Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах

Сокуева, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах"

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

005056280

СОКУЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НЕКОТОРЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИАМИНОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.01.04 «Биохимия» 03.02.07 «Генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

6 ДЕК 2012

005056280

Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Сяткин С.П. доктор биологических наук, профессор Шишкин С.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гурвиц Белла Яковлевна доктор медицинских наук, профессор Ижевская Вера Леонидовна

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «21» декабря 2012 г. в «/^ » ч. на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор ^ . ^-а^.у/^Е.В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Природные полиамины (ПА) и их синтетические аналоги изучаются уже не одно десятилетие как биологически активные вещества, способные оказывать существенное влияние на рост и развитие самых разных организмов путем регуляции клеточной пролиферации у микроорганизмов, растений и животных, включая человека [Wallace Н.М., Niiranen К. 2007; Huang Y., et al. 2009; Carmo A.M., et al. 2011] Установлено, что полиамины вовлечены в целый ряд важнейших внутриклеточных процессов, например, в обеспечение стресс-устойчивости, регуляцию определенных метаболических реакций, развитие апоптоза [Huang Y. et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Minois N. et al. 2011]. При этом некоторые полиамины нарушают функционирование клеточных геномов на разных уровнях, в частности, отдельные соединения указанного ряда способны достаточно специфично изменять экспрессию генов и влиять на активность ферментов [Huang Y., et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Wu Y. et al. 2012]. Естественно, большой интерес вызывают вопросы, связанные с изучением роли полиаминов в регуляции различных молекулярных процессов у человека и возможностей целенаправленного влияния на эти процессы синтетическими полиаминами. В настоящее время практически ежегодно появляются сообщения о создании новых синтетических полиаминов и использовании различных подходов к определению проявлений их биологической активности [Ignatenko N.A. et al. 2009; Carta F. et al. 2010; Yoon Y.J. et al. 2011; Wu Y. et al. 2012]. Как следствие, возникают объективные потребности в стандартизации условий для определения и сравнительного анализа цитостатических и других функциональных свойств синтетических аналогов полиаминов в рамках доклинических испытаний.

Имеются убедительные данные, свидетельствующие о том, что природные полиамины и их синтетические аналоги способны целенаправленно влиять на определенные этапы биосинтеза белков. В частности, были опубликованы статьи, в которых эффективно использовались

протеомные технологии для определения конкретных клеточных белков, подвергающихся различным изменениям после воздействий полиаминов [УоЬаппев Е. е! а1. 2005; ^тШепко 1Ч.А. е1 а1. 2009; Кио W.L. й а1. 2009 и др.]. Таким образом, применение протеомного анализа открывает широкие возможности для получения новых сведений о молекулярных эффектах, которые способны вызывать различные синтетические аналоги полиаминов, а также о потенциальных белках - мишенях.

Наконец важно отметить, что синтетические аналоги полиаминов могут найти применение как лекарственные средства или попадать в организм человека с пищевыми продуктами. Соответственно, представляется весьма актуальным проведение разработок стандартизированных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека, что позволит оптимизировать программы доклинических исследований новых синтетических аналогов полиаминов и уменьшит риск возможных осложнений при последующем изучении. Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в различных модельных системах.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в условиях модельной бесклеточной системы влияние ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ и др.) на общий пул природных полиаминов и некоторые показатели их обмена.

2. Проанализировать цитостатическую активность у отдельных синтетических аналогов полиаминов с помощью модельной системы на культивируемых клетках лабораторных животных.

3. Разработать биотест-систему на основе быстро пролиферирую-щих, культивируемых клеток человека и с её помощью изучить биологические эффекты ряда синтетических аналогов полиаминов

4. Провести сравнительный протеомный анализ белков в культивируемых клетках человека под действием отдельных синтетических аналогов полиаминов.

5. Исследовать возможность ассоциации отдельных полиморфных вариантов в двух генах, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов, а также в гене одного из актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна.

Получены новые данные о влиянии ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ, О-замещенных гидроксиламинов, алифатических гомологов природных полиаминов) на общий пул природных полиаминов, а также на соотношение спермидин / спермин и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы.

Для обеспечения определения цитостатической биологической активности синтетических аналогов полиаминов разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека (РС-3 и LNCaP). С помощью этой биотест-системы охарактеризованы четыре новых синтетических аналога полиаминов дифенил-содержащих аминов (ДФСА-1 - ДФСА-4) по их способности подавлять рост опухолевых клеток человека.

По результатам протеомного анализа в клетках линии РС-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2. При этом, впервые установлено присутствие в этих клетках двух «безымянных белков» - белка, который зарегистрирован в базе данных Protein NCBI под №193783699 (по данным анализа кДНК из ткани матки, локус BAG53610 в Genbank) и считается родственным аспартатами-нотрансферазам, а также белка, идентифицированного как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (№16552153 в Protein NCBI).

Впервые установлено, что у этнических русских по результатам изучения полиморфизма сайты rs61748925 SAT1 и rsll39915 РАОХявляют-

ся мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта гв 11072170 в гене РМЫ1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю в, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными, Таким образом, можно считать, что полиморфизм гв11072170 в гене РМЫ1 является перспективным для дальнейшего изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Научно-практическая значимость.

Апробировано несколько модельных систем для определения биологической активности синтетических аналогов природных полиаминов и разработана биотест-система, позволяющая оценивать цитостатические (цитотоксические) свойства указанных соединений (биотест-объекты -клетки ЬЫСаР и РС-3; метод тестирования - витальная система регистрации количества клеток).

Изучены показатели биологической активности 15-ти синтетических аналогов природных полиаминов, включая антипролиферативные свойства у 6-ти соединений на разработанной биотест-системе, использующей быстро пролиферирующие клетки рака простаты.

При протеомном анализе белков из клеток РС-3 проведена масс-спектрометрическая идентификация 52 белковых фракций в результате чего расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая предназначена для оптимизации поисков белковых биомаркеров этого заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Из 13 новых синтетических аналогов полиаминов три соединения (1 -аминоокси-3 -аминопропан, 8-(5 '-дезоксиаденозил)-8-метил-Р-тио-этилгидроксиламин, этилендиамин) обладают наибольшими биоэффектами в бесклеточной тест-системе.

2. В модельных условиях (на культивируемых Ь-клетках) 1-аминоокси-3-аминопропан и 5'-дезоксиаденозил-5'-метилтиоэтил-гидроксиламин показали себя как антипролиферативные агенты.

3. С помощью биотест-системы на основе быстро пролиферирующих клеток человека определены биологические эффекты ДФМО и МГБГ, а также 4-х новых синтетических дифенил-содержащих аминов (ДФСА 14).

4. Показано, что ДФСА-1 является наиболее перспективным цитоток-сическим агентов, поскольку для него выявлено наиболее выраженное антипролиферативное действие.

5. Протеомный анализа белков клеток РС-3 выявил два новых («безымянных») белка человека и позволил расширить информационный модуль «Белки РС-3» в базе данных «Протеомика рака простаты».

6. Показано, что у этнических русских сайт в гене SAT1 (rs61748925) и сайт в гене PA OX (rs 1139915) являются мономорфными, т.е. они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; а для сайта rs 11072170 в гене FMN1 существует полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на международных, российских конференциях и на научных съездах, в том числе: XVIII Межд. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2010. Украина, Ялта-Гурзуф; Intern, polyamine confer., 2010, Gotemba, Japan; I Межд. научно-практ. конф. «Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы», 2010, Москва; Intern. Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012 и др.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых профильных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 14 тезисов докладов на отечественных и международных научных конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (289 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов). Работа содержит 10 таблиц и 39 рисунков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалами для исследований служили линии культивируемых клеток рака предстательной железы (РПЖ) человека (LNCaP, РС-3), линия гепатомы человека Г-27, и L-клетки крыс.

Бесклеточные тест-системы получали из образцов регенерирующей печени здоровых крыс, а также из пролиферирующей ткани гепатомы крыс линии Г27. В полученных образцах определяли активности ОДК и уровень полиаминов методом ВЭЖХ на аппарате AKTABASIC 10 HPLC (Amersham Pharmacia Biotech., Milan, Италия). Для расчета удельных активностей орнитиндекарбоксилазы (ОДК), выраженных в нанокаталах на миллиграмм белка, определяли концентрации белка в каждой пробе ткани гепатомы Г-27. Определение проводили по фармакопейному методу [Государственная Фармакопея СССР, XI, 1998] по Лоури (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981).

В работе проводили исследование биологических эффектов 13

новых синтетических аналогов полиаминов (а-дифторметил-орнитин (ДМФО), метилглиоксальбис-(гуанилгидразон) (МГБГ), 1-аминоокси-3-аминопропан, I, 1,2-диаминооксиэтан, II, S-(5-дезоксиаденозил)-8-тиоэтилгидроксиламин, III, 8-(5-дезокси-аденозил)-8-метил-р-тиоэтилгидроксиламин, IV, Этилендиамин, V, 1,3-диаминопропан, VI, 1,5-диамино-З-азапентан, VII, 1,9-диамино-3,7-диазанонан, IX, 2-хлоро-Ы-[(32)-3-гидразинилиден-3-фенилпропил]анилин, ДФСА-1, 1-фенил-3-{[3-(трифтор-метил)-фенил]амино}пропан-1 -он, ДФСА-2, 3-[(2-фторфенил) амино]-1-фенилпропан-1 -он, ДФСА-3, 3-[(4-метилфенил)амино]-1-фенилпропан-1-он, ДФСА-4).

Оценку пролиферативной активности веществ на клетках определяли с помощью набора WST-1 фирмы «Millipore» (США) по прописям фир-

мы-изготовителя. Количество метаболически активных клеток в пробах коррелировало с концентрацией формазана, которую измеряли спек-трофотометрически с использованием планшетного ридера при 500 нм.

Для определения цитотоксического действия исследуемых веществ использовали флуоресцентный автоматизированный планшетный ридер CellReporter™ (Genetix/Molecular Devices, Англия). Определение цитотоксического эффекта проводили на основании количественного соотношения популяций живых и мертвых клеток в каждой лунке анализируемого планшета. С этой целью в каждую лунку планшета добавляли красители DAPI, и йодистый пропидий (окрашивает только мертвые клетки), по протоколам, рекомендуемым производителем.

Фракционирование белков проводили двумерным электрофорезом по О'Фарреллу в модификации [Kovalyov L.I. et al. 1995]. Детекция белков на гелевых пластинах осуществляли Кумасси голубым R-250, азотнокислым серебром и красителем Sypro Ruby.

Для идентификации белковых фракций обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов выполняли по протоколам «Центра протеомных исследований» при Институте биомедицинской химии РАМН [Говорун В.М. с соавт. 2003]. Идентификацию белков проводилась с помощью MALDI-TOF MS , а также в отдельных случаях с помощью MALDI-TOF MS/MS.

Материалами для ДНК-исследований служили образцы венозной крови жителей России - пациентов с РП (п=79) и здоровых мужчин (п=36), охарактеризованных как этнические русские. Препараты ДНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) в модификации метода выщеп-ления 5' концевой метки проводили в приборе фирмы «Applera» (США), модель 7300, используя наборы реактивов - SNP Genotyping Assay Mix (каталожные номера С_8339558_10, С_25966232_20, С_1895217_10), а также набор TaqMan Universal PCR Master Mix.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Биотест-системы на основе тканей и культивируемых клеток животных

Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фракцию (20 ООО g х 20 мин при 4°С) 33% -го гомогената регенерирующей печени или ткани гепатомы белых беспородных крыс - самцов массой 100 - 130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде, с добавлением необходимых компонентов для проявления активности ОДК. Количество белка в пробах исследуемых тканей определяли по методу Лоури.

