Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изыскание стимуляторов для получения культур клеток и интерферона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изыскание стимуляторов для получения культур клеток и интерферона"

МНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ШЮВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МВДВДШ И БИОТЕХЮЛОГШ имени К.И.СКРЯБИНА

Для служебного пользования„

экз. р|0 0 •> Д ,4,

* На правах рукописи ^

ОЛЕШКЕВИЧ Анна Анатольевна

ИЗЫСКАНИЕ СТИМУЛЯТОРОВ ДИН ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ИНГЕРВЕРЭНА

03.00.04 - Биохимия 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994.

Рабрта выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор Малахов А. Г.

доктор биологических наук, профессор Куравлев А.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Клопов М.И.

доктор биологических наук, • профессор Иванов И.И.

Ведущая организация: Всероссийский научно-иссле, вательский институт экспер] ментальной ветеринарии име! Я.Р.Коваленко

Защита состоится " 3 " ЯМА^Н^- 1995г. в часов на заев' дании диссертационного'совета Д 120.36.05 по зайдете диссертаци] на соискание ученой степени доктора наук в Московской государс1 венной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.1 Скрябина / 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Телефон

377 - 93 - 83 /.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан

" ^ Л'Н^У'МЛ'- 19951

Ученый секретарь специализированного совета . Сафонов Н,А

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теш, В условиях непрерывного сокращения биоло-нческих ресурсов резко растет их стоимость и возникает актуаль-зл проблема более полного их использования с наименьшими затра-ами, особенно дорогих биопрепаратов и реагентов, в своей работе 1 попытались решить проблему управления реактивностью живых сис-эм воздействием разнообразных стимуляторов с целью уменьшения зз биологически активных веществ / митогенов и цитостатиков /, зиорения пролиферации культур клеток используешх в биотехноло-1и, а также увеличения выхода интерферона / ИФН /.

Изучение стимуляции ростовых процессов и синтеза практичес- . л важных метаболитов постоянно привлекает внимание ученых и прак-шов. Этому посвящены работы Калинина Ф.М. / 19а4 /, Ситковско-) В.М. / 1979 /, ГЪрлиной Н.К. с соавт. / 1985 /, Раппопорта И.А. 19&) /, Кузнецова В.П. / 1981,1983 /, Ермольевой З.В. с соавт. 1970 /, Ранчялиса В.П. / 1973;1978 / и многих других авторов. 5пекты раздельного и совместного влияния стимуляторов различной гиологии, а также механизм этого воздействия на клеточные куль-Гри практически не изучены. Из обширной группы стимуляторов хи-таеской и биологической этиологии нами были выбраны хорошо изу-знныо на других объектах стимуляторы, в основе действия боль -шства из которых лежит изменение проницаемости мембран: конка-•шалин А / Кон А /, фитогемагглютинин / ФГА / и ряд других. 1к показано в работах Журавлева А.И. / 1980 /, Керра, Данна и »¿мари с соавторами /ИрГГр.С. еЬ. а?., /9&9; йиппР.,Ш5; 'оЬат-ЮП фактором физической природы, действующим

* мембранную проницаемость, является ультразвук / УЗ /. Влияние 3 в качестве стимулятора ростовых процессов клеточных культур ж индивидуально, так и совместно с другими агентами до нашей 1боты практически не изучалось. УЗ так.те нэ был никеи использо-иг для увеличения выхода ИФН.

Разработка нестандартных, экономически выгодных методов по-гзонил продукции ИФН позволит расширить сферу его .использования более успешно применять как при лечении и экстренной профилакти-) вирусных инфекций, так и в качестве нммунокорректора, нормали-гищего иммунный статус животных.

Цель и задачи исследований. Цель, которая преследовалась при ютановке данной работы - подобрать и найти оптимальный режим 13Д0йствия УЗ и других агентов для стимуляции пролиферативной ак-1ВНости перевиваемой культуры клеток почжЛ теленка

/ИдвИ/ и

стимуляции продукции ИФН; изучить стимуляции иммунного статуса при введении иммуномодуляторов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: I/ изучить рост и люминесценцию светящихся бактерий 1//7 /¿£,рЬег1 , взятых в качестве модельного объекта,в ответ на воз действие различных доз стимуляторов; 2/ изучить стиыуляторный фект различных агентов на пролиферацию культуры клеток ПиВИ", 3/ изучить действие УЗ на продукцию ИФН-а лейкоцитами. Сравнить 1йшуномодулирующий эффект полученного ИФН и Т- и В- активинов на повышение иммунного статуса гнотобиотических морских свинок; 4/ раз^бощч, и внести конструктивные изменения в методику очистки и проверки ИФН; 5/ отработать методику ввделения имыуноглобулино сыворотки крови морской свинки для получения видоспецифических а тисывороток.

