Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение цитогенетической активности фиторегуляторов из групп ретардантов и антистрессовых препаратов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение цитогенетической активности фиторегуляторов из групп ретардантов и антистрессовых препаратов"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО. ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи РГ6 0Дг9ЛОВНИНА Юлия Михайловна

2 5 ДГ.? Ш';

ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСадй АКТИВНОСТИ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ ИЗ ГРУПП РЕТАРДАНТОВ И АНТИСТРЕССОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА.

Научный руководитель — доктор биологических наук, акад. РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, акад. РАСХН Г. С. Муромцев, канд. биол. наук, доцент ТСХА С. В. Иванова.

Ведущее учреждение — Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН. Директор — проф. А. Л. Бучаченко.

Защита состоится «.Ж?...» 1994 г. на за-

седании специализированного ученого совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета -кандидат биологических наук

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Использование регуляторов роста и развития растений - важное направление современного растениеводства. . Их применение дает возможность воздействовать иа интенсивность и направленность физиологических процессов в растениях, повышать урожайность, улучшать качество и сохранность продукции. Однако, для некоторых из них, помимо л®лаемого физиологического эффекта, было выявлено мутагенное действие, что создает опасность изменения сортовых свойств культурных растений и снижения их жизнеспособности С Куриный, 1983).

Систематические исследования генетической активности химических средств, применяемых в сельском хозяйстве проводятся лишь для группы пестицидов и имеют в основном иедико-токсикологическую направленность. Вопросу проверки на ыутагеннув активность * фиторегуляторов. посвяадэны лишь отдельные работы. Нзиду тем, действие этой группы веществ, в отличиэ от пестицидов, направлено непосредственно на регуляторные системы возделываемых растений и имеет множество точек приложения. '

В свя8И о этим, необходима разработка комплексных систем генетического мониторинга ва применением рострегулируюших средств, составной частью которого является цитогенетнческий анализ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования была проверка фиторегуляторов из групп ретардантов и антистрессовых препаратов на мутагенную активность в соматических и генеративных клетках растений.

В задачи исследований входило:

1. Изучение мутагенной активности фиторегуляторов в биотесте Allium fistulosum.

2. Выяснение, механизмов цитогенетического действия фиторегуляторов, проявивших мутагенную активность.

3. Изучение влияния фиторегуляторов на генеративные и соматические клетки и показатели структуры урожая у различных сортов ярового ячменя.

4. Изучение последействия фиторегуляторов в первом и втором семенных поколениях ярового ячменя по цитогенетяческиы и биометрическим показателям.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Впервые проведена проверка на мутагенную активность в растительном биотесте фиторегуляторов : гидрел, 2-XMR, карто-лин, эпибрассинолид-55, СОС, декстрел.

2. Дана сравнительная оценка мутагенной активности препаратов 2-ХЭ5Й и картолина в биотесте Allium fistulosum и в сомати-

\ ческих и генеративных клетках ярового ячменя.

3. Зарегистрирована различная чувствительность сортов ярового ячменя к мутагенному действию картолина и 2-ХЭФК.

4. Показано, что мутагенное действие картолина и 2-ХЭФК сопровождается изменением биометрических показателей у. растений ярового ячменя.

Б. На основании цитогенетич&ских тестов и биометрического аналиаа структуры урожая показано отсутствие последействия картолина и 2-ХЭ4К у растений ярового ячменя второго семенного по-, коления.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Результаты исследований использованы для разработки " Штодичееких рекомендаций по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве. "(VL , МСХА, 1992). Заключение по мутагенному действию . гидрела и 2-ХЭФК было передано в Государственную межведомственную комиссию по испытанию и .регистрации средств защиты растений и использовано при разработке токсико-гигиенических регламентов их применения,

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на: Заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера". Ереван, 1987; Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы ге-нотоксической оценки", Ленинград, 1989; Всесоюзном координационном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды". Москва-Самарканд, 1990; Пятом международном молодежном симпозиуме "Регуляция метаболизма у растений", Варна,1090; совещании "Брассиностероиды", Шнек, 1091; Мзздународном конгрессе "Этноботаника-92", Кордоба, 1992.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит иа введения, об-^ вора литературы, экспериментальной'части, результатов, обсуждения и выводов. Материалы диссертации изложены наЩзтраницах текста, содержат,^ таблиц, /<Р рисунков и фотографий. Библиография содер-

ЮП^йИСТОЧНИКОВ,

- а -

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта для скрининга на мутагенную активность использовали лук-батун (Allium fistulosun).. Были изучены фиторе-гуляторы: 2-хлорэтилфосфоновая кислота (2-ХЭШ, декстрел, гид-рел, хлорхолинхлорид (ССС) в концентрациях - IX, 0,1%, О,01Z; ГМК-На и картолин в концентрациях - 1%, О,IX, 0,01%, lû"J X,

-5 £ -4

10 X, 10 X, 10 X; эпибрэссинолид-Бб в концентрациях - 10 X, 10~SZ. 10 eZ.

О мутагенном действии, препаратов судили по нарушениям в структуре хромосом клеток Корневых меристем в ана-телофазе мито-8а Семена дука-батуна проращивали в чашках Штри на влажной фильтровальной бумаге при t* -26е" С . Через 48 часов от начала проращивания проростки переносили на Фильтровальную бумагу, смоченную в растворе фиторегулятора на 18 часов, что соответствует продолжительности митотического цикла у лука-батуна. Для анализа отбирали коре паси длиной 1,5-2 см. Фиксацию проводили в фиксаторе Кларка, гидролиз - в 3 N соляной кислоте при комнатной температуре в течение 20 мин., окраску - в 6Х ацетокармине, микроскопию - на давленья препаратах о использованием фазового контраста на микроскопе "Axiophot". Ш каядый вариант обработки отбиралось по Б00 клеток, не менее чем от 20 растений. Статистическую вкачи-шеть.различий между уровнем мутирования клеток в опыте и контроле определяли по критерию Стыодента (Зако, 1976) . При определении мгготнческих (Mi) и фазовых индексов использовали стандартные методы (Шукева, 1988).

В полевых опытах изучали действие фиторегуляторов на сорта ярового ячменя (Hordeum vul?are) Босовский-9, Шсковский-2, Уосковский-3. Мэсковский-121. Обработку растений фиторегулятора-ми проводили в конце фазы кущения- начале выхода в трубку в рекомендованных концентрациях: IX — для ССС; 0,5% - для 2-ХЭФК; 0,15% - для картолина; lb" X для эпибрассинолнда-Б5.

Опыты проводили на экспериментальной базе лаборатории генетики и селекции полевых культур им. П. И. Лисицына ТСХА в 1989-1991 г. на выравненном агрофоне.

Приготовление цитолопгческих препаратов для анализа уровня мутирования клеток корневых меристем ячменя проводили по схеме, описанной для лука-батуна с небольшими изменениями: ткани маце-рировали в смеси 1%-ных растворов пектиназы и целлюлозы в течение 10-14 часов при комнатной температуре. Всего на вариант ана-

-.4 -

визировали не менее 20 растений.

' Влияние фиторегуляторов на генеративные клетки изучали в материнских клетках пшшцы (ШШ). Колосья фиксировали в уксусном алькоголе в течении 10-12 часов, для хранения материал переносили в 70% • этанол, виксацию проводили в утренние часы. Пыльники окрашивалш БХ ацетокармином, выдеряав их перед окраской в 41 растворе желевоашоннйных квасцов в течении 30 мин. Анализ нарушения в мейоае проводили на давленых препаратах, микроскопию в фазовом контрасте. Количество нарушений в ШI учитывали на стадиях Игтафаеы1 (Ш) , Анафазы1 (АО и на стадии тетрад, В Ml ш;аадаировали не менее - 200-330 клеток на вариант, в AI -300-400, на стадии тетрад -2000. Фертилыюсть пыльцы определяли ацетокаршмовыы методом (Паушева, 1988). Количество проанализированных на фертильнооть пыльцевых верен - от Б00 до 1000. На каждый вариант отбирали не менее 20 пыльников от равных . колосьев. •

Для изучения влияния фиторегудяторов на биометрические показатели растений с каждой опытной делянки проводили измерения ; высоты растений, длины главного колоса, количества зерен с главного колоса, массы 1000 зерен, ойдей и продуктивной кустистости. На каждый вариант опыта отбирали до 100 растений, повторность двухкратная. Статистическую обработку данных проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа ( Доспехов , 1986).

При исследовании последействия фиторегудяторов испольаовали сорт Кзсовский-Q. На второй год семена от обработанных растений высевали по семьям. Аля онтогенетического анализа отбирали 30-40 растений на вариант, для биометрического анализа в первом семенном поколении (id) - не менее 60 растений на вариант, во второй семенном поколении (1С) - не менее 200. Измеряли следующие биометрические показатели: высота растений, длина главного колоса, количество зерен в главном колосе, масса зерна с главного ко-, лоса. В качестве показателя изменчивости испольаовали коэффици-* ент вариации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

1. Скрининг фиторегуляторов на мутагенную активность в биотеоте Allium fistulosum.

Анализ хромосомных аббераций в ана-телофаае митоза показал,

- Б -

что препараты эпибрассинолид-Б5, декстрел, ССС не обладают кластогенным действием (способность вызывать хромосомные аббера-ции) ни в одной из испытанных концентраций.

Препараты 2-ХЭФК и гидрел вызывали достоверное увеличение уровня мутирования хромосом лишь в 1Х-ной концентрации.

В вариантах с картолином и ГМК-Иа было установлено, что IX картолин и IX и О, IX ГМК-Иа оказывают цитотоксическое действие на клетки - снижают митотический индекс (МО практически до нуля и вызывает деструкцию ядер. ГЬэтому, данные 4иторегуляторы были испытаны в . концентрациях. - от Ю~гх до 10"6Х. Нижний порог кластогенного действия для картолина был определен как 0.01Х, для ГШ-Иа как 0.001Х (Табл. 1).

Табл.1. Цитогенетическая активность фиторегуляторов в клетках корневых меристем Allium fistullosum.

Препарат Концент- Общее число Число

рация анафаз анафав.с X ± m td

X ' нарушениями

ГШ-Na 1 отсутстви э делений

• 0,1 отсутствие делений

0,01 634 та 13,67+1,49 5,04*

10'J 600 61 10,16+1,23 3,45*

ю"4 680 33 6,69+0,96 0,65

ю-5 520 36 6,73+1,10 1,32

630 26 4,91+0,99 0.29

Контроль 620 25 4,81±0,94

Брасси- ю"* 601 31 6,19+1,08 0,80

нолид-бб ю'5 616 40 7,76+1,78 1,78

ю'в 600 30 6.00+1.об 0,68

Контроль 460 23 6,00+1,02 —

ССС 1 978 35 3,68+0,69 1,04

0,1 , 434 17 3,92±0,93 1,08

0,01 ( 466 16 3,51+0,86 0,74

Контроль 1 980 27 2,76+0,52 —

- б -

Табл. 1. (продолжение).

Гй» парат Концент- Оборе число Число

рация ' анафаз анафаз с X £ ш 1(1

X нарушениями •

Картолин 1 отсут ствие делен) й

0.1 600 60 12,00+1,46 4,16*

0,01 612 45 8,79:1:1,25 2,54*

10~3 600 30 6,00*1,06 0,84

кг* 504 28 5,бб±1,.02 0,54

10* 560 ■ 25 4,46+0,87 -0,27

10 е 600 27' 4,50+0,86 -0,25

Контроль 520 25 4,81+0,94 —

2-ХЭ4Й 1 463 43 9,28+1,36 3,45*

0,1 454 23 5,06+1.03 0,95

0,01 617 26 . 6,03+0,96 0,96

Контроль 520 20 3,80±0,84 ---

Декстрел 1 . г 662 31 6,52*0,96 0,92

0.1 620 88 5,38±0,99 -0,77

0,01 510 27 5,29*0,99 -0,69

Контроль 974 , .. 60 6,16*0.77 —

Гидрел 1 646, 98 16,19+1,41 6,61*

0.1 ,381' 27 7,09±1,31 0,61

0,01 402 23 5,72*1,16 -0,32

Контроль 974 60 * 6,16*0,77 —

* - статистически достоверная разнила мевду контролем и опытом. • (Р>0,06, 1з1-1,9б)

Для фиторегуляторов, проявивших кластогенную активность (ГШ-Иа. картолина, гидрела, 2-ХЭОЙ) было изучено влияние различных доа на интенсивность клеточного деления с целью выявления пороговых физиологических концентраций, нэ обладающих кластоген-ным действием.

Для антистрессового препарата картолин, физиологическими

считали дозы, не вызывавшие сникоиия Mi. В результате исследований было показано, что О, И и 0,01% картолнн вызывает по толыт кластогенное действие, но и снижает интенсивность деления клеток. В то ей время, при снижении дозы препарата до 10~J X к ни?« картолнн проявил себя гсак стимулятор клеточного деления и не вызывал хромосомных нарушений.

Использование ГМК-Na, 2-ХЗФК и гидрела в растениеводство связано с их способностью ингибнровать процессы долепил н растяжения клеток. Поэтому, физиологическими дозами для этих препаратов считали концентрации, снижавшие Mi.

Д№ ГШ-lía все концентрации, яодаилявгае мнтотическую активность ¡слеток оказались кластогатыми. Кроме того, митотн-ческий профиль при воздействии ГШ-Na сильно смещался в сторону метафазы, что свидетельствует о способности препарата влиять па веретено клеточного деления. Количество ¡меток, эалержшшш на этой стадии было пропорционально дозе ведества.

В вариантах с 0,1% и 0,01* гидреломн 2-лЭ£К сохранялось кнгнбирование деления клеток при отсутствии кластогенного действия.

С целью изучения шшшзнов цитогенетического действии ГМК-Na, 2-ХЭФХ, картолина, гидрела регистрировались изменяют а уровне мутирования клеток и спектрах хрошсонных аббераций в течение *Б4 часов. Для' этого корешш пождали на раствори фгггорегу-ляторов на 18 часов, а затем доращивали на' воде. Фиксацию проводили ' через 18, 35 и 64 часа с момента обработки. Для контроля вступления клеток в деление измерялся Mi. Препараты бит испытаны в мшпошышх пороговых кластогеняых дозах (1Z для 2-УЭШ и гидрела, 0,012 для картолина и О,ООП для ПК-На). Результат» этих исследований представлены на рисунках 1,2,3,4.

Кластогенное действие препарата » картолнн не сохранялось б популяции мэристематических клеток. Чэреэ 26 часов о юш-гга обработки процент абберантных анафаз статистически дсотоверио не превышя контрольный уровень. Hi был иеэначктояьно ним контрольного в течение всего эксперимента, что говорит об отсутствии задержки клеток в интерфазе, В спектрах хромосомных -йбгрящгд присутствовал!» нарушения кзк хромосомного так и хрокаг-инего типов, их соотношение изменялось незначительно в to-ví.í¿ трех фиксаций и было сравнимо с контрольным. Это .указывает ¡-м способность препарата воздействовать па все стадш ннтepíasu ü'»'.').

. - 8 -

Рис.1. Динамика изменения цитогенетических показателей в клетках корневых меристем Allium flstulosum

при воздействии картолина

Соотношение .......

К>

З'авбераций *

хроматидные/хромосомные

II

« 5« 18 36 18 54_1

Время фиксации с момента обработки (час.)

★-статистически достоверная разница между контролем и опытом

- картолнн

С=3 _

контроль

Рис. £.

Динамика изменения цитогенетических показателей в клетках корневых меристем Allium flstulosum при воздействии ГЫК-Na

' 1 Соотношение . , Г

камера чий хроматидные/хромосомные * *" * транслокации

ни

1

1

-w—-JC.......=•—-- - « 36 §Ь" ■

Время фиксации с момента обработки (чао.) •^-статистически достоверная разница меаду контролем и опытом

- ГЫК-Na

а ..

контроль

. f

4

Кластогенное действие препарата ГШ-На наблюдалось в течение всего эксперимента. Пролонгированным было и его «простатическое действие.- В клетках выходящих в первый митоз после задержи в интерфазе преобладали абберации хроматидного типа, представленные одиночными мостами и фрагментами, что указывает на способность препарата вызывать нарушения преимущественно на стадиях S и G2. Аналогичные данные были зарегистрированы на клетках хивогных и характеризуют препарат как мутаген задерганного типа действия (Nishi.1979; Spelt,1983). Увеличение Ш к третьей фиксации свидетельствует о присутствии в анализируемой клеточной популяции клеток, входящих во второй и третий митозы. При этом, преобладание хроматидных нарушений над хромосошгыш сохранялось. Поэтому, можно предположить, что сохранение пови-сэнного уровня мутирования меток в течении 54 часов связано со способностью препарата вызывать потенциальные нарушения в структуре хромосом, реализующиеся в абОерашш в несколы а« последовательных клеточных циклах (Рис.2).

Исследования па ¡слетках животних показали, что препарат уд-люпшет S период, ингмбируя активность ДНК- пощшйраэы (Лосев 1971, Cortes, 1987). Крош того, нормальный ход репликации кокет нарушаться из-аа- включения ГНК-Ma в состав .молекул и-РНК и г-РНК Г&вестно так та, что шлекуда гидразшга способна реагировать с'пиримвдииовьми основания»® и разрушать их, создавая апи-римидиновые сайты в ДНК (Дубинин 1980). Можно предположить, что сочетание ДНК-повреждаицэго действия и влияния на пролнфератав-ную активность клеток и работу фершптов решшкащш обуславливает высокую кластогенную активность соединения.

При воздействии препарата 2-3005 уровень мутирования клеток был достоверно выл» контрольного в точение 54 часов. Зарегистрированное наш отсутствие, роста штотнчэской аегивностя клеток после снятия действия земства очевидно связало с задержкой клеток в интерфазе на стадш! G1 (Хрусталзва, Погоригая 1994), Это дает основание предполагать, что болгаитотво анализируемых в анафазе клеток находилось в первом после .'.Г-^йслет митозе." В этой связи представляет интерес анализ cnoirrpo;? ггзругк-Hitii, в которых з первой фиксации соотногонне хронжтядтгэ/ хромосомные трансло;сац!П1 шло отлеталось от ксотгапьного, а в последукшх преобладали абберащш хромосомного тяпз (Гис.З).

' " • ■ - ю - • • •• • : • Рис.3. Динамика изменения цитогенетических' показателей в клетках корневых меристем Allium fistulosu,n при воздействии гидрела. Соотношение , хроматидные/хромосомные . •

X аббераций • *

транслокации

Mii-х

I

/а' ; ЗС 5<t- ¡8 .... 36 54 .. .18, 36 5Н

Время фиксации с момента обработки ( час,) ■•,-•. *гстатнс1ИЧески достоверная разница Мезвду контролем и опытом"

JPI-гидрел, ED-контроль

Рис. 4. Динамика изменения, цитогенетических' показателей в клетках корневых меристем Allium ftstulosum при воздействии 2-ЯЭвК - ......__

• . соотношение"——-,'.'

X аббераций

хромат идные /хромосомные

i

js я .

*-С'

. . . _____ _________ ... 18 36

Время фиксации с момента обработки (час.) :татистотееки достоверная разница~дажду контролемтгопыгом*

; 1И-2т5СЭОй, контроль

- 11 - — -

Поскольку у препарата по данным литературы не было зарегистрировано ДНК-повреждавшего действия, мы считаем возможным предположить, что подобные изменения в хромосомных спектрзх могут быть результатом воздействия на системы репарации на фоне длительной задержки клеток на стадии G1.

В варианте с гидрелом повышенный уровень мутирования клеток регистрировался в течение 36 часов. В хромосомных спектрах при первой фиксации преобладали хроматидные транслокации и делеции, представленные одиночными фрагментами и одиночными мостами, что предполагает способность препарата вызывать нарушения преимущественно в S и G2 фазах. Митотическая активность клеток во второй и третьей фиксациях была несколько вида, чей в первой, что говорит о вступлении клеток, во второй и третий после обработки митозы. Однако, в отличие от-ГМК-Ма, начиная со второй фиксации соотношение хроматидные/хромосомные нарушения было сравнимо с контрольным (Рис. 4). Наши данные по мутагенной активности гидрела в растительных клетках согласуются с результатами, полученными на клетках животных и микроорганизмов, где для препарата была зарегистрирована способность вызывать генные мутации (Весманова, 1887).

2. Изучение чувствительности сортов яровго ячменя к Фиторегуляторам.

2.1. Влияние фиторегулятороа йа соматические клетки.

Результаты изучения цитогенетической активности фиторегу-ляторов в соматических клетках ячменя согласуются с данными, полученными на Allium flstulosum.

При обработке корневых меристем ячменя препаратами 2~ЯЭИ и ССС было показано, что 2-ХЭОК вызывает достоверное увеличение количества клеток с абберациями хромосом. ССО не влиял на уровень мутирования соматических клеток.

В вариантах с ' 2-ХЭСК были изучены сортовые реакции на кластогенное действие препарата Сорта распределялись следущим Сбразом в порядке убывания количества аббераятных анафаз : Ьэсковский-З, Нэсовский-9, Ыосковский-2, Носковский-121. Для сорта Московский-121 отличия в уровне мутирования клеток в контроле и опыте были статистически недостоверными (Рис.Б).

Рис. 6. Патогенетическая активность ретардантог в клетках корневой меристемы ячменя

X аберраций

I

II

ш

Г ' :

I - Сорт Иэскювский^З, II - Сорт Яосовский-б, " , . III - Сорт Мосюовский-2, IV - Сорт Московский-121 □■контроль, Ш-2-хэаж, ^-ссс , • • * - статистически достоверная разница между контролем и опытом • . /(Р >0.06)

2.2. Влияние фиторегуляторов на генеративные клетки. >,

'Аналиа уровня мутирования генеративных клеток ячменя показал статистически достоверные от контроля отличия в вариантах с картолином и 2-ХЭФК. Препараты ССС и эпибрассинолид-56 не вызывали нарушений в мейозе. Генеративные клетки сортов Шеовский-0 и Московский-3, так же. как и соматические клетки, оказались наиболее чувствительными к препаратам 2-ХЭФК и картолин. Для сортов Мэсковский-2 и Ыосковский-121 достоверных от контроля отличий зарегистрировано не было (табл.2).

При изучении спектров хромосомных нарушений в генеративных

- 1Й -

Табл.2. Дитогенетическая активность фиторегуляторов в генеративных клетках ячменя.

Количество Количество

Вариант проанали- клеток с X £ га Ъс!

опыта зированных клеток нарушениями

Сорт Носовский-9

Контроль 2500 30 1,2010.22 —

Картолин 2600 • 86 ' 3,40+0.36 5,18*

г-хэж ■ 2450 57 2.32Ю.30 2,99*

ССС 2300 "37 1,6110,26 1,19

Эпибрассинолид-65 2500 39 1.56+0,27 1,21

Сорт Московский-3

Контроль 2650 25 0,95+0,19 —

Картолин 2500 61 2,04+0,28 3,19*г

2-ХЭИ 2500 41 1,6410,25 2,18*

ССС ' 2500 31 1,2410,22 0.99

Зпираесинолид-Бб 2450 34 1.36±0,23 1,37

* Сорт Московский-^

Контроль 2300 39 1„6910.27 —

Картолин 2350 52 2,21±0,30 1,44

2-ГО® 2700 и 1.62+0,24 -0,17

ССС 2400 48 2,00+0,29 0,79

Эпибрассинолид-Бб 2400 31 1,29±0.23 -1.12

Сорт Московский-121

Контроль 2500 21 1. 0.84Ю.18 —

Картолин 2650 1,24+0,22 1.44

2-ХЭЯК 2400 • 24 1 1,0010.20 0.59

ССС 2600 17 " 0,6510,16 -0.78

Эпибраесинолид-56 2455 • 23 1 0,94+0,19 0.36

* - статистически достоверная разница между контролем опытом. (Р>0,06)

клетках в метафазе1 были выявлены слипания хромосом, их фрагментация и уннваденты, которые были особенно характерны для растений сорта и-з. обработанных картолиноы.. Количество открытых Си-

валентов в этом варианте статистически достоверно отличалось от контроля, что может служить косвенным свидетельством изменения характера конъюгации хромосом., в анафазеI наблюдали фрагменты, мосты и неравное количество хромосом на полюсах. На стадии тетрад преобладающими типами нарушений были микроядра, реже наблюдались триады и пентады. Максимальное количество клеток с микроядрами было зарегистрировано на сорте Нэсовский-9 в вариантах с картолином И 2-ХЭФК. .

Поскольку обработка фиторегуляторами проводилась незадолго до начала мейоза. одной из причин , регистрируемых в мейозе нарушений. могут быть изменения в тканях, дающих мейоциты. Не смотря на то, что в наших исследованиях непосредственного изучения предмейотических делений не проводилось, в последних перед мейозом, уже синхронных митозах регистрировалось реакое увеличение количества абберантных анафаз в вариантах с картолином и 2-ХЭФК. Очевидно, что большинство абберантных клеток элиминируется, однако, некоторые типы нарушений могут доходить до ыейоза и в результате кроссинговера у гетерозигот по инверсиям, дупликациям и симметричным транслокациям вызывать перестройки хромосом. Кроме того, картолнн и 2-ХЭФК, сохраняясь в тканях растений, могут воздействовать непосредственно на мейотическую интерфазу и профазу, вызывая нарушения при делении, ,

Учет влияния фиторегуляторов на фертильность пыльцы показал, что картолин статистически достоверно снижает фертильность растений сортов Нэсовский-9 и Мэсковский-З. Количество стерильных пыльцевых зерен для сорта Носовский-9 составило 16%, для сорта Мэсковский-3 - 21Z, при « и 6Z в соответствующих контрольных вариантах. Поскольку для этих сортов регистрировалось и максимальное увеличение уровня мутирования генеративных клеток можно предположить, что снидение фертильности при обработке картолином связано с нарушениями в мейозе. Препарат 2-ХЭФК увеличивал стерильнсть пыльцы на всех исследованных сортах,- кроме Московского-121. Ка сорте Ыосковский-2 половина исследованных пыльцевых зерен были стерильными при отсутствии хромосомных нарушений в мейозе. Вероятно, высокая стерильность пыльцы при использовании 2-ХЭФК не является прямым следствием мейотических аномалий. По данным литературы гаметоцидное действие препарата связывается с нарушениями работы клеток париентерального слоя пыльника, ответственного за питание генеративных клеток (Савчен-

. .' - 16 - ) ко, ' 1983). Незначительное снижение фертильнооти было отмечено и для ССС на ' сорте Московский-3. Препарат энибрассинолид-Бб не влиял на процесс формирования пыльцы.

2.3, Влияние, фиторегуляторов на соматические клетки : первого семенного поколения."

. Кластогенное дейсфвйе препаратов 2-ЛЭЖ и картолина не ограничивалось влиянием на генеративные и соматические клетки ячменя непосредственно,после обработки,' но и сказывалось на первом семенном поколении, ' Так же» как и в лабораторном эксперименте при непосредственной обработке корневых меристем, соматические клетки первого, семенного поколения-сорта Московский-121 оказались нечувствительными к фиторегуляторам. У остальных сортов в этих вариантах уровень мутирования клеток был статистически достоверно, выше контрольного. . / •:

'" ' ССС и. эпиОрассинолид-65 на > вызывали кяастогенного действия в соматических клетках Ш.

Предположительно,-сохранение повышенного уровня мутирования клеток в Ш может быть.связано с длительным сохранением фиторегу-ляторов в растениях. Нарушения, возникающие в клетках формирующегося многоклеточного зародыша, регистрируются в первом митозе по увеличению количества хромосомных аббераций.. Не исключено, что высокий процент нарушений может быть связан с генными мутациями, реализующимися в хромосомные абберации в первом митозе секян Ш (Весманова, 1987).

2. 4. Анализ биометрических показателей

. Результаты двухфакторного дисперс ионного анализа, представление в таблице 4, покйаываот, что картолин достостоверно снижал количество зерен в колобе у всех исследованных сортов. У сортов И и М-2 отмечалось снижение длины растений. Особенно чувствительным к картолину был сорт М-2, , у которого наблюдалось так же уменьшение массы 1000 зерен. Сорт Московский-121 был . наименее чувствительным .к обработке картолином (Табл.3).

; С нашей точки зрения, отрицательное влияние препарата на компоненты урожая обусловлено TeMi что доза в 0,161 является завышенной. Известно, что даже природные цитокинины при экзоген-

Табл. 3. Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели.

Высота Длина Количество Шсс а

Вариант раст. главн. зерен в 1000 O.K. Д к.

опыта см. колоса см. гл. колосе шт. верен г.

НОСОВ! жий-9 .

Контроль 68 7.80 21.07 43 2.70 1.86

Картолин 64.48* 7.00 19.05* 41.28 2.28 2.08

2-ХЭФК 68.70* 6.73 18.60* 37.20* 2.89 1.92

ССС 67.39 7.18 21.37 44.08 а 23 1.42

Эпибрассинолид- 65 68.52 7.87 21.60 45.32 2.81 1.41

ЫосковскиЯ-3

Контроль 67.12 7.62 20.07 46.96 1.46 1.29

Картолин 67.40 6.13 16.81* 45.32 1.62 1.09

2-ХЭОК 61.31* 6.60 16.74* 41.32* 2.42 1.52

ССС 68.88 7.33 18.91 47.44 1.62 1.54

Эпибрассинолид-ББ 74.67* 7.60 19.97 47.62 2.66 1.25

Мэсковский-2

Контроль 68.23 7.05 19.57 49.68 1.74 1.42

Картолин 59.52* 5.40 15.13* 44.92* 1.47 1.28

2-ХЭ5& 61.43* 6.10 15.40* 47.00* 3.09 1.73

ССС 67.21 6.17 17.87 49.31 1.81 1.59

Эпибрассинолид- 66 68.19 6.48 17.97 48.64 1.91 1.25

Московский-121

Контроль 63.46 7.08 20.47 46.04 2.00 1.62

Картолин 63.67 7.50 17.42* 44.08 2.33 1.69

2-X3SK ■ 63.71 7.38 21.00 46.92 а 66 1.83

ССС 63.91 8.36 19.37 46.00 3.21 1.64

ЭпиОрассинолид-66 61.67 8.92 21.03 48.48 2.27 1.47

ШР0.5 3.38 2.23 1.73 2.66 —

О. к. - общая кустистость, П. к. - продуктивная кустистость * - статистически достоверная разница между контролем и опытом.

ном внесении в высоких дозах оказывает ингибиторное действие на

-/17..- .

ростовые процессы, ^¿токсичность синтетических аналогов цито-кинина мнЬго выше, природных и связана с их длительным

сохранением в Ткадях гЗастений (Баскаков, 1981) .

Уве^мчени^йойичеЪтва боковых колосьев за счет подавления роста главно*^ побега - характерная реакция на 2-ХЭФК. Примене-яйе ретарданта в условиях засушливого лета 1989 года вызывала у сортов Носовский-9. Мэсковский-3 и Московский-2 увеличение количества колосьев при уменьшении количества зерен в колосе и массы 1000 зерен» что согласуется с данными литературы (Прусакова.Чи-юва, 1989; УаскИп^оп.СаКтгН^Ь, 1986). Возможно, что снижение количества зерен в колосе связано и с, зарегистрированной нами, высокой стерильностью пыльцы у этих сортов при обработке 2-ХЭФК. Ш сорте Московский-121 не было отмечено изменений биометрических показателей при обработке 2-ХЭФК. Этот сорт был также нечувствителен к ретардантному действию препарата.

Гфименение ССС и эпибрассинолида-55 не оказало существенного влияния на большинство биометрических показателей.

Обнаруженные нами различия сортового ответа на фиторегудя-торы очевидно связаны с особенностями генотипов изученных сортов и сортовой спецификой проникновения, передвижения, метаболизма и детсксикацки данных веществ. Связь чувствительности различных сортов ячменя к этиленпродуцеяту этрел с особенностями генотипа отмечается в литературе - для устойчивого сорта было показано образование дополнительных белковых компонентов, которые, по мнению авторов, выполняют защитную роль (Деева, 1988).

3. Изучение последействия фитбрегуляторов.

3.1. Влияние фиторегуляторов! на соматические клетки растений первого и второго семенных поколений.

Для изучения последействия фиторегуляторов в поколениях был выбран сорт ячменя Досовский-9. продемонстрировавший высокую чувствительность к картонку и 2-ХЭЖ в лабораторных тестах и полевых опытах в 1988 году. При обработке растений картолином и 2-ХЭвК в 1989 году было повторно зарегистрировано увеличение уровня мутирования соматических клеток Ш, что подтверждает способность эти препаратов оказывать кластогенное действие на растительные клетки (Табхв). Анализ изменчивости количества хромосомных : аббераций показал различную чувствительность растений на

Табл. 4. Влияние фиторегуляторов на уровень мутирования

соматических клеток двух поколений ярового ячменя сорта Носовский-9.

Вариант Общее Число 4

опита число анафаз с X ± m td

анафаз нарушениями

1990 год

Контроль 2783 76 2,73+0,31 —

2-ХЭФК 2202 108 4,9010,46 3,88*

Картолин 2334 136 5,8310,49 5,35*

1991 год

Контроль 2220 54 2,43+0,33 —

2-ХЭФК 1656 36 2,17+0,62 -0,30

Картолин ■ 1494 48 3,21+0,46 1,39

* - статистически достоверная разница между контролем и оптом. .

(Р>0,05, tst-1,06) . .

обработку этими фиторегуляторами.- Коэффициент вариации по количеству абберантных анафаз в варианте с картолином был равен 63,09%, а в варианте с 2-ХЭФК - 39,10%, при 11,27% в контроле. Применение фиторегудяторов CGC и эпибрассинолид-Б5, так же как и в 1988 году, не влияло на уровень мутирования соматических клеток М1. отличия между растениями опытных вариантов были несущественными.

В корневых меристемах растений Ы2 ни в одном из опытных вариантов не наблюдалось достоверных от контроля отличий, что свидетельствует об отсутствии кластогенного действия препаратов на второе семенное поколение (Табл.4). Различия растений опытных вариантов по уровню мутирования соматических клеток были не выше, чем в контроле.

Отсутствие цитогенетических изменеий в опытных вариантах, с нашей точки арения закономерно и связано с наличием соматического и гаметического отбора пораженных клеток в вегетирукдэм

растении.

3.2. Анализ биометрических показателей растений ячменя двух семенных поколений.

Обработка картолином и 2-ХЭФК в 1990 году, так да как и в 1989 году, привела к достоверному уменьшению длины растений, количества зерен в главном колосе, массы зерна с главного колоса (Табл.5). Варьирование биометрических показателей у опытных рас-

ТабЖ Б. Влияние фиторегуляторов на биометрические показатели двух поколений ярового ячменя сорта Нэсовский-9.

Вариант Высота Длина Количество Масса зерна

опыта растения главного зерен в главном с главного

см. колоса колосе колоса

• . шт • г.

1990 год

Контроль 62,42 . 8,66 21,40 0,86 .

2-ХЭФК 64,06* 7,96 16,63* 0,63*

Картолин 65,48*' 7,38 15.18* 0,66*

Эпибрассй- 61,31 7,98 19,54 0,82

нолид-55

ССС 61,64 8,00 20,34 • 0,82

НЗР 2,84 1,20 ч 2 О; 14

* 1 1991 год

Контроль 77,68 9,22 25,4 ¡6 - 0,76

2-ЯЭЖ 76,93 9,06 26,06 0,73

Картолин 76,60 9,10 25,23 0,72

Эпибрасси- 77,70 9,98. 26,06 0,73

нолид-ББ

ССС 76.69 9,54 26,24 0,73

ШР0.5 2,53 0,39 0,93 ■ 0,75

* - статистически достоверная разница между контролем и опытом.

тений было выше, чем в контроле. Особенно заметным был эффект по признаку количество зерен в колосе - коэффициент вариации по этому показателю вдвое превышал контрольный. Применение фиторе-гуляторов ССС и эпибрассинолида-55 не вызывало существенных изменений по биометрическим показателям, что согласуется с результатами, полученными в 1989 году.

При пересеве селенного материала от обработанных в 1990 году растений опытный материал статистически достоверно не отличался от контрольного (Табл. 5). Коэффициенты вариации в опыте по большинству признаков были близки с контрольными. Однако, всхожесть растений обработанных картолином и 2-Ш была , несколько ниже, что предположительно может быть связано с высоким уровнем мутирования клеток корневых меристем в проростках семян Ml. Таким образом, не было выявлено последействия картолина, 2-ХЭОК, ССС и зпибрассинолида-55 на биометрические показатели растений

иг. '

Увеличение изменчивости у опытных растений в год обработки по цитогенетическим и биометрическим тестам можно объяснить возможной физиологической вариабельностью растений. В частности, в момент обработки, растения могут находиться на блиаких, но различных стадиях развития., Эффективность же применения рострегули-рукпих средств существенно зависит от фазы органогенеэа. Таким образом, даже при высокой степени генетической однородности сортовой популяции, для отдельных растений можно ожидать отличия в ответе на фиторегуляторы, приводящее к увеличению коэффициента вариации по отдельным признакам в год обработки.

вывода. ,

1. Применение синтетических регуляторов роста оказывает существенное влияние на морфофиэиологичеекие и генетические процессы у растений. Масштабы колебаний этих показателей зависят от природы и концентрации химических соединений и от генотипа сортов. .

2. фи скрининге фиторегуляторов на кластогенную активность в биотесте Allium fistulosum установлено, что :

- IX и 0,12 ГМК-Na вызывала цитотоксичеекий эффект, 0,01% -0,001% ГМК-Na обладала кластогенным действием. Минимальный порог кластогенного действия для препарата составил - 0,001%; -

- этиленпродуценты гидрел и 2-ХЭФК обладали кластогенным

действием тольйо в IX-ной' концентрации;

- 1Х-ный картолин вызывал цитотоксический эффект, О, IX -0.01Х картолин обладал кластогенныч действием. Пороговая класто-генная концентрация препарата - 0,01%;

- 10Г** - 10"6 X эпибрассинолид-Б5, IX - 0.01Х - декстрел, IX - О,01X ССС не вызывали увеличения уровня мутирования хромосом.

3. При обработке фиторегуляторами ( О.бХ 2-ХЭФК, IX ССС, ОДБХ картолином, .10 X эпибрассинолидом-Бб) посевов ячменя зарегистрировано, ЧТО:

- 2-ХЭФК и картолин вывивали цигогенетические нарушения в мейоае, снижение фертильнооти пыльцы и увеличение уровня мутирования клеток первого семенного поколения. Эпибрассинолид -55 и ССС на обладали цитогенетической активностью в генеративных.и соматических клетках ячменя;

- кластогенное действие картолина сопровождалось изменением биометрических показателей - уменьшением количества зерен в главном колосе, массы 1000 зерен, снижением высоты растений; обработка 2-ХЭФК вызывала увеличение количества колосьев при сни-

нии высоты растений, количества верен в главном колосе и массы 1000 верен. Эпибрассинолид-ББ и ССС нэ вызывали существенных изменений биометрических показателей.

4. Установлена различная чувствительность сортов ячменя к фиторегуляторам картолин (0.16Х) и 2-ХЭФК (0,5Х).

- сорт If-121 был наименее чувствительным к кластогенному действию картолина и 2-ХЭФК. Для этого сорта не было зарегистрировано и существенных отклонений по биометрическим показателям.

- чувствительность сортов H-9,i i 1-2, М-З была примерно одинаковой по сумме цитогенетических и биометрических тестов.

5. Показано отсутствие последействия 0.16Х картолина, 0,5Х 2-ХЭФК, 10 X зпибрассинолида и IX' ССС на цитогенетические структуры и биометрические показатели растений ярового ячменя второго семенного поколения.

6. Полученные результаты позволили предложить дополнительные параметры в" Штодические рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве". подготовленные с нашим участием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. В. С. Шэведуха, Л И. Хрусталева, И. К. Еяшювский, 1йМ. Головнина к др. Генетический контроль за применением регуляторов роста растений . / "Вестник с.-х. науки". 1989, N.2, с.42-50.

2. В. С. Шевелуха, JL И. Хрусталева, И. К Блиновский, XX М. Головкина и др. Оценка генетического риска применения регуляторов роста. /"Регуляторы роста в растениеводстве" М., 1989, с. 137-134.

3. ЕС.Шевелуха, И.К.Блиновский, Л.И.Хрусталева, ЕМ.Головкина и др. "Методические рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фиторегуляторов в растениеводстве" UL . НСХА, 1992 Г. 28с. ;

4. Е С. Шевелуха, Л. К Хрусталева, И. К. Блиновский, Kl Н Головкина. Оценка мутагенной активности ряда фиторегуляторов. / Тезисы докладов на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера". Ереван, 1987, с. 117.

б. Л. И. Хрусталева, И. К. Блиновский, II11 Головкина, Г. Е Андреева и др. Скрининг на мутагенную активность новых фиторегуляторов. / Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Обгем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически-активных вевзэств", Ленинград, 1989, с. 32.

6. Л. И. Хрусталева, Г. H Андреева, КХ М. Головнина, А. И. Злобин и др. Генетический контроль эа применением картолина и кампоаана на зерновых культурах. / Тезисы докладов Всесоюзного координационного совещания "Генетические последствия загрязнения окружающей среды" Мзсква-Сашрканд, 1990, с. 185.

7. Khrustaleva L. I., Andreeva G.N., Golovnina G. M. Adaptation of Hordeum vulgaris (variety Kosovskiy-9) to growth regulators in a three year trial. /Proceedings of the 5-th International Youth Syirposium "Plant metabolism regulation", Varna, Bulgaria, 1990, p. 180-183.

8. Л.И. Хрусталева, Г.Е Андреева, Ю. U. Головкина, А. И. Злобин Цитогенетические исследования в соматических и генеративных клетках ячменя, обработанного эпибрасинолидом-55 в полевых условиях/ Тезисы докладов совещания "Брассиностеровды", Минск, 1991. с. 31-32.

9. Л. И. Хрусталева. Г.Н.Андреева, Ю. М. Головнина, А. Й. Злобин Генетические последствия применения химических средств в сельском хозяйстве. / Теаисы докладов н-п конференции "Природоохран-

ныв аспекты землепользования и с/х производства в свободных экономических зонах", Ленинград, 1991, с. 47.

10. L. I.Khrustaleva, GL N. Andreeva, G. М. Golovnlna, A. I. Zlobln The problem of preservation of gertroplasm in the conditions of antropogenio pollution. / V. Abst. 4: Exchange and convertatlon of Plant Genetlo Resources between America and Europe. Entobotan 1 oa-92" Cordoba, 1992. p. 42.

11. Л. И. Хрусталева, & iL Головкина . К вопросу сохранения растительного генофонда: Питогенетические эффенкты ретардантов в генеративных клетках ярового ячменя. / Доклады РАСХН, 1994, N. 6, (в печати).

12. Л. И. Хрусталева, D. М. Головкина Влияние брассинолида на цитологячеасие и физиологические показатели у ячменя (Hordeum vultrare L) в условиях солевого стресса. / С/х биология 1995, К. 1 (в печати).