Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивное действие хитозанов на биохимические и клеточные защитные механизмы Apis mellifera L.

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Адаптивное действие хитозанов на биохимические и клеточные защитные механизмы Apis mellifera L."

На правах рукописи

НАЗМИЕВ БУЛАТ КАВИСОВИЧ

АДАПТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ХИТОЗАНОВ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ЗАЩИТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

APIS MELLIFERA L.

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК Z013

005542917

Уфа 2013

005542917

Работа выполнена в лаборатории биохимии адаптивности насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Салтыкова Елена Станиславовна

Официальные оппоненты:

Яруллина Любовь Георгиевна

Морева Лариса Яковлевна

Ведущая организация:

Доктор биологических наук

Доктор биологических наук, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии иммунитета растений

Доктор биологических наук, профессор Кубанский государственный университет профессор кафедры зоологии беспозвоночных и энтомологии

ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет-МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится « J ^» декабря 2013 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д 002.133.01. при ФГБУН Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, 71; С электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: http//ibg.anrb.ra, e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «/¿b> U0 C^Jvd 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. С.М.Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дикая медоносная пчела (Apis mellifera L.) с давних пор одомашнена и расселена человеком практически по всей земле. Пчелиная колония представляет единый биологический организм, все члены которого не могут существовать отдельно друг от друга. В последнее время в силу различных причин происходит массовая гибель пчел, которая в отдельных странах приобретает катастрофические масштабы, имея достаточно серьезные последствия не только для экосистемы планеты, но для продовольственной и экономической безопасности стран. Синдром распада колоний (Colony Collapse Disorder - CCD), потери особей во время зимовки и ослабление пчелиных семей наблюдаются на многих пасеках, что привело к серьезной ситуации в пчеловодстве в целом (Беляева и др., 2009; Reed et al., 2009). Наиболее распространенная на сегодня гипотеза массовой гибели пчелиных семей - концепция иммунодефицита пчелы. Эта тема стала одной из активно обсуждаемых в рамках работы 43-го Международного Конгресса Апимондия в сентябре 2013 года. При действии неблагоприятных экологических факторов пчелы становятся более восприимчивыми, в частности, к инфекциям (Салтыкова, 2011).

Становится очевидным, что иммунная система пчел в настоящее время стала чрезвычайно уязвимой, в связи с этим поиск механизмов активации защитных систем медоносной пчелы является весьма актуальным. Защитные реакции медоносной пчелы включают как клеточные, так и гуморальные реакции, объединяющие множество взаимосвязанных систем, в том числе антибактериальные пептиды, гемагглютинины, фенолоксидазную и антиоксидантную системы (Zanetti, 2000; Yang et al., 2004; Kucharski, 2005).

Проблемы наращивания темпов развития пчелиных семей, способных эффективно использовать период основного медосбора и опылять энтомофильные сельскохозяйственные культуры, быстрого восстановления семей после медосбора и успешного проведения зимовки являются весьма актуальными. Широко используемые в современном пчеловодстве для подкормки пчел минерально-витаминные добавки не всегда эффективны, а средства борьбы с заболеваниями и паразитами зачастую токсичны для самих пчел (Чепурной, 2000; Лонин, 2005). Одной из важнейших задач пчеловодства во всем мире является повышение адаптивности и продуктивности медоносной пчелы с помощью биостимуляторов. Такие препараты

3

должны быть высокоэффективными и удобными в применении, способными повышать устойчивость пчел к неблагоприятным факторам среды, улучшать качество зимовки, быть экологичными и экономически выгодными, однако не все стимуляторы соответствуют данным требованиям. Решить часть поставленных задач можно разработкой и рациональным применением новых современных средств, например, препаратами на основе хитозанов, которые обладают многими вышеперечисленными свойствами, но не использовались до настоящего времени в практике пчеловодства. Хитозаны - одни из самых распространенных в природе полисахаридов - обладают как способностью связывать ионы водорода, металлов и различные токсины, так и многими видами биологической активности, которые зависят от их молекулярной массы и степени деацетилирования (Hernandez-Lauzardo. et al., 2008; Куликов и др., 2010). Для выявления адаптивных свойств хитозана в модельных лабораторных экспериментах в качестве стресс-фактора использовали битоксибациллин - препарат, предназначенный для защиты сельскохозяйственных, лекарственных, лесных и цветочных культур от насекомых вредителей. Данный препарат разрешен для употребления в сельском и приусадебном хозяйстве, а наличие в препарате кристаллического белка обеспечивает кишечный характер его действия.

Цель работы - определить влияние хитозанов на активность биохимических и клеточных механизмов, составляющих системную устойчивость медоносной пчелы. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить реакцию антиоксидантной и фенолоксидазной систем Apis mellifera L. на битоксибациллин на фоне действия хитозанов.

2. Определить агглютинирующую активность гемолимфы A. mellifera L. при действии битоксибациллина и хитозанов.

3. Изучить клеточную реакцию гемолимфы A. mellifera L. на битоксибациллин на фоне действия хитозанов.

4. Изучить действие хитозанов на развитие пчелиного патогена Ascosphaera apis в лабораторных условиях.

5. Оценить действие хитозанов на защитные ферментативные системы и жизнеспособность A. mellifera L. в условиях пасеки в зависимости от силы семей.

Научная новизна. Выявлена зависимость степени проявления биологической активности хитозанов от их молекулярной массы для медоносной пчелы. Показано,

что наиболее выраженной активностью обладают хитозан 200 кДа и сукциноил хитозана 330 кДа. Выявлена способность хитозанов индуцировать защитные биохимические и клеточные реакции насекомых. Впервые показано, что хитозаны повышают титр агглютининов у медоносной пчелы и процент фагоцитирующих клеток гемолимфы, увеличивая тем самым ее защитные свойства. Впервые отмечена фунгистатическая активность высокомолекулярного хитозана 200 кДа по отношению к грибному патогену медоносной пчелы Ascosphaera apis. Впервые показана эффективность использования хитозанов на пасеках для ослабленных семей.

Научно-практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе исследований, расширяют научные знания, касающиеся представлений о механизмах действия биостимуляторов на насекомых. Тем самым меняют методологические подходы в системе использования биологически активных веществ в практике пчеловодства. Показано, что выраженным иммуностимулирующим действием обладают высокомолекулярные хитозаны. Для применения в условиях пасеки наиболее оптимально использование хитозана 200 кДа, обладающего как иммуностимулирующей активностью, так и фунгистатической способностью в отношении Ascosphaera apis. Показано, что хитозан повышает активность защитных ферментов в большей степени у слабых семей, а также повышает эффективность зимовки, продуктивность медосбора и репродуктивный потенциал маток. Обоснована целесообразность применения хитозанов для улучшения продуктивности пасек. Полученные результаты могут быть использованы для создания препаратов на основе хитозанов нового типа действия, основанного на регуляции защитных реакций у насекомых, с последующей разработкой регламента их применения на пасеке.

Публикации. Основные результаты исследований отражены в 11 научных публикациях, в том числе, в 5 статьях в журналах, рекомендуемых ВАК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии и экологии животных» (Махачкала, 2011); II Всероссийской конференции молодых ученых «Биомика - наука 21 века» (Уфа, 2011); VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы (252 источника, в том числе 176 иностранных) и изложена на 142 страницах, включает 1 таблицу и 44 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования - пчела медоносная Apis mellifera L. Рабочих пчел доставляли с пасек Республики Башкортостан (Бирский и Чекмагушевский районы) в лабораторию и рассаживали по садкам размерами 30x30x30 см в количестве не более 200 особей при 18 часовом освещении и комнатной температуре. Пчел кормили 60%-м сахарным сиропом, который ежедневно заменялся свежим. В лабораторных экспериментах использовали пчел из одного улья с учетом силы семьи. Применяли хитиновые производные: сукциноил хитозана 330 кДа, хитозан 200 кДа, хитозан 20 кДа, хитозан 7 кДа. Хитиновые производные были любезно предоставлены объединением ЗАО «Биопрогресс» (хитозаны 330 кДа и 200 кДа) и лабораторией инженерии ферментов под руководством проф. В.П. Варламова Центра «Биоинженерия» РАН (хитозаны 20 кДа и 7 кДа). Степень деацетилирования хитиновых производных около 95%.

Экспериментально были выявлены эффективные концентрации и сроки действия хитозанов. В качестве модельного бактериального воздействия на медоносную пчелу в лабораторных условиях был использован битоксибациллин (БТБ) в концентрации 0,5%. Все вещества давали пчелам в составе 60%-го сахарного сиропа. Для определения процента выживаемости пчелы в опытных вариантах в течение трех суток получали соответствующие хитозаны, а на четвертые сутки им давали БТБ (0,5%). Выживаемость анализировали на 1 и 7 сутки после действия БТБ. В точках 1, 2, 4 и 24 часа после действия БТБ измеряли активность антиоксидантных ферментов и дифенолоксидазы в кишечнике и гемолимфе, титр гемагглютининов -через 2 часа, а измерение доли защитных клеток гемолимфы - через 4 часа.

Эффективность отобранных хитозанов также определяли по отношению к культуре Ascosphaera apis, патоген выращивался в чашках Петри на питательной среде Сабуро. Посев возбудителя осуществляли посредством смыва с зараженных

насекомых и распределения жидкости шпателем по поверхности питательной среды. Хитиновые производные вносили в питательную среду, далее осуществляли посев Ascosphaera apis. Чашки инкубировали в термостате при f = 30 С. Результат оценивали на третьи сутки.

Отобранный в лабораторных условиях по комплексу показателей эффективный хитозан был апробирован на трех пасеках удаленных друг от друга. Хитозан разово давали пчелиным семьям в виде осенней и весенней подкормки в объеме 1 литра под холстик с учетом силы семьи (2010-2011 гг). Силу семьи определяли по количеству занятых улочек: слабые семьи занимают менее 5 улочек; средние- 6-7, сильные -более 8. Определяли активность защитных ферментов (активность каталазы, пероксидазы и дифенолоксидазы) в кишечнике и гемолимфе, а также характеристики пчелосемей на пасеках (плодовитость маггок, медовая продуктивность, качество зимовки). Изменение репродуктивного потенциала маток фиксировали на основе подсчета печатного расплода через каждые 12 суток, медовую продуктивность оценивали по валовому сбору меда, учитывали расход меда за зиму, уровень подмора и чистоту ульев от поносных пятен в результате зимовки.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения, ошибки среднего, t-критерия Стьюдента и коэффициента корреляции Пирсона с помощью программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft), а также пакета программы «Statistica for Windows» (версия 6.0). Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние хитозанов на защитные ферментативные системы

Хитиновые производные благодаря своей молекулярной структуре способны являться элиситорами (Тарчевский, 1992), то есть могут осуществлять запуск защитных биохимических и клеточных реакций, которые проявляются в ответ на действие любого неблагоприятного средового фактора в отношении организма насекомого. В данной лабораторной модели в качестве стресс-фактора использовали апробированный ранее в экспериментах с пчелами битоксибациллин (БТБ). Применение БТБ в сублетальных концентрациях позволяет проявиться адаптивным реакциям организма, которые были бы несущественны при полулетальных и

летальных концентрациях или использовании других более токсичных для пчелы препаратов. При применении хитозанов отмечали повышение выживаемости рабочих пчел в лабораторных экспериментах в результате последующего воздействия на них БТБ. Наиболее значительное повышение выживаемости выявили при использовании хитозана 200 кДа по отношению контрольному варианту с БТБ (рис. 1).

80 70 60 60 40 30 20 10

ТТ

Контроль Контроль + Хитозан 7 Хитозан 20 Хитозан 200 Сукциноил БТБ кДя к Да кДа хитозана

330 кДа

Рисунок 1. Процент выживаемости Apis melliféra L. при действии БТБ на фоне применения хитиновых производных.

При применении БТБ на фоне действия хитозана 200 кДа возрастала активность антиоксидантных ферментов в гемолимфе пчел при развитии инфекции к концу суток, в то время как в первые часы отмечено некоторое снижение активности (рис. 2). Однако в кишечнике пчел в первые часы действия бактериального препарата при снижении активности пероксидазы, повышалась активность каталазы, сохраняя подобную динамику и демонстрируя четкое взаимодействие в течение суток (г = 0,70), что подтверждает эту выявленную ранее особенность у медоносной пчелы (Салтыкова и др., 2005; 2007).

В отдельных экспериментальных работах было показано, что благодаря физико-химическим свойствам молекулы хитозанов отличаются непосредственным и опосредованным антиоксидантным действием в отношении других организмов (Гальбрайх, 2001; Корягин и др., 2009). Уровень корреляции антиоксидантных ферментов с выживаемостью (рис. 1) при действии БТБ достаточно заметен (г = 0,65), что подтверждает значимость их в процессе патогенеза.

U,1

А В

Рисунок 2. Активность пероксидазы (ед. акт/мин/мг белка; А) и каталазы (нМ/мин/мг белка; В) при действии БТБ на фоне применения хитозана 200 кДа. Нормировано по контролю.

Активность дифенолоксидазы в гемолимфе и кишечнике стабилизировалась к концу суток на уровне контроля, хотя в первые часы отмечали значительное снижение активности (рис. 3). Фенолоксидазы у насекомых полифункциональны, в частности они регулируют уровень биогенных аминов-нейротрансмиттеров (Раушенбах, 1997), кроме того в процессе превращения фенольных соединений в хиноны могут образовываться цитотоксические активные кислородные метаболиты (в том числе перекисные соединения) (Глупов, 2001), уровень которых регулируется как раз антиоксидантной системой организма. Можно полагать, что низкий уровень активности фенолоксидаз на начальном этапе действия на пчел БТБ связан с необходимостью повышения концентрации биогенных аминов для обеспечения адекватной реакции нейроиммунной системы организма, а излишки данной продукции затем трансформируются возрастающей активностью дифенолоксидазы.

- - - - Кишечник Гемолимфа *

] * • * : * / ¿ i *р< 4 Час 0,05

Рисунок 3. Активность дифенолоксидазы (ед. акт/мин/мг белка) у Apis melliféra L. при действии хитозана 200 кДа и БТБ. Нормировано по контролю.

Избыток образующихся в результате этого активированных кислородных метаболитов (АКМ) нейтрализуется как раз антиоксидантной системой, активность ферментов которой в гемолимфе также повышается к концу первых суток.

Повышение активности защитных ферментов при применении хитозана 200 кДа, вероятно, имеет оптимальное значение для реализации защитных реакций, в результате которых сохраняется высокая выживаемость пчел в эксперименте. Однако, несомненна роль других защитных процессов, в модуляции которых может участвовать хитозан.

Выраженная активность антиоксидантных ферментов и дифенолоксидазы отмечена при применении сукциноил хитозана (рис.4; 5). Для его получения и повышения растворимости хитозан соединяют с янтарным ангидридом.

Рисунок 4. Активность пероксидазы (ед. акт/мин/мг белка; А) и каталазы (нМ/мин/мг белка; В) у Apis melliféra L. при действии сукциноил хитозана 330 кДа. Нормировано по контролю.

В отличие от вышеизложенного экспериментального варианта показано значительное повышение активности пероксидазы и особенно каталазы в кишечнике пчел в начальный период после начала действия БТБ, что может отражать столь же значительный рост содержания АКМ.

При этом не отмечается такой же кооперативной взаимодополняющей смены активности этих антиоксидантных ферментов, что может свидетельствовать о слишком интенсивном образовании АКМ. В то же время, при применении сукциноил хитозана не отмечается высокой выживаемости, как в случае хитозана 200 кДа. Вероятной причиной может быть негативное действие на организм активных форм

кислорода, уровень которых мог повысить значения необходимые для защиты от действия бактериального препарата.

----Кишечник Гемолимфа * * Р < 0,05 *

*

_ * -

1 2 Часы 4 24

Рисунок 5. Активность дифенолоксидазы (ед. акт/мин/мг белка) у Apis melliféra L. при действии БТБ на фоне использования сукциноил хитозана 330 кДа. Нормировано по контролю.

Повышенная активность дифенолоксидазы в кишечнике и гемолимфе пчел по отношению к уровню контроля также свидетельствует о возможном превышении допустимого уровня биогенных аминов, обеспечивающих адекватность формирования стресс-реакции организма.

Полученные результаты при использовании сукциноил хитозана могут быть обусловлены поведением молекул полимера в растворе, в частности большей растворимостью по сравнению с хитозаном и соответственно большей мобильностью. Вероятно, эти свойства обеспечивают сукциноилу хитозана большую возможность взаимодействия с клетками и меньшую сорбционную способность.

При применении хитозана 20 кДа не отмечено положительной реакции организма пчел на динамику действия бактериального препарата, так как наблюдается угнетение активности антиоксидантных ферментов, сопровождающееся ростом активности дифенолоксидазы. В случае применения хитозана 7 кДа напротив отмечено повышение активности антиоксидантных ферментов у пчел только на начальной фазе действия БТБ на фоне сильного угнетения активности дифенолоксидазы.

Быстрая активация антиоксидантных ферментов представляет собой первый уровень защитных реакций связанных с повышением концентрации АКМ при стрессовом состоянии. В тоже время их количество должно быть на оптимальном уровне для минимизации негативных процессов в организме. Тем не менее, все

хитозаны в той или иной степени повышают выживаемость пчел на фоне воздействия БТБ по сравнению с контрольным вариантом.

Влияние хитозанов на клеточную систему гемолимфы медоносной пчелы

Клеточный иммунитет неотъемлемо дополняет гуморальные иммунные реакции насекомых. Известно, что морфофункциональные характеристики и соотношение клеток гемолимфы насекомых изменяются в зависимости от физиологического состояния организма и действия факторов окружающей среды, особенно при инфекционном стрессе (Гайфуллина и др., 2003).

Родоначальным типом клеток у Apis mellifera L. являются прогемоциты составляющие в гемолимфе пчел, не получавших никаких добавок с кормом, до 90 % от общего гемоцитного состава. Этот факт может свидетельствовать об довольно однородном составе нового поколения пчел. Добавление в корм пчел препарата БТБ вызывало изменения в соотношении гемоцитов гемолимфы, что выражалось в снижении количества прогемоцитов и увеличении процента амебоидных фагоцитов и сферулоцитов (табл. 1).

Таблица 1

Изменение доли различных типов гемоцитов у медоносной пчелы Apis mellifera L при _ действии хитиновых производных и БТБ

Вариант Процент гемоцитов

Сферу-лоциты Веретен, фагоциты Амебоидные фагоциты Прогемоциты Эноци-тоиды

Хитозан 200 кДа 5,20±0,50 0,28±0,15 29,18±1,70 65,37±3,70 1,19±0,15

Хитозан 200 кДа + БТБ 1,58±0,15 1,76±0,41 32,2±2,65 67,79±4,65 1,20±0,26

Хитозан 20 кДа 5,19±0,56 11,53±0,87 36,02±2,50 47,26±3,00 1,19±0,25

Хитозан 20 кДа + БТБ 7,50±0,58 2,14±0,15 13,57±1,00 76,78±4,58 1,20±0,21

Хитозан 7 кДа 8,67±0,96 9,24±1,16 13,29±0,82 68,78±4,82 1,19±0,22

Хитозан 7 кДа +БТБ 1,48±0,36 12,59±1,62 54,07±4,30 31,85±2,55 1,21±0,26

Сукциноил хитозана 330 кДа 1,55±0,25 1,03±0,15 40,41±2,65 56,99±2,83 1,17±0,27

Сукциноил хитозана 330 кДа + БТБ 7,22±0,18 23,92±1,73 15,80±1,41 53,04±4,94 1,00±0,18

Контроль + БТБ 7,14±1,73 1,78±0,25 36,07±3,58 55,09±5,18 1,14±0,15

Контроль 1,58±0,15 1,76±1,16 6,17±1,18 90,47±8,82 1,00±0,10

Известно, что прогемоциты циркулирующие в гемолимфе, являются митотически активными и сохраняют способность к дальнейшей дифференциации. Использование хитозанов, так же как и БТБ, приводит к снижению количества циркулирующих прогемоцитов и одновременное увеличение числа других клеток. Так, уровень корреляции между увеличением доли амебоидных фагоцитов и активностью антиоксидантных ферментов довольно высок (пероксидаза, г = 0,81; каталаза, г = 0,83), что позволяет предположить тесную взаимосвязь антиоксидантных процессов с увеличением доли фагоцитирующих клеток. Во всех вариантах отмечено увеличение амебоидных фагоцитов, в то время как доля веретеновидных фагоцитов (активированных фагоцитов) повышалась при использовании сукциноил хитозана и хитозана 20 кДа. Последующее применение БТБ изменяет соотношение клеток. Снижение уровня амебоидных фагоцитов при последовательном применении хитозанов и БТБ, вероятно, связано с трансформацией амебоидных клеток в веретеновидную форму (Сиротина, 1961). В целом видно, что в случае применения всех хитиновых производных происходит повышение количества амебоцитов и сферулоцитов.

Клеточные реакции непосредственно связаны с функционированием патгерн-распознающих белков (Stebbins, Hapner, 1985; Глупов, 1992; 2001). Агглютинины насекомых играют медиаторную роль в иммунитете насекомых, участвуя в процессах распознавания и опсонизации чужеродных объектов. Показано, что агглютинины осуществляют данные процессы совместно с компонентами фенолоксидазной системы (Rowley et al., 1990; Nappi et al„ 2005). В многоуровневой системе защитных реакций насекомых гемагглютинины занимают одно из важнейших мест, однако реакции опосредованные ими у медоносной пчелы еще недостаточно изучены.

Применение сукциноил хитозана вызвало наибольшее повышение титра гемагглютининов соответствующее варианту с БТБ (табл. 2). При последующем воздействии битоксибациллином титр снижался до уровня контроля. Снижение титров агглютининов до уровня контроля при совместном использовании хитозанов и БТБ отмечено также и в случае хитозана 200 кДа. Применение хитозана 20 кДа вызывает изменения титров только после действия БТБ, вероятно, собственная агглютинирующая активность у этого хитозана незначительная. Хитозан 7 кДа не

изменяет титров во всех вариантах, в этом случае, возможно, происходит связывание агглютининов с самим хитозаном.

Таблица 2

Титр гемагглютинов гемолимфы Apis mellifera L при применении хитиновых

производных и БТБ.

V Контр. Контр. 200 200 кДа 330 330 кДа 20 20 7 7

+ БТБ кДа + БТБ кДа + БТБ кДа кДа + БТБ кДа кДа + БТБ

1 32 256 64 32 256 32 32 128 32 32

Вероятно, при действии хитиновых производных происходит активация или синтез агглютининов имеющих определенную специфичность для опсонизации Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. При совместном применении хитозана и БТБ происходит непосредственное связывание гемагглютининов с патогеном. Агглютинины гемолимфы способствуют оптимизации фагоцитоза осуществляемого амебоидными и веретеновидными фагоцитами.

Действие хитозана на лабораторную культуру Ascosphaera apis

Патогенный гриб Ascosphaera apis широко распространен во всем мире и нередко приносит существенный ущерб пчеловодческим хозяйствам. Вызываемое данным грибом заболевание аскосфероз сопровождается поражением расплода пчелиной семьи. Хитин и хитозан является важной составляющей тканей и продуктом метаболизма как насекомых, так и грибов, а значит хитозан в той или иной мере может влиять на метаболические процессы грибов и насекомых (Zhang et al, 2002). Известно фунгистатичное действие хитозана в отношении дрожжей, показано, что противогрибковое действие хитозана зависит от степени деацетилирования и полимеризации (Zakrewska et al., 2005). Для определения противогрибковой активности были отобраны высокомолекулярные хитозаны, показавшие наибольшую активность в отношении медоносной пчелы. Показано, что при непосредственном внесении в питательную среду хитозана 200 кДа происходит значительное угнетение роста гриба, в то время как сукциноил хитозана практически не повлиял на рост культуры Ascosphaera apis. При микроскопировании было выявлено, что хитозан 200 кДа нарушал формирование плодовых тел, они имели неправильную форму и мелкие размеры по сравнению с контролем (рис. 6).

Рисунок 6. Состояние культуры Ascosphaera apis после применения хитозана 200

хДа (1,2).

Отмечено отсутствие споровых шаров со спорами, искривление и утолщения оболочек мицелия. Таким образом, при действии хитозана происходит не только нарушение роста гифов, но и значительно снижается возможность спорового размножения.

Применение хитозана способствует активации естественных защитных механизмов клетки. Кроме того, хитозан 200 кДа обладает собственной фунгистатической активностью, что позволяет непосредственно угнетать развитие патогена, не оказывая негативного воздействия на организм медоносной пчелы.

Влияние хитозана на защитные ферментативные системы и жизнеспособность А. mellifera L. в условиях пасеки

Отрасль пчеловодства долгое время обходилось без применения всевозможных лекарственных препаратов и есть все основания считать, что в сопротивлении против патогенов важнейшую роль играет сила пчелиной семьи и здоровье отдельных особей (Сенюта, 2006; Гончаренко, 2007).

Хитиновые производные имеют большой потенциал для использования в составе стимулирующих подкормок, в том числе и при вынужденном применении лекарственных препаратов против паразитов и наличии слабых семей на пасеке. Для экспериментов в условиях пасеки был выбран хитозан 200 кДа в связи с тем, что среди хитозанов он обладал как фунгистатической активностью в отношении Ascosphaera apis, так и иммуномодулирующей способностью.

Одним из наиболее оптимальных путей улучшения слабых семей является повышение продуктивности пчелиной матки (рис. 7).

8/05/2010 ' 20/05/2010 ' 1/06/2010 ' 13/06/2010

Рисунок 7. Уровень репродуктивного потенциала маток медоносной пчелы слабых семей Бирской пасеки. По оси абсцисс - даты подсчета.

Для оценки плодовитости пчелиных маток нами была подсчитана их среднесуточная репродуктивная способность. Количество печатного расплода пчелиных семей учитывали через каждые 12 дней.

Подкормка хитозаном 200 кДа (0,01%) была произведена осенью 2009 года на трех удаленных друг от друга пасеках. В эксперименте было задействовано 10 контрольных и 10 опытных ульев. На следующий год производился учет плодовитости маток, в ходе которого было выявлено повышение репродуктивного потенциала у маток из семей получавших хитозан.

Применение хитозана обеспечивало повышение плодовитости пчелиных маток в основном у слабых семей до уровня сильных семей в весенне-летний период на Булгарской пасеке. У сильных семей не отметили достоверных изменений плодовитости маток. Данное явление, наблюдаемое в противоположность результатам, полученным у пчелосемей с Бирской пасеки (здесь и у сильных семей повышалась плодовитость), вероятно, обусловлено более узкой нормой реакции в сравнении с пчелосемьями Булгарской пасеки.

Летом 2010 года после весенней подкормки хитозаном была измерена активность ферментов антиоксидантной системы и дифенолоксидазы в заднем отделе кишечника у пчёл из трех пасек. Представляет интерес реакции защитных ферментов пчёл из семей разной силы. В результате проведенных экспериментов на пасеке было отмечено повышение активности антиоксидантных ферментов и дифенолоксидазы преимущественно у пчёл из слабых семей (табл. 3). В тоже время выявили снижение активности каталазы в сильных семьях Бирской пасеки и дифенолоксидазы в сильных семьях Баширской пасеки. Как известно, повышенная активность защитных

ферментов предполагает большую готовность организма к защите от патогенных организмов.

Таблица 3

Активность защитных ферментов летом 2010 г после весенней обработки __хитозаном. Нормировано по контролю._

Пасеки Сила семей Активность пероксидазы, ед. акт/мин/мг белка Активность катал азы, нМ/мин/мг белка Активность дифенолоксидазы, ед акт/мин/мг белка

Булгарская Сильная 5,07±2,89 2,01±1,23 3,89±1,11

Слабая 19,88±3,67 4,00±1,53 8,90±1,12

Бирская Сильная 3,06±0,79 0,67±1,35 4,90±1,31

Слабая 3,99±0,56 2,02±1,39 3,10±1,20

В связи с этим, применение хитозана может быть оправдано в условиях повышенной вероятности инфицирования ослабленных семей. Сильные пчелиные семьи в период медосбора более активно собирают нектар и пыльцу и, в конечном счете, накапливают большие объемы меда, что сказывается на качестве зимовки и экономической рентабельности пасеки (рис. 8).

В 2011 году нами отмечена средняя медовая продуктивность сильных семей из Бирской пасеки на уровне 48±2Д кг, а у пчёл из Булгарской пасеки данный показатель составил 40±1,92 кг. Подкормка хитозаном способствует повышению медовой продуктивности у сильных семей Бирской пасеки до 52±1,2 кг, у слабых также происходит значительное увеличение количества заготовленного меда с 37±1,08 кг до 50±1,35 кг.

Е0 -

50--.,. - 1 - X -

40-- - - - -

£ 30----- - - -

20-- - - - -

10-- - - - -

0 ---,---,---,---,

_1_2_3_4_

Рисунок 8. Медовая продуктивность семей из Бирской пасеки:

1- контрольная группа сильная семья; 2- опытная группа сильная семья;

3- контрольная группа слабая семья; 4-опытная группа слабая семья.

Повышение силы слабых семей актуально в связи с тем, что сильные семьи оптимально используют кормовые резервы, чем слабые, что выражается в более низком потреблении меда. Пчелосемьи с Бирской пасеки, получавшие подкормку хитозаном, имели сниженное потребление корма, в то время как пчёлы из Булгарской пасеки на подкормку хитозаном практически не отреагировали (рис. 9). Для изучения активности ферментов антиоксидантной системы и дифенолоксидазы и успешности зимовки пчёлы осенью 2010 года получили подкормку с хитозаном.

Рисунок 9. Расход меда в результате зимовки: 1-контрольный вариант, Бирская пасека; 2- опытный вариант, Бирская пасека; 3- контрольный вариант, Булгарская пасека; 4-опытный вариант, Булгарская пасека.

После измерений было выявлено, что активность защитных ферментных систем в весенний период по окончании зимовки также высокая и сохраняется тенденция активации ферментов преимущественно у слабых семей (табл. 3). Характерно то, что наибольшее различие между контролем и опытными вариантами отмечается у пчёл Булгарской пасеки, у которых изначальная выживаемость после зимовки существенно ниже.

Таблица 3

Активность защитных ферментов весной 2011 г после осенней обработки хитозаном.

Пасеки Сила семей Активность пероксидазы, ед. акт/мин/мг белка Активность катал азы, нМ/мин/мг белка Активность дифенолоксидазы, ед акт/мин/мг белка

Булгарская Сильная 3,89±1,16 5,01±1,98 2,11±1,21

Слабая 3,97±1,13 7,92±2,32 2,50±1,12

Бирская Сильная 2,12±1,12 1,10±1,34 7,11±3,98

Слабая 3,13±1,69 1,20±1,46 4,06±2,21

Использование хитозана позволило существенно сократить уровень подмора, как у пчёл Бирской пасеки, так и Булгарской, причем, как и в случае числа занятых

улочек, величина подмора сильно снижалась в ульях с Булгарской пасеки, снизившись до значения подмора в ульях Бирской пасеки. Показано снижение опоношенности ульев как у пчёл Бирской и Булгарской пасеки.

Таким образом, применение хитозана в условиях пасеки в качестве стимулирующей подкормки позволяет повысить эффективность зимовки, продуктивность медосбора и репродуктивный потенциал маток. Особенно оптимально использование подкормки хитозаном для слабых семей.

Заключение

Повышение устойчивости медоносной пчелы к патогенам в условиях техногенного загрязнения окружающей среды является одной из главных проблем в современном пчеловодстве. Для этого требуется решение целого ряда задач в области фундаментальных и прикладных исследований. Поиск новых адаптогенов и иммуномодуляторов, основанный на изучении механизмов их действия на насекомых, а также основанный на этих принципах регламент их применения приобретает большое значение.

В ходе лабораторных экспериментов с применением хитозанов в качестве предполагаемых адаптогенов для медоносной пчелы было установлено, что наблюдаемые эффекты зависят от молекулярной массы применяемых соединений. Хитиновые производные изменяют как общеорганизменные параметры, так и биохимические и клеточные защитные процессы. Показано, что предварительное применение хитозанов повышает выживаемость пчёл при инфекционном стрессе и в основном повышает активность антиоксидантной системы и дифенолоксидазы в вариантах с использованием высокомолекулярных хитозанов. Полученные результаты позволяют предположить элиситорное действие хитиновых производных, то есть наличие эффекта стимуляции иммунной системы при отсутствии патогена, что повышает устойчивость при последующем заражении. Отмечена фунгистатическая активность хитозана 200 кДа в отношении патогена медоносной пчелы Ascosphaera apis. Применение данного хитозана в условиях пасеки в качестве стимулирующей подкормки повышает эффективность зимовки, продуктивность медосбора и репродуктивный потенциал маток.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего поиска эффективных хитозанов для медоносной пчелы с выявлением их функциональности и разработкой регламента применения на пасеках для дальнейшего внедрения в практику пчеловодства.

Выводы

1. При инфекционном стрессе на фоне применения высокомолекулярных хитозанов происходит возрастание активности дифенолоксидазы и антиоксидантных ферментов медоносной пчелы в течение суток, которая коррелирует с выживаемостью, подтверждая взаимообусловленность этих показателей.

2. Сукциноил хитозана вызывает восьмикратное увеличение агглютинирующей активности гемолимфы Apis mellifera L., как при действии бактериального препарата Последовательное применение высокомолекулярных хитозанов и битоксибациллина вызывает стабилизацию титров гемагглютинации пчелы на уровне контроля.

3. Все хитиновые производные повышают долю прогемоцитов и фагоцитирующих гемоцитов в гемолимфе Apis mellifera L. Это в высокой степени коррелирует с активностью антиоксидантных ферментов и выживаемостью при последующем действии БТБ, подтверждая взаимосвязь данных параметров.

4. Хитозан 200 кДа обладает фунгистатическим действием в отношении лабораторной культуры Ascosphaera apis патогенного для расплода медоносной пчелы, которое выражается в нарушении формирования споровых шаров, искривлении и утолщении стенок мицелия патогена

5. Хитозан 200 кДа повышает активность антиоксидантных ферментов и дифенолоксидазы у слабых семей в условиях пасеки, что ведет к улучшению качества зимовки, увеличению продуктивности медосбора и репродуктивного потенциала маток.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Хамадиева А.Р. Хитозаны — перспективные адаптогены для медоносной пчелы Apis mellifera / Хамадиева А.Р., Кутлин Н.Г., Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г. // Вестник Оренбургского университета. - 2011. - №12. - С. 445446.

2. Хамадиева А.Р. Влияние препарата на основе хитозана на пораженность пчелиных семей варроатозом / Хамадиева А.Р., Кутлин Н.Г., Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2011. - Т.209. - С. 325-330.

3. Хамадиева А.Р. Влияние препарата на основе хитозана на зимовку пчелиных семей / Хамадиева А.Р., Кутлин Н.Г., Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2011. - Т.209. - С. 320-325.

4. Хамадиева А. Р. Влияние препарата на основе хитозана на зимостойкость пчёл / Хамадиева А.Р., Кутлин Н.Г., Шареева З.В., Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Пчеловодство. - 2012. - №3. - С. 18-19.

5. Назмиев Б.К. Производные хитозана как адаптогены в пчеловодстве / Назмиев Б.К., СалтыковаЕ.С., Николенко А.Г. //Пчеловодство. - 2013. - №1. - С. 34-35.

Публикации в сборниках и материалах конференций

6. Назмиев Б.К. Препараты хитозана — перспективные адаптогены для пчелы медоносной (Apis mellifera) / Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. - 2010. - Вып. 6. -С. 82-84.

7. Назмиев Б.К. Препараты на основе хитозана - перспективные адаптогены для Apis mellifera / Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Материалы международной научно-практической конференции «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии». Ярославль. - 2010. - С.126-128.

8. Назмиев Б.К. Хитозан как экологически безопасный адаптоген в пчеловодстве / Назмиев Б.К., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Материалы международной научной конференции «Современное проблемы биологии и экологии». Махачкала. - 2011. -С.376-378.

9. Назмиев Б.К. Индукция хитозаном и его производными неспецифического иммунитета насекомых / Назмиев Б.К., Салтыкова Е. С., Николенко А.Г. // Материалы международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». Санкт-Петербург. - 2011. - С. 112-113.

10. Назмиев Б.К. Хитозан как адаптоген в пчеловодстве / Назмиев Б.К., Салтыкова Е. С., Николенко А.Г. // Материалы И Всероссийской конференции «Биомика - наука 21 века». Уфа. - 2011. - С.92-93.

11. Назмиев Б.К. Модуляция хитозаном экспрессии гена дефензина у медоносной пчелы / Назмиев Б.К., Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г. // Материалы VI российского симпозиума «Белки и пептиды». Уфа. - 2013. -С. 156.

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 20. Подписано в печать 20.11.2013 г. Формат 60x84, 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 00,95 Уч.-изд. л. 01,44 Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Назмиев, Булат Кависович, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

04201454746

на правах рукописи

Назмиев Булат Кависович

АДАПТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ХИТОЗАНОВ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ЗАЩИТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

APIS MELLIFERA L.

03.01.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Е.С. Салтыкова

УФА-2013

Оглавление

Введение 5

Глава 1. Биохимические и клеточные системы устойчивости 10 медоносной пчелы

1.1. Иммунитет насекомых: соотношение неспецифических и 12 специфических механизмов защиты

1.2. Особенности иммунитета медоносной пчелы, как эусоциального 17 насекомого

1.3. Индивидуальный и системный иммунный ответ у медоносной 19 пчелы

1.4. Ферментные защитные системы насекомых 23

1.4.1. Антиоксидантная ферментная система 23

1.4.2. Фенолоксидазная ферментная система 27

1.5. Паттернраспознающие молекулы в иммунной системе насекомых 32

1.5.1. Гемагглютинины гемолимфы 32

1.5.2. Антимикробные пептиды 34

1.6. Клеточные иммунные реакции 37

1.7. Влияние хитозана на иммунную систему и общеорганизменные 42 реакции насекомых

1.7.1. Зависимость эффекта действия от физико - химических 43 свойств хитозана

1.7.2. Иммуностимулирующее и антимикробное действие 48 производных хитина

Глава 2. Объект исследования и методы 54

2.1. Объект исследования - медоносная пчела {Apis mellifera L.) 54

2.2. Методы проведения лабораторных экспериментов 55 2.2.1. Методика изучения действия хитиновых производных и 55 битоксибациллина

2.2.2. Методика гематологического анализа гемолимфы 57

2.2.3. Методика измерения активности пероксидазы (ЕС 1.11.1.7) 57

2.2.4. Методика измерения активности каталазы (ЕС 1.11.1.6) 58

2.2.5. Методика измерения дифенолоксидазной активности (ЕС 58 1.10.3.1)

2.2.6. Методика измерения активности гемагглютининов 59 гемолимфы

2.2.7. Методика работы с лабораторной культурой Ascospaera apis 60 2.3. Статистическая обработка результатов 60 Глава 3. Результаты исследований и обсуждения 62

3.1. Влияние хитозанов на выживаемость пчел 62

3.2. Влияние хитозанов на защитные ферментативные системы 64 медоносной пчелы

3.2.1. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы и 65 дифенолоксидазы при воздействии хитозаном 200 кДа

3.2.2. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы и 70 дифенолоксидазы при воздействии сукциноилом хитозана 330 кДа

3.2.3. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы и 72 дифенолоксидазы при применении низкомолекулярных хитиновых производных: хитозанов 20 кДа и 7 кДа

3.3. Влияние хитозанов на клеточную и гемагглютининовую системы 76 гемолимфы медоносной пчелы

3.3.1. Действие хитозана 200 кДа на цитологические параметры и 80 агглютинирующую активность гемолимфы Apis mellifera L.

3.3.2. Действие сукциноила хитозана 330 кДа на цитологические 83 параметры и агглютинирующую активность гемолимфы Apis mellifera

L.

3.3.3. Действие низкомолекулярных хитозанов 20 кДа и 7 кДа на 85 цитологические параметры и агглютинирующую активность

гемолимфы Apis mellifera L.

3.4. Действие хитозана на лабораторную культуру Ascosphaera apis 90

3.5. Влияние хитозана на защитные ферментативные системы и 95 жизнеспособность A. mellifera L. в условиях пасеки

Заключение 111

Выводы 113

Список литературы 114

Введение

Дикая медоносная пчела {Apis Mellifera L.) с давних пор одомашнена и расселена человеком практически по всей земле. Пчелиная колония представляет единый биологический организм, все члены которого не могут существовать отдельно друг от друга. В последнее время в силу различных причин происходит массовая гибель пчел, которая в отдельных странах приобретает катастрофические масштабы, имея достаточно серьезные последствия не только для экосистемы планеты, но для продовольственной и экономической безопасности стран. Синдром распада колоний (Colony Collapse Disorder - CCD), потери особей во время зимовки и ослабление пчелиных семей наблюдаются на многих пасеках, что привело к серьезной ситуации в пчеловодстве в целом (Беляева и др., 2009; Reed et al., 2009). Наиболее распространенная на сегодня гипотеза массовой гибели пчелиных семей - концепция иммунодефицита пчелы. Эта тема стала одной из активно обсуждаемых в рамках работы 43-го Международного Конгресса Апимондия в сентябре 2013 года. При действии неблагоприятных экологических факторов пчелы становятся более восприимчивыми, в частности, к инфекциям (Салтыкова, 2011).

Становится очевидным, что иммунная система пчёл в настоящее время стала чрезвычайно уязвимой, в связи с этим поиск механизмов активации защитных систем медоносной пчелы является весьма актуальным. Защитные реакции медоносной пчелы включают как клеточные, так и гуморальные реакции, объединяющие множество взаимосвязанных систем, в том числе антибактериальные пептиды, гемагглютинины, фенолоксидазную и антиоксидантную системы (Zanetti, 2000; Yang et al., 2004; Kucharski, 2005).

Проблемы наращивания темпов развития пчелиных семей, способных эффективно использовать период основного медосбора и опылять

энтомофильные сельскохозяйственные культуры, быстрого восстановления семей после медосбора и успешного проведения зимовки являются весьма актуальными. Широко используемые в современном пчеловодстве для подкормки пчёл минерально-витаминные добавки не всегда эффективны, а средства борьбы с заболеваниями и паразитами зачастую токсичны для самих пчёл (Чепурной, 2000; Лонин, 2005). Одной из важнейших задач пчеловодства во всем мире является повышение адаптивности и продуктивности медоносной пчелы с помощью биостимуляторов. Такие препараты должны быть высокоэффективными и удобными в применении, способными повышать устойчивость пчёл к неблагоприятным факторам среды, улучшать качество зимовки, быть экологичными и экономически выгодными, однако не все стимуляторы соответствуют данным требованиям.

Решить часть поставленных задач можно разработкой и рациональным применением новых современных средств, например, препаратами на основе хитозанов, которые обладают многими вышеперечисленными свойствами, но не использовались до настоящего времени в практике пчеловодства. Хитозаны - одни из самых распространенных в природе полисахаридов - обладают, как способностью связывать ионы водорода, металлов и различные токсины, так и многими видами биологической активности, которые зависят от их молекулярной массы и степени деацетилирования (Негпапёег-Ьаигагёо е1 а1., 2008; Куликов и др., 2010). Для выявления адаптивных свойств хитозана в модельных лабораторных экспериментах в качестве стресс-фактора использовали битоксибациллин - препарат, предназначенный для защиты сельскохозяйственных, лекарственных, лесных и цветочных культур от насекомых вредителей. Данный препарат разрешен для употребления в сельском и приусадебном хозяйстве, а наличие в препарате кристаллического белка обеспечивает кишечный характер его действия.

Целыо работы являлось изучение влияния хитозанов на активность биохимических и клеточных механизмов, определяющих системную устойчивость медоносной пчелы. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить реакцию антиоксидантной и фенолоксидазной систем Apis mellifera L. на битоксибациллин на фоне действия хитозанов.

2. Изучить агглютинирующую активность гемолимфы A. mellifera L. при действии битоксибациллина и хитозанов.

3. Изучить клеточную реакцию гемолимфы A. mellifera L. на битоксибациллин на фоне действия хитозанов.

4. Изучить действие высокомолекулярных хитозанов на развитие пчелиного патогена Ascosphaera apis в лабораторных условиях.

5. Оценить действие хитозана на защитные ферментативные системы и жизнеспособность A. mellifera L. в условиях пасеки в зависимости от силы семей.

Научная новизна. Выявлена зависимость степени проявления биологической активности хитозанов от их молекулярной массы для медоносной пчелы. Показано, что наиболее выраженной активностью обладают хитозан 200 кДа и сукциноил хитозана 330 кДа. Выявлена способность хитозанов индуцировать защитные биохимические и клеточные реакции насекомых. Впервые показано, что хитозаны повышают титр агглютининов у медоносной пчелы и процент фагоцитирующих клеток гемолимфы, увеличивая тем самым ее защитные свойства. Впервые отмечена фунгистатическая активность высокомолекулярного хитозана 200 кДа по отношению к грибному патогену медоносной пчелы Ascosphaera apis. Впервые показана эффективность использования хитозанов на пасеках для ослабленных семей.

Научно-практическая значимость работы. Результаты, полученные в ходе исследований, расширяют научные знания, касающиеся представлений о механизмах действия биостимуляторов на насекомых. Тем

самым меняют методологические подходы в системе использования биологически активных веществ в практике пчеловодства. Показано, что выраженным иммуностимулирующим действием обладают

высокомолекулярные хитозаны. Для применения в условиях пасеки наиболее оптимально использование хитозана 200 кДа, обладающего как иммуностимулирующей активностью, так и фунгистатической способностью в отношении Ascosphaera apis.

Показано, что хитозан повышает активность защитных ферментов в большей степени у слабых семей, а также повышает эффективность зимовки, продуктивность медосбора и репродуктивный потенциал маток. Обоснована целесообразность применения хитозанов для улучшения продуктивности пасек. Полученные результаты могут быть использованы для создания препаратов на основе хитозанов нового типа действия, основанного на регуляции защитных реакций у насекомых, с последующей разработкой регламента их применения на пасеке.

Положения выносимые на защиту:

1. Высокомолекулярные хитозаны повышают жизнеспособность Apis mellifera L. при инфекционном стрессе, увеличивая активность защитных ферментов, количество защитных клеток и агглютинирующей активности гемолимфы.

2. Высокомолекулярный хитозан 200 кДа обладает фунгистатическим действием в отношении лабораторной культуры Ascosphaera apis - патогена медоносной пчелы.

3. Высокомолекулярный хитозан 200 кДа повышает активность защитных ферментов у слабых семей, улучшает качество зимовки, увеличивает продуктивность пчелосемей.

Апробация работы. Основные результаты исследований отражены в 11 научных публикациях, в том числе 5 статьей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов кандидатских диссертаций. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции

«Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-

Петербург, 2011); на Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии и экологии животных» (Махачкала, 2011); II Всероссийской конференции молодых ученых «Биомика наука 21 века» (Уфа, 2011); на VI Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Благодарности. Выражаем большую признательность сотрудникам лаборатории инженерии ферментов под руководством проф. В.П. Варламова Центра «Биоинженерия» РАН и директору объединения ЗАО «Биопрогресс» проф. акад. РАЕН А.И. Албулову за предоставленные для работы хитозаны, а также пчеловодам пасек за предоставленную возможность проведения испытаний.

Выражаю признательность всем сотрудникам лаборатории биохимии адаптивности насекомых Института биохимии и генетики УНЦ РАН и лично д.б.н. Е.С. Салтыковой, к.б.н. JI.P. Гайфуллиной и проф. А.Г. Николенко за помощь в проведении экспериментов и обсуждении работы.

Глава 1

Биохимические и клеточные системы устойчивости медоносной пчелы

Необычайное разнообразие и экологический успех социальных насекомых обусловлены, помимо прочего, способностью справляться с разнообразными, в том числе, инфекционными микроорганизмами, населяющими их гнезда и распространяющимися при выкармливании потомства.

В распространении инфекционных агентов определенное значение имеет также характер жизнедеятельности и экологической стратегии. Так, специфика распределения отдельных индивидуумов насекомых в пространстве накладывает соответствующие закономерности распространения инфекции. В этой связи особенно выделяются общественные насекомые, такие как медоносные пчёлы.

Семья пчёл состоит из 15-80 тыс. рабочих особей, нескольких сотен трутней и одной матки. В семье медоносной пчелы существуют как внутриколониальные (горизонтальные взаимодействия), так и межколониальные пути (вертикальные взаимодействия) переноса инфекции. Горизонтальные взаимодействия осуществляются путем общения между членами семьи, а вертикальные главным образом через роение. Вертикальные отношения представляют главное значение в переносе инфекции между колониями (Ingemar, Scott, 2001). Однако характер размножения пчелиных семей через роение с оплодотворением маток путем полиандрии способствует повышению внутриколониального генетического разнообразия, что имеет приспособительное значение для повышения устойчивости к патогенам (Kellie et al., 2003).

Высокая плотность населения особей в гнездах социальных насекомых на первый взгляд способствует более успешному распространению инфекционных агентов различной природы. Однако у общественных насекомых, наряду с базовыми иммунными реакциями, которые сформировались в процессе эволюции, имеются специальные защитные реакции, отсутствующие у одиночных насекомых. Это разнообразные коллективные защитные реакции, имеющие как поведенческий характер, так и основанные на физиологических реакциях (Cremer et al, 2007; Gregoide et al, 2008).

Можно выделить следующие основные защитные механизмы в пчелиной семье, способствующие снижению распространения патогенов:

1. Использование антибактериальных веществ, таких как прополис;

2. Антибиотические свойства пыльцы и меда;

3. Гигиеническое поведение пчёл;

4. Избавление от погибших и больных особей;

5. Физиологические защитные механизмы (Ingemar, Scott, 2001).

Механизмы борьбы с болезнетворными микроорганизмами,

используемые социальными видами насекомых, включают антибиотики, секретируемые железами, взаимный уход и чистку гнезд, удаление зараженных и погибших особей из гнезда, а также врожденный и адаптивный иммунный ответ членов колонии.

Так называемая «социальная передача» сопротивления инфекции, которая ранее не признавалась механизмом борьбы с болезнями у социальных насекомых, может объяснить то, как возможно улучшение выживаемости членов колонии, несмотря на повышенный риск передачи патогенов, которые могут сопровождать социальный образ жизни (Traniello et al, 2002; Konrad et al, 2012).

1.1. Иммунитет насекомых: соотношение нсспецифических и специфических механизмов защиты

Взаимодействие организма хозяина и патогена, как правило, имеет долгую эволюционную историю и носит характер коадаптации, в результате которой формируется комплекс защитных механизмов и, в тоже время, соответствующие реакции патогена, направленных на обход этих защитных процессов (Eamonn et al, 2003). Конечный исход таких взаимодействий зависит от множества факторов, но главным является состояние организма хозяина, способность его защитных сил дать отпор инфекционной атаке.

Насекомые характеризуются тремя уровнями защиты от инфекционных агентов: физическая защита (кутикулярный покров, перитрофическая мембрана); гуморальные реакции (синтез антибактериальных пептидов, лизоцима и активация профенолоксидазной системы и т.д.); клеточные реакции (фагоцитоз, нодуляция, инкапсуляция (David et al., 2009)).

У всех насекомых хитиновый покров представляет собой первый уровень защиты от внешних негативных воздействий, в том числе и от патогенов. Однако инфекционные агенты нередко обходят этот барьер и попадают в организм. Одним из наиболее распространенных способов проникновения инфекции является вторжение через пищеварительный тракт. В целом кишечник чаще других органов подвергается действию различных микроорганизмов (Xu et al, 2003; Reed et al, 2009; Garcia et al, 2010). Патогены, проникшие в пищеварительный тракт, впоследствии могут попасть в гемолимфу, активируя общеорганизменные защитные системы организма хозяина.

Иммунитет насекомых, в целом, характеризуется как врожденный, поскольку не обнаруживает клональной селекции клеток, секретирующих высокоспецифичные антитела, как это происходит у млекопитающих (Vilmos & Kurucz, 1998; Edwin et al, 2002; Гайфуллина, 2006). Насекомые, как и все беспозвоночные, также лишены Т-рецепторных клеток и молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые опосредуют адаптивные реакции позвоночных (Little et al, 2003).

Индуцибельные механизмы во врожденном иммунитете отличаются от механизмов приобретенного иммунитета. Они носят скорее неспецифический характер и используют консервативные молекулярные паттерны, как, например, бактериальные липополисахариды и

У

липотейхоевые кислоты (Hancock et al., 2000).

Большое значение в неспецифических реакциях имеют ферменты антиоксидантной (Gary et al., 1995; James et al., 2002; Гайфуллина и др., 2006) и фенолоксидаз