Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействий РНК-полимеразы с однонитевыми и двунитевыми ДНК-аптамерами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействий РНК-полимеразы с однонитевыми и двунитевыми ДНК-аптамерами"

На правах рукописи

ФЕКЛИСТОВ Андрей Владимирович

Изучение взаимодействий РНК-полимеразы с однонитевыми и двунитевыми ДНК-аптамерами

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биологии Биологического факультета МГУ, в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН и в Институте общественного здравоохранения (Public Health Research Institute, г. Ныоарк, США)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, профессор Крашенинников Игорь Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Костров Сергей Викторович кандидат биологических наук Патрушев Лев Иванович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится « на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76

при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « ¡0» октября 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Н. О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. РНК-полимераза (РНКП) в процессе синтеза РНК осуществляет специфические и неспецифические контакты с однонитевой и двунитевой ДНК. Изучение функционально важных контактов РНКП с ДНК необходимо для детального понимания процесса транскрипции. В клетках бактерий РНКП присутствует в двух формах. Кор-фермент обладает каталитической активностью, но не способен к инициации транскрипции. Узнавание промоторов и инициация синтеза РНК осуществляются холоферментом РНКП, который содержит дополнительную с-субъединицу. Несмотря на то, что а играет главную роль в узнавании промоторов, в свободном виде она находится в неактивной конформации и не способна узнавать промоторные последовательности. Было показано, что в маскировании ДНК-связывающих центров ст большую роль играет Ы-концевой участок белка. При образовании холофермента происходят структурные превращения сг-субьединицы, в результате которых происходит экспонирование её ДНК-связывающих сайтов. Детальные механизмы автоингибирования ДНК-связывающей активности а-субьединицы, а также механизмы конформационных перестроек а, происходящих при образовании холофермента и в ходе инициации транскрипции, остаются неизвестными.

В процессе взаимодействия с промотором холофермент сначала узнает дцДНК, после чего происходит плавление ДНК около стартовой точки транскрипции и устанавливаются контакты с оцДНК. Структура контактов РНКП с промоторными последовательностями на разных этапах узнавания промотора остаётся не изученной. При переходе к элонгации транскрипции контакты с промоторными последовательностями разрываются, происходит диссоциация ст-субъединицы. Элонгация транскрипции осуществляется кор-ферментом РНКП. На этой стадии полимераза контактирует с ДНК (однонитевой и двунитевой) и РНК в основном сиквенс-неспецифически - эти контакты позволяют ферменту довольно прочно удерживать матрицу и, в тоже время, быстро по ией перемещаться. В процессе этого движения, при добавлении новых нуклеотидов в растущую цепь РНК, а также на стадии терминации фермент претерпевает конформационные изменения, детальные механизмы когорта изучены плохо. '1

Аптамерами называют однонитевые РНК- или ДНК-лиганды к различным мишеням,

получаемые направленным отбором из большого числа различных последовательностей.

Метод отбора аптамеров заключается в проведении нескольких циклов связывания

библиотеки случайных последовательностей с молекулой-мишенью с разделением свободных

олигонуклеотидов и комплексов олигонуклеотидов с мишенью и последующей

амплификацией связавшихся пг^т»т1Пяатртт^нгм-тпй Кытп ттгпгячяпп что аттгямрры ПОЛуЧвННЫе

РОС. НАЦИОНАЛЬНА '

БИБЛИОТЕКА, 1

¿"УДИТ

к белкам, in vivo контактирующим с нуклеиновыми кислотами (НК), обычно имитируют природные НК-белковые взаимодействия. Кроме того, аптамеры часто оказываются ингибиторами своих мишеней. Таким образом, аптамеры к РНК-полимеразе могут послужить удобной модельной системой для изучения взаимодействий этого белка с нуклеиновыми кислотами.

Цель работы я задачи исследования. Целью работы являлось получение аптамеров к кор-ферменту и а-субьединице РНКП и изучение их взаимодействий с РНКП. В работе ставились следующие задачи:

1) Получить ДНК-аптамеры к кор-ферментам РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus, а также к а-субъединице РНКП Thermus aquaticus.

2) Исследовать механизмы узнавания аптамеров кор-ферментом и а-субъединицей РНКП.

3) Проанализировать действие аптамеров на активность РНКП.

4) Изучить транскрипционные свойства аптамеров в однонитевом и двунитевом состоянии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены и охарактеризованы высокоаффинные ДНК-аптамеры к кор-ферментам РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus Показано, что аптамеры являются эффективными ингибиторами транскрипции, ст-субьединица, а также фактор элонгации транскрипции GreB подавляют связывание аптамеров с РНКП. При помощи аптамеров к РНКП Е coli показано, что фактор GreB вызывает конформационные изменения кор-РНКП. Получены ДНК-аптамеры, которые взаимодействуют с изолированной ст-субъединицей Т. aquaticus. Аптамеры к с-субъединице содержат последовательность -10 области промотора, окруженную дополнительными консервативными мотивами. Таким образом, впервые показано, что а-субьединица в свободном состоянии способна узнавать промоторные последовательности ДНК. На основе однонитевых аптамеров к а-субьединице Т aquaticus получен и охарактеризован двунитевой промотор нового типа, специфичный для РНКП Т. aquaticus. Отобранные в работе аптамеры предполагается использовать в дальнейших структурно-функциональных исследованиях РНКП. Кроме того, результаты работы могут найти практическое применение для создания высокоэффективных промоторов нового типа, а также для получения новых ингибиторов транскрипции.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на^страницах машинописного текста и содержит£^рисунков. Библиография включает^названий, в том числе ^ русских и иностранных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Аптамеры к кор-ферменту РНК-полимеразы

Первая часть данной работы посвящена получению и характеристике аптамеров к кор-ферментам РНКП Е coli (Eco) и Т aquaticus (Taq). Выбор этих двух РНКП был обусловлен тем, что из первая из них является наиболее полно изученным ферментом с биохимической и генетической точек зрения, а для второй РНКП была расшифрована трехмерная структура, что делает возможной структурную интерпретацию полученных данных.

Получение и общая характеристика аптамеров. Исходная библиотека оцДНК использованная при отборе, имела длину 75 нт. и содержала центральный район со случайной последовательностью длиной 32 нт., окруженный районами с фиксированными последовательностями (рис. 1А). В каждом раунде отбора библиотеку инкубировали с РНКП, ДНК-белковые комплексы отделяли от несвязавшихся олигонуклеотидов, связавшуюся ДНК амплифицировали и использовали для проведения следующего раунда. После проведения отбора обогащенную библиотеку клонировали и определяли последовательности индивидуальных клонов. Данная часть работы была проведена совместно с A.B. Кульбачинским.

Было получено и исследовано тринадцать классов аптамеров к кор-РНКП Eco (Е1 -Е13) и пять классов аптамеров, взаимодействующих с кор-РНКП Taq (Т1-Т5). Все аптамеры способны формировать различные вторичные структуры, в основном, разнообразные шпильки и G-квартеты. На рис. 1Б приведены предполагаемые вторичные структуры аптамеров к РНКП Taq, а также структура одного из аптамеров к РНКП Eco. Было показано, что аптамеры препятствуют взаимодействию ДНК-матрицы и РНК-транскрипта с кор-ферментом и подавляют транскрипционную активность фермента на синтетической конструкции из олигонуклеотидов, имитирующих нуклеиновые кислоты в составе элонгационного комплекса (минимальной матрице) (Рис. 2). Таким образом, связывание аптамеров происходит внутри главного канала РНКП, в естественных сайтах связывания нуклеиновых кислот.

>

(А) 5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-(N)-CTAGGCCCGGAGTACAGCTT-3'

(Б)

T1

к

T-cV

T2

-l.S

i СССЛОСКЛСЛА7ААЛ

T3

c-c

„Т-А.

T4

Si-T A

Gv-C-C

<-T-A A-T A-T

C-G О C-C C-G A-T A-T 5' 3'

t:

T5

й

G-'

c^ArG/ T-G>frJr

Рис.1. Предполагаемые вторичны* структуры апгамеров к кор-РНКП. (А) Случайная библиотека, использованная при отборе (Б) Предполагаемая вторичная структура алтамеров к кор-фермену Taq (Т1-Т5), и также аптамера Е5 к кор-ферменту Eco. Изображены минимальные варианты, полученные из полноразмерных лигандов путем удаления части последовательностей из фиксированных областей библиотеки

Рис. 2. Влияние апгамеров на каталитическую активность кор-РНКП Eco. РНКП инкубировали с минимальной матрицей из олигонуклеотидов, имитирующих РНК и ДНК в элонгационном комплексе МК (РНК-ДНК гетеродуплекс длиной 8 п н и дуплекс ДНК спереди по ходу транскрипции длиной 18 п н ) в присутствии аптамеров, после чего в реакционную смесь вносили a-[32P]-UTP. Реакцию транскрипции проводили 10 минут при комнатной температуре РНК-продукт длиной 9 нт идентифицировали при помощи электрофореза в 23% ПААГ с последующей радиоавтографией N-исходная случайная библиотека

Влияние а-субъеднницы и фактора GreB на взаимодействие апгамеров с кор-ферментом. ст-субъединица и белок GreB являются белковыми факторами, которые взаимодействуют с кор-ферментом РНКП. В то время как ст-субъединица связывается со стороны главного канала РНКП (Vassylyev et al., 2002, Murakami et al., 2002a), сайт связывания GreB располагается с противоположной стороны, около входа во вторичный канал (Opalka et al., 2004). Оба белка, по-видимому, изменяют конформацию кор-

фермента, поэтому можно было ожидать, что и о, и (ЗгеВ могут оказывать влияние на взаимодействие аптамеров с РНКП.

Действительно, было обнаружено, что и ст-субьединица, и фактор (ЗгеВ ингибируют связывание большинства аптамеров с РНКП. Для анализа механизма подавления связывания аптамеров этими факторами мы измерили кинетику диссоциации РНКП-аптамерного комплекса в присутствии различных лигандов: минимальной матрицы, ст-субьединицы или фактора (ЗтеВ. При инкубации комплекса РНКП, содержащего радиоактивно-меченый аптамер, с избытком немеченого аптамера время жизни комплекса превышает 1 час (рис. 3). Было показано, что минимальная матрица и о-субъединица не изменяют скорость диссоциации аптамеров. Таким образом, ингибирование связывания аптамеров с кор-РНКП этими факторами, по-видимому, объясняется, прямой конкуренцией за общие сайты связывания. В отличие от этого, фактор (ЗгеВ вызывает значительное ускорение диссоциации аптамеров (рис .3). Вероятно, это свидетельствует о том, что (ЗгеВ, связываясь с противоположной стороны РНКП, вызывает аллостерические конформационные изменения внутри главного канала РНКП, которые приводят к диссоциации аптамеров.

Рис. 3. Влияние er-субъединицы и фактора GreB на взаимодействие аптамеров с кор-РНКП Eco. Приведена кинетика диссоциации комплекса РНКП с аптамером ЕЮ в присутствии разных конкурентов Кор-фермент преинкубировапся с меченным аптамером, затем к комплексу прибавляли избыток немеченного аптамера ЕЮ, минимальной матрицы (ММ), рифампицина, с-субъединицы или фактора GreB и измеряли связывание через увеличивающиеся промежутки времени

120

-•-ЕЮ -в-ММ -е-ст -в-GreB

о

О 10 20 30 40 50 60 70

время, мин

Специфическое и неспецифическое взаимодействие аптамеров с главным каналом

РНКП. Бьшо обнаружено, что взаимодействие аптамеров с РНКП существенным образом зависит от ионной силы раствора. При исследовании аптамеров к кор-РНКП Eco было показано, что при повышенной ионной силе (440 мМ) связывание аптамеров зависит от последовательности, поскольку даже точечные мутации нарушают их связывание с РНКП. Также в этих условиях наблюдалась специфичность аптамеров в отношении кор-фермента Е. coli: ни один из аптамеров не связывался кор-РНКП T. aquaticus. При более низкой ионной силе (< 200 мМ) РНКП также связывает аптамеры с высокой аффинностью, но в этом случае сиквенс-специфичность пропадает. В этих условиях все исследованные последовательности, включая случайную ДНК-библиотеку, обладают одинаковым сродством к РНКП. В то время как при повышенной ионной силе о-субъединица подавляет связывание аптамеров, при пониженной ионной силе данный эффект не наблюдается. Все олигонуклеотиды подавляют связывание минимальной матрицы с одинаковой эффективностью, что говорит о том, что неспецифическое связывание также происходит в сайтах, взаимодействующих с РНК и ДНК в элоигационном комплексе. В то же время, структура неспецифических комплексов РНКП с аптамерами, видимо, существенно отличается от структуры комплексов, образованных в высокой ионной силе.

В целом, результаты, представленные в данной работе, показывают, что аптамеры к кор-ферменту РНКП являются перспективными лигандами для дальнейших структурно-функциональных исследований РНКП.

Аптамеры к а-субъединице РНКП Т. aquaticus

Транскрипция большинства генов домашнего хозяйства в бактериальной клетке осуществляется при участии главной ст-субъединицы (ст70 у Е coli). Главные о-субъединицы всех бактерий содержат 4 консервативных района, которые подразделяют на подрайоны (Lonetto et al., 1992; Campbell et al., 2002). Промоторы, узнаваемые этими факторами содержат два гексамерных элемента, необходимых для посадки РНКП: - 10 область с канонической последовательностью ТАТААТ (блок Прибнова), узнаваемую районом 2.4 ог-субъединицы, и - 35 элемент (TTGACA), узнаваемый районом ст 4.2. Также описан класс промоторов, у которых отсутствует - 35 область. В этом случае - 10 элемент имеет два дополнительных консервативных нуклеотида (TGnTATAAT), такие промоторы получили название промоторов с удлиненной - 10 областью. В узнавании TG-динуклеотида участвует район 3.0 с-субъединицы (Gross et al., 1998).

