Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭКЗОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ГЕНОМ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ЭКЗОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ГЕНОМ РАСТЕНИЙ"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ХРУСТАЛЕВА Людмила Ивановна

ЭКЗОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ГЕНОМ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1994 .

-

е

\

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной био-' технологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева

Научный консультант- доктор биологических наук, академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. В. Мазин; доктор биологических наук,' профессор В. А. Зинчен-ко; доктор биологических наук, профессор Б. Ф. Ванюшин.

Ведущее учреждение — НИИ сельскохозяйственной биотехнологии -

Защита состоится «&■>■> ^^^__ 1994 г.

в < » час на заседании специализированного совета Д.120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А Тимиря. .•'а

Адрес: 127550 і ул Тимирязевская, 49 Ученый

сов^т ТСХА

( „..ссертацией можно ознакомиться в Центральной науч- . ной библиотеке т""*

Автореферат

1994 г

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:Актуальность проблемы. Средства сельскохозяйственной хи--мии ; являются факторами внешней среды, которые способны вызывать изменения в наследственных структурах растений. Мутагенная активность найдена у многих пестицидов. В плане генетического риска применения эта группа веществ является наиболее изученной. Анализ литературных данных лишь по 400 пестицидным препаратам показал, что 262 из них вызывают мутагенный эффект (Куринный,1983). Экзогенные регуляторы роста, в отличие от .пестицидов, изучены меньше на предмет их генетической безопасности. По-видимому, это связано с тем, что фиторегуляторы не обладают "дидным"-убивающим действием, применяются в малых . концентрациях и способствуют росту и развитию растений. Пээто-му создалось обманчивое впечатление о том, что эта группа биологически активных веществ безвредна для растений. Однако не следует забывать, что физиологическое действие» фиторегуляторов направленно непосредственно на культурное растение, а механизм действия обусловлен главным образом сдвигом гормонального баланса, вменение содержания нативных гормонов в организме при 'воздействии экзогенных регуляторов роста может оказывать как ; положительное, так и отрицательное:действие на растения, проявляющееся в виде различных типов мутаций - (Каллах, 1981, Kumarl,' Vaidyanath, ' 1989, Nagl, 1988). Показана способность вызывать нарушения в структурехромосом и дм самих фитогормо-нов при их экзогенном внесении в высоких концентрациях (Арара-ТЯН, 1989; D'Amato, 1985). -

Локализация генов в хромосомах * определяет ; ведущую роль ядра в• формировании фенотипа. Функциональная активность ядра ' регулируется фитогормонами. Хотя пока ни для одного фитогормо-на не найдены конкретные локусы ДНК. ответственные за гормональную регуляцию экспрессии генов (Решетников.1992). Однако наличие мутантов с блоками в определенных звеньях гормонального действия дает надежду ' экспериментального приближения к проблеме растительной гормональной регуляции (Scott,1990). . >■/' Экзогенные регуляторы роста, ингибируя или активируя синтез эндогенных гормонов, способны активно влиять на ядерные структуры растений;. - Кроме' того-;синтетическне регуляторы шгут ' непосредственно выбывать изменения',, в; -геноме растений 's ''.'-•■•'■'•'■.■г-Ь" • • Ц . v.;i ■"■-•'.■ ■

: '.-.Г. '; ь

•'...". с?л.с<ьчэ л {5д5мии

И'<1. 11. А. .

вследствие специфики их химической природы (Cortes et al..1985), наличия в коммерческих препаратах примесей (Grant,1979) и образования мутагенов при их метаболизме в растениях (Plewa, Gentile,1976).

Одним иа последствий такого действия фиторегуляторов является ухудшении основных показателей сортов сельскохозяйственных культур из-за быстрого накопления в них мутаций, ведущего к потере части ценнейшего генофонда растений

В свиач с этим возникла необходимость обязательной проверки вновь соэдавимых и применяемых в с->льоком хозяйстве химических срндетв на их генетическую беэопасность для культурных растений. Агроценпаы, являясь неоть^млимой составной частью Сиоцнносюв, активно влияют на состояние дикой флоры. Поэтому осозор внимание в настоящее время придается разработке и стандартизации методов оценки на растениях (plant assays) мутагенных л канцерогенных свойств химических соединений, попавших в биосферу (Sandhu S. S. et al. ,1Q91). Согласно Международной программе безопасности (IPCS) проводится координация исследований в растительных тест-системах и создается банк данных.

Систематические исследования по оценке генетической активности химических средств регуляции роста и развития сельскохозяйственных растений в нашей стране не проводились.

Открытыми остаются многие вопросы о влиянии фитогормонов и синтетичрских регуляторов роста на ядерные структуры растений, нет точных знаний о мутагенной активности последних и степени наследования вызываемых ими повреждений в геноме растений

Цели и задачи исследования. В соответствии с изложенным целью работы было научение действия фиторегуляторов на геном растений для соаднния комплексной систоми генетического мониторинга, основанной на растительных ti-lt-объектах и позволяющая учитывать проявление и<,м. «еняй в геном« растений на молекулярном, клето-JHOM, оргчкис)|»енн м и гюпуллционном уровнях биологический Opr&riHd own

ДЛИ ДС^ТЮкзНИН nui CuB.eil ¡(¡Л I ^ЛИ НйиГлЗДДИмО было решить СЛсД^ЮцШ? основниые одзч^и

1 Изучить OfuOeHHuv. Г.! LvlTji^H ТИЧ и fO ДСЙСТЫИ ЗКсЮ" leHHux р«г>лнторов pocia ь m.i ими ги от ке тентрации, про-

должительности кластогенного последействия и физиологического состояния растительной клетки.

2. Выяснить способность фиторегуляторов индуцировать генные .мутации и вызывать, ДНК-повревдающий эффект (тест Эймса, . индикаторные штаммы Е.colt). ;

3. Изучить характер воздействия фиторегуляторов на кинетику клеточного цикла растений.

4.. Исследовать особенности проявления цитогенетического действия в зависимости от генотипа сорта.

. б. Изучить влияние фиторегуляторов на процесс мейова и формирование пыльцы; установить степень корреляции кластогенного действия фиторегуляторов в генеративных и соматических клетках растений.

6. Выяснить возможность использования в качестве, непрямого теста на генные мутации, индуцируемые, фиторегуляторами, учет изменений в спектрах белков эндосперма и изоферментов.

7. Определить возможность проявления генетической активности регуляторов роста в последующих поколениях, и выяснить особенности их действия при ежегодных многолетних обработках.

На защиту выносятсй следующие положения.

1. Комплексная система оценки генетических последствий применения регуляторов роста растений, основанная на растительных тёст-обьектах и позволяйся учитывать проявление изменений в геноме растений на молекулярном, клеточном, органиэ-менном и популяционном уровнях биологической организации.

2. Основные закономерности воздействия синтетических регуляторов роста на геном растений определяются химической природой и концентрацией веществ, повторностыо обработок и зависят от генома растений, .стадии клеточного цикла и физиологического состояния клеток..

' 3. Синтетические регуляторы роста растений активно влияют на кинетику прохождения клеткой митотического цикла. Ретардант 2-ХЭФК и ГЫК-Na увеличивают продолжительность клеточного цикла, угнетают митотическую активность клеток и образуют блоки на рубеже G1/S и G2/M - фаз. Брассинолид стимулирует вступление клеток в фазу синтеза. Структурный аналог цитокинююв -картолин обладает? дозозависимым воздействием на кинетику клеточного цикла. . .

4. Показано,, что кластогенный■ эффект регуляторов роста:

сохраняется только в первом семенном поколении.- \ ;"■;•. ■ '

Научная новизна: работы. В ходе выполнения исследований дана цитогенетическая характеристика корневой меристемы про-.': растаисэго семени лука-бзтуна (Allium fistulosum'.U) ' и на основании этого разработаны методические подходы использования данной экспериментальной модели в качестве Оиотеста для скрининга фиторегуляторов на мутагенную активность; Впервые изучен , кластогенний эффект у 14 фиторегуляторов: в растительной ■:■' тест-системе.. Показана природа кластогенного действия препаратов в зависимости от их концентрации и стадии клеточного цик- , ла. Шлученны данные о характере и продолжительности; мутаген-; ного'последействия на клеточном уровне.! : 7'■■ - Г : ,V >

■ Впервые на индикаторных вггаммах бактерий изучены молекулярные основы мутаций,, вызываемых картолинои.Установлено/ что';' препарат индуцирует точковые мутации типа сдЪига рамки считывания и замены пар оснований; ■ но не оказывает ДНК- повреждал* шего действия, т '-; .'....' - /.'.V. .'■';-. .'.,":■■.>' "•'. vji

. Приоритетными являются получе иные данные1 по.; цитофизиола-''^ -гическому действию экзогенных регуляторов роста.: .; Впервые изучено влияние . ретардантов на прохоидение'клеткой фаз митоза и продолжительность цшіла в целом.. Установлено, ': что ретарданты; вызывают образование блоков; на. рубеже. G1/S- и С32/М-фаз-и ; уве-' личивают.продолжительность клеточного цикла. Брассинолид сти-т Эмулирует вступление клеток в фазу синтеза.. Для картолииа показана ярко выраженная: зависимость' цитофиэиологического.эффекта '. от. дозы препарата,- • проявляшуюся в ингибировании - или, стимула^-■ ции.клеточногоцикла. ■ -V', '•••': .':.>•••'• ';'".'•'. : .;'■

,;'•*' На основании данных.' по влиянию.фиторегуляторов на. кинети-'. ' ку активно■, делящихся клеток предложено дополнение, к трактовке: о системах аащиты генетического материала от ошибок и повреждений, . заключаются в остановке клетки в менеее энергоемкой / стадии цикла,.1 где;' минимальная, ■'" вероятность'..V-* повреждений (предсинтетическая G1- и поетсиятегическая К-'фааы).Покааана возможность: использования' фиторегуляторов для;: эксперименталь-'¡. ного'машшулировшшя.клеточным -їдоком.'.'.-.'': У- ■ '--.;.;v-'^"- / і f ; .- ІЬлучены оригинальные данные па влиянию ретардантов и ан-.,-тистрессоеых препаратов ; на генеративные структуры у различных генотипов ячменя. . ■ Сделана попытка■ использования в качестве непрямого теста

• - ь -

на генные мутации- учет изменений в спектре белков эндосперма и иэоферментов.

Выявлены неизвестные ранее закономерности в действии ре- тардантов и антистрессовых препаратов при постановке многолетних полевых опытов.

;" Практическая значимость работы. Разработаны практические рекомендации по генетическому; риску применения регуляторов роста растений, которые переданы в Центральный институт агрономического обслуживания "сельского хозяйстваЧШНАО! и Государственную межведомственную коммиссию по испытанию и регистрации средств защиты растений, где были использованы для регистрации веирств и обоснования санитарно-гигиенических регламентов беэопасного применения.

Цатериалы по влиянию фиторегуляторов на структуру: хромосом, кинетику, клеточного цикла, синтез белков и иэоферментов используются в курсе лекций по биотехнологии в разделе "Регуляторы роста и развития растений" и проведения практических зЪнятий (Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания, VI: МЗХА, 1991) ■ -/ . .'.■

Разработаны Методические . рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве. Проведение исследований согласно предлагаемым рекомендациям позволит оценить степень генетического риска применения фиторегуляторов на сельскохозяйственных растениях, ограничить -сферу применения вешеств. . проявивших мутагенный эффект,' отработать более безопасные технологические регламенты применения и рекомендовать к широкому использованию вещества, безопасные в генетическом отношении. ;

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 253 страницах машинописного текста.и содержит•33 таблицы, 25 рисунков, приложение и включает 437 литературных источника.

Автор признателен заведующему кафедры с. -х. биотехнологии, академику РАСХН В. С. Шевелухе аа полезные, замечания при обсуждении * результатов ■■>■ экспериментов,. а также га поддержу при подготовке' диссертации. :" •. ;

Автор искренне благодарит сотрудников сектора генетического контроля кафедры сельскохозяйственной Сиотехн-логки эа '• помощь в проведении экспериментов по цитогенетике Ю. U. Головкину и К. Е ~ Балахяину, . по цитофизиологии ' Б. R Пэгорилую и • . Г. И. Карпова, по биохимии Г. М. Андрееву , и А. И. Злобина.. • Автор • сердечно благодарит за неоценимую помощь и поддеряку при под' готовке диссертации Г.И.Карлова . ' ■ V .-...

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и Си-'. ' осфера" МНГС при ГКНГ • СССР• (Ереван 1987); . в Пяовдивском .; сельскохозяйственном институте (Болгария, Пловдив,1Q87)г на 2-ой Всесоюзной . конференции "Регуляторы роста и, развития растений" (Киев.1988); на. 1 и 2" ежегодном рабочем совещании , - "регуляторы роста.и развития растений" (Мэсква, 1992,. 1993); на Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оцен-. ,ки и побочных эффектов биологически активных.веществ" (Лэнинг- / • •рад,: 1989); . на Всесоюзном;координационном совещании: "Генети-. ческие, последствия загрязнения Окрулаюсщгй: среды мутагенными. .'' факторами" (Самарканд;1990)на б-оМ Мэхдународном-симпозиуме ;,:' ■ "регуляция нетабодивиау-растений" (Варна,' 1990) на II сове«®;;.': нии "Брассиностероиды" ( Минск, 1991),: ■ 'на'.кафедре: генетики -Гро-нингенского университета" (Нидерланды, Гронинген,! 1991) на на-' : учно-практической • конференции "Природоохранные. аспекты ¿eme-. пользования и сельскохозяйственного производства в. свободных , экономических: эонах (Ленинград, 1991); в институте ботаники : Венского университета-(Австрия/ Вена, 1992); на международном конгрессе "Энтоботшшка-92". (Испания, Кордоба. 1992).' •,;■..

'/y/'^ -v;;;-'--: • '■/) СОДЕРЖАНКК РАБОТU

При разработке системы оценки~генетической активности фи-, торегуляторов мы исходили.из положения, что изыс-нения, .возникающие в геНоме растительной ^клетки (генные, "хромосомные и ге- .. н0мны8) М2ггут 'проявляться в виде изменений морфологических и" Физиологических свойств растений;- -биохимических,. -'влиякедих. на .■ течение биосинтеза в клетках; цитогенетических, выявляемых в ■ геноми- делящихся клеток:. и точковых. мутаций. Единого' метода, с ' помощью которого можно зарегистрировать' все эти категории, му-.. - таций! не существует. ГЬэтому разрабатываемая нами ■ система

оценки воздействия экаогенных регуляторов роста на геном .растений включила в себя набор достаточно информативных мето" дов, позволяющих выявить вещества-мутагены и оценить генетический риск их применения.

Общая схем$:испытания экзогенных регуляторов роста.

1.Регистрация изменений на - уровне ; . хромосом. . выявление аОбераций хромосом и геномных нарушений в соматических и генеративных клетках (лук-батун АШитЛеШозшп и яровой ячмень Нопаеит .уи1?аге- Ь.).

2. Регистрация генных мутаций.. - Выявление точковых мутаций на' бактериях Тест Эймса Ба1топа11а/микросомы и. ДНК повреждающего действия на индикаторных штаммах Е. ООП.; "

а Учет биохимических : изменений. Выявление изменений в спектрах белков эндосперма и изоферментов ярового ячменя. ' _ ; ; _ ' .

4. Регистрация морфо':. физиологических изменений. :. Наблюдение по количественным:приз на-кам.(высота растений, длинна колоса, масса 1000 зерен и т.д.) за отклонениями в потомствах Ш, 1С.

5. Накопление и обработка данных на ^ ЭВМ. - ' Установление генетической' безопасности применения фиторегуляторов для культурных растений.

- 8 -

Пэлевые эксперименты были выполнены по г-ледодай схеме СЗннчекко.1988):

1-ЫЯ год

2-ой год

3-ий год

1 о*

10 0

1

1 1

1 і 1

01/

0 0 1

о

о о

ООО

1 - вариант обработки Фиторегулятором.

О - вариант обработки аодой - контроль.

* - последняя цифра соответствует варианту обработки те-

1. Осрмммкг (игорвгуляторов на мутагенную активность.

1.1. ¡¡итоге нетическая характеристика модельного тест-обь-

Клетки корнеаоя меристемы проростков семян лука-батуна являются удобной моделью для изучения действия химических веществ на хромосому: стабильность получения качественных цитологических препаратов, крупные хромосомы; достаточно высокая чувствительность к действию мутагенов. .

Для проведения массовых испытаний веществ в данном биотесте необходимо было ючно установить время выхода первых митозов и появления максимального числа клеток в анафаае. С этой целью филировали кореши проростков семян лука-батуна каждые 2-3 часа начиная с 46 часов до 72 Часов с момента замачивания.

Первые митозы были оариисгрированы через 47 часов. Максимум выхода анс^фаа наблхйлли Через 66 часов (рис 1). Наибольшее число делящихся клечок найдено в корешках длиной 65мм. Шлученниа параметры ле[ лл а основу постановки дальнейших экспериментов.

кушэго года.

екта.

Рис. 1. Динамика выхода анафаз в первых митозах корневой ■ меристемы проростков семян АЦ1ит Г1з1и1озит. . -

' .".'Г (час.)

--Н-'Л/--;Ц-■■ "кореяка

, : . ' т- ^рец? фиксации с начала проращивания '.''А количество анафаз '

2.2. Ошнка кластогенного действия фнторегуляторов. >V.^;:^-'v'B\C0l0fввy«yв^и."'o''. классификацией ■'.- химических мутагенов, • ; соединения." вызывайте структурные нарушения, хромосом, называ-. . ются кластогенами (Шарма, 1989). . : ^ ' "

; * Дсэа-эффект: Анализ аберраций хромосом проводили аяафаз-ным методом.(шуюееа,1980). Выли испытаны следующие фиторегу-ляторы в концентрация* XXX* (хлорхолинхлорид) { ДЯК

: '(2,2-диметилгидразид янтарной кислоты);. картолин; брассинолид, спирокарбон, ГМК-На (натриевая ■ соль '.гидразида малеиновой. кислоты), этилен ^продуценты-';: 2тХМ«: (2-хлорэтилфэсфэноьая • кислота), гидрел (бис1сислый12-хлсрэтилфос4юновокисзп;й гидрази-.ний),: декстрел и:пять вновьсинтезированных соединений из этой .

же группы- ЛЯЗН. 409.111, 39Н5Н, 5001Н, ситрел.

Проведенный днафааный анализ показал наличие кд^тогенно-го действия у тр^х из восьми регуляторов роста из группы этиле »продуцентов. 2-ХЭФК, гилр^л и препарат 3983Н повышали уровень хромосомных аберраций по сравнению с контролем в высокой концентрации - IX. Анафазы с нарушениями в варианте с 2-ЗСЭФК составили 9.35 (в контроле- 3.8Х), с гидрелом- 1Ь,2Х (в контроле- б,?Х). с 3983- 9.8Х (в контроле - 3.2Х).

Анализ спектра нарушений, индуцируемых зтиленпродуцента-ми, показал. что для 2 ЧЭФК преобладающим является образование хроматидных и хромосомных мостов. Гидрел также увеличивал образование хроматмлшх и хромосомных мостов и более чем в 6 раз по сравнению с контролем повышал выход анафаз с отставанием хромосом. По-видимому, гидрел не только индуцирует нарушения в структуре хромосом, но и влияет на процесс их расхождения.

У еитреля, декстрзла, 4093Н, 5001Н не зарегистрировано клвстогенного действия. Напротив, при действии препарата Б001Н в концентрации О,01X снижался спонтанный уровень мутирования клеток. Препараты 4093Н и СИВ5Н оказались онтогенетически неактивными соединениями Ситрел обладал выраженным стимулирующим действиим. в концентрации 0.01Х он заметно снижал спонтанный уровень мутирования клеток.

Обработка картолилом в концентрации II и 0,11 достоверно привела к увеличению доли измененных анафаа. В концентрации 0.01Х не было зарегиетрировчно кластогенного действия препарата. Для картолика преобладающим типом хромосомных перестроек было образование одиночных фрагментов и хроматидных мостов. Действие картолина в основном проявлялось в постсинтетической Фазе С32, когда хромосома удвоена и представлена двумя нитями.

ГЫК-На в концентрациях 1-о IX обладал цитостатическим действием, задерживая деление клеток на стадии метафазы и вызывая сильную спир<*лизацию хромосом, в варианте с концентрацией IX доля мегяфгш составила 80,4Х от числа делящихся клеток^ При сняжвнил концентрации ГШ-Ка количества делящихся клеток, задер«1_ь/1ьос в стадии мстчфазы, уменьшалось.

0,01-0,001Х ГМК-На индуцировал статистически достоверное увеличение числа аберрантных анафаа (13,6Х и 10,2Х соответственно, контроль- 4.8Х). В более низких концентрациях 0,0001-0,000001Х) не было эа^гисарировако кластогенного

и-. -'

действия препарата. ■ ....

; Яаблюдается четкая зависимость эффекта от дозы препарата (рис. 2).. При ; характеристике, мутагенных свойств веществ имеет

■" •Рис. 2. Зависимость выхода аберраций хромосом в клетках V' Allium fistulбэит при действии регуляторов роста.

% аберраций '

■ . ■. is

• . ; ■ 14

-12 '■ 10

.. •.••■'■ "8 6

2

°ю 1С**": ю'* • юЧ ю"*' то"1, • V-* ■

концентрация^

У — ГМ<-М ■ ■ * -+-■ Кфгожи - 4"-*- 2-ХЭЖ • '

•• \ V 3 Гйфм • V **"

важное значение понятие о пороговой дозе, Классическим определением пороговой дозы в химическом мутагенезе является такая; доза»' при'уменьшении которой вещество уж не индуцирует мута-, ций* Величина этой доаы всегда будет зависеть от чувствитель-, ности метода и биологических/факторов.влияющих на проявление мутагенного действия- метаболическая дезактивация ¿ : проницаа-Мость мембран. реакция с компонентами клетки, работа систем

репарации. \ ; .. "--Л .■-■.."■

1 При решении.' прикладных вопросов о. безвредности применения

того или мого соедшенга мы такяе пользуёмся , понятием порого-'

вая доза кластогенного эффекта - недействующая доза, при кон-., центрация* ниже, которой- не регистрируем статистичеі_.іи достоверного увеличения аберрантных анафаз;над спонтанным уровнем. Однако спуск к минимальной,дозе при которой не проявляется по-' ОочныЯ мутагенный эффект имеет смысл,'. 'если фиторегуляторы . в этой доае сохраияш свою физиологическую активность; ретарданта, антистрессового препарата и т. д. . . ' .' [ . , V

г і. 1.3. Продсллитбмность кластогенного последействия. ; В данной серии экспериментов - ш попытались ответить•на вопрос, как долго сохраняются-нарушения при .снятии;:действия-ве№ства. С этой целью были ^отобраны.' вещества-^'проявившие кластогенний эМ*жт, а именно, О.ОІХ картолин, 0.001Х ПЖ-Иа, IX 2-ХЗФК и IX ■ гидг>ел. .48- часовые прорбстки лука-батуна бшш обработаны ф.)Торегуля'ГорамилЬ течение 18часов, . а затем.доращивались в течение ЗГ> часов на воде. г *: - * -

В вариантах 1с 0,0012: ГМК-^а и IX 2-ХЭ1К уровень мутирования оставался выше спонтанного 'на протяжении 3-х фиксаций (табл. 1). Одной иа причин такого длительного последействия является повышенное число хромосомных и .хроматидных мостов,.- индуцируемых этими препаратами." Возникающие Vв ' анафазе. «эсты] рвутся и образуются две дочерние клетки с разорванными, хро-*мосомами, которые в свою "очередь продолжают цикл разрыв-слияние-пост. Другая причина последействия, / вероятно; 'овявана о тем. что эти препараты, увеличивая продолжительность клеточно-, го'цикла, вадерживают продвижение клеток по циклу . :И , нако-. нец, это могло быть..результатом присутствия регуляторов в клетке.' •""'-'•'■'.-Ч.'.- Л'. — '-*'-'.4'. ••'

'.'"•..' 11-Ягидрел, индуцировал повышенное число мостов ¿'однако к третьей фиксации уровень мутирования.'клеток ' статистически ^достоверно не:превышал-зтот^показатеіь вконтроле, что,' вероят . .но, свяаано с более быстрым; выводом-препарата из организма.'- .

V /Б варианте с картолином уже-ко второй фиксации.т.-е.:через 18 часов после снятия действия.препарата не обнаружено. достоверного превышения числа-аберрантных анафаа. >:.-"•

'• Продолжительность- ••'.'. кластогенного' •• последействия -'.аа-.'*' висит от многих причин,.; но наиболее .существенные:-..это характер структурных повреждений хромосом, изменения - кинетики прохождения клеточно цикла и бйотронсформациа препарата.'

' * " * " ' •г' * ■ 13 ~ >*,'• "'": : ""' *

",' ' ' .Таблица 1..

Динамика мутирования хромосом в клетках корневых меристем А. Неводит в течении 3-х митотических циклов* при воздействии фиторегуляторов.

Препарат Концент- . рация, Уо Время . • пос^е 1 контакта с регулятором (час.) Количество анафаа с нарушениями," • • 2 + ш • ■ , Спектр нарушений (на 100 анафаз)

одиночные мосты парные мосты -,

Картолин ' 0 . 8,79+1,26* 3,13 2,73

0.01 - 18 6,41+1,01 - 2,03 3,03

36 4,82+0,86 - .2,06 * 1,72

ГМК-Ма . 0 10,16+1,23* 9,00 1,50

10"3 \ 18 11,25+1,34* . 6,71 1.64

,36 10,8641.36* 6,06 1,50

Контроль 0 ' 4,81+0,94 2,54 1,35

18 4,23+0,88 1,54 1,03

- Зв > 3,92+0,86 1,37 1,37

- • 2-ХЭФК 0 : 12,46+1,45* - 4,67 2,33

1 - 18 . 14,67+1,64* 3,50 7,24

36 12.3641.43* .2,70 4,75

Гидрел , О 19.96+1,65* 12,2 2,61

1 18 : 12,13+1,41* 6.14 • 2.43

36 , 6,60+1,07 2,14 1,62

Контроль.' • 0 4,58+0,76ч 2.73- .1,16

18 4.38+0,87 2,39 2,09

■ : Г . 36 4.77±0,91 2.39 1^.82

* - Р < 0,06

*;'v'v.' ' - ; 14 ^V.-y.".'Д.; V. .'V-' •;;

1.2.Генные. Нутации. '••".:. '' .;' • ' :■ •'■ -

- : •. Способность фкгорегуляторов индуцировать: генные мутации исследовали в. тесте; Salmonella typhlmurlum ¡.ТА1Б37, : ТА98,' TAI 00. Набор - ' указанных игаммов поаводяе« варегистрировать i 'действиё мутагенов, вызывающих замены пар оснований в молекуле • : ДНК (TAI00) и сдвига рамки : считывания; генетического кода у . fframsshift, ТА1Б37 и ТА98). . Учет мутагенеза проводили по' ин-. ' дукции реверсий от ауксотрофности по гистидину к прототроф- ; ности (his- his) у использованных пггаммов... , ' .. ' ¿

Препараты картолин, спирокарбон, ГМК-Na, 2-ХЭвК, XXX, г дёкстрел и гидрел вносили в стандартньы разведениях -o/l;.. 1;.: i10; 100; 1000 мкг/на чалку Штри. • • ' ; \ - V: VV :'■ V .В качестве позитивны» кЬнтродейj в■ соответствии с Мзтоди-•; ' ческими рекомендациями, испольаовали соедкнения, индуцирующие мутации у тест-штаммов'-в условия* отсутствия или наличия, метаболической активации/ Для вариантов с неполной микросомальной • активирующей смесью (НМАС)' - нитроаометилмочевина,; 2,7-кизил* но-4.9-диокси-БЛО-диоксо-4,б19,10-тетрагидро-4,9-Диааопирен. . (ДДДГДП) и З-аминоакридин, v а-для вариантов с полной микросо'-v мальной аетивирушэй смесью (ШАС) - нитроаоморфолин. *. i-b-'-J-:■ * Картолин в 1 разведении 0,013 мкг/чашку; индуцировал генные} мутации типа ' сдвига рамки считывания и замены пар оснований в./ условиях: наличия . или; отсутствия ' метаболической-.. активации '.(рис.3). . :У>; '';>•;-. С.--'- V-Д-V-;---

. - ПК- Na вызывал индукцию генных, мутаций на - всех; тест-штаы-^¿i ; махлишь в условиях,', метаболической активациив разведении ! . • V мкг.на чашку.'"', ■..:■;." /;,.'• ;•.••• Д'Ду-г f

- Г&юпараты 2-ХЭФК,.'. ХХЗС. декстрёх и гидред не выаывал уве-,| личеншг частоты генных, мутаций.ни-:у:'.одного;."-га индикаторных»} штаммов S.typhlmurlum, как в опытах с-неполной микросомальной активируюшэй смесью, так и с полной микросомальной активирую--шей смесью.

1.&ДНЯ- повреждающее действие. ':','-. ' " • .';

. Изучение.ДНК: повреждающего действия .препарата картолин проводили на втамш Е.coll №2 дикого типа и его мутантах polA и гесА.

V. Этот метод представляет собой. суспензионный тест Щ--■ vitro,', основанный:на регистрации ройта бактериальных штаммов,'

Рис. а Учет генных мутаций в тесте Ба1топе11а/микросомы (тест Эймса), индуцируемых картолином.

ЧИсло ревертантов на чалку

Штамм ТА 1537

- Контроль (ШАС)

- Контроль (ШАС)

- Картолин (ШАС) 'Картолин (ПМАС)

Игаш ТА 98

- Контроль (НМАС)

- контроль (ПМАС)

Картолин (НКАС) „ Картолин (ПМАС)

10у10 10 1$'10'^0<1Г0*'1сГ Концентрация

Штамм ТА 100

- - Контроль (ШАС) • - Контроль (ПМАС) .. Картолин (НМАС) Картолин (ПМАС)

10" 10 -й^'Л^о' 10е Концентрация

несущих мутации в генах, контролирующих различные этапы репарации ДНК. Гены polА и геоА контролируют'процессы эксцизионной и пострепликативной репарации соответственно. При наличии ДНК повреждающего дйствия исследуемого вещества при определенных * его концентрациях, рост бактерий, несущих мутации polА и reoА не регистрируется, тогда как бактерии дикого типа проявляют нормальную способность к росту,

В качестве позитивного контроля использовали препарат ряда нитрофуранов - фурааолидон - индуцирующий ДНК-повреждающий эффект. Картолин не проявил ДНК-повреждающей активности в стандартных разведениях 10-10 , но препарат в разведении 10 оказывал антибактериальное действие, которое может маскировать возможное JJHK-повреждак№е действие картолина в диапазоне разведений 10 - 10 Для юго чтобы исключить эту возможность была проведана дополниіельная серия экспериментов с испольеованием более дробной шкалы разведейий. Использование расширенной шкалы разведений не выявило ДНК- повреждающего действия картолина.