Научная новизна работы. Впервые на культурах клеток шза V. ¿¿ъеЬеп и лейкоцитов показано стимулирующее действие УЗ в самостоятельного фактора, так и совместно с биологически активны веществами. Благодаря увеличению проницаемости мембран клеток,УЗ индивидуально и в сочетании с другими стимуляторами интенсифицир ет процессы метаболизма, пролиферацию клеток, проникновение энзо генных / митогенн, цитостатики и др./ и эндогенных / ИФН / вещее через клеточцую стенку. Биохимическими методами подтвервдена пол ценность, отсутствие токсичности и иммугомодулирующее действие п лученного ИФН.

Новым в работе является нахождение способа получения культу клеток с применением указанных стимуляторов, а также способа пол чения ИФН. Приоритетный характер данных исследований и разработе подтверждены положительным решением Госкомизобретений СССР № 157 от 1.3.90 г. и Р 1597387 от 8.6.90 г. на выдачу авторских свидет как имеющих абсолютную новизну и практическую значимость.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученный фект увеличения проницаемости мембран живых клеток под влиянием является ключевым в понимании механизма его действия на кивые ор низмы. Биохимическая и клиническая полноценность дополнительно л ченных препаратов показывает отсутствие разрушительного, денатур рупцего действия применяемых интенсивностей. Для гнотобиотов - ы к их свинок установлены уровни содержшгия сывороточных белков, чте возможность изучать имыуномодулиругщее действие препаратов и органнзй животных.

Способы получения ИФН и культур клеток животных с использов

[ем эффекта изменения проницаемости клеточных мембран под дейст-ieit УЗ позволяют существенно увеличить выход ИФН и значительно побить индекс пролиферации.

Экспериментально отработана методика нахождения режимов воздей-вия на клетки физических факторов на примере действия УЗ на све-щиеся бактерии.

Предложен экономически обоснованный метод уменьшения в 10 раз нцентрации митогенов в процессе стимуляции размножения клеток в льтуре за счет воздействия оптимальными режимами УЗ.

В работе показана принципиальная возможность использования ьтражонцентрирования при получении ИФН, что позволит исключить Д трудоемких операций из технологического процесса.

Научные результаты внедрены на кафедрах органической и биоло-чоской химии и биофизики и физики при чтении лекций по темам: Биохимические основы иммунитета ", " Биохимия крови " Биохе-пюминесценция " и " Биофизика клетки Результаты диссертацион-й работы использованы в методических указаниях " Разделение и истка иммуноглобулинов сыворотки крови морской свинки и получе-э^ецифических антисывороток М., MB А, 1994.

Полученные результаты открывают перспективу целенаправленного гпериментального поиска возможности использования факторов биоло-1вской и физической природы для стимулирования биотехнологичес-с процессов с участием клеток различной этиологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы задавались на: Всесоюзном симпозиуме с международным участием 1риыенение ультразвука в промышленности и медицине Вильнюс, 37, 1988; Всесоюзной конференции " Ультразвук в сельском хозлй-)в Рязань, I98V; Научных конференциях МВА, Москва, 1987,1988; юоюзном симпозиуме " Акустическая кавитация и проблемы интенси-сации технологических процессов Одесса, 1989; Пятой националь-1 конференции по биомедицинской физике и инженерии, Болгария, Со-[, 1989; на межкафедральком и кафедральных совещаниях сотрудни-I МВА / 1986 - 1994 /. . .

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит введения, обзора литературы, собственных исследований, обсужде-[, выводов, сведений о практическом использовании результатов ледований, рекомендаций по использованию научных выводов, спис-литературы, включающего 334 источников, в том числе j^j иност-ных, приложения. Работа изложена на 194 страницах машинописно-текста, содержит 14 таблиц, 30 рисунков и ¿0 фотографий.

Публикация работы. По материалам диссертационной работы опубликовано II печатных работ, в которых отражены ео основные положения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИСОИВДЭВАШЯ 2.1. Материалы и методы исследований.

Экспериментальная работа была выполнена на кафедре органичес кой и биологической химии МВА, кафедре биофизики и физики MBA, а также в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Для изучения воздействия ряда физических, химических и биоло гических факторов на стимуляцию роста и метаболизма у различных объектов г качестве стимуляторов бьоти использованы: УЗ; некоторые митогены - Кон А, ФГА, динатриевая соль этилендиаминтетраацетата / ЭДГА /, парааминобензойная кислота / ПАЕК /; дрожжевой экстракт пероксид водорода; иммуномодуляторы - Т- и Б- активины, ИФН; а также изучено комбинированное воздействие УЗ с некоторыми из указанных соединений и лекарственных веществ.

