Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ ИЗ ГРУПП РЕТАРДАНТОВ И АНТИСТРЕССОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ ИЗ ГРУПП РЕТАРДАНТОВ И АНТИСТРЕССОВЫХ ПРЕПАРАТОВ"

А-зоШ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ .

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ГОЛОВНИ НА Юлия Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АКТИВНОСТИ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ ИЗ ГРУПП РЕТАРДАНТОВ И АНТИСТРЕССОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

> ' Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

□ иотек ИО-ОГир:.

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА. • -

Научный руководитель— доктор биологических наук, акад. РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, акад. РАСХН Г. С. Муромцев, канд. биол. наук, доцент ТСХА С.' В. Иванова:

Ведущее учреждение — Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН. Директор — проф. А.'Л. Бучаченко^

Защита состоится «./.(£.,.» 1994 г. в на за-

седании .специализированного ученого совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, ,г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты днссертаццй.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь ,

специализированного совета — ' кандидат биологических наук

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Использование регуляторов роста и развития растений - важное направление современного растениеводства. Их применение дает возможность воадействовать на интенсивность и направленность физиологических процессов в растениях, повышатьурожайность,.улучшать качество и сохранность продукции. Однако, для некоторых из них, помимо желаемого фиаиологического эффекта, было выявлено мутагенное действие, что создает опасность изменения сортовых свойств культурных растений и снижения их жизнеспособности (Куриный, 1983). : -

Систематические исследования - генетической активности химических средств, применяемых в сельском хозяйстве проводятся лишь для : группы пестицидов и ' имеют в основном медико-токсикологическую направленность. Вопросу проверки на мутагенную активность фиторегуляторов посвящены лишь отдельные работы. Между тем, действие этой группы веществ, в отличие от пестицидов, направлено непосредственно на регуляторные системы возделываемых растений и имеет множество точек приложения.

В связи о . этим, необходима равработка комплексных систем генетического мониторинга за применением рострегулирупяих средств, составной частью которого является цитогенетический авалю. - -

ЦВЛЬ И ЗАДАЧИЙССЛЕДОВАНИЙ. Целью настоящего исследования была проверка фиторегуляторовиа групп ретардантов и антистрессовых препаратов на мутагенную активность в соматических и генеративных клетках растений. . -Г-В'задачи исследований входило: У

1. Изучение мутагенной активности фиторегуляторов в биотесте Allium fistulosum.

. . 2. Выяснение механивмов цитогенеткческого действия фиторегуляторов. проявивших мутагенную активность.

3.»учение влияния фиторегуляторов на генеративные и соматические клетки и показатели структуры урожая у различных сортов ярового ячменя, у \ •

4 № учение последействия фиторегуляторов в первом и втором семенных поколениях ярового ячменя по цитогенетическим и Сиомет-рическим показателям.

- a -

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Впервые проведена проверка на мутагенную активность в растительном Снотэсте фиторегуляторов s гидре*, 2-ХЭ4К, кврто-лин, эгшСрассинолид-ББ, ОСС, декстрел.

2. Дэна сравнительная оценка мутагенно* активносте препаратов 2-ХЭФК и картолина в биотесте Allium rtstuloaum и в соматических и генеративных кяетках ярового ячменя.

а зарегистрирована различная чувствительность сортов ярового ячменя к мутагенному действию картошна я 2-ХЭ®К.

1 Показано, что мутагенное действие картолина и 2-JCMR сопровождается «вменением биометрических показателе* f растевхй ярового ячменя.

6. На основаним цигогеяетнчвскхх тестов и биометрического анализа структуры урожая покаааяо отсутствие последействия wap-толина и 2-ХЭМ1 у растений ярового ячменя второго семенного поколения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Реаультаты исследований использованы для рааравотки " Методических рекомендация по ношленсяой оцеп» генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве. "(Н., МЯСА, 1002). Закачен» по мутагепомг действие . гидрела и 2-ХЭЯС ошо передаю в Государственную межведомственную иотссию до испытан» я регистрации средств аащты растений и испольвоваио при разработке томсико-гигиенических регламентом их применении.

АЯЧЖАВДЯ равогы. Материалы диссертации докладовлмсь ив Заседаем секши генетических аеаенюв проблемы "Человек я 0»-осфера". Ереван. 1ВЄ7; Вэесосвиом сииювиуме "00мм ж методы ге-нотогоичесмой оцвшвГ. Ленинград. 198»; Всесоиеиом пгттгдмпмрг»-иом совецяии -Генетически» последствия аагривиеиия окрзшмумей сре»Г. Москва-Самарканд. 1000; Штом Ьмядлшюдаюм молодежом симяамуме -Регуляция метаболизма у растений*. Варна,1900; совещании "Брассииостероед*\ Иикк. 1091 s Ив муи вредили конгрессе -Эгиобогаиша-Ог", Первое*. 1002.

ОПП РАВОГЫ. ДМссертавдо— работа сое»« ИИ введення, об-

**ери*я>м. впсяертяотальаой частя, ремуаьтоов, оОсдомт ■ вмюдож. ЬЬгарна ш дяссертацш ипломим ш страницах текста, содераиг табащ. рмсуияиа и turn цп|ий ВнОлиографкя содер-

'оашхшшшяаовш;

•/•В'качествеобъекта дл скрнвиига па мутагенную активность пгммювют лук-батуи (Al I lua fistulosu»). Efcura изучены фмторе-гуляторы: 2-хлоретвлфоофоноаая кислота (2-ХЭ®0 , декстрел, гид-рел. хлорхолвихлоркд (ООО) в концентрациях -12, o.ix, О.МХ; ГШ-Na i юртолш в ноштотрацнях - IX, 0.1t. 0.01z, lo£ х. 10 X. IO^X, 10^X1 впабр«зснволнд~6Б В концентрациях - 10 X.

