ь|1п://>у№\у.univerprint.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Сташевская, Кира Сергеевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы регенерации тканей.

1.1.1. Особенности заживления кожных ран

1.1.2. Особенности заживления язвы желудка.;.

1.2. Покрытия для терапии ран.

1.3. Биологически активные вещества, ускоряющие репарацию тканей.

1.3.1. Факторы роста.

1.3.2. Тромбин.

1.3.3. Пептиды, имитирующие действие тромбина.

1.4. Системы доставки БАВ и методы их получения.

1.4.1. Микрочастицы и микрокапсулы.

1.4.2. Методы капсулирования БАВ в биосовместимые полимерные микрочастицы и микрокапсулы.

1.4.2.1. Метод простой эмульсии (В/М).

1.4.2.2. Метод двойной эмульсии (ТВ/М/В).

1.4.2.3. Метод двойной эмульсии (В1/М/В2).

1.4.3. Полимерные материалы для капсулирования БАВ.

1.4.3.1. Сополимеры молочной и гликолевой кислот.

1.4.3.1.1. Основные характеристики Р1ЛА.

1.4.3.1.2. Механизм и особенности деструкции РЬОА.

1.4.3.1.3. Механизм выделения БАВ из РЬОА микрочастиц.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины"

Одной из сложнейших задач современной биомедицины, а также одной из центральных проблем фундаментальной биохимии, является репарация тканей после повреждения. В настоящее время известно большое число биологически активных веществ (БАВ), влияющих на эффективность регенерации животных тканей. Например, компоненты матрикса раны (фибронектин [1], гиалуроновая кислота [2], различные факторы роста [3] глокозаминогликаны [4] и т.д.), БАВ растительного происхождения (подорожник [5], алоэ [6] и т.д.). Под влиянием различных БАВ происходит улучшение обменных процессов, ускорение регенерации тканей, стимуляция неспецифического иммунитета. Препараты на основе БАВ, используемые в фазах регенерации и рассасывания рубца с эпителизацией, должны обладать определенными свойствами: стимулировать регенеративные процессы, способствуя росту грануляций и ускорению эпителизации, защищать грануляционную ткань от вторичной инфекции и подавлять рост микрофлоры в ране.

Среди прочих биологически активных веществ, способных ускорить процесс заживления ран, повышенное внимание в последнее время уделяется белкам и пептидам (гормонам, различным факторам роста др.). Особое место среди них занимает тромбин (сериновая протеаза семейства трипсина), который, являясь фактором роста, не только регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, но также включается в воспалительную и пролиферативную фазы ранозаживления, стимулируя при этом пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и продукцию последними коллагена. Однако применение тромбина ограничено его высокой лабильностью и высокой стоимостью. Ранее в ИБХ РАН для стабилизации тромбина был разработан метод его инкапсулирования в пленки биосовместимого гидрогеля и продемонстрировано ускорение процесса заживление наружных ран под этими покрытиями в моделях in vivo. Кроме того, возможно еще одно решение данной проблемы. Некоторые синтетические пептиды могут имитировать действие тромбина в процессе регенерации ткани. Являясь более дешевыми по сравнению с тромбином, пептиды, однако, очень быстро расщепляются пептидазами в организме.

Разработка транспортных форм с контролируемым выделением пептидов, а именно, их капсулирование в биосовместимые полимерные матрицы позволит, как защитить пептиды от разрушения, так и направленно регулировать скорость их выхода in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы.

Использование полиэфиров на основе молочной и гликолевой кислот позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены для лечения как внешних, так и внутренних ран (раны после хирургических вмешательств, язвы и др.). Варьируя состав полимерной матрицы, размеры микрочастиц, количество капсулированных пептидов, можно контролировать скорость их выхода. Период выхода может варьироваться от нескольких часов до нескольких недель, в зависимости от свойств используемого полимера. Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось капсулирование биологически активных веществ, в частности, пептида-агониста тромбинового рецептора TRAP-6 (thrombin receptor agonist peptide) и его аналога TRAP-6(M) в биосовместимые биодеградируемые микрочастицы на основе сополимера (d,l)-молочной и гликолевой кислот (PLGA) и исследование возможности применения этих пептидов для репарации тканей.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить биологическую активность пептидов in vitro.

2. Разработать и оптимизировать метод инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(М) в PLGA микрочастицы.

3. Исследовать некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (распределение микрочастиц по размерам, морфологию поверхности и скорость их деструкции in vitro).

4. Исследовать кинетику выхода пептидов из микрочастиц, а также их адсорбцию на поверхность микрочастиц in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сташевская, Кира Сергеевна

выводы

5. Впервые продемонстрирован положительный эффект TRAP-6(M) на процесс репарации тканей.

6. Показано, что инкапсулированные пептиды TRAP-6 и TRAP-6(M) ускоряют заживление кожных резаных ран и язвы желудка в моделях на мышах и крысах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарен И.А. Прудченко за синтез пептидов TRAP-6 и TRAP-6(M), С.М. Струковой за сотрудничество при исследовании эффективности пептидов, инкапсулированных в микрочастицы in vivo на моделях кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс, Ш. Шуженс за помощь в проведении эксперментов. Отдельная благодарность научным руководителям Марквичевой Е.А. и Грандфису К. за возможность ознакомиться с широкими практическими навыками при выполнении этой работы, помощь в проведении экспериментов, своевременные и полезные советы, а также плодотворные обсуждения и помощь в подготовке этой работы.

1.5. Заключение

Разработка перспективных транспортных форм с контролируемым высвобождением активного вещества является одним из важнейших направлений современных исследований. Как следует из обзора литературы, для ускорения заживления ран представляется интересным использование пептидов-агонистов рецептора тромбина. Капсулирование таких пептидов в микрочастицы на основе РЬвА может позволить получить новые эффективные препараты с контролируемым выделением пептидов для заживления различных ран.

2. ЭКСПЕРИМЕНТНАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. Материалы 2.1.1. Реагенты

В работе были использованы следующие синтетические пептиды, синтезированные в Лаборатории химии пептидов ИБХ РАН:

- TRAP-6: Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-NH2 (Mw 976 Да).

- TRAP-6(M): модифицированный TRAP-6.

- PLGA: (Resomer RG 503 P(D,L-)LA/GA: (50/50); Mw 24,6 кДа, Mn 14,3 кДа, [т\]

- 0.4 дл/г) производства фирмы «Boehringer Ingelheim» (Германия).

- Желатин - типа A (G2500) производства фирмы «Sigma» (США).

- Поливиниловый спирт (ПВС): (Mw 18 кДа, ацетатных групп - 17%) марки Mowiol VP 3-83, производства фирмы «Hoechst» (Германия).

2.1.2. Буферные растворы

Буфер для исследования кинетики выхода и адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности PLGA микрочастиц: (HEPES (5 mM) NaN3 - 0.001 %, pH 7,5); Буфер для исследования биологической активности пептидов: фосфатно-солевой буфер (PBS): (Na2HP04 (5 mM) /КН2Р04 (5 mM), NaCl - 0.9 %, pH 7,2) производства фирмы Henogen (Бельгия).

2.1.3. Растворители

Использовали сл едущие растворители марки х.ч.: метиленхлорид (113460025), ацетонитрил (258560010) и толуол (176850010) производства фирмы Acros Organics (Бельгия); этилацетат (А3611) производства фирмы

Labscan (Бельгия); диметил сульфоксид - DMSO (16785.04) производства Janssen Chimica (Бельгия); тетрагидрофуран - THF (8075) и ацетон (8003) производства фирмы Mallinckrodt Baker (Голландия).

2.2. Лабораторное оборудование

В работе использовали гомогенизатор Omni International 2000; термостатируемую качалку SW 20С (Julabo); механическую мешалку RW20 (ПСА) с диаметром пропеллера 2.5 см; тахометр DZM1 (Ika-Tron); бумажные фильтры диаметром 10 см (Schleicher & Schuell) и диаметром 7 см (Whatman); световой микроскоп OLYMPUS PROVIS АХ-70 с камерой Olympus DP50; сканирующий электронный микроскоп JSM-840 (JEOL); установку для напыления Au-PD слоя SCP-20 (Sputtering Balzer); счетчик частиц Coulter Multisizer II (Beckman); центрифугу Allegra 21R (Beckman); лиофилизатор Speed Vac (Savant); хроматограф «System Gold», (Beckman), оснащенный градиентным насосом 126, UV детектором 166, колонкой С18 125 х 4 мм (Lichrosphere 100 Merck) и автосамплером (Hitachi/Merck L7200); установку для очистки воды Simlicity (Millipore); весы аналитические (Mettler РМ460); автоматические микропипетки (Pipetman); стеклянные пробирки PCS (5 мл); полипропиленовые пробирки (5 мл); полипропиленовые пробирки Eppendorf (0,5 мл), Пастеровские стеклянные пипетки длиной 230 мм (Deltalab), стеклянные конические колбы (250 мл), шейкер Vortex RX-3 (Velp, Италия), магнитную мешалку MR1000 (Heidolph), водяную баню TW-2 (Julabo), лиофилизатор ALPHA 1-4 LD (Martin Christ).

2.3. Методы

2.3.1. Капсулирование пептидов методом двойной эмульсии (В|/М/В2)

Процесс получения микрочастиц с методом В|/М/В2 состоит из 3-х стадий (рис. 13):

1) Приготовление первичной эмульсии. Первичную эмульсию В|/М получают гомогенизацией внутренней водной фазы, представленной раствором пептида, и внешней органической фазы, представленной раствором РЬОА в метнленхлориде. Первичная эмульсия стабилизируется желатином.

2) Эмульгирование первичной эмульсии во вторичной видной фазе, представленной раствором ПВС, с образованием двойной эмульсии В1/М/В2;

3) Испарение растворителя с образованием твердых микрочастиц.

-N м X1 о ••••• сч

Р1СА + Пептид Желатин

СН2С12 Растворитель А

В,/М

В/М/Вг

Твердые микрочастицы

Рис. 13. Схема получения капсулиронапия ТЯАР-б и ТЯАР-6{М) в Р1,ОА микрочастицы методом В1/М/В2

Для капсулирования пептидов были приготовлены следующие растворы:

- 0,703 г PLGA растворяли в 6,37 мл метиленхлорида в стеклянном флаконе (10 мл) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре;

- 12,5 мг TRAP-6 и 10.1 мг TRAP-6(M) растворяли в 750 мкл деионизированной воды в стеклянной пробирке PCS при комнатной температуре;

- 0,2 г желатина растворяли в 1 мл деионизированной воды в стеклянной пробирке PCS при 50°С на водяной бане в течение 1 часа;

- 3,75 мг ПВС растворяли в 150 мл деионизированной воды в конической стеклянной колбе (250 мл) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа при RT;

Первичную эмульсию получали из растворов, нагретых до температуры 40°С. Для получения первичной эмульсии, 300 мкл 1,6 % раствора пептида добавляли к 100 мкл 20% раствора желатина и перемешивали в течение 30 сек при помощи гомогенизатора Omni International 2000 (скорость п° 2). К полученной дисперсии водной фазы, не прекращая перемешивания, добавляли 1,8 мл раствора PLGA.

Добавив раствор полимера, увеличивали скорость перемешивания (п°3-4) и продолжали процесс еще 30 с. Далее полученную первичную эмульсию (Bj/M) добавляли к 30 мл вторичной водной фазы (2,5 % раствор ПВС), находящейся в термостатируемой качалке (Julabo SW 20С) при 15°С и перемешиваемой со скоростью 500 об/мин механической мешалкой (IKA RW20, тахометр Ika-Tron: DZM1). Перемешивание продолжали 15 мин при 15°С для получения вторичной эмульсии (В1/М/В2). Затем температуру увеличивали до 30°С и продолжали перемешивание еще 30 мин до полного испарения растворителя. К полученной суспензии микрочастиц добавляли 40 мл деионизированной воды комнатной температуры и останавливали процесс через 1 мин. Осажденные микрочастицы промывали на бумажном фильтре (Whatman/Schleicher & Schuell) и лиофильно сушили. После лиофилизации микрочастицы взвешивали и перемещали из бумажных фильтров в пластиковые пробирки Eppendorf. Микрочастицы хранили при - 25°С до проведения последующих анализов. Количественный выход тщательно промытых и лиофильно высушенных микрочастиц определяли как процентное отношение массы частиц к суммарной массе полимера и пептида по формуле:

Мм/ч

М= —-- :|:100%

-^пол + М-пепт

•■пол где Мм/, - масса промытых и лиофильно высушенных микрочастиц; Мп масса и Мпепт - соответственно массы полимера и пептида, использованных для микрокапсулирования.

2.3.2. Капсулирование пептидов методом простой эмульсии (В/М)

Капсулирование проводили в стеклянной пробирке с использованием этилацетата или смеси метиленхлорид/ацетон (90/10% масс.). Метод заключался в диспергировании пептида в твердом виде непосредственно в этилацетате и в смеси метиленхлорид/ацетон, содержащих PLGA, а последовательность всех последующих операций была, как описано ранее для метода Bi/M/B2 (см. главу Экспериментальная часть, п/п 2.3.1.).

2.3.3. Исследование стабильности двойной эмульсии и распределения

PLGA микрочастиц по размерам

Наблюдение и фотографирование для исследования стабильности капель двойной эмульсии проводили с помощью светового микроскопа (Olympus PROVIS АХ 70), оснащенного камерой (DP 50). Аликвоту суспензии капель двойной эмульсии отбирали непосредственно после внесения первичной эмульсии (В[/М) во вторичную водную фазу. ч

Определение формы и распределения по размерам лиофильно высушенных контрольных микрочастиц и микрочастиц с пептидами также проводили с помощью светового микроскопа. Распределение микрочастиц по размерам определяли с помощью программного обеспечения (Lucia Karyo). Подсчитывали количесто частиц различного размера, оказавшихся в поле зрения микроскопа. Процедуру повторяли несколько раз, сдвигая поле микроскопа на новое место. По результатам анализа строили зависимость суммарного объема частиц от их размера.

2.3.4. Получение образцов для исследований

2.3.4.1. Получение образцов для исследования скорости деструкции PLGA микрочастиц

Для получения образцов в стеклянные пробирки (32 х 11,5 мм; 1,5 мл; Merck), содержащие 0,5 мл буферного раствора HEPES (pH 7,5), вносили, по 5 мг микрочастиц с пептидами и контрольных микрочастиц. Из каждого образца отбирали (0,1 мг) микрочастиц до инкубации и через 1 день, 2 дня, 5 дней, 7 дней, и 15 дней после начала инкубации. После инкубирования образцы микрочастиц трижды промывали деионизированной водой для очистки от солей и лиофильно высушивали. Образцы микрочастиц хранили при -25°С до проведения анализа.

2.3.4.2. Получение образцов для исследования кинетики выхода пептидов и их адсорбции/десорбции с/на поверхности PLGA микрочастиц

Для получения образцов в стеклянные пробирки PCS, содержащие 1 мл буферного раствора HEPES (pH 7,5), вносили:

1) 10 мг микрочастиц с пептидами (для исследования кинетики выхода пептидов);

2) 10 мг контрольных микрочастиц и 0,2 мг пептида (для исследования адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности микрочастиц);

3) 0,2 мг пептида (для контролирования стабильности пептида в буферном растворе).

Полученные образцы инкубировали в термостатируемой качалке Julabo SW 20С (37°С, 100 об/мин). Из каждого образца в стеклянные пробирки для автосэмплеров проб ВЭЖХ (1,5 мл; Waters) через 5 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч, 8 ч, 1 день, 2 дня, 5 дней, 7 дней и 15 дней после начали инкубации отбирали следующие аликвоты супернатантов:

1) 100 мкл из инкубируемых образцов, содержащих 0,2 мг пептида;

2) 750 мкл из образцов, содержащих контрольные микрочастицы и 0,2 мг пептидов.

3) 750 мкл из образцов, содержащих микрочастицы с пептидами.

Вместо отобранных аликвот супернатантов в каждый образец добавляли соответствующий объем буферного раствора.

Аликвоты супернатантов хранили при -25°С до проведения экспериментов.

2.3.4.3. Получение образцов для исследования биологической активности пептидов

Образцы для исследования методом агрегации тромбоцитов получали разбавлением буфером PBS (рН 7,2) исходных водных растворов пептидов (10 мМ) по схеме, приведенной в таблице 2.

Растворы пептидов в концентрациях 2, 5, 10, 20, 40 мкМ использовали для построения калибровочной кривой и определения значений полумаксимальной стимулирующей концентрации пептидов. Растворы пептидов (10 мкМ) использовали для исследования стабильности каждой используемой фракции отп.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Сташевская, Кира Сергеевна, Москва

1. K.M. Yamada. Fibronectin peptides in cell migration and wound repair. - J. Clin. 1.vest., 2000, v. 105, N 11, p. 1507-1509.

2. S.R. King, W.L. Hickerson, K.G. Proctor. Beneficial actions of hyaluronic acid on wound healing. Surgery, 1991, v. 109, N 1, p. 76-84.

3. G.F. Pierce, T.A. Mustoe, B.W. Altrock, T.F. Deuel, A. Thomason. Role of platelet-derived growth factor in wound healing. J. Cell. Biochem., 2004, v. 45, N4. p. 319-326.

4. P.V. Peplow. Glycosaminoglycan: a candidate to stimulate the repair of chronic wounds. Thromb. Haemost., 2005, v. 94, N 1, p. 4-16.

5. A.B. Samuelsen. The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. J. Ethnopharmacol., 2000, v. 71, N 1-2, p. 1-21.

6. S.W. Choi, B.W. Son, Y.S. Son, Y.I. Park, S.K. Lee, M.H. Chung. The wound healing effect of a glycoprotein fraction isolated from aloe vera. Br. J. Dermatol., 2001, v. 145, N4, p. 535-545.

7. R.A.F. Clark. Wound repair: Overview and general considerations. In: The Molecular and Cell Biology of Wound Repair. Second Edition. (R.A.F. Clark - Ed.), Plenum Press, New York, 1996, p. 3-50.8. http://connection.lww.com/Products/porth7e/Ch20.asp

8. L. Russel. Understanding physiology of wound healing and how dressings can help. Br. J. Nurs., 2000, v. 9, N 1, p. 10-21.

9. P. Martin. Wound healing aiming for perfect skin regeneration. - Science, 1997, v. 276, p. 75-81.

10. D.J. Cullen, B.J. Collins, K.J. Christiansen, J. Epis, J.R. Warren, I. Surveyor, K.J. Cullen. When is Helicobacter pylori infection acquired? Gut., 1993, v. 34, N 12, p. 1681-1682.

11. J.R. Warren. Gastric pathology associated with Helicobacter pylori. -Gastroenterol. Clin. North. Am., 2000, v. 29, N 3, p. 705-751.13. http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/PGC03E.html

12. M. Bradley, N. Cullum, E.A. Nelson, M. Petticrew, T. Sheldon, D. Torgerson. Systematic reviews of wound care management: (2) Dressings and topical agents used in the healing of chronic wounds. Health. Technol. Assess., 1999; v. 3, N 17, p. 1-35.

13. T. Natsume, 0. Ike, T. Okada, N. Takimoto, Y. Shimizu, Y. Ikada. Porous collagen sponge for esophageal replacement. J. Biomed. Mater. Res., 1993, v. 27, N 7, p. 867-875.

14. J.A. Rowley, G. Madlambayan, D.J. Mooney. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials, 1999, v. 20, N 1, p. 45-53.

15. K. Lay-Flurrie. The properties of hydrogel dressings and their impact on wound healing. Prof. Nurse., 2004, v. 19, N 5, p. 269-273.

16. Z. Wu, Z. Sheng, T. Sun, M. Geng, J. Li, Y. Yao, Z. Huang. Preparation of collagen-based materials for wound dressing. Chin. Med. J., 2003, v. 116, N 3, p. 419-423.

17. H.C. Segal, B.J. Hunt, K. Gilding. The effects of alginate and non-alginate wound dressings on blood coagulation and platelet activation. J. Biomater. Appl., 1998, v. 12, N 3, p. 249-257.

18. H. Ueno, H. Yamada, I. Tanaka, N. Kaba, M. Matsuura, M. Okumura, T. Kadosawa, T. Fujinaga. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs. Biomaterials, 1999, v. 20, N 15, p. 1407-1414.

19. L. Morris. Clinical efficacy of C-View transparent film wound dressing. Br. J. Nurs., 2001, v. 10, N 9, p. 616-620.

20. CJ. Doillon. Porous collagen sponge wound dressings: in vivo and in vitro studies. J. Biomater. Appl., 1988, v. 2, N 4, p. 562-578.

21. S. Thomas. Hydrocolloids update. J. Wound Care, 1992, v. 1, p. 27-30.

22. V. Jones. Alginate dressings and diabetic foot lesions. Diab. Foot., 1999, v. 2, p. 8-14.

23. S. Thomas, N.P. Hay. Assessing the hydroaffinity of hydrogel dressings. J. Wound Care, 1995, v. 3, p. 89-91.

24. S. Werner, R. Grose. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol. Rev., 2003, v. 83, p. 835-870.

25. D.G. Greenhalgh. The role of growth factors in wound healing. J. Trauma, 1996, v. 41, p. 159-167.

26. G.S. Schultz, M. White, R. Mitchel, G. Brown, J. Lynch, D.R. Twardzik, G.J. Todaro. Epithelial wound healing enhanced by transforming growth factor-a and vaccinia growth factor. Science, 1987, v. 235, p. 350-352.

27. D.L. Steed. Modifying the wound healing response with exogenous growth factors. Clin. Plast. Surg., 1998, v. 25, p. 397-405.

28. S.T. Schuschereba, P.D. Bowman, R.E. Ferrando, D.J. Lund, J.A. Quong, J.A. Vargas. Accelerated healing of laser-injured rabbit retina by basic fibroblast growth factor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, v. 35, p. 945-954.

29. R. Tsubai, D.B. Rifkin. Recombinant basic fibroblast growth factor stimulates wound healing in healing-impaired db/db mice. J. Exp. Med., 1990, v. 172, p. 245251.

30. S.E. Lynch, R.B. Colvin, H.N. Antoniades. Growth factors in wound healing. Single and synergistic effects on partial thickness porcine skin wounds. J. Clin. Invest., 1989, v. 84, p. 640-646.

31. R.A. Clark. Regulation of fibropasia in cutaneous wound repair. Am. J. Med.

32. Sci., 1993, v. 306, p. 42-48.

33. C.H. Heldin, B. Westermark. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol. Rev., 1999, v. 79, p. 1283-1316.

34. T.G. Terrell, P.K. Working, C.P. Chow, J.D. Green. Pathology of recombinant human transforming growth factor-beta 1 in rats and rabbits. Int. Rev. Exp. Pathol., 1993, v. 34, p. 43-67.

35. P. Carmeliet. VEGF gene therapy: stimulating angiogenesis or angioma-genesis? -Nat. Med, 2000, v. 6, p. 1102-1103.

36. N. Celebi, N. Erden, B. Gonul, M. Koz. Effects of epidermal growth factor dosage forms on dermal wound strength in mice. J. Pharm. Pharmacol, 1994, v. 46, p. 386-387.

37. C.K. Derian, B.P. Damiano, M.R. D'Andrea, P. Andrade-Gordon. Thrombin Regulation of Cell Function through Protease-Activated Receptors: Implications for Therapeutic Intervention. Biochemistry, 2002, v. 67, N. 1, p. 56-64.

38. SR. Coughlin, E. Camerer. PARticipation in inflammation. J. Clin. Invest, 2003, v. Ill, p. 25-27.

39. R.C. Chambers, K. Dabbagh, R.J. McAnulty, A.J. Gray, O.P. Blanc-Brude, G.J. Laurent. Thrombin stimulates fibroblast procollagen production via proteolytic activation of protease-activated receptor 1. Biochem J, 1998, v. 333, N 1, p. 121127.

40. K. Dabbagh, G.J. Laurent, R.J. McAnulty, R.C. Chambers. Thrombin stimulates smooth muscle cell procollagen synthesis and mRNA levels via a PAR-1 mediated mechanism. Thromb. Haemost, 1998, v. 79, N 2, p. 405-409.

41. R.J.A. Grand, A.S. Turnell, P.W. Grabham. Cellular consequences of thrombin-receptor activation. Biochem J., 1996, v. 313, p. 353-368.

42. T.K. Vu, D.T. Hung, V.I. Wheaton, S.R. Couglin, Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell, 1991, v. 64, N 6, p. 1057-1068.

43. R.E. Gerszten, J. Chen, M. Ishii, L. Wang, T. Natevicz, C.W. Turk, T.K. Vu, S.R. Couglin. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature, 1994, v. 368, N 6472, p. 648-651.

44. W.F. Bahou, J.L. Kutlok, A. Wong, C.L. Potter, B.S. Coller. Identification of a novel thrombin receptor sequence required for activation-dependent responses. -Blood, 1994, v. 84, N 12, p. 4195-202.

45. S.M. Strukova, T.N. Dugina, I.V. Chistov, E.A. Markvicheva, S.V. Kuptsova, E.G. Kolokol'chikova, L.D. Rumsh, V.P. Zubov, E. Gluza. Thrombin a regulator of reparative processes in wound healing. - Bioorg Khim., 1998, v. 24, N 4, p. 288-292.

46. R.R Vassalo, T. Kieber-Emmons, K. Cichowski, L.F. Brass. Structure-function relationships in the activation of platelet thrombin receptors by receptor-derived peptides. J. Biol.Chem., 1992, v. 267, p. 6081-6085.

47. T.K. Vu, D.T. Hung, V.I. Wheaton, S.R. Coughlin. Cell, 1991, v. 64, p. 10571068.

48. E. Van Obberghen-Schilling, U.B. Rasmussen, V. Vouret-Craviari, K.U. Lentes, A. Pavirani, J. Pouyssequr. Structure-activity analysis of synthetic alpha-thrombin-receptor-activating peptides. Biochem. J., 1993, v. 292, p. 667-671.

49. V. Vouret-Craviari, E. Van Obberghen-Schilling, J.C. Scimeca, E. Van Obberghen, J. Pouyssequr. Differential activation of p44mapk (ERK1) by alpha-thrombin and thrombin-receptor peptide agonist. Biochem. J., 1993, v. 289, p. 209214.

50. A. Kawabata. The G Protein-Coupled Protease Receptor PAR (Protease-Activated Receptor) as a Novel Target for Drug Development. Yakugaku Zasshi, 2001, v. 121, N 1, p. 1—7.

51. S.M. Strukova, T.N. Dugina," I.V. Chistov, M. Lange, E.A. Markvicheva, S. Kuptsova, V.P. Zubov, Glusa E. (2001) Immobilized thrombin receptor agonist peptide accelerates wound healing in mice. Clin. Appl. Thromb. Hemost., 2001, v. 7, N4, p. 325-329.

52. K, Petrak. Essential properties of drug-targeting delivery systems. Drug Discov. Today, 2005, v. 10, N 23-24, p. 1667-1673.

53. L.M. Mainardes, L.P. Silva. Drug delivery systems: past, present, and future. -Curr. Drug. Targets, 2004, v. 5, N 5, p. 449-455.

54. Л.И. Валуев, Т.А. Валуева, И.JI. Валуев, Н.А. Платэ. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных веществ. Усп. Биол. Хим., 2003, т. 3, с. 307-328.

55. D. Eisenbud, Н. Hunter, L. Kessler, К. Zulkowski. Hydrogel wound dressings: where do we stand in 2003? Ostomy Wound Manage, 2003, v. 49, N 10, p. 52-57.

56. C. Dai, B. Wang, H. Zhao, B. Li, J. Wang. Preparation and characterization of liposomes-in-alginate (LIA) for protein delivery system. Colloids. Surf. В Biointerfaces, 2006, v. 47, N 2, p. 205-210.

57. R. Singh, S.P. Vyas. Topical liposomal system for localized and controlled drug delivery. J. Dermatol. Sci., 1996, v. 13, p. 107-111.

58. F. Gu, B. Amsden, R. Neufeld. Sustained delivery of vascular endothelial growth factor with alginate beads. J. Control. Release, 2004, v. 96, N 3, p. 463-472.

59. S. Dumitriu. Polymeric Biomaterials. 2nd Ed. Marcel Dekker, New York, 2002. 79. М.И. Штильман. Полимеры в биологически активных системах. -Соросовский образовательный журнал, 1998, v. 4, N 5, р. 48-53.

60. K.S. Soppimath, Т.М. Aminabhavi, A.R. Kulkarni, W.E. Rudzinski. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. J. Control. Release, 2001, v. 70, p. 1-20.

61. M.H. Lameiro, A. Lopes, L.O. Martins, P.M. Alves, E. Melo. Incorporation of a model protein into chitosan-bile salt microparticles. Int. J. Pharm., 2006, v. 312, N 1-2, p. 119-130.

62. A. Grenha, B. Seijo, C. Remunan-Lopez. Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery. Eur. J. Pharm. Sci., 2005, v. 25, N 4-5, p. 427-437.

63. G. Lambert, E. Fattal, P. Couvreur. Nanoparticulate systems for the delivery of antisense oligonucleotides. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2001, v. 47, N 1, p. 99-112.

64. G. De Rosa, F. Quaglia, M. La Rotonda, M. Besnard, E. Fattal. Biodegradable microparticles for the controlled delivery of oligonucleotides. Int. J. Pharm., 2002, v. 242, N1-2, p. 225-228.

65. Y. Hattori, Y. Maitani. Folate-linked lipid-based nanoparticle for targeted gene delivery. Curr. Drug. Deliv., 2005, v. 2, N 3, p. 243-252.

66. L. Lu, M.J. Yaszemski, A.J. Mikos. TGF-B1 Release from Biodegradable

67. Polymer Microparticles: Its Effects on Marrow Stromal Osteoblast Function. The Journal of Bone and Joint Surgery, 2001, v. 83, p. 82-92.

68. D.T. Birnbaum, L. Brannon-Peppas. Microparticle drug delivery systems. In: Drug Delivery Systems in Cancer Therapy. (Brown D.M. Ed.) pp. 117-136, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003.

69. R.P. Batycky, J. Hanes, R. Langer, D.A. Edwards. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J. Pharm. Sci, 1997, v. 86, N12, p. 1464-1477.

70. C.S. Brazel, N.A. Peppas. Modelling of drug release from swellable polymers. -Eur. J. Pharm. Biopharm, 2000, v. 49, N 1, p. 47-58.81. http://www.drugdel.com/polymer.htm

71. S. Freitas, H.P. Merkle, B. Gander Microencapsulation by solvent extraction/evaporation: reviewing the state of the art of microsphere preparation process technology. J. Control. Release, 2005, v. 102, p. 313-332.

72. I.D. Rosea, F. Watari, M. Uo. Microparticle formation and its mechanism in single and double emulsion solvent evaporation. J. Control. Release, 2004, v. 99, N 2, p. 271-280.

73. C.H. Chang, S.M. Tung, D.W. Lu, M.K. Yeh. In vitro and in vivo evaluation of an ocular delivery system of 5-fluorouracil microspheres. J. Ocul. Pharmacol. Ther, 2001, v. 17, N 6, p. 545-553.

74. Vracken M.N, Claeys. 3.526.906. Unated States Patent Office. 1970.

75. De Jaeger N.C, Tavernier B.H. 1.405.108. British Patent. 1971.

76. N. Nihant, Ch. Shugens, Ch. Grandfils, R. Jerome, Ph. Teyssie. Polylactide microparticles prepared by double emulsion/evaporation technique. I. Effect of primary emulsion stability. Pharmaceutical Research, 1994, v. 11, N 10, p. 14791484.

77. N. Nihant, Ch. Schugens, Ch. Grandfils, R. Jerome, Ph. Teyssie. Polulactide microparticles prepared by double emulsion-evaporation. II. Effect of poly(lactideco-glycolide) composition on the stability of the primary and secondary emulsions.

78. J. Colloid. Interfacal. Sci., 1995, v. 173, p. 55-65.

79. N.B. Viswanathan, P.A. Thomas, J.K. Pandit, M.G. Kulkarni, R.A. Mashelkar. Preparation of non-porous microspheres with high entrapment efficiency of proteins by a (water-in-oil)-in oil emulsion technique. J. Control. Release, 1999, v. 58, p. 920.

80. Sh. Takada, Y. Yamagata, M. Misaki, K. Taira, T. Kurokawa. Sustained release of human growth hormone from microcapsules prepared by a solvent evaporation technique. J. Control. Release, 2003, v. 88, p. 229-242.

81. Castellanos I.J., Carrasquillo K.G., de Jesus Lopez J., Alvarez M., Griebnow K. Encapsulation of bovine serum albumin in poly(lactide-co-glycolide) microspheres by the solid-in-oil-in-water technique. J. Pharm. Pharmacol., 2001, v. 53, p. 167178.

82. R. Jain, N.H. Shah, A.W. Malick, C.T. Rhodes. Controlled drug delivery by biodegradable poly(ester) devices: different preparative approaches. Drug. Dev. Ind. Pharm, 1998, v. 24, N 8, p. 703-727.

83. S.K. Dordunoo, J.K. Jackson, L.A. Arsenault, A.M.C. Oktaba, W.L. Hunter, H.M. Burt. Taxol encapsulation in poly(£-caprolactone) microspheres. Cancer Chemother Pharmacol, 1995, v. 36, N 4, p. 279-282.

84. F. Ahmed, D.E. Discher Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. J Control Release. 2004; 96(1): 37-53.

85. Y. Deyrail, N. Zydowicz, P. Cassagnau. Polymer crosslinking controlled by release of catalyst encapsulated in polycarbonate micro-spheres. Polymer, 2003, v. 45, N 18, p. 6123-6131.

86. S. Bogdansky. Natural Polymers as Drug Delivery Systems In: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (M. Chasin, R. Langer, Eds.), p. 231-259. Marcel Dekker, New York, 1990.

87. M. Vert, G. Schwach, R. Engel, J. Coudane. Something new in the field of PLA/GA bioresorbable polymers? J. Control. Release, 1998, v. 53, p. 85-92.

88. R. Jeyanthi, B.C. Thanoo, R.C. Metha, P.P. DeLuca. Effect of solvent removal technique on the matrix characteristics of polylactide/glycolide microspheres for •peptide delivery. J. Control. Release, 1996, v. 38, p. 235-244.

89. W-I. Li, K.W. Amderson, R.C. Mehta, P.P. DeLuca. Prediction of solvent removal profile and eeffect on properties for peptide-loaded PLGA microspheres prepared by solvent extraction/evaporation method. J. Control. Release, 1995, v. 37, p. 199-214.

90. C. Thies. Formulation of degradable drug-loaded microparticles by in-liquid drying processes. In: Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy (M. Dunbrow, Ed.), p. 47-71, CRC, Boca Raton, FL, 1992.

91. F. Ungaro, M. Biondi, L. Indolfi, G. De Rosa, M.I. La Rotonda, F. Quaglia, P. Netti. Bioactivated Polymer Scaffolds for Tissue Engineering. Topics in Tissue Engineering, 2005, v. 2, p. 1-38.

92. Piskin E. Biodegradable polymers as biomaterials. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1995, v. 6, N9, p. 775-795.

93. K.Y. Win, S. Feng. Effects of particle size and surface coating on cellular uptake of polymeric nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials, 2005, v. 26, p. 2713-2722.105. www.puracbiomaterials.com

94. L.D. Shea, D. Wang, R.T. Franceschi, D.J. Mooney. Engineered bone development from a pre-osteoblast cell line on three-dimensional scaffolds. Tissue Eng., 2000, v. 6, N 6, p. 605-617.

95. J. Mayer, E. Karamuk, T. Akaike, E. Wintermantel. Matrices for tissue engineering-scaffold structure for a bioacrtificial liver support system. J. Control.

96. Release, 2000, v. 64, N 1, p. 81-90.

97. N.K. Varde, D.W. Pack. Microspheres for controlled release drug delivery. -Expert. Opin. Biol. Ther., 2004, v. 4, p. 35-51.

98. V.R. Sinha, A. Trehan. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control. Release, 2003, v. 90, p. 261-280.

99. I. Engelberg, J. Kohn. Physico-mechanical properties of degradable polymers used in medical applications: a comparative study. Biomaterials, 1991, v. 12, p. 292-304.

100. L. Lu, Ch.A. Garcia, A.G. Mikos. In vitro degradation of thin poly(DL-lactic-co-glycolic acid) films. J. Biomed. Mater. Res., 1999, v. 46, N 2, p. 236-244.

101. U. Edlund, A.C. Albertsson. Degradable polymer microspheres for controlled drug delivery. Advances in Polymer Science, 2002, v. 157, p. 67-112.

102. V. Lemaire, J. Belair, P. Hildgen. Structural modeling of drug release from biodegradable porous matrices based on a combined diffusion/erosion process. Int. J. Pharm., 2003, v. 258, p. 95-107.

103. C. Washington. Drug release from microparticulate systems. In: Microencapsulation. (S. Benita, ed.) p. 155-182, Marcel Dekker, New York, 1996.

104. G. Crotts, T.G. Park. Protein delivery from poly(lactic-co-glycolic acid) biodegradable microspheres: release kinetics and stability issues. J. Microencapsul., 1998, v. 15, p. 699-713.

105. H.S. Okabe, J.L.A. Roth, C.J. Pfeiffer. A method for experimental, penetratinggastric and duodenal ulcers in rats. Observations on normal healing. Amer. J. Digestive Disease, 1971, v. 16, N 3, p. 277-284.120. http://en.wikipedia.org/wiki/Aminoacid

106. T. Nose, T. Fujita, M. Nakajima, Y. Inoue, T. Costa, Y. Shimohigashi. Interaction mode of the Phe-Phenyl group of thrombin receptortethered ligand SFLLRNP in receptor activation. J. Biochem, 1998, v. 124, p. 354-358.

107. C.K Derian, B.E. Maryanoff, P. Andrade-Gordon, H.C. Zhang. Design and evaluation of peptide-mimetic PAR-1 antagonists. Drug Development Res, 2003, v. 59, p. 355-366.

108. M. Weber, F. Gerdsen, K. Gutensohn, V. Schoder, B. Eifring, D.K. Hossfeld. Enhanced platelet aggregation with TRAP-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism. Thrombosis Res, 2002, v. 107, N 6, p. 325-328.

109. D. Glaser, T. Hilberg. The influence of bromelain on platelet count and plateletactivity in vitro. Platelets, 2006, v. 17, N 1, p. 37-41.

110. S. Kulkarni, S.M. Dopheide, C.L. Yap, C. Ravanat, M. Freund, P. Mangin, K.A. Heel, A. Street, I.S. Harper, F. Lanza, S.P. Jackson. A revised model of platelet aggregation. J. Clin. Invest., 2000, v. 105, N 6, p. 699-701.

111. K.J. Clemetson. Primary haemostasis: sticky fingers cement the relationship. -Curr. Biol., 1999, v. 9, p. 110-112.

112. J.G. White. EDTA-induced changes in platelet structure and function: clot retraction. Platelets, 2000, v. 11, N 1, p. 49-55.

113. R. Qi, Y. Yatomi, Y. Ozaki. Effect of incubation time, temperature and anticoagulants on platelet aggregation in whole blood. Thrombosis Res., 2001, v. 101, p. 139-144.

114. F.S. London, M. Marcinkiewicz, P.N. Walsh. A Subpopulation of Platelets Responds to Thrombin- or SFLLRN-stimulation with Binding Sites for Factor IXa. -J. Biol. Chem., 2004, v. 279, N 19, p. 19854-19859.

115. N. Moran, A. Kiernan, E. Dunne, R.J. Edwards, D.C. Shields, D. Kenny. Monitoring modulators of platelet aggregation in a microtiter plate assay. Analyt. Biochem., 2006, v. 357, p. 77-84.

116. J. Vandervoort, K. Yoncheva, A. Ludwig. Influence of the homogenization procedure on the physico-chemical properties of PLGA nanoparticles. Chem. Pharm. Bull, 2004, v. 52, N 11, p. 1273-1279.

117. Y.F. Maa, C.C. Hsu. Effect of primary emulsions on microsphere size and protein-loading in the double emulsion process. J. Microencapsulation, 1997, v. 14, p. 225-241.

118. M.A. Benoit, B. Baras, J. Gillard. Preparation and characterization of proteinloaded poly(£-caprolactone) microparticles for oral vaccine delivery. Int. J. Pharmaceut, 1999, v. 184, p. 73-84.

119. H. Sah, R. Toddywala, Y. Chien. The influence of biodegradable microcapsule formulations on the controlled release of a protein. J. Control. Release, 1994, v. 30, p. 201-211.

120. D.T. O'Hagan, H. Jeffery, S.S. Davis. The preparation and characterization of PLGA microspheres: III. Microparticle/polymer degradation rates and the in vitro release of a model protein. Int. J. Pharm, 1994, v. 103, p. 37-45.

121. X. Huang, C.S. Brazel. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J. Control. Release, 2001, v. 73, p. 121136.

122. Chaw, CS.; Yang, YY.; Lim, IJ.; Phan, IT. Water-soluble betamethasone-loaded poly(lactide-co-glycolide) hollow microcapsules as a sustained release dosage form. J. Microencapsulation, 2001, v. 20, N 3, p. 349-359.

123. T. Tsai, R.C. Mehta, P.P. DeLuca. Adsorption of peptides to poly(D,L-lactide-co-glycolide): 2. Effect of solution properties on the adsorption. Int. J. Pharm., 1996, v. 127, p. 43-52.

124. R. Ghaderi, J. Carlfors. Biological activity of lysozyme after entrapment in poly(D,L-lactide-co-glycolide)-microspheres. Pharm. Res., 1997, v. 14, p. 1556— 1562.

125. M. van de Weert, J. Hoechstetter, W.E. Hennink, D.J. Crommelin. The effect of a water/organic solvent interface on the structural stability of lysozyme. J. Control. Release, 2000, v. 68, p. 351-359.

126. Y.M. Kwon, M. Baudys, K. Knutson, S.W. Kim. In situ study of insulin aggregation induced by water-organic solvent interface. Pharm. Res., 2001, v. 18, p. 1754-1759.

127. R.S. Raghuvanshi, S. Goyal, O. Singh, A.K. Panda, Stabilization of dichloromethane-induced protein denaturation during microencapsulation. Pharm. Dev. Technol., 1998, v. 3, p. 269-276.

128. K. Griebenow, A.M. Klibanov. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 11695-11700.

129. C.L.Stevenson. Characterization of Protein and Peptide Stability and Solubility in Non-Aqueous Solvents. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2000, v. 1, p. 165-182.

Информация о работе

Сташевская, Кира Сергеевна
кандидата химических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы