Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью фотоактивируемого красителя на основе родамина

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью фотоактивируемого красителя на основе родамина"

На правах рукописи

Генералов Александр Андреевич

Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью фотоактивируемого красителя на основе родамина

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

25 № 2015

Москва - 2015

005559527

005559527

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ), и в ФГБУН «Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук» (ФГБУН ИБХ РАН).

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Зайцев Сергей Юрьевич;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Свирщевская Елена Викторовна

Официальные оппоненты:

Зубов Виталий Павлович - доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова», кафедра химии и технологии высокомолекулярных соединений, профессор, тел.: +7 (903) 252-47-92, Email: zubov@ibch.ru

Захарова Людмила Алексеевна - доктор биологических наук, профессор, ФГБНУ «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, лаборатория клеточных и молекулярных основ гистогенеза, главный научный сотрудник, тел.: +7 906 055 29 56; +7 495 454 12 47, Email: zakharova-l@mail.ru.

Ведущая организация: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАН, тел.: (495) 526-43-74; (495) 526-45-16, Email: Vnitibp@mail.ru.

Защита состоится «_»_2015 г. в_ч. на заседании диссертационного

совета Д.220.042.01 при ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23. Тел. (495)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и на сайте http://www.ingavin.ru/.

Автореферат разослан «_»_2015 года и размещен на сайте

http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного

совета, профессор

Т.Н. Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Упаковка лекарственных средств в липосомы или наночастицы позволяет частично решать проблему токсичности препаратов для здоровых тканей, увеличить время циркуляции лекарства в крови, направлять системы доставки в нужный орган или ткань, например в опухоль. Использование систем доставки позволяет создавать многокомпонентные препараты, в состав которых можно включать несколько лекарственных препаратов, а также один или несколько целевых векторов - молекул, связывающихся со специфическими рецепторами на тканях. Размер, заряд и гидрофобность системы доставки также во многом определяет биораспределение доставляемых лекарств, а также внутриклеточный транспорт молекул. Для разработки таких систем используют различные полимеры.

Хитозан, получаемый из хитина, является одним из перспективных биополимеров для разработки систем доставки. Хитозан совместим с тканями млекопитающих, малотоксичен, деградируется ферментами организма. Значительным преимуществом хитозана по сравнению с прочими биополимерами является наличие многочисленных реакционно-способных групп, что позволяет получить необходимые характеристики с помощью химических модификаций [Wang W., 2015; Abdelhamid HN., 2014]. В полимерную матрицу на основе хитозана и его производных могут быть включены вещества различной природы - белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, витамины, противоопухолевые препараты и др. [Xiaoyu Y., 2014; Cifani N., 2014; Park S., 2013]. Кроме того, в зависимости от молекулярной массы и степени модификации полимера различными заместителями, могут быть получены носители различного размера и заряда. Для эффективного использования хитозана для систем доставки требуется детальное понимание поведения хитозана и наночастиц на его основе в клетках и организме в целом.

Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной инструментальной биологии является применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей, обладающих селективными свойствами окрашивания тканей, клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов. В данной работе использовали новый фотоактивируемый краситель на основе родамина TMP-NN-813 для анализа внутриклеточного транспорта производных хитозана с различными физико-химическими свойствами.

Цель работы: Изучить транспорт производных хитозана с различными физико-химическими свойствами с помощью фотоактивируемого флуоресцентного зонда ТМР-NN-813.

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить спектральные характеристики и внутриклеточный транспорт флуорофора TMP-NN-813.

2. Получить и охарактеризовать панель производных хитозана с различными физико-химическими свойствами.

3. Изучить и сравнить способность полученных производных хитозана связываться с макрофагальными и эпителиальными клеточными линиями методом проточной цитометрии.

4. Определить с помощью фотоактивируемого флуорофора TMP-NN-813 внутриклеточный транспорт производных хитозана в клетках млекопитающих.

5. Сравнить в динамике различия транспорта производных хитозана в эпителиальных и макрофагальных клетках.

Научная новизна работы. С помощью фотоактивируемого красителя TMP-NN-813 впервые в мире показана внутриклеточная сортировка положительно заряженных производных хитозана в митохондрии клеток. Впервые в мире показан митоптоз и экзоцитоз митохондрий, нагруженных положительно заряженным хитозаном. Впервые в мире показано отсутствие транспорта через мембраны клеток хитозана с низкой степенью дезацетилирования (50-40%). Впервые в мире фотоактивируемый краситель на основе родамина TMP-NN-813 использован для анализа внутриклеточного транспорта хитозана.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы связана с изучением механизмов транспорта хитозана с разными физико-химическими свойствами в эпителиальных и макрофагальных клетках в культурах in vitro, что является необходимым этапом при создании систем доставки лекарств. Практическое значение работы состоит в выборе производных хитозана, перспективных для использования в системах доставки лекарств, а также определение спектра патологий, для терапии которых такие системы могут использоваться. Показано, что системы доставки лекарств на основе положительно заряженных производных хитозана с высокой степенью дезацетилирования могут применяться для терапии патологий,

вызванных дисфункцией митохондрий (митохондриальная энцефаломиопатия, миоклоническая эпилепсия, гликогеноз, кардиомиопатия, митохондриальный сахарный диабет, эклампсия и др.). Полученные в работе теоретические и практические данные используются в лекционном курсе и лабораторных практикумах ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по курсам дисциплин: "Биохимия" - 3 курс ВБФ, "Спектральные методы исследований" - 3 курс ВБФ, "Биохимия мембран" - 4 курс ВБФ, "Современные методы исследований в бионанотехнологии" - магистратура по направлению «Биология» (магистерская программа «Биохимия и бионанотехнологии»).

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований при РАН «Молекулярная и клеточная биология»; "Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов"; ФЦП (П730, 14.740.11.0548-0724; 16.512.11.2069; 12.572.11.0008), а также грантом 7-ой Рамочной программы Евросоюза European Frame Program 7, NMP.2010.4.0-1, Development of nanotechnology-based systems for detection, diagnosis and therapy for cancer.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых и семинарах: в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 20122014), международная конференция «Ломоносов и Гумбольдт: Научное сотрудничество России и Германии - от истоков до наших дней» (Москва, 2011).; XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011)_; 10-th international conference of the European chitin society (St.-Petersburg, 2011); Третья Международная научная конференция "Химическая термодинамика и кинетика" (Великий Новгород, 2013); Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию ИБХ им. Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 6 статей в журналах (в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК) и 2 тезисов докладов на Российских и международных конференциях.

Личный вклад соискателя являлся основополагающим на всех этапах работы и состоял в непосредственном участии в выборе направления научного поиска, разработке цели и задач исследований по теме диссертационной работы; выполнении

экспериментальных и теоретические исследований по теме диссертации; проведении биотехнологических, биохимических и цитологических исследований; анализе полученных результатов.

Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на 143 страницах машинописного текста и включают 56 рисунков, 10 таблиц и 3 страницы приложений. Список литературы содержит 221 источник, из них 208 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фотоактивируемый краситель на основе родамина TMP-NN-813 имеет преимущества перед аналогами по устойчивости к выгоранию, возможности использования в широком диапазоне концентраций, позволяет достигать лучшего разрешения изображения.

2. Производные хитозана с низкой степенью дезацетилирования не транспортируются внутрь клеток и, соответственно, не могут использоваться для разработки систем доставки лекарств в эпителиальные (раковые) клетки.

3. Положительно заряженные производные хитозана с высокой степенью дезацетилирования транспортируются внутрь клеток, где локализуются преимущественно в митохондриях. Отрицательно заряженные производные хитозана транспортируются в лизосомы клеток.

4. Макрофаги эффективнее захватывают хитозаны, чем эпителиальные клетки и способны фагоцитировать производные с любой степенью дезацетилирования.

5. Накопление производных хитозана в клетках приводит к апоптозу (митоптозу) и экзоцитозу митохондрий во внеклеточную среду, что является частью метаболизма клеток и токсично только при высоких концентрациях хитозана.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена на кафедре химии имени профессоров С.И. Афонского, А.Г. Малахова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории клеточных взаимодействий ФГБУН ИБХ РАН в период с 2011 по 2014 год.

Фотоактивируемый флуоресцентный краситель TMP-NN-813 предоставлен Беловым В.Н., Германия. В работе использовали трекеры клеточных органелл форм Sigma, Invitrogen и Molecular Probes; хитозаны с молекулярной массой (ММ) 200 кДа и степенью деацетилирования (СД) 90%; хитозан 50 кДа и СД 90% (Sigma), хитозаны 12 и 7 кДа, СД 90% (Aladdin Chemistry Co., Ltd.. Китай). Производные с низкой СД получали методом реацетилирования хитозана Al. СД определяли с помощью 'Н-ЯМР кондуктометрией. Среднюю ММ определяли методом вискозиметрии и фракционирования. Для визуализации транспорта все производных хитозана маркировали ФИТЦ. В работе использовали линии эпителиальных и макрофагальных клеток. Анализ проводили с помощью конфокальной микроскопии на приборе Eclipse Е2000 (Nikon, Japan) и проточном цитометре FACScan (BD, USA). Результаты анализировали с помощью пакета статистических программ Excel. Определяли среднее значение и стандартные отклонения. Достоверные различия оценивали по Т-критерию Стьюдента При р<0,05 различия считали достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение физико-химических параметров и внутриклеточного транспорта TMP-NN-813. При сравнении с тетраметилродамином (TMP) краситель TMP-NN-813 в неактивном виде не дает фонового свечения (Рис.1). Для определения мишени связывания красителя внутри клеток использовали коммерческие трекеры органелл.

1»

. 120 -

Рис. 1. Флуоресцентные спектры TMP-NN-813 (А) и TMP (Б) до (левое окно) и после (правое окно) фотоактивации

Рис. 2. Ко-локализация TMP-NN-813 и трекеров органелл: контроль (А), ЭПР (В), лизосомы (С), митохондрии (D,E), комплекс Гольджи (F).

Показали, что TMP-NN-813 окрашивает не только митохондрии, но и проходит в цитоплазму и ядро (Рис. 2). Основной мишенью TMP-NN-81 являются митохондрии (Рис.2).

Не наблюдали ко-локализации с эндоплазматическим ретикуломом, лизосомами. аппаратом Гольджи. Рядом экспериментов показано преимущество фотоактивируемого красителя TMP-NN-813 по сравнению с TMP по устойчивости к выгоранию, контролируемой интенсивности сигнала, лучшей визуализации внутриклеточных органелл.

Получение и характеристика производных хитозана с различными физико-химическими свойствами. В работе была получена панель производных хитозана. различающихся по степени дезацетилирования (СД) (хитозаны AI-A3), молекулярной массе (ММ) (хитозаны A-D). наличию гидрофобных остатков (хитозан Е), а также имеющих отрицательный заряд (хитозан F) (Таблица 1).

Для получения производных с низкой СД провели реакцию реацетилирования в мягких условиях. СД и ММ определяли методом 'Н-ЯМР и вискозиметрией по Уббелоде соответственно (Рис. 3).

Для производных AI-A3, В. С и Е уточняли ММ с помощью нового метода фракционирования хитозанов в ассиметрическом потоке с детекцией по статическому

светорассеянию. Показали, что при снижении СД производные отличаются по упаковке молекулярных цепей, что выражалось в изменении условной вязкостной массы (Таб. 2).

Таблица 1 - Характеристика хитозанов

СД' СЗ2 ММ3 Химическое название

1 А1 89 - 217 Хитозан

2 А2 50 - 100 Хитозан

3 АЗ 40 - 80 Хитозан

4 В 90 - 50 Хитозан

5 С 90 - 12 Хитозан

6 о 89 - 7 Хитозан

7 Е 90 9/9 50 (2-додецен-1-ил) сукциноил-хитозан

8 И 90 70/9 50 (2-додецен-1-ил) сукциноил сукциноилхитозан

'СД - степень дезацетилирования хитозана, %; ~СЗ - степень замещения N1-12- групп на СООН-группы, %/степень замещения N142- групп на остатки додеценовой кислоты, %; 3ММ - молекулярная масса, килодапьтоны.

А

<

У ^ Щ

Л

¡Л!

Ц 20 1.5

1.00

[Хитозан], тд/гт1

Рис. 3. Спектры 1Н-ЯМР (А) и кривые зависимости вязкости от концентрации растворов хитозанов А1-АЗ (Б).

Гидрофобизованные производные хитозана были получены из хитозана с ММ 50 кДа на основе додеценилхитозана (Таблицы 1-2, Е и Р соответственно). Степень замещения по жирнокислотным остаткам в обоих случаях была около 9%, что является достаточным для изменения свойств хитозана; степень замещения по сукцинильным группам в хитозане Р составила 70%, что определяли методом 'Н-ЯМР (Рис. 4).

Все полученные производные были коньюгированы с ФИТЦ для визуализации, диализованы и хранились при +4°С. Все препараты были стабильными, по крайней мере, 2 месяца.

Таблица 2 - Степень дезацетилирования и молекулярная масса хитозанов

сд',% ММ2, к Да ММ3, кДа ММ4, к Да

п г

А1 87 300±20 868±35 90±9 220±20 570±31

А2 50 240±12 771±30 85±9 110±9 150±17

АЗ 40 220±10 646±19 47±5 62±4 82±18

В 87 35±5 97±12 34±3 37±4 44±5

С 88 20±2 10±2 26±3 27±2 29±4

О 88 5±1 1±0.2 - - -

Е 87 50±8 120±14 - - -

Р 89 50±8 120±14 - - -

Степень дезацетилирования (СД) определяли по данным 1Н-ЯМР ^Молекулярная масса посчитана с коэффициентами к=0.082 и а=0.76. 'Молекулярная масса посчитана с коэффициентами, учитывающими СД. 4Молекулярная масса определена методом РРР и приведена в трех вариантах: п, ииг.

Сравнение связывания производных хитозана с клетками методом проточной цитометрии. Связывание с поверхностью клетки является первым шагом в транспорте хитозана внутрь. Для количественной оценки связывания разных хитозанов использовали метод проточной цитометрии.

I

Рис. 4. Спектры ЯМР хитозанов Е (А) и Р (Б)

Показали, что хитозан А1 связывается значительно эффективнее, чем все остальные хитозаны. В целом связывание убывало в ряду А1>Е>А2=АЗ=В=С=0=Р. Связывание хитозана с клетками не означает обязательного дальнейшего транспорта внутрь клеток. Для анализа транспорта внутрь клеток использовали проточную цитометрию. Клетки инкубировали в присутствии хитозанов 72 ч, после чего анализировали распределение

Ю

Ж

.М™ ПН? Г-

--/ \

хитозана в клетках. Пример внутриклеточной и мембранной локализации хитозана приведен на рисунке 5-А. где видно изменение светимости хитозана А1 в клетках (по оси У) со временем.

РЭС-Н

1023

Рис. 5. Распределение хитозана А1 и А2 в клетках М|аРаСа-2 через 72 ч инкубации.

Рисунок 5-Б показывает неизменное распределение хитозана А2, ассоциированного с мембранами клеток и не попадающего внутрь клетки, где происходит его процессинг.

Анализ транспорта хитозана через мембрану показал, что хитозаны А2 и АЗ с низкой СД не проходят в клетки. Хитозаны с низкой ММ проходили в клетки аналогично хитозану А1. Гидрофобизованный отрицательно заряженный хитозан Р хуже проходил в клетки, чем положительно заряженный хитозан Е.

Для определения токсичности производных хитозана использовали проточную цитометрию и МТТ-тест.

Для выявления апоптотических и некротических клеток использовали окрашивание с помощью ОЮС6. красителя, чувствительного к потенциалу митохондрий, и йодистого пропидия (Р1). попадающего только в поврежденные клетки. Известно, что потенциал митохондрий апоптотических клеток снижается, что приводит к снижению флуоресценции ОЮС6. Показали, что только хитозаны. проходящие внутрь клетки, вызывают частичную гибель клеток, при этом наблюдается гиперполяризация митохондрий (Рис. 6).

Анализ пролиферации клеток 4 линий, включая линию М1аРаСа-2, методом МТТ не показал значительной токсичности (менее 20%) при инкубации те же 72 ч, что может означать не только токсичное действие на клетки, но и стимуляцию пролиферации остальных клеток.

27.4% 16,

100 101 102 юз 104

5.3%

66.0% 22.2% 26.0%

100 101 102 103 104 0ЮС6

В и

'

100 101 102 103 104 14.4% РЮС6 41.0%

V Г л.:- •

100 101 102 103 104

13.8% 0ЮС6 31.6%

Рис. 6. Оценка апоптоза клеток 1УШРаСа-2, вызванного хитозанами А1 (Б), А2 (В) и АЗ (Г). Клетки инкубировали 72 ч инкубации с хитозанами (100 мкг/мл), отмывали от хитозанов, окрашивали ОЮС6 и йодистым пропндием (Р1) и анализировали на проточном цитометре. А - отрицательный контроль.

Данный феномен требует дальнейшего изучения. Эффект хитозанов с низкой ММ был аналогичен хитозану А1 и проявлялся в достоверном увеличении доли апоптотических и некротических клеток в культурах при отсутствии токсического эффекта в целом на популяцию клеток по оценке в МТТ-тесте. В результате проведенной работы было показано, что производные хитозана с низкой СД, а также отрицательно заряженные гидрофобные производные (в частности додеценил сукциноил сукциноил хитозан) не проходят внутрь клеток. Хитозаны с высокой СД и любой ММ, в том числе гидрофобные, попадают в клетки млекопитающих. Для прохождения хитозана в клетки требуется более 24 ч. При высокой концентрации хитозан вызывает апоптоз и некроз клеток. При физиологических концентрация токсичность всех полученных хитозанов была низкой (0-20%).

Анализ внутриклеточного транспорта производных хитозана. Клетки инкубировали с хитозанами 24, 48 и 72 ч. На линиях МОСК и М1аРаСа-2 показали, что большая часть молекул хитозана собирается в комплексы, которые длительно локализуются на поверхности эпителиальных клеток (Рис.7). Так, через 24 ч хитозаны А1 и А2 оставались на поверхности клеток. В то же время, инкубация в течение 24 ч макрофагапьных клеток ЯАШ267.4 с хитозанами приводила к его транспортировке в митохондрии (Рис. 7, желтый цвет).

В отличие от эпителиальных клеток макрофаги экспрессируют маннозный рецептор, связывающий хитозан. а также способны фагоцитировать корпускулярный материал. Одновременная окраска митохондрий с помощью ТМР-М1Ч-813 показала, что хитозаны А1-АЗ попадают в митохондрии макрофагов (желтый цвет), что соответствует специфическому транспорту положительно заряженных хитозанов в митохондрии.

Аналогичный анализ провели с хитозанами с разной ММ. Транспортировка положительно заряженных хитозанов через мембраны эпителиальных клеток идет медленно (более 24 ч). Во все времена инкубации на эпителиальных клетках можно видеть наночастицы хитозана. ассоциированные с мембраной клеток. Макрофагальные клетки более эффективно захватывали хитозаны и транспортировали их в митохондрии (Рис.8).

Наличие жирных остатков оказывает неоднозначное действие и требует более детального изучения. На рисунке 9 приведены изображения клеток КА\¥264.7, обработанные хитозанами Е (А) и Р (Б) в течение 48 ч и окрашенные ТМР-ЫМ-813 для визуализации митохондрий. Положительно заряженный гидрофобный хитозан Е накапливался в митохондриях аналогично хитозанам А1, В-О. что постепенно приводило к их деполяризации (снижение окраски ТМР-М~Ы-813).

Отрицательно заряженный гидрофобный хитозан приводил к обратному эффекту - гиперполяризации митохондрий (Рис. 9. Б). В обоих случаях наблюдали увеличение размера митохондрий.

Картина транспорта отрицательно заряженного хитозана Б не соответствовала митохондриальной локализации. Поскольку в литературе сообщается, что хитозан транспортируется в лизосомы. мы провели окрашивание клеток лизотрекером и показали ко-локализацию отрицательно заряженного хитозана Е с лизосомами (Рис. 10).

Рис. 7. Мембранная локализация хитозанов А1 (А, В) и А2 (Б, Г) (зеленые) на клетках MDCK (А и Б) и внутриклеточная - на клетках макрофагов RAW 264.7 (В и Г) через 24 ч после внесения. Клетки окрашены TMP-NN-813 (красный). Ко-локализация с митохондриями показана стрелками.

Лизосомы и митохондрии значительно отличаются друг от друга по рН. Показано, что митохондрии и лизосомы имеют оппозитные по отношению к нейтральному значения рН (8 и 5 соответственно). Поскольку мы обнаружили положительно заряженные хитозаны в митохондриях, а отрицательно заряженные - в лизосомах, то решили проверить, что происходит в этом случае с зарядом хитозанов. Инкубация хитозанов в буферах с рН 8 и 5 показала, что в обоих случаях хитозаны нейтрализуют свой заряд. Соответственно, можно сделать вывод, что клетки распределяют заряженные молекулы по органеллам, нейтрализуя суммарный локальный заряд.

Рис.8. Транспорт хитозанов (зеленый) с разной ММ А1 (А), В (Б), С (В) и Э (Г) в макрофагальные клетки КА\У264.7 через 48 ч после внесения. Частичная ко-локализация хитозанов с митохондриями (красный) дает желтый цвет.

д * ¿г' 7 . «.,*>. - Г • »в Б Г " ■ • <,' ' д • г»--« • р * ' Ч

* 1 V -ГС*

Рис. 9. Митохондриальная локализация хитозана Е (А), но не хитозана Е(Б) в

клетках 11А\\'264.7 через 48 ч после внесения. Хитозан Е локализуется в деполяризованных митохондриях, а хитозан Г вызывает гиперполяризацию митохондрий, но в них не находится.

Хитозан Е Хитозан Г

О.

с*

I

о

X

о

о о о со

А 3 , -ч

<г «Л,. •

« • . *

1 ..у"»

В

г

а * Ы> V " «

•

"-л™

Рис. 10. Транспорт гидрофобизованных хитозанов (зеленый) в митохондрии (А и Б) или лизосомы (В и Г) зависит от заряда. Хитозан Е имеет положительный

заряд и транспортируется клеткой в митохондрии (А). Хитозан Р имеет отрицательный заряд и транспортируется в лизосомы (Г). Ядра окрашены Хехст (синий). Ко-локализации соответствуют желтые участки.

Митоптоз и экзоцитоз митохондрий. Последним этапом явилось определение дальнейшей судьбы хитозанов. Избыточное накопление хитозанов в клетке приводит к изменению заряда митохондрий. В случае накопления в митохондриях положительно заряженных хитозанов наблюдается снижение потенциала митохондрий и последующий из экзоцитоз (Рис. 11А). Отрицательно заряженный хитозан Р вызывал гиперполяризацию митохондрий и их экзоцитозу (Рис.11 Б). Изменение размера и потенциала митохондрий называется митоптозом.

и #

% 4

* _

.Л

Б

• . < г

л-г •■ '• 1 "•с*- *

ъ С л 1*0 о

Пч < • *» .

• *

Рис. 11. Экзоцитоз положительно заряженных хитозанов Е (А и В) с деполяризованными митохондриями. Экзоцитоз хитозана Г с лизосомами и параллельный экзоцитоз гиперполяризованных митохондрий (Б).

Мы показали, что митоптоз не приводит к гибели клеток, а вызывает экзоцитоз таких митохондрий. Процесс митоптоза регистрировался в культурах с хитозанами. способными проходить внутрь клеток (А1. В, С, Э, Е и Б), но не в культурах с хитозанами А2 и АЗ.

ВЫВОДЫ

1. Получена панель из 8 производных хитозана с молекулярными массами 217, 50. 20 и 10 килодальтон. степенью дезацетилирования 90. 50 и 40%. положительным и отрицательным зарядами, а также гидрофобизованные производные, модифицированные остатками додеценовой кислоты. Получены флуоресцентные аналоги всех производных.

2. Показано связывание всех производных с мембранами клеток с выходом на плато в течение 4 часов. Связывание с клетками падало в ряду А1 >Е>А2=АЗ=В=С=0=Е (р<0.05).

3. Производные хитозана с низкой степенью дезацетилирования практически не проходят внутрь эпителиальных клеток, но фагоцитируются макрофагами.

4. С помощью фотоактивируемого красителя ТМР-ЫТ\1-813 и трекеров органелл клетки показали, что отрицательно заряженные производные хитозана

транспортируются клеткой в лизосомы, а положительно заряженные — в митохондрии, что связано с нейтрализацией заряда хитозана.

5. При длительной инкубации (48-72 ч) с положительно заряженными производными хитозана наблюдается гипополяризация митохондрий (митоптоз), а при инкубации с отрицательно заряженным производным - гиперполяризация митохондрий. Во всех случаях поглощение клетками заряженных производных хитозана приводило к экзоцитозу митохондоий и лизосом.

6. С помощью коммерческих трекеров органелл клетки было установлено, что транспорт TMP-NN-813 зависит от времени инкубации. TMP-NN-813 пассивно попадает в митохондрии уже через 5 минут, где накапливается в течении 10-30 мин, а затем распределяется по цитоплазме и мембранам клетки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для разработки систем доставки лекарств при патологиях, связанных с дисфункцией митохондрий, рекомендуется использовать положительно заряженный хитозан с высокой СД и ММ.

2. Для разработки систем доставки лекарств в цитоплазму клеток, например в опухоли, рекомендуется использовать отрицательно заряженные производные хитозана или наночастицы на их основе.

3. Рекомендуется использовать отрицательно заряженные производные хитозана для разработки систем для доставки вакцин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Новые флуоресцентные красители для окрашивания клеток животных / М.Н. Шапошников, Е.В. Свирщевская, A.A. Генералов, и др. // Современная ветеринарная медицина,- 2011.- № 1,- С. 24-25.

2. Фотоактивируемый флуоресцентный краситель для лазерной конфокальной микроскопии / М.Н. Шапошников, Е.В. Свиршевская, A.A. Генералов и др. // Конференция «XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии»: тезисы докладов,- Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, 2011,- С. 436.

3. Study of intracellular chitosan traffic using caged thodamine derivative / A. Generalov, M. Shaposhnikov, S. Zaitsev et al. // 10-th international conference of the European chitin society: theses.- St.P.: EUCHIS'l 1, 2011,- P. 106

4. Зависимость флуоресценции нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя от параметров среды / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, A.A. Генералов и др. // Фундаментальные исследования.- 2012.- № 9.- С. 322-327.

5. Определение локализации нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя в культуре клеток А431 с помощью селективных флуоресцентных зондов / М.Н. Шапошников, С.Ю. Зайцев, Д.Б. Чудаков, A.A. Генералов и др. // Ученые записки казанской государственной академии ветеринарной медецины им. Н.Э. Баумана.- 2013.-№214,- С. 483-488.

6. Генералов, А. А. Определение целевых органелл при внутриклеточном транспорте фотоактивируемого флуоресцентного красителя TMP-NN-813 / A.A. Генералов, С.Ю. Зайцев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии: сборник научных трудов ФГБОУ ВПО МГАВМиБ,- 2014,- С. 329-330.

7. Генералов, А. А. Определение целевых органелл при внутриклеточном транспорте фотоактивируемого флуоресцентного красителя TMP-NN-813 / A.A. Генералов, С.Ю. Зайцев, Е.В. Свирщевская // Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию института биоорганической химии им. Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина Российской академии наук и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова: мат. науч,-практ. конференции,- М.: ActaNaturae, 2014,- С. 20-21.

8. Анализ апоптоза с помощью фотоактивируемого красителя TMP-NN-813 / A.A. Генералов, С.Ю. Зайцев, Г.В. Луценко и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2014.- № 3(49).- С. 16-17.

Заказ № 38-Р/02/2015 Подписано в печать 05.02.15 Тираж 100 экз. Усл. пл. 0,8

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 ¿F^N тел. (495)649-83-30

( )) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru