Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ядерных протеогликанов клеток печени мышей

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ядерных протеогликанов клеток печени мышей"

та т

На правах рукописи УДК 577.352.4; 547.963.3

РГ6 0/1

Григорьева Эльвира Витальевна

Изучение ядерных протеогликанов клеток печени мышей

клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.И. Рыкова,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.Н.Загребельный Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Т.В. Русова

Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, г. Новосибирск

Ведущая организация: Институт биологии гена, г. Москва

Защита диссертации состоится 1998г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, просп. академика Лаврентьева, 10 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук " ^!/" А.Д.Груздев

Актуальность темы. Протеогликаны (ПГ) являются одним из компонентов живой клетки. Наряду с выполнением структурных функций, связанных с организацией околоклеточного окружения, протеогликаны участвуют в механизмах регуляции клеточной пролиферации. Они являются одним из регуляторов клеточного цикла, назйваемых ранее "кейлонами"' и способны изменять митотическую активность клеток тканеспецифич-ным и видонеспецифичным образом (Роничевская и др., 1985). Механизмы регуляторного воздействий протеогликанов на пролиферацию клеток до сих пор неизвестны. Полагают, что один из них может быть связан со способностью функционально активных углеводных цепей протеогликанов (гликозаминогликанов-ГАГ) транслоцироваться в ядро клетки (МШага е1 а1.,1986). Однако согласно литературным данным в ядрах клеток присутствуют также эндогенные молекулы протеогликанов, а регуляторный эффект экзогенных протеогликанов строго корреллирует с пролиферативным статусом клеток, из которых они были выделены. Это позволило высказать предположение, что в клеточном ядре, вероятно, постоянно присутствуют специфические виды протеогликанов, участвующие в поддержании определенного пролиферативного статуса данной клетки. Изучение таких протеогликанов, характерных для клеток с различным уровнем пролиферации, может служить одним из подходов к пониманию механизмов регуляции миготической активности клеток. Целью настоящей работы было изучение состава ядерных протеогликанов в нормальных и трансформированных клетках печени мышей и выявление возможных биохимических особенностей ядерных протеогликанов, характерных для клеток с различным пролиферативным статусом. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: 1) идентифицировать состав гликозаминогликанов в ядрах клеток нормальной печени и клеток гепатомы мышей; 2) показать присутствие (или отсутствие) в составе клеточных ядер истинных протеогликанов (имеющих белковый кор) и/или свободных цепей гликозаминогликанов; 3) провести сравнительный анализ ядерных ПГ(ГАГ) из клеток с различным пролиферативным статусом.

Научная новизна и практическая ценность. В данной работе впервые показано, что: 1) основная часть ядерных гликозаминогликанов клеток печени мышей представлена дерматансульфатом. Идентифицированный в клеточных ядрах дерматансульфат ковалентно связан с коровым белком и является, таким образом, дерматансульфат протеогликаном. 2) В ядрах клеток, подвергнутых неопластической трансформации происходит частичное замещение дерматансульфата на хондроитинсульфат АС, который, как известно, является не полностью модифицированным предшественником дерматансульфата. 3) Дерматансульфат протеогликан в ядрах нормальных клеток присутствует в виде макромолекулярных агрегатов с Г-богатой олигоРНК длиной 9-10 нуклеотидов, в то время как ХСАС этой способностью не обладает и выделяется в чистом виде. Полученные данные открывают возможность новых подходов к лучению механизма регуляторного действия макромолекул протеогликанов, основанных на использовании методов работы с РНК при исследовании внутриядерных комплексов протеогликан-РНК. Появление специфических ПГ (ХСАС) в ядрах активно пролиферирующих клеток могло бы служить критерием определения пролиферативного статуса исследуемой клетки.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты исследований были доложены на Российско-Французском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (Новосибирск, 1995), на международной Школе молодых ученых "Структура и функции генома" (Марсиана Марина, 1996). Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах, содержит 26 рисунков и 6 таблиц. Список литературы составляет 187 источников. Работа состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследований, Обсуждение результатов, Заключение, Выводы, Список литературы.

Материалы и методы Материалы. В работе использовали печень мышей линии СВА^ас, высокораковой линии ДД в возрасте 3-9 месяцев и гепатому, индуцированную мышам линии ДД орто-аминоазотолуолом.

Методы. Клеточные ядра получали седиментацией в 2.1М сахарозе и их чистоту проверяли под световым микроскопом после окрашивания азур-эозином. Для выделения протеогликанов из клеточных ядер нами был разработан метод, который заключается в постадийном удалении различных классов макромолекул из исходного гомогената и дает в результате препарат, значительно обогащенный внутриклеточными проте-огликанами (Григорьева и др., 1992). Содержащиеся в нем примесные белки удаляли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Сефадексе А-25, затем экстрагировали липиды смесью хлороформ:метанол:НС1 (200:100:0.1) и обрабатывали интерфазную фракцию РНКазой А для удаления нуклеиновых кислот.

Полученные препараты ядерных протеогликанов характеризовали по элекгрофоретической подвижности в агарозном геле в ВаАс2 буфере, степени окрашивания Толуидиновым синим и чувствительности к обработке специфическими ферментами.

Результаты и их обсуждение Определение состава ядерных гликозаминогликанов клеток печени мышей. Состав углеводных молекул (гликозаминогликанов - ГАГ) в препарате ядерных протеогликанов идентифицировали обработкой препарата специфическими ферментами, избирательно деградирующими углеводные цепи ГАГ различных классов, с последующим электрофорезом в агарозном геле в ВаАсг буфере, pH 8.0.