Первую группу исследуемых веществ составили оксиамино аналоги декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина. Вторую группу сформировали из алифатических гомологов путресцина (Пут), спермидина (Сд) и спермина (См).

Эффективность антипролиферативного действия соединений оценивали по степени торможения синтеза ПА, а также по величине суммарного пула ПА (£ПА) и коэффициента молярного отношения спермидина к спермину (Сд/См), который положительно коррелирует со скоростью пролиферации как нормальной, так и опухолевой ткани [Morgan DM, 1999], после одного часа инкубации. Результаты этих исследований представлены в Таблице. 1.

В первой группе тестируемых веществ наиболее активными оказались соединения I и IV. Они не уступали по эффективности действия, а по некоторым показателям даже превосходили ДФМО и МГБГ (Табл. 1).

Соединения второй группы ингибировали синтез ПА в обеих системах с разной степенью эффективности. Но этилендиамин (V) проявил сильные антипролиферативные свойства по всем выбранным показателям (Сд/См, ХПА и уровень Сд), в особенности по отношению к опухолевой ткани.

Таблица. 1. Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксили-рования орнитина и Б-аденозилметионина в бесклеточной тест-системе

В-во одк Эффект в% Синтез спермидина Эффект в% Синтез спермина Эффект в%

Бесклеточная тест-система из регенерирующей печени крыс

- 2.7±0.1 0 1.2910.04 0 0.48+0.01 0

ДФМО 1.7±0.Г 37 0.87+0.02* 33 0.21+0.01* 56

МГБГ 2.710.1 0 0.910.02" 26 0.31+0.01* 35

I 1.110.Г 59 0.57+0.01' 56 0.110.01' 79

IV 1.7+0. Г 37 0.6310.02' 51 0.2610.07' 46

V 2.3+0.1" 15 0.9810.02" 24 0.3210.09 33

Бесклеточная тест-система из гепатомы Г-27 крыс

- 2.6+0.2 0 1.110.04 0 0.4+0.01 0

ДФМО 2.0±0.1' 23 1.110.1 0 0.2+0.01' 50

МГБГ 2.7+0.2 4 0.97+0.02" 22 0.35+0.02* 25

I 2.010.1" 23 1.210.04 +9' 0.3510.02* 25

IV 1.51.01" 42 0.810.01" 27 0.410.01' 0

V 1.610.1" 38 0.45+0.01* 59 0.210.03' 50

Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка. Результаты даны в виде М+т для 6 параллельных измерений. * - достоверные отличия от контроля, Р<0.05. а - знак "+ " обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПЛ.

Сравнительный анализ степени эффективности двух групп тестируемых соединений, проведенный на двух модельных бесклеточных системах с различными биологическими, но с одинаково высокими пролифе-ративными свойствами, показал, что потенциально сильные антипроли-феративные агенты должны одновременно существенно снижать ЕПА, отношение Сд/См и уровень Сд до критического значения (70%). Из числа исследуемых соединений этим требованиям удовлетворяют 1-аминоокси-3-аминопропан (АПА), 8-(5'-дезоксиаденозил)-8-метил-Р-тиоэтилгидроксиламин (АПА) и этилендиамин.

В дальнейшем характер действия АПА и AMA был изучен на L-клетках. Эти вещества индивидуально и в сочетании одного с другим показали эффект, сходный с ДФМО и МГБГ, но менее выраженный.

Данные, полученные на бесклеточных тест-системах и на культурах клеток, указывают на перспективность дальнейших исследований данной группы оксиаминопроизводных как новых потенциальных проти-

воопухолевых веществ.

Биотест-система на основе быстро пролиферирующих клеток человека.

Для тестирования функциональной активности препаратов полиаминов использовались быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека линий ЬМСаР и РС-3.

Оценку пролиферативной активности клеток определяли с помощью набора \VST-1. Адекватность работы данной биотест-системы была проверена с помощью акриламида - маркерного амина, для которого известен выраженный цитотоксический эффект. На данной системе препарат акриламида в концентрациях 300 и 350 мкг/мл после 24 часов инкубации оказывал выраженное цитотоксическое действие на клетки ЬЫСаР, проявляющееся в 2-х и 3-х кратном снижении количества метаболически активных клеток, соответственно.

В дальнейшем эту биотест-систему использовали для определения биологических эффектов, вызываемых двумя известными аналогами полиаминов - ДФМО и МГБГ.

Препарат ДФМО в концентрациях 0,1-200 мкМ после 48 часов инкубации не оказывал выраженного действия на культивируемые клетки рака простаты линий ЬМСаР и РС-3. С другой стороны, для препарата МГБГ выявлен достоверный цитотоксический эффект на данных клеточных линиях в диапазоне концентраций 100-200 мкМ.

На клетках линии РС-3 было проведено тестирование биологических эффектов четырех новых дифенил-содержащих аналогов полиаминов -препаратов ДФСА-1-4. Для проведения тестирования готовили стоковые растворы препаратов с концентрацией 40 мМ на 0,5% растворе ДМСО, стерилизовали в условиях культурального бокса с использованием 0,22 мкм фильтров. Из стерильного стокового раствора на культу-ральной среде ЯРМ1-1640, содержащей 5% ЭТС, готовили растворы с концентрацией 0,1-400 мкМ. *

Рис. 1. А. Биологическое действие препаратов ДФСА-1 и ДФСА-2 на клетки линии РС-3. Б. Биологическое действие препаратов ДФСА-3, ДФСА-4 на клетки линии РС-3. По оси абсцисс - концентрация препарата в мкМоль.

* - достоверные отличия от контроля, Р<0.05 Из представленных данных (рисунок 1А, Б) видно, что препараты ДФСА-1, ДФСА-2 и ДФСА-4 оказываю цитотоксический эффект при концентрации 10 мкМ и выше, в то время как для препарата ДФСА-3 цитотоксическое действие отмечается при концентрации 50 кМ и выше.

Изучение апоптотического действия полиаминов ДФМО и МГБГ также проводилось на клеточном сортере CelIReporter™ с использованием дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток.

Количественный анализ доли мертвых клеток в контрольных лунках и в лунках с добавлением ДФМО показал отсутствие значимых различий, что сопоставимо с данными, полученными при окраске клеток красителем WST-1, в то время как после воздействия МГБГ регистрировалось дозозависимое увеличение доли умерших клеток при концентрациях МГБГ 100 и 200 мкМ.

Сформированная биотест-система пригодна для определения функциональной активности синтетических полиаминов и с использованием наборов WST-1, и с помощью флуоресцентного клеточного ридера CelIReporter™, что позволило использовать ее для изучения 4-х новых синтетических аналогов полиаминов.

Протеомный анализ клеток линии РС-3 и изучение биологических эффектов синтетических аналогов полиаминов.

Учитывая полученные данных о способности изучаемых синтетических аналогов полиаминов ингибировать клеточную пролиферацию, представлялось целесообразным исследовать изменения протеомного профиля клеток рака простаты. На первом этапе данного цикла исследований был проведен протеомный анализ белков в культивируемых клетках линии РС-3. Типичная двумерная электрофореграмма (ДЭ) суммарных белков, экстрагированных из клеток линии РС-3, представлена на Рис. 2.

Как видно из этих данных, на ДЭ суммарных белков, экстрагированных из клеток линии РС-3, удавалось регистрировать более 500 белковых фракций при окраске нитратом серебра. Основные из них обладали Мм в диапазоне 170 - 11 кДа и pi от 4,5 до 11,5. С помощью масс-спектрометрических методов (MALDI-TOF MS и MS/MS) удалось идентифицировать 52 белковые фракции.

Среди идентифицированных белков, в первую очередь, надо отметить № 18, который оказался фактически новым белком человека, поскольку

для него ранее был обнаружен только соответствующий транскрипт. Сведения об этом транскрипте, присутствующем в матке, трижды представили японские исследователи по результатам изучения cDNA [запись 193783699 Protein NCBI; прямое представление - KawakamiB. et al. и Isogai Т. and Yamamoto J.)].

Вероятный продукт, который может образоваться при считывании информации с указанного транскрипта, включен в базу данных Protein NCBI под названием «неназванный белковый продукт» (unnamed protein product). Анализ его предполагаемой аминокислотной последовательности выявил сходство с митохондриальной аспартатаминотрансферазой (ген - GOT2), что дало основание предполагать принадлежность этого «неназванного белкового продукта» к семейству аминотрансфераз.

Среди идентифицированных белков оказалась также дисульфид изо-мераза белков или ER-протеаза, которая ранее была включена в перечень потенциальных биомаркеров РП [Шишкин С.С. с соавт. 2010].

В целом, полученные результаты протеомного анализа суммарных белковых экстрактов из клеток линии РС-3 были использованы для расширения информационного модуля «Белки РС-3» в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая размещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, зарегистрирована в Государственном реестре баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012) и доступна для пользователей сети «Интернет» (адрес: ef.inbi.ras.ru).

Эти результаты стали основой для проведения следующего цикла исследований, направленных на определение изменений протеомного профиля этих клеток после воздействия двумя синтетическими аналогами полиаминов ДФСА-1 и 2.

Рис. 2. Результаты протеомного анализа суммарных белков клеточной линии РС-3. Типичная ДЭ, окрашенная нитратом серебра. Слева показаны белки-маркеры Мм в кДа (набор ) Фиолетовыми стрелками и цифрами обозначены фракции, идентифицированные методами масс-спектрометрии.

В этих экспериментах клетки РС-3 сначала культивировали в пластиковых матрацах в среде RPMI-1620 с 20% ЭТС. По достижении 80% монослоя проводили смену среды на среду с 5% ЭТС, содержащей исследуемые препараты ДФСА-1 или ДФСА-2 в конечных концентрациях 10 мкМ, в которых они обладают цитостатическим эффектом.

После 96 часов инкубации со сменой среды со свежеприготовленными аналогами полиаминов по истечении 48 ч инкубации матрацев клетки отмывали трехкратно холодным фосфатно-солевым буфером и снимали с поверхности культурального пластика скребком для клеток (23 см, Thermo Fisher Scientific, США). Получившуюся клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин (Elmi, Латвия), супернатант удаляли. Осадок количественно (около 40 млн. клеток) переносили в пробирки Эппендорф и замораживали при -20°С.

При сравнении полученных ДЭ белковых экстрактов из клеток, обработанных ДФСА-1, с ДЭ контрольных экстрактов были обнаружены существенные изменения в распределении белков на двух участках, обозначенных А и Б. Для проведения дальнейшего сравнительного анализа с помощью компьютерной денситометрии требовалось выявить на этих участках общие белковые фракции с помощью масс-спектрометрической идентификации ряда белковых фракций, расположенных на выбранных участках.

Важно отметить, что по результатам масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS и MS/MS) один из белков на ДЭ экстрактов из РС-3 клеток, обработанных ДФСА-1, был идентифицирован как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (16552153 Protein NCBI). Из Рис. 3 видно, что, несмотря на сравнительно небольшое «покрытие» предсказанной аминокислотной последовательности выявленными триптическими пептидами (17%), полученный высокий показатель «счёта очков» (Score = 235) позволяет считать проведенную идентификацию вполне достоверной.

Регистрация в базе данных Protein NCBI (№16552153) рассматриваемого «безымянного белка» как представителя семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом состоялась по материалам изуче-

ния кДНК, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови [Isogai Т. et al. 24-ОСТ-2001].

{££?£?/£/ MASCOT Search Results Protein View: gi| 16552153

unnamed protein product [Homo sapiens]

Database: NCBtnr

Score: 235

Expect: 7.8e-19

Nominal mass (Mr): 62439 Calculated pi: 9.43

Taxonomy: flomo sapten;

yuery start - End Observed

¿21 213 - 235 M9«.0£23

¿3 331 - 358 1431.7425

Л7 337 - 354 2072.0942

¿4 355 - 368 Ш0.6791

til 363 - 37? 1022.455«

<7 36$ - 333 1684.8114

¿1 416 - «30 1223.55«

ЛЗ 517 - 53S 1963.9675

Рис. 3. Результаты масс-спектрометрического анализа белковой фракции №8 на ДЭ экстрактов из РС-3 клеток, обработанных ДФСА-1, и её идентифицкации с помощью программы Mascot как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (16552153 Protein NCBI).

рргс Н Score Peptide

5.11 о us кдемаеткдажжза.з matta к 8.37 О К.ТОвВ&ШГСМС.Е + OjMitisi М

4.721 &.идаюипшимк.е • ышъ* » {.57 о к.сшаухшгряжд

I.20 0 K.MVESSXX.B 8.80 1 76 К.АШШ>3!ФГ®ЙХ.1

-1Л6 о х.южв««маи1*м№я w

II.5 3 K,SffiSe»!BISGS6WFKKR.3 + fttitei« И

Hr(expt) Kr(ralc)

249S.C553 2495.0406

1430.7348 1430.7228

«71.0870 2071.3772

1443,6719 1449.6624

1021.4881 1021.4869

1683.8041 1683.7833

1322.5432 1222.5513

1М2.И03 1962.3377

Protein sequence coverage: 17%

Matched peptides shown in hi>klrai.

1 HSSTDYSTYS

51 SYTQiamr

101 TTSTiTTTQA

151 SYSQQKIYGQ

201 QSS5YGQQSS

251 FDRGGHSRGG

301 DSBHSAIYVQ

351 GliPKGDATVS

401 GLPPREGRGK

451 GHPSGGGHVg

501 PPPGGDRGRG

QAAAQQGYSA YGQTAYATSY SYftAQSSYGT PSSYG2QGSY

551 RGGFGGGRRG

BGGGRGGKGS GLHDSVTLDD ИЮРРТЛКМ. PPPLROGPCa BS4GOTQCPN GPGaiRgSG GPGGPPGPUl

YTAQPTQGYa GQPPTGYTIP QPAYPiYGQQ GQQSSYGQQP

VKSESOTS AGEHGGR1KP LfiDFFKQCGV

VEWFDGRDFQ POSPGQHBR

PGCGNGHFMJ

gueroseoc

EQWGGRRGGR

OTTOAYGOaS TbPQAYSQPV PAATAPTSYS PISYPPgiGS GPGEHRSHSG GGIKDEGPDL VKMHXRTQ^ CSKLKVSL8R MGGKGGDRGG RTEOIQCKAP

mfrsc&ggdr

GGPGXMDKGE

YGTYGQPTDV QGYCTGAYDT STQPTSYDQS YSQRPS3YSQ PDHRGRGRGG DLGPEVDPDE НШШЛВ EKPPHNSMRG FPPRGPRGSH KPEGFLPPPF GGFRGGP.aiD HRQESRDRPY

А- Итоговое сообщение программы; Б — триптические пептиды, выявленные при МАЬП1-ТОР МЭ анализе; В — предсказанная последовательность «безымянного белка», на которой красным цветом выделены выявленные триптические пептиды, синей линией подчеркнуты некоторые пролнн (Р) и глицин (в) -богатые участки

Таким образом, полученные результаты протеомного исследования клеток РС-3 являются первой прямой регистрацией человека белка с указанными свойствами, которые подтверждают сделанное ранее предположение японских авторов по материалам изучения кДНК.

Рис. 4. Результаты сравнительного протеомного анализа фрагментов Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток без воздействия (контроль) и белковых экстрактов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и ДФСА-2. Справа изображения ДЭ, слева трехмерные модели, построенные с помощью программы ImageMaster 2D Platinum 7.0 (фирма «Genebio», Швейцария). Синими стрелками и символами показаны основные реперные белки (SFPQ -фактор сплайсинга, содержащий пролин-глутаминовый тракт; РАВР - поли(А)-связывающий цитоплазматический белок 1; зелеными стрелкам и символами SNW - SNW домен содержащий белок 1, количественно увеличившиеся под действием ДФСА-2; фиолетовыми стрелками - белки №8 и 9, появившиеся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2. Пунктирными овалами (фиолетового цвета) выделены области на контрольной ДЭ, где отсутствуют белковые фракции, индуцируемые ДФСА-1 и ДФСА-2.

В целом, сравнительный протеомный анализ указанных фрагментов А и Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток, не подвергавшихся воздейст-

вию синтетическими аналогами полиаминов (контроль) и белковых экстрактов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и 2, пока зал несколько специфичных изменений в белковых профилях, вызванных этими соединениями.

Во-первых, ДФСА-1, обладающий значимым цитостатическим эффектом при концентрации 10 мкМ, существенно индуцировал синтез винкулина, тогда как ДФСА-2 в той же концентрации с небольшим цитостатическим действием) не оказывал влияния на содержание винкулина. Во-вторых, под действием ДФСА-1 в клетках РС-3 появлялась дополнительная белковая фракция, которая была идентифицирована как АТФ-аза транзита эндоплазматического ретикулума. В-третьих, этот синтетический аналог полиаминов приводил к исчезновению неиденти-фицированного белка, располагавшегося между HSPD1 и HSPA9 на контрольных ДЭ. При этом белок с близкими электрофоретическими свойствам выявлялся после воздействия ДФСА-2. На фрагментах Б под действием ДФСА-1 (а также и ДФСА-2) появлялись два дополнительных по сравнению с контролем белка №8 и 9 (Рис. 4). ДФСА-2 обладал более выраженным индуцирующим эффектом в отношении белков №8 и 9. Кроме того, регистрировалось количественное увеличение ещё одной фракции, идентифицированный как SNW домен содержащий белок 1. Интересно то, что все три изменяющиеся белковые фракции, которые удалось идентифицировать на фрагментах Б, связаны (или могут быть связаны) с процессами созревания мРНК, включая сплайсинг. Тем самым эти данные позволяют думать, что ДФСА-1 и ДФСА-2 способны влиять на биосинтез белков.

По результатам модельных экспериментов и протеомного анализа белков клеток РС-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2.

Изучение полиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 в выборке пациентов с раком простаты и у здоровых россиян.

Изучение однонуклеотидных замен в трех генах - SAT 1 и РАОХ, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов (сперми-дин/спермин N-ацетилтрансферазу и полиаминоксидазу, соответствен-

но) и FMN1, кодирующего формин 1, проводили методом дискриминации аллелей на амплификаторе в реальном времени фирмы Applied Biosystems RT-PCR 7300 с использованием наборов TaqMan (С_25966232_20, С_8339558_10, С_16193337_10) и набора для амплификации TaqMan Universal PCR Master Mix, No Am-pEraseUNG.

Проведенное исследование, охватившее более ста лиц (т.е. более 200 соответствующих генов) показало, что в изученных выборках в сайте rs61748925 присутствовал только аллель G, а в сайте rsl 139915 только аллель Т. Было установлено, что у этнических русских сайты rs61748925 SAT1 и rsl 139915 РАОХ являются мономорфными и не пригодны для изучения ассоциаций с РП. В отличие от этого для сайта rsl 1072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными. Соответственно, полиморфный сайт rsl 1072170 представляется перспективным для изучения у русских возможных ассоциаций его аллелей с РП.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние на общий пул природных полиаминов, на соотношение спермидина к спермину и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы у ряда синтетических аналогов полиаминов: ДФМО, МГБГ, о-замещенных гидроксиламинов и алифатических гомологов природных полиаминов. Показано, что соединения 1-аминоокси-З-аминопропан, Б-(5'-дезоксиаденозил)-8-метил-Р-тиоэтилгидроксиламин и этилендиамин обладают максимальным эффектом по изучавшимся критериям.

2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) О-замещенные производные гидроксиламины (1-аминоокси-З-аминопропан и 5'-дезоксиаденозил-5'-метилтиоэтилгидроксиламин) показали себя как антипролиферативные агенты.

3. Разработана биотест-система на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека (биотест-объекты - клетки LNCaP и

РС-3; метод тестирования — витальная система регистрации количества клеток). С её помощью определены биологические эффекты, вызываемые двумя известными синтетическими полиаминами (ДФМО и МГБГ) и четырьмя новыми синтетическими дифенил-содержащими аминами (ДФСА 1-4).

4. Наиболее выраженное антипролиферативное действие выявлено у ДФСА-1 (80% ингибирование роста клеток при 10 мкМ концентрации), тогда как ДФМО (в диапазоне концентраций 10-400 мкМ) не проявлял функциональной активности, а у МГБГ был зарегистрирован цитотокси-ческий эффект только в концентрациях 200-400 мкМ, что позволяет рассматривать ДФСА-1 как наиболее перспективный цитотоксический агент.

5. По результатам протеомного анализа белков клеток РС-3:

а) выявлено два новых («безымянных») белка человека; б) определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2; в) расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты».

6. По результатам изучения полиморфизма (однонуклеотидных замен) установлено, что у этнических русских сайты геб 1748925 БАТ1 и гб1139915 РА ОХ являются мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта гэ11072170 в гене РМЫ1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю в, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и№ 2.1.1./ 11377 «Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как системы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)"

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Сокуева Н.А., Устинова Е.В,, Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов полиаминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость синтеза полиаминов в тест-системах из тканей с повышенной пролиферацией // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. - 2010. - № 3, С. 9-14.

2. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я. Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Сокуева Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на рост L-клеток в культуре ткани // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. - 2010. - № 4, С. 26-31.

3. Сяткин С.П., Неборак Е.В., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Левов А.Н., Р.И., Сокуева Н.А. Прогнозирование антипролиферативных свойств производных анилинового ряда диоксаборининопиридина путем оценки их влияния на скорость окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии,, 2011. - №10, С. 53-56.

Другие печатные материалы:

4. Сяткин С.П., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Неборак К.В., Шевкун Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Прогноз канцерогенных и антипролиферативных свойств производных диоксаборенинопиридина и анилина // Труды XVIII Международной конференции и дискуссиионного научного клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. ТОМ 1.1Т + М&Ес'20Ю. Украина, Ялта-Гурзуф, с 31 мая по 9 июня 2010 года.

5. Syatkin, S.P., Fedoronchuk, T.V., Gridina. N.Ya., Neborakh, E.A., Shevkhun, N.A., Sokueva, N.A., Ustinova, E.V., Sokuev, R.I. The influence of chemical polyamines analogues, decarboxylated ornithine and S-(adenosyl)-methionine on the polyamine synthesis velocity in test-systems from tissues with high proliferation // International polyamine conference. Gotemba, Shizuoka, Japan, June 14 - June 18, 2010. P. 102103.

6. Syatkin S, Shevkun N, Fedorontchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Ustinova E. Activators of polyamine oxidative deamination as the potential antitumor agents // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. P. 213-214

7. Syatkin S, Shevkun N, Levov A, Golomazova K, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Fedorontchuk T, Ustinova E. Prediction of carcinogenic and antiproliferative properties of benzimidazole, azofluorene, dioxaboreninopyridine and aniline derivatives by their effects on the polyamine oxidative deamination // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. P. 209-210

8. Shevkun N., Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Golomazova K, Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the aminooxidases in vitro // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 53.

9. Shevkun N, Fedoronchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R. Targeting poly-amine catabolism in malignant hepatic tissue // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 54.

10. Сяткин С.П., Федорончук T.B., Шевкун H.A., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Со-куева Н.А. Противоопухолевая активность активаторов окислительного дезами-нирования полиаминов. // XX Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 5-15 июня 2012 г. - с. 98-99.

11. Syatkin S., Neborak Е., Shevkun N., Sokueva N., Sokuev R., Golomazova K., Fedoronchuk T. Screening of n-heterocyclic compounds and aniline derivatives fro their effects on the amine oxidases in vitro as useful tools for prediction of carcinogenic and antiproliferative activity // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012. - P. 34.

12. Syatkin S., Fedoronchuk Т., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Shevkun N. Antitumor activity of activators of polyamine oxidative deamination during hepatocar-cinogenesis // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012. Abstract book. - p. 225 - 226.

13. Сяткин С.П., Федорончук T.B., Шевкун H.A., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Со-куева Н.А. Противопухолевая активность активаторов окислительного дезами-нирования полиаминов // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2012. С. 19.

14. Шевкун Н., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р., Голомазова К., Федорончук Т. Скрининг N-гетероциклических и анилиновых производных по влиянию на ами-нооксидазы in vitro. // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной конференции. 18-21 апреля 2012 г., РУДН, Москва. - М.: РУДН. 2012. - С. 57-58.

15. Шевкун Н., Федорончук Т., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р. Катаболизм полиаминов при карциногенезе печени как мишень для поиска новых противораковых соединений // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной конференции. 18-21 апреля 2012 г., РУДН, Москва.-М.: РУДН. 2012.-58-59 сс.

16. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Активаторы окислительного дезаминирования как потенциальные противоопухолевые агенты // Scientific and educational journal: Материалы конференции «Health and education millenium»: 2012. РУДН. Москва. - M.: РУДН. 2012.-Т. 14 [2]. С. 58.

17. Сокуева Н.А., Крахмалева И.Н., Лисицкая К.В., Шишкин С.С. Изучение полиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 // Материалы XIV Всемирного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», 2012. РУДН. Москва. - М.: РУДН. 2012. -С. 58.

Сокуева Наталья Александровна

Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах

В данной работе проводилось изучение биологических эффектов ряда синтетических аналогов полиаминов на бесклеточной тест-системе, полученной из регенерирующей печени и клеток гепатомы крыс и на клеточных тест-системах (клетки линий рака простаты РС-3 и 1^ЫСаР). С помощью протеомного анализа было показано влияние 2-х препаратов синтетических аналогов полиаминов на белковый профиль клеток линии РС-3.

Sokueva Natalia Aleksandrovna

The study of cytostatic and other biological effects of some synthetic pol-yamines in model systems

This work is devoted to the study of biological effects of a number of synthetic polyamine analogues on cell-free test systems obtained from regenerating liver and hepatoma cells of rats, as well as on cellular test systems (the cells of prostate cancer cell lines PC-3 and LNCaP). The influence of two preparations of synthetic polyamine analogues on the protein profile of PC-3 cells was studied using proteomic analysis.

Подписано в печать 14.11.12. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,5. Заказ 1499

Типография Издательства РУДН 115419, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д.З

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сокуева, Наталья Александровна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Основные природные и синтетические полиамины, их свойства и роль в разработках некоторых биомедицинских проблем. (Обзор литературы).

1.1. Общие биохимические характеристики полиаминов

1.2. Общие представления о метаболизме полиаминов у человека и некоторых других млекопитающих

1.3. Главные функции полиаминов у человека и некоторых других млекопитающих; полиамины и рак.

1.3.1. Полиамины в регуляции биосинтеза белков.

1.3.2. Полиамины в функционировании некоторых ионных каналов и рецепторов

1.4. Полиамины при стрессе, старении и некоторых заболеваниях

1.4.1. Полиамины при стрессе

1.4.2. Полиамины при старении

1.4.3. Полиамины при онкологических и некоторых других заболеваниях

1.5. Синтетические полиамины и их некоторые биомедицинские приложения

1.6. Некоторые модели для определения биологической активности синтетических полиаминов.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Биологические материалы и реактивы

2.1.1. Клеточные культуры

2.1.2. Образцы цельной крови

2.1.3. Образцы регенерирующей печени здоровых крыс

2.1.4. Пролиферирующая ткань гепатомы крыс линии Г

2.1.5. Химические соединения - аналоги полиаминов

2.1.6. Реактивы

2.2. Методы выращивания клеточных культур и методики определения пролиферативной активности.

2.3. Оценка пролиферативной активности и цитотоксичности тестируемых веществ «

2.3.1. Оценка цитотоксичности - ХУБТ-тест

2.3.2. Оценка цитотоксичности на флуоресцентном ридере Се11Яерог1ег™

2.4. Количественное определение содержания полиаминов

2.4.1. Экстракция свободных полиаминов

2.4.2. Разделение и количественное определение полиаминов методом ВЭЖХ

2.4.3. Количественное определение белка в бесклеточных тест-структурах

2.5. Цротеомные методы исследования. 2.5.1. Подготовка проб 2.5.2. Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О'Фарреллу 2.5.2.1. Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с градиентом рН, сформированном амфолинами 2.5.2.2. ЗОБ-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля 2.5.3. Детекция белков на гелевых пластинах. Денситометрия двумерных электро-фореграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин 2.5.4. Масс-спектрометрическая идентификация белков 2.6. Методы получения ДНК и формирование ДНК-коллекций 2.7. Методы исследования ДНК-полиморфизма 2.7.1. Метод дискриминации аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (ЯТ-РСЯ) 2.8. Статистическая обработка результатов.

Результаты исследований и их обсуждение

Глава 3. Биотест-системы на основе тканей и культивируемых клеток животных

Глава 4. Биотест-система на основе быстро пролиферирующих клеток человека.

Глава 5. Протеомный анализ клеток линии РС-3 и изучение биологических эффектов синтетических аналогов полиаминов

Глава 6. Изучение полиморфизма генов РАОХ, 8АТ1 и FMЛ7 в выборке пациентов с раком простаты и у здоровых россиян

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах"

Актуальность проблемы.

Природные полиамины (ПА) и их синтетические аналоги изучаются уже не одно десятилетие как биологически активные вещества, способные оказывать существенное влияние на рост и развитие самых разных организмов, регулируя пролиферацию различных клеток, причем последние могут принадлежать и микроорганизмам, и растениям, и животным, включая человека [Wallace Н.М., Niiranen К. 2007; Huang Y., et al. 2009; Carmo A.M., et al. 2011; Marco F.,et al 2011]. Установлено, что полиамины вовлечены в целый ряд важнейших внутриклеточных процессов, например, в обеспечение стресс-устойчивости, регуляцию определенных метаболических реакций, развитие апоптоза [Huang Y. et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Minois N. et al. 2011]. При этом некоторые полиамины нарушают функционирование клеточных геномов на разных уровнях, в частности, отдельные соединения указанного ряда способны достаточно специфично изменять экспрессию генов и влиять на активность ферментов [Huang Y., et al. 2009; Wu Y. et al. 2012]. Естественно, большой интерес вызывают вопросы, связанные с изучением роли полиаминов в регуляции различных молекулярных процессов у человека и возможностей целенаправленного влияния на эти процессы синтетическими полиаминами [Wallace H.M., Niiranen К. 2007; Minois N. et al. 2011; Wu Y. et al. 2012]. В настоящее время практически ежегодно появляются сообщения о создании новых синтетических полиаминов и использовании различных подходов к определению проявлений их биологической активности [Ignatenko N.A. et al. 2009; Carta F. et al. 2010; Yoon Y.J. et al. 2011; Wu Y. et al. 2012]. Как следствие, возниI кают объективные потребности в стандартизации условий для определения и сравнительного анализа цитостатических и других функциональных свойств синтетических аналогов полиаминов в рамках доклинических испытаний.

За последние десятилетия появились убедительные данные, свидетельствующие о том, что природные полиамины и их синтетические аналоги способны целенаправленно влиять на определенные этапы биосинтеза белков. При этом в постгеномном периоде развития биомедицины был опубликован ряд статей, в которых эффективно использовались протеомные технологии для определения конкретных клеточных белков, подвергающихся различным изменениям после воздействий полиаминов [Yohannes Е. et al. 2005; Ignatenko N.A. et al. 2009; Kuo W.L. et al. 2009 и др.]. Таким образом, применение протеомного анализа открывает широкие возможности для получения новых сведений о молекулярных эффектах, которые способны вызывать различные синтетические аналоги полиаминов, а также о потенциальных белках - мишенях.

Наконец, важно отметить, что синтетические аналоги полиаминов могут найти применение как лекарственные средства или попадать в организм человека на стадии клинических испытаний, а также с пищевыми продуктами. При этом прямая экстраполяция в отношении человека данных доклинических исследований, полученных на лабораторных животных, сопряжена с определенными трудностями. Соответственно, представляется весьма актуальным проведение разработок стандартизированных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека, что позволит оптимизировать программы доклинических исследований новых синтетических аналогов полиаминов и уменьшит риск возможных осложнений при последующем изучении.

Цель и задачи исследования.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:

3. Разработать биотест-систему на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека и с её помощью изучить биологические эффекты, ряда синтетических аналогов полиаминов

Научная новизна.

Получены новые данные о влиянии ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ, О-замещенных гидроксиламинов и алифатических гомологов природных полиаминов) на общий пул природных полиаминов, а также на соотношение спермидин / спермин и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы.

Для обеспечения определения цитостатической биологической активности синтетических полиаминов разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека (РС-3 и LNCaP).

С помощью этой биотест-системы охарактеризованы четыре новых синтетических аналога полиаминов дифенил-содержащих амина (ДФСА-1 - ДФСА-4) по их способности подавлять рост опухолевых клеток человека.

По результатам протеомного анализа в клетках линии РС-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2. При этом впервые установлено присутствие в этих клетках двух «безымянных белков» - белка, который зарегистрирован в базе данных Protein NCBI под №193783699 (по данным анализа кДНК из ткани матки, локус BAG53610 в Genbank) и считается родственным аспартат аминотрансфе-разам, а также белка, идентифицированного как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (№16552153 в Protein NCBI).

Впервые установлено, что у этнических русских по результатам изучения полиморфизма (однонуклеотидных замен) сайты rs61748925 SAT1 и rsl 139915 РА ОХ являются мо-номорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта rsl 1072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными. Таким образом, можно считать, что полиморфизм rsl 1072170 в гене FMN1 является перспективным для дальнейшего изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП. I

Научно-практическая значимость.

Апробировано несколько модельных систем для определения биологической активности синтетических аналогов природных полиаминов и разработана биотест-система, позволяющая оценивать цитостатические (цитотоксические) свойства указанных соединений (на клетках LNCaP и РС-3; метод тестирования - витальная система регистрации количества клеток).

При протеомном анализе белков из клеток РС-3 проведена масс-спектрометрическая идентификация 52 белковых фракций, в результате чего расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая предназначена для оптимизации поисков белковых биомаркеров этого заболевания и размещена для свободного доступа в Интернете на странице Института биохимии им. А.Н. Баха.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Из 13 новых синтетических аналогов полиаминов три соединения (1-аминоокси-З-аминопропан, S-(5дезоксиаденозил)-S-метил-(3-тиоэтилгидроксиламин, этилендиамин) обладают наибольшими биоэффектами в бесклеточной тест-системе.

2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) 1-аминоокси-З-аминопропан и 5'-дезоксиаденозил-5'-метилтиоэтил-гидроксиламин показали себя как антипролифера-тивные агенты.

3. С помощью биотест-системы на основе быстро пролиферирующих клеток человека определены биологические эффекты ДФМО и МГБГ, а также 4-х новых синтетических ди-фенил-содержащих аминов (ДФСА 1-4).

