Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств"

На правах рукописи

ГЕРАСИМЕНКО ДЕНИС ВАСИЛЬЕВИЧ

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2005

Работа выполнена в Центре "Биоинженерия" РАН и во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Научный консультант:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Валерий Петрович Варламов

Любовь Васильевна Диденко

Вячеслав Михайлович Червинец Дмитрий Павлович Кузнецов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт

рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО)

Защита диссертации состоится /^июня 2005 года в часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП РАСХН. Автореферат разослан ^мая 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

Мб-1/ S&6Y

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование антибактериальных свойств биополимеров является актуальной задачей на сегодняшний день. По данным многих исследователей хитозан обладает достаточно выраженными антибактериальными свойствами, однако, в основном, исследования проводились с высокомолекулярными препаратами хитозана, растворимыми в слабокислых растворах, в то время как антибактериальные свойства низкомолекулярного хитозана практически не изучались. Исследование антибактериальных свойств ферментативно полученных водорастворимых препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных на примере целой группы микроорганизмов, в том числе и патогенных, позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера, в том числе и о перспективности направления, связанного с ферментативным получением низкомолекулярного хитозана и его использованием в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, косметической и пищевой промышленности.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана путем ферментативного гидролиза и изучение их антибактериальных свойств. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. получить культуральную жидкость 8&ер1отусез кигзвапоуИ с высокой хитиназной активностью

2. получить препараты низкомолекулярного водорастворимого

хитозана и исследовать их физико-химические свойства

3. изучить антибактериальные свойства препаратов хитозана на примере грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибах рода

Candida

4. изучить механизм действия.хшшана на бактериальные клетки

Научная новизна работы.

1. Показано, что основньми факторами, влияющими на антибактериальные свойства хитозана, являются его степень дезацетилирования и молекулярная масса. Водорастворимый хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей активностью. С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана снижается.

2. Показано, что с увеличением степени дезацетилирования возрастает и антибактериальное действие препаратов хитозана.

3. Установлена прямая зависимость гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном.

4. Методами трансмиссионной электронной и атомно-силовой микроскопии были исследованы морфологические изменения бактериальных клеток, в том числе патогенных микроорганизмов, после их обработки хитозаном.

5. Предложены механизмы антибактериального действия низкомолекулярного водораствормого хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

6. Показано, что взаимодействие хитозана с бактериальными клетками приводит к деструкции поверхностных структур бактерий, дезорганизации цитоплазматического матрикса и нуклеоида.

7. Показано, что после обработки клеток хитозаном в них происходит резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ.

Практическая значимость. Установлено, что полученные ферментативным гидролизом препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана обладают выраженными антибактериальными свойствами, вызывая практически полную гибель всех исследуемых микроорганизмов.

Показано, что низкомолекулярный хитозан вызывает гибель клеток А^оЪшепит Ште/аЫеп$. Данный результат может иметь практическое

з ж к

значение для борьбы с бактериальным раком винограда, плодовых,

кустарников и других двудольных растений, которые поражаются А tumefaciens, что наносит большой вред сельскому хозяйству.

Важный результат получен при действии хитозана на клинические штаммы микроорганизмов Candida albicans, Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus. Так, культура Candida albicans оказалась чувствительной ко всем изученным препаратам крабового и пчелиного хитозана. Следовательно, низкомолекулярный хитозан можно рекомендовать для борьбы с кандидозной инфекцией, которая на сегодняшний день является распространенным заболеванием. Кроме того, препараты низкомолекулярного хитозана вызывали гибель культур Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus.

Таким образом, можно рекомендовать использование низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана в качестве антибактериального средства в медицинской, пищевой, косметической промышленности, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), VII-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003), 5-ой Международной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения» (Черноголовка, 2004), 6-th Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symposium (Singapore, 2004), 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), ХШ-ой Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи (3 статьи в печати).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 202 ссылки, из которых 52 на

русском языке. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 8 таблиц.

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВОДОРАСТВОРИМОГО ХИТОЗАНА Отбор штамма - продуцента хитинолитических ферментов. С целью получения колоний З^ер^этусе', кигаапоуН, обладающих наибольшей хитиназной активностью, был проведен рассев данного микроорганизма на разные питательные среды, как бедные, так и богатые. Рассев проводили на овсяной среде, овсяной среде с коллоидным хитином, на среде Чигалейчика с коллоидным хитином и глюкозо-картофельном агаре.

В результате эксперимента были отобраны колонии 5 киг$ь,апоу'й (выращенные на овсяной среде с коллоидным хитином), обладающие хитиназной активностью, то есть колонии, давшие наибольшие зоны расщепления хитина.

Подбор индуктора синтеза ферментов с высокой хитинолитической активностью. Был проведен подбор оптимального индуктора синтеза хитинолитических ферментов, обладающих высокой активностью. Для этого при выращивании 5 ки^апоуп использовали несколько видов хитинсодержащих субстратов: коллоидный хитин краба, хитин краба, подмор пчел, хитин пчел (с меланином), коллоидный хитин пчел (с меланином), хитин пчел (обесцвеченный), коллоидный хитин пчел (обесцвеченный), хитин-глюкановый комплекс (ХГК), в результате чего были получены 8 культуральных жидкостей (КЖ).

С целью определения наиболее активной КЖ был проведен ферментативный гидролиз исходного высокомолекулярного хитозана со средневязкостной молекулярной массой (М4) ~800кДа полученными КЖ. Наилучший результат по гидролитической активности показали КЖ,

полученные при выращивании кигяяапоуЦ на хитине краба, хитине пчел (с меланином) и ХГК. С помощью данных КЖ были получены три препарата низкомолекулярного водорастворимого хитозана - два препарата с Му-ми 8кДа и один с М„ 9кДа. У всех препаратов степень дезацетилирования (СД) составила 85%.

Таким образом, путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана КЖ, полученными при культивировании 5. кикБапоуи на среде с крабовым хитином, хитином пчел (с меланином) и ХГК были получены препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана. В дальнейшей работе для получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана, в качестве субстрата для выращивания 5. кигчхапоуи, был использован хитин краба, так как данный субстрат показал хорошие результаты и оказался наиболее доступным из 3-х изученных.

Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана КЖ, полученной при культивировании 5 кигввапоуи на хитине краба были получены препараты низкомолекулярного водорастворимого крабового хитозана с М„ 5, 6, 10, 12, 27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Му 16кДа и СД 85%, антибактериальные свойства которых были изучены.

2.2 ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВОДОРАСТВОРИМОГО ХИТОЗАНА

Подбор концентрации хитозана. С целью подбора концентрации хитозана, оказывающей антибактериальное воздействие на микроорганизмы были проведены исследования антибактериальной активности хитозана с Му бкДа в концентрациях ОД; 0,25; 0,5; 1 и 2% против грамположительной В. БиЫШз и грамотрицательной Ет agglomerans. Результаты эксперимента

показали, что наилучшим антибактериальным эффектом обладал хитозан в концентрации 1 и 2%.

Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от Му хитозана. Был изучен процент гибели микроорганизмов, обработанных хитозаном с разными М%. (табл. 1).

Таблица 1

Процент гибели микроорганизмов, обработанных хитозаном с разными Мч и СД 85%, (%):

Микроорганизмы Му хитозана

27кДа 12кДа ЮкДа бкДа 5кДа 16кДа

Е. соИ 80,0% 76,3% 79,9% 79,6% 38,0% 60,1%

Рх. аигео/аает 89,5% 84,1% 90,0% 80,0% 89,6% 85,7%

Епи agglomerans 99,7% 99,8% 99,6% 99,5% 99,8% 99,4%

С. кгиЫе! 9,6% 5,1% 3,5% 2,2% 0% 15,4%

В. виЬШЬ 99,8% 99,3% 99,9% 99,2% 98,9% 99,9%

В. Ь 'фЛит 791 97,9% 93,5% 85,7% 82,0% 97,4% 99,0%

Результаты исследований показали, что препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с М, от 5 до 27кДа и СД 85% и водорастворимый пчелиный хитозан с 16кДа и СД 85%, эффективно действуют как на исследованные грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии, вызывая практически их полную гибель (99,9%) В отличие от бактерий, дрожжи С кгинег оказались менее чувствительными к хитозану. Вероятно, хитозан не может прикрепиться к поверхности клетки гриба и вызвать его гибель. Однако, этот эффект видоспецифичен, так как у

другого вида дрожжей рода Candida - С albicans (см. табл. 2), была обнаружена высокая чувствительность ко всем хитозанам.

Кроме того, было показано, что низкомолекулярный хитозан с Mv 5кДа вызывает гибель клеток Agrobacterium tumefaciens. Данный результат может иметь практическое значение для борьбы с бактериальным раком винограда, плодовых, кустарников и других двудольных растений, которые поражаются Л tumefaciens, что наносит большой вред сельскому хозяйству.

Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном. Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном показало, что достаточно 10 мин взаимодействия хитозана с клетками, чтобы 80-99,9% клеток потеряли жизнеспособность (рис. 1).

0 10 30 60 120 время экспозиции, мин

Рис. 1. Гибель бактерий (% от общего количества клеток) при взаимодействии их с хитозаном 12кДа при 37°С и pH 6,5 в зависимости от времени экспозиции (мин). 1- В. subtilis, 2-Е. coli

Определение прочности связывания хитозана с бактериальными клетками. В опытах по определению прочности связывания хитозана с бактериальными клетками использовали трехкратную отмывку клеток бактерий смесью из 0,1 М ацетатнного буфера (pH 6,5) и 0,5 М NaCl. В результате колориметрических исследований было установлено, что количество хитозана в супернатанте было минимальным, то есть практически весь хитозан остался

связанным с бактериями. Это же было подтверждено с помощью атомно-силовой микроскопии. Было показано, что даже после трехкратной отмывки клеток В. ьиЫШч от хитозана 0,5 М раствором МаС1 полисахарид оставался прочно связанным с их поверхностью (рис. 3) и отличался от контрольного препарата (рис. 2) характерным блеском.

Изучение влияния рН на взаимодействие хитозана с бактериальными клетками. Было изучено влияние рН (5,3 и 6,5) на взаимодействие хитозана с бактериальными клетками. Результаты показали, что сдвиг рН до 5,3 не вызывал увеличения контакта хитозана с клетками и не оказывал заметного влияния на выживаемость клеток В зиЬНШ и Е соИ после их обработки хитозаном. Процент гибели клеток, обработанных раствором хитозана с рН 5,3 и 6,5, был практически одинаков. Однако следует учитывать, что антибактериальное воздействие хитозана на клетки обусловлено не только электростатическим взаимодействием, но так же и ионным. Так же оно возможно за счет диполь-дипольных взаимодействий; водородных и

(контроль). Изображение:

двухмерная географическая палитра

Рис. 2. Клетки В. subtilis, не обработанные хитозаном

Рис. 3. Клетки В. subtilis, обработанные хитозаном бкДа и подвергнутые трехкратной отмывке раствором NaCl (опыт). Изображение: двухмерное с подсветкой

гидрофобных связей и зависит от плотности заряда (конформации цепей), соотношения времени их взаимодействия и температуры.

Изучение влияиия СД на антибактериальную активность хитозана.

При изучении влияния СД на антибактериальную активность хитозана была выявлена четкая тенденция к увеличению процента гибели клеток с повышением СД хитозана, что связано с увеличением положительного заряда хитозана, вследствие чего он более прочно связывается с поверхностью клеточной стенки (КС) микроорганизмов (рис.4).

(а) (б)

^ 100

§ 80

I 60

л 40

I 20

.1

55

73 78

СД, %

85

Рис 4 Влияние хитозана с М, 4кДа и разными СД на гибель клеток (% от общего котичества клеток) С соИ (а) и В Ьф<Лит 791 (б) через 1 ч при 37°С и рН 6,5.

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) хитозана.

Для определения минимальной концентрации хитозана, вызывающей гибель бактерий была исследована МИК крабового хитозана с М1 5, 6, 12, 27кДа и СД 85% и пчелиного хитозана с М^ 16кДа и СД 85% (табл. 2).

Определение МИК хитозана в зависимости от Mv, (%):

Таблица 2

Микроорганизмы Mv хитозана

27кДа 12кДа бкДа 5кДа 16кДа

Е. coli 0,5% 0,1% 0,06% >1% >1%

S. aureus >1% 0,1% >1% 0,5% 0,25%

С. albicans 0,01% 0,01% 0,005% 0,01% 0,06%

Ps. aeruginosa >1% >1% >1% >1% >1%

Pr. mirabilis >1% >1% >1% >1% >1%

Kl. pneumoniae >1% >1% >1% >1% >1%

L. plantarum >ЗЮ"5% 610'2% 0,5% , „ a-JA, 1,210^% 6-10"2%

В. bifidum

АТСС 14893

В экспериментах по определению МИК хитозана важный результат был получен при действии хитозана на клинические штаммы микроорганизмов С albicans и S aureus. Культура С albicans оказалась чувствительной ко всем изученным препаратам крабового и пчелиного хитозана. Следовательно, низкомолекулярный хитозан можно рекомендовать для борьбы с кандидозной инфекцией, которая на сегодняшний день является распространенным заболеванием. Кроме того, препараты низкомолекулярного хитозана вызывали гибель культур 5. aureus. Таким образом, можно рекомендовать использование

низкомолекулярных водорастворимых препаратов хиюзана в качестве антибактериального средства в медицинской, пищевой промышленности и ветеринарии.

Исследование антибактериальных свойств хитозана с отрицательным зарядом. Была исследована антибактериальная активность препаратов хитозана с отрицательным зарядом: N-сукциноилсульфат хитозан, N-сукциноил хитозан, сульфат хитозан, карбоксиметил хитозан. Результаты экспериментов показали, что ни у одного из исследованных препаратов хитозана антибактериальных свойств выявлено не было.

Таким образом, с помощью микробиологических методов исследования было показано, что ферментативно полученный низкомолекулярный водорастворимый хитозан обладает антибактериальным действием против изученных грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов и грибов рода Candida.

С помощью атомно-силовой и трансмиссионной электронной микроскопии были исследованы механизмы действия низкомолекулярного водорастворимого хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы

Изучение антибактериально! о воздействия хитозана на клетки В. subtilis с помощью атомно-силовой микроскопии1. Результаты исследований с помощью атомно-силовой микроскопии показали, что в контрольном препарате клетки В subtilis тесно контактируют между собой, на

'Работа выполнена на кафедре «Химической энзимологии» химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова совместно с зав. лаб. «Экобиокатализа», д.х.н. И.Н. Курочкиным

поверхности клеток четко выявляются пили (Рис. 5). После обработки клеток В БиЬМШ хитозаном с М^ бкДа наблюдалось увеличение пространства между отдельно лежащими клетками, не просматривались пили, поверхность клеток становилась бугристой. Изменения в бактериях усиливались по мере увеличения времени инкубации, и в конечном итоге, лизированные клетки приобретали вид аморфных масс (Рис 6-13)

Рис. 5. Клетки В тЬг/Ил, не обработанные хитозаном (контроль). Изображение: двухмерная географическая пачитра

Рис. 6. Клетки В $иЬЫ1$, обработанные хитозаном с Мч бкДа (опьп). Изображение: а - двухмерное с подсветкой, б - трехмерное с подсветкой

щ Рис. 7. Клетки В яиЫШз, обработанные хитозаном с М* бкДа (опыт).

Изображение: а - двухмерная топография, б - трехмерное с подсветкой

Рис. 8. Клетки В ьиЬШм, обработанные хитозаном с Му6кДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б- двухмерное с подсветкой

Рис. 9. Клетки В .п/ЬНИъ, обработанные хитозаном с М, бкДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б - двухмерное с подсветкой

Рис. 10. Гибель клеток В зиЫШь, обработанных хитозаном с МубкДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б - двухмерная географическая палитра

Рис. 11. Гибель клеток В чиЫ^э, обработанных хитозаном с М* бкДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б - двухмерная географическая палитра

Рис. 12. Гибель клеток В зиЫШ.ч, обработанных хитозаном с бкДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б - трехмерное с подсветкой

(а) (б)

Рис. 13. Гибель клеток В эиЬиШ, обработанных хитозаном с М, бкДа (опыт). Изображение: а - двухмерная топография, б-трехмерное с подсветкой

Таким образом, из полученных результатов следует, что после воздействия хитозана на бактериальные клетки происходит нарушение их целостности, содержимое клеток вытекает наружу и, в конце-концов, бактерии погибают.

Исследование содержания АТФ в клетках В.зиЬМИй, обработанных хитозаном2. С помощью биолюминесцентного метода было показано, что в течение первых 5 мин взаимодействия клеток В $иЬШЬ с хитозаном происходит увеличение содержания АТФ в клетках. Вероятно, после обработки бактерий хитозаном происходит активация защитных механизмов в клетке, связанных с увеличением энергетических затрат, маркером которых являются показатели содержания и активности АТФ, вследствие чего концентрация внутриклеточного АТФ возрастает. Однако далее наблюдается резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ, что свидетельствует о гибели бактерий (рис. 14).

2Работа выполнена на кафедре «Химической энзимологии» химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова совместно со ст. науч. сотр., к.х.н. В.Г. Фрунджяном

2.00x10*" 1.75x10".

S

g 1.50x10™

5 •

6 1.28x10*"-' о

I 1.00x10". i

О 7.50x10"

s

H 5.00x10". <

2.50x10'"_ 0.00

-I-1-,-,-,-1-,-,-,-1-,-1-,-1-,

0 10 20 30 40 50 60

инкубирование, мин

Рис. 14. Концентрация АТФ в суспензии В. subtilis, обработанной хитозаном с Mv бкДа и СД 85% (моль/мл).

Изучение антибактериального воздействия хитозана на клетки Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus с помощью трансмиссионной электронной микроскопии3. Была изучена ультраструктурная организация хитозана с целью его выявления в опытных образцах при взаимодействии с бактериальными клетками. Структура хитозана представляла собой аморфную

3Работа выполнена в лаборатории «Анатомии микроорганизмов» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН совместно с рук. лаб., д.м.н. Л.В. Диденко

неоднородную массу средней электронной плотности с более плотными мелкими вкраплениями (рис. 15а).

(а)

(б)

ш w

Http

Рис. 15. Ультраструктура К pneumoniae под действием хитозана: а -структура хитозана на ультратонких срезах, х 105 ООО; б - К pneumoniae в тесном контакте с хитозаном, х 100 ООО. Условные обозначения: Х-хитозан, К-капсула, Ц-цитоплазма, ВКС-внутренний слой клеточной стенки, НКС-наружный слой клеточной стенки, >-место разрушения клеточной стенки

Удалось обнаружить наличие хитозана, в виде радиально расходящихся тяжей, связанных с поверхностью КС (Рис. 156). Отдельные клетки находились в тесном контакте друг с другом и между ними располагались массы, идентичные хитозану.

(а) (б)

нкс

Рис. 16. Ультраструктура К pneumoniae под действием хитозана: а-контроль, х 96 700; б - действие хитозана бкДа, х 100 000; в - действие хитозана 27кДа, х 100 000. Условные обозначения: К-капсула, Ц-цитоплазма, ВКС-внутренний слой клеточной стенки, НКС-наружный слой клеточной стенки, >-место разрушения клеточной стенки

Результаты исследований показали, что при воздействии на К. pneumoniae хитозана с Mv 6 и 27кДа структура капсулы не изменялась, но у части клеток происходило ее истончение, при этом плотность цитоплазмы и структура нуклеоида не менялась. В отличие от контрольных препаратов (рис. 16а), основным морфологическим признаком действия хитозана сМ,6и 27кДа на К pneumoniae являлось фрагментарное разрушение наружной мембраны КС, разрыхление внутреннего слоя КС (рис. 156, 166) и выход в этих участках цитоплазматического матрикса из клетки наружу (рис. 16в).

Клетки S. aureus контрольных препаратов имели толстую КС, состоящую из двух слоев - гомогенного наружного слоя средней электронной плотности и внутреннего высокой электронной плотности, который срастался с наружным слоем цитоплазматической мембраны (ЦПМ), образуя, так называемый, мембраностеночный комплекс (Рис. 17а).

При воздействии хитозана с М„ бкДа на S. aureus были обнаружены изменения структуры, сопряженные с мембраностеночным комплексом.

Нарушалась структура внутреннего электронно-плотного слоя КС и примыкающей к ней ЦПМ (Рис. 176).

При воздействии на S aureus хитозана с 27кДа были обнаружены протопласты (бактерии, полностью лишенные КС), у которых фрагментарно разрушался наружный слой ЦПМ (рис. 17в).

мск

( v '.'

Рис. 17. Ультраструктура S aureus под действием хитозана: а - фрагмент клетки (контроль), х 136 500; б - действие хитозана бкДа, х 126 900; в -действие хитозана 27кДа, х 98 400. Условные обозначения: Ц-цитоплазма, КС-клеточная стенка, МСК-мембраностеночный комплекс, ЦПМ-цитоплазматическая мембрана, ПР-протопласт

Таким образом, в проведенном исследовании было показано, что влияние низкомолекулярного водорастворимого хитозана сМ„6и 27кДа на субмикроскопическую организацию бактерий разных систематических групп принципиально одинаково и связано с воздействием на поверхностные структуры клеток.

Кроме того, исходя из результатов проведенных микробиологических исследований по изучению антибактериального воздействия хитозана на бактериальные клетки, а так же данных, полученных с помощью атомно-силовой и трансмиссионной электронной микроскопии, можно сделать вывод, что низкомолекулярный водорастворимый хитозан, скорее всего, оказывает ярко выраженное бактериостатическое и, возможно, бактерицидное действие на все изученные микроорганизмы. Однако следует уточнить, что полной гибели микроорганизмов не происходит, так как в микробном сообществе всегда существуют клетки эволюционно более устойчивые к действию антибактериальных агентов (например, антибиотикоустойчивые штаммы микроорганизмов) по сравнению с другими клетками.

ВЫВОДЫ

1. Получена культуральная жидкость 5 ктххапти с высокой хитиназной активностью.

2. Пу; ем ферментативного гидролиза исходного высокомолекулярного хитозана (Му ~800кДа) получены препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с Му 5, 6,10,12,27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Му 16кДа и СД 85%.

3. Установлено, что препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с Му от 5 до 27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Му 1 бкДа и СД 85% проявляют антибактериальные свойства против изученных грамположительных,

грамотрицательных микроорганизмов и грибов рода Candida, вызывая практически их полную гибель (99,9%).

4. Показано, что с увеличением Mv антибактериальный эффект хитозана снижается. Кроме toi о, показано, что с увеличением СД возрастает и антибактериальное, действие препаратов хитозана. Установлено, что достаточно 10 минут взаимодействия бактериальных клеток с хитозаном, чтобы наблюдался антибактериальный эффект.

5. С помощью атомно-силовой микроскопии изучены механизмы антибактериального воздействия хитозана на клетки В. subtilis. Результаты показали, что после обработки клеток В. subtilis хитозаном поверхность клеток в отличие от контроля становится бугристой, происходит нарушение целостности поверхностных структур бактериальных клеток, содержимое клеток вытекает наружу и, в результате, бактерии погибают.

6. С помощью биолюминесцентного метода показано, что в течение первых 5 мин взаимодействия клеток В. subtilis с хитозаном происходит увеличение содержания АТФ в клетках. Однако далее наблюдается резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ, что свидетельствует о гибели бактерий.

7. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии изучены механизмы антибактериального воздействия хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Результаты трансмиссионной электронной микроскопии показали, что взаимодействие хитозана с бактериальными клетками приводит к усилению проницаемости поверхностных структур микроорганизмов. Кроме того, происходит фрагментарное разрушение наружной мембраны КС, разрыхление внутреннего слоя КС и выход в этих участках цитоплазматического матрикса из клетки наружу.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Юсупова Д.В., Варламов В.П. Исследование микроорганизмов - продуцентов хитинолитических ферментов // 1-ый Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва. 2002. С. 231

2. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Ильина A.B., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана // Материалы 7-ой Международной конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". Санкт-Петербург - Репино. 2003. С.233-238.

3. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Фролова М.А., Шинкарев С.М., Фоменко A.C., Авдиенко И.Д., Герасименко Д.В., Немцев C.B., Варламов В.П. Перспективы применения низкомолекулярных хитозанов в производстве БАД // Материалы 5-ой Международной научной конф. «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения». Черноголовка. 2004. С. 312-317.

4. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. № 3. С. 301-306.

5. Gcrasimenko D.V., Avdienko I.D., Bannikova G.E., Zyeva O.Yu., Varlamov V.P. Research of Antibacterial Properties of Low-Molecular Weight Water-Soluble chitosans // The 6-th Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symposium. 23-26 may 2004. National University of Singapore, Singapore. P. 41.

6. Диденко JI.B., Герасименко Д.В., Ультраструктурное исследование воздействия хитозана на клебсиеллы и стафилококки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (в печати).

7. Tikhonov V.E., Stepnova E.A., Babak V.G., Yamskov I.A., Palma-Guerrero J., Jansson H.-B., Lopez-Llorca L.V., Salinas I, Gerasimcnko D.V., Avdienko I.D., Varlamov V.P. Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-/2(3) - (dodec-2-enyl) succínoyl/-derivatives // Int. J. Antimicrob. Agents (in press).

8. Герасименко Д.В., Банникова Г.Е., Варламов В.П., Диденко JI.B., Константинова Н.Д., Силкина Т.А Исследование антибактериальных свойств препаратов хитозана // 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2005. С. 342.

9. Герасименко Д.В., Банникова Г.Е., Авдиенко И.Д., Варламов В.П. Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств // Материалы XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». Казань. 2005. С. 22-24.

10. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Албулов А.И., Диденко Л.В., Константинова Н.Д., Силкина Т.А., Варламов В.П. Низкомолекулярный хитозана как средство борьбы с патогенными микроорганизмами // VII Международная научно-практическая конференция «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». ВНИТИБП. 26-27 мая 2005 (в печати).

11. Авдиенко И.Д., Герасименко Д.В., Банникова Г.Е., Варламов В.П. Исследование антибактериальной активности хитозана против Agrobacterium tumefaciens И Микробиология (в печати).

* - 8 7 J î*

РНБ Русский фонд

2006-4 15767

Принято к исполнению 29/04/2005 Заказ № 825

Исполнено 03/05/2005 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Герасименко, Денис Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

Список используемых сокращений.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 ХИТИН.

1.2 ХИТОЗАН. И

1.2.1 Низкомолекулярный хитозан.

1.3 ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА.

1.3.1 Химический способ.

1.3.2 Физический способ.

1.3.3 Ферментативный способ.

1.3.3.1 Хитиназы.

1.3.3.2 Хитозаназы.

1.3.3.3 Неспецифическое действие ферментов.

1.4 АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНА.

1.4.1 Механизм антибактериального действия хитозана.

1.5 ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЗАНА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств"

Хитин и хитозан, а также производные этих полисахаридов считаются перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005 году составит на сумму около 2 млрд. долларов, из которых 75% будет использовано в крупнейших отраслях промышленности, таких как — пищевая, медицинская, косметическая, сельское хозяйство, а также в биотехнологии. Уникальная структура хитозана обуславливает проявление целого ряда полезных свойств этого полисахарида, основными из которых являются - гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, способность к пленко- и волокнообразованию, а также широкие антимикробные свойства.

Актуальность темы. Исследование антибактериальных свойств биополимеров является актуальной задачей на сегодняшний день. По данным многих исследователей хитозан обладает достаточно выраженными антибактериальными свойствами, однако, в основном, исследования проводились с высокомолекулярными препаратами хитозана, растворимыми в слабокислых растворах, в то время как антибактериальные свойства низкомолекулярного хитозана практически не изучались. Исследование антибактериальных свойств ферментативно полученных водорастворимых препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных на примере целой группы микроорганизмов, в том числе и патогенных, позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера, в том числе и о перспективности направления, связанного с ферментативным получением низкомолекулярного хитозана и его использованием в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, косметической и пищевой промышленности.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана путем ферментативного гидролиза и изучение их антибактериальных свойств. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. получить культуральную жидкость Streptomyces kurssanovii с высокой хитиназной активностью

2. получить препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана и исследовать их физико-химические свойства

3. изучить антибактериальные свойства препаратов хитозана на примере грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибах рода Candida

4. изучить механизм действия хитозана на бактериальные клетки

Научная новизна работы.

1. Показано, что основными факторами, влияющими на антибактериальные свойства хитозана, являются его степень дезацетилирования и молекулярная масса. Водорастворимый хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей активностью. С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана снижается.

2. Показано, что с увеличением степени дезацетилирования возрастает и антибактериальное действие препаратов хитозана.

3. Установлена прямая зависимость гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном.

4. Методами трансмиссионной электронной и атомно-силовой микроскопии были исследованы морфологические изменения бактериальных клеток, в том числе патогенных микроорганизмов, после их обработки хитозаном.

5. Предложены механизмы антибактериального действия низкомолекулярного водораствормого хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

6. Показано, что взаимодействие хитозана с бактериальными клетками приводит к деструкции поверхностных структур бактерий, дезорганизации цитоплазматического матрикса и нуклеоида.

7. Показано, что после обработки клеток хитозаном в них происходит резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ.

Практическая значимость. Установлено, что полученные ферментативным гидролизом препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана обладают выраженными антибактериальными свойствами, вызывая практически полную гибель всех исследуемых микроорганизмов.

Показано, что низкомолекулярный хитозан вызывает гибель клеток Agrobacterium tumefaciens. Данный результат может иметь практическое значение для борьбы с бактериальным раком винограда, плодовых, кустарников и других двудольных растений, которые поражаются А. tumefaciens, что наносит большой вред сельскому хозяйству.

Важный результат получен при действии хитозана на клинические штаммы микроорганизмов Candida albicans, Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus. Так, культура С albicans оказалась чувствительной ко всем изученным препаратам крабового и пчелиного хитозана. Следовательно, низкомолекулярный хитозан можно рекомендовать для борьбы с кандидозной инфекцией, которая на сегодняшний день является распространенным заболеванием. Кроме того, препараты низкомолекулярного хитозана вызывали гибель культур Kl. pneumoniae и S. aureus.

Таким образом, можно рекомендовать использование низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана в качестве антибактериального средства в медицинской, пищевой, косметической промышленности, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), VII-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург — Репино, 2003), 5-ой Международной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения» (Черноголовка, 2004), 6-th Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symposium (Singapore, 2004), 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), ХШ-ой Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи (3 статьи в печати).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 202 ссылки, из которых 52 на русском языке. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Герасименко, Денис Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Получена культуральная жидкость S. kurssanovii с высокой хитиназной активностью.

2. Путем ферментативного гидролиза исходного высокомолекулярного хитозана (Mv ~800кДа) получены препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с Mv 5, 6, 10, 12, 27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Mv 16кДа и СД 85%.

3. Установлено, что препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с Mv от 5 до 27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Mv 16кДа и СД 85% проявляют антибактериальные свойства против изученных грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов и грибов рода Candida, вызывая практически их полную гибель (99,9%).

4. Показано, что с увеличением Mv антибактериальный эффект хитозана снижается. Кроме того, показано, что с увеличением СД возрастает и антибактериальное действие препаратов хитозана. Установлено, что достаточно 10 минут взаимодействия бактериальных клеток с хитозаном, чтобы наблюдался антибактериальный эффект.

5. С помощью атомно-силовой микроскопии изучены механизмы антибактериального воздействия хитозана на клетки В. subtilis. Результаты показали, что после обработки клеток В. subtilis хитозаном поверхность клеток в отличие от контроля становится бугристой, происходит нарушение целостности поверхностных структур бактериальных клеток, содержимое клеток вытекает наружу и, в результате, бактерии погибают.

6. С помощью биолюминесцентного метода показано, что в течение первых 5 мин взаимодействия клеток В. subtilis с хитозаном происходит увеличение содержания АТФ в клетках. Однако далее наблюдается резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ, что свидетельствует о гибели бактерий.

7. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии изучены механизмы антибактериального воздействия хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Результаты трансмиссионной электронной микроскопии показали, что взаимодействие хитозана с бактериальными клетками приводит к усилению проницаемости поверхностных структур микроорганизмов. Кроме того, происходит фрагментарное разрушение наружной мембраны КС, разрыхление внутреннего слоя КС и выход в этих участках цитоплазматического матрикса из клетки наружу.

Заключение

Методом рассева S. kurssanovii на бедные и богатые питательные среды, содержащие, либо не содержащие коллоидный хитин, были получены колонии микроорганизма, обладающие хитиназной активностью.

Был проведен подбор оптимального индуктора синтеза хитинолитических ферментов, обладающих высокой активностью. Для этого при выращивании S. kurssanovii использовали 8 видов хитинсодержащих субстратов, в результате чего были получены 8 КЖ. С целью определения наиболее активной КЖ был проведен ферментативный гидролиз исходного высокомолекулярного хитозана (Mv ~800кДа) полученными КЖ. Наилучший результат по гидролитической активности показали КЖ, полученные при выращивании S. kurssanovii на хитине краба, хитине пчел (с меланином) и ХГК. С помощью данных КЖ были получены три препарата низкомолекулярного водорастворимого хитозана - два препарата с Му-ми 8кДа и один с Mv 9кДа. У всех препаратов СД составила 85%.

Таким образом, путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана КЖ, полученными при культивировании S. kurssanovii на среде с крабовым хитином, хитином пчел (с меланином) и ХГК были получены препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана. В дальнейшей работе для получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана, в качестве субстрата для выращивания S. kurssanovii, был использован хитин краба, так как данный субстрат показал хорошие результаты и оказался наиболее доступным из 3-х изученных.

Путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана КЖ, полученной при культивировании S. kurssanovii на хитине краба были получены препараты низкомолекулярного водорастворимого крабового хитозана с Mv 5, 6, 10, 12, 27кДа и СД 85% и препарат низкомолекулярного водорастворимого пчелиного хитозана с Mv 16кДа и СД 85%, антибактериальные свойства которых были изучены.

С целью подбора концентрации хитозана, оказывающей антибактериальное воздействие на микроорганизмы были проведены исследования антибактериальной активности хитозана с Mv бкДа в концентрациях 0,1; 0,25; 0,5; 1 и 2% против грамположительной В. subtilis и грамотрицательной Ent. agglomerans. Результаты эксперимента показали, что наилучшим антибактериальным эффектом обладал хитозан в концентрации 1 и 2%.

Был изучен процент гибели микроорганизмов, обработанных хитозаном с разными Mv. Оказалось, что препараты хитозана краба с Mv от 5 до 27кДа и пчелиный хитозан с Mv 16кДа эффективно действуют на все изученные бактерии, вызывая практически их полную гибель (99,9%). Кроме того, было показано, что низкомолекулярный хитозан вызывает гибель клеток A. tumefaciens. Данный результат может иметь практическое значение для борьбы с бактериальным раком винограда, плодовых, кустарников и других двудольных растений, которые поражаются A. tumefaciens, что наносит большой вред сельскому хозяйству.

Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном показало, что достаточно 10 мин взаимодействия хитозана с клетками, чтобы 80-99,9%) клеток потеряли жизнеспособность.

В опытах по определению прочности связывания хитозана с бактериальными клетками использовали трехкратную отмывку клеток бактерий смесью из 0,1 М ацетатнного буфера (рН 6,5) и 0,5 М NaCl. В результате колориметрических исследований было установлено, что количество хитозана в супернатанте было минимальным, то есть практически весь хитозан остался связанным с бактериями. Это же было подтверждено с помощью атомно-силовой микроскопии.

Было изучено влияние рН (5,3 и 6,5) на взаимодействие хитозана с бактериальными клетками. Результаты показали, что сдвиг рН до 5,3 не вызывал увеличения контакта хитозана с клетками и не оказывал заметного влияния на выживаемость клеток В. subtilis и Е. coli после их обработки хитозаном.

При изучении влияния СД на антибактериальную активность хитозана была выявлена четкая тенденция к увеличению процента гибели клеток с повышением СД хитозана, что связано с увеличением положительного заряда хитозана, вследствие чего он более прочно связывается с поверхностью КС микроорганизмов.

В экспериментах по определению МИК хитозана важный результат был получен при действии хитозана на клинические штаммы микроорганизмов С. albicans, Kl. pneumoniae и S. aureus. Культура С. albicans оказалась чувствительной ко всем изученным препаратам крабового и пчелиного хитозана. Следовательно, низкомолекулярный хитозан можно рекомендовать для борьбы с кандидозной инфекцией, которая на сегодняшний день является распространенным заболеванием. Кроме того, препараты низкомолекулярного хитозана вызывали гибель культур К1. pneumoniae и S. aureus. Таким образом, можно рекомендовать использование низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана в качестве антибактериального средства в медицинской, пищевой промышленности и ветеринарии.

Была исследована антибактериальная активность препаратов хитозана с отрицательным зарядом. Результаты экспериментов показали, что ни у одного из исследованных препаратов хитозана антибактериальных свойств выявлено не было.

С помощью атомно-силовой и трансмиссионной электронной микроскопии были исследованы механизмы действия низкомолекулярного водорастворимого хитозана на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Результаты исследований с помощью атомно-силовой микроскопии показали, что в отличие от контрольных препаратов после обработки клеток В. subtilis хитозаном с Mv бкДа наблюдалось увеличение пространства между отдельно лежащими клетками, не просматривались пили, поверхность клеток становилась бугристой. Изменения в бактериях усиливались по мере увеличения времени инкубации, и в конечном итоге, лизированные клетки приобретали вид аморфных масс. Кроме того, с помощью биолюминесцентного метода было показано, что в течение первых 5 мин взаимодействия клеток В. subtilis с хитозаном происходит увеличение содержания АТФ в клетках. Однако далее наблюдается резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ, что свидетельствует о гибели бактерий.

Результаты исследований с помощью трансмиссионной электронной микроскопии показали, что при воздействии на KL pneumoniae хитозана с Mv 6 и 27кДа структура капсулы не изменялась, но у части клеток происходило ее истончение, при этом плотность цитоплазмы и структура нуклеоида не менялась. Основным морфологическим признаком действия препаратов хитозана с Mv 6 и 27кДа на KL pneumoniae являлось фрагментарное разрушение наружной мембраны КС, разрыхление внутреннего слоя КС и выход в этих участках цитоплазматического матрикса из клетки наружу.

При воздействии хитозана с Mv бкДа на S. aureus были обнаружены изменения структуры, сопряженные с мембраностеночным комплексом. Нарушалась структура внутреннего электронно-плотного слоя КС и примыкающей к ней ЦПМ. При воздействии на S. aureus хитозана с Mv 27кДа были обнаружены протопласты (бактерии, полностью лишенные КС), у которых фрагментарно разрушался наружный слой ЦПМ.

Таким образом, в проведенном исследовании было показано, что влияние низкомолекулярного водорастворимого хитозана с Mv 6 и 27кДа на субмикроскопическую организацию бактерий разных систематических групп принципиально одинаково и связано с воздействием на поверхностные структуры клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Герасименко, Денис Васильевич, Щёлково

1. Ward H.D., Alroy J., Lev B.I., Keusch G.T., Pereira M.E.A. Identification of chitin as a srtuctural component of Giardia cysts II Infection and Immunity. 1985. V. 49. № 3. P. 629-634

2. Muzzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977. 309p.

3. Synowiecki J., Al-Khateeb N.A. Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives // Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 2003. V. 43. № 2. P. 145-171

4. Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы использования // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 100-111

5. Shepherd R., Reader S., Falshaw A. Chitosan functional properties // Glycoconjugate J. 1997. V. 14. P. 535-542

6. Плиско E.A., Нудьга Л.А. Хитин и его химические превращения // Успехи химии. 1984. Т. 46. № 8. С. 1470-1487.

7. Zhang М., Haga A., Sekiguchi Н., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mor 'i) pupa exuvia // Int. J. Biological Macromolecules. 2000. V. 27. № 1. P. 99-105

8. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов.-М.: Наука. 1983. 315с.

9. Горовой Л.Ф., Косяков В.Н. Сорбционные свойства хитина и его производных // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 217-246

10. Kollar R., Petracova Е., Ashwell G., Robbins P.W., Cabib Е. Architecture of the yeast cell wall //J.Biol.Chem. 1995. V.270. №3 P.l 170-1178

11. Тиунова Н.А. Хитинолитические ферменты микрорганизмов // Успехи биологической химии. 1989. Т. 30. С. 199-219

12. Sampson M.N., Gooday G.W. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects // Microbiology. 1998. V. 144. P. 21892194

13. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 30. P. 627-635

14. Howling G.I., Dettmar P.W., Goddard P.A., Hampson F.C., Dornish M., Wood E.J. The effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin fibroblasts and keratinocytes in vitro // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 2959-2966

15. Kumar M.N.V.R. A review of chitin and chitosan applications (Review) II React. Functional Polymers. 2000. V. 46. P. 1-27

16. Khor E., Lim L.Y. Implantable applications of chitin and chitosan // Biomaterials. 2003. V. 24. P. 2339-2349

17. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20Х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №2. С. 132-135

18. Davis S.S., Ilium L. Chitosan for oral delivery of drugs // Chitosan per os from Dietary Supplement to Drug Carrier / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Grottammare: Atec. 2000. P. 137-164.

19. Lim S.-H., Hudson S.M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative to cotton fabric as a zero-salt dyeing auxiliary // Color. Technol. 2004. V. 120. P. 108113

20. Lim S.-H., Hudson S.M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative to cotton fabric as an antimicrobial textile finish // Carbohydr. Polym. 2004. V. 56. P. 227-234

21. Ленинджер А. Биохимия. -M: Мир. 1974. 957c.

22. Onsoyen E., Skaugrud O. Metal recovery using chitosan // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1990. V. 49. № 4. P. 395-404

23. Кочкина З.М., Чирков С.Н. Влияние производных хитозана на репродукцию колифагов Т2 и Т7 // Микробиология. 2000. Т.69. № 2. С. 257-260

24. Hsu S., Whu S.W., Tsai C-L., Wu Y.-H., Chen H.-W., Hsieh K.-H. Chitosan as scaffold materials: effects of molecular weight and degree of deacetylation // J. Polymer Research. 2004. V. 11. P. 141-147

25. Huang M., Khor E., Lim L.-Y. Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree of deacetylation // Pharmaceutical Research. 2004. V. 21. № 2. P. 344-353

26. Lim S.-H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. V. 43. № 2. P. 223-269

27. Ceo С.-Б., Рю Ч.-С., Ким Х.-Б., Ан Г.-В., Джо Б.-К., Каджиучи Т. Получение многофункционального низкомолекулярного хитозана и его применение в косметике // Косметическая химия. 2003. № 1. С. 26-30

28. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 1-6

29. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci. 2001. V. 79. P. 13241335

30. Berger J., Reist M., Mayer J.M., Felt O., Gurny R. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V. 57. № 1. P. 35-52

31. Chitin Handbook / Eds. Muzzarelli R.A.A., Peter M.G. Grottammare: Atec Edizioni. 1999. P. 534

32. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects-an update//J. Pharm Pharmocol. 2001. V. 53. № 8. P. 1047-1067

33. Thongngam M., McClements D J. Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. № 4. P. 987991

34. Xie W., Xu P., Wang W., Liu Q. Preparation of water-soluble chitosan derivatives and their antibacterial activity // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 85. P. 13571361

35. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions // Pharmaceutical Research. 2004. V. 21. № 1. P. 43-49

36. Hejazi R., Amiji M. Chitosan based gastrointestinal delivery systems // J. Control Release. 2003. V. 89. № 2. P. 151-165

37. Harding S.E. Mucoadhesive interactions // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31. Pt. 5. P. 1036-1041

38. Helander I.M., Nurmiaho-Lassila E.-L., Ahvenainen R., Rhoades J., Roller S. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria // Int. J. Food Microbiology. 2001. V. 71. P. 235-244

39. Cuero R.G. Antimicrobial action of exogenous chitosan // EXS. 1999. V. 87. P. 315-333

40. Muzzarelli R., Tarsi R., Filippini O., Glovanetti E., Biagini G., Varaldo P.E. Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chitosan // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990. V. 34. № Ю. P. 2019-2023

41. Tsai G.J., Wu Z.Y., Su W.H. Antibacterial activity of a chitooligosaccharide mixture prepared by cellulase digestion of shrimp chitosan and its application to milk preservation // J. Food Prot. 2000. V. 63. № 6. P. 747-752

42. Felt O., Carrel A., Baehni P., Buri P., Gurny R. Chitosan as tear substitute: a wetting agent endowed with antimicrobial efficacy // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. V. 16. №3. P. 261-270

43. No H.K., Lee S.H., Park N.Y., Meyers S.P. Comparison of physicochemical, binding, and antibacterial properties of chitosans prepared without and with deproteinization process // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. N° 26. P. 7659-7663

44. Divakaran R., Pillai V.N. Flocculation of river silt using chitosan // Water Res. 2002. V. 36. № 9. P. 2414-2418

45. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1670. P. 137-146

46. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products //Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 713-723

47. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 II Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 2. С. 160-163.

48. Brugnerotto J., Lizardi J., Goycoolea F.M., Argiielles-Monal W., Desbrieres J. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization //Polymer. 2001. V. 42. P. 3569-3580

49. Патент № 2073016 РФ «Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана».

50. Ilyina A.V., Tikhonov V.E., Albulov A.I., Varlamov V.P. Enzymic preparation of acid-free-water-soluble chitosan // Process Biochemistry. 2000. V. 35. № 6. P. 563-568

51. Ilyina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii //Process Biochemistry. 1999. V. 34. № 9. P. 875-878

52. Sabnis S., Block L.H. Chitosan as an enabling excipient for drug delivery systems. I. Molecular modifications // Int. J. Biol. Macromol. 2000. V. 27. № 3. P. 181-186

53. Scheel О., Thiem J. Cleavage of chitin by means of aqueous hydrochloric acid and isolation of chito-oligosaccharides // Chitin Handbook / Ed. Muzzarelli R.A.A., Peter M.G. European Chitin Society. Atec Edizioni, Grottammare AP, Italy. 1997. P. 165-170

54. Varum K.M., Holme H.K., Izume M., Stokke B.T., Smidsmd O. Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans //Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1291. № 1. P. 5-15

55. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № l.P. 80-86

56. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. P. 1283-1290

57. Lim S.H., Hudson S.M. Synthesis and antimicrobial activity of a water-soluble chitosan derivative with a fiber-reactive group // Carbohydr. Res. 2004. V. 339. P. 313-319

58. Tsai G.J., Zhang S.L., Shieh P.L. Antimicrobial activity of a low-molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of chitosan // J. Food Prot. 2004. V. 67. № 2. P. 396-398

59. Zhang М., Tan Т., Yuan Н., Rui С. Insecticidal and fungicidal activities of chitosan and oligo-chitosan // J. Bioact. Compat. Polym. 2003. V. 18. P. 391-400

60. Pettersen H., Sannes A., Holme H.K., Kristensen A.H., Dornish M., Smidsrod O. Thermal depolymerization of chitosan salts // In: Advan. Chitin Sci. / Ed M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany. 1999. P. 422-428

61. T0mmeraas K., Varum K.M.,Christensen B.E., Smidsrad O. Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans // Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 137-144

62. Chen R.H., Chang J.R., Shyur J.S. Effects of ultrasonic conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight and polydispersity of treated chitosan // Carbohydr. Res. 1997. V. 299. P. 287-294

63. Маслова Г.В. Теория и практика получения хитина электрохимическим способом // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 24-43

64. Куприна Е.Э., Водолажская С.В. Способы получения и активации хитина и хитозана // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 44-63

65. Роговина С.З. Химическая модификация природных полисахаридов целлюлозы, хитина и хитозана в твердой фазе под действием сдвиговых деформаций: Дисс. Доктора хим. Наук. Москва. 2003. 163с.

66. Zhang Н., Neay S.H. In vitro degradation of chitosan by a commertial enzyme preparation effect of molecular weight and degree of deacetilation // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 1653-1658

67. Reetarani S.P., Ghormade V., Deshpande M.V. Chitinolytic enzymes: an exploration (Review) // Enz. Microb. Technology. 2000. V. 26. P. 473-483

68. Порфирьева O.B., Юсупова Д.В., Зоткина H.JI., Соколова Р.Б., Габдрахманова Л.А. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза//Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 347-353

69. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 6. С. 624-628.

70. Lim H.-S., Kim Y.-S., Kim S.-D. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot//Appl. Environ. Microbiol. 1991. V.57. № 2. P.510-516

71. Ohtakara A., Matsunaga H., Mitsutomi M. Action pattern of Streptomyces griseus chitinase on partially N-acetylated chitosan // Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54. № 12. P. 3191-3199

72. Brurberg М.В., Eijsink G.H., Haandrikman F.J. Chitinase В from S.marcescens BJL 200 is exported to the periplasm without processing // Microbiol. 1994. V.141. №2. P.123-131.

73. Harpster M.H., Dunsmuir P. Nucleotide seguence of the chitinase В gene of S.marcescens QMB 1466 //Nucl. Acids Research. 1989. V.17. № 13. P.5395-5402

74. Okazaki K., Kato F., Watanabe N. Purification and properties of two chitinases from Streptomyces sp. J-13-3 // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V.59. № 8. P.1586-1587.

75. Стояченко И.А. Выделение, очистка хитиназ Str. kurssanovii и ферментативное расщепление хитина и хитозана. Диссертация к.х.н. Институт Биохимии. 1992. 169с.

76. Stoyachenko I.A., Varlamov V.A., Davankov V.A. Chitinases of Streptomyces kurssanovii: purification and some properties // Carbohydr. Polym. 1994. V. 24. № 1. P. 47-54

77. Ильина A.B., Татаринова Н.Ю., Тихонов B.E., Варламов В.П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kursanovii II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 2. С. 173177

78. Пириева Д.А., Чигалейчик А.Г., Тиунова Н.А., Рылкин С.С. Физиолого-биохимические свойства Actinomyces kurssanovii активного продуцента хитиназы // Микробиология. 1977. Т. 46. № 4. С. 661-665

79. Петрова Н.Т., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Ларина JI.H., Бравова Г.Б. Оптимизация биосинтеза литических ферментов термотолерантным актиномицетом Streptomyces griseinus II Биотехнология. 2002. № 1. С. 28-35

80. Takayanagi Т., Ajisaka К., Takiguchi Y., Shimahara K. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1078. P. 404-410

81. Watanabe Т., Oyanagi W., Suzuki К., Tanaka H. Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and importance of chitinase AI in chitin degradation // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 7. P. 4017-4022

82. Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity //J. Gen. Microbiol. 1988. V.134. P.164-176.

83. Mitsutomi M., Ueda M., Arai M., Ando A., Watanabe T. Action patterns of microbial chitinases and chitosanases on partially N-acetylated chitosan // Chitin Enzymology / Ed. Muzzarelli R.A.A. Atec Edizioni, Grottammare, Italy. 1996. V. 2. P. 273-284

84. Ohno Т., Armand S., Hata Т., Nikaidou N., Henrissat В., Mitsutomi M., Watanabe T. A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 // J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 17. P. 5065-5070

85. El-Aassar S.A., Ghanem K.M., Sabry S.A., Ghanem N.B. Purification and characterization of chitinases produced by Bacillus amyloliquefaciens H Bioseparation. 1992. V. 3. P. 37-46

86. Harish S., Manjula K., Podile A.R. Fusarium udum is resistant to the mycolytic activity of a biocontrol strain of Bacillus subtilis AF1 // Microbiol. Ecology. 1998. V.25. P.385-390.

87. Gupta R., Saxena R., Chaturvedi P. Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis // J. Appl. Bacterid. 1995. V.78. P.378-383

88. Appel M., Riesde W., Hofmeyr J.-H. A method for the quatitative assessment of wound induced chitinase activity in potato tubers // J. Phytopathol. 1995. V.143. № 9. P.525-529

89. Sahai A., Manocha M. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host parasite interaction // Microbiol. Rev. 1993. V.l 1. P.317-338

90. Trachuk L.A., Revina L.P., Shemyakina T.M., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839: isolation and properties // Can. J. Microbiol. 1996. V. 42. P. 307-315

91. Jackson D.T., Saunders V.A., Gooday G.W., Humphereys A.M. Chitinase activities from yeast and hyphal calls of Candida albicans II Mycol. Res. 1996. V. 100. №3. P. 321-327

92. Tsujibo H., Minoura K., Miyamoto K., Endo H., Moriwaki M., Inamori Y. Purification and properties of a thermostable chitinase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 // Appl. Environ. Microbiology. 1993. V. 59. № 2. P. 620622

93. Tanaka Т., Fukui Т., Imanaka T. Different cleavage specificities of the dual catalytic domains in chitinase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1 // J. Biol.Chem. 2001. V. 276. № 38. P. 35629-35635

94. Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин B.H. Получение экзогенного препарата хитиназы высокой активности, продуцируемой Vibrio sp. X // Биотехнология. 1998. № з. с. 13-18

95. Young М.Е., Bell R.L., Carfoad P.A. Kinetics of chitinase production. I Chitin hydrolysis. II Relation between bacteriol growth, chitin hydrolysis and enzyme synthesis // Biotechnol. Bioeng. 1985. V.27. № 6. P.769-780

96. Тиунова Н.А. Целлюлазы микроорганизмов. -М.: Наука. 1981. 158с.

97. Pleban S., Chernin L., Chet I. Chitinolytic activity of an endophytic strain of Bacillus cereus II Appl. Microbiol. 1997. V.25. P.284-288.

98. Максютова H.H., Тарчевский И.А., Юсупова Д.В., Гвоздева E.J1., Валуева, Т.А., Яковлева В.Г. Ферментативная активность афропротеинов // Биохимия. 1999. Т. 64. Вып. 7. С. 931-934

99. Iseli В., Boiler Т., Neuhaus J.-M. Functional analysis of the domains of a plant PR-3 chitinase // In: Chitin Enzymology. R.A.A. Muzzarelli, Italy, ed. Atec Edizioni. 1996. V. 2. P. 135-142

100. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология микробиологических систем. В кн.: Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. -М.: Мир. 2002. 589с.

101. Henrissat В. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities //Biochem. J. 1991. V. 1. № 280. P. 309-316

102. Актуганов Г.Э., Широков A.B., Мелентьев А.И. Выделение и свойства хитозаназы штамма Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5. С. 536-541

103. Kurakake М., Yo-u S., Nakagawa К., Sugihara М., Komaki Т. Properties of chitosanase from Bacillus cereus SI // Current Microbiology. 2000. V. 40. P. 6-9

104. Omumasaba C.A., Yoshida N., Sekiguchi Y., Kariya K., Ogawa K. Purification and some properties of a novel chitosanase from Bacillus subtilis KH1 // J. Gen. Appl. Microbiol. 2000. V. 46. № 1. P. 19-27

105. Mitsutomi M., Isono M., Uchiyama A., Nikaidou N., Ikegami Т., Watanabe T. Chitosanase activity of the enzyme previously reported as beta-1,3-1,4-glucanase from bacillus circulans WL-12 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. V. 62. № 11. P. 2107-2114

106. Zhu X.-F., Wu X.-Y., Dai Y. Fermentation conditions and properties of a chitosanase from Acinetobacter sp. C-17 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67. № 2. P. 284-290

107. Fukamizo Т., Ohkawa Т., Ikeda Y., Goto S. Specificity of chitosanase from Bacilluspumilus/f Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1205. № 2. P. 183-188

108. Azarkan M., Amrani A., Nijs M., Vandermeers A., Zerhouni S., Smolders N., Looze Y. Carica papaya latex is a rich source of a class II chitinase // Phytochemistry. 1997. V. 46. № 8. P. 1319-1325

109. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F., Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica //Biomacromolecules. 2001. V. 2. P. 165-169

110. Gil G., del Monaco S., Cerrutti P., Galvagno M. Selective antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacteria and brewing yeasts // Biotechnology Letters. 2004. V. 26. P. 569-574

111. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratoiy media and apple juice//Int. J. Food. Microbiol. 1999. V. 47. № 1-2. P. 67-77

112. Senel S., Ikinci G., Kas S., Yousefi-Rad A., Sargon M.F., Hincal A.A. Chitosan films and hydrogels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal deliveiy // Int. J. Pharm. 2000. V. 193. № 2. P. 197-203

113. Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A., Vercellotti S.V., Ruprecht R.M. N-carboxymethylchitosan-N, O-sulfate as an anti-HIV-1 agent // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 174. № 2. P. 489-496

114. Kochanska В., Kedzia A. Susceptibility of Candida, Geotrichum and Rhodotorula to chitosan ascorbate // Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec. Italy. 2002. P. 165-170

115. Rabea E.I., Badawy M. E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromolecules. 2003. V. 4. № 6. P. 1457-1465

116. Chung Y.C., Wang H.L., Chen Y.M., Li S.L. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens // Bioresour Technol. 2003. V. 88. № 3. P. 179-184

117. Tsai G.-J., Su W.-H., Chen H.-C., Pan C.-L. Antimicrobial activity of shrimp chitin and chitosan from different treatments and applications of fish preservation // Fisheries Science. 2002. V. 68. № 1. P. 170-177

118. No H.K., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // Int. J. Food. Microbiol. 2002. V. 74. № 1-2. P. 65-72

119. Alsarra I.A., Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau S.H. Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Biomaterials. 2002. V. 23. P. 3637-3644

120. Sano H., Shibasaki K., Matsukubo Т., Takaesu Y. Effect of molecular mass and degree of deacetylation of chitosan on adsorption of Streptococcus sobrinus 6715 to saliva treated hydroxyapatite // Bull. Tokyo Dent. Coll. 2002. V. 43. № 2. P. 75-82

121. Zheng L.-Y., Zhu J.-F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights // Carbohydr. Polym. 2003. V. 54. Issue 4. P. 527-530

122. Taha S.M., Swailam H.M. Antibacterial activity of chitosan against Aeromonas hydrophila //Nahrung. 2002. V. 46. № 5. P. 337-340

123. Meyer H., Butte W., Schlaak M. Influence of chitosan on bacterial growth // Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec. Italy. 2002. P. 157-163

124. Мишустин E.H., Емцев B.T. Микробиология. -М.: Колос. 1978. 351с.

125. Feofllova Е.Р., Mar'in А.Р., Tereshina V.M., Nemsev D.M., Kozlov V.P. Role of components of cell walls in metal uptake by Aspergillus niger II Res. Environ. Biotech. 2000. V. 3. P. 61-69

126. Chung Y.C., Su Y.P., Chen C.C., Jia G., Wang H.L., Wu J.C., Lin J.G. Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall // Acta. Pharmacol. Sin. 2004. V. 25. № 7. P. 932-936

127. Sorlier P., Denuziere A., Viton C., Domard A. Relation between the degree of acetylation and electrostatic properties of chitin and chitosan // Biomacromolecules. 2001. V. 2. № 3. P. 765-772

128. Tsai G.-J., Hwang S.-P. In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria // Fisheries Sci. 2004. V. 70. P. 675681

129. MacLaughlin F.C., Mumper R.J., Wang J., Tagliaferri J.M., Gill I., Hinchcliffe M., Rolland A.P. Chitosan and depolimerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery // J. Control. Release. 1998. V. 56. № 1-3. P. 259-272

130. Шлегель Г. Общая микробиология. -М: Мир. 1987. 477с.

131. Комаров Б.А. Почему хитозан полезен человеку? // Материалы Шестой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2001.С. 187-195

132. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. № 3. P. 395-411

133. Tang Z.H., Hou C.L., Chen Q.Q. Experimental study on bacteriostasis of chitosan and sodium hyaluronate // Zhongguo. Xiu. Fu. Chong. Jian. Wai. Ke. Za. Zhi. 2002. V. 16. № 4. P. 259-261

134. Roller S., Covill N. The antimicrobial properties of chitosan in mayonnaise and mayonnaise-based shrimp salads // J. Food. Prot. 2000. V. 63. № 2. P. 202-209

135. Savard Т., Beaulieu С., Boucher I., Champagne С.Р. Antimicrobial action of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and lactic acid bacteria of fermented vegetables // J. Food Prot. 2002. V. 65. № 5. p. 828-833

136. Тютерев С.Jl. Молекулярные механизмы действия хитозана в качестве средства, повышающего болезнеустойчивость растений // Материалы Седьмой Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2003. С. 118-121

137. Wang X., Du Y., Liu H. Preparation, characterization and antimicrobial activity of chitosan-Zn complex // Carbohydr. Polym. 2004. V. 56. P. 21-26

138. Кайминьш И.Ф. Физико-химические свойства хитозана и возможности его практического использования // Матер. V Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 1999. С. 230-231

139. Кочкина З.М., Сургучева Н.А., Чирков С.Н. Инактивация колифагов производными хитозана // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 261-265

140. Tsai G.J., Su W.H. Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli И J. Food Prot. 1999. V. 62. № 3. P. 239-243

141. Lin W.-C., Liu T.-Y., Yang M.-C. Hemocompatibility of polyacrylonitrile dialysis membrane immobilized with chitosan and heparin conjugate // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 1947-1957

142. Sudarshan N.R., Hoover D.G., Knorr D. Antibacterial action of chitosan // Food Biotechnol. 1992. V. 6. № 3. P. 257-272

143. Ishii Т., Okahata Y., Sato T. Mechanism of cell transfection with plasmid/chitosan complexes //Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1514. P. 51-64

144. Yang F., Cui X., Yang X. Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied by electrochemical methods and surface plasmon resonance // Biophys. Chem. 2002. V. 99. № 1. P. 99-106

145. Рогозкин В. Д. Новое направление исследований по поиску радиозащитных препаратов // Бюллетень радиационной медицины. 1968. № 3. С. 3-11

146. Davidova V.N., Yermak I.M., Gorbach V.I., Solovieva T.F. The effect of temperature on the interaction of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharide with chitosan // Membr. Cell. Biol. 1999. V. 13. № 1. P. 49-58

147. Tobias P.S., Soldau K., Gegner J.A., Mintz D., Ulevitch R.J. Lipopoly saccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14 //J. Biological Chemistry 1995. V. 270. № 18. P. 10482-10488.

148. Ohno N., Tanida N., Yadomae T. Characterization of complex formation between lipopolysaccharide and lysozyme // Carbohydr. Res. 1991. V. 214. № 1. P. 115-130.

149. Кочкина 3.M., Поспешны Г., Чирков С.Н. Ингибирование хитозаном продуктивной инфекции бактериофагов Т-серии в культуре Escherichia coli II Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. С. 211-215.

150. Кочкина З.М., Поспешны Г., Чирков С.Н. Ингибирование хитозаном фаголизиса культуры Bacillus thuringiensis // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 2. С. 247-250

151. Torrado S., Prada P., Torre P.M., Torrado S. Chitosan-poly (acrylic) acid polyionic complex: in vivo study to demonstrate prolonged gastric retention // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 917-923

152. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Application of chitin and chitosan darivatives in the pharmaceutical field // Curr. Pharm. Biotechnol. 2003. V. 4. № 5. P. 303-309

153. Peluso G., Petillo O., Ranieri M., Santin M., Ambrosio L., Calabro D., Avallone В., Balsamo G. Chitosan-mediated stimulation of macrophage function // Biomaterials. 1994. V. 15. № 15. P. 1215-1220

154. Chatelet C., Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 261268

155. Sionkowska A., Wisniewski M., Skopinska J., Kennedy C.J., Wess T.J. Molecular interactions in collagen and chitosan blends // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 795-801

156. Liu H., Mao J., Yao K., Yang G., Cui L., Cao Y. A study on a chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2004. V. 15. № 1. P. 25-40

157. Zarzycki R., Modrzejewska Z. Use of chitosan in medicine and biomedical engineering // Polim. Med. 2003. V. 33. № 1-2. P. 47-58

158. Kuberka M., Heschel I., Glasmacher В., Rau G. Preparation of collagen scaffolds and their applications in tissue engineering // Biomed. Tech. 2002. V. 47. Suppl. l.Pt. 1. P. 485-487

159. Бондаренко B.M., Червинец B.M., Воробьев A.A. Роль персистирующих условнопатогенных бактерий в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 4. С. 11-17

160. Глебов В .И., Тувальбаев Б.Г. Фитотерапия предраковых гинекологических заболеваний // Материалы 5-й Международной научной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения». Черноголовка. 2004. С. 150-158

161. Ikinci G., Senel S., Akincibay H., Kas S., Ercis S., Wilson C.G., Hincal A.A. Effect of chitosan on a periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis II Int. J. Pharm. 2002. V. 235. № 1-2. P. 121-127

162. Тюпенко Г.И., Скорикова E.E., Зязин А.Б. Электрофорез хитозана при лечении заболеваний пародонта // Матер. VI Междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2001. С. 241-248

163. Alonso M.J., Sanchez A. The potential of chitosan in ocular drug delivery //J. Pharm. Pharmocol. 2003. V. 55. № 11. P. 1451-1463

164. Senel S., McClure S.J. Potential applications of chitosan in veterinary medicine //Adv. Drug. Deliv. Rev. 2004. V. 56. № 10. P. 1467-1480

165. Ueno H., Mori Т., Fujinaga T. Topical formulations and wound healing applications of chitosan // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 52. № 2. P. 105-115

166. Bacon A., Makin J., Sizer P.J., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M., Ilium L., Chatfield S., Roberts M. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infec. Immunity. 2000. V. 68. № 10. P. 57645770

167. Guggi D., Kast C.E., Bernkop-Schnurch A. In vivo evaluation of an oral salmon calcitonin-deliveiy system based on a thiolated chitosan carrier matrix // Pharm. Res. 2003. V. 20. № 12. P. 1989-1994

168. Kelly H.M., Deasy P.B., Ziaka E., Claffey N. Formulation and preliminary in vivo dog studies of a novel drug delivery system for the treatment of periodontitis // Int. J. Pharm. 2004. V. 274. № 1-2. P. 167-183

169. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 1. С. 5-13

170. Кулев Д.Х., Львова Е.Б. Хитинсодержащая пищевая добавка из мицелиальной биомассы Aspergillus niger // Матер. VI Междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2001. С. 204-207

171. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных // Материалы Пятой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 1999. С. 15-17

172. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №4. С. 355-362

173. Spector Т. Refinement of the Comassie Blue method of protein quantitation//Anal. Biochem. 1978. V. 86. P. 141-146

174. Lim S., Hattori K., Hudson S.M. Preparation of a fiber-reactive chitosan derivative with enhanced antimicrobial activity / In: Advan. Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam, Germany. 2000. V. 4.1. P. 454-459

175. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (визкозиметрический метод оценки). -М.: Химия. 1981. 281с.

176. Wang W., Во S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. 1991. V. 13. №5. P. 281-285

177. Патент № 2164241 РФ «Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата»

178. Балинер Л.М., Богаутдинов З.Ф., Опарин Ю.Г., Угарова Н.Н., Фрунджян В.Г. Биолюминесцентное определение жизнеспособных клеток в лиофилизованных вакцинах // Ветеринария. 2002. Т.9. С.22-27

179. Романова Н.А., Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н. Сравнение методов экстракции внутриклеточного АТФ микроорганизмов различного типа длябиолюминесцентного определения клеток микроорганизмов // Прикладная биохимия микробиология. 1997. Т.ЗЗ. №.3. С.344-349

180. Ito S., Karnovski М. Formaldehyde glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds // J. Cell. Biol. 1969. V. 39. P. 168-169

181. Luft I.H. Improvements in epoxy resin embedding method // J. Biophys. Biochim. 1961. V. 9. P. 409-411

182. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electrona paque stain in electron microscopy // J. Cell. Bioll. 1963. V. 17. P. 208-212

183. Байдерберк P. Опухоли растений. -M.: Колос. 1981. 303с.

184. Угарова Н.Н. Биоаналитические применения люциферазы светляков (Обзор) // Прикладная биохимия микробиология. 1993. Т.29. №.2. С.180-191