а-субъединица в свободном состоянии не способна узнавать промоторные последовательности. Для активации ДНК-связывающей активности а-субъединицы

необходимы конформационное превращения, вызываемые присоединением кор-фермента (Burgess, 1969; Sethi, 1970; Callaci, 1998; Gross, 1998).

Расшифровка трёхмерной структуры фрагментов сАсубъединицы Thermits aquaticus, а также структур холоферментов бактерий Т. aquaticus и Т, thermophilus показало, что а состоит из трёх доменов, соединённых гибкими линкерами (Campbell, 2002; Murakami, 2002; Vassylyev, 2002). По всей видимости, относительное расположение этих доменов различается для свободной ст и холофермента. Было показано, что связывание сг-субъединицы с кор-ферментом сопровождается существенным увеличением расстояния между районами 2 и 4 (Callaci, 1998). Детальные механизмы этих конформационных изменений остаются неизвестны, прежде всего потому, что структура полноразмерной а-субъединицы в свободном состоянии остается неизвестной.

Получение и общая характеристика аптамгров. Для изучения ДНК-связывающих свойств изолированной сигмы с помощью протокола SELEX были получены однонитевые ДНК-аптамеры к а-субъединице РНКП Т. aquaticus (Taq). Для отбора аптамеров была использована та же библиотека, что и в случае аптамеров к кор-ферменту (см. рис. 1); отбор проводился по похожей схеме. После проведения отбора были определены последовательности 33-х индивидуальных клонов. Все аптамеры содержат содержат гомологичный участок длиной 12 нуклеотидов: T/r.GTAc/rAATGGGA (рис. 4). Подчеркнутая последовательность идентична консенсусу - 10 промоторного элемента. т/сС-динуклеотид встречается в промоторах, не содержащих -35 области, хотя у этих промоторов он отделён от блока Прибнова одним случайным нуклеотидом. Тринуклеотид GGG был обнаружен в некоторых генах фагов Е. coli непосредственно справа от ТАТААТ-подобного элемента (GGGT - у бактериофага X, GGGA - у фага 80), в этом случае он необходим для а-зависимого паузирования РНКП (Ring et al., 1996).

Центральный участок гомологии аптамеров можно условно разделить на три элемента: TG-динуклеотид, ТАТААТ-подобный элемент и GGGA-тетрамер. Исследование мутантных производных аптамеров показало, что каждый из этих элементов абсолютно необходим для узнавания а-субъединицей и мутации по любому из них приводят к потере связывания.

Аптамеры обладают высокой афинностью к а-субъединице, комплекс аптамера с а характеризуется кажущимися Kd наномолярного диапазона (7-14 нМ) и временем полужизни около 10 минут. Аптамеры обладают также высокой специфичностью и не связываются с сг-субъединицами РНКП других бактерий (Е coli и Deinococcus radiodurans, Kj > 1 цМ).

Кд, нМ

Клон 13' Клон 1

Клон 15' Клон 4,8'

Клон 6

Клон 15 Клон 18' Клон 10' Клон 4' Клон 2' Клон 3 Клон 18 Клон 7 Клон 16'

9.8 7

13.8 13.5

Рис. 4. Последовательности некоторых аптамеров к а-субъединице Тая. Серым показан консервативный участок последовательности аптамеров Справа приведены Кд для четырех исследованных аптамеров

Предполагаемая структура аптамеров изображена на рисунке 5; все аптамеры, вероятно, содержат шпильки похожей структуры с 3'-конца от последовательности -10 элемента. Для определения участков аптамера. находящихся в тесном контакте с ст-субъединицей, использовался метод футпршгпшга гидроксильными радикалами (опыт проводился на полноразмерном варианте аптамера 15'). Наиболее эффективная защита ДНК от ОН-радикалов наблюдалась в участке аптамера, содержащем последовательность Прибнова. Было обнаружено, что второй аденин, последний тимин ТАТААТ-подобного элемента, а также три гуанина в последовательности ОООА-элсмснта аптамера защищаются белком с наибольшей эффективностью (см. рис. 3). Очевидно, эти нуклеотиды образуют очепь тесные контакты с а-субъсдипнцей. Соответствующие нуклеотиды в - 10 элементе промотора являются наиболее консервативными и важными для работы промотора. В частности, было показано, что - 11А необходим для открывания промотора (1лт й а1., 2001), а также по-видимому находится в плотном окружении гидрофобного кармана а-субъединицы (Тэи^кахуа ег а1., 2002).

В совокупности, полученные данные позволяют утверждать, что связывание аптамеров а-субьединицей имитирует ДНК-белковые взаимодействия между районом 2.4 ст и нематричной нитью блока Прибнова в открытом промоторном комплексе.

Л / i хс?

\ i ^L / Lj l^j

д^-^ g' \ G \ / \

T oTaq 15'(35) \ т oTaq 10,(39) G ? ^ ^ \

G. I I I G

£

T-A / i

cL 'c TV /т

/ ' л

к5. .. ^ К / \ /

Рис. б. Предполагаемые вторичные структуры аптамеров к а-субъединице Taq. Показана предполагаемая структура укороченных вариантов аптамеров из клонов № 15', Iff и 18' длиной 35, 39 и 44 мт, соответственно, полученных из полноразмерных лигандов путем удаления части последовательностей из фиксированных областей библиотеки ТАТААТ-подобный элемент аптамеров выделен полужирным шрифтом. Нуклеотиды аптамерэ 15' в консервативном участке, защищаемые о-субъединицей от гидроксильных радикалов, показаны стрелками (длина стрелки соответствует степени защиты). Звёздочкой показана граница между случайным и константным районом библиотеки

Ингибировяние синтеза РНК in vitro аптамерами к «т-субъединице. В тесте по транскрипции in vitro было показано, что, как и лиганды к кор-ферменту РНКП, аптамеры к о-субъединице являются эффективными ингибиторами транскрипции (рис. 6). Этот эффект может объясняться не только их взаимодействием со свободной о-субъединицей, но и с холоферментом РНКП. Чтобы проверить это предположение, было исследовано связывание аптамера с увеличивающимися количествами а в присутствии избытка кор-фермента. Как видно из рисунка 7, аптамеры связываются холоферментом с большим сродством, чем с а-субъединицей. Точечная мутация во втором положении -10 последовательности (А->С) предотвращает взаимодействие аптамера как с сг, так и с холоферментом РНКП, что говорит о высокой специфичности связывания аптамеров холоферментом.

Олигонуклеотид - 15' К Н-опиг М-олиг N -

Концентрация, нМ - 20 100 20 100 20 100 20 100 20 100 -

СрАр'и-* УЁ* 1 2 3 шш 4 5 •Ж,- ШШЩ^ШШШ-6 7 8 9 10 11 12

Рис. в. Влияние различных однонитевых ДНК на активность холофермента РНКП Т.

ащиаИси». Холофермент РНКП (20 нМ) и различные оцДНК (в концентрации 20 или 100 нМ) инкубировали в 10 мкл буфера в течение 15 мин. при 23°С Прибавляли фрагмент дцДНК, содержащий Т7А1 промотор (до концентрации 20 нМ), динуклеотидную РНК-затравку СрА (до 10 мкМ) и а-[32Р]-итР (100 нМ) Синтез тринуклеотида проводили 10 мин при 65°С Продукты транскрипции идентифицировали денатурирующим электрофорезом в 23% ПААГ с последующей авторадиографией В данном опыте были использованы следующие оцДНК' 15' - укороченный до 45 нт. вариант аптамера 15'; К - олигонуклеотид с последовательностью константных районов случайной библиотеки (длиной 43 нт); Н-олиг - содержит последовательность нематричной нити ДНК в -10 области /ас11\/5 промотора (АТТСССТАТААТСТСТССА); М-олиг - комплементарен Н-олигонуклеотиду (ТССАСАСАТТАТАСвСААТ), N - случайная библиотека оцДНК

120

-А-81дша -е-1ю1о

-±-з1дта[-11С] -#-Ио1о[-11С]

1 ю

[а] или [Ъо1о],нМ

1000

Рис. 7. Узнавание холоферментом РНКП Г. ациаЧсиз алтамеров и их мутант»ых производных. Приведены кривые связывания олигонуклеотидов с о-субъединицей и с холоферментом РНКП Связывание показано в процентах от общего количества ДНК, внесенной в пробу. Пробы содержали либо только а-субъединицу, либо о в присутствии 100 нМ кор-фермента РНКП В контрольном эксперименте было показано, что в отсутствие ст-субъединицы кор-фермент в концентрации 100 нМ не связывает аптамеры [-11С] - аптамер с точечной мутацией А-»С во втором положении последовательности блока Прибнова

Двунитевая ДНК, содержащая последовательность аптамеров, является промотором нового типа, специфичным для РНКП 7. aquaticus. Однопитевой ДНК-аптамер к а-субъединице содержит основной элемент промотора - ТАТААТ. Это позволило предположить, что двунитевой фрагмент ДНК с аптамерной последовательностью может выступать в качестве промотора, специфически узнаваемою РНКП. Для проверки этого предположения при помощи ПЦР были получены дцДНК, содержащие последовательность аптамеров из клонов 8', 10', 15' и 18' (рис. 4). Было показано, что данные последовательности ДНК действительно являются промоторами, специфичными в отношении РНКП Т aquaticus (рис. 8). Хотя аптамерный промотор не содержит - 35 элемента, на нём образуется полноразмерный транскрипт; при этом инициация транскрипции происходит примерно на 6 нуклеотидных пар правее последнего тимина в последовательности блока Прибнова. РНКП Е coli неактивна на аптамерных промоторах, и лишь на одном из них (151) она образует абортивные продукты (рис. 8).

По своим свойствам аптамерные промоторы напоминают описанные ранее природные промоторы. Так оптимальной температурой для работы РНКП Т. aquaticus на промоторе, полученном на основе аптамера 15', является 60°С. Высокая чувствительность РНКП к конкурентному ингибитору связывания ДНК гепарину так же напоминает ранее описанные промоторы (/acUV5, Т7 AI).

промотор! 8' к°Р j М fe li TJ 10' Ё Т 15'; 18' ¡Ж 1]£ т

сигма I -Ь Т Е Т Е Т|Е Т

34 gm»

2s m

19 m

♦ *•] I

0 О

1 §

14 Щ

£ * ! |

Рис. 8. Холофермент РНКП Т. aquaticus использует двунитевую ДНК аптамеров в качестве

промотора. Приведен радиоавтограф 23% геля денатурирующего электрофореза РНК-продуктов Реакции синтеза РНК проводились при оптимальных температурах (37 и 65°С для Е coli и Т. aquaticus, соответственно) М - маркеры длины РНК, Е-Е coli РНКП, Т - Г aquaticus РНКП

мутируемый элемент TG ТАСААТ GGGA WT

РНКП Е Т Е Т Е Т Е Т

полноразмерный продукт -►

»**»■"Кh/t<--- ,tii>t*"

-ЛА-

Рис. 9. Роль консервативных элементов аптамерного промотора 18* в инициации транскрипции. Приведён радиоавтограф геля денатурирующего электрофореза РНК-продуктов, синтезируемых на аптамерном промоторе и его мутантных вариантах Указаны консервативные элементы промотора, инактивированные мутагенезом WT - аптамерный промотор дикого типа Е - РНКП Е coli, Т - РНКП Т. aquaticus Транскрипция проводилась при температурах 37 и 65°С.

Для выявления последовательностей ДНК, обеспечивающих инициацию транскрипции на аптамерных промоторах, было исследовано три мутантных варианта промотора, содержащих замены TG-, ТАТААТ- и GGGA-мотивов. Было показано, что из всех консервативных элементов аптамерной последовательности для транскрипции в двунитевом состоянии оказываются важны ТАТААТ и GGGA, в то время как TG-динуклеотид может быть мутирован без существенной потери активности РКНП (рис. 9). Тот факт, что аптамерный промотор может работать в отсутствие -35 области, а также TG-элемента позволяет отнести его к новому типу промоторов с ранее не описанным консервативным элементом GGGA, лежащим правее блока Прибнова.

Транскрипция на однонитевых ДНК аптамерах к а-субъединнце РНКП. На

двунитевой ДНК транскрипция начинается в строго определенных участках ДНК -промоторах. Для инициации транскрипции ДНК требуется чтобы ее матричная нить в зоне контакта с РНК-полимеразой перешла в однонитевое состояние. Принято считать, что на однонитевой ДНК инициация происходит неспецифически на однонитевых участках, не вовлеченных в образование двунитевых шпилек. Поэтому механизм транскрипции однонитевой ДНК лишь изредка привлекал внимание исследователей.

В то же время, довольно давно было установлено, что существуют сравнительно короткие (20-40 нуклеотидов) последовательности, на которых может происходить специфическая транскрипция с одной стартовой точки. Так, в лаборатории Кораны исследовалась матричная активность химически синтезированного гетеро-олигонуклеотида длиной 29 нуклеотидов. Было установлено, что инициация происходит с АТР и GTP в 5-ом, 7-ом и 9-ом положениях матрицы от 3' конца (Terao et al., 1972).

12

Рис. 10. Синтез РНК холофермекгом и кор-ферментом РНКП Taq на однонитевом аптаиере 10'. (А) Предполагаемая вторичная структура аптамера 10' длиной 39 нт, и его укороченного варианта длиной 30 нт Черным кружном обозначена предполагаемая точка инициации транскрипции, серыми кружками - точки остановки синтеза РНК (Б) Продукты транскрипции кор-фермента и холофермента РНКП на аптзмере 10' длиной 39 нт М-маркер длин РНК-продуктов, длины указаны слева от рисунка (В) Продукты транскрипии холофермента РНКП на мутатных вариантах агттамера 10' (-11С) - аптамер с заменой второго А в -10 элементе; (30) - укороченный вариант аптамера длиной 30 нт, не содержащий -10 области

Известны также примеры специфической инициации РНК на однонитевой ДНК, встречающейся у фагов, содержащих однонитевую ДНК. До недавнего времени считалось, что эта инициация, обеспечивающая синтез РНК-затравки для репликации ДНК, осуществляется на громоздких структурах, напоминающих промотор в двунитевой ДНК и содержащих двунитсвые участки, соответствущие каноническим -10 и - 35 областям. Совсем недавно появилось сообщение, что смоделировать синтез праймерной РНК можно на значительно более коротком фрагменте однонитевой ДНК, не содержащем ранее постулированных -10 и - 35 областей (Zenkin and Severinov, 2004).

Гипотетическая структура алтамеров к а-субъединице Taq напоминает структуру ДНК в открытом промоторном комплексе (а именно, участок расплавленной области промотора и дуплекс ДНК справа от точки инициации транскрипции). Мы предположили, что данные аптамеры могут выступать в роли матрицы, специфически узнаваемой РНКП. В качестве матрицы для транскрипции был использован укороченный вариант аптамера 10' длиной 39 нт. (рис. 10А) (данный аптамер связывается с изолированной о-субъединицей с Кд ~ 35 нМ). Было обнаружено, что холофермент РНКП Taq синтезирует

на данной матрице набор РНК-продуктов различной длины (рис. 10Б). Было показано, что инициация транскрипции на этой матрице происходит преимущественно в одной точке, расположенной за 6 нт от З'-конца олигонуклеотида (рис. 10Б). В присутствии тринуклеотидной РНК-затравки в НС большая часть молекул РНК синтезируется с использованием затравки, что отражается на незначительном изменении подвижности продукта длиной 13 нт. (вероятно, это объясняется тем, что на 5'-конце используемого праймера отсутствует трифотфатная группа). По всей видимости, гетерогенность синтезируемых РНК возникает за счет остановок на стадии элонгации синтеза РНК. Лишь незначительная фракция молекул РНКП достигает конца матрицы, синтезируя полноразмерный РНК-продукт длиной 34 нт.; значительная доля транскриптов останавливается в 13-ом положении от стартовой точки.

В отличие от холофермента, кор-фермент не способен транскрибировать аптамер 10'длиной 39 нт (рис. 10Б, дорожка 4). При добавлении праймера Оис синтезируются продукты, рост большинства которых заканчивается не доходя до конца матрицы в районе 25 нуклеотидов от старта (дорожка 5). Таким образом, можно сделать вывод, что для транскрипции на оцДНК-аптамерах необходимо наличие а-субъединицы, хотя она может быть заменена тринуклеотидной РНК-затравкой.

Роль а-субъединицы в инициации транскрипции на однонитевых аптамерах может заключаться либо в специфическом узнавании последовательности «расширенного» -10 элемента (ТОТАТААТОСЮА), либо в связывании инициаторного нуклеотида (Тепкт е1 а1., 2004). Было обнаружено, что замена аденина во втором положении -10 элемента (ТАААСТ ~> ТСААСТ) у аптамера 10' приводит к общей стимуляции транскрипции и способствует прохождению РНКП до конца матрицы (ср. дорожки 3 и 4 на рис. 10В). Более того, удаление большей части -10 области не приводит к уменьшению эффективности инициации транскрипции на аптамере и значительно увеличивает эффективность синтеза полноразмерной РНК (имеющей в этом случае длину 23 нт.). Из полученных данных можно заключить, что для инициации транскрипции на однонитевых аптамерах не важны специфические контакты а-субъединицы с -10 элементом. Более того, эти контакты, по-видимому, могут мешать РНК-полимеразе осуществлять элонгацию. Можно предположить, что специфические контакты аптамера с а-субъединицей могут мешать и инициации, так как положение стартовой точки на однонитевом аптамере (рис. 10А) не соотвествует ее каноническому расстоянию от - 10 последовательности. Так как в присутствии тринуклеотидной затравки инициация происходит в отсутствие о-субъединицы, можно сделать вывод, что роль а в инициации транскрипции на однонитевой ДНК, по-видимому, заключается в связывании инициаторных нуклеотидов.

Выводы

1. Получены и охарактеризованы высоаффинные ДНК-аптамеры к кор-РНК-полимеразам Е. coli и Т. aquaticus, которые являются эффективными ингибиторами транскрипции. При помощи аптамеров показано, что фактор GreB вызывает конформационные перестройки внутри главного канала РНКП.

2. Осуществлен поиск ДНК-аптамеров к изолированной о-субъединице РНК-пояимеразы Т aquaticus. Отобранные аптамеры содержат последовательность нематричной нити -10 области бактериальных промоторов. Таким образом, свободная о-субьединица способна узнавать промоторную последовательность в отсутствие кор-фермента РНК-полимеразы. Аптамеры взаимодействуют с РНК-полимеразой с высокой аффинностью и являются эффективными ингибиторами синтеза РНК in vitro.

3. Двунитевой фрагмент ДНК, содержащий последовательность аптамера к о-субъединице Т. aquaticus, является промотором нового типа, не содержащим -35 области и TG-элемента и специфичным для холофермента РНК-полимеразы Т. aquaticus. Для узнавания аптамерного промотора необходимо наличие расширенного мотива -10 области TATAATGGGA, содержащего ранее не известный GGGA-элемент.

4. Однонитевой ДНК-аптамер к изолированной о-субъединице Т aquaticus служит матрицей для специфической ст-зависимой инициации транскрипции РНК-полимеразой Т. aquaticus.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kulbachinskiy A., Feklistov A., Krasheninnikov I., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, a-subunit and GreB. Eur. J. Biochem. 271: 4921-4931.

2. Feklistov A., Kulbachinsky A., Nikiforov V. DNA aptamers unveil sequence specificity of free sigma factor. FASEB Slimmer Research Conference "Transcription initiation in Prokaryotes". June 12-17, 2004, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

3. Феклистов А. В., Кульбачинский А. В., Никифоров В. Г. ДНК-связывающая специфичность ст-субъединицы РНК-полимеразы Т aquaticus, изученная методом SELEX. Конференция молодых учёных, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвящённая 50-летию открытия двойной спирали ДНК, а также 30-ой годовщине Института молекулярной биологии и генетики академии наук Украины. 25-27 сентября 2003 г., Украина, Киев.

Подписано в печать 05.10.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 117 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

ДО 1 8 6 1 £

РНБ Русский фонд

2006-4 19800

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Феклистов, Андрей Владимирович

Выводы

1. Получены и охарактеризованы высоаффинные ДНК-аптамеры к кор-РНК-полимеразам Е. coli и Т. aquaticus, которые являются эффективными ингибиторами транскрипции. При помощи аптамеров показано, что фактор GreB вызывает конформационные перестройки внутри главного канала РНКП.

2. Осуществлён поиск ДНК-аптамеров к изолированной а-субъединице РНК-полимеразы Т. aquaticus. Отобранные аптамеры содержат последовательность нематричной нити -10 области бактериальных промоторов. Таким образом, свободная а-субъединица способна узнавать промоторную последовательность в отсутствие кор-фермента РНК-полимеразы. Аптамеры взаимодействуют с РНК-полимеразой с высокой аффинностью и являются эффективными ингибиторами синтеза РНК in vitro.

3. Двунитевой фрагмент ДНК, содержащий последовательность аптамера к ст-субъединице Т. aquaticus, является промотором нового типа, не содержащим -35 области и TG-элемента и специфичным для холофермента РНК-полимеразы Т. aquaticus. Для узнавания аптамерного промотора необходимо наличие расширенного мотива -10 области TATAATGGGA, содержащего ранее не известный GGGA-элемент.

4. Однонитевой ДНК-аптамер к изолированной <т-субъединице Т. aquaticus служит матрицей для специфической ст-зависимой инициации транскрипции РНК-полимеразой Т. aquaticus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Kulbachinskiy A., Feklistov A., Krasheninnikov I., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, o-subunit and GreB. Eur. J. Biochem. 271: 4921-4931.

Feklistov A., Kulbachinsky A., Nikiforov V. DNA aptamers unveil sequence specificity of free sigma factor. FASEB Summer Research Conference "Transcription initiation in Prokaryotes". June 12-17, 2004, Vermont Academy in Saxtons River, Vermont, USA.

Феклистов А. В., Кульбачинский А. В., Никифоров В. Г. ДПК-связывающая специфичность ст-субъединицы РНК-полимеразы Т. aquaticus, изученная методом SELEX. Конференция молодых учёных, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященная 50-летию открытия двойной спирали ДНК, а также 30-ой годовщине Института молекулярной биологии и генетики академии наук Украины. 25-27 сентября 2003 г., Украина, Киев.

Благодарности

Автор благодарит А. В. Кульбачинского и В. Г. Никифорова за организацию работы, руководство, советы и критику, А. Гольдфарба и И.А. Крашенинникова за создание условий для работы.

Автор благодарен сотрудникам ЛМГМ, ОМГЖ ИМГ РАН и лаборатории молекулярной биофизики Рокфеллеровского университета, а также коллективу Кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ за внимание, советы и помощь в работе.

Автор очень признателен Н. Наумовой, С. Колбу, А. Кульбачинскому, Н. Севостьяновой, В. Вагину, А. и П. Моториным, М. и М. Фрих-Харам, А. Мустаеву, И. Аджубею, И. Абрамсон, А. Машину, О. Глебову, А. Ленцу, В. Эпштейну, Д. Альперну, Л. Вестблэйд и Д. Мюррей за неоценимую дружескую помощь и поддержку в процессе выполнения работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Феклистов, Андрей Владимирович, Москва

1. Савинкова Л.К., Кнорре В.Л., Салганик Р.И. 1983. Избирательное связывание определенных нуклеотидных последовательностей промоторов генов Escherichia coli и фага Т7 с соответствующими РНК-полимеразами. Докл. АН СССР 270: 1501-1504.

2. Тулохонов И. И., Савинкова Л. К., Pay В. А., Pap В. А. 1999. Взаимодействие изолированной субъединицы <т-70 с олигодезоксинуклеотидами, идентичными участкам -10 и —35 промотора spc. Молекулярная Биология, 33: 169 — 173.

3. Bar-Nahum G., Nudler Е. 2001. Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell, 2001,106: 443-451.

4. Barne K. A., Bown J. A., Busby S. J., Minchin S. D. 1997. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBOJ., 16: 4034-4040.

5. Blackburn E. H. 1975. Transcription by Escherichia coli RNA polymerase of a single-stranded fragment by 0X174 bacteriophage DNA 48 residues in length. J. Mol. Biol. 93: 367-370.

6. Bock L. C., Griffin L. C., Latham J. A., Vermaas E. H., Toole J. J. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 355: 564-566.

7. Breaker R. R., Banerji A., Joyce G. F. 1994. Continuous in vitro evolution of bacteriophage RNA polymerase promoters. Biochemistry, 33: 11980-11986.

8. Burden D.A., OsherofTN. 1999. In vitro evolution of preferred topoisomerase II DNA cleavage sites. J. Biol. Chem., 274: 5227-5235.

9. Burgess R. R., Travers A. A., Dunn J. J., Bautz E. K. 1969. Factor stimulating transcription by RNA polymerase. Nature, 221: 43-46.

10. Callaci S., Heyduk T. 1998. Conformation and DNA binding properties of a single-stranded DNA binding region of sigma 70 subunit from Escherichia coli RNA polymerase are modulated by an interaction with the core enzyme. Biochemistry, 37: 3312-3320.

11. Campbell E. A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb A., Darst S. A. 2001. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell, 104: 901912.

12. Campbell E. A., Muzzin O., Chlenov M., Sun J. L., Olson C. A., Weinman O., Trester-Zedlitz M. L., Darst S. A. 2002. Structure of the Bacterial RNA Polymerase Promoter Specificity sigma Subunit. Mol. Cell, 9: 527-539.

13. Chan В., Spassky A., Busby S. 1990. The organization of open complexes between Escherichia coli RNA polymerase and DNA fragments carrying promoters either with or without consensus -35 region sequences. Biochem. J., I: 141-148.

14. Chan C. L., Gross C. A. 2001. The anti-initial transcribed sequence, a portable sequence that impedes promoter escape, requires sigma70 for function. J. Biol. Chem., 276: 38201-38209.

15. Colland F., Orsini G., Brody E.N., Buc H., Kolb A. 1998. The bacteriophage T4 AsiA protein: a molecular switch for sigma 70-dependent promoters. Mol. Microbiol., 27: 819-829.

16. Convery, M.A., Rowsell, S., Stonehouse, N.J., Ellington, A.D., Hirao, I., Murray, J.B., Peabody, D.S., Phillips, S.E., Stockley, P.G. 1998. Crystal structure of an RNA aptamer-protein complex at 2.8 A resolution. Nat. Struct. Biol., 5: 133-139.

17. Daube S. S and von Hippel P. H. 1992. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science, 258: 1320-4.

18. Daube S. S and von Hippel P. H. 1994. RNA displacement pathways during transcription from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Biochemistry 33: 340-7

19. Dedrick R. L and Chamberlin M. J. 1985. Studies on transcription of 3'-extended templates by mammalian RNA polymerase II. Parameters that affect the initiation and elongation reactions. Biochemistry. 24: 2245-53.

20. Dombroski, A. J., Walter W. A., Record M. T., Jr., Siegele D. A., Gross C. A. 1992. Polypeptides, containing higly conserved regions of transcription initiation factor cr70 exhibit speficity of binding to promoter DNA. Cell, 70: 501-512.

21. Dombroski A. J. 1997. Recognition of the -10 promoter sequence by a partial polypeptide of sigma70 in vitro. J. Biol. Chem., 111-. 3487-3494.

22. Eaton B. E., Gold L., Zichi D. A. 1995. Let's get specific: the relationship between specificity and affinity. Chemistry and Biology, 2: 633 — 638.

23. Eichenberger P., Dethiollaz S., Buc H., Geiselmann J. 1997. Structural kinetics of transcription activation at the malT promoter of Escherichia coli by UV laser footprinting. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 9022-9027.

24. Ellington A. D. and Szostak J. W. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature, 346: 818-22

25. Estrem, S.T., Gaal, T., Ross, W., Gourse, R.L. 1998. Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters. Proc. Natl. Acad. Sei., USA 95: 9761-9766.

26. Falashi A., Adler J., Khorana H. G. 1963. Chemical synthesized deoxypolynucleotides as templates for ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 238: 3080-3085.

27. Fedoriw A. M., Liu H., Anderson V. E., DeHaseth P. L. 1998. Equilibrium and kinetic parameters of the sequence-specific interaction of Escherichia coli RNA polymerase with nontemplate strand oligodeoxyribonucleotides. Biochemistry 37: 11971-11979.

28. Fenton M. S., Gralla J. D. 2001. Function of the bacterial TATAAT -10 element as single-stranded DNA during RNA polymerase isomerization. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98: 90209025.

29. Fenton M. S., Lee S. J., Gralla J. D. 2000. Escherichia coli promoter opening and -10 recognition: mutational analysis of sigma70. EMBOJ., 19: 1130-1137.

30. Gold L., Brown D., He Y., Shtatland T., Singer B. S., Wu Y. 1997. From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: Novel biological regulatory loops. Proc. Natl. Acad. Sei., 94: 59-64.

31. Gold L., Polisky B., Uhlenbeck O., Yarus M. 1995. Diversity of oligonucleotide functions. Annu. Rev. Biochem., 64: 763-797.

32. Gribskov M., Burgess R.R. 1983. Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Gene 26: 109-118.

33. Guo Y., Gralla J. D. 1998. Promoter opening via a DNA fork junction binding activity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 11655-11660.

34. Hale S. P., Schimmel P. 1996. Protein synthesis editing by a DNA aptamer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 93: 2755-2758.

35. He, Y.Y., Stockley, P.G., Gold, L. 1996. In vitro evolution of the DNA binding sites of Escherichia coli methionine repressor, MetJ. J. Mol. Biol., 255: 55-66.

36. Helmann J. D. 1995. Compilation and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. Nucleic Acids Res., 23: 2351-2360.

37. Hermann T., Patel D. J. 2000. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science, 287: 820825.

38. Hesselberth J. R., Miller D., Robertus J., Ellington A. D. 2000. In vitro selection of RNA molecules that inhibit the activity of ricin A-chain. J. Biol. Chem., 275: 4937-4942.

39. Higashitani A, Higashitani N, Horiuchi K. 1997. Minus-strand origin of filamentous phage versus transcriptional promoters in recognition of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94: 2909-14

40. Jaeger J., Restle T., Steitz T. A. 1998. The structure of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an RNA pseudoknot inhibitor EMBOJ., 17: 4535-4542.

41. Jenison R. D., Gill S. C., Pardi A., Polisky B. 1994. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science, 263: 1425-1429.

42. Jeon C., Agarwal K. 1996. Fidelity of RNA polymerase II transcription controlled by elongation factor TFIIS. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93: 13677-82

43. Jing N., Hogan M. E. 1998. Structure-activity of tetrad-forming oligonucleotides as a potent anti-HIV therapeutic drug. J. Biol. Chem., 273: 34992-34999.

44. Jing N., Marchand С., Liu J., Mitra R., Hogan M. E., Pommier Y. 2000. Mechanism of inhibition of HIV-1 integrase by G-tetrad-forming oligonucleotides in vitro. J. Biol. Chem., 275: 2146021467.

45. Juang Y. L., Helmann J. D. 1994. A promoter melting region in the primary sigma factor of Bacillus subtilis. Identification of functionally important aromatic amino acids. J. Mol. Biol, 235: 1470-1488.

46. Kaguni J. M and Kornberg A. 1982. The rho subunit of RNA polymerase holoenzyme confers specificity in priming M13 viral DNA replication. J. Biol. Chem. 257: 5437-43.

47. Kimoto M., Sakamoto K., Shirouzu M., Hirao I., Yokoyama S. 1998. RNA aptamers that specifically bind to the Ras-binding domain of Raf-1. FEBS Lett., 441: 322-326.

48. Korzheva N., Mustaev A., Nudler E., Nikiforov V., Goldfarb A. 1998. Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63: 337-345.

49. Korzheva N., Mustaev A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S.A. 2000. A structural model of transcription elongation. Science. 289: 619-625.

50. Korzheva N., Mustaev A. 2001. Transcription elongation complex: structure and function. Current Opinion in Microbiology, 4: 119-125.

51. Kubik M. F, Stephens A. W., Schneider D., Marlar R. A., Tasset D. 1994. High-affinity RNA ligands to human alpha-thrombin. Nucleic Acids Res., 22: 2619-2626.

52. Kudo Т., Doi R. H. 1981. Free sigma factor of Escherichia coli RNA polymerase can bind to DNA. J. Biol. Chem., 256: 9778-9781.

53. Kudo Т., Jaffe D., Doi R. H. 1981. Free sigma subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase binds to DNA. Mol. Gen. Genet., 181: 63-68.

54. Kulbachinskiy A., Mustaev A., Goldfarb A., Nikiforov V. 1999. Interaction with free beta' subunit unmasks DNA-binding domain of RNA polymerase sigma subunit. FEBS Lett., 454: 7174.

55. Kulbachinskiy A., Feklistov A., Krasheninnikov I., Goldfarb A., Nikiforov V. 2004. Aptamers to Escherichia coli core RNA polymerase that sense its interaction with rifampicin, o-subunit and GreB. Eur. J. Biochem. Ill: 4921-4931.

56. Marr M. T., Roberts J. W. 1997. Promoter recognition as measured by binding of polymerase to nontemplate strand oligonucleotide. Science., 276: 1258-1260.

57. Masukata H. and Tomizawa J. 1990. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62: 331-8.

58. McClure W. R. 1985. Mechanizm and control of transcription initiation in prokariotes. Ann. Rev. Biochem., 54: 171-204.

59. Mecsas J., Cowing D. W., Gross C. A. 1991. Development of RNA polymerase-promoter contacts during open complex formation. J. Mol. Biol., 220: 585-597.

60. Meima R., Rothfuss H. M., Gewin L., Lidstrom M. E. 2001. Promoter cloning in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. Bacteriol., 183: 3169-3175

61. Michaud M., Jourdan E., Ravelet C., Villet A., Ravel A., Grosset C., Peyrin E. 2004. Immobilized DNA aptamers as target-specific chiral stationary phases for resolution of nucleoside and amino acid derivative enantiomers. Anal. Chem. 76: 1015-20.

62. Minakhin L., Nechaev S., Campbell E. A., Severinov K. 2001. Recombinant Thermus aquaticus RNA polymerase, a new tool for structure-based analysis of transcription. J. Bacteriol., 183: 7176.

63. Morris K.N., Jensen K.B., Jul in C.M., Weil M., Gold, L. 1998. High affinity ligands from in vitro selection: complex targets. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 2902-2907.

64. Murakami K. S., Masuda S., Darst S. A. 2002a. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 Ä resolution. Science, 296: 1280-1284.

65. Murakami K. S., Masuda S., Campbell E. A., Muzzin O., Darst S. A. 2002b. Structural Basis of Transcription Initiation: An RNA Polymerase Holoenzyme-DNA Complex. Science, 296: 12851290.

66. Naryshkin N., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R. H. 2000. Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex. Cell, 101: 601-611.

67. Pan, W., Craven, R.C., Qiu, Q., Wilson, C.B., Wills, J.W., Golovine, S., Wang, J.F. 1995. Isolation of virus-neutralizing RNAs from a large pool of random sequences. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 11509-11513.

68. Patel, D.J., Suri, A.K., Jiang, F., Jiang, L., Fan, P., Kumar, R.A., Nonin, S. 1997. Structure, recognition and adaptive binding in RNA aptamer complexes. J. Mol. Biol. 272: 645-664.

69. Peterson E. T., Pan T., Coleman J., Uhlenbeck O. C. 1994. In vitro selection of small RNAs that bind to Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase. J. Mol. Biol., 242: 186-192.

70. Pleij C. 1994. RNA pseudoknots. Current Opinion in Structural Biology, 4: 337-344.

71. Pribnow D. 1975. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72: 784-788.

72. Qiu J., Helmann J. D. 1999. Adenines at -11, -9 and -8 play a key role in the binding of Bacillus subtilis Esigma(A) RNA polymerase to -10 region single-stranded DNA. Nucleic Acids Res., 27: 4541-4546.

73. Ring B. Z., Yarnell W. S., Roberts J. W. 1996. Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing. Cell, 86: 485-493.

74. Ringquist, S., Jones, T., Snyder, E.E., Gibson, T., Boni, I., Gold, L. 1995. High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosomal protein SI: comparison of natural and unnatural binding sites. Biochemistry, 34: 3640-3648.

75. Roberts C. W., Roberts J. W. 1996. Base-Specific Recognition of the Nontemplate strand of Promoter DNA by E. coli RNA Polymerase. Cell, 86: 495-501.

76. Ross W., Gosink K. K., Salomon J., Igarashi K., Zhou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R. L. 1993. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the a-subunit of RNA polymerase. Science, 262: 1407-1413.

77. Sambrook, J., E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. Cold spring harbor press.

78. Santoro, S. W., Joyce, G. F. 1997. A general purpose RNA-cIeaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 4262-4266.

79. Schickor P., Metzger W., Werel W., Lederer H., Heumann H. 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EMBOJ. 9: 2215-2220.

80. Schneider, D., Feigon, J., Hostomsky, Z., Gold, L. 1995. High-affinity ssDNA inhibitors of the reverse transcriptase of type 1 human immunodeficiency virus. Biochemistry, 34: 9599-9610.

81. Siebenlist U., Simpson R. B., Gilbert W. 1980. Escherichia coli RNA polymerase interacts gomologously with two different promoters. Cell, 20: 269-281.

82. Siegele D. A., Hu J. C., Walter W. A., Gross C. A. 1989. Altered promoter recognition by mutant forms of the sigma 70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol 206: 591-603.

83. Simpson R. B. 1979. The molecular topography of RNA polymerase-promoter interaction. Cell, 18: 277-285.

84. Szkaradkiewicz K., Nanninga M., Nesper-Brock M., Gerrits M., Erdmann V. A., Sprinzl M. 2002. RNA aptamers directed against release factor 1 from Thermus thermophilics. FEBS Lett., 514: 90-95.

85. Tasset D. M., Kubik M. F., Steiner W. 1997. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. J. Mol. Biol., 272: 688-698.

86. Terao T., Dahlberg J. E., Khorana H. G. 1972. Studies on polynucleotides. CXX. On the transcription of a synthetic 29-unit long deoxyribopolynucleotide. J. Biol. Chem. 247: 61576166.

87. Tombelli S., Minunni M., Mascini M. 2005. Analytical applications of aptamers. Biosens. Bioelectron. 20: 2424-34.

88. Triqueneaux G., Velten M., Franzon P., Dautry F., Jacquemin-Sablon H. 1999. RNA binding specificity of Unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Res., 27: 1926-1934.

89. Tsai, R.Y., Reed, R.R. 1998. Identification of DNA recognition sequences and protein interaction domains of the multiple-Zn-finger protein Roaz. Mol. Cell. Biol., 18: 6447-6456.

90. Tsiang M., Gibbs C. S., Griffin L. C., Dunn K. E., Leung L. L. 1995. Selection of a suppressor mutation that restores affinity of an oligonucleotide inhibitor for thrombin using in vitro genetics. J. Biol. Chem., 270: 19370-19376.

91. Tuerk C., MacDougal S., Gold L. 1992. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 89: 6988-6992.

92. Tuerk, C., Gold, L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 249: 505-510.

93. Vassylyev D. G., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M. N., Borukhov S., Yokoyama S. 2002. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature. 417: 712-9.

94. Venables J. P., Ruggiu M., Cooke H. J. 2001. The RNA-binding specificity of the mouse Dazl protein. Nucleic Acids Res., 29: 2479-2483.

95. Wang K. Y., McCurdy S., Shea R. G., Swaminathan S., Bolton P. H. 1993a. A DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA. Biochemistry, 32: 1899-1904.

96. Wang K. Y., Krawczyk S. H., Bischofberger N., Swaminathan S„ Bolton P. H. 1993b. The tertiary structure of a DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin determines activity. Biochemistry, 32: 11285-11292.

97. Wilson D. S., Szostak J. W. 1999. In vitro selection of functional nucleic acids. Annu. Rev. Biochem., 68: 611-647.

98. Xu J., McCabe B. C., Koudelka G. B. 2001. Function-based selection and characterization of base-pair polymorphisms in a promoter of Escherichia coli RNA polymerase-sigma(70). J. Bacteriol., 183:2866-2873.

99. Ye X., Gorin A., Frederick R., Hu W., Majumdar A., Xu W., McLendon G., Ellington A., Patel D. J. 1999. RNA architecture dictates the conformations of a bound peptide. Chem. Biol., 6: 657669.

100. Zalenskaya K., Lee J., Gujulova C.N., Shin Y.K., Slutsky M., Goldfarb A. 1990. Recombinant RNA polymerase: inducible overexpression, purification and assembly of Escherichia coli rpo gene products. Gene. 89: 7-12.

101. Zenkin N, Severinov K. 2004. The role of RNA polymerase sigma subunit in promoter-independent initiation of transcription. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 101: 4396-400.

102. Zenkin N., Naryshkina T., Kuznedelov K. and Severinov K. 2005. The mechanism of DNA replication primer synthesis by RNA polymerase. Nature, in press.

103. Zhang G., Campbell E. A., Minakhin L., Richter C., Severinov K., Darst S. A. 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 Ä resolution. Cell, 98: 811-824.