4. Показано, что ДФСА-1 является наиболее перспективным цитотоксическим агентом, поскольку для него выявлено наиболее выраженное антипролиферативное действие.

6. Показано, что у этнических русских сайт в гене SAT1 (rs61748925) и сайт в гене РАОХ (rsl 139915) являются мономорфными, т.е. они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; а для сайта rsl 1072170 в гене FMN1 существует полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Апробация работы.

Материалы данной работы докладывались на международных, российских конференциях, а также на научных съездах и конгрессах, в том числе: XVIII Межд. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2010. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф; International polyamine conference, 2010, Gotemba, Japan; i Межд. научно-практической конф. «Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы», 2010, Москва; International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012 Публикации.

Структура и объем диссертации. I

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сокуева, Наталья Александровна

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние на общий пул природных полиаминов, на соотношение спермидина к спермину и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы у ряда синтетических аналогов полиаминов: ДФМО, МГБГ, о-замещенных гидроксиламинов и алифатических гомологов природных полиаминов. Показано, что соединения 1-аминоокси-З-аминопропан, 8-(5'-дезоксиаденозил)-8-метил-Р-тиоэтилгидроксиламин и этилендиамин обладают максимальным эффектом по изучавшимся критериям.

2. В модельных условиях (на культивируемых Ь-клетках) О-замещенные производные гидроксиламины (1-аминоокси-З-аминопропан и 5'-дезоксиаденозил-5'-метилтиоэтил-гидроксиламин) показали себя как антипролиферативные агенты.

3. Разработана биотест-система на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека (биотест-объекты - клетки ЬЫСаР и РС-3; метод тестирования - витальная система регистрации количества клеток). С её помощью определены биологические эффекты, вызываемые двумя известными синтетическими полиаминами (ДФМО и МГБГ) и четырьмя новыми синтетическими дифенил-содержащими аминами (ДФСА 1-4).

4. Наиболее выраженное антипролиферативное действие выявлено у ДФСА-1 (80% инги-бирование роста клеток при 10 мкМ концентрации), тогда как ДФМО (в диапазоне концентраций 10-400 мкМ) не проявлял функциональной активности, а у МГБГ был зарегистрирован цитотоксический эффект только в концентрациях 200-400 мкМ, что позволяет рассматривать ДФСА-1 как наиболее перспективный цитотоксический агент.

5. По результатам протеомного анализа белков клеток РС-3: а) выявлено два новых («безымянных») белка человека; б) определены шесть белков, индуцируемых действием ДФСА-1 и 2; в) расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты».

6. По результатам изучения полиморфизма (однонуклеотидных замен) установлено, что у этнических русских сайты гэб 1748925 БАТ! и гв 1139915 РА ОХ являются мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта 1072170 в гене FM7W удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю в, 27.8% -по аллелю А, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сокуева, Наталья Александровна, Москва

1. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. М.: Мир, 1982,- С. 488.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биохимия. Из-во Медицина, Москва, 1998. С.431-446.

3. Берлинских Н.К., Залеток С.П. Полиамины и опухолевый рост 1987. Твердый переплет. 140 с

4. Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. // Биохимия. 2002. № 67. С. 1341-1359.

5. Гмурман В. Е. Руководство к решению задач по теории вероятностей и математи-; ческой статистике. М.: Высш. школа, 1979. - С. 400.

6. Крахмалева И.Н., Липатова Н.А., Шишкин С.С., Шаховская Н.И. Структура дис-трофинового гена у больных миодистрофией Дюшена. // Журнал неврологии и психиатрии. 1999.- № 99. - С. 41-43.

7. Сяткин С.П. Модифицированный метод определения белка в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов // Вопр. мед. химии. 1981. - Т. 27. - № 1.-С. 136-138.

8. Хомутов А.Р., Хомутов P.M. Синтез аминооксианалогов путресцина и спермиди-на // Биоорг. Химии. 1989. - Т. 15. - №5. - С.698-703.

9. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. (ред.) Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). //М.: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России, 2011. С. 260.

10. Швембергер И.Н. Перевиваемый штамм гепатомы крысы Г-27 // Цитология. 1970. -Т. 12. - С.1057-1059.

11. Alhonen L, Uimari A, Pietilà M, Hyvônen MT, Pirinen E, Keinànen TA. Transgenic an-i imals modelling polyamine metabolism-related diseases. // Essays Biochem. 2009. - V.4.-No. 46. P.125-144.

12. Andrews RC. The side effects of antimalarial drugs indicates a polyamine involvement in both schizophrenia and depression. // Med Hypotheses. 1985. - V.15. - No.l. - P.11-18.

13. Auvinen M, Paasinen A, Andersson LC, Holttá E. Ornithine decarboxylase activity is 1 critical for cell transformation. // Nature. 1992. - V.360. - P.355-358.

14. Bachrach U. The early history of polyamine research. // Plant Physiol Biochem. 2010. -V.48. - No.7. - P.490-495.

15. Bale S, Ealick SE. Structural biology of S-adenosylmethionine decarboxylase. // Amino Acids. 2010. - V.38. - No.2. - P.451-460.

16. Basu, H. S., Smirnov, I. V., Peng, H. F., Tiffany, K., and Jackson, V. (1997) Effects of spermine and its cytotoxic analogs on nucleosome formation on topologically stressed DNA in vitro. // Eur. J. Biochem. 1997. - V.243. - P.247-258.

17. Basuroy U.K., Gerner E.W. Emerging concepts in targeting the polyamine metabolic pathway in epithelial cancer chemoprevention and chemotherapy. // J Biochem. 2006. -V.139. - No. 1. -P.:27-33.

18. Becker M, Misselwitz R, Damaschun H, Damaschun G, Zirwer D. Spermine-DNA complexes build up metastable structures. Small-angle X-ray scattering and circular dichroism studies. // Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. - No.5. - P. 1297-1309.

19. Beninati S, Folk JE. Covalent polyamine-protein conjugates: analysis and distribution. // ' Adv Exp Med Biol. 1988. - V.;250. - P.411-22.

20. Berdinskikh NK, Lialiushko NM. Polyamine concentrations in the liver and kidney tissues of rats of different ages. // Ukr Biokhim Zh. 1979. - V.51. - No.l. - P.73-75.

21. Bergeron RJ, Feng Y, Weimar WR, McManis JS, Dimova H, Porter C, Raisler B, Phanstiel O. A comparison of structure-activity relationships between spermidine and spermine analogue antineoplastics. // J Med Chem. 1997. - V.40. - No. 10. - P. 14751494.

22. Bergeron RJ, Neims AH, McManis JS, Hawthorne TR, Vinson JR, Bortell R, Ingeno MJ. Synthetic polyamine analogues as antineoplastics. // J Med Chem. 1988. - V.31. - No.6. - P.l 183-1190.

23. Bergeron R.J., Wiegand J., Fannin T.L. Control of irritable bowel syndrome with polyamine analogs: a structure-activity study. // Dig Dis Sci. 2001. - V.46. - No. 12. -P.2615-2623.

24. Bhattacharya S, Ray RM, Johnson LR. Role of polyamines in p53-dependent apoptosis of intestinal epithelial cells. // Cell Signal. 2009. - V.4. - P.509-522.

25. Blum H., Beir H., Cross H.G. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. // Electrophoresis. 1987. - V. 8. - P.126-129.

26. Brunton V.G., Grant M.H., Wallace H.M. Mechanisms of spermine toxicity in babyhamster kidney (BHK) cells. The role of amine oxidases and oxidative stress. // Biochem. J. 1991.-V.280.-P. 193-198.

27. Buga G.M., Wei L.H., Bauer P.M., Fukuto J.M., Ignarro L.J. NG-hydroxy-L-arginine and nitric oxide inhibit Caco-2 tumor cell proliferation by distinct mechanisms. // Am J Physiol. 1998. - V.275. - P. 1256-1264.

28. Cai J, Mao Z, Hwang JJ, Lu SC. Differential expression of methionine adenosyltransferase genes influences the rate of growth of human hepatocellular carcinoma cells. // Cancer Res. 1998. - V.7. - No.58. - P. 1444-1450.

29. Canellakis ES, Viceps-Madore D, Kyriakidis DA, Heller JS. The regulation and function of ornithine decarboxylase and of the polyamines. // Curr Top Cell Regul. 1979. - V.15. - P.155-202.

30. Canellakis ZN, Marsh LL, Bondy PK. Polyamines and their derivatives as modulators in growth and differentiation. // Yale J Biol Med. 1989. - V. 62. - No.5. - P.481-491.

31. Carew JS, Nawrocki ST, Reddy VK, Bush D, Rehg JE, Goodwin A, Houghton JA, Casero RA Jr, Marton LJ, Cleveland JL. The novel polyamine analogue CGC-11093 enhances the antimyeloma activity of bortezomib. // Cancer Res. 2008. - V.68. - No.12. -P.4783-4790.

32. Carta F, Temperini C, Innocenti A, Scozzafava A, Kaila K, Supuran CT. Polyamines inhibit carbonic anhydrases by anchoring to the zinc-coordinated water molecule. // J Med Chem. 2010. -V. 53. No.15. - P.5511-5522.

33. Casero RA Jr, Marton LJ. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. // Nat Rev Drug Discov. 2007. - V.6. - No.5. - P.373-390.

34. Casero RA, Pegg AE. Polyamine catabolism and disease. // Biochem J. 2009. - V.421. -No.3. -P.323-338.

35. Casero RA Jr, Woster PM. Recent advances in the development of polyamine analogues as antitumor agents. // J Med Chem. 2009. - V.52. - No.15. - P.4551-4573.

36. Casero RA Jr, Woster PM. Terminally alkylated polyamine analogues as chemotherapeu-tic agents. // J Med Chem. 2001. - V.44. - No.l. - P. 1-26.

37. Cechetto JD, Sadacharan SK, Berk PD, Gupta RS. Immunogold localization of mitochondrial aspartate aminotransferase in mitochondria and on the cell surface in normal rat tissues. // Histol Histopathol. 2002. - V.17. - No.2. - P.353-364.

38. Chamaillard L, Catros-Quemener V, Delcros JG, Bansard JY, Havouis R, Desury D, Commeurec A, Genetet N, Moulinoux JP. Polyamine deprivation prevents the development of tumour-induced immune suppression. // Br J Cancer. 1997. - V.76. - No.3. -P.365-370.

39. Chang HL, Cheng YJ, Su CK, Chen MC, Chang FH, Lin FG, Liu LF, Yuan SS, Chou MC, Huang CF, Yang CC. Association of estrogen receptor a gene PvuII and Xbal polymorphisms with non-small cell lung cancer. // Oncol Lett. 2012. - V.3. - No.2. - P.462-468.

40. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., and Tabor, H. (2003) Polyamines protect Escherichia coli cells from the toxic effect of oxygen. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. - V.100.- P.2261-2265.

41. Chen B, Calvert AE, Cui H, Nelin LD. Hypoxia promotes human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation through induction of arginase. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009. - V.297(6). - P.l 151-9.

42. Chen KY, Chang ZF. Age dependency of the metabolic conversion of polyamines into amino acids in IMR-90 human embryonic lung diploid fibroblasts. // J Cell Physiol. -1986. V.128(l). - P.27-32.

43. Childs A.C., Mehta D.J., Gerner E.W. Polyamine-dependent gene expression.// Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V.60. - P. 1394-1406

44. Christianson DW. Arginase: structure, mechanism, and physiological role in male and female sexual arousal. // Acc Chem Res. 2005. - V.38(3). - P.191-201.

45. Chrzanowska A, Gajewska B, Baranczyk-Kuzma A. Arginase isoenzymes in human cirrhotic liver. // Acta Biochim Pol. 2009. - V.56(3). - P.465-9.

46. Cipolla BG, Havouis R, Moulinoux JP. Polyamine reduced diet (PRD) nutrition therapy in hormone refractory prostate cancer patients. // Biomed Pharmacother. 2010. -V.64(5). - P.363-368.

47. Cohn U. S., Tabor S. W., Tabor H. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants deficient in S-adenosylmethionine decarboxylase, spermidine, and spermine.// J. Bacterid. 1978. - V.134. - P.208-212.

48. Conroy PD, Simms DM, Pointon JJ. Occurrence of ornithine decarboxylase and polyamines in cartilage. // Biochem J. 1977. - V. 162(2). - P.347-50.

49. Cooper KD, Shukla JB, Rennert OM. Polyamine compartmentalization in various human disease states. // Clin Chim Acta. 1978. - V.82. - No. 1-2. - P. 1-7.

50. Das I, Ramchand CN, Gliddon A, Hirsch SR. Nitric oxide, free radicals and polyamines may have a role in the membrane pathology of schizophrenia. // Neuropsychobiology.1998. V.37. - No.2. - P.65-67.

51. Davidson NE, Hahm HA, McCloskey DE, Woster PM, Casero RA Jr. Clinical aspects of cell death in breast cancer: the polyamine pathway as a new target for treatment. // Endocr Relat Cancer. 1999. - V.6. - No.l. - P.69-73.

52. Di Costanzo L, Pique ME, Christianson DW. Crystal structure of human arginase I complexed with thiosemicarbazide reveals an unusual thiocarbonyl mu-sulfide ligand in the binuclear manganese cluster. // J Am Chem Soc. 2007. - V.129(20). - P.6388-9.

53. Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF. The glutamate receptor ion channels. // Pharmacol Rev. 1999. - V.51. - No.l. - P.7-61.

54. Ducros V., Ruffieux D., Belva-Besnet H., de Fraipont F. Framois Berger c, Alain Favier. Determination of dansylated polyamines in red blood cells by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.// Analytical Biochemistry. 2009. V.390. - P. 46-51.

55. Dudley H.W., Rosenheim O., Starling W.W. The Constitution and Synthesis of Spermidine, a Newly Discovered Base Isolated from Animal Tissues. // Biochem J. -1927. -V.21. No.l. -P.97-103.

56. Durante W., Johnson F.K., Johnson R.A. Arginase: a critical regulator of nitric oxide synthesis and vascular function. // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007. V.34. - P.906-911.

57. Durie BG, Salmon SE, Russell DH. Polyamines as markers of response and disease activity in cancer chemotherapy. // Cancer Res. 1977. - V.37. - No.l. - P.214-221.

58. Dvorak HF, Weaver VM, Tlsty TD, Bergers G. Tumor microenvironment and progression. // J Surg Oncol. 2011. - V. 103. - No.6. - P.468-474.

59. Edwards ML, Prakash NJ, Stemerick DM, Sunkara SP, Bitonti AJ, Davis GF, Dumont JA, Bey P. Polyamine analogues with antitumor activity. // J Med Chem. 1990. - V.33. -No.5. - P.1369-1375.

60. Eloranta T.O., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Hyvönen T. Aminooxy analogues of spermidine as inhibitors of spermine synthase and substrates of hepatic polyamine acety-lating activity. // J Biochem. 1990. - V.108. - No.4. - P.593-598.

61. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major peptides ot the erythrocyte membrane. // Biochemystry. 1971. - V. 10. - P.2607-2617.

62. Federico M, Bagella L. Histone deacetylase inhibitors in the treatment of hematological malignancies and solid tumors. // J Biomed Biotechnol. 2011. - P.475641.

63. Feuerstein BG, Deen DF, Marton LJ. Effects of dicyclohexylamine sulfate, a spermidine synthase inhibitor, in 9L rat brain tumor cells. // Cancer Res. 1985. - V.45. - No. 10. -P.4950-4954.

64. Fiori LM, Turecki G. Implication of the polyamine system in mental disorders. // J Psychiatry Neurosci. 2008. - V.33. - No.2. - P.102-10.

65. Fiori LM, Wanner B, Jomphe V, Croteau J, Vitaro F, Tremblay RE, Bureau A, Turecki G. Association of polyaminergic loci with anxiety, mood disorders, and attempted suicide. // PLoS One. 2010. - V.5. - No.l 1. - P.15146.

66. Fredlund JO, Oredsson SM. Normal Gl/S transition and prolonged S phase within one cell cycle after seeding cells in the presence of an ornithine decarboxylase inhibitor. // Cell Prolif. 1996. - V.8. - P.457-66.

67. Freedlander B.L. French F.A. Carcinostatic action of polycarbonyl compounds and their derivatives. II. Glyoxal bis (guanylhydrazone) and derivatives. // Cancer Res. 1958. -V.3. - P.360-3.

68. Gerner EW, Mamont PS. Restoration of the polyamine contents in rat hepatoma tissue-culture cells after inhibition of polyamine biosynthesis. Relationship with cell proliferation // Eur J Biochem. 1986. - V.156. - No.l. - P.31-5.

69. Gerner EW, Meyskens FL Jr. Polyamines and cancer: old molecules, new understanding. Nat Rev Cancer. 2004. - V.10. - P.781-92.

70. Glatz JF, Luiken JJ, Bonen A. Membrane fatty acid transporters as regulators of lipid metabolism: implications for metabolic disease. // Physiol Rev. 2010. - V.90. - No.l. -P.367-417.

71. Glikman P, Manni A, Demers L, Bartholomew M. Polyamine involvement in the growth of hormone-responsive and -resistant human breast cancer cells in culture. // Cancer Res. 1989 Mar 15;49(6):1371-6.

72. Gomes-Trolin C, Nygren I, Aquilonius SM, Askmark H. Increased red blood cell poly-amines in ALS and Parkinson's disease. // Exp Neurol. 2002. - V.177. - No.2. - P.515-20.

73. Gosslau A, Jao DL, Butler R, Liu AY, Chen KY. Thermal killing of human colon cancer cells is associated with the loss of eukaryotic initiation factor 5A. // J Cell Physiol. -2009. V.219. - No.2. - P.485-93.

74. Guo X, Harada C, Namekata K, Kimura A, Mitamura Y, Yoshida H, Matsumoto Y, Harada T. Spermidine alleviates severity of murine experimental autoimmune encephalomyelitis. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011. - V.12. - P.767-772.

75. Guo D, Lu Z. Interaction mechanisms between polyamines and IRK1 inward rectifier K+ channels. // J Gen Physiol. 2003. - V.122. - No.5. - P.485-500.

76. Ha HC, Woster PM, Casero RA Jr. Unsymmetrically substituted polyamine analogue induces caspase-independent programmed cell death in Bcl-2-overexpressing cells. // Cancer Res. 1998. - V.58(13). - P.2711-4.

77. Ha HC, Woster PM, Casero RA Jr. Unsymmetrically substituted polyamine analogue induces caspase-independent programmed cell death in Bcl-2-overexpressing cells. // Cancer Res. 1998. - V.58(13). - P.2711-4.

78. Ha HC, Woster PM, Yager JD, Casero RA Jr. The role of polyamine catabolism in polyamine analogue-induced programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Oct 14;94(21):11557-62.

79. Hahm HA, Ettinger DS, Bowling K, Hoker B, Chen TL, Zabelina Y, Casero RA Jr. Phase I study of N(1),N(1 l)-diethylnorspermine in patients with non-small cell lung cancer. // Clin Cancer Res. 2002. - V.3. - P.684-90.

80. Harik SI, Sutton CH. Putrescine as a biochemical marker of malignant brain tumors. // Cancer Res. 1979. - V.12. - P.5010-5.

81. He Y, Shimogori T, Kashiwagi K, Shirahata A, Igarashi K. Inhibition of cell growth by combination of alpha-difluoromethylornithine and an inhibitor of spermine synthase. // J Biochem. 1995. - V.4. - P.824-9.

82. Heby O. DNA methylation and polyamines in embryonic development and cancer. // Int J Dev Biol. 1995. - V.39. - No.5. - P.737-57.

83. Herr HW, Kleinert EL, Conti PS, Burchenal JH, Whitmore WF Jr. Effects of alpha-difluoromethylornithine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) on the growth of experimental renal adenocarcinoma in mice. // Cancer Res. 1984. - V.44 . - No. 10,-P.4382-5.

84. Hibshoosh H, Johnson M, Weinstein IB. Effects of overexpression of ornithine decarboxylase (ODC) on growth control and oncogene-induced cell transformation. // Oncogene. 1991. - V.6.-P.739-43.

85. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimantal pathology of liver: restoration of liver of white rat following partial surgical removal // Arch. Path. -1931.-V. 12.-P. 186-202.

86. Huang Y, Keen JC, Hager E, Smith R, Hacker A, Frydman B, Valasinas AL, Reddy VK, Marton LJ, Casero RA Jr, Davidson NE. Regulation of polyamine analogue cytotoxicity by c-Jun in human MDA-MB-435 cancer cells. // Mol Cancer Res. 2004. - V.2. - P.81-8.

87. Huang Y., Marton L.J., Woster P.M., Casero R.A. Polyamine analogues targeting epige-netic gene regulation.// Essays Biochem. 2009. - V.4. - No.46. - P.95-110.

88. Herr HW, Kleinert EL, Conti PS, Burchenal JH, Whitmore WF Jr. Effects of alpha-difluoromethylornithine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) on the growth of experimental renal adenocarcinoma in mice. // Cancer Res. 1984. - V.44. - P.4382-5.

89. Jack DL, Paulsen IT, Saier MH. The amino acid/polyamine/organocation (APC) super-family of transporters specific for amino acids, polyamines and organocations. // Microbiology. -2000. V.146. - P.1797-814.

90. Janne J, Alhonen L, Pietila M, Keinanen TA. Genetic approaches to the cellular functions of polyamines in mammals. // Eur J Biochem. 2004. - V.71. - No.5. - P.877-94.

91. Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray T., Xu J., Smigal C., Thun M.J. Cancer statistics, 2007. // CA Cancer J. Clin. 2007. - V.57. - P.43-.66.

92. Jemal A., Bray F., Center M.M., Ferlay J., Ward E., Forman D. Global cancer statistics. // CA Cancer J. Clin. 2011. - V.61. - P.69-90.

93. Jin HT, Raty S, Minkkinen M, Jarvinen S, Sand J, Alhonen L, Nordback I. Changes in blood polyamine levels in human acute pancreatitis. // Scand J Gastroenterol. 2009. -V.44.-P. 1004-11

94. Jung YS, Kim SJ, Kwon do Y, Kim YC. Metabolomic analysis of sulfur-containing substances and polyamines in regenerating rat liver.//Amino Acids.-2012/ -V.42.-P.2095-02.

95. Kaasinen SK, Oksman M, Alhonen L, Tanila H, Janne J. Spermidine/spermine N1-acetyltransferase overexpression in mice induces hypoactivity and spatial learning impairment. // Pharmacol Biochem Behav. 2004. - V.78. - P.35-45.

96. Kaul D, Wu CL, Adkins CB, Jordan KW, Defeo EM, Habbel P, Peterson RT, McDougal WS, Pohl U, Cheng LL. Assessing prostate cancer growth with mRNA of spermine metabolic enzymes. // Cancer Biol Ther.- 2010. V.9. - P.736-42.

97. Kauppinen RA, Alhonen LI. Transgenic animals as models in the study of the neurobio-logical role of polyamines. // Prog Neurobiol. 1995. - V.47. - No.6. - P.545-63.

98. Kawakita M, Hiramatsu K. Diacetylated derivatives of spermine and spermidine as novel promising tumor markers. // J Biochem. 2006. - V.139. - No.3. - P.315-22.137.138.139.140.141.142.143.144,145146147148149150151152

99. Kingsnorth AN. The chemotherapeutic potential of polyamine antimetabolites. Ann R // Coll Surg Engl. 1986. - V.68. - No.2. - P.76-81.

100. Koike C, Chao D.T., Zetter B.R. Sensitivity to polyamine-induced growth arrest correlates with antizyme induction in prostate carcinoma cells. // Cancer Res. 1999. - V.59. -P.6109-12.

101. Kotb M., Kredich N.M. S-Adenosylmethionine synthetase from human lymphocytes. Purification and characterization. // J Biol Chem. 1985. - V.10. - P.3923-30.

102. Kovalyov L.I., Shishkin S.S., Efimochkin A.S., Kovalyova M.A., Ershova E.S., Egorov T.A., Musalyamov A.K. The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. // Electrophoresis. 1995. - V.16. - P.1160-9

103. Kramer D, Mett H, Evans A, Regenass U, Diegelman P, Porter CW. Stable amplification of the S-adenosylmethionine decarboxylase gene in Chinese hamster ovary cells. // J Biol Chem. 1995. - V.270. - No.5. - P.2124-32.

104. Kusano T, Berberich T, Tateda C, Takahashi Y. Polyamines: essential factors for growth and survival. // Planta. 2008. - V.228. - No.3. - P.367-81.

105. Kuramoto N, Ogita K, Yoneda Y. Gene transcription through Myc family members in eukaryotic cells. // Jpn J Pharmacol. 1999. - V.80. - No.2. - P. 103-9.

106. Li L., Liu L., Rao J.N., Esmaili A., Strauch E.D., Bass B.L., Wang J.Y. JunD stabilization results in inhibition of normal intestinal epithelial cell growth through P21 after polyamine depletion. Gastroenterology. 2002. - V.123. - No.3. - P.764-79.

107. Li J, Doyle KM, Tatlisumak T. Polyamines in the brain: distribution, biological interactions, and their potential therapeutic role in brain ischaemia. // Curr Med Chem. 2007. -V.14. - No.17. - P.1807-13.

108. Linsalata M, Caruso MG, Leo S, Guerra V, D'Attoma B, Di Leo A: Prognostic value of tissue polyamine levels in human colorectal carcinoma. // Anticancer Res. 2002. - V. 22. - P.2465-2469.

109. Levillain O, Havouis R, Moulinoux JP. Polyamines are unevenly distributed within the rat and rabbit kidney. // Amino Acids. 2000. - V.18. - No.2. - P. 129-37.

110. Lowry O.K., Rosebrough N.J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P.265-275.

111. Lu SC, Mato JM. S-Adenosylmethionine in cell growth, apoptosis and liver cancer. // J Gastroenterol Hepatol. 2008. - V.23. - No.l. - P.73-7.

112. Luk GD, Abeloff MD, Griffin CA, Baylin SB. Successful treatment with DL-alpha-difluoromethylornithine in established human small cell variant lung carcinoma implants in athymic mice. // Cancer Res. 1983. - V.43. - No.9. - P.4239-43.

113. Luqman S. Ornithine decarboxylase: a promising and exploratory candidate target for natural products in cancer chemoprevention. // Asian Pac J Cancer Prev. 2012. - V.13. -No.5. - P.2425-7.

114. Makitie LT, Kanerva K, Andersson LC. Ornithine decarboxylase regulates the activity and localization of rhoA via polyamination. // Exp Cell Res. 2009. - V.315. - No.6. -P.1008-14.

115. Mao Y. FORMIN a link between kinetochores and microtubule ends. // Trends Cell Biol. 2011. - V.21. - No.l 1. - P.625-9.

116. Marco F., Alcazar R., Tiburcio A.F., Carrasco P. Interactions between polyamines and . abiotic stress pathway responses unraveled by transcriptome analysis of polyamine overproducers.// OMICS. 2011. - V. 15. - No. 11. - P.775-781.

117. Mato JM, Corrales FJ, Lu SC, Avila MA. S-Adenosylmethionine: a control switch that regulates liver function. // FASEB J. 2002. - V. 16. - No.l. - P. 15-26.

118. Matters G.L., Manni A., Bond J.S. Inhibitors of polyamine biosynthesis decrease the expression of the metalloproteases meprin alpha and MMP-7 in hormone-independent human breast cancer cells. // Clin Exp Metastasis. 2005. - V.22. - No.4. - P.331-9.

119. Matthews H.R. Polyamines, chromatin structure and transcription. // Bioessays. 1993. -V.15. - No.8. - P.561-6.

120. McCloskey D.E., Pegg A.E. Properties of the spermidine/spermine Nl-acetyltransferase mutant L156F that decreases cellular sensitivity to the polyamine analogue N1, N11bis(ethyl)norspermine. // J Biol Chem. 2003. - V.278. - No.16. - P.13881-7.

121. McCloskey DE, Yang J, Woster PM, Davidson NE, Casero RA Jr. Polyamine analogue induction of programmed cell death in human lung tumor cells. // Clin Cancer Res. -1996. V.2. - No.3. - P.441-6.

122. McGrath AP, Hilmer KM, Collyer CA, Shepard EM, Elmore BO, Brown DE, Dooley DM, Guss JM. Structure and inhibition of human diamine oxidase. // Biochemistry. -2009. V.48. - No.41. - P.9810-22.

123. Mechulam A., Chernov K.G., Mucher E., Hamon L., Curmi P.A., Pastre D. Polyamine sharingbetween tubulin dimers favours microtubule nucleation and elongation via facilitated diffusion. // PLoS Comput Biol. 2009. - V.5. - No.l. - P.375-381.

124. Merali S, Clarkson AB Jr. Polyamine content of Pneumocystis carinii and response to the ornithine decarboxylase inhibitor DL-alpha-difluoromethylornithine. // Antimicrob Agents Chemother. 1996. - V.40. - No.4. - P.973-8.

125. Mibu N., Yokomizo K., Uchida W., Takemura S., Zhou J., Aki H., Miyata T., Sumoto K. Molecular symmetry and biological activities of new symmetrical tris(2-aminoethyl)amine derivatives. // Chem Pharm Bull. 2012. - V.60. - No.3. - P.408-14.

126. Minois N., Carmona-Gutierrez D., Madeo F. Polyamines in aging and disease. // Aging. -2011. V.3. - No.8. - P.716-732.

127. Mohapatra S, Cherry S, Minocha R, Majumdar R, Thangavel P, Long S, Minocha SC. The response of high and low polyamine-producing cell lines to aluminum and calcium stress. // Plant Physiol Biochem. 2010. - V.48. - No.7. - P.612-20.

128. Monti MG, Ghiaroni S, Pernecco L, Barbieri D, Marverti G, Franceschi C. Polyamine depletion protects HL-60 cells from 2-deoxy-D-ribose-induced apoptosis. // Life Sci. -1998. V.62. - No.9. - P.799-806.

129. Morris S.M. Arginine metabolism: boundaries of our knowledge. // J Nutr. 2007. -V.137. - No.6. - P.1602S-1609S.

130. Nilsson J, Koskiniemi S, Persson K, Grahn B, Holm I. Polyamines regulate both transcription and translation of the gene encoding ornithine decarboxylase antizyme in mouse. // Eur J Biochem. 1997. - V.250. - No.2. - P.223-31.

131. Nishikawa Y, Kar S, Wiest L, Pegg AE, Carr BI. Inhibition of spermidine synthase gene expression by transforming growth factor-beta 1 in hepatoma cells. // Biochem J. 1997. - V.321. -P.537-43.

132. Nishimura K, Lee SB, Park JH, Park MH. Essential role of eIF5A-l and deoxyhypusine synthase in mouse embryonic development. // Amino Acids. 2012. - V.42. - P.703-10.

133. Nishimura K, Shiina R, Kashiwagi K, Igarashi K. Decrease in polyamines with aging and their ingestion from food and drink. // J Biochem. 2006. - V.139. - No.l. - P.81-90.

134. North ML, Khanna N, Marsden PA, Grasemann H, Scott JA. Functionally important role for arginase 1 in the airway hyperresponsiveness of asthma. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009. - V.296. - No.6. - P.911-20.

135. Palavan-Unsal N, Aloglu-Senturk SM, Arsan D. The function of poliamine metabolism in prostate cancer. // Exp Oncol. 2006. - V.28. - No.3. - P. 178-86.

136. Park MH. The post-translational synthesis of a polyamine-derived amino acid, hypusine, in the eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A). // J Biochem. 2006. - V.139. -No.2. -P.161-9.

137. Pegg AE. Polyamine metabolism and its importance in neoplastic growth and as a target forchemotherapy. // Cancer Res. 1988. - V.48. - P.759-774.

138. Pegg AE. Mammalian polyamine metabolism and function. // IUBMB Life. 2009. -V.61. -No.9. -P.880-94.

139. Pegg AE. Spermidine/spermine-N(l)-acetyltransferase: a key metabolic regulator. // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008. - V.294. - No.6. - P.E995-1010.

140. Pegg A.E. Mammalian polyamine metabolism and function. // IUBMB Life. 2009. -V.61.-No.9.-P.880-94.

141. Pegg AE, Casero RA Jr. Current status of the polyamine research field. // Methods Mol Biol. -2011. -V.720. -P.3-35.

142. Pegg AE, Feith DJ, Fong LY, Coleman CS, O'Brien TG, Shantz LM. Transgenic mouse models for studies of the role of polyamines in normal, hypertrophic and neoplastic growth. // Biochem Soc Trans. 2003. - V.31. - No.2. - P.356-60.

143. Pegg AE, Michael AJ. Spermine synthase.// Cell Mol Life Sci. 2010. - V.67. - No.l. -P.113-21.

144. Peralta Soler A, Gilliard G, Megosh L, George K, O'Brien TG. Polyamines regulate expression of the neoplastic phenotype in mouse skin. // Cancer Res. 1998. - V.15. - No.8.- P.1654-9.

145. Perez-Leal O, Merali S. Regulation of polyamine metabolism by translational control. // Amino Acids. 2012. - V.42. - P.611-7.

146. Persson L. Polyamine homoeostasis. // Essays Biochem. 2009. - V.46. - P. 11-24.

147. Pollack PF, Koldovsky O, Nishioka K. Polyamines in human and rat milk and in infant formulas.// Am J Clin Nutr. 1992. - V.56. - No.2. - P.371-5.

148. Porter CW, Berger FG, Pegg AE, Ganis B, Bergeron RJ. Regulation of ornithine decarboxylase activity by spermidine and the spermidine analogue N1N8-bis(ethyl)spermidine. // Biochem J. 1987. - V.242. - No.2. - P.433-40.

149. Porter CW, Sufrin JR. Interference with polyamine biosynthesis and/or function by analogs of polyamines or methionine as a potential anticancer chemotherapeutic strategy. // Anticancer Res. 1986. - V.6. - No.4. - P.525-42.

150. Puntambekar SS, Davis DS, Hawel L 3rd, Crane J, Byus CV, Carson MJ. LPS-induced CCL2 expression and macrophage influx into the murine central nervous system is poly-amine-dependent. // Brain Behav Immun. 2011. - V.4. - P.629-39.

151. Ramot Y, Tiede S, Biro T, Abu Bakar MH, Sugawara K, Philpott MP, Harrison W, Pietila M, Paus R. Spermidine promotes human hair growth and is a novel modulator of human epithelial stem cell functions. // PLoS One. 2011. - V.6. - No.7. - P.22564.

