Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение видоспецифичности поверхностных компонентов Mycobacterium kansasii

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение видоспецифичности поверхностных компонентов Mycobacterium kansasii"

Міністерство охорони здоров’я України Харківський науково-дослідний інститут мікробіології та імунології ім. I.L Мечнікова

•УЗЕВСЫСИЙ ОЛЕКСАНДР АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 579. 61: 616-078: 579, 873. 21

Вивчення видоспецифічності поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii

03.00.07- мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Харків - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров України

Науковий керівник: доктор медичних наук, доцент Протченко Павло Захарович, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології Одеського державного медичного університету

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Мінухін Валерій Володимирович, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету МОЗ України.

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії МОЗ Україн

Провідна установа: Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України

Захист дисертації відбудеться “ •'“и *.■ 200С р. о,- //‘’годині на засіданні

спеціалізованої Вченої Ради Д 64.618.01 при Харківському науково-дослідному інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова (м. Харків, вул. Пушкінська, 14)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського науково-дослідного інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова (м. Харків, вул. Пушкінська, 14)

Автореферат розісланий “______”_________________200____р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради, кандидат медичних наук

Кучма І.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Захворювання, що спричинені мікобактеріями, у теперішній час не лише зберігають свою яуальність, але й мають тенденцію до неухильного поширення (Мельник В.М., 1997, Липкан

Н., 1999, Akita Y., et al., 1999). Такий стан притаманний різним країнам, не виключаючи й сономічно високорозвинені (Horsburg C.R., 1991, Selik et al., 1987). Україна також не є винятком, уберкульоз в Україні, на думку багатьох спеціалістів, представляє собою національну небезпеку Лельник В.М., 1997, Пухлик Б.М., 1999, Фещенко Ю.І., 2000), оскільки рівень захворюваності гухильно зростає і може вийти з-під контролю. В період з 1990 по 1999 рік показник іхворюваносгі на туберкульоз зріс на 68,8 %, смертність - на 146 % (Липкан Г.Н., 1999, Фещенко ).!, 2000). З 1995 року в нашій країні офіційно оголошено про епідемію туберкульозу (Фещенко ).І„ 2000).

Таке погіршення епідеміологічної ситуації s туберкульозу обумовлене, зокрема, зниженням іунобіологічної резистентності організму людини в сучасних умовах. Цьому сприяють іунодефіцитні стани первинного та вторинного походження, погіршення екологічної рівноваги, Ю призводить до суттєвих негативних змін у резистентності людини.

Аюуальність теми. На тлі зростання захворюваності на туберкульоз усе більшого бачення в усьому світі набувають захворювання, спричинені атиповими мікобактеріями (Murray LJ.L., et al., 1990, Raviglione M.C., et al., 1995, Sherer R., et al., 1986). В Україні з 1986 року потерігається поступове зростання захворюваності на мікобактеріози, причому у 1995 році 3,1 % ипадків захворювань мікобактеріальної етіології склали захвоювання, спричинені атиповими (ікобактеріями (Сибірна Р.І. та співавт., 1996). Значення атипових мікобактерій як етіологічних іакторів захворюваності людини поглиблюється їх здатністю бути збудниками опортуністичних гіфекцій при СНТДі та інших імунодефіцитних станах (Бібергаль Е.А., 1991, Олисаев В.Б. и соавт., 992, Seldenrijk С.А., et al., 1990, McGeady S.J., et al., 1981).

Фотохромогенні мікобактерії досить часто виявляються збудниками мікобактеріозів -астота їх виділення коливається від 2 % до 50 % усіх мікобактеріозів, причому мова йде майже иключно про Mycobacterium kansasii (Рибка Л.Н. та співавт., 1981, Kubin М., et al., 1987). іраховуючи здатність до тривалого виживання цього мікроорганізму на об’єктах зовнішнього ередовища та у воді, нерідко значний ступінь інфікування сільськогосподарских тварин та іізноманіття шляхів проникнення до організму людини, можна сказати що М. kansasii має у еперішній час велике епідеміологічне значення (Akita Y., et al., 1999, Dillon J., et al., 1990, Caustova J.,et al., 1981).

Слід відзначити, що хоча клінічна картина мікобактеріозів, які спричинені Mycobacterium :ansasii схожа з клінічною картиною туберкульозу відповідної локалізації, є й суттєві відмінності

(Kubin М., et al., 1987, Sriyabhaya N., et al., 1981), що потребує міжвидової диференціаі мікобактерій. Крім того, лікування захворювань, спричинених різними видами мікобактер також часто вимагає встановлення біологічного виду збудника (Ewig S., et al., 1990, Tsukamura IV et al., 1989).

Можливі два основних підходи до розв’язання цього завдання. По-перше, можна було обмежитися диференціацією туберкульозних мікобактерій від атипових, без встановлення ви; останніх. По-друге, можливо встановлювати окремо вид кожного збудника. Другий підхід більа відповідає потребам медичної, епідеміологічної та епізоотологічної практики.

До теперішнього часу встановлення виду збудника мікобактеріозу базується, головни чином, на бактеріологічному методі дослідження. Але його тривалість, трудомісткість та знач витрати примушують вести пошук іншіх методів міжвидової диференціації. Значний прогрес цьому напрямку досягнутий завдяки застосуванню ПЛР, але й цей метод вимагає складної устаткування, підготовленого персоналу та реактивів (Abed Y., et al., 1995, Barclay R., et al., 1992 Крім того, він також не може розв’язати всіх проблем, пов’язаних з перебігом інфекційної процесу, діагностикою та лікуванням (Zimmerman D.R., et al., 1997).

Особливу увагу дослідників привертають серологічні методи виявлення видоспецифічни компонентів мікобактерій. Це зумовлено тим, що, незважаючи на простоту виконання та невелін вартість, такі методи спроможні забезпечити достатню чутливість, специфічність, і інформативність (Літвинов В И., 1990, Krest’anpol М., et al., 1993). Однак пошук видоспецифічни компонентів значно ускладнений високою мірою антигенної спорідненості між різним речовинами, що можуть бути одержані з клітин. Водночас спостерігається досить велика кількісі антигенів мікобактерій, що також утруднює пошук серед них видоспецифічних.

Найбільше значення може мати знаходження видоспецифічних компонентів сере поверхневих структур бактеріальної клітини, оскільки саме вони першими стикаються з імунної системою організму, до них, у першу чергу, формується імунна відповідь, що відкрива перспективу для своєчасної, високоспецифічної диагностики та визначає напрямок наши досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота є фрагменте планової наукової роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології Одеського державног медичного університету N° 0199U002025 “Вивчення видоспецифічних протеїнмістячи поверхневих компонентів мікобактерій з метою створення диагносгичної тест-системи”. Окре,\ частини дисертаційної роботи були фрагментами планових наукових робіт Одеського інститут клінічної біохімії та санітарії тварин УААН № 01.01.02 “Ідентифікувати, виділити та вивчит специфічні детермінанти мікобактерій туберкульозу” та № 01.06.2 “Вивчити антигенну структур атипових мікобактерій з застосуванням ІФА-методів та виділити видоспецифічні антигени

з

ло розробки антигенних діагностикумів”. Автор е виконавцем перерахованих комплексних

Мета і завдання дослідження. Мета робота - виділити поверхневі компоненти М. kansasii ивчити наявність серед них видоспецифічних антигенів.

Для досягнення мети були поставлені завдання:

1. Розробити метод одержання поверхневих компонентів М. kansasii шляхом екстрагування серійної маси у неденатуруючих умовах.

2. Провести фракціонування екстрактів М. kansasii для виділення компонентів з

і генними властивостями.

3. Одержати імунні сироватки до екстрактів М. kansasii шляхом імунізації кролів та

іідити антигенну структуру нативних і фракціонованих екстрактів М. kansasii.

4. Провести порівняльний аналіз антигенної структури екстрактів М. kansasii та

цставників інших груп мікобактерій.

5. Провести оцінку видоспецифічності виділеного компоненту при дослідженні екстрактів cansasii та інших видів мікобактерій.

Об’єкт дослідження - Mycobacterium kansasii.

Предмет дослідження - антигенна структура Mycobacterium kansasii.

Методи дослідження - бактеріологічні - посів та накопичення бактеріальної маси :obacterium kansasii; фізико-хімічні - екстрагування компонентів мікобактерій, ктрофорегичне фракціонування, знесолювання шляхом гель-хроматографії, іонообмінна матографія для виділення окремих компонентів, спектрофотометрія, визначення білку за Lowry Bradford; імунологічні - імунізація лабораторних тварин для отримання імунних сироваток, кція преципитації у гелі, імуноелекгрофорез.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше обгрунтовано можливість виділення ерхневих компонентів Mycobacterium kansasii у неденатуруючихї умовах без суттєвого нування мікробних клітин. Серед отриманих компонентів встановлено наявність ;оспецифічних антигенів, що можуть бути використані для індикації та міжвидової зференціації Mycobacterium kansasii.

Практичне значення роботи: на базі виділених видоспецифічних компонентів М. kansasii можливою розробка діагностнкума для швидкої та якісної ідентифікації мікобактерій в перименті та клініці. Одержані результати вказують на перспективність подальших досліджень аду поверхневих компонентів мікобактерій з метою удосконалення диференційної диагносгики обактеріозів.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто був здійснений патентно-інформаційний иук, у тому числі з застосуванням електронних засобів, визначені мета і завдання дослідження,

методичні підходи, опрацьовані моделі, згідно з якими особисто виконані експериментал дослідження. Проведено оформлення одержаних результатів у вигляді таблиць і графі] зроблений їх аналіз, сформульовані висновки роботи. Автором розроблено метод одержаї поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii у м’яких умовах з послідовним застосуваш детергентів різної хімічної природи та без помітного руйнування бактеріальних кліт Відпрацьовані умови розділу екстрактів поверхневих протеїнів на окремі фракції (спільні Філіповським О.В.), проведено аналіз одержаних фракцій з точки зору їх хімічного складу антигенної специфічності. Дослідження, що їх було виконано, дозволили виявити компонент kansasii, який на цьому етапі можна вважати видоспецифічним. Автором розроблені ум< виділення видоспецифічного компонента з ектракта поверхневих компонентів Mycobacteri kansasii. Усі положення та висновки дисертації належать авторові. Автором написано особис або у співавторстві з д.мед.н. Протченко П.З., х.мед.н. Созіновим В.О., Александровою JL Філіповським О.В. усі друковані матеріали, що мають відношення до теми роботи.

Апробація роботи і публікації за темою дисертації. Результати роботи висвітлено ; наукових роботах, у тому числі у 6 журнальних статтях, з яких 1 - в іноземному журналі, 1 збірнику наукових праць.

Результати роботи доповідались та обговорювались на:

XIII з’їзді Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів Д.К. Заболотного (Київ - Вінниця, 1996);

Науково - практичній конференції молодих вчених та студентів, присвяченої IV конгрі СФУЛТ (Одеса, 1996);

Конференції “Актуальні проблеми мікробіології, вірусології та імунології” (Харків, 1998);

Пленуму Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів Д.К. Заболотного “Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі стор (Одеса, 2000).

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 145 сторінках комп’ютерного тексту складається з вступу, розділів, які влючають огляд літератури, опис матеріалів і мето досліджень, результати власних досліджень, заключення, висновки. Список літератури вклю 211 джерел вітчизняного та зарубіжного походження. Матеріали дисертації ілюстровано таблицями, 24 малюнками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експерименти проводили з штамами Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bo' Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegma

yrcobacterium fortuitum, Mycobacterium phlei. Усі штами були надані Одеським інститутом інічної біохімії та санітарії тварин УААН. Мікобактерії вирощували та зберігали на твердому івильному середовищі Гельберга, а накопичували бактеріальну масу на синтетичному зедовищі Сотона.

Для підтвердження видової належності отриманих штамів застосовували бактеріологічні та )хімічні тести: ніациновий, ріст на середовищі з саліцилатом натрію, швидкість росту иа ердих поживних середовищах, утворення пігменту, розщеплення сахарів, гідроліз твіну-80, цукція нітратів, ріст у присутності різних хімічних реагентів.

Екстрагування знешкодженої 2% розчином фенолу бактерійної маси проводили з слідовним застосуванням 0,5 % розчину ДСН і 0,4 % розчином тритону Х-100. Від детергентів стракти звільнювали шляхом осадження на холоді, гель-хроматографії та екстрагування ороформом.

Вміст білку в розчині контролювали шляхом визначення оптичної щільності при 260 и 280 г, за Lowry, а також методом зв’язування барвника за Bradford (Досон Р. та співавт., 1991). f клеї нові кислоти у розчині також визначали за оптичною щільністю. Вуглеводи та ліпіди значали методом тонкошарової хроматографії, застосовуючи для обробки хроматограм різні агенти (Досон Р. та співавт., 1991, Кучеренко Н Е. та співавт., 1988).

Для розділення екстракту на окремі фракції застосовували іонообмінну хроматографію на лонці з ДЕАЕ-целюлозою «Ватман DE-32». В отриманих фракціях визначали вміст білку та ■клеїнових кислот методами, що вказані вище.

Електрофорез у поліакриламідному гелі за Laemmli використовували для тонкого вивчення ладу екстрактів, для підтвердження чистоти отриманих хроматографічних фракцій, а також для значення молекулярних мас окремих компонентів екстрактів (Осгерман Л.А., 1981, Laemmli К., 1970). З цією метою використовували маркерні білки фірми “Sigma”.

Для одержання імунних сироваток використовували 16 кролів. Імунізацію проводили за адифікованою методикою О.Е. В’язова та Ш.Х. Ходжаева (1973) з використанням неповного ,’юванта Фрейнда. Моноспецифічні сироватки одержували шляхом «виснаження» сироватки юти Mycobacterium kansasii екстрактами наступних видів мікобактерій: Mycobacterium bovis, ycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intraceilulare, Mycobacterium llei.

Антигенні властивості екстрактів досліджували в реакдіі преципітації у гелі та методом уноелектрофорезу. РПГ проводили як двойну радіальну імунодифузію за методом Ouchterlony модифікації Л.А. Зільбера (1958). Результати відзначали візуально, а також фарбуванням гелевої іастинки та її фотографуванням.

Імуноелектрофорез виконували за модифікованим методом Грабар и Уильямс в 1 % агарози (Grabar P., Williams С. А., 1953). Визначення результатів проводили аналогічно РПГ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження умов екстрагування поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii

Досліджували вплив ДСН, тритону Х-100, холату натрію та твіну-80 на екстрагува клітинних компонентів Mycobacterium kansasii. Експерименти у цьому напрямку вели однаковою схемою: вивчали вихід білку при концентраціях нижчих за ККМ, дорівнюючих К та вищих ККМ. З’ясовано, що найбільший вихід білку спостерігається при застосуванні ДСН тритону Х-100. При цьому оптимальними виявилися концентрація ДСН 0,5 % и pH 6,8 концентрація тритону Х-100 - 0,4% (вага/об’єм) и pH 7,0. Максимальна ж концентрація бі. складає відповідно 200 мкг ' см'3 та 180 мкг ' см'3. Холат натрію та твін-80 забезпечують ви білку у концентраціях не вищих, ніж 10 мкг' см'3.

Вивчено можливість послідовного застосування найбільш активних детергентів. Для ць спочатку проводили екстрагування ДСН, після чого бактеріальну масу обробляли 0,4 % розчад тритону Х-100 в 0,15 М трис-НСІ буферному розчині pH 7,0. Завдяки цьому вдавалося додатю екстрагувати білок у кількості 50 мкг см'3 экстракта.

Неушкодженість бактеріальних клітин протягом екстрагування доводили шлях забарвлювання за Цілем-Нільсеном з подальшим мікроскопічним вивченням. При цьому 63 встановлено, що клітини мікобактерій навіть після послідовного застосування детергентів втрачають кислотостійкости, що свідчить про неушкодженість клітинної стінки мікобактер Було встановлено, що вміст нуклеїнових кислот в ектратах при застосуванні пропонованої на методики екстрагування не був значним, причому визначалася виключно РНК, ДНК ж не б; виявлена жодного разу. Руйнування клітин повинне було б супроводжуватися значним виход нуклеїнових кислот. Це також підтверджує неушкодженість клітин протягом екстрагування.

Таким чином, одержані екстракти Mycobacterium kansasii містять практично лише поверхи компоненти й не мають суттєвої домішки внутрішньоклітинних компонентів.

Антигенні властивості отриманих екстрактів досліджували в реакції преципітації у гелі. Е цьому було встановлено, по-перше, що обробка ДСН не спричинює втрати екстракта антигенних властивостей (або вони відновлюються) після видалення цього детергенту. По-дру екстрагування в різних випадках ДСН чи тритоном Х-100 дозволяє вивільнювати різні антигеї компоненти. По-третє, естракти, одержані з використанням холату натрію та твіну-80 антигени компонентів не містили. Водночас, послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 дозво; вивільнити максимальну кількість антигенних компонентів. Встановлено, що послідоб

застосування ДСН та тритону Х-100 сприяє екстрагуванню з бактерійної маси Mycobacterium kansasii максимальної кількості антигенннх компонентів ~ 4 (за даними РПГ), що більше, ніж у випадку використання кожного з ПАР окремо.

Таким чином, послідовне застосування ДСН та тритону Х-100 призводить до найбільш ефективної солюбілізації антигненних поверхневих компонентів.

Результати розділення екстратів Mycobacterium kansasii методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

Склад екстрактів різних видів мікобактерій досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Наступне порівняння електрофоретичних картин розділення екстрактів Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scro&laceum, Mycobacterium intracellulare та Mycobacterium phlei дозволило встановити, що бактеріопротеїни розташовуються на фореграмах у широкому диапазоні - від 205 кД до 14 кД і менше. В середньому екстракти різних видів мікобактерій містили 20 - 30 електрофоретичних фракцій (електрофореграми екстрактів Mycobacterium kansasii - 17 фракцій), причому серед них можна було помітити деяки «характерні» за розташуванням, тобто за електрофоретичною рухливістю. Зокрема, електрофореграма екстракту Mycobacterium kansasii вміщує 6 таких фракцій. Наявність у складі екстракту Mycobacterium kansasii «характерних» фракцій може дозволити ідентифікувати цей мікроорганізм за його елекгрофореграмою. Загалом же, електрофоретичне дослідження екстрактів дозволило підтвердити припущення про багатокомпонентний їх склад, тому треба було розділити екстракти на окремі фракції з препаративною метою.

Дослідження фізико-хімічних властивостей екстрактів мікобактерій, розділених методом іонообмінної хроматографії

Спочатку були проведені дослідження оптимальних умов розділення екстрактів мікобактерй на окремі фракції з використанням різних іонообмінників. Встановлено, що для первинного розділення отриманих нами екстрактів Mycobacterium kansasii оптимальним є використання ДЕАЕ-целюлози. При цьому, як це можна бачити з рисунка 1, екстракти Mycobacterium kansasii розділяються на три основні групи фракцій: група “А” - компоненти, що здатні адсорбуватися на колонці лише за умов зниження концентрації вихідного буферного розчину до 0,05 М; група “В” -компоненти, що адсорбуються при 0,1 М концентрації вихідного буферного розчину з 0,2 М хлоридом натрію і елюціюються при поступовому підвищенні концентрації хлориду натрію до ЇМ; група “С” - компоненти, що могли бути елюційовані лише завдяки використанню розчину лугу - 1н. гідроксиду натрію. Первинне розділення не дозволяє провести відокремлення деяких компонентів один від одного, тому проводили рехроматографію кожної групи фракцій з

використанням “лінійного” градієнту концентрації хлориду натрію. Внаслідок рехроматогр було одержано 10 хроматографічних фракцій

Фракції досліджували спектрофотометричним методом з метою визначення наявності в білку та інших складових. Було з’ясовано, що фракції різних груп не однакові за своїм кількіс та якісним складом, що демонструє таблиця 1.

З таблиці 1 можна бачити, що вміст нуклеїнових кислот, зокрема РНК, не корелює зі вміс білку. Майже вся кількість цієї нуклеїнової кислоти зосереджується у фракціях групи «С». нашу думку, такий характер перерозподілу РНК є гарантією остаточного очищення білка в і і фракціях від цієї нуклеїнової кислоти. Вірогідно, РНК у цих фракціях зв’язана з білком, тобто містяться рибонуклеопротеїди. Відсутність же ДНК у складі фракцій ще раз свідчить про те, і не було в екстракті, тобто суттєвого руйнування клітин у процесі екстрагування не відбуваєтьс:

Оскільки екстракти, крім білку та нуклеїнових кислот могли містити речовини іншої хімі природи, ми провели дослідження хроматографічних фракцій методом тонкошар хроматографії із застосуванням різних реагентів для «проявки» хроматограм. Було встановл що суцільні екстракти Mycobacterium kansasii містять речовини вуглеводної та ліпідної прир однак розподіл таких речовин між хроматографічними фракціями неоднаковий. Вуглев компоненти містилися як у фракціях групи “А”, так “В”, і “С”. Це дозволяє припустити, що у цих фракціях наявні глікопротеїди. Компоненти ліпідної природи були зосереджені лин фракціях В2, В4 и В5. Це дає певні підстави вважати, що у цих фракціях знаходяться, перева; ліпопротеїди.

Електрофоретичне розділення одержаних хроматографічних фракцій дозволило з’ясув що електрофоретична рухливість більшості компонентів, які входять до складу фракцій змінюється в ході іонообмінної хроматографії. Однак розподіл бактеріопротеїнів між фракці не був однаковим. Фракції Аі, Аа, Ві, В.*, Сз вміщували по одному компоненту, фракції В2, Вз Сі - по два. Фракція Сі вміщувала навіть три компоненти. Були визначені молекулярні t компонентів, що входили до складу хроматографічних фракцій.

Дослідження антигенної будови екстрактів Mycobacterium kansasii Показано, що фракції Аг, В2, В5, Сг, Сз, не були активними в РПГ. Більшість же імунолог активних фракцій були антигенно неідентичними та містили компоненти, що могли вступаті перехресних реакцій з сироватками проти іншіх видів мікобактерій. Лише фракції В4 ті містили компоненти, що могли бути визнані видоспецифічними для Mycobacterium kans Водночас, фракції В4 и Сі давали реакцію «часткової антигенної тотожності» стосовно одн одної.

^ г ^ 5 CM Ю ІЛ

О О Т- CM СЧ

о" о‘ о о о'

2 2 О 't

о" о'

5 ^

Ю 12

о о

2 ю S ^

г і- N Z

Рис. 1 Хроматограма суцільного екстракту Mycobacterium kansasii на ДЕАЕ-целюлозі:

"■ - оптична щільність фракцій, D595; 0,02 М - 2 М - концентрації NaCl у 0,1 М трис-[ буферному розчині.

Таблиця 1.

ультати спектрофотометричного дослідження фракцій екстракту Mycobacterium kansasii, які були одержані методом іонообмінної хроматографії

ява Властивості, що досліджувалися

лади D260 D280 ^Bradford Вміст білку, МКГ' см'3 Вміст РНК, МКГ ' см'3* Вміст ДНК, мкг' см'3’

0,163 0,284 2,100 0,260 320 - -

^2 0,13 0,225 1,734 0,220 250 - -

Зі 0,025 0,047 0,464 0,030 51 - -

Ї2 0,103 0,180 1,522 0200 203 - -

З3 0,129 0,225 1,742 0,221 250 - -

34 0,Ш5 0,183 1,544 0,213 205 - -

З3 0,110 0,174 1,464 0,192 188 0,6 -

-1 0,473 0,422 1,962 0,241 295 13,9 -

-2 0,435 0,384 1,862 0,231 270 12,6 -

1,044 0,703 1,902 0,242 280 34,6 -

римітка. Відсутність даних у цих стовпчиках означає, що нуклеїнові кислоти у зразках не йдені. Вірогідно, це може свідчити про їх відсутність або про такий вміст, що не евищував нижню межу чутливості застосованих методів виявлення.

Методом імуноелектрофорезу в агарозному гелі в екстрактах Mycobacterium kansasii ( виявлено дев’ять антигенних компонентів, серед яких е такі, що визначаються лише сироват проти Mycobacterium kansasii, а також такі, що виявляються усіма сироватками, які були взят експерименту, що демонструє рисунок 2.

____________________S. leans.

--------

□

м

Рис. 2. Загальна схема результатів імуноелектрофорезу екстракту Mycobacterium kansas участю антисироваток до різних видів мікобактерій: К - екстракт Mycobacterium kansasii; Sk ангисироватка до Mycobacterium kansasii; М - передбачувана суміш антисироваток Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium phlei, Mycobacterium to Mycobacterium scrofulaceum.

Антигенні компоненти, які були присутні у хроматографічних фракціях А;, Ві и Вз екстр Mycobacterium kansasii, присутні також і в екстрактах іншіх видів мікобактерій. Компонеш фракцій В4 и Сі були характерні лише для екстракту Mycobacterium kansasii і не реагували з жод з узятих до експерименту сироваток проти мікобактерій (Mycobacterium avium-intracellu Mycobacterium bovis; Mycobacterium fortuitum; Mycobacterium phlei; Mycobacterium scrofulaci нормальна кроляча сироватка), як показано на рисунку 3.

Дослідження антигенної специфічності компонентів фракцій з використаї моноспецифічних сироваток дозволило встановити, що, по-перше, моноспецифічні антисиров “В4 и Сі” спроможні виявити відповідні їм компоненти екстракту Mycobacterium kansasii с екстрактів іншіх видів мікобактерій, по-друге, компоненти, що присутні у фракціях В4 и Сі собою дають реакцію «неповної ідентичності», нарешті, компоненти В4 и Сі екстр Mycobacterium kansasii виявляються спроможними до виявлення специфічних антитіл у сирова лабораторних тварин. Останнє положення демонструє рисунок 4.

и

Таким чином, можна вважати, що хроматографічні фракції В4 и Сі екстракту М. катавіі или, щонайменше, один антигенний компонент, який за результатами проведених ііджень можна вважати видоспецифічним. Молекулярна маса цього компоненту :одиться в межах 72 - 86 кД. Це речовина білкової природи, що, вірогідно, має вуглеводний ліпідний компонент як простетичну групу. На основі хроматографичних фракций В4 и Сі ракту М. каїкаїи в подальшому можливе створення препарату для диагностики (бактеріозів, що спричинені цим мікроорганізмом.

Рис. З Реакційна здатність фракцій В4 та Сі стосовно сироваток проти різних видів >бактерій: В4 - хроматографічна фракція В4 екстракту Mycobacterium kansasii; Сі -яатографічна фракція Сі екстракту Mycobacterium kansasii; 1 - антисироватка до :obacterium kansasii; 2 - антисироватка до Mycobacterium avium-intracellulare; 3 -їсироватка до Mycobacterium bovis; 4 - антисироватка до Mycobacterium fortuitum; 5 -ісироватка до Mycobacterium phlei; б - антисироватка до Mycobacterium scrofulaceum; 7 -мальна кроляча сироватка.

Рис. 4 Визначення можливості виявлення за допомогою компонентів фракцій В4 і специфічних антитіл в антисировагці до Mycobacterium kansasii: 1 - суміш антисировато Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacte intracellulare, Mycobacterium phlei, Mycobacterium kansasii; 2 - суміш ангисироваток Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacte intracellulare, Mycobacterium phlei; 3 - суміш ангисироваток до Mycobacterium bovis, Mycobacte fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium phlei, до фр B4 екстракту Mycobacterium kansasii, до фракції Сі екстракту Mycobacterium kansasii; М - с; фракцій В4 и Сі; К - суцільний екстракт Mycobacterium kansasii.

висновки

зроблені метод та умови екстрагування поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii эм використання детергентів з різними механізмами солюбілізуючої дії. Послідовне :ування ДСН в концентрації 0,5 % і тритона Х-100 в концентрації 0,4 % дозволяє агувати з інактивованих фенолом мікобактерій більшу кількість антигенних компонентів, ніж сування кожного з детергентів окремо. Одержані у такий спосіб екстракти Mycobacterium sii містять переважно поверхневі компоненти бактеріальних клітин, про що свідчить ження мікобактеріями кислотостійкості та відсутність в екстрактах дезоксірибонуклеїнової

)ТИ.

стракги поверхневих компонентів Mycobacterium kansasii є багатокомпонентні системи, які ують, за даними тонкошарової хроматографії та електрофорезу в поліакриламідному гелі зини білкової, ліпідної та полісахаридної природи.

кстракт Mycobacterium kansasii в результаті електрофорезу в поліакриламідному гелі лясться на 17 компонентів, які відрізняються електрофоретичною рухомістю. Порівняння грофоретичних картин розділення екстрактів Mycobacterium kansasii, Mycobacterium bovis, jbacterium fortuitum, Mycobacterium scroflilaceum, Mycobacterium mtracelluiare, Mycobacterium вказує, що в електрофоретичному спектрі Mycobacterium kansasii можна виділити б юнеитів, які за своєю молекулярною масою та електрофоретичною рухомістю є характерними цього мікроорганізму та можуть бути використані для ідентифікації електрофоретичного тру Mycobacterium kansasii.

кстракт Mycobacterium kansasii методом колоночної іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-злозі й наступної рехроматографії розділяється на 10 фракцій, котрі відрізняються міцністю ку з іонообмінником та хімічним складом. За даними електрофорезу в поліакриламідному гелі поненти фракцій відрізняються молекулярною масою, а в реакції преципітації у гелі івляють неоднакові антигенні властивості. Серед антигенних компонентів є як загальні для ! фракцій, так і індивідуальні, що притаманні лише одній фракції,

.'еред виділених фракцій виявлені антигени, які можуть бути визнані видоспецифічними для ■obactcrium kansasii. Видоспецифічність цих підтверджується в реакції преципітації в гелі та в іоелектрофорезі, в тому числі, з використанням імунних сироваток, що були виснажені грактами Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, :obacterium avium-intracellulare, Mycobacterium phlei. Подібні антигени не зустрічаються в цюго з представників основних груп мікобактерій. Такі компоненти знаходяться у фракціях В4 оюється при концентрації хлориду натрію 0,75 М) та Сі (елююється при pH буферного розчину 8,9) і є речовинами білкової природи з молекулярною масою в межах 72 - 86 кДа, які містять

вуглеводний та ліпідний компоненти. Обидва антигени дають реакцію неповної антиген ідентичності один з одним в реакції преципітації у гелі.

6. Видоспецифічні компоненти Mycobacterium kansasii можуть служити основою для розроі тест-системи з метою покращення діагностики мікобактеріозів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Грузевский А.А. Современные данные о роли фотохромогенных микобактерий в патолої человека (Обзор литературы) // Проблемы туберкулеза. - 1999. - №6. - С. 58-61.

2. Грузевський О.А. Вивчення видоспецифічних компонентів Mycobacterium kansasii допомогою імунодифузійних методів // Буковинський медичний вісник. - 2000. - № 1. - С. її 174.

3. Протченко П.З., Грузевский А.А., Филиповский А.В., Александрова Л.Н. Изуче: протеинового состава и антигенных свойств некоторых видов микобактерий // Експерименталь клінічна медицина. - 1999. - №2. - С. 75 - 78.

4. Грузевський О.А., Протченко П.З., Філіповський О.В. Вивчення протеїнових ексграггів дея видів атипових мікобактерій методом іонообмінної хроматографії // Одеський медичний журна 1999,- №4.-С. 12-15.

5. Філіповський О.В., Протченко П.З., Грузевський О.А. Використання аніонного детерге додецилсульфату натрію для екстракції поверхневих протеінвмісних компонентів мікобактері Одеський медичний журнал. - 1999. - №3. - С. 19-21.

6. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Виділення поверхневих протеїнових компонентів М. b та М. kansasii. // Нові технології у навчальному процесі, теоретичній та клінічній медиі (Додаток до “Одеського медичного журналу”). - 1999. - С. 157-159.

7. Протченко П.З., Грузевський О. А., Філіповський О.В. Вивчення поверхневих видоспецифіч компонентів деяких видів атипових мікобактерій // Пленум Українського наукового товарні мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного "Наукові та практичні асш боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіч". Тези доповідей. - Одеса, 2000 p. - С. 86-87.

8. Созінов В.О., Протченко П.З., Грузевський О.А., Александрова Л.М., Філіповський < Дослідження протеїнового складу та антигенної структури деяких видів мікобактерій. // Актуа проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб. ' доповідей ХПІ з’їзду українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів паразитологів ім. Д.К. Заболотного. - Київ - Вінниця, 1996. - С. 139 - 140.

9. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Антигенна структура та протеїновий склад деяких в атипових мікобактерій // Науково-практична конференція молодих вчених та студеї присвячена IV конгресу СФУЛТ. Тези доповідей. - Одеса, 1996. - С. 8 - 10.

АНОТАЦІЯ

Груїевськнй О.А. Вивчення видоспецифічності поверхневих КОИПО'ент‘я cobacterium kansasii. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата иедичиих наук за сп‘ЦІяльностю J0.07 — мікробіологія. — Харківський науково-дослідний інститут м^р°б'ОЛОПІ та нології ім. І.І. Мечішкова МОЗ України. Харків, 2000.

Дисертацію присвячено проблемі пошуку видоспецифічких компонентів Mycobacterium sasii. Розроблений метод одержання поверхневих компонентів мікобактерій / м’яких умовах. ічєно картину електрофоретичного розділення екстрактів Mycobacterium kansasii. Одержані ктрофореграми дозволяють виділити 6 характерних компонентів, які можуть бути використані ідентифікації електрофоретичних спектрів екстрактів Mycobacterium kansasii. Вивчено також ічну природу та молекулярну масу складових екстрактів. Розроблено умови хроматографічного ділення ектрактів на окремі фракції. Проведено дослідження антигенної структури фргкцій, азано, ідо деякі хроматографічні фракції містили антигенні компонентіи, що можуть бути нані видоспецифічними. Такі компоненти можуть бути використав Для створення 'ностичної тест-системи.

Основні результати проведених досліджень Еикористор^*оться в учбових програмах з робіологй та фтізіатрії в Національній фармацет ичній академії України, Одеському жавному медичному університеті, Львівському державному медичному університеті ім. Д. мцького, Луганському державному медичному університеті, Кримському державному (ичному університеті ім. С Георгі енського, Івано-Франківській медичній академії, шопільській державній медичніи академії ім. 1.5І. Горбачевського, Буковинській державній Нічній академії.

Ключові слова: атипові мікобактерії, опортуністичні інфекції, видоспецифічні

шонегл’и, антигенна структура, диференційна діагностика, Mycobacterium kansasii, поверхневі укгури.

АННОТАЦИЯ

Грузевский А.А. Изучение вндоспецифичности поверхностных компонен! Mycobacterium' kansasii. - Рукопись.

Диссертация на" соискание ученой степени кандидата медицинских наук специальности 03.00.07 - микробиология. - Харьковский научно-исследовательск институт микробиологии и иммунологии им. И.П. Мечникова М3 Украины, Харьков, 200<

Диссертация посвящена проблеме поиска видоспецифических компонентов атипичк микобактерий, в частности, их представителя - Mycobacterium kansasii.

Разработан метод получения поверхностных компонентов микобактерий в мягких услов! без разрушения бактериальных клеток, который предусматривает- как использование дегерген-в невысоких концентрациях, так и последовательное применение детергентов различ! структуры. Отсутствие разрушения бактериальных клеток подтверждено микроскопическ исследованием бактериальной массы после экстрагирования, а также отсутствием в экстрак определяемых количеств ДНК.

Изучена картина электрофоретического разделения экстрактов Mycobacterium kansasi: полиакриламидном геле, в том числе в сравнении с экстрактами поверхностных компонен' микобактерий - представителей других групп в классификации Runyon (Mycobacterium bo' Mycobacterium, avium-intracellulare, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegma Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium phlei). При этом показано, что все экстракты являю многокомпонентными системами.

Полученные электрофореграммы Mycobacterium kansasii позволяют выделить 6 характерf пс электрофоретической подвижности компонентов, которые могут быть использованы , идентификации электрофоретических спектров экстрактов Mycobacterium kansasii.

Исследованы также химическая природа и молекулярные массы составляющих экстрак Mycobacterium kansasii. Показано, что в их состав входят вещества белковой, липидн углеводной природы и небольшое количество РНК.

Разработаны условия разделения экстрактов поверхностных компонентов Mycobacteri kansasii на отдельные фракции методом колоночной ионообменной хроматографии на ДЭ/ целлюлозе. При этом показано, что существуют компоненты, слабо адсобирующиеся ионообменнике, адсорбирующиеся относительно прочно и адсорбирующиеся весьма проч Всего получено 10 хроматографических фракций экстрактов поверхностных компонен Mycobacterium kansasii.

Проведено изучение антигенной структуры цельных экстрактов Mycobacterium kansasii и фракций в сравнении с экстрактами других видов микобактерий в реакции преципитации в гел

иуноэлектрофорезе. При этом доказано, что последовательное применение для экстрагирования творов додецилсульфата натрия и тритона Х-100 позволяет солюбилизировать большее 1ичество антигенных компонентов, чем применение каждого из детергентов в отдельности.

Выявлено, что некоторые хроматографические фракции содержали антигенные компоненты, орые могут быть признаны видоспецифическими на этом этапе исследований. Определена лическая структура и молекулярные массы этих компонентов, а также их способность выявлять итела к М. kansasii в полиспецифических антисыворотках. При этом антисывротки к cobacterium bovis, Mycobacterium avium-sntracellulare, Mycobacterium scrofulaceum, cobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium phlei не реагируют с такими гаонентами экстрактов Mycobacterium kansasii. Выявленные видоспецифические компоненты ут быть использованы для создания диагностической тест-системы.

Основные результаты проведенных исследований используются в учебных программах по •сробиологии и фтизиатрии в Национальной фармацевтической академии Украины, в Одесском ударственном медицинском университете, во Львовском государственном медицинском [верситете им. Д. Галицкого, в Луганском государственном медицинском университете, лмском государственном медицинском университете им. С.И. Георгиевского, Ивано-анковской медцинской академии, Тернопольской государственной медицинской академии им.

I. Горбачевского, Буковинской государственной медицинской академии.

Ключевые слова: атипичные микобактерии, оппортунистические инфекции,

юспецифические компоненты, антигенная структура, дифференциальная диагностика, cobacterium kansasii, поверхностные структуры.

SUMMARY

uzevskiy A.A. The study of species-specificity of Mycobacterium kansasii surface components. -nuscript.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of medical sciences on ciality 03.00.07 - microbiology. - Research Institute of Microbiology and Immunology named by Mechnikov, Kharkov, 2000.

The dissertation is dedicated to the problem of looking for species-specific components of cobacterium kansasii. The method of obtaining of mycobacterial surface components in mild ditions is elaborated. The picture of electrophoretic division of Mycobacterium kansasii extracts is lied. Obtained electrophoregrams allow to note 6 characteristic components which could be used for itification of electrophoretic spectrums of Mycobacterium kansasii extracts. Chemical nature and

molecular weights of extracts components were studied. The conditions of chromatographic divisioi extracts into isolated fractions are elaborated. The investigation of fractions antigenic structure fulfilled. There was revealed that some these fractions contained antigenic components which maj considered as species-specific. Revealed species-specific components could be used for creatior diagnostic test-system.

The main results of fulfilled investigations are used in studying programs in microbiology phtisiatry in National pfarmaceutical academy of Ukraine, in Odessa state medical university, in I state medical university, in Lugansk state medical university, in Crimean state medical university Ivano-Frankivsk state medical academy, Ternopol state medical academy, Bucovina state med academy.

Key words: atypical mycobacteria, opportunistic infections, species-specific compone antigenic structure, differential diagnostics, Mycobacterium kansasii, surface components.