Рис.1 Электрофоретическое i 2 з 4 5 разделение ядерных протеог-

^ ликанов из клеток печени мы-10111 ' %% ^ , шей и идентификация гликоза-

ги-дсгп" 4 (+) миногликанов, входящих в их

дсrrr— щщ .т состав. 1 - интактный препа-

рат, 2 - после обработки хонд-роитин АС лиазой, 3 - после обработки хондроитин ABC лиазой, 4 -после обработки хондроитин ABC лиазой и гепариназой, J - после обработки гепариназой.

Полученные данные показали, что ядра клеток печени мышей содержат гетерогенный набор углеводных цепей гликозаминогликанов двух различных классов - гепарансульфата(ГС) и дерматансульфата(ДС). Появление на электрофореграмме полосы дерматансульфата после удаления цепей ГС гепариназой(рис.1,5) может указывать на присутствие в ядрах клеток печени мышей сложного протеогликана, несущегб одновременно цепи гепарансульфата и дерматансульфата.

Такой набор ядерных протеогликанов не был ранее описан ни в одном из исследованных объектов, хотя отдельные его компоненты идентифицированы в различных типах клеток: гепарансульфат - в ядрах гепатоцитов крысы (Fedarko,Conrad,1986) и дерматансульфат - в ядрах гранулоцитов яичника крысы (Hiscock et al.,1994). Однако по их данным гепарансульфат (ГС) и дерматансульфат (ДС) присутствуют в клеточных ядрах в виде углеводных цепей гликозаминогликанов. Сложные виды протеогликанов, несущие углеводные цепи различных классов, в ядрах клеток никем ранее обнаружены не были.

Доказательство ядерного происхождения выделенных протеогликанов. Поскольку сложные виды протеогликанов встречаются обычно на плазматических мембранах клеток, было необходимо убедиться, что идентифицированные нами ядерные гликозаминогликаны(ГАГ) не являются частью ГАГ других клеточных субфракций. С этой целью

а) цитоскелетные филаменты и ядерные мембраны были удалены обработкой ядер раствором, содержащим 1% Tween-40 и 0.5% дезоксихолат натрия.

Рис.2 Спектр ядерных протеогликанов, полученный сканированием элек-трофореграмм: а - ПГ, выделенные из исходных необработанных ядер, б - ПГ из ядер, очищенных от цитоске-летных филаментов и ядерных мембран. Электрофореграммы сканировали при 590нм на денситометре ОЕ-503 (Labor, Венгрия).

а)

б)

ГСПГ— | клеточных субфракций. Цит

ДС-ГСПГ__И^ яН * * щтозольные протеогликаны;

Сравнительный анализ спектров показал, что такая обработка не приводит к исчезновению протеогликанов из ядер клеток (рис.2,а,б). Хотя электрофоретическая подвижность различных фракций протеогликанов несколько изменяется, однако основной состав ядерных ПГ остается прежним и даже дает более четкую картину электрофоретического разделения. Во фракции ядерных мембран гликозаминогликаны обнаружены не были.

б) были выделены гликозаминогликаны из различных клеточных субфракций (цитозоль, плазматические мембраны, фракция внутриклеточных органелл и ядра) и проведен их сравнительный электрофоретиче-ский анализ.

цит я м о Рис.3 Электрофореграмма

^ ^ протеогликанов из различных

I

дСПГ_ зз^ Щ (+)' я - ядерные протеогликаны; м -

протеогликаны плазматических мембран; о - протеогликаны внутриклеточных мембран и органелл.

Характерный спектр электрофоретического разделения ядерных протеогликанов(ПГ), в котором наблюдается явное преобладание одного из дерматансульфат протеогликанов(ДСПГ) над гепарансульфат-дерматансульфат протеогликаном(ГС-ДСПГ) и гепарансульфатом(ГС), отличается от спектра ПГ из других клеточных субфракций, что также может служить подтверждением ядерного происхождения исследуемых нами протеогликанов.

Таким образом нами было показано, что идентифицированные гликозаминогликаны действительно имеют ядерное происхождение и представляют собой гетерогенную популяцию, основное количество которой составляет дерматансульфат. В минорных количествах в ядрах присутствуют, вероятно, гепарансульфат и гепарансульфат-дерматансульфат протеогликан.

Содержание гликозаминогликанов в ядрах клеток составляет приблизительно 8.5% от суммы всех клеточных ГАГ и 0.1% от суммарного

количества ядерных белков, что согласуется с литературными данными (РесЬгко.Сопгаё, ] 986).

Связь гликозаминогликанов с коровым белком в ядрах клеток Поскольку присутствие в клеточных ядрах истинных молекул протеогликанов (в которых углеводные цепи ковалентно связаны с коровым белком) было показано ранее только для эмбрионов морских ежей, было важно проверить, действительно ли они присутствуют также и в ядрах клеток млекопитающих.

С этой целью мы провели обработку препарата ядерных протеог-ликанов щелочным раствором боргидрида, который гидролизует глико-зидную связь между ГАГ и коровым белком.

Рис.4 Электрафореграмма ядерных протеогликанов до и после обработки их щелочным боргидридом. а - исходный препарат интактных ПГ, б - после обработки ЫаВН4 (отделившиеся цепи гликозаминогликанов).

Из рис.4 видно, что обработка препарата ядерных протеогликанов боргидридом щелочи приводит к изменению электрофоретической подвижности отделившихся гликозаминогликанов(ГАГ) по сравнению с ин-тактным препаратом. Это может указывать на то, что первоначально ГАГ были связаны с коровым белком и гидролиз этой связи изменил подвижность гликозаминогликанов при электрофорезе.

Коровые белки ядерных ПГ были выделены обработкой препарата щелочным боргидридом, отделены от ГАГ ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-Сефадексом А-25 и проанализированы электрофорезом в полиакриламидном геле в диссоциирующих условиях (рис.5).

Согласно результатам электрофореза, основную массу коровых белков составляют белки с Мв 60-66кДа, помимо которых в препарате присутствуют также несколько минорных белков большего молекулярного веса.

б

I ГС

и

I :

ГС-ДСПГ— дс ?

дспг - 4

Рис.5 Электрофоретическое разделение коровых белков ядерных протеогли-канов в полиакриламидном геле : а - ко-ровые белки ядерных протеогликанов, б - стандартный набор белков ( LMJV Calibration kit, "Pharmacia").

Таким образом, изменение электро-форетической подвижности гликозами-ногликанов по сравнению с протеоглика-нами и появление на электрофореграмме коровых белков говорит о том, что в ядрах клеток печени мышей действительно присутствуют интактные макромолекулы протеогликанов (ПГ). Состав ядерных протеогликанов гетерогенен и представлен как простым ПГ (дерматансульфат протеогликан), так и сложным ПГ, на белковом коре которого имеются цепи гепарансульфата и дерматансульфата (ГС-ДС ПГ). Помимо этого возможно присутствие в ядрах клеток гепаран-сульфатов в виде свободных цепей гликозаминогликанов.

Полученные нами данные о присутствии интактных молекул протеогликанов в ядрах клеток in vivo дополняют имеющиеся литературные данные (Kinoshita,1974) и служат подтверждением реального транспорта синтезированных протеогликанов в ядро клетки.

Локализация протеогликанов в клеточном ядре Для выяснения внутриядерной локализации идентифицированных нами протеогликанов ядра фракционировали на ядерные мембраны, фракцию растворимых ядерных белков, хроматин и ядерный матрикс по методу Fey et al.(1986). Протеогликаны из исследуемых фракций выделяли методом, аналогичным выделению протеогликанов из интактных ядер и анализировали электрофорезом в агарозном геле (рис.6).

^s-^ —-да <- СТАРГ

Мв, кДа

ч ! - «-.«¡í — 94 М

66- « ¿л f>r * — 67 i

60--/п

• 4 — 43

ó — 30 * (+)

^--20,1

- «Й* — 14,4

а 6 в

Рис.6 Электрофореграшш протеогликанов из различных

1С

ГС . субфракций ядра. а - ин-

ДСПГ— |(1

(О

тактный препарат ядерных протеогликанов, б - протеог-ликаны, выделенные из хрома-тиновой фракции, в - протеог-ликаны, выделенные из фрак-

ции растворимых ядерных белков.

Элекгрофоретический анализ протеогликанов из различных ядерных субфракций показал, что дерматансульфат протеогликан локализован преимущественно в хроматиновой фракции, а гепарансульфат - во фракции растворимых ядерных белков. Во фракции ядерных мембран и ядерном матриксе протеогликаны обнаружены не были. Не исключено, что присутствие в клеточных ядрах различных классов протеогликанов и их различная внутриядерная локализация могут быть связаны с неоднозначностью выполняемых ими функций. В частности, присутствие основного количества ядерных ПГ(ДСПГ) во фракции хроматина согласуется с литературными данными (Ригика\уа, Тегауата,1977) и может указывать на возможность его участия в процессах поддержания определенного уровня матричной активности хроматина.

Исследование ядерных протеогликанов опухолевых клеток. Для

проведения сравнительного анализа состава ядерных протеогликанов из клеток с различным уровнем митотической активности нами были выделены и идентифицированы ядерные ПГ из клеток гепатомы мыши. В качестве объекта были использованы клетки асцитной гепатомы, охарактеризованные как гепатокарцинома. Все манипуляции проводились аналогично исследованию ядерных протеогликанов нормальных клеток. Элек-трофоретический анализ показал (рйс.7), что ядра клеток гепатомы также содержат гетерогенную популяцию протеогликанов, в состав которой входят гепарансульфат протеогликан, дерматансульфат протеогликан и хондроитинсульфат АС протеогликан.

гспг-

дспг-

ХСАС ПГ -

crapi

РНК

О

Рис. 7 Электрофо-ретическое разделение ядерных протеогликанов из клеток гепатомы и идентификация гликозаминоглжа

нов, входящих в их состав.

а - препарат ядерных ПГ клеток гепатомы, б - после обработки хонд-

роитин АС лиагой, в - после обработки хондроитин ABC лиазой, г - noSene обработка HNO2, д - после обработки хондроитин ABC лиазой и

HNO2, е - после обработки хондроитин ABC лиазой, HNO2 и РНКазой А. Особенностью ядерных протеогликанов опухолевых клеток является то, что исходный препарат сразу выделяется в чистом виде и не требует дополнительной обработки РНКазой А. Однако при удалении из препарата гепарансульфата на электрофореграмме проявляется значительное количество РНК (рис.7,д), что подтверждает необходимость очистки ядерных ПГ гепатомы от РНК в ходе выделения. Отметим, что аналогичное появление РНК после удаления углеводных цепей ГАГ было недавно показано в работе Умбрейта (Umbreit, 1996).

Сравнительный анализ ядерных протеогликанов гепатомы с ядерными протеогликанами, выделенными из клеток нормальной печени мышей, показал их отличие, которое закпючйется в появлении в ядрах клеток гепатомы молекул хондроитансульфат АС протеогликана, отсутствующего в ядрах нормальных клеток.

rcnrz:

дс-гс пг — дспг —

■ старт

:гспг

- ДСПГ "ХСАС ПГ

Рис.8 Электрофоретиче-ское разделение протеогликанов из клеточных ядер нормальной (Н) и трансформированной (Г) печени мышей.

Более четко это отличие видно при сравнении не интактных проте-огликанов, а их углеводных цепей(ГАГ), полученных после разделения молекулы на белковую и углеводную части и удаления коровых белков.

Рис.9 Электрофоретическое разделение гликозаминогликанов из клеточных ядер нормальной (Н) и трансформированной (Г) печени мышей.

Как видно из электрофореграммы, в ядрах клеток гепатомы наряду с появлением хондроитинсульфата АС происходит заметное увеличение относительного содержания гепарансульфата.

Сканирование спектра электрофорегического разделения ядерных гдикозаминогликанов(ГАГ) трансформированных клеток печени позволило провести приблизительную количественную оценку соотношения различных видов ГАГ в препарате (рис.10).

Рис.10 Денситограмма электрофореграммы ядерных гликозаминогликанов из клеток гепатомы. а) - денситограмма электрофореграммы, б) электрофореграмма. Электрофореграммы сканировали при 590нм на денситометре ОЕ-503 (Labor, Венгрия). Оценка площади пиков показала, что гепарансульфаты составляют основную массу ядерных гликозаминогликанов (ГАГ) гепатомы (около75%), а остальное количество приходится на дерматансульфат и хондроитинсульфат АС.

Таким образом, принципиальным отличием состава ядерных ГАГ клеток гепатомы от ядерных ГАГ нормальных клеток печени можно считать появление в трансформированных клетках хондроитинсульфата АС

н г

Дс— * , —Дс (+) 4- -ХСАС

' «I' ^

t*

............

6)

•III II

старт ГС ДС ХСАС

О-*-(+)

и увеличение относительного содержания гепарансульфата. Углеводные цепи ГАГ присутствуют в ядрах, по-видимому, в виде интактных макромолекул протеогликанов.

Известно, что хондроитинсульфат АС характерен для мембранных структур активно пролиферирующих клеток (эмбриональных и опухолевых) (Рыкова и др., 1990, Йепке et а1.,1996). Результаты, полученные нами для ГАГ(ПГ) из клеточных ядер, дополняют литературные данные и показывают, что замещение ДС на ХСАС, происходящее на плазматической мембране при повышении уровня митотической активности клетки, затрагивает также и клеточное ядро. Не исключено, что именно ядерные гликозаминогликаны способны опосредовать антипролиферативные эффекты экзогенных протеогликанов. Возможно, появление хондроитин-сульфата АС в клеточных ядрах (или исчезновение дерматансульфата) служит одним из внутриядерных сигналов к переходу клетки на программу активного деления, причем механизм постепенной модификации ХСАС до ДС (характерного для взрослой ткани) может обеспечивать плавную регуляцию уровня митотической активности клеток. Образование протеогликанами макромолекулярных агрегатов с РНК При исследовании внутриклеточных протеогликанов(ПГ) обращают на себя внимание некоторые биохимические особенности ядерных ПГ. Интактные препараты ядерных протеогликанов, выделенные без специальных очисток, всегда содержали примесь РНК, которая окрашивается на электрофореграмме в синий цвет (рис. 11,а).

Рис.11 Электрофореграм-ма интактпого препарата ядерных протеогликанов до и после обработки РНКазой А. а - интакт-ный препарат ПГ, б - после обработки РНКазой А.

После удаления РНК РНКазой А спектр элекгрофоретического разделения ядерных протеогликанов сильно изменяется в сторону значительного увеличения содержания дерматансульфат протеогликана.

РНК —

гс-дспг—

ГС

гс-дспг дспг

б

Эти данные привели нас к предположению, что РНК, присутствующая в препаратах протеогликанов, является не просто примесью. Возможно, нашим методом ядерный дерматансульфат протеогликан выделяется как комплекс с РНК и высвобождается лишь после ее деградации. Хроматографический анализ интактного препарата ядерных протеогликанов гель-фильграыией в нативных условиях и в условиях, способствующих диссоциации нековалентных комплексов, показал изменение хроматографической подвижности РНК, что также говорит о возможной взаимосвязи этой РНК с другими макромолекулами, присутствующими в препарате (рис. 12).

Хотя в нативных условиях профиль хроматографической элюции выглядит в виде 2 не полностью разошедшихся пиков -1 и II (рис.12,а).В диссоциирующих условиях практически весь материал, поглощающий при 260нм, элюировался в виде четкого пика (рис. 12,6), что указывает на достаточно высокую гомогенность РНК, присутствующей в препарате ядерных протеогликанов, по размеру. Изменение электрофоретической подвижности дерматансульфат протеогликана после удаления РНК и изменение хроматографической подвижности РНК в диссоциирующих условиях говорит о возможном взаимодействии этих макромолекул.

Чтобы проверить присутствие протеогликанов в РНК-содержащих пиках I и II, соответствующие им хроматографические фракции были обработаны РНКазой А и проанализированы электрофорезом в агароз-ном геле в ацетате бария (рис.13):

п,

Рис.13 Элсктрофореграшш ядерных

а С

........................................(^ протеогликанов, выделенных из пиков

ГС | РНК-содержащего материала., а -

дГПГ_ ^ ^ протеогликаны, выделенные из пика

I, б - протеогликаны, выделенные из пика II (рис. 12).

По результатам электрофореза можно сказать, что основная часть ядерных протеогликанов (дерматансульфат протеогликан) содержится в пике II и комплекс протеогликан-РНК элюируется, по-видимому, именно в этом пике. В пике I обнаружено незначительное количество гепаран-сульфата.

Следует отметить, что протеогликаны, выделенные из цитозольной фракции, не содержали РНК, несмотря на значительное количество РНК в исходной цитозольной фракции (рис.14). Сравнение интактного препарата ядерных протеогликанов с протеогликанами из других клеточных субфракций показало, что примесь РНК присутствует лишь в препаратах протеогликанов, выделенных из клеточных органелл.

Рис.14 Электрофоре-

я м о цит

грамма интактных

-д.я»^' —~-старт : ' (-) '

препаратов протеог-

РШС - __ _

' ликанов из различных ГС-ДСПГ— ЯР " ' (+) клеточных субфрак-.

ДСПГ— Ш ций. Я - ядерные ПГ, м

- ПГ плазматических

мембран, о - ПГ внутриклеточных мембран и органелл, цит - цито-золъные ПГ. (РНК окрашена на электрофореграмме в синий цвет, протеогликаны окрашены в фиолетовый цвет.)

Однако лишь во фракции ядерных протеогликанов удаление присутствующей РНК приводило к заметному перераспределению электро-фэретических полос.

Отсутствие РНК в препарате протеогликанов из цитозоля, сохранение картины электрофоретического разделения ПГ из фракции внутриклеточных органелл и мембран после удаления РНК и изменение кар-

тины электрофоретического разделения ядерных протеогликанов являются косвенными аргументами в пользу того, что присутствие РНК в препарате ядерных протеогликанов является не случайным, а они образуют комплекс с определенным соотношением компонентов.

Согласно проведенной оценке, соотношение белков, гликозами-ногликанов(ГАГ) и РНК в ядерных макромолекулярных агрегатах составляет 5:1:5. Практически полное отсутствие РНК в препарате ци-тозольных протеогликанов (соотношение белковой и углеводной частей составляет 1:1) является косвенным доказательством избирательного взаимодействия РНК со специфическими ядерными протеогликанами. Определение длины РНК Далее мы провели оценку длины и состава РНК, входящей в состав комплекса. Длину олигорибонуклеотидов определяли ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Сефадексе А-25, элюи-руя их градиентом раствора ИаС1 (0-0.8М) в 7М мочевине (рис.15).

Рис. 15 Хрома-

С-И С1 М тография олиго РНК, выделенной из препаратов ядерных протеогликанов.

В качестве маркеров длины использовали стандартные олигонуклео-тиды длиной 4 и 15 нуклеотидов. С^оа. концентрация ИаС1 в молях. Согласно полученным данным, исследуемая РНК элюировалась с колонки при концентрации ИаС1 равной 0.31 М, что соответствует длине 9-10 нуклеотидов и согласуется с предварительным результатом, полученным гель-фильтрацией.

Для определения состава олигорибонуклеотидов исследуемую РНК гидролизовали щелочью и проводили тонкослойную хроматографию на

0,2-

пластинках Силикагеля. Количественную оценку содержания нуклеоти-дов проводили спектрофотометрическим методом.

Рис.16 Хроматографическое разделение нуклеотидов на пластинке Силикагеля. А - аденозин, Ц - цитидин, У - уридин, Г - гуаннозин, олигоРНК - гидролизованная олигоРНК.

Результаты показали, что в исследуемой пробе практически отсутствуют аденозин, а половину количества остальных нуклеотидов составляет гуанозин (Г- 53.1 % , У - 25.6 % , Ц -21.3%).

Таким образом, согласно предварительной оценке, в составе ин-тактного препарата ядерных протеогликанов(ПГ) из клеток нормальной печени мышей присутствуют Г-богатые олигорибонуклеотиды длиной 9-Юнуклеотидов. Эти олигонуклеотиды выделяются во фракции ядерных протеогликанов, по-видимому, как компоненты макромолекулярного комплекса с одним из видов ядерных ПГ(дерматансульфат протеоглика-ном).

Хотя наши данные являются первым экспериментальным подтверждением возможности взаимодействия ядерных протеогликанов с нуклеиновой кислотой, факт этот не является чем-то совсем уж невероятным и косвенные указания на какую-то функциональную взаимосвязь гликозаминогликанов (протеогликанов) с РНК несколько раз появлялись в литературе (Тшика\уа, Тегауата,1979). А в последней работе Умбрейта (итЬгек,1996) было получены данные о взаимодействии дерматансуль-фат протеогликана из кожи свиньи с Г-богатой олигоРНК дойной около 9-10 и 20 нуклеотидов, что является прямым подтверждением полученных нами результатов.

Каково значение взаимодействия ядерных протеогликанов с РНК (или олигонуклеотидами) - пока неизвестно. Однако не исключено, что именно образование подобных макромолекулярных агрегатов является

одним из звеньев механизма регуляции клеточной пролиферации экзо-- генными или эндогенными протеогликанами(глйкозаминогликанами).

ВЫВОДЫ

1. В ядрах клеток печени мышей идентифицированы 2 различных класса

v гликозаминогликанов - гепарансульфат и дерматансульфат.

2. В клеточных ядрах гликозаминогликаны представлены в форме про-теогликанов. Состав ядерных протеогликанов. гетерогенен и содержит как простые протеогликаны (дерматансульфат протеогликан), так и сложный протеогликан, на белковом коре которого имеются цепи ге-парансульфата и дерматансульфата.

3. Протеогликаны различных классов имеют различную внутриядерную локализацию - дерматансульфат локализован в хроматиновой фракции ядра, а гепарансульфат во фракции растворимых ядерных белков.

4. При злокачественной трансформации состав ядерных протеогликанов изменяется - присходит увеличение относительного содержания гепа-рансульфата и в ядрах клеток гепатомы появляется хондроитинсуль-фат АС, отсутствующий в ядрах нормальных клеток.

5. Дерматансульфат протеогликан, составляющий основную массу ядерных протеогликанов, выделяется в виде макромолекулярного агрегата с Г-богатыми олигорибонуклеотидами определенной длины (9-10 нук-леотидов).

Список работ, опубликованных по теме диссертации :

1. Григорьева Э.В., Рыкова В.И. Ядерные протеогликаны клеток печени мышей: выделение и идентификация. - Биохимия, 1992, 57, 8, 11651170.

2. Grigorieva E.V., Rykova V.I. Nuclear proteoglycans of mouse liver cells: specific interaction with G-rich oligonucleotides. - Protein Science, 1995, 4, suppl.l, 106.

3. Grigorieva E.V., Rykova V.I., Levashova Z.B. Revelation and characterization of proteoglycan-G-rich oligoRNA complex. - French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression, Novosibirsk, Russia, 1995.

4. Григорьева Э.В., Рыкова В.И., Ахунов Э.А. Ядерные протеогликаны клеток печени мышей: гетерогенность состава и некоторые биохимические свойства. -Цитология, 1997, 39, 51.

5. Григорьева Э.В., Рыкова В.И. Взаимодействие специфических ядерных протеогликанов с олигорибонуклеотидами. - Докл.Акад.Наук, 1997, 356, 5, 693-695.

6. Рыкова В.И., Григорьева Э.В. Состав протеогликанов в ядрах клеток, гепатомы мышей - Биохимия, 1998, 9.

Подписано к печати 18.06.98 Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд.л. 08 Тираж 100 экз. Заказ 48.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьева, Эльвира Витальевна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

1 На правах рукописи

а '

ж

^ ГРИГОРЬЕВА ЭЛЬВИРА ВИТАЛЬЕВНА

Изучение ядерных протеогликанов клеток

печени мышей

Клеточная биология - 03.00.25

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.н. В.И.Рыкова

Новосибирск -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................ ......10

2.1 Общие сведения о протеогликанах...................................................10

2.2 Структура и классификация гликозаминогликанов..........................11

2.2.1 Структурная гетерогенность гликозаминогликанов..................13

2.2.2 Модификационные возможности гликозаминогликанов..........14

2.3 Структура протеогликанов.................................................................16

2.3.1 Классификация протеогликанов.................................................18

2.3.2 Организация молекул протеогликанов.......................................18

2.3.3 Гликозилированные и белковые формы функционально активных протеогликанов ..........................................................19

2.3.4 Протеогликан и белок как альтернативные продукты одного гена..............................................................................................20

2.4 Локализация протеогликанов и их функции...................................... 21

2.4.1 Протеогликаны внеклеточного матрикса...................................22

2.4.2 Протеогликаны плазматических мембран.................................. 24

2.4.3 Внутриклеточные протеогликаны...............................................28

2.4.4 Ядерные протеогликаны..............................................................31

2.5 Биологические функции протеогликанов..........................................33

2.6 Протеогликаны нормальных и трансформированных клеток.......... 34

2.6.1 Изменение степени сульфатирования гликозаминогликанов ... 34

2.6.2 Изменения состава протеогликанов в клетках с различным пролиферативным статусом.......................................................35

2.7 Антимитотическая активность протеогликанов................................39

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................45

3.1 Реактивы..............................................................................................45

3.2 Материалы..........................................................................................46

3.3 Методы.................................................................................................47

3.3.1 Выделение ядер............................................................................47

3.3.2 Очистка ядер от цитоскелетных филаментов.........................................47

3.3.3 Удаление ядерных мембран........................................................48

3.3.4 Фракционирование ядер..............................................................48

3.3.5 Выделение протеогликанов.........................................................49

3.3.6 Ионообменная хроматография йнтактных препаратов протеогликанов...........................................................................49

3.3.7 Экстракция липидов органическими растворителями...............50

3.3.8 Аналитический электрофорез в агарозном геле.........................50

3.3.9 Обработка азотистой кислотой...................................................51

3.3.10 Обработка ферментами.............................................................51

3.3.11 Электрофорез коровых белков в полиакриламидном геле......51

3.3.12 Аналитические методы..............................................................52

3.3.13 Гель-фильтрация очищенных препаратов протеогликанов..... 53

3.3.14 Хроматографическое определение длины РНК.......................54

3.3.15 Определение состава выделенной РНК методом тонкослойной хроматографии............................................................................54

4. РЕЗУЛЬТАТЫ..............................................................................................................55

4.1 Выделение протеогликанов из клеточных ядер................................ 55

4.2 Определение состава ядерных гликозаминогликанов клеток печени мышей.................................................................................................58

4.3 Доказательство ядерного происхождения выделенных протеогликанов.......;...........................................................................60

4.3.1 Спектр ядерных гликозаминогликанов до и после очистки ядер от цитоскелетных филаментов............................................:......60

4.3.2 Сравнительный анализ состава гликозаминогликанов из различных клеточных субфракций............................................62

4.4 Связь гликозаминогликанов с коровым белком в ядрах клеток......66

4.5 Локализация протеогликанов в клеточном ядре...............................70

4.6 Изучение состава ядерных протеогликанов в трансформированных клетках печени мышей................................71

4.6.1 Определение состава ядерных протеогликанов опухолевых клеток..........................................................................................72

4.6.2 Сравнительный анализ состава протеогликанов из ядер нормальных и трансформированных клеток печени мышей .. 74

4.7 Биохимические особенности ядерных протеогликанов ...................77

4.7.1 Образование протеогликанами макромолекулярных агрегатов с РНК..............................................................................................78

4.7.2 Хроматографический анализ интактного препарата ядерных протеогликанов........................................................................... 81

4.8 Исследование РНК, присутствующей в интактном препарате

ядерных протеогликанов.....................................................................84

4.8.1 Определение длины РНК............................................................84

4.8.2 Определение нуклеотидного состава олигоРНК....................87

5. ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................................................89

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................99

7. ВЫВОДЫ...................................................................................................................101

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................102

Работа выполнена в лаборатории Структуры генома Института цитологии и генетики Сибирского Отделения Российской Академии Наук. Материалы работы докладывались на Международном Российско-Французском симпозиуме по регуляции экспрессии генов (Новосибирск, 1995), обсуждались на 2 Международной школе молодых ученых по структуре и функциям генома (Марсиана Марина, Италия, 1996).

Автор глубоко признательна к.б.н. Рыковой Валентине Ивановне за постоянную помощь и поддержку в ходе выполнения данной работы и к.б.н. Савинковой за ценные замечания, связанные с оформлением работы. Автор также выражает благодарность д.б.н. Дымшицу Г.М., к.б.н. Дикаловой А.Э., к.б.н. Меркуловой Т.И., Левашовой З.Б. за помощь и внимание, оказанные при обсуждении работы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

•ГАГ - гликозаминогликан

•Ге - гепарин

•ГС - гепарансульфат

•ДС - дерматансульфат

•ХС - хондроитинсульфат

•ГК - гиалуроновая кислота

•ПГ - протеогликан

•ГСПГ - гепарансульфат протеогликан

•ДСПГ - дерматансульфат протеогликан

•ХСПГ - хондроитинсульфат протеогликан

•ВКМ - внеклеточный матрикс

•01сМ - глюкозамин

•ОаШ - галактозамин

•01сиА - глюкуроновая кислота

•МоИА - идуроновая кислота

•БОГ - фактор роста фибробластов

•КОБ - фактор роста нервной ткани

•ЕОБ - эпидермальный фактор роста

•ТСГ - трансформирующий фактор роста

1. ВВЕДЕНИЕ

Протеогликаны (ПГ) являются одним из компонентов живой клетки.

Основное их количество сосредоточено во внеклеточном матриксе (ВКМ) и на поверхности клеток, где они играют важную роль в адгезии и агрегации клеток (Storms et al.,1996), поддержании межклеточного контакта и передаче информации (Bernfield et al.,1992), механизмах действия факторов роста (Faham et al.,1996, Gleizes et al.,1995). Эти эффекты во многом определяются углеводными цепями протеогликанов (гликозаминогликанами), которые способны к самоассоциации и взаимодействию с различными компонентами ВКМ, функционально активными регуляторными молекулами и двухвалентными катионами Са2+, Mg2*.

Наряду с выполнением структурных функций, связанных с организацией околоклеточного окружения, протеогликаны участвуют в механизмах регуляции клеточной пролиферации. Они являются одним из регуляторов клеточного цикла, называемых ранее "кейлонами" (Рыкова и др., 1981) и способны изменять митотическую активность клеток тканеспецифичным и видонеспецифичным образом (Роничевская и др.,1985). Механизмы регуляторного воздействия протеогликанов на пролиферацию клеток до сих пор неизвестны.

В последнее время было выдвинуто предположение, что один из таких механизмов может быть связан со способностью функционально активных углеводных цепей протеогликанов (гликозаминогликанов - ГАГ) транслоциро-ваться в ядро клетки. Такая транслокация показана для экзогенных гепаран-сульфатов (ГС) (Ishihara et al.,1986), мембранных гепарансульфатов и дерма-тансульфатов (ДС) (Hiscock et al.,1994), причем состав и количество транслоци-рованных ГС коррелируют с уровнем митотической активности клеток (Fedarko, Conrad, 1986). Что является материальной основой подобной взаимосвязи - пока непонятно. Возможно, проникая в ядро клетки, углеводные цепи гликозаминогликанов способны изменять матричную активность хроматина взаимодействием

с ядерной ферментной системой (Furukawa, Terayama, 1977) и регулировать таким образом митотическую активность клетки (Fedarko et al.Д989, Ishihara, Conrad, 1989).

Регуляторная роль протеогликанов изучалась в лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН в течение ряда лет - исследовались протеогликаны из различных типов клеток, был охарактеризован их состав и структурные особенности. В работах В.И.Рыковой и Г.М.Роничевской с соавторами была показана антимитотическая активность ПГ, выделенных из препаратов суммарной клеточной РНК (Роничевская и др.,1973) и их влияние на синтез ДНК в клетке (Зимина, Рыкова, 1986). Был обнаружен интересный факт, связанный со строгой корреляцией антимитотического эффекта изучаемых протеогликанов с проли-феративным статусом клеток, из которых они были выделены - ПГ взрослых тканей обладали такой активностью, в то время как ПГ из эмбриональных и опухолевых тканей не обладали способностью ингибировать пролиферативную активность клеток (Роничевская, 1985, Fedarko et al., 1989).

На основании этих данных было высказано предположение, что транслокация экзогенных гликозаминогликанов в клеточное ядро является лишь одним из нескольких механизмов влияния ПГ(ГАГ) на митотическую активность клетки. Возможно, в клеточном ядре постоянно присутствуют специфические виды протеогликанов, участвующие в поддержании определенного пролиферативно-го статуса данной клетки, в то время как транслокация функционально активных гликозаминогликанов из других компартментов опосредует регуляторные эффекты экзогенных и мембранных макромолекул.

Для проверки этого предположения нам представляется важным показать присутствие (или отсутствие) в клеточных ядрах интактных макромолекул протеогликанов, имеющих белковый кор, и провести сравнительный анализ состава ядерных ПГ из клеток нормальной и трансформированной ткани. Идентификация макромолекулярных компонентов ядра, способных взаимодействовать с идентифицированными ядерными протеогликанами, могла бы дать перспектив-

ный подход к дальнейшему изучению роли внутриядерных ПГ и возможного механизма их функционирования.

Научная новизна и практическая ценность. В данной работе впервые показано, что: 1) основная часть ядерных гликозаминогликанов клеток печени мышей представлена дерматансульфатом. Идентифицированный в клеточных ядрах дерматансульфат ковалентно связан с коровым белком и является, таким образом, дерматансульфат протеогликаном. 2) В ядрах клеток, подвергнутых неопластической трансформации происходит частичное замещение дерматан-сульфата на хондроитинсульфат АС, который, как известно, является не полностью модифицированным предшественником дерматансульфата. 3) Дерматансульфат протеогликан в ядрах нормальных клеток присутствует в виде макро-молекулярных агрегатов с Г-богатой олигоРНК длиной 9-10 нуклеотидов, в то время как ХСАС этой способностью не обладает и выделяется в чистом виде. Полученные данные откывают возможность новых подходов к изучению механизма регуляторного действия макромолекул протеогликанов, основанных на использовании методов работы с РНК при исследовании внутриядерных комплексов протеогликан-РНК. Появление специфических ПГ (ХСАС) в ядрах активно пролиферирующих клеток может служить критерием определения про-лиферативного статуса исследуемой клетки и иметь практическое значение как один из возможных методов диагностики злокачественной трансформации. Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты исследований были доложены на Российско-Французском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (Новосибирск, 1995), на международной Школе молодых ученых "Структура и функции генома" (Марсиана Марина, 1996).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общие сведения о протеогликанах

Протеогликаны (ПГ) - это сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и ковалентно связанных с ним углеводных цепей особой структуры. Они называются гликозаминогликанами (ГАГ) и представляют собой линейный полимер, структурной единицей которого является дисахарид гексозамин - уро-новая кислота.

Протеогликаны присутствуют во всех тканях многоклеточных животных и наиболее хорошо представлены в соединительных тканях. Их состав характеризуется тканевой, но не видовой специфичностью. Протеогликаны занимают важные стратегические позиции на поверхности клеток, базальной мембране и во внеклеточном матриксе (ВКМ), где участвуют в межклеточном взаимодействии (Зимина и др., 1987).

Это не пассивные, инертные макромолекулы, а динамические компоненты, которые влияют на такие фундаментальные биологические процессы, как клеточная пролиферация, узнавание и цитодифференцировка, что обусловлено их полианионной природой, разветвленной конфигурацией и способностью взаимодействовать с различными компонентами ВКМ.

По экспериментальным данным, многие патологические процессы сопровождаются изменением структуры, биосинтеза, локализации протеогликанов (Говво, 1985).

и

2.2 Структура и классификация гликозаминогликанов

Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными единицами, которые включают в себя :

1. гексозамин ( или В-глюкозамин, или В-галактозамин )

В - глюкозамин

Ш2ОН

В - галактозамин

рн2он

но

)Н Ш12 как наиболее постоянный компонент.

ОаШ

2. уроновую кислоту (или В-глюкуроновую, или Ь-идуроновую) В - глюкуроновая ь „ ИДуроновая

)Н он

вША МоПА

присутствующую во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы.

Класс гликозаминогликанов определяется природой их структурной единицы (рис.1).

галактоза

;н2он

но

В - глюкозамин

;н2он

Оа1

Кератансульфат (КС) Мв=5-20*103 кДа, 0.9-1.8 БОЛцисах.

) - глюкозамин в - глюкуроновая

галактозамин о - глюкуроновая

;н2он соон

но -и>

чО

США

Гиалуроновая кислота (ГК) Мв=1-80*105 кДа, не сульфатирована

ОаШ

США

Хондроитинсульфат (ХС АС) Мв= 10-50*103 кДа, 0.1-1.3 8042"/дисах.

О - глюкозамин уроновая кислота

галактозамин ;н,он

но

уроновая кислота

юон

Оч

о

КН.

«ЗШ С1сиА(1ёоиА)

Гепарансульфат (ГС), гепарин (Те) Мв= 10-40*103 кДа, 0.4-3 БО^'/дисах.

°аШ С1сиА(ЫоиА)

Дерматансульфат (ДС) Мв= 10-40*103 кДа, 1-2.5 8042~/дисах.

Рис. 1. Структура дисахаридов, образующих углеводные цепочки гликозаминог-ликанов различных классов.

Периодичность структуры встречается также у некоторых других углеводных молекул - например, недавно Takaya et al.(1994) был описан линейный полисахарид с трисахаридной структурной единицей (-6GalNAcal -3GlcAf31 -3Fucal)n , однако он не является в полном смысле слова гликозаминогликаном ввиду присутствия нейтрального сахара фукозы.

2.2.1 Структурная гетерогенность шикозаминогликанов

Многообразие углеводных молекул гликозаминогликанов(ГАГ) в клетке определяется 2 относительно независимыми путями: 1) структурной гетерогенностью линейных цепей ГАГ и 2) последующей мозаичной модификацией ГАГ за счет обратимого присоединения отрицательно заряженных биологически активных групп.

Высокой микрогетерогенности линейных цепей гликозаминогликанов до недавнего времени не придавали самостоятельного значения. Полагали, что синтез цепей ГАГ определяется первичной последовательностью корового полипептида и, следовательно, именно коровый белок заслуживает самого пристального изучения. Однако с развитием новых методических подходов (особенно иммунологических) было показано, что это не совсем так: даже химически подобные протеогликаны (по размеру, молекулярному весу(Мв) корового белка, аминокислотному составу, длине углеводных цепей ГАГ) различаются по структуре цепей гликозаминогликанов (Denti et al.,1995).

Степень эпимеризации глюкуроновой кислоты(01сЦА) в идуроновую ки-слоту(Ыо11а), обеспечивающая постепенную модификацию хондроитинсульфа-таАС (ХСАС) до дерматансульфата (ДС), варьирует в различных тканях (Coster et al.,1987). Аналогичные дерматансульфат протеогликаны(ДСПГ) из бычьей кожи и волчьего хряща имеют коровые белки с одинаковой первичной структурой, но их гликозаминогликаны сильно различаются по содержанию IdoUA И это, должно быть, определено тканеспецифичными механизмами, которые регулируют степень эпимеризации GlcUA - IdoUA, а не первичной структурой ко-

рового белка (Choi et al.,1989). Предполагают, что какую-то роль может играть в этом степень сульфатирования гликозамин