.0 мутагенвом действия препаратов судили по нарушншм в структуре хрошоом клеток корневых меристем в ава-телофаве мйто-м. Семена лука-бзтува прорастали в чавкал Петри на влаюоВ iMbTPOMiibHoa бумаге при t*;-86e>C-. Чврев 48 часов от вачала проряввгааявяпророотки переносили ва фильтровальную бумагу, смоченную в растворе фиторегулятора на 18 часов, что соответствуют продп иитвльнооти шнктгавемого цикла у лука-бегуна. Для янвдивя отбирала кореши длкноВ 1.Б-2 он. ввксвцив проводили в фшссаторе Ваврка. паролю - вЗ N солявов кжлоте при комватвоя температуре в*ечение20 млн., омраоцг - в БХадетокармше. микроскопию - на давленых препаратах ошпольаованвем фввового контраста ва > шкросжше "Axioptot". ИЬ казан* вариант обработка отбвралось по 600 кле*ок,> ве мввее чем от 20 растения. Отытвитичеокуц вначи-ыип.равличиа мия? уровнем мутирования клеток в опыте в контроле определяй во критерию Отыдонта (Зеке, 187В) > Оря сореде-ленивисголпвских (Ш)в4авовых нндексовисполъвовалн отан-тявт Ш90ЯШ (Шунева. 1988) . .

.; ■ 8 поливы» ■ ошвах научали действие фвторегуляторов на сорта ярового «шиш CHordein vulgar») ВЬсовскяЯ-0. Москоьсюй»-2. бэсковский-З. МЬоковсквй-121. Обработку растений фиторегулятора-ш провопим в новое фавн цгявнян- начале выхода в трубку; в ре-комввдсшаввых кс«ц|»втрашшх:1Х - для ООО: о.бх - для 2-хэ«; 0.16Х - для картолнна; ^* X для эпвбрассинолида-бб.

' Сюыгы проводвлв ва аксперимевташой баае лаборатории генетики и ■ селекции : волевых культур им. .0. И. Лисицына . ТСХА в Д989-1991 г. ва выравненном агрофоне. -

-; Приготовление цитологических препаратов для анализа уровня lOtapóetiam i клеток горневых мервсгем ячшня проводили по схеме, спшанной для лука-батуна о вебольииш ивмэнейиями: • тканн маце-ряровалн в смесв 1Х-ных растворов пектинааы в цвллюлааы в тече-вив 10-14 часов при комнатной температуре. Всего ва вариант ана-

- 4 -

дозировали не менее 20 растения.

Влияние фиторегуляторов на генеративные клетки изучал» в материнских клетках пыльцы (МКП). Колосья Фиксировали в уксусной алькоголе в течении 10-12 часов, для хранения материал переносили в 70х этанол, амксацию проводили в утренние часа Пыльники окрашивали 52 ацетокармином, выдержав их перед окраской в 42 растворе желеаоамшнийных квасцов в течении 20 мин. Анализ нарушений в мейоэе проводили на давленых препаратах, микроскопии в фазовом контрасте. Количество нарушений в ШШ учитывали на стадиях Штафавы! (Ш) . Анафааы! (А!) и на стадии тетрад. В VI я!,алиапровали не менее - 200-300 клеток на вариант, в А1 -300400, на стадии тетрад -2000. Ферт иль нос ть пыльцы определяли ацетокарминоаым методом (Щушева, 1988). Количество проанализированных на фертильность пыльцевых зерен - от 500 до 1000. На каждый вариант отбирали не менее 20 пыльников от разных колосьев.

Для иаучения влияния фиторегуляторов на биометрические показатели растений с каждой опытной делянки проводили измерения : высоты растений, длины главного колоса, количества зерен с главного колоса, массы 1000 зерен, общей и продуктивной кустистости. ' На каждый вариант опыта отбирали до 100 растений, повторность двухкгатная. Статистическую обработку данных проводили методой двухфакторного дисперсионного анализа ( Доспехов . 1985).

При исследовании последействия фиторегуляторов использовали сорт Нэсовский-9. На второй год семена от обработанных растений высевали по семьям. Для онтогенетического анализа отбирали 30-40 растений на вариант, для биометрического анализа в первом семенном поколении (Ш) - не менее 50 растений на вариант, во второы семенном поколении (иг) - не менее 200. Измеряли следующие биометрические показатели: высота растений, длина главного колоса, количество зерен в главном колосе, масса верна с главного колоса в качестве показателя изменчивости использовали коэффици-* ент вариации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Скрининг Фиторегуляторов на мутагенную активность в биотесте АШит П&Шозик

Анализ хромосомных аобераций в ана-телофаае мигова показал,

V .■■:•. - б - -х,

что- препараты эпибрассинолид-ББ. декстрел. ОСО не обладает кластогеннім действием (способность вызывать хромосомные абоерации) ни в одной ив испытанных концентраций.

Препараты 2-ХЭФК и гидрел вывывали достоверное увеличение уровня мутирования хромосом лишь в IX-ной концентрации.

В вариантах с картолином и ГЖ-Ыа было установлено, что IX карт о лин и IX и О. IX ГМК-Ыаокааызаюг цитотоксическое действие на клетки - снижаютмитотический индекс (МО практически до нуля и выаываюг деструкцию ядер. Поэтому, данные «{иторегуляторы были испытаны в концентрациях. - от 10~ X до 10*6Х. . Нижний порог кластогенного действия для картолина был определен как 0.01Х. для ГМК-Ыа как 0.001Х (Табл.1).

Табл.1. Цитогенетическая активность фиторегуляторов в клетках : корневых меристем Allium fistullosum.

фепарат Концент- Обдає число Число

рація анафав анафав с X ± m td

X нарушениями V '. ' ' ' '

ГШС-Na 1 : отсутствю »делений

*. 0.1 ' отсутствие делений

0.01 634 73 13.67il.48 5.04*

' 10"' 600 61 ' : 10.16tl.23 3,46*

■ : ^ .. .. . 680 33 • 6.60+0,96 0.66

10"S 620 ■••■ 36 . 6,73+1.10 1,32,

■-. ' ■ V •.' ' 10"® 630 26 4,91+0,98 0.29

Контролі V 620 • •...• 26 4,81±0,94 .. —

Брасси- ,10-v 601 31 6,1941,08 0,80

нолид-Бб 10 s 618 . 40 7,76*1.78 1,78

10'6 >; 600 30 6.00+1.06 0,68

Контроль «во ■:■ , 23 6.00+1.02

: ссо •" ir ¿'.--і 878 ■ 36 ' 3,6840,69: 1,04

0.1 434 17 3.9240,83 1,08

0,01 Г 466 16 3.6140.86 0.74

Контроль ! , 080 ' 27 ■ - 2.76+0.Б2 • —,

Гавл 1. (продолжение).

Шедарат Концент- ССщае число Число

рация • анафаз анафаз с X + ш

X нарушениями •

Картолин 1 отсут ствие делеш й

од 600 60 12,00+1,46 4,16*

0.01 612 45 8,7911,26 2,54*

10'л 600 30 б,00±1.06 0,84

10 " 604 28 5,66±1,02 0,54

юь 660 25 4,46±0.87 -0,27

10 е 600 27 4,60+0,86 -0,25

Контроль 620 25 4,81±0,94 ---

2-ХЭЖ 1 463 43 9,28+1,35 3.45л

0.1 454 23 5,06+1,03 0,95

0.01 617 26 6,03+0,96 0,96

Контроль 620 20 3,80±0,84

Декстрел 1 562 31 5,5210,96 0.92

0.1 620 28 б.38±0,99 -0,77

0.01 610 27 5,29±0,99 -0,69

Контроль 974 60 6,1640,77 ---

Гидрел 1 645 08 15,19+1,41 6,61*

0.1 381 27 7,09±1,31 0,61

0.01 402 23 5,72±1.16 -0,32

Контроль 974 60 « 6,1640,77 ---

* - статистически достоверная разница между контролем и опытом. (Р>0.05. tst.-l.96)

Для фиторегуляторов, проявивших кластогенную активность (ГМК-Ыа. картолина. гидреда, 2-ХЭФК) Оьио научено влияние различных доа на интенсивность клеточного деления с целью выявления пороговых Физиологических концентраций, не обладающих кластоген-ным действием.

Для антистрессового препарата картодин, физиологическими

V-' ■ - 7 -

считали дозы, не вызывавшие снижения Мі. В результате исследований было показано, что О, IX и О,ОН картолин выэьшает не только кластогенно© действие, но и снижает интенсивность деления клеток. В то же время, при снижении дозы препарата до 1СГ3 X и ниже картолин проявил себя как стимулятор клеточного деления и не вызывал хромосомных нарушений.

Использование ГМК-Иа, 2-ХЭФК и гидрела в растениеводстве связано, с их способностью ингибировать процессы деления и растяжения клеток. Поэтому, физиологическими дозами для этих препаратов считали концентрации, снижавшие Мі.

Для ГМК-Иа все концентрации, подавлявшие митотическую активность .клеток оказались кластогенними. Кроме того, шгготи-ческий профиль при воздействии ГМК-Ыа сильно смедался.в сторону метафазы, что свидетельствует о способности препарата влиять на веретено клеточного деления. Количество клеток, задержанных на этой стадии было.пропорционально дозе вещества

В вариантах с О,IX и О.ОІХ гидреломи 2-ХЭ1К сохранялось ингибирование - деления клеток при отсутствии кластогенного действия. _

С целью научения механизмов цитогенетического действия ГМК-Ма, 2-ХЭСЖ; карто лина, гидрела регистрировались изменения в уровне мутирования клеток и спектрах хромосомных аббераций в течение *54 часов. Для' этого корешки поменяли на растворы фитсрегу-ляторов на 18 часов, а затем доращивали на воде. Фиксацию проводили черев 18, 36 и 64 часа с момента обработки. Для контроля вступления клеток ^ деление измерялся Мк Препараты были испыга- ■ вы в минимальных пороговых кластогениых дозах (IX для 2-ХЭФК и гидрела. 0,01X для картолина и 0.001Х для ГМК-Ыа). Результаты зтихисследований представлены на рисункахі.2,3,4.

Класгогенное действие препарата т картолин не сохранялось в популяции меристематических клеток. Через 36 часов с момента обработки процент абберантных анафаз статистически достоверно не превышлконтрольный уровень. Ш был незначительно ниже контрель-ного в течение всего эксперимента, что говорит об отсутствии Еа-держки клеток в интерфазе, в спектрах хромосошшх аббераций присутствовалинаругается как хромосомного так и хромат иднего типов, «соотношение изменялось незначительно в течение трех фиксаций и было сравнимо с контрольным. Это указывает'на способность препарата воздействовать па все стадии интерфазы (Рис.1).

Рис.1. Динамика изменения нитогенетическях показателей в клетках корневых меристем АШшп Г^Щоэит

при воздействии картоюгаа Соотношение

^аобераиий

, хроматидные/хромосомные

" Время фиксации с момента обработки (час. )

★-статистически достоверная разница между контролем и опытоы

картолин ,

СИ -

контроль

Рис. 2.' Динамика изменения ' цитогенетичесюш показателей

в клетках корневых меристем АП1шп Пэ^озиш У. .. - . при воадейстаии ГШС-Ыа .

■ • . ' .. > ■. ("соотношение-' ;'

■ Гамемцив * хроматидные/хромосомные _ , ;

* тоанслокашт '

.„ лв, 51 1в_36 5к'_ : 1Я 36 ■

Время фиксации с момента обработки (час.) " •,/*:;"'■' '★-статистически достоверная рааница между контролем и "опытом

-. ГМК-Иа

'Контроль

- в - ,.

Кластогенное действие препарата ГМК-Na наблюдалось в течение всего эксперимента. Пролонгированным было и его митостати-ческое действие.- В клетках выходящих в первый митоз после задержки в интерфаве преобладали абберации хроматидного типа, представленные одиночными мостами и фрагментами, .что указывает на способность препарата вызывать нарушения поимущественно на стадиях S и 62. Аналогичные данные были зарегистрированы на клетках животных и характеризуют препарат как мутаген задержанного типа действия (Nlshi.1979: Spelt,1683). Увеличение Ш к третьей фиксации свидетельствует о присутствии в анализируемой клеточной популяции клеток, входящих во второй и третий митозы. При этом, преобладание хроматидных нарушений над хромосомными сохранялось. Поэтому, можно предположить, что сохранение повышенного уровня мутирования клеток в течении 54 часов связано со способностью препарата вызывать потенциальные нарушения в структуре хромосом, реализующиеся в абберации в нескольких последовательных клеточных циклах (Рис.2).

Исследования на клетках животных показали, что препарат уд-линняет S период, ингибируя активность ДНКг полимеразы (Лобов 1971, Cortes, 1987). Кроме того, нормальный ход репликации моют нарушаться из-за- включения ГЫК-Na в состав молекул и-РНК и т-РНК. Известно так же, что молекула гидразина способна реагировать с' пиримидиновыми основаниями и разрушать их, создавая апи-римидиновые сайты ■ ДНК (Дубинин 1980). Можно предположить,, что сочетание ДНК-повреедаодего действия и влияния на пролифератив-ную активность клеток и работу ферментов репликации обуславливает высокую кластогенную активность соединения.

При воздействии препарата 2-ХЭФК -уровень : мутирования клеток был достоверно вше контрольного в течение 54 часов. Зарегистрированное нами отсутствие роста митотической активности клеток после снятия действия вещества очевидно связано с задержкой клеток в интерфаве. на стадии <31 (Хрусталева. Погорилая 19S4). Это дает основание предполагать,, что большинство анализируемых в анафазе клеток находилось в первом после обработки ми-тове.В этой свяаи представляет интерес анализ спектров нарушений, в которых в первой фиксации соотношение хроматидные/ хромосомные транслокации мало отличалось от контрольного, а в последующих преобладали аОСерацки хромосомного типа (Рис. Ш.

Рис. 3. Динамика изменения цитогенетических показателей в клетках корневых меристем АШш ПаОДозид при воздействии гидрела Соотношение хроматидные/хромосомные X абСе раций » транс локации М( ¡~

{ ■ * - «С

* . 1

* ]

шь

' в

4 >

I

О

4

Ьв_:

1

м

18 _36 54

18. 36 54

, зв .. ...__„ _.

Вреьд фиксации с момента обработки (чае.) /■-статистически достоверная ра&ница между контролем и опытом"

н гидрел, •контроль

РИС.4. Динамика изменения цитогенетических показателей в клетках корневых меристем АШшп Пэилозит при воздействии г-ХЭФК Соотношение"^—---

X аббераций

хроиатидные/хромосомные транрлокашм ' ..

I

1

36__54- ' . р 36 54 1

2-ЯМ«, О- контроль

- _______ __________обработки (час.,

«стичЪсгаГЯостовериая разница между койтролем чг опытом*

Поскольку у препарата; ло данным литературы не было варе--гиотриро'Ьано ДНК- повреждавшего действия, мы считаем возможпым предположить, что подобные изменения в хромосомных спектрах могут быть результатом воа действия на системы репарации на фоне длительной вадержки клеток на стадии G1. л В варианте с гидрелом повышенный уровень мутирования

клеток регистрировался в течение 36 часов.' В хромосомных спект-. pax при первой фиксации преобладали хроматидные транслокации и делеции. представленные одиночными фрагментами и одиночными мостами, что предполагает способность препарата вызывать нарушения преимущественно в S и G2 фазах. Митотическая активность клеток во второй и третьей фиксациях была несколько, выше, чем в первой, что говорит о вступлении клеток,' во второй и третий после обработки митоза Однако, в отличие от ГМК-Na, начиная со второй фиксации соотношение хроматидные/хромосомные нарушения было сравнимо с контрольным (Рис. J). Наши данные по мутагенной активности гидрела в растительных клетках согласуются с результатами, полученными на клетках животных и микроорганизмов, где для препарата была зарегистрирована способность вызывать генныэ : мутации (Весманова, 1087).

2. Изучение 'чувствительности сортов яровго ячменя к фиторегуляторам.

2.1. Влияние фиторегуляторов йа соматические клетки.

Результаты изучения цитогенетической активности фиторегу-ляторов в -соматических клетках ячменя согласуются с данными, полученными на Allium fistulosum. -

■ При обработке корневых меристем ячменя препаратами 2-ХЭФК II ССС было показано, что 2-ХЭФК вьвывает достоверное увеличение количества клеток с абберациями хромосом. ССС не влиял на уровень мутирования соматических клеток.

В вариантах с 2-Ш были изучены сортовые реакции на кластогенное действие препарата. Сорта распределялись следующим Ьбразом в порядке убывания количества абберентных .анафаз : ¡Ьсковский-З, Носовский-9. Московский-2,; Московский-121. Для борта Московский-121 отличия в уровне мутирования клеток в контроле и опыте были статистически недостоверными (Рис.6).

Рис. Б. Цитогенетическая активность ретардантог • в клетках корневой меристемы ячменя

X.аберраций _____ _ ■___

i - Сорт Московский-3, II - Сорт Носовский-Э," • III - Сорт иэсковский-2, IV - Сорт Мэсковский-121 □-контроль, *2-ХЭ®, EZ2-CCC • *- статистически достоверная разница между контролем и опытом

, ■■".' ' ; . ,'(Р > 0.06)! л : ' ' ■■

Л 2.2. Влияние фиторегуляторов на генеративные клетки. •• •,

. 'Анализ уровня мутирования генеративных клеток ячменя пока- ] вал статистически достоверные , от контроля отличия в вариантах с картолином и 2-ХЭЖ. Препараты ОССизпибрассинолид-ББ не выаы-вали нарушений в мвйозе.: 'генеративные;клетки сортов Нэсовский-в я Носковский-з, так же., как и соматические клетки, оказались наиболее чувствительны»« к препаратам 2-ХЭЖ и картолиа. Едясор-тов Мхковский-2 и Мэсковский-121, достоверных от контроля отличий зарегистрировано не было (табл.2); v; ^ \

фи изучении спектров хромосомных нарушений в генеративных

Табл. 2. Патогенетическая айгиб^ость фиторегуляторов в генеративных «летках ячменя. .

Количество Количество ■

Вариант проанали- клеток с . X ± и -

опта зированных нарувениями

клеток • . .

: Сорт НэсовскиЯ-9

Контроль 2500 30 1.2040,22

Картолин * г 2600 • 86 V 3,«5+0,36 6,18*

2-Хэак. • 2460 67 - 2,32±0,30 2,99*

ССС: 2300 " 37 1,6140,26 1.19

Эпибрассинолид-Бб • 2600 39 ■ ' 1,6б±0,27 1,21

' * .... Сорт Шсковсккй-З

Контроль 2660 .26 0.9640.19 г-

Картолин . 2500 . 61 2,04+0,28 3.19*

2-ХЭЖ - 2600 ' 41 • 1,64¿0,25 2.18*

ООО * 2600 ' 31 1¿2410,22 0.99

Эпирассинолид-ББ 2450 34 1.3640.23 1.37

Сорт кЬсновский-2

Контроль .."•'- ; У: 2300 ; 39 1«69±0,27 --•.'

Картолин 2360 ■ 62 2,2140,30 1.44'

2-ХЭФК ;.; 2700 '. 44; 1.62*0.24 -0.17

ссс . 2400 48 2,00+0,29 0,79

Эпибрассинолид-Бб 2400 31 1.29±0.23 -1.12

; г, • -;ч Сорт иосновский-121::

Контроль-;;' . • ~ 2600 21 0,8440,18

Картолин 2660 :; а?; 1,2440,22 1,44

г-ш • "•. • . . 2400 . ■■ •: 24 1,0040,20 0,69

ооо ... ;' ; 2600 . 17 0,6640,16 -0.78

Эпибрассинолид-Бб . 2466 V . • 23 0.9440.19 0.36

^ • д- * .отатиотячеоки достоверная разница мэвду контролем > - * ОПЫТОМ. (Р>0,06) ; . •. л''.-.' ^< ■ '

клетках в метафазеГбшш выявлены слипания хромосом,.их фрагиея-тация и униваленты,. которыебыли особенно характерны для расте-• . ний сортан-з. обработанньа картолинои. КоличестЕО открытыг би-

• •' ~ 14 - ■ ■ -V -

валеятов в этом варианте статистически достоверно отличалось от контроля," что может служить косвенным свидетельством изменения характера конъюгации хромосом.. В анафазе! наблвдали фрагменты, мосты и неравное количество хромосом на полюсах. На стадии тетрад преобладающими типами нарушений были микроядра, реже наблюдались триады и пентада Максимальнее количество клеток с микроядрами было зарегистрировано на сорте Носовский-9 а вариантах о картолином и 2-ХЭФК. . . . .V

Поскольку обработка фиторегуляторами проводилась неаадолго до начала мейоза, одной ив причин, регистрируеуыхв мейоае нарушений, могут быть изменения в тканях,' дающих мейоциты. Не . смотря на то, что в наших исследованиях непосредственного научения предмейотических делений не проводилось, впоследних перед мейовом, уже синхронных митозах регистрировалось реекое увеличение количества абберантных анафав в вариантах с картолином я 2-ХЭФК. Очевидно, что большинство абберентных клеток элиминируются, однако,' некоторые типы нарушений могут доходить до мейоаа и в результате кроссинговера у гетерозигот по инверсиям, дупликациям и симметричным транслокациям' вывывать перестройки хромосом. Кроме того, картолин и 2-ХЭФК, сохраняясь в тканях растений, могут воздействовать непосредственно на шйотическую интерфагу и профазу, вызывая нарушения при делении. ■

Учет влияния фиторегуляторов на фертильность пыльцы показал, что картолин статистически достоверно снижает фертильность растений сортов Нэсовский-9 и Мэсковский-3. Количество стерильных пыльцевых верен для сорта Носовский-9 составило 1БХ, для \ сорта Мэсковский-3 - 21Х, при 4Х и 6* в соответствуй»« контрольных вариантах. Поскольку для этих сортов регистрировалось и максимальное увеличение уровня мутирования генеративных клеток можно предположить, что снижение фертильности при обработке картолином связано с нарушениями в мейове. Препарат 2-ХЭОК увеличивал стерильнсть пыльцы на всех исследованных сортах,- кроме Московского-121. На сорте Московский-2 половина исследованных пыльцевых верен были стерильными при-отсутствии хромосомных нарушений в мейозе. Вероятно, высокая стерильность пыльцы при использовании 2-ХЭФК не является прямым следствием мейотических -аномалий. По данным литературы гаметоцидное действие препарата-связывается с нарушениями работы клеток париентерального слоя пыльника, ответственного аа питание генеративных клеток (Савчен-

ко, 1083). Незначительное снижение фертильнопти было отмечено и для ССО на сорте Московский-3. Препарат эпибрассинолид-Бб не влиял на процесс формирования пыльцы.

2. 3. Влияние фиторегуляторов на соматические клетки первого семенного поколения.

Хластогенное действие препаратов 2-ХЭЖ и картолина не ограничивалось влиянием на генеративные и соматические клетки ячменя непосредственно после обработки, но и сказывалось на первом семенном поколении. Так же, как и в лабораторном эксперименте при непосредственной обработке корневых меристем, соматические клетки первого семенного поколения*сорта Московский-121 исааа-лись нечувствительными к фиторегуляторам. У остальных сортов в этих вариантах уровень мутирования клеток был статистически достоверна выше контрольного.

ССС и. зпибрассинолид-65 на вызывали кластогенного действия в соматических клетках Ш.

Предположительно, сохранение повышенного уровня мутирования клеток в М1 может быть свяаяно с длительным сохранением фиторегуляторов в растениях. Нарушения, воаникаивдо а клетках формируя-«эгося многоклеточного гародьша, регистрируются в первом митозе по увеличению количества'хромосомных абберадий. Не исключено, что высокий! процент нарушений может бШь.связан с генными мута--циями. реализующимися в хромосомные абберации в первом митозе семян Ш (Весманова, 1987). *

2.4. Анализ биометрических показателей

Результаты двухфакторного диспероионного анализа, представление в таблице 4, показывает..что' каотолин достостоверно снижал количество аереН'В полосе у всех исследованных сортов. У сортов Н-9 и и-Е отмечаюсь снижение длины растений. Особенно чувствительным к картолину был сорт 11-2.. у которого наблюдалось так же уменьшение массы 1000-верен. Сорт Мэсковский-121 был наименее чувствительным к обработке картолнном (Табл.3).

С нашей точки врения, отрицательное влияние препарата на компоненты урожая обусловлено тем, что. доза в 0,162 является завышенной. Известно, что даже природные цитокиняны при экэоген-

• - 16 -Табл.3. Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели.

Высота Длина Количество Масса

Вариант раст. главн. зерен в 1000 O.k. il к.

опыта см. кол4Ьа см. гл. колосе вт. верен г.

Носов« 2кий-0 .

Контроль 68 7.80 21.07 43 2.70 1.86

Картолин 64. 48* 7.00 19.06* 41.28 2.28 2.08

2-ХЭФК 68.70* 6.73 18.60* 37.20* 2.Я9 1.02

ССС 67.30 7.18 21.'37 44.08 а 23 1.42

Эпи0рассинолид-5б 68. 52 7.87 21.60 45.32 2.81 1.41

Московский-3 г-

Контроль 67.12 7.52 20.07 46.06 1.46 1.20

Картолин 67.40 6.13 16.81* 46.32 1.62 1.00

2-ХЭФК 61.31* 6.50 16.74* 41.32* 2.42 1.62

ООО 68.88 7.33 18.91 47.44 1.62 1.54

Эпибрассинолид-55 74. 67* 7.50 10.07 47.62 2.66 1.25

• * Московский-2

Контроль 60. 23 7.06 10.57 40.68 1.74 1.42

Картолин 59. 52* 5.40 16.13* 44.92* 1.47 1.28

2-ХЭФК 61.43* 6.10 16.40* 47.00* а 09 1.73

ССС 67.21 6.17 17.87 40.31 1.81 1.60

Эпибрассиволид-Бб 68.10 6.48 17.07 4а 64 1.01 1.2S

Московский-121

Контроль ба 46 7.06 20.47 46.04 2.00 1.62

Картолин еаб7 7.60 w 17.42* 44.08 2.33 1.60

2-ХЭФК баті 7.38 21.00 46.02 а 56 1.83

ССС , 63.91 а 36 10.37 46.00 а 21 1.64

Эпибрассииалид-55 61.67 а 02 21.03 48.48* 2.27 1.47

ня>„.5 3.38 2.23 1.73 2.66 — ■•г—

й к. - общая кустистость. Л к. - продуктивная кустистость * - статистически достоверная разница между контролем и опитом..

ном внесении в высоких дозах оказывают ингиСиторвое действие на

ростовые процессы, йитотоксичнооть синтетических аналогов цито-кинина мнЬго выше. . Wu.-4у природных и связана с их длительным сохранением в ^к^адчййтеНий (Баскаков. 1981) .

Увеличени^«а>ЛнчеЬтва боковых колосьев за счет подавления; роста ^лавноРр" rioöera - характерная реакция на 2-ХЭФК. Примене-нйе ретарданта в условиях засушливого лета-1989 года вызывала у сортов Нэсовский-9. Шсковский-3 и Мэсковский-2 увеличение количества колосьев при уменьшении количества зерен в колосе и массы 1000 зерен, что согласуется с данными литературы (Прусакова.Чи-жова, 1989; Vaddlngton.Cartvriffth. 1986). Возможно, что снижение количества зерен в колосе связано и с, зарегистрированной нами, высокой стерильностью пыльцы у этих сортов при обработке 2-ХЭОК. На сорте Мсюковский-121 не было отмечено изменений биометрических показателей при обработке 2-X3SK.C Этот сорт бил также нечувствителен к ретардактноыу действию препарата

Применение ССС и эпибраесинолнда-бб не оказало сувдэствэн-ного влияния ка большинство биометрических, показателе а.

Обнаруженные нами различия сортового.ответа на фиторегуля-торы очевидно . свяааны с особенностями генотипов изученных сортов и сортовод спецификой проникновения, передвижения,, метаболизма и детсксикации данных веществ. Связь чувствительности различных сортов ячменя к этиленпродуценту, этрел с особенностями генотипа отмечается в литературе ~ - для устойчивого сорта было показано образование дополнительных белковых компонентов, которые. по мнению авторов, выполняют защитную роль (Деева. 1988).

. 3, ■ Изучение последействия фитАрегуляторов.

Д 3.1. Влияние фиторегуляторов! на соматические клетки расте-; ний первого н второго семенных поколений.

- Для изучения последействия фнторегуляторов в поколениях был выбран сорт ячменя Нэсовский-9, продемонстрировавший высокую чувствительность к картолкну и 2-ХЭФК в лабораторных тестах и полевых опытах в 1988 году. При обработке растений картолином и 2-ХЭОК в ; 18ее году/' было повторно зарегистрировано увеличение уровня мутирования соматических; клеток Ш, что подтверждает способность этих препаратов оказывать кластогенное действие на растительные клетки (Табл! S)» Анализ; изменчивости количества хромосомных аббераций покаэал различную чувствительность растений на

, - 18 -. Табл. 4. Влияние фиторегуляторов на уровень мутирования

соматических клеток двух поколений ярового ячменя сорта Носовский-9.

Вариант \ Общее Число ' > - "

опыта число анафаа с X ± т

анафаз нарушениями

1990 год •

Контроль 2783 76 2,73+0,31

2-ХЭФК . 2202 ' 108 4,90±0,46 3,88*

Картолин 2334 136 5,83±0*49 5,35*

1991 год

Контроль 2220 54 2,43±0,33

2-ХЭФК .1656 36 2Д7±0.62 -0,30

Картолин • 1494 48 3,21+0.46 1,39

* - статистически достоверная,разница между контролем и опытом.

(Р>0,05. tst.-l.96) . • - . : '

обработку этими фиторегуляторами. Коэффициент вариации по количеству абберантных анафаз в варианте с картолином был равен 63,092, а в варианте с 2-ХЭФК - 39.10Х, ■ при 11.27Х в контроле. Применение фиторегуляторов ССС и эпибрассинолид-бб, так ж как и в 1988 году, не влияло на уровень мутирования соматических клеток Ш. Отличия между растениями опытных вариантов были несущественными. ' • • '-Ч -'."■■. *•'"''".'

В корневых меристемах растений 1С ни в одном ив опытных вариантов не наблюдалось достоверных от контроля отличий,- что свидетельствует об отсутствии кластогенного действия препаратов: на второе семенное поколение (Табл. 4); » Различия растений опытных вариантов по уровню мутирования соматических клеток были не вы-ве, чем в контроле. ' • ; : • V у Ч -.7' •'

' Отсутствие цитогенетических изменеий в опытных вариантах, с ' надой точки зрения закономерно и связано с наличием соматического и гаметического отбора пораженных клеток в вегетируицвм

растении.

3.2. Анализ биометрических показателей растений ячменя двух семенных поколений.

*

Обработка картолином и 2-ХЭФК в 1990 году, так же как и в 1989 году, привела к достоверному уменьшению длины растений, количества верен в главном колосе, массы верна с главного колоса (Табл.5). Варьирование биометрических показателей у опытных рас-

ТабАБ. Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели двух поколений ярового ячменя сорта Нэсовский-9.

Вариант Высота Длина Количество Масса верна

опыта растения главного зерен в главном с главного

см. колоса колосе колоса

• от. г.

1990 ГОД

Контроль 62,42 8,66 21,40 0,86

2-ХЭСй 54,06а 7,96 16,63* 0,63*

Картолин 56,48* 7,38 15,18* 0,66*

Эпибрасси- 61,31 7,98 19,64 0,82

нолид-55

ССС 61,64 8,00 20,34 • 0,82

НЗР 2,84 1,20 1.^2 0,14

. 1991 год

Контроль 77,68 9,22 26,46 0,76

2-ХЭФК 76,93 9,06 25,06 0,73

Картолин 76,60 9,10 25,23 0,72

Эпибрасси- 77,70 9,98. 25,06 0,73

нолид-ББ

ССС 76,69 9,54 26,24 0,73

НЗРо.з 2,53 0,39 0,93 0,*5

* - статистически достоверная разница между контролем и опытом.

тений было выше, чем в контроле. Особенно заметным был эффект по признаку количество зерен в колосе - коэффициент вариации по этому показателю вдвое превышал контрольный. Применение фиторе-гуляторов ССС и эпибраесинолида-5Б яе вызывало существенных изменений по биометрическим показателям, что согласуется с результатами, полученными в 1989 году. I

При пересеве семенного материала от обработанных в 1990 году растений опытный материал статистически достоверно не отличался от контрольного (Табл. 5). Коэффициенты вариации в опыте по' большинству признаков били близки с контрольными, однако, всхожесть растений обработанных картолином и 2-ХЭОК была несколько ниже, что предположительно может быть связано с высоким уровнем мутирования клеток корневых меристем в проростках семян Ш.. Таким образом, не было выявлено последействия картолива, 2-ХЭФК, ССС и эпибрассдаголида-Бб на биометрические показатели растений

мг.

. Увеличение изменчивости у опытных растений в год обработки по онтогенетическим и биометрическим тестам можно объяснить вое-южюй физиологической вариабельностью растений. В частности, в момент обработки, растения могут находиться на близких, но различных стадиях развития. Эффективность яе применения рострегули-рующих средств существенно вависит от фазы; органогенеза. Таким образом, даже при высокой степени генетической однородности сортовой популяции, для отдельных растений можно ожидать отличия в ответе на фиторегуляторы, , приводящее к увеличению коэффициента вариации по отдельным признакам в год обработки.

.'■■■". вывода": '

1. Применение синтетических регуляторов роста оказывает существенное влияние на морфофиаиологические и генетические процессы у растений. Масштабы колебаний этих показателей зависят от природы и концентрации химических соединений и от генотипа сортов. / ...'

2. фи скрининге фиторёгуляторов на кластогеяную активность в биотесте А111шя Пгииогшп установлено, что :

-IX и О,IX ГМК-На вызывала цитотоксический эффект, 0,01Х -0,0012 ГМК-Ыа обладала кластогенным действием. Минимальный порог кластогенного действия для препарата составил - 0.001Х; ; ^

- этиленпродуценты гидрел и 2-ХЭФК обладали клаетогеннш

- 21 -

действием только в IX-ной концентрации;

- ix-ный картолин вызывал цитотоксический эффект. О,IX -0.01Х картолин обладал кластогенкым действием. ГЬроговая кластогенная концентрация препарата - 0.01Х;

- 10""г - 10е X эпибрассинолид-бб, IX - О.ИХ - декстрел. IX - Q.01X ССС не вызывали увеличения уровня мутирования хромосом.

а При обработке фиторегуляторами С О.БХ 2-ХЭЗЖ, IX СХХ!, 0,1БХ картолином, lCP1*X эпибрассинолидом-Бб) посевов ячменя зарегистрировано , что:

- 2-ХЭФК и картолин вызывали цитогенетические нарушения в мейозе. снижение фертильности пыльцы и увеличение уровня мутирования клеток первого семенного поколения. Эпибрассинолид -55 и ССС не обладали цитогенетической активностью в генеративных и соматических клетках ячменя;

- кластогенное действие картолина сопровождалось изменением биометрических показателей - уменьшением количества зерен в главном колосе, массы 1000 зерен, снижением высоты растений: обработка 2-ХЭФК вызывала увеличение количества колосьев при снижении высоты растений, количества верен в главном колосе и массы 1000 зерен. Эпибрассинолид-бб и ССС нэ вызывали существенных изменений биометрических показателей.

4. Установлена различная чувствительность сортов ячменя к фиторегуляторам картолин (0.16Х) и 2-ХЭФК (О.БХ).

- сорт U-121 был наименее чувствительным к кластогенному действию картолина и 2-ХЭФК. Для этого сорта не было зарегистрировано и существенных отклонений по биометрическим показателям.

- чувствительность сортов Н-9.1 11-2, м-3 была примерно одинаковой по сумме цитогенетических и биометрических тестов.

6. Наказано отсутствие последействия 0.16Х картолина, 0,5Х 2-ХЭФК. Ю-3"* эпибрассинолида и IX' ССС на цитогенетические структуры и биометрические показатели растений ярового ячменя второго семенного поколения.

б. Полученные результаты позволили предложить дополнительные параметры в** Методические рекомендации по комплексной оценка генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве", подготовленные с нашим участием.

- гг -

СПИСОК РАБОТ, ОПУВПКОВАНШХ OO TBflC ДИОСЕРТАЦШ ,

1. В. С. Шввелуха. X Ж. Х]русталева. Я X. Ндиновскяй. И М. Ролов-яяна к др. - Генетический контроль ав прямевеяяем регуляторов роста растений - / "Вестник с.-х. науяГ, 1060, N.2. 0.48-60. :'-/.'

2. в. с. Шввелуха. X X. фусталава, Ж. К. Riaaoaoiutf. С. И. Голвв-ннна и др. оценка генетического риска применения регулипцх» роста. /"Регуляторы: роста в растениеводстве" К. - 1980, с. 137-134. - ' ;

3. К С. Шввелуха, Е К ЕююовскяЯ, X К. Лрусталева. EL М. Голов-яява и др. "Методическиерегомендацп по юшдекояойоцрнхег»-ветического ряска применения Дтирегуадтцриь в растениеводстве" Л.' ICXA, 1902 Г. 28с.; • • у - / ^ :

4. ЕС. Иввелуха, XК.Эфусталева, X.ЯВлнновский. ХХМ.П>-лпввнва. Оценка мутагенной активности рада фиторегулаторов./ Те-аасы докладов ва заседании секции генетических аспектов дроОлещ "Человек и биосфера", Ереван, 1987, 0.117. .'•

6. X X. фуеталева, X. В. Влхаовсккй, El М. Головина, Г. К Андреева и др. Окринанг на мутагенную актнввость доимг фяирегу*» -торов. / Тезисы докладов Ввееоввшго ешоовяушмО0ъ0М вывтоды теиотоксической оценка в поОочны» эффектов оисхжл'ичьоки-активных аецвств", Ленинград, 1989, о. 32. V:.. \' -лV'.i'

в. х и. зцусталева, Г. а Андреева, ь К Головя1ша, А. Х. Ввобш1 я др. Геветнчэскиа контроль ва применением картолина и кампована шв вервовых культурах. / Тееисы докладов врвс(»рвогр кц»|днмапн-шииаго совещания "Генетические последствия аагреввення: окруюя-Ш0» среды" Мзсква-Самарканд, 1000,' с.186. ;

7. Khrustaleva L. I.. Andreeva a H. , aolovnina a il Adaptation or Hcrdeun vulearls{variety Hoaow*iy-9)to v growth insulators in - a three ; year trial. /Proceedings of the 5-th ¡international Youth Symposium "Plant aetabollsa regulation", Warns. Bulgaria. 1000. p.180-183. ""'-•■^"vV "

а XJL Црусталева, Г. И. Андреева. П М, ХУшднпта. А;а, вж>-Лт Юнсгеветичвские аоследавашк в соматическяхн генеративны» яавпак ячменя, обработанного эпиОраеиволадсм-бб в полевых условиях/ Тваисы докладов совеяцти "Врессиностеро«ды",1йшок, 1001, ¡и-а-аг. -..VЧ;--, ":-/: ' ✓ —-:Т-л-;.

9. хЖ.Здсталева. Г.И,Андреева. ИМ.Голодиявр.А.Ж.Елобин Фаавтвсюв аослвдствня пришяения химических средств е сель-авиом жввлеят./ Тезисы докладов н-п конференции "Цшродоохран-

выв аспекты земае пользования и с/х производства в свободных эко-вомгавскнх зонах", Ленинград, 1991, с. 47.

10. L. I. Khrustaleva, Q. К. Andreeva, Q. ML Gblovnina, A. I.Zlobln The ргоЫея of preservation or germoplasm in the conditions oT antropogenlo pollution. / V. Abst. 4: Exchange and oonvertatlon oT Plant Qenetio Resources between America and Europe. Entobotanloa-92** Cordoba, 1992. p. 42.

11. JL K. фусталева, D. If. Головника . к вопросу сохранения растительного генофонда: Онтогенетические эффенкты ретардантов в генеративных клетках ярового ячменя. / Доклады РАСХН. 1994, М. 6. (в печати).

12. Л Ж. ЭДсталева, II К. Головкина Влияние брассинолкда на цитологическм и фенологические. показатели у ячменя ( Horde uei vultare L.) в уело—их солевого стресса. / О/ж биология 1996, N. 1 (в мчш),

■ Объем 1'/г п. л.

Тираж 100

Заказ 574

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва Н-550, Тимирязевская ул., 44