Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния повышенной температуры на морфогенетические и некоторые адаптивные процессы в культуре клеток пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния повышенной температуры на морфогенетические и некоторые адаптивные процессы в культуре клеток пшеницы"

Р Г Б ОД

\ о ИЮ11 133£1

ЛКЛДЕЛШЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОГО РЕСПУБЛИКИ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

На правах рукописи УДК 581.143 6.

ЛУКАНИНА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ЛЮРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕКОТОРЫЕ АДАПТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ

03.00.12—физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

БАКУ — 1904

Работа выполнена в Институте ботаники АН Азербайджанской Республики.

Научный руководитель:

— доктор биологических наук, академик Дж. А. Алиев

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук Курбанова И- М.

— кандидат сельскохозяйственных наук Леонть,ев-Орлов О. А.

Ведущее учреждение: Институт Земледелия Министерства сельского хозяйства Азербайджанской Республики.

Защита состоится «---»------1994 г. в «---»

часов на заседании Специализированного совета Д.004.12.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности «Физиология растений» при Институте ботаники Академии Наук Азербайджанской Республики (370073, г. Баку, Пагамдарское шоссе, 40).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ботаники АН Азербайджанской Республики-

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

ДЖАВАДОВА Р. К.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Aiityaflbijcahjipafj.iiiibu D рдцу наиболее важных проблем физиологии И биохимии растений проблема устойчивости К неблагоприятным факторам, и, в частости к температур-;, занимает одно из основных мест. Изучение процессов, лежащих л оспог-з свойства устойчивости, фнзнолого-бпо-химичесхнх механизме» гормональной регуляции я процессе стрессовых воздействий является пахенмм и перспективным в аспекте фундаментальных исследований (Александрой, 1975; Nover st я1., 1984). Культура клеток растении находит все более широкое применение для исследования некоторых механизмов устойчивости пне коррелятивных спязей целого организма, так как наиболее близко соответсвует модели для тучепил адаптивных реакции на клеточном уровне. Несмотря на определенный прогресс, достигнутый в этой области, механизмы, определяющие тот или иной уровень адаптшшых способностей до сих пор не ясны. Культура клеток может быть успешно использонана в разработке подходов к создан/но аовь:у технолог! i улучшения растений (Бутенко, 1991). Разработка таких подходов предполагает создание надежной системы-реципиента, обладающей воспроизводимой регеиерацион-нон способное»ыо (Vasil,l987). Использование стрессовых условий при культивировании in vitro может способствовать лыявленню и отбору штаммов с повышенной устойчивостью из широкого разнообразия клеточных популяций. Важное значение при этом приобретает изучение закономерностей реакций клеток на влияние прессовых факторов а также на селективное воздействие отбора в культуре клеток. Другим немаловажным вопросом явяляетсн выяснение адекватности ответа 1ш стрессовое воздействие на уровне культуры клеток а также сохранение присущей генотипам степени устойчивости при переходе от' уровня целого растения к дедиффе-ренцировшшой системе каллусной культуры.

Цель .и зашт. иссаещ лит. Цель настоящей работы - изучение влияния повышенной температуры на процессы морфогенеза в культуре клеток растений пшеницы и зависимость этих процессов от уровня устойчивости исходных генотипов, а также на выделение этилена, которое является адаптивной реакцией растительного организма. В соответспии с этим были поставлены следующие задачи;

1. Получение пассируемой культуры клеток ..шеницы генопшез, различающихся ио уровню исходной устойчивости.

2. Изучение морфогенного потенциала И ре генерационной способности и сохранения этих показателей при дшггёлыгом культивировании, а также

зависимости этих процессов от уровней устойчивости исходных генотипов.

3. Изучение шикни" повышенной температуры fía процессы каллусоге-кеза, пролиферации кадлусных клеток а пи процессы морфогенеза л регенерации в культуре •леток различные по устойчивости генотипов пшеницы.

4. Изучение возможности использования выращиганиа клеточных куль- . тур на фоне повышенной температуры для получения штаммов клеток, отличающихся повышенной устойчивость!'? к действию селективного фактора.

5. Выделение эпшена проро»гкам!г н культурой ткани генотипов пшеницы, различающихся но уровню устоичнпости и норме и при воздействия повышенной температуры, •

Iíayüua;¡.-J[0»u3ii¡i. У пяти сортов пшеницы исследована зависимость между -пособпосгыо к кадлусогепезу, морфогенным потенциалом и геноти-ппческнми особенностями изученных сортов, связанными с различиями в устойчивости. Проведенные исследования показали, что с отсугсттш стрессового фактора отмечается прямая зависимость только между уровнем устойчивости генотипов и морфогенным потенциалом каллусных культур, которая утрачивается rip t длительном пассировании. Воздействие повышенной температурой способствует реализации генетически детерминированной устойчивости в культуре клеток [пученных генотипов пшеницы. Предпринятая попытка выяснения вкл; и различных типов каллусных клеток в общую реге-нерационную способность генотипа позволила сделать вывод о том, что способность к регенерации определяется Не только наличием морфогенного каллуса^ но п соотношением различных типов ¡слеток в культуре. В предложенных меделы'мх системах, предстааляюиигх собой сегменты проростков и культуру клеток, установлен;-! особенности в генерации этилена у сортов, обладающих повышенной устойчивостью, которые характерна и для отселек-тировалных на фоне повышенных температур клеточных Штаммов.

Прам5!иесяая_зшшш!10с1ь. В результате проведенных исследовании показана возможность получения и отбора штаммов клеток, обладающих повышенной устойчивостью к температуре. Исследование процессов индукции каллуса и морфогенеза у различных 'по устойчивости сортов пшеницы а также влияние па эти процессы повышенной температуры. имеет важное практическое значение для получения устойчивых форм растений из таких стабильно резистентных штаммов. Важное практическое значение имеют также результаты исследований о возможности использования в качестве молельных систем для изучения некоторых адаптивных реакций сегментов проростков и культуры клеток пшеницы.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и представлены' в публикациях ряда научных конференций: на конференции аспирантов All Азербайджана (Баку, 1491), втором международном симн'хиумс "Культура in vitro и селекция садовых культур"( Балтимор, США.

1992), девятом международном конгрессе по фотосинтезу (Пагоня, Япония, 1992), третьем съезде ВОФР (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 ¡ц.-Зош.

Сгрухтура„л_абъем._ .диссертации, Диссертация состоит '¡п -ьведення, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов н их обсуждения, выводов п списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков н таблиц. Список использованной литературы вкчочает наименований, из них на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обгскти.. исследования. Объектами исследования служили пят:-, сортов пшеницы: Диамант - неустопчиш ш к засолению, засухе к жаре; Казахстанская 126 - средиеустойчнпый к высокой температуре; Эритроспериум 84! -устойчивый к засухе, жаре и засолению; Скала - устойчивый к вчеокоп температуре; Гаратылчик-2 - засухоустойчивый. Первые указанные четыре сорта являются паспортнзиропанними по устойчивости сортами коллекции ВНРа. Сорт Гарагылчык-2 пргдетавдяет собой новмй районированный сорт селекции АзНИИ земледелия. Исходный растительный материал поп':ми в полевых условиях.

Кулыур:1..1П_у11гаь Исходными эксплантатами длл получен, и к.ишусных культур служили зрелые и незрелые зародыши пшеницы. Зрелые зерновки дал выделения зародышей стерилизовали в 10-12'/'о Н20, в течении ¡5-20 минут, промывали одним объемом стерилыюп поди н замачивали п стерильной йоде на 48 часом для набухания. Перед вычленением зародышей набухшие зерновки последовательно стерилизовали по следующей схеме: спирт этиловый 70" -5 сек.,; трехкратная проминка стерильной полой по 15 минут; хлоргексидинглюхонат 1% - 15 минут. Незрелые зародыши вычленяли из предварительно пристернлизованных зерновок на 10-13 день после опыления. Очищенные зерновки стерн поиалн по тон же схеме, что и зрелые. Для пндукшт каллуса зрелые к незрелые зародыши помешали на агаровую среду щитком вверх. Питательные среды были составлены на основе базалыгых прописей по Мурасиге и Слугу (Murasige.Skoog.1962), Ли Скугу (1лпкта!ег,Я1;оо£, 1965), Гамборга В-5(ОатЬогц а а].,! 968), Неизменной для всех пропнеен оставалась минеральная часть основных сред, а физиологически активные вещества 11 фитогормоны добавлялись в нашей модификации. Использовались гизролизат казеина, инозит, триптофан, 2,4-Д и кинетин. Индукцию каллусогенеза просолили в темноте при температуре 2б°С. Время одного пассажа составляло 28-30 дней. Инаукиим морфогенеза проводили помещением киллусных клеток на среду, содержащую ЛУК в концентрации 0,5 мг/л в условиях освещения и 16-ти часов../о фотонгриоца.

Изунйш1алшшш^лршшс1ш£>й лсмпершуры. В случае экспериментов с длительной экспозицией на высокотемпературном фоне клеточные культуры выращивались d воздушном термостате ТЛ-i. Б экспериментах с кратковременной экспозицией на фоне повышенной температуры клеточные культуры с культуральных сосудах помещались в водяной термостат UT. Адаптивную пособиость генотипов оценивали по приросту сырой биомассы каллуса. Оценку прироста биомассы производили путем взвешивания материала, взятого из 10 пробирок для ка;хдого варианта.

Определение, ^ллтлшл^жшена. Ддл опытои использовались листовые сегменты размером I см, вычленясмыг из средней Части проростков а также клеточк:.:е штаммы, полученнме из незрелых зародышей пшениц:.!. Листовые сегменты помещали D инкубационную среду, содержащую 1/Î5 M фосфатный Оуф-р с рИ 6,0 и 0,4 M сахарозой. В случае экспериментов с культурой ткани в качестве инкубационного раствора использовал!! минеральную часть питательно!! среды Мурасигс и Скуга с 3% сахарозой и рН 5,8. Газовые пробы из пшеубациошых систем отбирали медицинским шприцем на 1 мл и анализировали газохроматографичгскн. с использованием

пламенно-ионизационного детектора. Расчет образовавшегося этилена выражали в нп.г.час. Опыты выполняли в двух биологических повторное ях и воспроизводили 2-3 раза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Каллусегснез с культуре различных гаютниои пшеницы Подбор оптмальных условий для "индукции каш1усоге!!еза и получение стабильно пассируемо»! культуры явился первым и важным этапом на нуги к решению поставленных нами задач.

Широкий спектр испытанных сред н их вариантов позволил не только найти оптимальные условия для успешной индукции каллусогенеза достаточно специфично для каждого сорта, но также выявил некоторые общие закономерности в требованиях к условиям инициации каллуса как в зависимости от генотипических особенностей, так и от исходного эксплантата. Это, в свою очередь, позволило, с одной стороны- несколько унифицировать методику индукции каллуса у пшеницы, а с другой в достаточной мере разграничить влияние генотипа и типа исходного эксплантата на этот процесс.

В целом же, наши исследования по индукции каллусообразоваиия из зрелых и незрелых зародышей различных генотипов пшеницы показали, что каллусообразование у зрелых зародышей происходит с меньшей частотой (табл. I), более медленно во времени. Также зрелые зародыши отличались большей требовательностью к уровню фигогормоноа п среде и содержанию физиологически активных соединений. Индукция каллусстентн у зрелых

Таблица 1 Частота каллуеообразавапия у различных генотипов

пшеницы в зависимости от эксплантата .

Сорт ' Диамант Казахстанская ■126 Эритросггармум 341 С'-гла Гарагьшчыг-2

ЗР НЗ ЗР ю ЗР 1 НЗ ЗР 1 нз ЗР ИЗ

Количество эксплантатов 48 8 б 60 96 58 78 54 86 60 100

Количество каллусов 43 84 50 35 40 65 1 41 | 51 52 99

Чаич^а. калзусообразозагыя Сг^ 25,4 97,6 33,3 93,8 65,9 83.3 75,9 54,2. 35,7 99

1. ЗР - зрелые зародыши

2. НЗ - незрелы зародыши

ее

ере« ЛС*-

П

123 незрелые зародыши [53 зрелые ззродмшн

0,1 0.4 50 100 10

{икакин) Гмщро.'пгат! Е+трклгсфэиЗ мг/л I пиита I мг/л А [ мг/л X

тнамин-0.1 н 0,4 мг/л паролизат кажши -50 и 100 иг/л зриптофан - Ю иг/л

Рис.1 Впиянне физнлошчсски активных веществ на интенсивность каллусообразованНя у зрелых и незрелых зародышей сорта Казахстанская 126

* Основная среда - Линсмайера и Скуга, с добавлением 2,4-Г, 2 мг/л для незрелых И 2,4-Д - 5 мг/л, кинетин - 0,5 мг/л для Зрелых зародышей

100

»9

_ И

Й | 10 В й

I | 8

I? и

ВиамаНГ

4Т' 'У, Ь\

аЮ!!

казахстански 126

Эрнтроспермум 8-11

Гарагылчиг-2

рис.2 Соотношение типов каллусных клеток в культуре различных генотипов пшеницы

1 □ - каллус 1-го типа (неморфогениый) 2[3 - каллус 11-го типа (морфогенный) ЛО - к;плус Ш-го типа (рптшенный)

зародышей происходит па более высоком фоне содержания в среде 2,4-Д, кннетина и физиологически активных веществ, таких как триптофан, гидролнзат казеина и тиамин (рие.1). Для дальнейшего успешного пассирования каллуса, полненного из зрелых зародышей, гребоналась оптимизация среды, что выражалось в снижении уровня фитогормонов к добавок. У незрелых зародышей наиболее эффективно индукция каллусогенеза и пассирование образовавшегося каллуса происходила на той же самой среде.

Генетические факторы оказывают значительное влияние как на каллусообразующую способность, так н на тип образующегося каллуса. У всех изученных нами генотипов обнаружены различия в способности к каллусогенезу и пролиферации. Однако не было найдено зависимости этих показателен от уровня устойчивости со[ :ов. Более всего определялся генотипом тип образующегося каллуса. Здесь можно было проследить зависимость ме;кду уровнем устойчивости сорта и типом каллусных клеток, преобладающих в культуре. Основная тендеш ¡я, которую можно отметить, это преобладание клеток неморфогенного типа каллуса з культурах неустойчивого сорта Диамант и средиеустойчивого Казахстанская 126, а также преобладание морфогенного типа каллуса в культурах устопшшых сортов Эритрослерыум 841, Скала и Гарагылчык-2. Для сортов с более высоким уровнем устойчивости также было характерно присутствие р их кул [.турах значительного количества рпзогенного типа каллуса. Схематическое соотношение каллусных клеток различных типов п культурах изученных нами генотипов пшеницы представлено на рисунке 2.

Морфогенез в культуре клеток различных генотипов пшеницы

Для получения и создания штаммов клеток с высоким- морфогенным потенциалом важны данные об активности и длительности этих процессов в каллусной культуре, а также о факторах, влияющих па эти процессы.

Сравнение использования в качестве исходных эксплантатов в наших исследованиях зрелых и незрелых зародышей показало, что наибольшая по-бегообразующая способность характерна для более незрелых эксплантатов, и в частности, дчя незрелых зародышей еоответспуюших генотипов (табл. 2). Быстрая потеря регенерационнон способности в культуре зрелых зародышей явилась еще одним фактором, учитывая который, предпочтение было отдано использованию в качестве первичных эксплантатов незрелых зародышей.

Генетический фактор оказывал значительное слияние на

потенциал полученных каллусных культур. Установлено, чго h......

этапе культивирования существует зависимость между уровнем устойчивости исходного генотипа и регенерацноннои способностью образовавшейся культуры. Исследопанные нами генотипы условно можно разделить на три группы: I. с высоким уровнем морфогенного потенциала и peic№.-paii(ir.Hnofi

Таблица 2

Зависимость морфогеиного потенциала и рггекерациоииой способности культуры клеток пшеницы от геногипических особенностей и типа эксхиаотата '

Количество каллусов Количество МК Частота образования . МК % Количество МК с РС Частота образования МК (%) с РС

Диамант НЗ 34 41 • 43,8% 12 29,2%

ЗР 41 10 24,3% -

Казахстанская 126 НЗ 95 63 66,3% 31; 49,2%

ЗР 50 . 21 42% 5 • •23,8%

Эритроскермум 841 НЗ 65 4Э 73,8% 27 56,2%

ЗР 40 16 40% 3 18,7%

Скала из 81 70 ■ 86,4% 48 68,5%

3? 41 13 43,9% 6 33,3%

Ггрггылчыг-2 НЗ . 99 58 93,9% 72 73,4%

ЗР 52 30 57,6 % 12 40,0%

МК НЗ ЗР РС

морфогснный клллус незрелые зародыши зрелые зарэдшш регснсрацношая способность

способности - сорта Скала и. Гарагылчык-2, 2. со средним уровнем морфогенного потенциала и регенерацноннои способности - сорта Эритроспермум 841 и Казахстанская 126, 3. с низким уровнем морфогенного потенциала и регенерационпой способности - сорт Диамант. Можно отметить, что высокий уровень морфогенного потенциала и регенерацноннои способности соответсвует здесь наиболее высокому уровню устойчивости генотипов, а для неустойчивого сорта Диамант характерен самый низкий из изученных нами генотипов уровень исследуемых показателей. Сорта Эритроспермум 841 и Казахстанская 126 занимают промежуточное положение по этим показателям, причем сорт Эритроспермум S41 и по уровню устойчивости и по значениям морфогенного потенциала и регенерьцисннлн способности стоит ближе к пысокоустойчивым сортам ( табл. 2).

Однако, такое соотг.етсвие наблюдав!.я лишь в течение первого пассажа. При дальнейшем культивировании происходит снижение морфогешого потенциала и регеиерациоНиой способности у всех изученных генотипов вне зависимости от исходного уровня устойчииости. Так, быстрее всех теряют регенерационную способность устойчивый сорт Скала и неустойчивый сорт Диамант. Дольше всех сохраняют регенерационную способность штаммы культуры сорта Казахстанская 126, полная потеря регенерационпой способности у этого сорта происходит лишь к 10 пассажу, однако и после года культивирования в штаммах этого сорта удавалось получить отдельные регенераты.

В этом случае проявляется зависимость между длительностью морфогенетических процессов и способностью генотипа образовывать при культивировании преимущественно каллус 1-го (неморфогенного), 2-го (морфогенного) иди 3-го {ризогенного) Tima. Так, быстрая потеря регенерационпой способности у сортов Диамант и особенно у сорта Скала по нашим наблюдешмм соответсвует способности этих сортов образовывать в культуре преимущественно каллусы 1-го и ризогенного тта сооыетсвенио. Дольше всех регенерационную способность сохраняют штаммы пультуры сорта Казахстанская 126, каллусные линии которого характеризуются или- более сбалансированным количеством клеток 1-го ' и 2-го типа, а присутствие ризогенного каллуса незначительно. Что же касается сортов Гарашлчык-2 к Эритроспермум 841, то здесь и в первом и во втором случае преобладают каллусные клетки 2-го типа, но в обоих сл«чаях в значительной мере присутствует ризогенный каллус.

Для выяснения вклада различных типов калпусных клеток в регенерационную способность того или иного генотипа, каллусные клеткг различных типов культивировали раздельно. Деление каллусов производили визуально, на основе морфологически; признаков. Помимо раздельного

культивирования каллусов 1-го, 2-го и рнзогеннсго тина нами был выделен также условно названный нами "смешанный" тип, который включал клетки каллусов 1-го и 2-го типа приблизительно в равной мер'\

Сравнение регенераннонной способности у раздельно культивируемых каллусов 2--о и смешанного типа показывает, что регенерационная способность во втором случае оказывается выше для соответсвующих генотипов. При длительном культивировании смешанный тин каллуса также дольше сохраняет регеперационную способность.

Можно предположить, что это происходит либо за счет дерепрсссип скрыты., зон морфогенеза, пргсутствующих в каллусах 1-го типа, либо за счет иного типа регуляции при образовании таких зон dc novo, и обусловленных гормональным балансом, определяемым другими тинами каллусных клеток. Более высокий уровень регеперацноипон способности смешанного типа каллуса может предположительно определяться и тем, что при перенесении на регенерацноннут ср-ду часть клеток каллуса 1-го типа может приобретать компетентно н давать начало новым зонам морфогенеза (Моисеева, 1991). Потеря регенерационнон способности культурой при длительном пассировании может являться в ра люй степени кал следствием потери способности к индуцированию компетентности клетками культуры, гак и потерей самих компетентных клеток при субкультнвироваиин.

. Необходимо также отметить, что снижение регенерационной способности культуры вплоть до полной се потери сопровождается увеличением рпзогенного потенциала каллусных культур.

Изучение влияния повышенных температур на каллусообразующую, пролнферирующую и регенеряцнонную способность культуры клеток различных генотшкш пшеницы Каллусные культуры, полученные от различных по устойчивости генотипов пшеницы могут служить удобной моделью для изучения степени сохранения и экспрессии признака устойчивости прн переходе от уровга целого организма к недифференцированной клеточной массе, а также для получения и отбора клеточных штаммов, обладающих повышенной устойчивостью к температуре по сравнению с исходными.

Для всех изученных генотипов ответной реакцией на высокотемпературное воздействие являлось снижение частоты каллусообразования а также замедление во времени скорости инициации' первичного каллуса. При этом обнаружено, что наиболее чувствительным к действию повы- шенной температуры оказался неустойчивый сорт Циамант, для которого уже длительная экспозиция при температуре 35" С снижает частоту каллусообразования до 40%. Для устойчивых сортов Ск;'ла, Гарагылчык-2 а также Эрнтроспермум 841 снижение частоты каллусообразопаиия до 40-50%

Таблица 3 Влияние повышенной температуры на частоту каллусообразовання в зависимости от генотипа

Количество эксллантов Контроль 26 С 35"С 40°С

6 ч 12 ч ' 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Диамант 50 49 98% 84% . Л 74% ~46% 9 18% 6% -

Казахстанская 126 50 100% 96,0% 96,0% З1? 70%. "44,0% 20,07с 4%.

Эритроспермум 841 50 42 42 42 39 34 48% ?

84% 84,0% 84,0% 78% 68,1% ' 16%

Скал:» 70 66 65 —65_ 92,8% 85,7% 54 41 17

94,2% 92,8% 77,1% 58,5% ■ 24,2%

Гарагылчыг-2 70 100% т _62_ 97,1% 61 • 71,4% 36 ~2Ь4%

98,5% 87,1% 51,4%

над чертой - количество каллусов

под чертой - частота каллусообразованкя (%>)

100 ■

2 90

| ВО -

I ТО-

* 60-

50 ■

1 40-

1 30-

1 20

1- ,0-

А

' ' -

«»у*»-?

'■¿л ■■;,*.>:■. *\ "• -

Л;

Днамз«г

Казазстанская Эритроспермум 126 841

Гарагыд'ШГ-2

* в ч 1 ш я я . .. .. . * ■ • Гара1и1Чыг-2

.а □ а а □ ООП а оо 3 0 0 □ Скала

4 ■ 4 Л 4 Л .1 4 4 4 4 44 4 . Л Эритроспсрмум 841

■ • ♦ » а * . .. Кашстднска* 126 ,

и . с о а о о Днамакг

40 50 60 70 80 90 100%

Б

Рис 3. Влияиие выращивания на фоне температуры 32"С в течение пассажа на прирост биома.сы (А) и распределение единичных каллусов различных генотипов по приросту биомассы (Б)

10 20 30 прирост биомассы (%)

происходит при температурном воздействии 40°С в течение более 6-тн часов (табл. 3). Что же касается замедления процессов каллус образования , то эта реакция более четко выражена для генотипов с высоким уровнем устойчивости, у которых индукция каллусогенеза задерживалась на 3-4 суток по сравнению с контролем, тогда как у сортов Диамант н Казахстанская 126 только на 1-2 дня.

В зависимости от величины температурного воздействия, интенсивность пролиферации каллусных культур подавлялась тем сильнее, чем ниже был уровень устойчивости исходного генотипа (рис. 3). По интенсивности прироста каллусной массы при воздействии повышенной температурой изученные нами сорта можно разместить в следующий ряд и направлении ослабления этой характернстикн:Скала-Гарагылчык-2-Эрптроснермум 84)-Казахстанская 126-Диамант. Уровень генетически детерминированной устойчивости также убывает в этом ряду. Такая четкая зависимость наблюдается лишь в первых пассажах после индукции первичного каллуса. С возрастом культуры различия в ответе па высокотемпературное воздействие . нивелируются с каждым последующим пассажем. Распределение отдельных каллусных линий по массам единичных "каллусов у изученных сортов после воздействия повышенной температурой дает более дифференцированную картину. Это-выражается в степени разброса по массам отделы»,« каллусов у различных по устойчивости генотипов. Наибольшим разброс характерен для неустойчивого сорта Диамант и сорта со средним уровнем устойчивости Казахстанская 126, а наименьший • для сортов с более высоким уровнем устойчивости. Разброс но массам отдельных каллусов отражает размах экс-пресспруемой вариабельности адаптивных способностей каллусных культур соответствующих генотипов. Нами также установлено, что у всех изучен- них генотипов более устойчивы к неблагоприятному воздействию тем- пературы клетки каллусов 2-го (морфогенного) типа, а рост каллуса 1-го типа подавляется тем сильнее, чем ниже уровень устойчивости исходного генотипа. Этот вопрос практически не изучен, однако предположительно меньшую устойчивость культур сортов Диамант и Казахстанская 126 можно было бы соотнести с преимущественным присутствием в штаммах этих сортов клеток каллусов 1-го типа, а более высокую устойчивость, присущую сортам Скала, Гарагылчык-2 и Эригроспермум 841 со значительным присутствием ь их культурах клеток каллусов 2-го типа.

Для получения клеточных штаммов с повышенной устойчивостью к температуре были рассмотрены 2 схемы отбора: I. Экспозиция на фоне температуры 36"С и течение 40 часов с 'последующим переносом "ч.■ е -фон повышенной ростовой температуры 32"0. 2. Культивирование на фоне температур 37-38"С в течение недели с последующим отбором выживши».

Таблица 4 Влияние повышенной теютературы на регенерационную способность рамичных типов каллусов у сортов Гарашлчыг-2 н Казахстанская 126

Схема опыта РС (в % от контроля) Тип каллуса

Гарагылчыг-2 Казахстанская 126

Г 26°С ( 36°С 1 26°С 67,3% 58,3% смешанный

Р '20час' К 48,5% . 34,3% морфогенный

г 32СС I 26 °С ' (-- ■ ■ . , )-5-, 82,3% 70,1% СМОШЗШГЫК

Р Я 63,2% 52,2% морфогенный

126°С <32°С 43% 32,0% смешанный

р а 79.8% 67,3% морфогенный

* Р -К -РС -

среда для пассирования среда для регенерации регенерационная способность

резистентных штаммов. При повторном воздействии повышенных температур с возрастающим уровнем повреждающего действия не выявляется значительных различий в степени устойчивости клеточных линии, полученных по той или иной схеме и определяемой степенью угнетения роста. Однако, размах экспрессируемон вариабельности выше по втором случае. Вероятно, в первой схеме преимущество в г.ролнферацни получают клетки с повышенно!'! адаптивной способностью, а по второй - с более высокой первичной устойчивостью к температуре.

Температура яаляется одним из важных факторов, регулирующих ход и течение морфогенных процессов. Результаты экспериментов показали, что различные типы каллусов в пределах одного генотипа неодинаково реагировали па воздействие повышенной температурой. Снижение рггенерз-циониой способности у культивируемых раздельно смешанного и морфо-генного типа каллусов происходит различно также в зависимости от гогс, на какой стадии - пассирования или шщукцни морфогенеза клеточные культуры были подвергнуты температурному воздействию. Как видно нз таблт.м 4 , если раздельно культивируемые каллусные клетки 2-го и смешанного типа подвергались температурному воздействию до перенесения на среду длл индукции морфогенеза, то ретенсрационнпя способность была выше у смешанного типа каллуса, независимо от длительности температурного воздействия. О том случае, когда температурное воздействие применялось на стати: индукции морфогенеза, ре генерационная способьость оказалась выше у клеток 2-го (морфогенпото) типа каллуса. Мо кно предположить, что здесь мы сталкиваемся с воздействием температуры на зоны морфогенеза, находящиеся на различных стадиях формирования (Sung, 1985), и вероятно »следствии этого на разных стадиях чувствительности к температуре. Морфогениый каллус более синхронизирован в отношении морфогенных процессов и, следовательно, вероятность повреждения или ингибирования развития зон, находящихся на одной стадии чувствительности к температуре, более вероятна. С другой стороны, индукция компетентных к морфогенезу клеток, которая, вероятно (Моисеева, 199!) происходит на регенерапионной среде, может блокироваться под действием повышенной температуры. Преимущество в регенерации п этом случае получают уже сформированные морфогенные зоны.

Влияние повышенных температур на пмдеясшге этилена рг.хтичньь'П

генотипами пшеницы

Для изучения вклада систем клеточного и организменного уровней в формирование признака устойчивости а также для выяснения наличия зависимости по этому признаку в культуре клеток и у проростков были проведены исследования- по изучению образования этилена в норме и при воздействии повышенных температур у различных ио устойчивости генотипов

Рис,4 Зависимость выделения ыпяена проростками пшеницы от температуры (время инкубации - I час) 1 - Диамант; 2 - Казахстанская-126; 3 - Эрнтроспермум 841; 4 - Гарагылчыг-2; 5 - Скала.

Бремя И'И-'Ы)

Рис.5 Выделение этилена проростками пшеницы при воздействии температурой 32°С (15 часов)

1 - Диамант; 2 - Казахстанская 126; 3 -Эрнтроспермум 84; 4 - Гарагылчыг-2; 5 - Скала,

о 2

А

I 3 Л 7 9 и 12 14 16 16 20 22 24 26 2? 30 Время(ЯМИ)

I С

Рис.6

25® 217!

4-- «

А I о о о О'

1 а °

5 1*4 О"

(

1 зг'с А

" 4.......«

/

/ И—в—

\

Й а

Динамика выделения этилена культурой клетох пшеницы при культнпн-вапин на фоне 1емпера-Т)'ры 32°С в течение пассажа

А - неадаптированные штаммы: ! -Диамант,

2-Казахстанская 126,

3-Эрнтроспермум 841, 4-Гарагылчыг-2, 5-Ск.ша,

Б - ¡(датированные штаммы: 1-Скала,

2-Дпамаит,

3-Казахстанская 126..

| * ч 1г 12 г г п :: .ч

Ир*'МИ I !Ш11 - - , •

О

пшеницы. В качестве модельных систем использовались сегменты проростков и культуры клеток, полученные из незрелых зародышей пшеницы. Не установлено генотипическнх различий, обусловленных степенью устойчивости, в уровне и характере синтеза этилеиа в условиях нормальных температур как у сегмснтов проростков, так и в штаммах клеточных культур. При воздействии повышенной температурой происходит '„'(сличение интенсивности выделения этилена у всех изученных генотипов. Как это видно па рисунке 4 , у сегментов проростков пои кратковременном воздействии температурой 32°С прослеживается обратная зависимость уровня выделения этилена от степени устойчивости генотипа. В случае клеточных культур характер этой реакции в большей степени определяется интенсивностью ростовых показателей культуры, При увеличении времени температурного воздействия, основной тенденцией, отмененной для сегментов проростков и сохраняющейся на уровне клеточных культур, является появление второго пика выделения этилена, наличие которого отмечено только для устойчивых сортов Эрнтроспермум 841, Гарагылчик-2 п Скала, У неустойчивого сорта Дпамант и средне-устойчивого Казахстанская 126 такого пика не наблюдается, а происходит снижение выделения этилена (рис. 5}, В клеточных культурах, в отличие от проростков, появление 2-го пика отмечается уже после кратковременного (2 часа) температурного воздействия 32°С . Первичные адаптивные реакции малоспецифичны и у всех растений увеличение синтеза этилена вызывает кратковременную адаптацию. В зависимости от генотипа эти адаптивные реакции могут иметь продолжение пли же вследсгвии некомпетентности генотипа к первичному триггеру быть быстротечными, без продолжения, что приводит ни фоне развития повреждающего фактора к гибели организма. Выращивание клеточных штаммов на фоне повышенной температуры 32°С в течении пассажа также характеризуется появлением второго пика образования этилена у устойчивых сортов. Исследования, проведенные со штаммами клеток, адаптированными к действию повышенной температуры в результате выращивания на фоне селективного (¡¡актора, показали, что о этом случае происходит нивелирование различий в уровнях продукции этилена у различных генотипов. Кик видно из рисунка 6, наступление первого пика образования этилена не изменяется По времени, по меняется его характер. Что же касается второго пика, то его появление, характерное для устойчивых сортов, отмечается ц у адаптированных клеточных ннаммов генотипов с низким уровнем устойчивости Диамант и у среднеустойчивого copra Катахстанская 126. Приобретение адаптивности культурами кльток, происходящее при дчителыюм культивировании в pc¡y;u.iaie селекции на фоне повышенной температуры может быть связано с изменением Гормонального баланса вообще и с уровнем синтеза этилена либо еш

предшественников в частности. Изменение гормонального баланса могут также приводить к изменению в компетентности клеточных культур к действию этилена. Таким образом, Предложенные модельные системы в определенной' степени отражают при стрессовых воздействиях геиотнпические особенности изученных сортов п отношении устойчивости к Температуре. Сохранение такой реакции как синтез этилена в ответах на стрессовые воздействия, дает основание предполагать существование и сохранение других процессов, отражающих адаптивную способность Целого организма в модельных системах.

Выводы

1. Для полученных каллусных культур пяти различающихся по устойчивости генотипов пшеницы не обнаружено зависимости между уровнем детерминированной устойчивости и способность К каллусогёнезу. Установлена прямая зависимость между уровнем устойчивости и морфогенным потенциалом клеточных культур, полученных из незрелых зародышей.

2. Длительное культивирование приводит к снижению регенерациенной способности культуры независимо от уровня устойчивости исходного генотипа. Показано, Что способность к регенерации определяется не только наличием морфогенного типа каллуса, но и соотношением различных типов клеток в культуре.

3. Повышение температуры приводит к снижению частоты каллусо-генеза. интенсивности пролиферации, частоты регенерации в клеточных культурах всех изученных генотипов. Степень подавления этих процессов тем сильнее, чем ниже уровень устойчивости исходного генотипа.

4. Показана возможность получения и отбора штаммов клеток, обла-. дающих повышенной устойчивостью к температуре.

5. В предложенных модельных системах, представляющих собой сегменты проростков и культуру клеток пшеницы при нормальных температурах не установлено генотнпнческих различии, обусловленных степенью устойчивости сортов, в уровне и характере синтеза этилена.

6. Повышение температуры в пределах установленных физиологических норм приводит к увеличению синтеза этилена как у проростков, так и в культуре клеток всех изученных генотипов. Характер и уровень образования этилена зависит от генотнпнческих особенностей.

7. Показано, что предложенные модельные ' системы' адекватно стабильны в сохранении такой адаптивной реакции как синтез этилена, особенности характера-и протекания которой могут свидетельствовать о детерминированной роли этилена в адаптивной способности генотипов..

Сгшссз; работ, опубликовании;; по те:«е диссертации

1. Луханнна H.H. Изменив адаптивных реакций у различных по устойчивости генотипов пшеницы в условиях iti vitro// Материалы научной конференции аспирантов АН Азербайд;кана.-Баку.-1991.-С.96.

2. Lukaniiui N.N., Karagesov T.G. Screening for thermotolerance in wheat using cell culture// Abs. 2nd International Congsess "In vitro culture and Horticultural breeding",- Daltimore, USA, - 1992. - P.384.

3. Mamedova M., Makhmudov R., Lukanina N. Evaluation of regenerates under water stress according to photosynthetic signs// Photosynthesis research. Nagoya, Japan. - 1992. - V.34, - N. 1.- P.220..

4. Луханнна H.H., Карагезов Т.Г. Изучение влияния повышенных температур. На пролиферируюшуш и морфогенную способность различных штаммов культур*г пшешщы// Тезисы докладов третьего съезда Всероссийского общества физиологов растений. - Санкт-Петербург. - 1993.- С,657

Луканина Натаяла Нгаолэлэвва -•Еугдаичн Ьучэлрэ културасчнда морфокенетго,: вэ бз"зи апаптпв' просвслэрэ луксзгс тешерчтурун тэ"спришш э;)рэш!лкгсн - .

X У Л Л С 9 '

Ьучэ^рэ селекси,]-чсш!чн нэзэри вэ практики ыэсэлэлэрглш тпа.Згс» Ьтз'.фч гпг пэгсэдичэ бугл-г Ьуче^рэлэри културасивда с-трес (Тпкторлэ--рчп, хусусглэ чо луксэк тешературун кал^сокенез, про.'шТюрчсн^ ч ъэ гздртокэпез просеслэрг'лэ тэ"сиришш елрэшимэсииэ.Ьэср влюшкщдпр.

Бунунла элггэдэр олчртг "стрэс тэраптпндэ втялеаин спитезк тает' пд1.пт'1ся,]а олуйкут рэяксцДа «сшпип бутвэ организм вэ Ьучздра $сул-туря.сч сзвкззэскодэ давиглчлчгнн кенетпк чэЬзтдзп муэ.Цэн олуннуп хусусз!^этлэрини1 с.татапма вэ експрессйла гаЗялпллэти тэдгаг олун-иуидур.Стрес фактору олмазеа, лалнчз каллусун морфопеяэтгк потенся-. • ил г.чэ кокоткплэрш давадгачлчг сэвглзэси арасчтща йирблич асчйялнг . ге,]л олупур. Еу дсчлчлпг култпваоиЗанш бирзтчл втшганда муиэЬтщэ олуиур вэ узуинуддэтли эхишэ- нвткчэстедэ ЕГИр.-Муэ^ОП £>луш-»!тасгр кг., рпког;ор!С1Г]1 гчбгшг^эт.т тэкчэ кяжяусуя корТюкен тпщшёр -алмасч пяэ лох, Ьэм дэ култур-щ-1 иухтэлк$ тип Ьуче,1рэлэрвн нисбэтй ИЛО дэ нуэллзн олунур. Теютерчтурун артмаси» Ьгчелрэ култураснпчп 6утун <?;]-рэгпягшя К8Г!0ТКаЛЭр;;!!ЦЭ КЯЛЛуСОКЭЯеМЭД Т03ЛН.1)ШЛ1Э, тролкгери;и.1?-

гт : т'тэпскр^гаго! ьа рокепорасг;}а тоялп^п'пш ячпгн дуп&лэслнэ кэ-тгрпб ччхчр';р.К9Стор;^п:пдир юг, теотэртгура;}! даваг.яч Ь.-челрэ татан-ГЛарЧЛ'-'П ЗЛНПМТСН вэ СвДКЛМЭС!. МШШ1ДУР. "УЭ^ЭЛ ОЛУ"ЦУП "ЧГЧЦОДОХН

•«.»г.. "л 'р "орч'во'зг'чтч тлгч го ^"фул чучэртплгряэ олцугу ккик

бутув кси.отг.плэрдэ Ьучелрэ култураларннда етилеппп слнте-:!Г.'П'.,'. :рТ;-.С«К.а КЭТГ.рпб ТТХСф'ф. КвСТЭрГЛМ",ЩЗ!р КГ», ТЭКЛНТ) 0ЛУ!1?.1У!Й чоцэл сгстомлэр етглешл мттази кими адаптив рёакси;)анын сахлапнл-'..'чс'ждч. адбхват стабглдпр. Чгглзгозг а>:ачэ кашэсп йэЕП,1.}эси сэ хг-ргстэр" хэгот-ягдзд я стовд-'ш^кг дон гточлчдчр. Бу раягап;).акга ха-р ттзри вэ г.е»р 'жг>а хусуси.^отлз^и кзстэр:лр' хк, т потягал чдаптта Г;¡излт".ллпт;,:.''.др г.тяЦон рол. оЗиа^'ф.

Nataliya N.LuUanina

STUDY OF HIGH TEMPERATURE EFFECT ON MORPHOGENIC AND SOME ADAPTIVE PROCESSES IN WHEAT CELL CULTURE

• SUMMARY

Effect of stress factors, high temperature, in particular, on callusogenesis, proliferation anil morphogenesis processes in wheat ccll culture was studied in order to investigate theoretical and practical aspects of cell selection.' In this connection the ability to preserve and express genetically determined resistance property on the level of cell culture and the whole plant was studied on the example of such adaptive reaction as ethylene synthesis, In stress factor absence direct dependence is noted only Letwesn genotypes resistance level and callus morphogcnic potential, This dependence is observed during the first stages of cultivation and is lost during long-term subculture. Studies of contribution of different callus types into total regeneration ability of genotype showed that regeneration ability was determined not only by the prescncc of morphogenic callus but also by the correlation of different cell types in the culture. High temperature effect promotes realization of genetically determined resistance in cull" culture of wheat cultivars studied. Temperature increase lesults in the suppression of callusogenesis frequency, proliferation intensity, regeneration ability in cell cultures of all genotypes studied. The more is degree of these processes suppression the lesser is the resistance level of the initial genotype. The results of study pf high temperature effect on ethylene synthesis by wheat shoot segments and cell cultures showed that both these model systems are adequately stable in preservation of this adaptive reaction. Tempeiature increase in the limits of physiologically established norms results in the increase of ethylene synthesis both in wheat shoot segments and cell culture. Character and the proccss of this reaction can testify the determinative role of ethylene on adaptive ability of the genotype.