152. Ray RM, Bhattacharya S, Johnson LR. EGFR plays a pivotal role in the regulation of polyamine-dependent apoptosis in intestinal epithelial cells. // Cell Signal. 2007. - V.19.- No.12. P.2519-27.

153. Ray RM, McCormack SA, Johnson LR. Polyamine depletion arrests growth of IEC-6 and Caco-2 cells by different mechanisms. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001.- V.281. No.l. - P.G37-43.

154. Reddy VK, Valasinas A, Sarkar A, Basu HS, Marton LJ, Frydman B. Conformationally restricted analogues of lN,12N-bisethylspermine: synthesis and growth inhibitory effects on human tumor cell lines. // J Med Chem. 1998. - V.41. - No.24. - P.4723-32.

155. Rogers MS, Yim SF, Li KC, Wang CC, Arumanayagam M. Cervical intraepithelial neoplasia is associated with increased polyamine oxidase and diamine oxidase concentrations in cervical mucus. // Gynecol Oncol. 2002. - V.84. - No.3. - P.383-7.

156. Ruhayel RA, Zgani I, Berners-Price SJ, Farrell NP. Solution studies of dinuclear polyam-ine-linked platinum-based antitumour complexes. // Dalton Trans. 2011. - V.40. -No.16. - P.4147-54.

157. Rukunga G.M., Waterman P.G. New macrocyclic spermine (budmunchiamine) alkaloids from Albizia gummifera: with some observations on the structure—activity relationships of the budmunchiamines. // J Nat Prod. 1996. - V.59. - No.9. - P.850-3.

158. Scalabrino G, Ferioli ME. Polyamines in mammalian ageing: an oncological problem, too? A review. // Mech Ageing Dev. 1984. - V.26. - P. 149-64.

159. Schipper RG, Romijn JC, Cuijpers VM, Verhofstad AA. Polyamines and prostatic cancer. // Biochem Soc Trans. 2003. - V.31. - No.2. - P.375-80.

160. Seiler N. Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 1. Selective enzyme inhibitors. // Curr Drug Targets. 2003. - V.4. - No.7.- P.537-64.

161. Seiler N, Raul F. Polyamines and apoptosis. // J Cell Mol Med. 2005. - V.9. - P.623-42.

162. Senanayake MD, Amunugama H, Boncher TD, Casero RA, Woster PM. Design of poly-amine-based therapeutic agents: new targets and new directions. // Essays Biochem. -2009. V.46. - P.77-94.

163. Shah, N., Thomas, T. J., Lewis, J. S., et al. (2001) Regulation of estrogenic and nuclear factor kappa B functions by polyamines and their role in polyamine analog-induced apoptosis of breast cancer cells. // Oncogene. 2011. - V.20. - P. 1715-1729.

164. Shi C, Welsh PA, Sass-Kuhn S, Wang X, McCloskey DE, Pegg AE, Feith DJ. Characterization of transgenic mice with overexpression of spermidine synthase. // Amino Acids. 2012. V.42. - No.2-3. - P.495-505.

165. Shin J, Shen F, Huguenard J. PKC and polyamine modulation of GluR2-deficient AMPA receptors in immature neocortical pyramidal neurons of the rat. // J Physiol. 2007. -V.581. - P.679-91.

166. Siegel R., Ward E., Brawley O., Jemal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths. // CA Cancer J Clin. 2011. - V.61. - P.212-236.

167. Soda K. The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. // J Exp Clin Cancer Res. 2011. - P. 107-115.

168. Soda K. Polyamine intake, dietary pattern, and cardiovascular disease. Med Hypotheses. 2010 Sep;75(3):299-301.

169. Soto D, Coombs ID, Kelly L, Farrant M, Cull-Candy SG. Stargazin attenuates intracellular polyamine block of calcium-permeable AMPA receptors. // Nat Neurosci. 2007. -V.10.-No.10.-P.1260-7.

170. Smith, R. C., Litwin, M. S., Lu, Y., and Zetter, B. R. Identification of an endogenous inhibitor of prostatic carcinoma cell growth. // Nat. Med. 1995. - V.l. - P.1040-1045.

171. Stanfield PR, Sutcliffe MJ. Spermine is fit to block inward rectifier (Kir) channels. // J Gen Physiol. 2003. - V.122. - No.5. - P.481-4.

172. Stanley BA, Pegg AE. Amino acid residues necessary for putrescine stimulation of human S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme processing and catalytic activity. // // J Biol Chem. 1991. - V.266. - No.28. - P.18502-6.

173. Stefanelli C, Bonavita F, Stanic' I, Pignatti C, Flamigni F, Guarnieri C, Caldarera CM. Spermine triggers the activation of caspase-3 in a cell-free model of apoptosis. // FEBS Lett. 1999. - V.451. - No.2. - P.95-8.

174. Stoscheck CM, Erwin BG, Florini JR, Richman RA, Pegg AE. Effects of inhibitors of ornithine and S-adenosylmethionine decarboxylases on L6 myoblast proliferation. // J Cell Physiol. 1982. - V.l 10. - No.2. - P.161-8.

175. Streiff RR, Bender JF. Phase 1 study of Nl-Nl 1 -diethylnorspermine (DENSPM) administered TID for 6 days in patients with advanced malignancies. // Invest New Drugs. -2001.-V.19.-No.L-P.29-39.

176. Svinarev V.I. Serum spermidine levels of schizophrenic patients. // Zh Nevropatol Psikhiatr ImSS Korsakova. 1987. - V.87. - No.5. - P.732-4.

177. Szumilak M, Szulawska-Mroczek A, Koprowska K, Stasiak M, Lewgowd W, Stanczak A, Czyz M. Synthesis and in vitro biological evaluation of new polyamine conjugates as potential anticancer drugs. // Eur J Med Chem. 2010. - V.45. - No.12. - P.5744-51.

178. Tabor C.W. and Tabor H. Polyamines. // Annu. Rev. Biochem. 1984. - V.53. - P.749-790.

179. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines in microorganisms. // Microbiol. Rev. 1985. - V.49. -P.81-99.

180. Tamura H., Horiike K., Fukuda H., Watanabe T. Kinetic studies on the inhibition mechanism of diamine oxidase from porcine kidney by aminoguanidine. // J Biochem. 1989. -V.105. - No.2. - P.299-306.

181. Thomas T., Kiang D.T. A twenty-two-fold increase in the relative affinity of estrogen receptor to poly (dA-dC).poly (dG-dT) in the presence of polyamines. // Nucleic Acids Res. 1988. - V.16. - P.4705^1720.

182. Thomas, T., Thomas, T. J. (2001) Polyamines in cell growth and cell death: molecular mechanisms and therapeutic applications. // Cell. Mol. Life Sci. V. 58. - P.244-258.

183. Tsujinaka S., Soda K., Kano Y., Konishi F. Spermine accelerates hypoxia-initiated cancer cell migration. // Int J Oncol. 2011. - V.38. - No.2. - P.305-12.

184. Vaidya RJ, Ray RM, Johnson LR. MEK1 restores migration of polyamine-depleted cells by retention and activation of Racl in the cytoplasm. // Am J Physiol Cell Physiol. -2005. V.288. - No.2. - P.C350-9.

185. Vijayanathan, V., Thomas, T., and Thomas, T. J.DNA nanoparticles and development of DNA delivery vehicles for gene therapy. // Biochemistry. 2002. -V.41. - P. 14,085-94.

186. Vivó M, de Vera N, Cortés R, Mengod G, Camón L, Martínez E. Polyamines in the basal ganglia of human brain. Influence of aging and degenerative movement disorders. // Neurosci Lett. 2001. - V.304. - No. 1-2. - P. 107-11.

187. Wallace HM. Polyamines in human health. // Proc Nutr Soc. 1996. - V.55. - P.419-31.

188. Wallace HM, Fraser AV, Hughes A. A perspective of polyamine metabolism. // Biochem J. 2003.-V.376.-P.l-14.

189. Wallace H.M., Niiranen K. Polyamine analogues an update. // Amino Acids. - 2007. -V.33. - No.2. - P.261-265.

190. Wallon UM, Shassetz LR, Cress AE, Bowden GT, Gerner EW. Polyamine-dependent expression of the matrix metalloproteinase matrilysin in a human colon cancer-derived cell line. // Mol Carcinog. 1994. - V.l 1. - No.3. - P.138-44.

191. Wang J., Sun P.P., Chen C.L., Wang Y., Fu X.Z., Liu J.H. An arginine decarboxylase gene PtADC from Poncirus trifoliata confers abiotic stress tolerance and promotes primary root growth in Arabidopsis. // J Exp Bot. 2011. - V.62. - No.8. - P.2899-914.

192. Webber M. M., Chaproniere-Rickenberg D. Spermine oxidation products are selectively toxic to fibroblasts in culture of normal human prostatic epithelium. // Cell. Biol. Int. Rep. 1980. - V.4.-P.185-193.

193. Weiss T.S., Bernhardt G., Buschauer A., Thasler W.E., Dolgner D., Zirngibl H., Jauch K.W.: Polyamine levels of human colorectal adenocarcinomas are correlated with tumor stage and grade. // Int J Colorectal Dis. 2002. - V.17. - P.381-387.

194. Wilding G., King D., Tutsch K., Pomplun M., Feierabend C., Alberti D, Arzoomanian R. Phase I trial of the polyamine analog Nl,N14-diethylhomospermine (DEHSPM) in patients with advanced solid tumors. // Invest New Drugs. 2004. - V.22 - No.2 - P.131-8.

195. Williams K. Interactions of polyamines with ion channels. // Biochem J. 1997. - V.325. - P.289-97.

196. Wolff EC, Lee SB, Park MH. Assay of deoxyhypusine synthase activity. // Methods Mol Biol. 2011. - V.720. - P. 195-205.

197. Wu H, Min J, Ikeguchi Y, Zeng H, Dong A, Loppnau P, Pegg AE, Plotnikov AN. Structure and mechanism of spermidine synthases. // Biochemistry. 2007. - V.46. - No.28. -P.8331-9.

198. Xia M., Chen Y., Wang L.C., Zandi E., Yang H., Bemanian S., Martinez-Chantar M.L., Mato J.M., Lu S.C. Novel function and intracellular localization of methionine adenosyltransferase 2beta splicing variants. // J Biol Chem. 2010. - V.285. - P.20015-21.

199. Xiong H., Stanley B.A., Pegg A.E. Role of cysteine-82 in the catalytic mechanism of human S-adenosylmethionine decarboxylase. // Biochemistry. 1999. - V.38. - No.8. -P.2462-70.

200. Yan X, Takahara M, Xie L, Gondo C, Setsu N, Oda Y, Takeuchi S, Tu Y, Moroi Y, Furue M. Arginine metabolism in soft tissue sarcoma. // J Dermatol Sci. 2011. - V.61. -No.3.-P.211-5.

201. Yang H, Li TW, Peng J, Mato JM, Lu SC. Insulin-like growth factor 1 activates methionine adenosyltransferase 2A transcription by multiple pathways in human colon cancer cells.//Biochem J. -2011. -V.436. -No.2. -P.507-16.

202. Yohannes E, Thurber AE, Wilks JC, Tate DP, Slonczewski JL. Polyamine stress at high pH in Escherichia coli K-12. // BMC Microbiol. 2005. - V.5. - P.59.

203. Yoshinaga K, Ishizuka J, Evers BM, Townsend CM Jr, Thompson JC. Age-related changes in polyamine biosynthesis after fasting and refeeding. // Exp Gerontol. 1993. -V.28. - No.6. - P.565-72.

Информация о работе

Сокуева, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы