Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение воздействия энтомопатогенных вирусов (гранулезов и денсонуклеоза) на теплокровных животных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение воздействия энтомопатогенных вирусов (гранулезов и денсонуклеоза) на теплокровных животных"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЕ УКРАИНЫ КИЕВСКИЙ НАЯНО-ШСУГЕДОВАТЕИЬСЮЙ ИШТГОТ

этщтюлотт и инфекционных болезней

ем. Л.В. ГРОШ НЕВСКОГО

Па правах рукоякос ЧИГИРЬ Т&гьява Влапа-шрозвд

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭНТСШПАТОГЕШЖ ЗЙРГСОВ (ГРАШЯГЕЗОВ И ДШШШШЕОЗА) Щ ТЕПЛОКРОВНЫХ 2И3021ИХ

03.00.05 - ааруоологй!

АВТОРЕФЕРАТ диеоортадаи па соискание ученой отепзя! кандидата йиояогичооких няук

Киев - 1992

Работа выполнена а Киоаоком каучао-иоаледоваг-ельоком институте зоЕДвкаологии а ИЕфекцковиых <Золезпей иы.Л.З.Громаш&вакого МЗ драишь

Научнне руководителя: доктор мвдгцинских наук, профеооор

З.Л.Ваоильеш

Д01{Г0р МВДЙЦЗЕ2КИХ ИауК А.Л.Гураль

Офйциялькие оппоцэиты; доктор баологинеоркх наук, арофоеоор

Р.И.Гвоэддк. доктор иедащцаких наук А.М.Щербакокая

Ведуцеа учреди шм: Киевский увнввроигег иа. Тар аз а Шэв-

*18®50.

Защита оооюнгоя 1.992 года в // ча-

сов на заобдаяик опевдаливгропайЕого сонета Д. 088.04.02 при Еиеаакоц ваучго-иооледова'геяьохом кцстпгуте зшадеиаологля к нифакшсишых болэзней ни.й.В.Громашэвского МЗ Украины (2521Б0, г.Кдэв, ул.Сэтнеаого повсгайкя,2!3}.

Автореферат разослав "Л/" ЛАСЩ^ 1992 г.

УЧеныВ секретарь одзцзалазировданого оовега доктор иедндакацшс каук

А.Д. Вовк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. В настоящее время намечается яэмене-ше отратегяи защита раатеняй и сельскохозяйственных продуктов, федусматриващсе ограничение прамененяя химических препаратов, 'капитально аозроо ннтереа к разработке новых путей рэгулироэа-[яя чиолеииоотя прааных насекомых, учитывающих но только эконо-¡кчсолие. по и экологические, медико-биологячсакие, ооциальяые юпектн проблема. С.этих иозищй, оопоной современной з. будущей тратегии должна быть долговременная .актогргроваыпая оастзма задеты раотепий, оочетапцая рациональное иопользоваикэ химичеоких, иологичеокнх оролотв..агротехнических, оргадязааионно-хозяйот-еннта я других мер. 3 рамках этой оноте.мн существенное практи-еокое значение, приобретает бдолокпеонай и, прежде всего микро-зологетвскаЯ негод, основанный на использовании естэотЕонных эл-омопятогеноз - варуооз, бактерий, грибов и гр., способных вкзы-чть эпззотие а популлвдях вредителей и таким образом регулпро-1ть их чаолеяноатъ (О.А.АлешйнаД982; В.Л.Ваоильеза, А.Л.Гураль, 309; H.L.HostBtter, c.K.ignoffo IS84; н.з.зп^з IS87; i.т«аа-nchi 1987; K.D.Seniei-bnd 1990).

Еедыпуп перспективу ямевд энтомоаатогеяные варуон. Иноектс-вдие препарат» на их оонопя достаточно вффекгшзвц, экономичны, оаиов глаззоо, характэразут'ся наиболее ээраяэнпоЗ ореди еэях 1томопатогон:ых микроорганизмов избирательностью яатогокпего гоая, которая состааяяег теоретическую оомозу гарантии вх иедп-зйокой и зкологэтеомш б&зопааноотя (И.ЯЛ'ое, 1980; Е.В.Орлов-?ая, 1981; В.В.Гулнй и ооаат,Д932: ВД.Вапильева, А.Л.Гураль, 389; 1976; тл\т1гш1оу ?.n,t I9&Q; ?.м, Loper-

iia 1980; R. tovia, ÏS89; я.s^.piro ÏSS3; c.i.Povi» et nii., 1930).

Указанное теоретическое положеяио не может служить основанием для широкого использования пируоных энтсмопатогенов а практике зшдата раотеацй. Б ооответотваи о рекомендациями международных органазацай БОЗ я ФАО изучение оффектавнозгя и экономичности этих вируaон a препаратов на их основе необходимо ноота на фоне всесторонней. научной оценки их возможных вредных потенций для человека* полезных животных и природных биоценозов (Техн.докл. ВОЗ. № 531, 197?К

Опубликованные в квровой литературе ыногочиоленкио данные как правило, свидетельствуют о той. что энтоыопатогзнные варуои и препарата не оказывают вредного воздейотвия на человека и ки-BOfiiHX других клаоооа, кротче конкретного члениотоногого-хозжш: (В.Л.Васдльова а соапт.,1989; АЛ.Гураль а ооавт.,1979; c.p.ig coffo 1973; A.M.Heimpal, 197'i; H.I.H'aang at all., IS77; AJÍ .IT iupel, 1980; Я-I.Miltenburger, 1980; Atañer, O.DSller, 193 K.Reimarji, U.B.Mlltsnburgar, • 1983; J.Huber, 1988 R.Levis, 19 Указанные даанно базируются, задавши образом, на результатах и ченкя сотрой и хроничвокой токойчнооте этлх вгеитов и недооват ко затрагивают другие о героин проблемы медяко-биологитеакой os ки безопасности. вирусных инсектицидов.

Сущеотвуэт опасения, что известная плаотачноатъ и Езменш £00гь вирусов можбУ лрнаодить к изменению спектра юс пагогенш двйогаия. Не огазргауга к геореютескав предположения, что в < чаэ массового производства а применения шрусных энгоыопатоге везмоани изменения вярулеятпеоли, ¿дастация к новым ХОЗЯОЕЭМ появление в дряроде нафекцноыкой болезни, ранее не СЕОйагаегш другому биологическому ¡виду. Предполагают возмоякоать геяетэт оких рекомбинаций, оеноибалкзарущее, мутагенное и каицерогег дейотвие и т.л. (В.Л.Ваоильова, А.Л.Гураль,1983.1909;

Г.к.т1пв1еу, 1979; н.в.вогевв «г «11., 1980; с.с.Гал», 1982; я.о.ЩПвпЪпгевг, л.кпев 1984; 1989; з-элогвв,

1991: К.ЯвШКагЧ, 1991).

Опубликованные материала отражают; главным образом, результаты иооледований безопасности биоикаектишдов на основе вируоов ядерных полиэдрозов (ВЯП). фрагментарно иэучеин препарат действующим началом которкх являютоя вируоц грануле зов (ВГ). Что же касается эятомопагогэнш/х гаруооэ, отяооящихоя к другим оемейот-ваы, то оценке их безопаонооти посвящены единичные сообщения.

Изложенное позволяет констатировать, что несмотря на значительную перспективу использования знтомопагогешшх вируоов в качестве бисансектитлоа', многие вопросы, овязанкые о проблемой нх медико-биологачеокой безопасности, изучен« недостаточно и 1ребувт дальнейшей научной и практической разработки.

В настоящее время в различных научно-иооледовательоких учреждениях проводятся интенсивные исследования по разработке перспективных эптомопатогенвнх вируоных препаратов. К их числу отно-оятоя биоиноехташдн. на основе ВТ г. Вириа-КМ, Внрин-ОС и ориги-нальаий вяруоный- иноэктищд - Зароден, дейотвущям началом которого явдяетоя шруо деноонуклеоза комара (ВДН).

Цель а задачи иооледования. Изучение возможной патогенноотк (гокоичностя, инфекционноети, осноибияизируодей шдаваооти) для теплокровных животных ВТ картофельной моли (ВГ ЮЛ), озимой ооэки (ВТ ОС), ВДН а энтомопатогенннх препаратов да пх оонове - ВЕрян--Ш. Бпран-02, Виролен, предназначенных для применения о яарод-яом хозяйстве.

Были поогавленн следующие задачи:

I. Разработать мзтодичеенкв подходы к оценке беэопаанооти ВГ КМ. ВГ ОС. ВДВ и зноектишдннх првдапагол на их оонове.

2. Лровеоги изучение воэмоааого токсического действия виру-оов и препаратов, сконструированных на их ооноае для теплокровных животных.

,3. Последовать возмохнуо инфекционное ть ВТ КГЛ. ВГ ОС и ВДН, поведение этих аируоов в организме теплокровных животных прв раз-лдчньк ¿утях поступления: возможность срошшаовепия в ток крови, адаптации.тс клеткам к репродукцаи в теплокровном организме.

4. Изучить оейоибилиэврувдую активность иоследугмых шруоов.

б, Па ейноъаньв ароводеняых иооледоваяий дать заключение о возможности. постановка авоактишиных препаратов Вириц-КМ. Вирин-00 а Екродеа на государственные испытания, рекомендации по безо-шааому те применении.

Ооковшв положения диооед^ацич, предотаюекиые к защите:

1. Методы изучения взаимодействия ВГ Ш, ВГ ОС и ВДН о организмом теплокровных елзоишх, индикации этих вирусов в организмах, кулыгуралышх «адксотях. в разЛлчннх биооуботратах.

2. Особенности поведения ВГ в гзплонровнса организме: способность яроаикать в ток кпоаи при. различных путях введения вирусов, поступать ао внутренние органы о последующей элиминацией из орга-■нязиа. ДроникнсЕвнзе БГ в организм на сопровождается их репродукцией.

3. ВГ КМ, ВГ ОС, ВДН к созданные па .их основе препараты ве-руоных инсектясндоя Варш-1®, Виргн-ОС и вироден - маю токсична и не внфвкщовны для теплокровных казотних.

4. 31' КМ, ВГ СС - ДШ обладают саноабшшэяруючвй активноетхю.

Научная новизна. Бсервна провалены комплексные иооледоваиия

оо эзучешю возможной шгогон.чооти (токсичности, иифекшонпооти, ооноибилизарувщей активности) для теплокровных хшзотанх ВГ ЮЛ, ВГ ОС и ВДН. являющихся дейотвующим началом препаратов вирус га к

иноектицилоа Вирин-КМ, Вирин-ОС и Виродеи; получены новые данные

0 взаимодействии этих вирусов о организмом теплокровных животных;

- разработаны методы изучения взаимодействия 2Г КМ, ВГ 00 я ВДН о организмом теплокровных животных, индикации этих вируоов и антител к ним;

- изучены особенности поведения ВГ в организме теплокровных киаотных и при этом установлено, что независимо от опособа введения эти вирусы способны проникать в ток крови, поступать во внутренние органы о последующей элиминацией из организма (9-му дню) Зез адаптации к клеткам и репродукции;

- показано, что изучаемые вируоы и созданные на их оонове препараты вируоных иноектишяоэ мало токсичны и не инфекоионны гля теплокровных животных; .

- впервые получены данные о овнаибилизирупцем действии виру-)ов гранулем и ВДН.

Практическая значимость и внедрение результатов исследований. Доведенные исследования позволили разработать и рекомендовать а юучно-практичеоких целях схему оценки безопасности (инфекшонно->ти, токоичности, оекоибилизируодей активности) ВГ КМ, ВГ ОС, ВДН

1 препаратов вируоных изоектяцидов Вирин-КМ. Вирин-ОС и Вироден. 1аучно обоснованы рекомендации по безопасному производству и признании вирусного инсектицида Вирин-СС, опытно-производственному црименению препарата Вароден.

По материалам проведенных иооледовашзй в МЗ СССР и Государственную комиооию по химичеоким средствам борьбы с вредителями, . ¡олезпями растений и сорняками при МСХ предотавяены заключения о (езультатах медико-баологичеокой оценка препаратов Вярин-ОС и За-юден. На ооновании этих материалов эти препараты допущены к гооу-tapoтаенным иопнтанням и опытно-произзодотвенному применаиив. Зая-

лечение по оценка безопасности биоиноектицида Вирин-КМ пред ставлено в НИИ карантина и станшш зашиты растений (г.Симферополь), что явилось основанием для проведения опытно-полевых испытаний по оценке эффективности и экономичности препарата. Вирин-ОС вклн чвв з "Сяиеок химических а биологических средств борьбы о вредителями, бояезншя растений,' сорняками и регуляторами роога раст< Ш1й, разрешенных для применения в сельоком хозяйстве fia I9S6 -1990 гг." (M., 1987).

Ревульгаты исследований по медако-биояогичеакой оценке вз-руоыых инсектицидов Варин-ОС, Вараа-Ш я Вир од su опоообогасаалк решение вазшой народно-хозяйственной задачи по внедрении в прак тику защити раетеанй новых зкологачеоки безопасных средотв защн раотэндЕ.

Апробация работа> Основные положения диссертации долоконч и обсуадекы на Ученчх оовегах а научных конференциях Киовокого Ш: эпидемиологии к инфзкияовных? болезной те.Я,В.Грокааевско го МЗ 3 раина (1987-ГЭ91 от.)« копференшд "Генетические последатвт si грязнения окружавдэй ореды" (Ереван,. 1986), конференции по "Мол пуляркой баологин ДйК-оодеркащих вирусов" (Киев. 1987, 1990) нг заседании секдак генетачаеннх аспектов проблема "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР (Клав, 1938)» УП съезде кикробиолсятаескс; оош.оогса (Киев, 1988), Всесоюзной научной конференции "Знтомош тогеяааэ вирусы и юс роль п защите.раатеной" (Новосибирск. IÔSi Всесоюзной ноггфербнвдн "Проблемы создания и применения мшгообк логических средств гащата растений" (Велегож, 1983), ïl-м Симп зау«е огран-членоа СЭВ по. микробным пеатацидам (Протвино, 1990 Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы применения пеотищяов и полимерных материалов в народном хозяйстве" (Knei 1990), XII Украинском съезде микробиологов, эпидемиологов й ne эитологов (Харьков.1991).

Публикации. По теме диооертация опубликовано 13 наянах ра-

т.

Объем и огрукгтоз диооортаюш. Работа изложэна на 149 отра-цах машинописного текста, иллоттриросааа 20 таблицами и 7 риалами. Состоит из введения, шеотп глав, заключения, выводов и пока цитируемой литература, который внлотает 214 источников: отечеотзояншс и 115 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Мэгериали и методн. Изучали три перспективных вируоннх ия-ктицида: Вирин-КМ, Вирии-ОС и Виродея. «ко п ерям он таль miii прэ-рат Вирин-КМ ооздаи на ооновз ВТ Ш на Крамской станция защгтн отвний (г.Симферополь). Препарат Вирян-OG разработан и предло-а для применения з качестве шюектидада научно-ясолвдователъ-им ииотитутом биологических мзтодоа защита раотанпй (г.Кшетнев). оектишднай препарат Вироден разработай в Проблемной научно-ио-едовательокой лаборатории экологии и токсиколог;!;: Киевского упя-роитета им.Тарааа Вовчонко,

Препарата Вирин-ХМ и Вирин-ОС предотанляют собой оуопенз.мг

аиул в 50^-ном гляцэриие, полученных из трупов гусениц, погяб-

9 Т?

х от оостзототвукцих болезней. Титр препаратов - I'IO -1*10А' аиул в ыв. Бкроден - б/5-ная пиру оная суапензия в глицерина.

Объекта наследования: а) гранулы, не ооково которых создались энтснояатогенчие ларустге препараты; б) шруснио чаотиш ириош), ввделенние из гранул; в) БДН; г) орепаративнке формк руоных иноектишдов.

В оонозу работы положен принша комплексного исследования, котором оочэталиоь вирусологические, токсикодогкчвокие, кммуно-гичоокне и огатиогичеокие и с тоет наследования.

Эксперименты проведены на 680 беспородных белых мышах различных возраозгов наооой 12-25 г; на 460.белых крыоах маооой 100-200 г; 880 гзипейских свинках - 200-500 г; 15 кроликах породы шиншилла - 3-4 кг; 370 развивавдихоя куриных эмбрионах 9-10 дн.); на первичной (ЧЭТ) человеческой эмбриональной ткани а перевиваемой ( ь -41) культуре клетод лейкоцитов человека.

Вируоологичеокие методы наследования включали выделение и очиоису гранул и ВДЙ из соответствующих вирусных препаратов, получение варионов из гранул ВТ КМ, ВГ ОС, инфицирование белых мышей, белых крас, культивируемых культур клеток млекопитающих и куриных эмбрионов.

Выделение гранул из препаратов проводили при помощи дифференциального центрифугирования о очисткой в градиенте плсоткоо-m сахарозы (В.И.Барановский, С.А.БахЕзлов, 1974; А.С.Надерет. 1991; rvoatan, 1931). Количество гранул подсчитывали по формуле Вид оград с к ür о- Брада а микрооногш "Дюмам P-S" (М.Н.Пкмексва и ооавт., 1971).

Прп вщелении шрионов из гранул использовали модкфэдаро-ванпый иаыи метод С.з.вэП, о.в,ог1съ, (1977). Сущность ¡»одафа вди заключалась в создании более щадящих условий щелочной обработки гранул цугам osaseиая значений рн раотзора с 11,0-11,5 до 10,0-9,5. Очистку варионов проводили по методу Е.В.колгукоеа 'ÍISS2 г,) о V48V0M разниод в размерах вирусных часгнц,

ВДН выделяли из препарата лрк помощи дифференциального деп трифугироазнал с последующей очисткой а линейном градиенте плот коога сахарозы; ftixp ВДН определяли в реакции обратной лаозивпо гем&илютиаацяи (РОНТА) и выражали в генагглютиадруащих единица 1ГЕ). Содержание белка в препарате определяли на опекгрофотокет СФ-16 (Л.П.Бучапкий,1982; В.Д.Васильева и ооавг.,1990).

Новорожденных белых мышей 1-3-х-дневного возраота инфишро-

1али интрацеребрально и оубкутанно. половозрелых - внутрибрюшн-

ю. персрально и кнтраназачьно очищенной взвеоыо гранул, вираонсв.

¡аделенннх из них а ВДН. Дга изучения воздействия указанных агзя-

гов на организм экслериментальних животных вели наблюдение за их

юзвденкем, заболеваемостью, смертностью, массой тела, показагэ-

шка гемограммы. Производили макро- и микроскопические иоалэдова-

1ия внутренних органов, определяли их относительную ыэосу.

Инфекдаоннозть заданных вирусов, а также их поведение в

теплокровном организме изучала в опытах на б ал их крысах. О этой

целью из внутренних органов подопытных животных (печень, почка,

иегкие и солепакка), забитых в разные сроки поело введения вкру-

зоз. готовили гшогсяагн в виде 1055-ной суспензий а 0,85^-ном

раатворо »аС1 для гсоледувдего исследования а РОПГА, ША и Рй&.

3 сыворотке крова подопытных гмвотних определяли слецифхчоокив

антитело в РПГА.

Культуры клеток ь -41 и ЧЗТ инфицировали различными дозами

иоолелуемых вирусов и вирионов, звдзленных из гранул (1*10° -9

1-Ю грн/глл, 4-32 ГЕ). Проведено по 5 серийанх пооохт.ей. Инфицированные культурн просматриваю под озегои»! микроскопом для обнаружения ЦПЭ. Наличка вяруеннх антигенов определяли з РОПГА. Ш к РШ.

С пзльй раннего выявления воздействия ВГ на культурн клеток

проведены исследования о использованием фепомокоэ гемадоорбгия и

вирусной изтврферэнаия (С.Я.Гайдамовяч, 1885; с.умем?^,

Н.К.ЕаГа1!со, 1972).

В опытах ка куриных эмбрионах в алланговоную полооть 9-10-

б

дневных эмбрионов вводили различные дозч гранул от 0,2*10 до 0.2'Ю11 и ВДН - от 4 до 32 ГЕ. Мазки-оглечагки из различннх орга-

вов и жидкостей эмбрионов изучали в РЙ5.

Токоикологичеокие исследования проводили в ооотаегогши о рекомендациями ВОЗ, а также по охемаи, разработанным в КШ1ЛЗИБ в острых, под острых и хронических опытах на белых мышах, крноах. г-кшейоких овянках, кроликах при ттраназальном, авроральном впе-дении »¿атерпалов, нанесении ka кожу и олизиотую глаз (Техн.докл. ЕОЗ, J* 531, IS75: В.Л.Васильева, А.Я.Гураль, I98S). Для оценки возможного токсического действия изучаемых препаратов использовали комплекс визуалыю-кетркчеаких иетодов: проводили общий осмотр подопытных животных, обращая вкамакие на. попал turne, внешний вид (состояние волосяного покрова, глаз, рта, носа, ушей), развитие, наличие признаков интоксикаций и т.п. Измеряли температуру в маа-ау тела животных, проводили гематологические исследования, макроскопические обследования внутренних органов, в конце опыта - определение их относительной каос«. Дяя сценки острой токсичности изучаемых зируоов шшояьзозали также теог отека конечности белых мышей (Е.В.Акоенова, 1980; А.М.Ткачева и ооаат.,1980; В.В.Кзирикздз-1980; Л.И.Корзая,1982).

{Иммунологические кетоди. Дот ?ыязлеявя антител к изучаемым вирусам. обнаружения вирусных антигенов в культуральных жидкостях и других биооубстрагах применяли РИГА, РОПГА и ISA.

Антигенные и аншгельные диагкос твчеокие препараты получала путем присоединения вирусных антигенов к специфических иммуноглобулинов к формалинизированшш эритроцитам барана при помощи бифункционального соединения 4-4-биодифе«шловдаазонийборофторада (¿..Т.Гурпль и ооавт., IS83) . Гранулезные антигены для конструирования ЭД получали из очияюкных гранул по ывгоду С.У.НооЬтшш, (197? р.) в кашей кодификация, которая заключалась в увеличений количеотва гранул, подвергащихоя щелочной обработке, и в опоообе

очистки антигенов. Антигены ВДН получаля по методика, оаиоанной Л.П.Бучацким (1982). Колачеотво белка в антигенах определяли по метода Лсури ( o.H.Lcwry et oil., 1951) и на спектрофотометре СФ-16.

Гиперкммуннао кроличьи сыворотки получали по разработанной, применительно к исследуемым вирусам схеме, предусматривающей трехкратное, с интервалом в 7 дней внутривенное ивеленее 2 мл взвеси счищепккх гранул (ВГ Mi - I'lO10 грн/мл, ВТ ОС - 140* грн/нл.) я ВДН (2 ыг белка в I ш). Выделение 1е из кроличьих антиоывороток проводили риванолсульфатным осаэдепием (И.Брок,1979) о последующим обсса'олйванием на осТадекаа С-25 (ТДетерман,19?0). Наличие Is контролировали на апектрофотемэтре СФ-16 лра длина волки 280 пи.

Для изучения взаимодействия наследуемых вирусов. о организмом теплокровных использовали РИГА а РОПЕА, котсрао отавилл в панелях !-типа микротигратора Тадачя (Л.Л.Гураль, Б.Л,Васильева, I9S3), пряной и непрямой варианты РИФ (3.15. Трусов, IS8I) к прямой твердофазный метод 11ФА (B.M.lftycoD, С.И.Рыбалко, 1990).

Изучение влиялхия пзруоов гращлеза и ВДН на ишзнологиявокуо реактивнноть организма, кх сенсибилизирующих овойотв, проводили путем постановки-у экопоримбкгальннх жшвояпас РИГА. КАП, РСЛЯ, а также при помощи опытов переноса гмерчупо гви тельное та. Тс а-г ТОМ отавила по методика, предложенной для вкнпяекил а изучения овнчи-Зияязагая химической и лекарственной этиологии (Л.Л.Луеаа, Р.й.Бару, I97S). Опыта переноса гиисрчувотвиташюоги проводили по методике Г.А.Артемовой (3970 г.).

Сгаткотическая обработка полученных дашп.'х в ходе асолсдояа-¡шй ооущесталялэоь методами вариационной отагиотшш о иопользсаа-геем критерия Стьщента (Л.С.Кашшакий,1964: А.К.Белсуа, В.И.Коло-хял1ийД971). Математическую обработку показататей отпеангйльгсой

ЛВС ОН ВНуГрб!1Ш!Х ОрГОКОВ ПРОВОДИЛИ путем ПЧЧЯСЛОИПЯ сродного квад-

ратического отклонения по размаху (амплитуде) (Р.Н.Бирюкова, 1962). Температурные показатели анализировали методом пепараматричеоких критериев о помощью вычисления медианы (Ме) и квартилей (Он и Ов). т.е. нахождения средяой варианты и ее размаха (К.В.Лашков,Л.Е.Поляков. 1971).

Исследование инфекционное те в токсичноотй изучаемых материалов выполнены ооилеотно 'с н.б.н, В.И.Труоовым и А.С.Нещеретом.

РЕЗУЛЬТАТЫ аОБСТВШЖ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальное изучение возможной инфекционноети вирусов гранулеза к вируса дансонуклеоза. Исследования проводились на ор-генизмеяном а ил о точном уровне о яопольэсяанием теот-оистш, очя~ тающихоя в варусологиг наиболее чувствительными для наделения вирусов и проявления канифеотной икфзкдаи - белые иивш, развивавшие оя курннке эмбрионы, культуры клеток. В отличие от традивдошяс токсикологических экспериментов проводились "слепне" лаооажи мате риалов, что было необходимо для выявления возиояной адаптации я размножения е непермкооивш/х культурах клеток и в ерга'шэме зке-периыентальвдх животных.

В экспериментах на белых мышах маооой 10-25 г установлено, что экреральнсз и парентеральное заеяеиае гранул, вирионов, выделенных из них к ВДН (титры ииокулятез от 1'109до 0,5*10 10 гр., 64-128 ГЕ вирионов и ВДЯ - I мг/ьш по аиру о нону белку) Н'> приводило к нарушению общего состояния, вотэомеяного прироста ыаоон, одвигам в гемогфакые. Не обнаружено изменений во внутренних органах подопытных животных. Аналогичные результаты получены при про ведении 3-х пассажей.

В оории экспериментов по изучению возможной ияфекцвошюотя исследуемых вирусов бшш использованы новорожденные белые мыши

1-Э-дневного возраста, которым интрацоребрально и оубкутанно вво-

7 ТО

лились различные дозы вируоного материала (1*10' - I*10 гр. 8-32 ГЕ ВДШ. Показано отсутствие отклонений во внешнем виде, поведении. признаков патологии или гибели мышей в течение периода наблвдений. Аналогичные результаты зафиксированы и при паосирова-вии материала (6 паооажвй). При изучениий РШ мазков-отпечатков мозговой гааяи после порвячного введения гранул, а в единичных олучаях и в материалах первого паооажа. были отмечены положительные результаты, свидетельствующие о наличии вирусных антигенов. В последующих лаооажах их выявить не удалось. Обнаружение вируо-пнх антигонов после первичного паооажа, по-видимому, явилось следствием механического переноса их из мозга, инфицированного большими дозами гранул.

В опытах на белых мыаах различных возрастов показано, что ВГ КМ, ВГ ОС и ВДН но адаптируются к клеткам теплокровных животных, не рэпродуцируатоя в них, не вызывают каких-либо признаков инфекционной патологии.

С позиций прогнозирования возможного воздействия энтомопато-геншх вир.уоов на организм теплокровных животных, важное значение имеет пепроо сб их судьба при попадании в организм так называемыми "естественными" путями - в лицевой канал и дыхательные пути. Проведены исследования, направленные на изучение поведения ВГ КМ н ВГ ОС в организме белых крыо, инфицированных путем энутрибрюпш-ного, перорального и интраказального введения. Как и в предыдущих экспериментах, введение криоам ВГ не вызывало видимых признаков заболеваний и специфических органических пораженчй внутренних органов. Примененные в настоящих исследованиях методы (РОПГД, РИЗ, 15ФА) позлолили выявить ао внутренних органах крыо (печень, почки, легкие, оелеэенкя) гранулезные антигены уже на 1-й день после вве-

дения гранул. Специфические антигена и более выоокие их титры и у большого числа животных выяалены на 3-5-й дни иооледования при внутрябродияксм введонии. Несколько нияе эти показатели были при интраназальном и пероральном введении гранул. К ?-«у дно иаблэда-лооь значительное снижение титров антигенов, а к 9-14-му дням они были выявлены лишь а пробах почек и только при внутрибрющиняом введении патогенов. Достоверного нэраотания титров антигенов при исоледозакии в разные сроки после введения гранул не обнаружено (рисЛ). Таким образом, независимо от способа введения в организм вирусов гранулеза. они могут проникать в ток крови,, поступать во внутренние органы, фи эта»,; вирусы не адаптируются к теплокровному организму и не вызывают признаков инфекционного прошооа. Зафиксированная динамика выявления специфических антигенов в организме подопытных животных о неуклоинш падением их титров при отсутствия каких-либо патологических оемптомон даят основания говорит: о том, что репродукция а накопление вкруоов нэ происходит, а отмечается активная элюшнааия. вяруоных антигенов из организма.

После установления йакта проникновения ВГ в ток крови теплокровных животинх, била проведена исследования в опытах аа гвн-пейоккх сванках по изучению иммунологических одьигов при воздействия эrr.Mii шруоами. При. серологических иаследопаниях в РПГЛ установлено, что а отдельных случаях, антитела и ндзкнх литрах (1:16 - 1:64) бвлк зияваеяы ужо ка 3-й день после ингсрапавального

и вкутрибрлшшного ваеяэюш. Максимальная частота обнаружена?; (у

> »1

50-60 % обследованиях сточных) и даоогь- ттроз (1:64 - 1:1024) азтлгел ^зафиксирована на 7-14 дни при мох путях введения гранул. Б лоолеиуювре орикв отаочепо суяесггеакоб оаажэнио этих показателей я к 21-;- дни антитела обнаружен« ляеь у отдельных животных. Во все орокк иозлеяоиакай более высокие татры аа.дтел я частота

О

о

14

О

Оо-

М

о о

р-

Ог

о

ек

А

I

5

7

9

ао.1. Выявление специфического антигена во внутренних органах белых крыс (РПШ пооле внутрибрюшинного 1л), инграпа-зального (Б) к перорального (И) введения гранул; а - печень, б- селезенка, в -почки, г-легкие. По оса абсвдоо -дни исследований; орияаат - среднегеометрические тигра антигена; 0 ~ обнаружено овеченде антигена в РЮ.

их обнаружения наблгщалиоь пооле внугрибршинного введения, значительно ниже они при иктраназалвком и особенно, пероральнои поступлении гранул.

В соответствии о поставленными задачами, проведены эксперимента на развшаюцихоя куриных эмбрионах и культурах клеток. Показано, что введение гранул в дозах от О.Я'М6 до 0,2'10*° не вызывало гибели взятых в опыт эмбрионов. Вмеоте о тем, инфицирование вибрионов а дозах гранул приводило к гибели части эмбрионов (.30-40 %) на 1-3-й левь после заражения. Вирусные антигены не были выявлены э иаэках-отпечатках <РШ), приготовленных из- органов и жидкостей погибших вибрионов. Цри паооировании материалов из хорионаллантоисноЕ здюсооти погибших эмбрионов, гибель или заболевание эмбрионов не воспроизведены, антигены не обнаружены. Имеются основания полагать, что гибель куриных эмбрионов . после первичного заражения в дозе 0.2'10** гр. является тококче-око." реакцией на сведение большого количества чужеродного бачка. При заражении 9-10-ти-дй&внщ куриных эмбрионов различными дозами ВДВ (4-32 ГЕ) в хорсон-аллантоионуи полость х>ибели или заболеваний не наблвдэлсоь. .

Исследованиями, проведенными на первичной (ЧЭТ) и перзвивае-мой (1,-41) культурах клеток, уотаноалено отоутогвие ЩВ ка:; при первичном зйрэЕвнш ВГ ХМ» ВГ ОС и ВДН так к в последующих пассатах. При изучении клеточных линий,инфицированных атиш материалами' о использованием методой гемадоорбши 1. вирусной энтерференши установлено, что йооледусже культуры теток не адсорбировали куриные эритроциты. Приоутотоае изучаемых взруоов в культурах не препятствовало дроаякяоввшш в клетку и репродукции ашикагорпоп вируоа-Еенеоу^льского энцефаломиелита ('>'ЕЕ). Изучение препаратов из культур клеток, инфицированных граяулаии, в РИФ позволило уст

новить специфическое овеченив гранул, которые адоорбировалиоь на поверхности отдельных клеток или групп клеток, а также располагались овободно. Вяруоные антигены были обнаружены в культуральных жидкостях первично инфицированных клеток и в материалах первого паооажа. Причем, титры вирусных антигенов не изменялись в течение 7-и суток пооло инфицирования. С паосагаш их количество уменьшалось вплоть до полного оовобовденкя культур.- Полученные данные свидетельствуют о резистентности .клеток теплокровных животных л гранулам, которые не разрушаются в условиях жизнедеятельности изученных клеточных линий (ЧЭТ, 1-41) и, по-видимому, смаваютоя о клеточных мембран при пассировании культур и смене питательной среды.

В соответствии о поставленными задачами, проведено изучение воздействия вкриоксз, выделенных из гранул 03 на культуры клеток (ЧЭТ и ь -41). Показано, что вириояы ВГ ОС яе называли ЦПЭ в изученных культурах клеток. Методами гамадосрбши и аируоной интерференции не отмочено создейотвае вирионов на культуры клеток. Им-ыу ислЬлюор ее цеп тпоа изучение препаратов из культур длетск. яяфлда-попвгжх здпионами в дозах 0-64 ГБ, показало неравномерное сэече-длэ плеючичх мембран. Внутриклеточное свечение, которое могло бы свидетельогаэвать о проникновении аирионов в клетки, ваяетено не было. Однако при увеличения дозы'вирионов до 123-256 ГЕ через 2,6,18 часов в культуре клеток х--41 било выявлено специфическое ямаупнсз свечение различной интенсивности лсдяморфвых гр: пул. расположенных з цитоплазма клеток, дающее оокоетние говорить о 1^онак-новенаи вирусных антигенов з клетки. В якрал свечение не наблюдалось. 15 поолсдушие сроки наблюдения (24, 48, 72 ч и до 7-и дней), а тякяе при изолировании вируоного материала опоиифическое сзече-кие не обнаружено. При исследовании в ИФА культуральных яидкостеЯ

в разные сроки после первичного инфицирования показано снижение титров вируоного антигена, а на 5-е сут антиген выявить не удалось. Вируоный антиген был выявлен также только в материалах первого паооежа. Зафиксированная динамика выявления-вирусного антигена указывает на то, что проникновение вирионов ВТ ОС в культивируемые клетки ь-41 происходят по-видимому, по способу пинош-тоза и не сопровождается репликацией вируса. Проникший в клетку вируо подвергается разрушению, его геном не функционирует как оа-моотояташюя генртнчеокая единица, онтогенетический цикл развития вируоа прерываетоя в овяэи о деструкцией, по-видныому. в лиао-с омо-фагосомальном аппарате клетки. Оиеченнув форму взаимодействия слруоа и метки некоторые исследователи называют вирусопаги-чеокой (В.Д.Соловьев и ооавт., 1979; А.Г.Букринокая, 1Э82).

Токсикологическая характеритика энтомопатогенных препаратов. Показано, что вируоы гранулеза КМ. ОС, яэрвоэируо ШЯ и препараты п их основе не токсична для белых мнией и крно в острых и хроничеоких опытах при перорачьном введении. Изучаемые показатели (прирост маооы, даннае термометрдрования, результата гематологических иооледозаний и др;) доотоасрпо не отличалиоь s группах опытных и контрольных гашотных.

Нанесение изучаемых патогенов на слизистую оболочку глаз кроликоп, на здоровую или окарафишрованну» кожу гвннейокях ови-нок так®9 но приводило к развитию какой-либо взшшой патологии. Токаачеокс действие ВГ по было отмечоно rva эведешш мышам и криоам 0.5 Ю10 гранул (2.5-3. ОЧО11 и 2,5-5'Ю10 гранул на кг маооы животных ооответотаоаво). При пересчете на человека массой 70 кг это ооотаюхяет 1,73-2,1'ХО13 и 1.75-3,5'Ю12 гр. В реальных уологяях F9 иогут возникнуть оитуашш, при которых человек подвергался óu еоздеёотыш таких бодъаих доз укапнных вирусов.

Применение теота отека конечностей мышей позволило выявить

9 ТО

токонческие действие ВТ при введении в дозах 1*10 - 1*10 гранул (5.5'Ю10 - 5,4*10^ на кг маооы), которое не быво обнаружено при пероральном введении гранул мышам и крысам. При сопоставлении токоичеокого действия гранул и белка гранул, полученного метолом щелочной дезинтеграции последних,' установлено, что формирование токсического отека конечноотей у подопытных животам явилось следствием введения чужеродного белка и не овязано с действием живых вирусов.

В серии токсикологических экспериментов получены данные, позволяющие оделать заклэтениэ о нешоокой токсичности ВГ ИМ, ВГ ОС. ВДН и препаратов вирусных инсектицидов, созданных на их ооновэ. По гигиенической классификации, в которой токоичнооть рассматривается как критерий вредности, эта вирусы отнооятоя к малотоксичным.

Экспериментальное исследование оеноибилизирувдего действия вирусов гранулоза и вируса денооауклаоза комара. Чрезвычайно актуальный является оценка всех сторон возможного отрицательного влияния знтомопатогеикнх вирусов, в том числе, изучение их оен-оибилизирущего дейотвия. При проведении исследований иопояьзо-ваны методы оеноибилязаши экспериментальных животных, позволявшие заявлять ке только сильные, но и слабые аллергены. В качестве лабораторной модели попользованы гвинейские свинки, которых сенсибилизировали путем однократного введения в подушечк^ лап гранул ВГ КМ, ВГ 00, ВДН в оме-и с равным объемом адъювакта

Фрейцда, а также пятикратного введения вирусов (суммарно от 7 9

1*10 до 1*10 гр. 0,2-1,0 мг белка ВДН). Показано, что парентеральное введение изучаемых вируоов приводит к оеноибилиэаццн организма и формированию повышенной чувствительности замедленного

типа (ГИЗТ). Такой вид повишвнвой чувогаительноотибыл установ-лев на основании положительных результатов КАП.развивавдихоя по замедленному типу, а также геога РОЛЛ. Выраженноогь кожно-ал-лергичеохнх реакций и показателей специфического лизиса лейкоцитов находялаоь в прямо! завиоимоотн от суммарной сеиоибиливирув-цей дозы (табл.1). Замедленный характер индуцируемой ВТ и ЬДН комара повышенной чувствительности подтвержден опоообноотыа лейкоцитов крова оенонбилиэйрованных животных передавать его ооотоя-ние янтактным гвивейоюш ованкаы.

Таблица I

Показатели специфических иммунологических реакшй у гвинейских свинок, оеноибилизяроааниых подкоашо

¡Сеноиби- {

(лиэирую- кивог- | )иий аи- ,кнх !

I I

Схема иммунизации

1

I 5x0,2Ч07 гранул 1.5±0,7 11,7+0,65

ВТ КМ 2 бх0.2'108 2,8+0.73 16.1+2.04

3 5Х0.2-109 5.3+0,64 25.712.7

4 5x0,2* Ю7 гранул 2.4+0,2 12.0+0.7

ВТ ОС 5 5х0.2'Ю8 -г4- 3.9+0.41 15,7+1.6 6 5x0,2*10® 5,9+0.63 19.Й+1.9

ВДВ

7 5^.2 иг белка 4,3+0,9 18.2+4.2

8 5x0,6 4,7+0.42 20.0*3,1

9 5x1.0 6,3+0.57 23,3+4,4 •

Контроль (несенси-бадизиро- 1С

ванные.животные)

О

4,1+1.6

Далее было проведено исследование сенсибилизирующей активности ВГ ОС при введения в организм подопытных животных "естественными" путями, которые были бы наиболее адекватна реальным условиям контакта о ними человека при изучении, производстве, различных этапах применении вирусных препаратов. В данной серии экспериментов гвинейских свинок сенсибилизировали путем внутрибргаишн-ного, ингранэзплыюго, пероршгьного введения гранул и занесения материала па кожу. Наиболее то окне показатели специфической сеа-оибилизаши были вкявлеиы у аивозяых пооле внутрибрюцинного взэ-депия граггул. Вместе о тем, при иигранэзальком и пероральнок г.о-отушгопяи 0%-йх вируссп в организм танка обнаружен« положигвлыгав результаты постановки РСШ и РИГА, свидетельству иди в о сенсибилизации организма. Болев выоокив показатели специфического лизиаа лейкоцитов (33,3+6,6) и тигра антител (1 г 1:130) зарегистрирована при внутрибршиннсм введении гранул. Статистически достоверно эти показатели ниже при пероральном поступлении этих вирусов -15,5+1,22 и X г 1:31 соответственно. Наиеоеайе гранул на ксяу подопытннх згдвотннх ¡ш приводило к сеноябияпзасяк организма.

В результате проведенных исследований установлено, что ЗГ КМ, ВГ ОС и ВДН, аашщвеся активным началом препаратов Ви-жн-КМ, Виркн-ОС и Виродек, обладав? сенсибилизирующей актив-татьв, которая завиаит от дозы антигена, кратности его примене-шя а т.п.

Таким образом, исследования по изучена» патогеняоат- ВТ Uli, Г 00, ВДЙ и сконструированных на их основе биоинсектапидов посолили установить, что эти препараты не инфекционны и мало токсич-ы для теплокровных животных. Вместе о тем, эти вирусы способны называть сенсибилизирующее действие. что может служить лиыити» увдим критерием при проведении оанитарно-гигиенического контроля

производства и применения вирусных инсектицидов. Результаты исследования способствовали внедрению а народное хозяйство, новых, экономичных и достаточно эффективных средств защити растений. По материалам проведенных доследований оредогавлены заключения для МЗ СССР и Гоолмкомиооии МСХ СССР, на основании которых изученные препараты допущевн к государственным испытаниям (ВГ ОС -Вирсн-СС и Вир од ею, разрешены для опнтно-проиэводотвзнного применения (Вирин-КЮ.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено изучение патогеннооти (инфекдаонноотн, токоичнооти, оенсибилиэирукшей активнооти) для теплокровных животных вируоов гранулаза картофельной моли, озимой оовки, вируоа деноонуклеоза комара и созданных на их основе препаратоз вирусных иноектишдов Виран-йЛ, Вярин-ОС и Вироден, предлагаемых для использования в народном хозяйотве.

2. ВГ КМ. ВГ ОС и ВИД не адаптируются к организму теплокровных животных, ае репродуцируются в нем и не вызывают признаков манифеогнсй или инапарангной ив^екцил.

3. В экспериментах на культурах клеток человека получены данные о резиотентноота меток и вирусам гранулеза к о яярусоват; чеокой форме взаинодойотвая шркояов, выделенных и? гранул, о «лотками,

4. Вируои гранулеза и их антигены опоообпы проникать в ток крови теплокровных ждеотных, поступать во внутренние органы и элиминировать к 9-у дно.

5. Поступление вируоов в организм теплокровных животных может приводить к выработке и оярнуляшш в крози специфических антител, сенсибилизации организма и развитию повышенной чувствительное та ЗЕыедаенного типа.

6. В оерии гакаикологкчеакях экспериментов показано, что ВГ, ВДН и препараты вируоных иноектицидов Вярин-КМ, Вирин-ОС и Виро-ден малотокоичны для теплокровных животных, не оказывают раздражающего и кояно-розорбтканого действия.

7. Разработаны практические охемы п методы изучения различных аспектов взаимодействия вируоов гранулеэа и денсонуклооза комара а организмом теплокровных животных.

8. На основании проведенных.исследований-даны заклачения о возглояност-И постановки препаратов на Госиопытания и о опытно-производственной их наработке.

СПИСОК работ, опубликованных по тема диоаертапки

1. Разработка рсакшя паооквной гемэгглатикаши для выявления специфических антител к вирусам граяулеза //В;юл.метод в яи-тогрир.защите о/х культур от вредителей, болезней и сорняков.~ Кишинев. - 1985. - С. 43-50 (ооавт. А.С.Нещэрет).

2. Бакуловируоы группы Б - безопаоныо агенты биологической борьбы против наоекоь-ых-Бредитолей //Использование биооферных и модельных объектов для гигиеничеокого мониторинга загрязнителей окружающей среды: Тез.докл. Секции генетических аопектов проблемы при ГШ' СССР. Человек а биосфера. - Ереван. -1987.-С.72 (ооавт. Л.С.Нацерет).

3. Оценка острой токсичности бакуловируоов //Вирусы и вируоные заболевания. - Киев.- 1988. - Вып.16. - С.83-88 (ооавт. Л.-Т.Гураль),

4. Исследование сенсибилизирующего дейатвяя вируоов гранулеза насекомых //Тез.докл.Секши генетических аопектов проблемы при ГКНТ СССР. Человек и биосфера. -Клев. - 1938. - С. 131 (ооавт. А.С.Нещорет).

б. Пагогеннооть ифуооа гранулээа для теплокровных животных // Энтомопатогенные вируоы и кх роль в защите растений: Тез.докл.

• СО ИАСХНИЛ. - Ноаооибирок. - 1988. - С.75 (ооавт.В.ИЛ}эуоов. А.С.Нецерет).

6. Разработка реакции паосявной гемагглютинадаи (РОПГА) для обнаружения вируоа денсонуклеоза //Энтомопатогенные вирусы

и их роль в защите раотений: Тез .докл. СО ВАСХШШ. - Новосибирск. - 1986. - С.75 (ооавт. В.И.Труооя, Н.Н.Лобединец. М.А.Кузнецова).

7. Влияние балулоиируоов на швунанй ответ к гетерологичяшу антигену // Микробиол.аурн. - 1988. ~ Т.50. -Ä 2. - С.55-58.

8. Модадо-токоикологяческая оценка бакуловируоов е препаратов на их основе // XII съезд ÏM): Тез.докл. Кпев-Чераовцы. - ÏS39. - С. 193 (ооавт. В.Л.Ваоильеиа, В.И.Т^усоя. АЛ.Гураль;.

9. 'Влияние вируса гранул a sa озимой оовчи на иммунологииеокуз реактивность организма теплокровных еийотных // .Симпозиум стран-членов СЭВ со микробным пестицидам: Тез.докл. - фот-вино. СССР. - 1990. - С.187 (ооавт.-A.C.Нещерег).

• 10. Оиекка патогенноотк для теплокровных биояеотиачдов па оонозо вирусов гранулеза // Боеаоазн.коаф. Актуальные вопросы тжоп-кол сгии, гигиены пркмеяекия пестицидов и полиморних материалов в народном хозяйстве: Tos .докл. - Киев. - 1990. - С. 49 (ооавт. А.С.Еещерет, И.А.Ратума).

11. Исследование безопасное та препарата Бдродена для позвоночных каяояшх // Еадробиол.аурн. - 1990. - Т.52. - JS 6. - C.73-7S (ооавт. В,I.Васильева. Н.НЛебсяипец, А.Я.Гураль, Л.П.Буча-ischü, М.Л.Кузнецова).

12. Экспериментальное обоонованзе ПДК бакуловзруоов а воздухе рабочей зона //Гигиена а оакитария. - 1991. - £ 12. - С.39-41 (ооазт^. В.Л.Васильева. А.Я.Х^раль. В.И.И&уооз).

13. BtpycH протя иаМдякзих комах. Медико-еколог'чн). дося!дкеавя // XII УйраУноький реопубл1каиоький зп1зд м(крсб!,оло<пв, еп?до->н!олог!н i паразитолог^: Tes. доп. - wiqt.ÏI. - 1Ыв - Хар~

Kia. - 1991. - С.8».(ооавт. Б.Л.Вэооьева, З.И.Трусов, A.C.ÎIe-щерэт).