2 . Проявление цитагенетнчвского действия фаорегуляторав в завиюмостм от генотипа.

Универсальность и единообразие строения хромосом у эука-риот позволяет в определенных пределах экстраполировать данные, полученные при изучении хромосомных нарушений о одних растительных объектов на другие.

Представляло интерес ьыяснигь отзывчивость на воздействие фиторегуляторов 4-х сортов растений ярового ячменя (Носовс-кий-9, Иэсковский-2, Московский-3 и Мэсковский-121) . Были отобрлны два препарата из группы ретардантов - IX XXX, который не проявил кластогенного эффект в опытах на луке-батуне и 2-)ИвК - препарат с кластогенним действием Эксперименты были проведены б два этапа. В» начале в лабораюрных опытах методом анафааного аналиаа нарушений в клетках корневой ивриэтемы проростков выявлена чувствительность сортов к препаратам. Затем в полевых экспериментах проведена обработка посевов регуляторами роста в стадии выхода в трубку и научено влияние препаратов ьа Геном растений в соматически* и генеративных клетках

' ,• . - 17 - : ; ^ " V

; 2.1. Кмастогеняое действие в соматических клетках ячиеня .-'. ~ \ (лабораторные опыты).-

КластогенныЯ эффект XXX не был обнаружен ни на одном иа

• ■ испытуемых сортов (табд. 2). В варианте , с 2-ХЭШ цитогенети-

ческий эффект проявлялся на • трех . сортах - Носовский - 9,

• .. Мэсковский 7 2 и Московский - 3 при наибольшей чувствительности

сорта Московский - 3: здесь доля анафаз с нарушениями более чем ; в. 7 раз превышала этот, показатель в контроле. Сорт Московский

• . 121 оказался; устойчивым к воздействию 2-ЗСЭ4Й. .

; '• • ' - .' .'.. '.' . ' Таблица 2

, Цитогенетическая активность ретардантов в клетках." корневой меристемы четырех сортов ячменя.

Сорт ячменя' Препарат Всего анафаз ^Анафазы с нарушениями -м

всего Л 2 і Щ

йэсовский-9: Контроль 2-ХЭФК V. XXX ', 530 520 500 . * 10 " 39 5 1.91+0.59 7. 63+1.16 1. 04+0. 44 4.30* 1.22

Московский-2 Контроль 2-ХЭФК'. XXX 500 . 600 500 : ' ■ ."'э ;Г 36 ; 10 . 1. 80+0. 59 6. 02+0. 94 2.69+0.63 3.70* 0.23

Московский-З Контроль 2-ХЭФК XXX 545. 600 600 8 ; , 38 ■"'" '•■" .'•■3:; 1.57+0.52 10.83+1.39 0.54+0.28 9.78* 1.70

Мэсковский-121 Контроль 2-ХЭОК XXX 540 .500. 520 —; 8 15 ;'•'. \ 1.57+0.52 а 08+0.76 1; 75+0.55 • 1.58 0.21

* '■>'■'.* - р < 0,05 ■.".'' ■. ; .

; Спектр структурных >• изменений. хромосом,,1 \ индуцируемых •. 2-ХЭФК, также зависел от особенностей генотипа сорта. Так, на : сорте Носовский - 9 преимущественным типом нарушений были оди, ночные и двойные мосты, на сорте Московский - 2 препарат вызы-

■■'■'■' ' • - 18 - À:: ; V,.

вал образований хроматидных фрагментов и одиночных мостов, а , на сорте Мэсковский -;з были зарегистрированы почти все типы : аберрация с максимумом одиночных мостов. ... ; Л Л-

V 2.2. Сравнительная. оценка цитогенетичесного ■' действия ре- ' i ■ -, : тардантов в ' соматических и генеративных1клеткахС';. :;•■■/■. ;/:'■• : (полевые ОПЫТЫ). ..- . .'••" .. у Влияние ретэрдантов на процесс мейоза наблюдали в мате. ринских клетках пыльцы ( UKT0 в течение двух мейотических де-: V : лений. Цитогенётический анализ был проведен в метафаэе 1 (И))'.'. анафазе 1 ( А1) ■ и тетрадах. Увеличение общего числа нарушений в Ш было зарегистрировано на'Носовском-9 7и Московском-Зв-' . варианте с 2-ХЭФК (табл.3). При этом в Vtt обнаружены следующие ; . нарушения: слипания, и фрагментация хромосом, неправильная ори- • ентация бивалентов и унивалентов; Такой спектр нарушений ха-, > рактерен для многих пестицидов ( Amer, Farah, 1087). В ' Al ;; мы наблюдали фрагшнты.У 'неравномерное.расходдение' хромосом к , люсаы, хромосомные.мосты и отставание бивалентов. Сравнительный < ; анализ спектров нару1вений в А1покааал различия в ответе испы-/,; f туемых сортов на обработку 2-ХЭФК.' * .Так на сорте' • Носовский-8 i преимущественным типом нарушенйй были отставания . • фрагменты и }'> ■ неравномерное расхождение хромосом к полюсам.. Мосты были более'<у типичны - для сорта кЬсковский-З. Я:; ч% -v1. \V-:' ;у >у ■ Типичными:нарушениями-: в тетрадах бьши микроядра и редко ' j:'r встречались триады и пентады. Шсковский-2 .и иэсковский-121 "лг i' ■■ оказались • менее < чувствительны i к цитогенетичесюму действию 2-ХЭСЖ. Гфепарат -XXX не вызывал'увеличения числа..' хромосомных ' аберраций ни на одном из Четырех .анализируемых;сортов. : ; ■ [ V . Исследование фертилъности;/"пыльи^ -" показало!' V. что ^2-ХЭФК;'

увеличивала процент у аномальной" пыльцы на - всех сортах",у кроме • •.'•• Московский-1211 .XXX .не вызывал увеличения выхода пыльцы с на-1 / ■ рулениями и линь на; сорте \ Мэсковский-З : этот. показатель* был! " несколько выше, чем в контроле .(ЯОС"^; io,9X+l;36^KOHTpoib^ V' 6, 7Z+1,18) ^Следует отштить.Учто в: варианте' с! наблюдав4-

'•■' лась; вадержк^в раавитиипыльцы';-причем,: особенно это ; было ; вы- : ра1вно на №совском-9. ; В большинстве работ. Гкасавщихся анома- ' г лий в мейозе, индуцируеши химическими веществами, авторы ука-. *- зьшают. на прямую корреляцию между, частотой нарушений в '■ мейоае: и стерильностью; пыльцы ( Devadas et al., 1986; i . Reddyi Rao, 1982)-Ц-, но i имеются .и противоположные данные ( Âmar, .-Al ibnaam.l983)/.;f

.. 7 ■ ' - 19 - . \ •••

. • Таблица 3.

' Онтогенетические нарушения мейоэа в материнских клетках * пыльцы ярового ячменя при обработке ретардантами.

Вариант ' Всего про- ШШ с нару- X нарушений К1

обработки анализировано шениями в МКП ,

* ■- ШЩ

•-Ч. , , л • Носовский-* } ' " •

Контроль' 4697 66 1,22+0,16

2-ХЭФК 4248. .'. У Ю1 2,38+0,23 4,09*

XXX • 2738. 44 ' 1,64+0,24 1.34

' * • * ' . - Московский- •3". '

Контроль . 6922 ■ У-'. 66 У. 0,9410,12

2-ХЭФК ; 3990 ;" бб ■ у 1,66+0,20 3,04*

XXX ■■ 4831 .'• 61 ' 1,26+0,16 1,61

".. ' . ■ Московский- •2 .

Контроль 2149 • 36 1,68+0.28

2-ХЭФК 2093 . : - ■ 34 1,62+0,28 -0,14

XXX . . 2230 V,;: ^ У' .: " 45 : 2,01±0,30 0,83

-■:>' /''' Московский- -121 " - ; • * „

Контроль' У Л 4799 40 0.83+0.13

2-хэж: - 6291 , 62 , • 0.98+0.14 0,81

XXX У - 4374 V' 28 0,64+0,12 -1,07

* - р < 0,06

.* « Хотя вероятность .того, .что пыльца, несущая аберрантные хромосомы, окажется жизнеспособной и сможет через слияние с нормальной; мегаспорой дать потомство с измененной цитогенети-ческой конституцией чрезвычайно мала. И вей же, даже редкие случаи появления таких растений может стать проблемой в семеноводстве, ; где сохранение единообразия и генетической чистоты имеет первоочередное,значение," Подтверждением тому могут быть наши данные, двухфакторного -дисперсионного' анализа; биометрических показателей струтуры урожая посевов ячменя, обработанных;. ретардантами I (табл. 4). - 2-ХЭФК на всех,- сортах, : кроме Московского-121, вызываласнижение количества верен в колосе и массы 1000 зерен. Установлена прямая корреляция между частотой

хромосомных нарушений в мейозе и показателями; урожайности..

Представляется интересным и тот факт, что ' давни по' сор-' "^чувствительности . к обработке'2-ХЭ&К в генеративных клетках;

; .. : . Таблица А Двухфакторный дисперсионный' анализ по биометрическим- •. -показателям.

Вариант Кол-во зерен Масса 1000

опыта в колосе верен. ■

, Носовск ИЙ-9

Контроль 21,07' : 1 • 43,00

2-ХЭ4К " 18,50* 37,20*

XXX 21,37 | - 44,08

■ -V ■ ; Мэсковский-З •

Контроль ■ ■ " . V 20,07 46,96

2-ХЭОК - : . 15,74* ' 41,32* "

XXX •■■•■ ■■ ■.'.' * .-■'■"' :' 18,91 47,44

Контроль ■ . ■ ■■ ■ 7 •■•. ■ Иосковский-2

19,57 49,69

2-ХЭФК ; 15,40* . 47,00*

XXX 17,87 : 49,31

' . •.Московский^! '

Контроль " ' : 20,47: . V 45,04

2-ХЭЖ '21,90 . '• • 46,92 '

XXX . 19,37 46,00

ИГР (для сравнения ; - •

частных средних)< . .' 1,73 2,66

Коэффициент детерминации , - , ■ ; V

по фактору "сорт" 0,07 0,34

Коэффициент детерминации

по фактору "вещество"-' .0,10 "0,17

статистически опытом. •• .

достоверная разница между контролем и

■ - 2i -

коррелирует с тановыми в соматических клетках в лабораторных и полевых экспериментах. При анализе структурных наруиений хромосом в корневой меристеме проростков семян, полученных от обработанных растений; было установлено, что XXX не обладал кластогенным действием ни на одном из 4-х сортов. 2-ХЭФК индуцировал ./увеличение уровня мутирования клеток на трех сортах Мэсковский-2, Мэсковский-3, Кэсовский-9.. Сорт иэскодский-121 был не чувствителен к клзстогенному действию препарата ' .

. • йгак, проведенные вами исследования показали, что ретардант 2-ХЭФК вызывал нарушения в генеративных и. соматических клетках; ;Цитогенетический эффект, 2-ХЭФК проявился на трех сортах, ; сорт Шсковский-121 оказался нечувствительным к негативному действии ретарданта.; XXX не вызывал достоверных нарушений в Ш1. .не изменял процент фертильности пыльцы и не оказывал отрицательноговлшшия на структуру урожая. Степень генети-ческиго риска'применения испытуемых ретардантов зависела от их химической природы и от генотипа сорта.

3. ЦигпфитжитносвовлрЛсгят. '

3. t. Влияние,ка- продолжительность клеточного цикла и про, хохдвги& отязмыш фаа'шгтбэа* :^ :; -^, '^

Вопросы фитогормональной i регуляции : клетрчного деления давно привлекают/ внимание.: исследователей. С отбытием генов cdo (oeil division' cyole) и 'белков циклинов была внесена, ясностьв; понимание процессов регулирования вступления клеток в деление и последовательного' чередования фаз цикла (Hartvel et al. ,1074, Evans'et al.',1983," * Masul, 1971). Вместе с этим . была определена роль.и место фитогорм ihob в регуляции клеточного цикла, /Фитогормокы влияют на, стартовый переход» участвуя наряду с другими компонентами клетки в : регуляции накопления циклина (Franols, 1992). :.•. V

^ В. сравнительно недавно вышедшем обзоре К. Н, Гудкова( 1985), обобщены данные о: способности фитогормонов влиять на продолжительность митотического- цикла и отдельных его фаз.. Аналогичных исследований по синтетическим регуляторам не было. Хотя их фи-■ зиологкческоел действие-- непосредственно связано с влиянием на баланс эндогенных'4гаогоршнов..-'крЬш того некоторые из из у-

' * 22 - - •■■■'■ і ченных нами фиторегуляторов имели отрицательное побочное действие на структуру хромосом растений, вьвывая повышение уровня мутирования клеток. і • : -

В данной серии экспериментов научено влияние регуляторов роста на состав клеточной популяции и—продолжительность клеточного цикла в клетках корневой меристемы Al. fistulosum.

Были испытаны следующие фиторегуляторы: ГМК -ЛбО.ОСЛХ и О. ЇХ; XXX - IX; 2-ХЭСВК - IX И 0.12; Брассинолвд-214 - 0.0001Х; Картолин - о.IX и о,ИХ.'- ", V-", , V ^ ;

48-часовые проростки семян Al. fistulosum, пророченные на воде, переносили в растворы фиторегуляторов.' Черев 18 часов 1/3 часть проросших семян фиксировали в этанол-уксусном фиксаторе 3:1, а оставшийся материал отмывали в воде и доращивали с последующей фиксацией черев 18 и 36 часов. • ' v.;

Готовили^ окрашенные по Фвлъгвну при холодном гидролизе, постоянные давленные препараты, которые анализировали с помощью ИБАС-2000, используя специально созданные программы. " О количестве ДНК в ядре судили по оптической плотности, выраженной в условных единицах 1.0. D. Все полученные данные обрабатывались с помощью статистической программы Classl и Class2, входящих в математическое обеспечение ИБАС-2000. Цюцент распределения ядер по фагам цикла определяли методом Slater et al. (1977). Измерение продолжительности митотического цикла проводили кофеиновым методом (G1menez-Martin et al., ; 1965). Корешки помещали на 1. час в О,IX р-р кофеина с последующей об-; работкой фиторегуляторами и фиксацией каодые 2 часа в течение трех суток. •:'■•■■..' Л.-.- ' ;'■•'';•' ' >•'•.' '.

Было показано, < что через 18 часов после обработки. IX р-р XXX картина распределения ядер по фааам цикла не отличалась от таковой в контроле (табл.Б).- Черев 18 часов после снятия непосредственного действия препарата наблюдается падение пула клеток в S-фазе, что мы связываем с образованием блока на рубеже G1/S. Спустя 36 часов после снятия действия препарата, блок G1/S снимался. Продолжительность клеточного цикла под воздействием. XXX не изменялась и составила как и в контроле 16 часов. * - ;•.■."■.' *"',!•*■ v.' '*V' А •

ГМК-Na О. IX вызывала реэкоескижение митотического ин- ' декса к первой фиксации и в после душэм полную остановку дёле-ния. Довольно интересная картина складывается<а составе интер-

Таблица Б.

. Состав клеточной популяции в корневой меристеме проростков Allium ftstulosum, обработанных фиторегуляторами.

—- 1 —.--■—., Г... ..... Препарат | Время после 1Y Процент, клеток в фазах цикла

nUHUVtrt" | nutl'j CUVld u рация [препаратом І(час) Iі і. 1 61 1 1 1 S і і 1 G2 | 1 ■;•"-:■ 1 і M

■ ■ —■■ і Контроль| 1 1 1 0 18 38 1 1 . 1 41.8 | 1 41.9 | 1 4a 5 | 21.6 24.4 V-24.8 і. | 29.3 | I 26.6 | 24.6 7.2 7.1 7.1

1 ССС | 1* 1 1 ' * "" г 0 18 36 ' 1 .. 1 | 42.3 | 1 42.4 | 1 38.4 | I 1 2a 6 . 12.8 22.0 I 27.3 | 39.8 | .. 34.1 6.8 .6.0 6.1

..... 1 ГЫК-Na | 0.1Х | 1 і ► 0 18 38 1 .1 1 42.7 | 1 25.4 I 1 20.4 | 27.1 16.6 5.9 1 | 29.0 | 68.1 I 7a 2 і .1.2 0 0

ГМК-Ма | 0.001Х . | f I .......t 0 18 > 36 ♦ fefeS: oi u o ! '■ .' * ;.' r -} іаз 14.8 16.8 I 35.2 1 38.8 ; 1 27.6 2.2 2.3 6.1

1 2-ЯЗФК | її 1 1 ......I - 0 18 36 . 1 .. 1 1 43.4 • | 1 57.1 I 57.3 | I I 16. ( 10. 11. ) I 34.6 | 29.8 I 28.5 , 6.3 2.9 3.1

... 1 Брассиво| лид-214:1 aoooizi і . 0 18 * 36 . I- 1 1 34.7 | 1 36.9 | f 41.7 | і -і 1 29. 27. 2a; | 28.8 -I 28. 6 -: І 2а і - 7.6 7.4 7.6

1 Картолин| a їх і ' \ • I і • і v 0 Б0.2 „ 1 18 * | 63.8 " | 36 1 68.1 1 • • • ■ .....• га о . 19.9 18.2 | 27.7;, і i9.8 •; і 17.0 2.1 6.2 7.2

. ..■ , і Картолин| 0.01Г I I і 0 -18 36 і і 1 43.7 | 1 4a 9 | » 44.7 1 ■ і 18.5 20.0 - 26.7 I 31.8 1 28.5 Г 20.3 I б:з 6.0 7.1

: • - 24 -

фазных клеток (рис. 4в). В связи с тем, что полностью заблокировано продвижение клеток в G2/M происходит значительное накопление клеток в G2 - фазе, что, соответственно, ведет к падению процента клеток в Gl - фазе. Клетки, вступившие в синтез завершает репликацию ДНК и тем самым увеличивают процент клеток в G2 - фазе. Елок на рубеже G1/S ведет к сильному истощэнию пула клеток в S - фазе и к третьей фиксации он падает до 5. 9Z; Продолжительность цикла не удалось' определить из-за полного, отсутствия деления клеток. • - 1

ГМК-Na O.OOlt полностью не останавливала деление цлеток, хотя значение MI было довольно низким Z.2X. Продолжительность цикла возрасда более, чем в 2 раза и составила 37 часов Препарат вызывал образование блоков G1/S и G2/M .

В. Б. Иванов С1974) показал, что ГМК действует на "рост и размножение клеток , подобно облучению. Действительно в наша экспериментах при высоких дозах ГМК картина распределения клеток по фазам цикла сходна с таковой при у-облучении, наблхщае-мой И. Н. Гудковым (1981) в популяции клеток корневой меристемы гороха Если в норме бее облучения клетки, прекратившие деление останавливаются почти всегда в Gl фазе.^т. е. завершив очередной митоз, то при облучении они преимущественно накапливаются в G2 фазе, что мы и наблюдаем в наших экспериментах с высокой дозой ГМК: накопление клеток в Gl я G2 (особенно в G2) и сильное истощение пула клеток B S- фазе. ■ То небольшое число клеток, которое к моменту воздействия препарата успели пройти через середину синтеза ДИК завершает репликацию ивступаетв G2-$aay. ' - ; ' ".' "* ■ л:''"-'ч'-'

18-ти часовая экспозиция проростков лука в IX растворе 2-ХЭФК привела к снижению MI до 6,3% и увеличению числа клеток в G2 фазе , что говорит о задержке выхода клеток в митоз. К второй фиксации четко видно образование блоков на рубеже.Gl/S и 02/М-фаз. Митотический индекс.падает до 2,92./Происходит накопление клеток в Gl-фазе,, так как клетки не вступают в стадию синтеза. К третьей фиксации мототический индекс остается довольно низким - 3,1 Z и не изменяется.картина распределения интерфазных ядер. Сохраняются блоки Gl/S и G2/M (рис. 46).

Известно, что физиологическое действие 2-ХЭФК, как ретарданта связано с продуктом его метаболизма в организме расте-

Рис. 4. Распределение клеток по фазам клеточного цикла: а - контроль; б - IX 2-ХМК; В - 0,12 ГМК-Ма

Частота 60

ветречаомоотк

Частота >60|

Чаоуота 601

18 Ч.

Интегральная оптическая плотность 36 ч. 64 ч.

- 26 - ■ ...■.'•■" ний, а именно этиленом. Исследователями, научавшими влияние этилена, на скорость деления и длительность митотического цикла установлено, что этилен в зависимости от концнтрации может останавливать рост корня и практически полностью подавлять митоз (Apelhaum, Buntf. 1972). В наших опытах действие 2-ХЭФК было более мягкое и пролонгированное по сравнению с ' этиленом. Ш- видимому, это связано с динамикой поступления и разложения 2-ЖЖ в растениях. Период полуразлоления препарата в организме растений равен 2-4 дням, а полный распад происходит через 32 дня (Сиушева, Влиновский, 1990).. ' /; . •

Шханиэм действия брассинолида . не на столько юучен, как других групп фитогормонов, . и почти не изучен на клеточном уровне. Нами было установлено,-что брассинолид-214 не изменял продолжительность клеточного цикла, но увеличивал процент клеток в S-фаэе, что свидетельствует о : стимуляции препаратом вступления большего числа клеток в'синтез. Подтверждением этого предположения могут служить данные по, влиянию брассиноли-да-214. на метаболизм нуклеиновых кислот, где было показано, что брассинолид-214 увеличивает активность ДНК к РНК-полимерав и способствует накоплению белка.РНК и ДНК (Kalinlsh et al. , 1986). ' ' :' -'Vy'v

Картолян в концентрации О, IX резко снижал Ш (2,IX) к моменту первой фиксации. Но уяе; через 18 часов после, снятия действия вещества наблюдается увеличениеМІ до 6.2Х, а к третьей фиксации ill достигает уровня контроля. В составе популяции интерфаэяых ядер четко определяется блок Gl/'S. Картолии увеличивал продолжительность • цдела до 26 часов, j Картолин в 10 раз меньшей концентрации (0.01Х) лишь незначитвльноснижалМГ. Препарат увеличивал продолжительность цикла на 2 часа. Л

; Обобщая данные полученные нами, следует :' сказать, , что; брассинолид-214 стимулировал вступление', клеток в синтез и; не влиял на продолжительность клеточного цикла; для картолина по^ лучена четко выраженная зависимость эффекга от доаы препарата; - ретарданты увеличивали длительность'клеточного цикла , угнетали митотическую активность- клеток; . /вызывали: образование блоков на рубежа Gl/3 и G2/M и накопление клеток в 01 и G2 фагах.

' 3.2. Влияниэ срассннолида на цитофиэиологнческш локаэа-тели у ячненя в условиях солевого стресса.

с целью испытания регуляторов роста как антистрессовых средств г нами - было изучено действие брассинолида на процессы клеточного деления и характер структурных нарушений хромосом в условиях солевого стресса.

Опыты были проведены на проростках семян ярового ячменя

Добавка ÍQZ зпибрассинолида-Б5 на фоне хлоридного засо-, ления активировала деление клеток - митотический индекс резко возрастал. . При 0.3U NaCl не было зарегистрировано стимулирую-< ирго действия" препарата на . процесс клеточного деления С Табл. 6). . У . ' .

.'•'■ ' .-••; -. \.-v\v • / ■:' ' • Таблица 6

Влияние эпибрассинолида-Б5 на ыитотическую активность клеток корневой меристемы ячменя в условиях хлоридного .-:•• ■ ■ засоления. • ''-..•"• -i-.

Вариант опыта

Всего проана-|Иэ них -| локированных•|делящихся|■ клеток I • ~ | ' I 1

I •

Ш ± m | / td

: '..-v., і

Контроль , т. . « • ■•:■ ■ - -■ 1797

Эпибрассинолид (Эб)) 1346

0.1 М NaCl 1 1448

0.2 U -NaCl - > Г 1768

0.3 U NaCl 1 .1288

0.1 U NaCl + 36 l 1577

0,2,U NaCl + 36 | - 1286

0.3 U: NaCl + 36 1 -1366

* І \

162 - І 9.01+0.67 І —-124 я І 9.21 іО. 78 |-0.19 ;' 92 ' \ б. 35+0.64 І 2.86* ' '66 ; І а 73+0.45 І 6.53* - | 3.26+0.49 І 6.90* 8. 31+0.69 І 0.72 І 1,09 " І 8.47+0.78 | 0.52 І ¡46 " І 3.37+0. 49. І 6. 80* і. ..." Г ..'' і— "__

^31-; ■

* ^ Р < 0.06 . ; V V- _ - ■

Ионы соли выаывали задержку клеток в метафазе-анафазе., Зпиб-.рассинолида изменял^картину распределения клеток по фазам ый--' тоза и- делал ее сравнимой с контрольной... Эпибрассинолида-55 существенно снижал уровень; йаоушений возникающих в клетках при хлоридном засолении (Табл.7).- л:- ^ . '

: .■ - 28 - ' ./ . '.

Таблица 7

- Вчияние эпибрассинолида 65на уровень мутирования хромосом клеток корневой меристемы ячменя в условиях солевого стресса.

Препарат і Всего проанализированных клеток 1 ' ." - -......-- • -і—- • , ІКоличество I 1 -|клеток с | X + m 1 td 1нарушениями| . | Г і " і"

Контроль 836 1 1 1 1-22 1 2.63+0.55 1 —' і ' і і

Na СІ 0.2М .804 1 1 1 1 БО 1 6.21+0.85 1 а 64* І І І

Na СІЮ. SU эпибрассино-лид 55, 890 . 1 1 .....J І 32 1 а 59+0.62 1 1.16 1 1 " V'iv 1 ; 1 І;. 1 і і ........■ і,. :,-.„ .„...'і..- ■ ■

* - р < о.обv ..* -,Х'/-;*-/-:;-v.-Анализ спектра хромосомных нарушений в варианте схлорид-ным засолением выявил увеличение всех типов аберраций в среднем в 3,5-4 раза. Эпибрассинолид-56 снижал образование двойных и одиночных, мостов.-'V-.;, - * . С :

Активация клеточных делений'и снилэниечисластруктурных нарушений брассинолидом является проявлением на клеточном уровне способности препарата снимать последствия солевого стресса. '•,.'•;"",/';:' '.'.-*■--'. -. •;., 'ч

4 Последи*, тиии регуднгаораа рост (аолвав опыт). :

Поскольку регуляторы роста активно влияв* на ядерные структуры, необходимо установить, в какой мере сохраняются trat менения в последующа поколениях, какова' способность к воста-новленип на разных уровнях биологической организации, как изменится генотипическая структура сорта при регулярной еяегод-, ном применении фиторегуляторов. ; •; .:•■> -'-. Посевы ячменя сорта №совский-9 были обработаны 0,5Х 2-ХЭак в стадии выхода в трубку и 0,15* картолином в фазу: цветения. В течение трех последующих поколений "вели наблюдения за уровнем мутирования соматических клеток: и морфофизиологически-

ми параметрами растений. Парааельно с этими опытами по слежению. проводили: ежегодные обработки фиторегуляторами в течение трех лет.

, 4.1. Учет структурных нарушения в Лаоэе.

. При анализе нарушений в клетках корневой меристеме проростков, выращенных из семян растений ячменя,: обработанных в 1986 году 2-ХЭ1К и картолином,— установлено наличие кластоген-ных эффектов (Табл. 81*В 1987 и 1988 годах прклаересеве'семян,-полученных от обработанных в 1986 году растений, не зарегистрировано сохранения повышенного уровня мутирования клеток корневой меристемы проростков-семян второго и третьего поколения. Вероятность длительного сохранения кластогенного эффекта пре-паратовУ до первого семенного поколения была проверена в повторных полевых экспериментах, проведенных в 1990 и 1991 годах., При. этом было установлено, что повышение уровня мутирования клеток сохраняется только в первом семенном поколении.

Итак, в результате трехлетних полевых экспериментов было показано сохранение кластогенного эффекта для 2-ХШ и. карто-лина в первом семенном поколении.' Пока мы не можем дать достаточно полного объяснения природе этого явления. Мэжно предполагать^ что вл момент обработки под действием вещества образуются нарушения в ядерных структурах архиспориальных .клетск, которые сохраняются в ' многоклеточном зародыше и реализуются при проращивании семян. Длительное сохранение повышенного уровня мутирования.. клеток в варианте с 'картолином возможно связано с тем; что препарат- вызывает генные мутации. Клетки с нелетальными генными мутациямимогут сохраняться довольно долГо. влияя на уровень мутирования. В|то время как крупные обменные нарушения - хромосом чаще всего губительны для клеток. Через два-три деления такие, клетки элиминируют.' ' :

Ши трехлетней обработке отмечен«^ снижение уровня мутирования клеток дог спонтанного при действии картолина и 2-ХЭФК. :При ежегодном воздействии, препарат становится постоянно действующим фактором, поэтому реакция организма на них постепенно стабилизируется. 1Ь-видимому, под влиянием этого внешне го фактора из популяции элиминируются ослабленные растений с пониженной, жизнеспособностью^ .Выживаюшда^ более устойчивые растения формируютпопуляции последующих поколений.. С другой сторо-

ны возможно происходит генетическая адаптация популяции в от-

•'„"'* Таблица 8

Влияние регуляторов роста на уровень мутирования соматических клеток трех поколений ярового ячменя Носовский-9. Л

Препарат"^ -ИНфры опыта 1 . | Обцэе |чиело | анафаз 1- ■ 1 1 |Анафазы Iтениями 1. I всего 1 о нару-X + И " м . ■ / .

1 1986 '

Контроль ... о | 1045 | 23. 2,2+0,31 : ' V - ;"■*,' '

О.БХ 2-ХЭФК | 1093 I 68 6,1+0,29 8,86*

0,1БХ картолин 1:: | 1609 1 75 4,9+0,25; 6,14*

1 1987

Контроль 00 | 1825 .1 : 26 2,4+0,23 ■ ■.:

О.БХ 2-ХЭФК 10 I 60 2,6+0,25 0,64

О.БХ 2-ХЭФК : и | 1500 | 35 4,3+0,26 ' 6,13*

0.15Х картолин 10 I 1275 I 50 2,9+0,27 1,57

0.15Х картолин . п | 1100 1-й 4,0+0,30 6,33*

1988

Контроль ООО | 1250 | 28 2,2+0,28

0.5Х 2-ХЭФК , 100 | 1390 I 36 2,5+0,26 0,71

О.БХ 2-ХЭФК 1и I 1517 1- эо; 2,0+0,25 0,46

0,15Х картолин 100 | 1290 Г 57 2^4+0,27' 0,62

0.15Х картолин 111 Г 1255 1 33 2,610,28 1,06

. *. •• ' -У' • 1990 ■ •

Контроль , 0 | 2783 1 76 2,7+0,31 ■

О.БХ 2-ХЭФК | 2202 | 108 4^9+0,46 3,38*

ОДБХ картолин 1 | 2334 | 136 5,8+0,49 5,36*

1991

Контроль - 00 Г 2220 1 .64 2,4+0,33

'О.БХ 2- ХЭФК : * 10 | 1656 | 36 2,2+0,62 0,30

0,1БХ картолин 10 |. 1494 . 1 .... ___;, | 48 » ■ 3,2+0,46 1. ■____1 1,39.

А - Р < 0,05. \ ; ■ .у ."- :' ** - 10 и 100 вариант "слежения",

11 и 111 вариант ежегодных обработок.

ват на воздействие внешнего агента- возрастает зашита ДНК Ферментативными системами клеток, что обеспечивает возвращение уровня мутабіцьности к оптимальному значению (Дубинин. 1986).

4.2. Диализ нашивний количественных приз намов

Обработка посевов ячменя IX 2-ХЭФК и 0.15Х картолинсм вызывала изменения покаватлей количественных привнаїсов (тнбл 9).

Таблица 9

Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели трех поколений ярового ячменя сорта Носовский 9.

1 1...... |Препарат | Шифры | | опыта 1 1 1 1 і > 1 |Высота 1растений, I см. ■.....- I Длина колоса, см. -----г ^сло зерен в колосе, шт. Масса зерен. гр. * 10001

і і 1 і 1986

|Контроль | 0 I 70,31 8,32 20.80 38. 34 |

Ю.БХ 2-ХЭФК | 1 I 66.82* 7,76* 16.63* 35, 27* |

|0,1БХ картолин| 1 | 65,48* 7,53* 16.29* 36, 60 |

1 ШР | 1 2,63 1.1 1,74 1. 80 1

1 1987

|Контроль [ 00 I 83,04 7,70 19,93 50, 01 і

І0.5Х 2-ХЭХК 1 10 1 81.10 7,61 20,11 49 52 |

Ю.бХ 2-ХЭФК 1 11 I 72,51* 6,32* 15,31* 40 01* |

І0.1ЄХ картолин| 10 I 83,43 71,81 19,73 49 63 1

Ю.16Х картолин | 11 1 86,01 . Ц.Ю 20,00 49 01 I

I ЖР ' | 1 2,41 а, 43 1,10 1 77 |

1 . 198В

(Контроль | ООО 1 70,31 7,70 20,82 38 .31 |

|0,5Х 2-ХЭФК 100 1 68,82 7,71 19,63 39 .04 |

Ю.БХ 2-ХЭФК | 111 I 56,41* 7,02* 15,81* 27 .53* |

|0,1БХ картолин| 100 1 70,33 7,73 21,02 37 .71 |

|0,1БХ картолин| 111 1 68,81 7,64 20,41 39 .32 |

1 НЗР | ■ і 1 2,3 0.4 і 0,9 > 1 і .2 | і

* - статистически достоверная разница между контролем и опытом

Особенно это было выражено в варианте : с 2-ХЭФК. ; Препарат достоверно снижал высоту растений, длину колоса, число зерен в колосе и массу 1000 зерен.

При пересеве в 1987 и 1988 годах семян, полученных от. обработанных в 1986 году растений, не наблюдали видишх отклонений. Было обнаружено лишь небольшое снижение высоты растений и . длины колоса в вариантах с 2-ХЭФК. .

Выраженное угнетающее воздействие на ростовые процессы и формирование зерновок оказывали ежегодные обработки регуляторами роста, особенно в варианте с 2-ХЭЖ. Щюпарат вызывал статистически достоверное по сравнению с контролем снижение высоты растений, длины колоса, а также уменьшал число зерен в колосе и массу 1000 зерен. ■ ч.

Б. Влияние аижячим геи йиторвгулятораш яа сшсгав Омп.

Злектрофоретический анализ спектров белков эндосперма ячменя и иэоферментоЕ был использован как непрямой тест на генные мутации. ' Цноголокусный контроль позволил задействовать' каждую хромосому кариотипа (рис.5) и сократить обьем выборки.

ГЬсевы ячменя Нэсовский-9 и Зааерский-85 были обработаны картолином (БОмг/га), брассинолидом (БОнг/га) к спирокарбоном (50 г/га) (10). ' Цредварительно бш получен генетически: однородный материал от одного колоса, ' проверенного на . гомозигот-, ность (по гордеинам). Достаточное количество семенного материала для полевых испытаний выращено в ряде поколений. ' Эксперимент проводился в течении 3-х лет по описанной ранее, схеме: пересев материала, обработанного в первый год (1989) и ежегодная обработка в течение трех лет (1989, 1990, 1991гг. ). , .Я"

Разделение гордеинов было проведено с использованием методики sds-пааг. эштраюдочгордеижмдо фракции гамя&^ячыеня'; осуществляли по методу P. Shewry (1982) с некоторой модификацией. Электрофорез • 'белков-ферментов у ставили в:-3,7Х- ПААГ по В. J. Devis (1964). Для извлечения белков-ферментов использовали 6-ти дневные проростки семян ячменя. Выявление исследуемых ферментов осуществляли по методу КВ. Левитес (1986). Гели, анализировали как визуально, ,так и с помощью сканирования : на лазерном , денситометре "Ультраскан". На каждый вариант опьгга было проанализировано120 зерен. :

Рис. 6 . Расположение в хромосомах ячменя лок/сов, коди^уыних изучаемые белки.

ЕэЪ вгр<1-2

ЄР<1-і

ШЬ-2

аор2

|0.23 10,48

□

— Ногб — 77,6 —

Ног2 — 77,4

Ногі 64,8

Ног4 63. б

НогЗ — 8,1

□ О

шъ-ки аорЗШ

I

II

III

IV

VI

УІІ

етх1-1.ВР<1-2 - глхкозо-б-фосфатдегидрогеназа; ШЬ-НЬ), МйЬ-2 -малат дегидрогеназа; азр2 - кислая фосфатаза! Ези, Езгг, Е^4-- зстерааа; Ногі - гордеин С; Ног2, Ног4 - гордеин В; НогЗ -гордеин Л; Ног5 - гамма-гордеин.

У ячменя наиболее изученными в генетическом отношении являются спирторастворимые б&лки эндосперма - гордеины. Они кодируются докусами Ног 2, Ног 1 и Нор 8. Все локусы наследуются сцепленно и расположены на коротком пйече 5-й хромосомы.

Анализ спектров гордеиновой фракции позволил выявить до 11 белковых компонентов у Нэсовского-9 и 7 компонентов у Эа-зерского-85. На сорте Зааерский-85 не зарегистрировано изменена в гордеиновой Фракции по трем исследуемым препаратам На Носовском-9 выявлены единичные изменения в гордеиновой фракции. Так в год обработки эпибрассинолид-55 вызывал усиление компонента в зоне С С рис. б), картолин - появление нового ком понента в той же зоне , спирокарбон - усиление коміюлс-ь.а в зоне Е

. Рис. б.Электрсщюреграмма гордеинов. , ;

; + I 2 ■ V - 3-* _

1. Иэсовский-9 - контроль.

2. НЬсовский-9 - усиление компонента в аоне "С"

под действием эпибрассинолида-ББ. а Заэерский-86 - контроль. , .

Рис. 7. Электрофореграмма ; : / Малатдегидрогенаэы. ,»

» V' 2 з. - ^

1. НосовсюйРЭ - контроль. !Г ~ ;'

2. Носовский-9 - появление компонента в локусе ШЬ-2

под действием эпиОрассинолида-Бб. а Зааерский-85 - контроль. •

4. Зааерский-85 - усиление компонента в локусе ШЬ-1 под действием картолина

■■-. • - 35 - -

V Наиболее отзывчивой к воздействию исследуемых препаратоз была малатдегидрогеназа. В. год обработки эпибрассинйлидом-Б5 на Носовском-9 выявлен новый компонент в зоне быстроподвижных белков в локусе ШЬ 2 (рис. 7). Спирокарбон индуцировал усиление синтеза одного из компонентов в зоне высокомолекулярных белков локуса ШЬ 1. Количество изменений' на вариант составило 2.ІХ. Картолин на Носовском-9 не влиял на спектр изофермента. но на Заяерском-85 препарат вызывал усиление компонента ь ло-кусе 1 (рис. 7). Количество изменений составило 0,3 X.

При пересеве в 1990 и 1991-годах семян, полученных от растений обработанных в 1989 году регуляторами роста, «е обнаружено сохранение биохимических изменений.

'. Ежегодные двухлетние обработки эпибрассинолмдом-55 выявили на сорте Нэсовский-9 усиление компонента в локусе 2 (1,72). На сорте Зазерский-85 при.трехлетних ежегодных обработках картолином зарегистрировано увеличение синтеза компонента локуса МЯі 1 (0,8Х). ' . .

.Шш показано, что антистрессовые препараты влияют на бел- . ковые системы, вызывая/усиление или ослабление отдельных компонентов в спектрах изофбрментов и белков эндосперма и появле-ниа .-• новых компонентов. ' Щоявление эффекта препарата зависело от генотипа сорта. Д?и сравнительном анализе двух сортов ярового г ячменя по спектрам белков эндосперма и изоферментов -сорт. Нэсовский-9 был >• более • отзывчив : к воз действию препаратов. : Изменения в спектрах белков эндосперма изоферментов носит. характер модификаций, . так как- уже во втором поколении не было зарегистрировано сохранение биохимических изменений. \.

".'і' • ЗШЩЕНИЕ -г

На основе разработанной тест-системы, по оценке генети-. ческих последствий : применения экзогенных регуляторов роста растений изучены закономерности их воздействия на геном расте-ний;в зависимости от их химической природы, концентрации, пов-; . торности обработок," стадии клеточного цикла, генотипа и физио-. логического состояния клетки. 1

Скрининг 14 фиторегуляторов ва мутагенную активность показал наличие 'кластогенного эффекта у 5 веществ. В полевых экспериментах показано,, -что. увеличенный выход хромосомных на-

- Эв -

рушений, индуцируемых регуляторами роста, сохраняется "В первой семенном поколении. Однако во втором поколении не отмечено повышенного уровня мутирования клеток,.по-видимому, в результате соматического и гаметического.отборов в вегетирующем растении происходит элиминации аберрантных клеток. /

Установлено, что регуляторы роста активно влияют на белковые системы. На генетически однородном материале показано, что изменения в спектрах проявляются только в год обработки. Сохранение эффекта не было зарегистрировано у следующего поколения. Изменения, вызываемые регуляторами роста, , носили модификационный характер и не затрагивали генетические'^ структуры локусов, кодирующих изучаемые белки. - •-.'•

При ежегодных обработках регуляторами роста посевов ячмё-ня, т.е. на фоне постоянного воздействия, регуляторов роста , вероятно, происходит отбор форм нечувствительных к кластоген-, ному действию препаратов.. Но такая устойчивость генома к повреждающему действию ксенобиотиков сопровождается потерей ■ хо-зяйственноценных признаков сортов. : • - . . .. - -

Показано, что препараты XXX и брассинолид не обладают мутагенным действием и могут применятся как в интенсивных техног логиях, так и в семеноводческих хозяйствах. Картолин и проявили кластогенный эффект в биотесте и на трех сортах ярового ячменя. При применении этих регуляторов роста необходимо учитывать генотип сорта и технологические концентрации, особенно для картолина,- так как этот; препарат в зависимости от концентрации моют оказывать ., стимулирующее , или' ингибирующее действие на геном растений. Не рекомендуется проводить ежегодные обработки посевов ярового ячменя 2-ХЭФК ., так как это приводит к снижению показателей урожайности.

Приведенная картина взаимодействия генома растений и ре-: гуллторов роста подводит к пониманию тех последствий, которые могут иметь место при применении .препаратов с мутагенным действием. Проведение систематических исследований по оценке генетического риска применения ^гудяторов роста позволит не-допустить попадание в биосферу вещэств, обладающих мутагенной активностью.

- 37 -вывода

.. 1.' Разработана комплексная тест-система, основанная на регистрации морфофизиологических, биохимических и цитогенети-ческих изменений у растений^ вызываемых экзогенными регулято-• рами роста.* выявлены основные закономерности воздействия синтетических регуляторов роста на "геном растенМ^ и установлена . параметры, характеризующие их зависимость отхимичеекой природы и концентрации веществ, повторностей обработок, стадии клеточного, цикла, физиологического; состояния клеток и генотипа „сорта. ' "Установлена корреляция цитогенетического эффекта в со- т /матических и генеративных клетках.. Г

•; г; 2. В биотёсте показана кластогенная активность у б регу-■ ляторов роста в зависимости от.концентрации препаратов и определена пороговая доза их кластогенного действия. В порядке ."убывания кластогенной активности регуляторы роста распредели-улись.ь такой последовательности: ГЖ-Ма,- картолин - гидрел - , ■ • > - • 3983Д Ш.характеру кластогенного действия препараты

. иа группы этиленпродуцентов и картолин следует отнести к мута-;; генам ¿ .незадержанного типа действия; ГМК-Ыа - к мутагенам эа-/•;;дёртанного типа,-"' л- ? : '; . - :

3. Продолжительность кластогенного последействия зависит '] от : характера ; структурных ; повреждений -хромосом и степени воз-V-V действия препаратов на кинетику клеточного цикла и . колеблется от 18-ти до Зб-ти часов.; , ' -* '. • •'•' '■""•■;:*"■■■• ■".' ■•'■'""

. , : , : ; ; Ч. Картолин вызывает генншмутациитипа сдвига рамси .считывания и замены пар-оснований в условиях отсутствия и наличия^ метаболической активации,в тесте Эймса, ГШ-Ыа вызывает Ч. генные .; мутации в ¿ условиях 1®таболкчаской активации. 2-ХЭФК, >,. XXX, : декстрел и гидрел не вызывают генных мутаций. На. индикн- ■ торньк'штаммах еГсоП не установлено ¿ей-повреждающего эффекта . у картолйна' ;.•• '■'"'• ■ ' . , '

'ЧЧ':;^;Экзогенные регуляторы роста активно влияют на кинетику клеточного цикла. Ретардант 2-ХЭЯК и ГЫК-Ма. задерживают деление клеток на рубежах 61/Б и <32 ЛЬ фаз. увеличивая длительность Клеточного цикла и угнетая ■ митотическую активность клеток. Брассинолид стимулирует вступление клеток в стадию синтеза, но ,:не влияет, на продолжительность, клеточного цикла. Картолин в

концентрации О,IX угнетает митотическую активность клеток и увеличивает продолжительность клеточного цикла. " ■

6. Изучено антистрессовое действие брассинолида на геном, растений в условиях хлоридного засоления. Показана способность брассинолида снимать последствие солевого стресса Препарат активирует клеточное деление и снижает число структурных нарушений хромосом.

7. Проявление цитогенетического действия регуляторов роста зависит от генотипа растений.. Различия в устойчивости и чувствительности сортов к мутагенному воздействию применяемых в растениеводстве средств химизации должны учитываться при; разработке технологий возделывания сельскохозяйственных культур. . _ .у_ . '•- .. ... .

8. Регуляторы роста растений способны .вызывать усиление или ослабление отдельных компонентов и появление новых компо-' нентов в спектрах иаоферментов и белков эндосперма ячменя. Наиболее чувствительными к воздействию регуляторов роста были гордеиновая фракция и малатдегидрогеназа Изменения в спектрах белков эндосперма и ивоферментов в год обработки носят характер модификаций. , ,

9. Кластогенный эффект наблюдается в первом семенном поколении ячменя, полученном от растений, обработанных регуляторами роста В результате элиминации в вегетирующем растении нежизнеспособных клеток с нарушениями в геноме кластогенный эффект во втором семенном поколени не сохраняется.

10. Цри многолетнем воздействии регуляторов роста, способных вызывать хромосомные аберрации и другие нарушения-а геноме растений, возможны изменения в генотипической структуре сорта В результате снижается чувствительность растений к кластогенному действию экзогенных регуляторов роста, сопровож-" дающэяся ухудшением хозяйственно-ценных показателей сорта

- 39 -

список ршл. опувлнговшшх го так диоскгсацшс

1. а С Шевелуха, Л »1 Хруеталева, И. К. Блиновский, К\ М. Головкина и «р. Генетический контроль за применением регуляторов роста растений. / "Вестник с -х. науки", 198е», N 2, С. 42-50.

2. В. С. Шввелуха, Л И. Хруеталева, И. К. Блиновский. П. U. Го ловнина и др. Оценка генетического риска применения регуляторов роста. / Сборник "Регуляторы роста в растениеводстве" М. , 1989, С. 137-134.

3 а С. Шевелуха, И. К. Блиновский, Л. И. Хруеталева, И. М. Г">-ловнина и др. "Мэтодические рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениэ-водстве" М. , МСХА, 1992, 28с.

4. а С. Шевелуха, Л. И. Хруеталева, И. К. Блиновский, Ю. м. го-ловнина. Оценка мутагенной активности ряда фиторегуляторов. / Тезисы докладов на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" Ереван 1987, С. 117.

5. Л. И. Хруеталева, и. К. Блиновский, XX U. Головкина и др. Скрининг на мутагенную активность новых фиторегуляторов. / Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Объем и методы гено-токсической оценки" Ленинград, 1989, С. 32.

6. Л. И. Хруеталева, Г. Е Андреева, И. Ы. Головнина, А. И. Зло-бии и др. Генетический контроль за применением картолина и камяозана на зерновых культурах. / Тезисы докладов Всесоюзного координационного совещания "Генетические последствия загрязнения окружающей среды" Москва-Самарканд, 1990, С. 185.

7. Л. И. Хруеталева, Злобин А. И., Андреева Г. а Действие картолина на компонентный состав запасных белков ячменя. / Тезисы докладов Всесоюзного координационного совещания " Генетические последствия загрязнения окружающей среды" Ыэсква-Самарканд, 1990, С. 186.

8. Khrustaleva L. I. , Andreeva a M., Golovmna G. M. Adaptation of Hordeum vulgaris (variety Nosovskiy-9) to growth regulators in a three year trial./ Proceedings cr the 5-th International Youth Symposium "Plant retabolibm regulation", Varna, Bulgaria, 1990, P. 180-183.

9. Л.И. Хруеталева, Г. E Андреева. 10. M. Гсловни-на, А. И. Злобин . Цитогенетичеекие исследования в соматических и

генеративных клетках ячменя, обработанного эпибрасинолидом-Б5 в полевых условиях. / Тезисы докладов совещания "Враосиностерои-ды", Минск, 1991, С. 31-32.

10. Л. И. Хрусталева, Г. Н, Андреева, in IL Головнина, А. И. Зло-бин . Генетические последствия применения химических средств в сельском хозяйстве. / Тезисы докладов н-п конференции "Природоохранные аспекты землепользования и с/х производства в свободных экономических зонах" Ленинград. 1991, С. 47.> "■

. 11. L. I. Khrustaleva, üN. Andreeva, ДО. UGolovnina," A. I. Zlobln./ The problem of preservation of germoplasm in the conditions of antropogenio pollution" V.Abst. 4:Exchange and convertation of PlantGenetlc Resources between America and Europe. £tnobotanica^92" Cordoba, 1992. P. 42. Ч-/.Г .

12. Л И. Хрусталева, kl u. Головнина . К вопросу сохранения растительного генофонда: Цитогенетические эффекты ретардантов в генеративных клетках ярового ячменя. / .Доклады РАСХН, 1994, N. б, (в печати). , .

la ЛИ.Хрусталева, laU.Головнина. . Влияние брассинолида на цитологические и физиологические показатели у ячменя (Hordeum vulgare L.) в условиях солевого стресса./ С.-х.биология 1984, N. 5 • ' : . . ; ' .;' ■

14. Шевелуха ЕС.,' Блиновский И. К., Хрусталева Л. И. ®гго-регулятора- за и против. / Наука в СССР., 1989, N4," С. 23-24. ' .

15. Артамонова Г. U., Герасимова С. И., Хрусталева Л IL ' и др. "Лабораторно-практические ванятия по сельскохозяйственной биотехнологии" U.: Иэд-во ТСХА, 1991, 94 с. .

16. Хрусталева Л И. . Погорилая Е. R Влияние фиторегулято-ров на состав клеточной популяции в корневой меристеме Allium flstulosum Li/ онтогенез, 1994. N 6 I* - ' . i '

Объем 2'/г п т

Тираж 100

Заказ Ь7т

Типография Московской с -х академии имени К А Тимирязева 127550, Москва II ^"О Тичиргзьвская ул, 44