Диапазоны испытанных концентраций стимуляторов находились в пределах 10- 10 мг/цл. Экспозиция УЗ варьировала: время от I $ 300 сек, интенсивность 0,01 - 2,0 Вт-cu"2, несущая частота 880 к1 Действие стимуляторов изучалось " ¿Л ItitfO " и " LP VLVO ". Объектами исследования служили чистые культуры: I/ для изучения действия биостимуляторов на скорость пролиферации была использова на перевиваемая культура клеток почки теленка М,DSU ; 2/ для г лучения интерферона - лейкоциты / их выделяли только из свежепол} ченной крови /; 3/ для отработки оптимальных режимов УЗ-воздейст-вия - морские лшинесцирующие бактерии VlSrtO = PhoiooQÜtG -Кит /¿reherí штамм 6 М1У / Данилов B.C., Егоров Н.С., 1990 J быстро реагирующие на воздействие внешних факторов и использующие в реакциях свечения универсальные биологические молекулы - ФАД> НАДН или НАДФН. Реакции, сопровождаемые испусканием света, сопряжены со многими биологически важными реакциями в организме. Ответ на стимулирующее воздействие легко и быстро регистрируется.

все культуры клеток выращивали традиционными способами / Дм конов Л.П. и др., 19«6; Адаме, 19оЗ; Гительзон и др., 19а4; Кузнецов tí.11., I&J4 /. Рост культур оценивали по изменению оптической плотности /£>/ и прямым подсчетом клеток, иценка биохемилю-минесценнии бактерий - по методу Журавлева А.И. Контроль на чистоту ИФН и иммуноглобулинов методом DS-Na - электрофореза с иеркаптбртанолом в ПААГ. ичистка препарата проводилась ыетодоы ш муяо сорбции. аонтроль ее - методом юшуноферментного анализа

И$А /ВооМ # /., 1988 /. Ультраконцентрирование луфабриката интерферона проводили на кассете 10 кД - мембран с бочей поверхностью прибором РбссССОП с учетом рекомен-

ций фирмы-изготовителя, ьелок - по методу лоури и с помощью реф-ктометра. Протеолитическую активность - методом Старки уйМ., 19/7 /. Концентрацию полиэтиленгликоля в препарате -эктрофотометрически по методу Игудина с соавт. / 1993 /. Дня целения и очистки имыуноглобулинов использовали: диализ / против Ю67 М фосфатного буфера рН 5,4 в течение суток при 4°С /, выса-зание сульфатом аммония при насыщении 0,67 , гельфильтрацию на (акриле /Э - ЭиО / колонка длиной 90 см, диаметром 16 мм, )5М трис-Ш1 буфер рН 8,0Ь , скорость элюции 30 мл/ч / с поело- . яцей идентификацией методом ишуноэлектрофореза в 1,6 % агарозе. ггроль действия полученного ИФН на организм животных проводили морских свинках с исследованием соотношения сывороточных компо-гтов с помощью электрофореза.

Статистическая обработка результатов - по Стьюденту.

2.2. Результаты исследований.

Часть I. Изучение, применение и оценка эффекта повышения проницаемости мембран клеток под влиянием ультразвука.

1.1. Стимуляция роста и люминесценции светящихся бактерий \J.jLsoh9rL

Известно, что интенсивность свечения отражает интенсивность ания и метаболизма бактерий / Угарова, 1989 /. В ходе проведен-экспериментов выявлено изменение роста и люминесценции светя-ся бактерий в ответ на стимулирующие воздействия УЗ частотой кГц, перокевда водорода, дрожжевого экстракта. На рис.1 прк-енн результаты УЗ-воздействия на культуру бактерий в динамике роста. Найдена оптимальная интенсивность УЗ /-У = 0,4 Вт»см~2 / времени экспозиции / Т / I - 3 мин / риоЛа /. Представленные . рис. 16 данные отражают сложный'отклик организма на действие После посева интенс^яость люминесценции немного уменьшалась гох пор, пока число клеток не достигало пороговой величины. Зароет замедлялся, наблюдали характерную аутоивдукцию и подъем шесценции. Бедно, что максимальная интенсивность свечения клев опытном варианте выше контрольной примерно на 35 % / Р<0,01/.

При воздействии на клетки V. 73 интенсивностей,

4 8 46 20 2А 1,ЧАС.

Рис Л. Влияние УЗ /а; б - 1,3 / на светящиеся бактерии.

а - изменение люминесценции /У/ в зависимости от интенсивности УЗ б " Р°ст / 1,2 / и люминес-

ценция /3,4/ в динамике развития. Контроль - 2,4.

меньших 0,4 Бт-см"^, эффект стимуляции люминесценции был менее т раженным. При интенсивностях УЗ, превышающих 0,6 ОТ'оГ^, в резу! тате появл'ния кавитации наблюдали необратимое подавление биолюьп несценции и уменьшение числа жизнеспособных клеток. Дзполнительге эксперименты подтвердили возникновение ультразвукового кавитацио! ного свечения в питательной среде,свободной от бактериальных клеток, при интенсивно стях в диапазоне 0,6 - 1,0 Вт •си"''.

Таким образом, в этой серии опытов было установлено, что УЗ с интенсивностью 0,4 Вт'си"^ / время экспозиции 3 мин /, вызывая повышение проницаемости цитоплазыатической мембраны клеток \Z.JlS-еЬвг1 , интенсифицирует процессы метаболизма. В связи с этим сделано предположение, что УЗ в данной оптимальной дозе будет способствовать ускорению транспорта через клеточную мембрану таких экзогенных веществ, как лекарственные - цитостатики и антиби отики.

Циклофосфан и доксорубицин вносили в питательную среду в ра ных концентраглях при посеве бактерий. Установлено, что УЗ позво

Рис.2 Эффект УЗ /1,5/ и циклофосфана /3,7/ на культуру V. jischeri . Изменение: а - оптической плотности IL)I\ б - интенсивности свечения ///. 2,6 - необработанные клетки; 4,8 - клетки, обработанные совместно УЗ и циклофосфаном.

лет'снижать дозу внесенного лекарства. УЗ усиливает супрессорное иологическое действие указанных веществ: значительно уменьшается ксло жизнеспособных клеток, сильнее тормозится клеточное деление, меньшается интенсивность свечения /рис.2/. Это свойство может быть [спользовано для экспресс-анализа действия вновь синтезируемых ле-:арственных препаратов и уменьшения концентрации применяемых вмес-■е с УЗ антибактериальных и др. препаратов. Тест-объект - V.JischorL. 'аким образом, было показано, что светящиеся бактерии являются удоб-юй моделью экспресс-метода поиска стимулирующих интенсивностей и [03 УЗ-воздействия на мембраны живых клеток.

1.2. Стимуляция пролиферации культуры клеток мтн .

В результате воздействия митогенов на суспензию клеток найце-ы оптимальные концентрации и установлен максимальный стимулирую-(ий эффект на пролиферативную активность Кон А в концентрации ,0 мг/мл и ФГА в концентрации 0,01 мг/мл /рис.3/. Индекс пролифе-

Рис.3. Влияние митогенов и УЗ на пролиферацию клеток MDB К . Диаграмма: Q - ФГА; О - ФГА с УЗ. График: I - КЬн А; 2 -Кон А с УЗ.

рации увеличился более, чем в 3 раза /р<0,05/. Подобным стимула рущим действием обладали также ПаьК и ЭДТА в оптимальных концен рациях 0,01 м^/мл, увеличивая ивдекс пролиферации в а и 3 раза,с ответственно. Дрожжевой экстракт, богатый витаминами, аминокисло тами в оптимальной концентрации 0,1 иг/мл, обладал также значите ныл стимулирующим эффектом, увеличивая пролиферативный индекс в 1,75 раза /р<0,05/.

УЗ-обрабстка суспензии культуры Клеток MDBK непосредст венно перед выращиванием / частота 880 кГц, У = 0,01 - 0,05 Вт*с Т т 5 - 30 сек / позволяет значительно увеличить прирост массы клеток : на 65 - 140 S / р>0,05 /. Максимальная скорость пролиф рации отмечена при У» 0,05 Вт«см~2 и Т ■ 10 сек. / рис.4 /. Ицц пролиферации возрастал в 2,4 раза с 3,8 до 9,0 / р<0,05 /; сокр щалось время на получение единицы объема клеточной массы, что по волило значительно удешевить ее производство.

Микроскопический контроль не выявил морфологических изменен плеток при обработке УЗ в течение 5 сек - I мин интенсивностью 0,01 - 0,05 Вт«см~'г; контроль на целостность мембран подтвердил сутстви'е повреждений мембраны приблизительно у 80 % клеток /р < О Преимуществом разработанной методики является использование экол

ш О

Зс

1 §

0

1

I

/|\

// / /1 \ Ч1

/^в 1 контроль

\ \ \

\ \ 0. 4 , 3

0,2 Заз.Вт см"а

Рис.4. Эффект УЗ на рост культуры клеток тви. Время обработки: 10 сек /I/, 30 сек /2/, 5 сек /3/, 35 сек /4/, 45 сек /5/, 3 сек /б/.

чески чистого стимулятора - ультразвука и малые затраты времени на стимуляции. На способ стимуляции культур клеток животных получено авторское свидетельство.

Изучено также комбинированное действие УЗ с некоторыми химическими стимуляторами на рост культуры клеток М1ЭВК /рйс.З/. Установлено, что скорость пролиферации под влиянием УЗ и Кок А значительно увеличивалась /3 « 0,05 Вт'см"^, Т » 10 сек, концентрация Кон А - I мкг/ил /. Число клеток возросло в 3 раза. Отметим, что при комбинированном воздействии стимулирующая концентрация Кон А уменьшалась в 1000 раз по сравнению с концентрацией Кон А, стимулирующей пролиферацию ивдиввдуально.

Подобные результаты получены при совместном действии УЗ /^У » 0,05 Вт'см"^, Т = 10 сек / и ФГА /рис.3/. Оптимальная концентрация ФГА при солместном действии с УЗ уменьшалась в 10 раз. При этом число клеток увеличивалось в 3 раза за аналогичный период культивирования по сравнению с контролем - клетками, выращенными традиционным способом.

Такш образом, проведенные исследования свидетельствуют о значительном преимуществе применения УЗ как с агентами, усиливающими 1ролиферацию клеточных культур, так я с препаратам, тормозящими чроцессы метаболизма и клеточного деления. Использование УЗ допус-

§

и

Вю

а

I8 § ■

§3

СО 1-

-----

/

/ . II » и,

1 1 1 N Ч 1 1 1

к

; N

1 *■-1 1 11 1

о.\

0,5

ТО Эу3,Втсм

Рис.5. Продукция ИФН индуцированными /I, К^ / и " отработанными " / 2,3,(С, / лейкоцитами под действием УЗ / 1,2,3 /. Время УЗ-обработки: 5 мин /I/, 3 мин /2/, 4 мин /3/. Контроль - и I

кает возможность сокращения в десятки раз стимулирующих доз экзоген ных веществ за счет увеличения проницаемости клеточных мембран.

1.3.Действие УЗ на лейкоциты. Установлено, /рис.5/, что УЗ обладал стимулирующим воздействием на продукцию интерферона лейкоци тами: как индуцированными, так и однократно использованными для био синтеза ИФН /"отработанными"/. "Облучение" УЗ-оы суспензии лейкоцитов до прайминга или после него, но до вирусной индукции, не приводило к заметному изменению количества синтезированного ИФН. С учетом численности жизнеспособных клеток / тест с трипановым синим / был рассчитан титр / активность / и показано, что стимулирующим воздействием на продукцию ИФН индуцированными лейкоцитами обладал УЗ интенсивностью 0,1 - 0,7 Вт*см~*% Т - 5'мин. /рис.5, кривая I/.

р

В диапазоне интенсивностей УЗ 0,4 - 0,7 Вт-см регистрировали увеличение на~ 30 - ЗЬ % /Р>0,05/ продукции ИФН при сохранении постоянного числа житагх клеток в суспензии, Р< 0,01. ь области уровне

и,7 - 1,0 Вт•сн'г наблюдали значительное уменьшение числа клеток с неповрежденными мембранами, на 80 - 85 % /Р<0,05/ ингибирование С1штеза ИФН и агрегацию клеток с последующим разрушением. Интенсивность УЗ вше I ит-см"^ приводила к практически полному подавлению биосинтеза, что обусловлено процессами, сопровождающими кавитацию, например, грубым нарушением внутриклеточной архитектоники и подавлением биохимических реакций.

Технология получения ИФН методом суспензионного биосинтеза предусматривает однократное использование лейкоцитов, т.о. "отработанные" клетки после биосинтеза выбрасываются. Рис.5 / кривые 2,3 / иллюстрирует стимуляцию выхода ИФН на 2*: - 30 % от общего "урожая" /Р<0,01/ после УЗ-воздействия на "отработанные" клетки. Оптимальный уровень ^/-составил 0,05 - 0,2 Бт-см"^, Т - 2 - 4 мин. ИФН, удерживаемый клетками в течете первого синтеза, благодаря увеличению проницаемости мембраны, выходит из клетки: активность ИФН по сравнению с контролем /рис.5, К^/ возрастает в 3 - 8 раз. На предложенный способ получения дополнительного количества ИФН получено авторское свидетельство.

Таким образом, УЗ является эффективным стимулятором выхода эндогенных веществ.

Часть II. Изучение некоторых свойств интерферона.

2.1.' Ультраконцентрирование. Метод ультраконцентрирования был апробирован и показана перспективность его включения в принятую схему очистки / Кузнецов З.П.,19оЗ / ИФН. Установлено, что при использовании фильтрационных 10 цД мембран, давления 24 р51. , температуры +6°С, скорости потока 0,2 л/мин., оптимальным является 3х-5 кратное концентрирование подаваемого на мембраны полуфабриката; потерь активности ИФН не было / таблица I /.

Таблица I. Ультраконцентрирование полуфабриката ИФН.

Образец Объем л Активность НЕ Болок ыг/мл ПЭГ г/л рН Протеолиз, степень

Полуфабрикат-I 5 32000 2,50 2,12 7.3 0,65

Фильтрат-1 4 <10 0,175 0,35 7,3 -

Полуфабрикат-^ 5 32000 2,50 2,56 7.4 0,22

Фильтрат-2 3,4 <10 0,П 0,62 7,4 0,03

Концентрат-1 I 1(30000 10,50 9,15 7,4 0,12

Смыв - 1 0.2 - 4,25 0,21 7,4 0,83

Концентрат-2 1,6 100000 7,50 6,та 7,3 0,11

Контроль на протеолиз.(Стандарт специфических лейкоцитарных

протеиназ).

Контроль степени протеолиза показал, что в основном она была незначительна, протеиназы задерживались мембранами. Полиэтиленгли-коль присутствовал в больших количествах в концентрате, чем в фильтрате, поэтому в дальнейшем от него освобовдались в хо,"5 последующей очистки.

Данные " CLISA "-теста подтвердили отсутствие иммуноглобулина G / IoG/ в очищенном препарате ИФН. Для контроля чистоты применяли нативный и Dp~A/tX - электрофорез в ПААГ. Молекулярная масса ИФН равна 20500 Дальтон. Результаты нативного электрофореза сыворотки крови морской свинки после введения полученного ИФН разной активности подтвердили одинаковую электрофоретическую подвижность альбуминовых и глобулиновых фракций опытных и контрольных сывороток / контроль - интактная сыворотка /. Результаты позволили сделать вывод об отсутствии токсичности синтезированного и очищенного препарата ИФН. В качестве дополнительного теста на отсутствие токсичности ИФН предложено использовать культуру светящихся бактерий V.JtScheri как биосенсор. На диаграмме / рис.б / показано, что ни одна из использованных доз ИФН-а отрицательно не влияла на рост и люминесценцию фотобактерий. С увеличением концентрации ИФН в среде интенсивность свечения увеличивалась.

Рис.б. Эффект различных концентраций ИФН на рост /Di и хемилши-несценцию /7/ V.Jischeri .

2.2.Действие биологических стимуляторов на организм животных. Исследован эффект применения "if] VIVO" ИФН в сравнении с Т- и В-активинами: анализировали гематологические и биохимические показатели крови гнотобиотических морских свинок / табл.2 /, сравнивая с покупателями крови конвенциальных животных.

Таблица 2. Биохимические показатели сыворотки крови морских свинок.

общ. белок альб. г/л глоб. г/л альб. глоб. с^-гл. г/л гл. г/л <Г- гл. г/л

{онвенциальн. 68,20 32,67 24,63 1,33 11,79 5,91 6,98

кивотное

Гнотобиот 53,21 17,01 5,15 3,30 3,15 0,65 1,34

Г-активин 61,85 23,65 10,38 2,28 7,61 0,87 1,91

3-алтивин 65,16 22,75 17,07 1,33 11,51 1,06 3,91

Ш 60,77 23,40 17,53 1,33 11,61 2,86 3,06

Зведение стимуляторов приводило к приближению уровня гемопоэза к горке. Существенно возрастало содержание глобулиновых фракций сн-зоротки крови: с 9,67 + 0,281 % контрольной группы гнотобиотов до 28,«4 + 0,548 % у животных, получавших ИФН, и 26,19 + 0,736 % и 16,78 + 0,Ь4Ь % соответственно - Т- и Б- активины. Уровень -глобулинов, остановленный нами у гнотобиотов, значительно ниже нормы и составил 2,52 + 0,053 У животных-конвенциалов, участвующих в экспери-1енте, он составлял 9,14+0,311 % / при норме 9,93+0,35 % /. Ритрн иммуноглобулинов в 2 - 4 раза ниже у гнотобиотов, чем у кон-¡енциальных животных. После введения гнотобиотам иммуностимулято-х>в количество ^ -глобулинов резко возрастало: с 2,5Я 94 до 6,89 >,145, Ь,03+0,106 и 3,08± 0,094 / В-активин, ИФН и Т-активин соот-штственно/. Количество с/ - и £ -глобулинов у гнотобиотических жи-ютных также занижено. Процент с^ -глобулинов в 3,8 раза ниже нора, а £ -глобулинов - в 7,67 раза / Р< 0,03; Р<и,01 /. Данные по-газатели под действием иммуномодуляторов также достоверно увеличились и приближались к норме. Наибольший эффект давало использова-ше ИФН: рост количества -глобулинов с Ь,92± 0,072 % до 19,1 + ,516 процент^ -глобулинов увеличивался с 1,23 до 4,71 / КО,02/.

шло отмечено, что количество альбуминов у гнотобиотических швотных значительно ниже нормативных показателей, характерных для ;анного вида животных: 31,94 * против 49,'/9 / Р<0,05 /. Поело ртенешм иммуномодуляторов наблюдалась тендшщил к росту процента льбуминов сыворотки крови до 38, &± 1,14 возрастало и приближалось irop.ro содержание общего белка: от 53,21±и,б4 г/л у шггактнмх нотобиотов до 61,8 г/л, 6о,г г/л и 69,7 г/л поело применения Т-, -активина и ИФН соответственно / Р<0,05; Р<0,01; Р<0,03 /. риближалось к норме соотношение альбушты/глобултш: с 3,3±0,095 # у гнотобиотов в контроле до 1,33 + 0,032 % - в опыто.

I4

Из сыворотки крови морских свинок ввделены и отработана методика очистки иммуноглобулинов . После диализа фракция, содержащая Уд С, оставалась в растворе, тогда кале - в осадке. В дальнейшем в схеме очистки использовали стадию высаливания. Гельфильтрация на сефакриле Р -300 позволила получить фракции индивидуальных иммуноглобулинов.

Проведена количественная и качественная оценка, дуги преципитации, полученные после встречного иммуноэлектрофореза, были характерны для иммуноглобулинов класса С и

м. Электрофорез " с расщеплением " на легкие ¿, - и тяжелые И -цепи позволил идентифицировать иммуноглобулины и сделать вывод об их иммунологической чистоте друг относительно друга.

вывода.

1. Впервые установлено, что эффективным стимулятором люминесценции светящихся бактерий УсвсАб^с является УЗ низких интен-сивностей. При воздействии УЗ оптимальной интенсивности 0,4 Вт»сы~^ и времени экспозиции 3 мин уровень свечения увеличивается на 35 При интенсивностях УЗ,больших 0,6 Вт»см"^ наблюдается подавление биолюминесценции, уменьшение жизнеспособности клеток, совпадающее

с порогами кавитации в суспензии.

2. Впервые установлен стимулирующий эффект на пролиферативную активность перевиваемой культуры клеток /У/)^//веществ химико-биологической природы и УЗ.

а. Митогены Кон А и ФГА в оптимальных концентрациях I и 0,01 мг/мл,соответственно, более чем в 3 раза стимулировали ростовые процессы. ЭДТА, ПАШ в концентрациях по 0,01 иг/мл и дрожжевой экстракт в концентрации О, I мг/мл увеличивают индекс пролиферации, соответственно, в 3,2 и 1,75 раза.

б. Обработка клеток высокочастотным / У80 кПд / УЗ низкой интенсивности 0,05 Вт-см"2 с экспозицией 10 сек увеличивает индекс пролиферации с 3,0 до 9,0.

в. Способ стимуляции пролиферативной активности клеток защищен авторским свидетельством Р 1597387.

3. Изучены резистентность лейкоцитов к УЗ-воздействию и продукция ИФН индуцированными клетками лейкоцитов "¿Л VIIГ О

а. Показано, что с увеличением интенсивности УЗ от 0,1 до 2 Вт'см"^ жизнеспособность лейкоцитов достоверно уменьшалась на фоне обралования агрегатов клеток.

б. Впервые обнаружена стимуляция УЗ продукции ИФН индупиро-

ванными лейкоцитами - на 32 - 35 %; оптимальные условия: интенсивность УЗ - 0,4 - 0,7 Вт-см"^, время - 5 мин.

в. Впервые предложены условия повторного использования однократна " отработанных " при суспензионном биосинтезе ИФН лейкоцитов для получения дополнительного количества препарата: УЗ-воздействие в оптимальных режимах - интенсивность 0,01 - 0,2 Вт-см-^, время экспозиции 2-4 мин. Выход ИФН увеличивался в б - Ь раз по сравнению с контролем. На способ получения ИФН с помощью УЗ получено авторское свидетельство № 1575362.

4. Показано повышение проницаемости мембран клеток под влиянием УЗ по уменьшении в десятки раз концентраций экзогенных веществ

- лекарственные препараты циклофосфан и доксорубицин, - подавляющих интенсивность люминесценции светящихся бактерий; в сотни раз -количества экзогенных митогенов, необходимых для увеличения проли-феративной активности, а также по увеличению выхода эндогенного продукта / синтезированного лейкоцитами-ИФН /.

5. Апробирован и отработан метод ультраконцентрирования полученного полуфабриката ИФН. Установлены оптимальные пара-нетш процесса ультрафильтрации: кратность концентрирования по объему - 3 раза, давление на входе и выходе - 24рз1, температура б°С.

6. Полученный ИФН биологически полноценен, что подтверждают: результаты электрофореза сыворотки крови конвенциальной морской свинки после введения полученного препарата; отсутствие токсического эффекта при введении гнотобиотическим животным ИФН. Аналогично действию Т- и в-активинов наблюдали иымуномодулирующий эффект синтезированного ИФН: возрастание и приближение к норме содержания общего белка сыворотки крови, ее о( -, и $ - глобулиновых фргкций, нормализацию соотношения альбумины/глобулины в крови; лей-коформула изменялась незначительно. Иммуностимулирующий эффект подтверждало увеличение содержания иммуноглобулинов с 2 до 9

7. .впервые разработан экспресс-контроль на отсутствие токсичности синтезированного ИФН. В качестве тест-объекта предложено использовать светящиеся бактерии.

о. итработана методика выделения и очистки иммуноглобулинов из сыворотки крови морских свинок.

иврдения о практическом использовании научных результатов.

¡о результатам исследования изданы методические рекомендации для

слушателей факультета повышения квалификации " Разделение и очист-

^ аидо

та иммуноглобулинов сыворотки крови морской свинки и получение "спо-

.ги^ческих антисыиороток " // М.М.Интизаров, Л.А.Олеяксвич, Г.И.

Павлов, Г.Б.Телегин. - IL: Моск. вет. акад. им. К.И.Скрябина.~199< - 14 с. Эти методические рекомендации используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биологической химии по темам: " Биохимические основы иммунитета " и " Биохимия крови " / выписка из протокола № 9 от 8 июня 1994 г. заседания ученого совета факультета биотехнологии и экологии в ветеринарной медицине /. Научные результаты используются на кафедре биофизики и физики при чтении лекций и проведении практических занятий в спецкурсе " Биохемшпоминесценция " и " Биофизика клетки " / выписка из протокола №-2 от 15 ноября 1994 года ученого совета факультета биотехнологии и экологии в ветеринарной медицине /.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧШХ ШВЭДЗВ

1. Установленные особенности реакции фотобактерий на действие биостимуляторов и цитостатиков дают возможность применять морские люг нвсцирующие бактерии в качестве тест-объекта при экспресс-контроле на отсутствие токсичности вновь синтезируемых лекарственных пр< паратов.

2. Экспериментально отработанную методику нахождения оптимальных режимов воздействия на клетки физичнских факторов и-агентов химико-биологической природа рекомендуется использовать в научно-иссл( довательской работе по интенсификации биотехнологических процессо! с участием клеток различной этиологии.

3. Полученные результаты могут явиться базовыми при разработке методик выделения и очистки иммуноглобулинов сыворотки крови лабораторных и сельскохозяйственных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЙ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

■ I. Акопян В.Б., Кузнецов В.П., Цаплина / Олешкевич / A.A. Улг тразвуковая стимуляция биосинтеза интерферона // Дэкл. АН СССР. -1987. - Т.296. - (РЗ. - С.732 - 734.

2. Ультразвуковая кавитация в суспензии клеток / Н.И.Ботян, А.А.Олешкевич, Е.Г.Кутукова, В.Б.Акопян //Тез. докл. Воес. симпозиума " Акустическая кавитация и проблемы интенсификации техшлоп ческих процессов - Одесса. - 1989. - С.60.

3. Смирнова Л.П., Олешкевич A.A., Смоленский В.П. Исследоваш влияния ультразвука и митогенов на клеточйые культуры // Ультразв}

ельском хозяйстве:. Межвузовский сб. науч. тр. / Моск. пет., акад. им. .И.Скрябина. -М.. 1988. -С.49-52.

4. Олешкевич А.А., Смирнова Л.П., Акопян В.Б. Влияние физико-хи--ических факторов на монослой перевиваемых ¡слеток // Вопросы современ-ой биологии животных: Сб. науч. тр. / Моск. вет. акад. им. К.И.Скря-ина. -М., 1939. -С. 1,04-107.

5. Botyan N., Oleshkevich А., Akopvan V. Reaction of photobact.e-ia on ultrasound combined with medicine // Preceed. of UBIO MED-8. Brno. -1989. -P.49.

Ботян H., Олешкевич A.. Акопян В. Реакция фотобактерий на уль-развук и лекарственные препараты // Матер. UBIO MED-8. -Брно. -1089. С. 49.

6. Botyan N., Oleshkevich A., Akopyan V. Citostatic effect of ltrasound combined with medicine on photobacterla: Thesis V National onfer. on Biomedical Physics and Engineering. -Bulgaria.' -Sofia. 1989. -P.109-110.

Ботян H., Олешкевич A., Акопян В. Совместное цитостатическое гйствие ультразвука и лекарственных препаратов на фотобактерии: Те-лсы V нацист, конф. по биомедицинской физике и инженерии. -Болгария. ЭДия. -1989. -С.109-110.

7. А.е.. 1575362. Способ получения интерферона / А.А.Олешкевич, .Б.Акопян, В.П.Кузнецов.-1+4393622; Заяв. 18.03.88 г.

8. А.с. 1597387. Способ получения культуры клеток животных / .А.Олешкевич, В.Б.Акопян, Л.П.Смирнова,-г/4465008; Заяв. 22.07.88 г.

9. Akopyan V., Kuznetsov V., Oleshkevich A. The effect of ultra-Dund on interferon biosynthesis // Scripta Medlca. - 1990. -V. 63.

405-409.

Акопян В., Кузнецов В., Олешкевич А. Эффект ультразвука на бн-:интез интерферона // Scripta Medlca. - 1990. -Т. 63. -С. 405-409.

10. Олешкевич А.А. Действие биостимуляторов на бактериальные четки // Вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. tp. / Моск. вет. сад. им. К.И.Скрябина. -М., 1994.. -С.65-67.

11. Разделение и очистка иммуноглобулинов сыворотки крови морской зинки и получение видоспецифичекиих антисывороток. М.М.Интизаров. А.Олешкевич, Г.В.Павлов, Г.Б.Телегин: Методические рекомендации. L: Моск. вет. акад. им. К.И.Скрябина, 1994. -14 с.