Диссертации » Физико-химическая биология » Физиология и биохимия растений

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OSMYB4
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OSMYB4"

На правах рукописи Ю4В577 "

АММАН МОХАМЕД ЭЛЬ САЕД ГОМАА

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА (Brassica пар us L.) СО ВСТРОЕННЫМ ГЕНОМ OSMYB4

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 (

1 ИЮН 2011

Москва-2011

4848577

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и на кафедре ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российского университета дружбы народов, Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ралдугина Галина Николаевна

Научный консультант: доктор биологических наук

профессор, чл.-корр. РАН Кузнецов Владимир Васильевич Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Хрянин Виктор Николаевич

Кандидат биологических наук, профессор Семенов Олег Григорьевич

Ведущая организация:

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 21 июня 2011 г. в _15_ часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276,г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (499)977 80 18, е-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан « 20 » мая 2011 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

I

С

Азаркович М.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование современных методов клеточной, молекулярной биологии и биотехнологии позволило достичь крупных успехов в повышении устойчивости растений к гербицидам и биопатогенам, но не к повреждающим абиотическим факторам. Это делает актуальным разработку теоретических основ создания безопасных для человека и окружающей среды стресс-толерантных сортов растений. Одной из таких культур является рапс -важнейшая масличная с/х культура, которая наряду с подсолнечником, соей и хлопчатником служит источником пищевого и технического масла, содержащего самое низкое количество вредных для здоровья насыщенных жирных кислот.

На протяжении онтогенеза растения подвергаются действию различных неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как низкие положительные температуры, засуха, засоление, тяжелые металлы и многие другие, негативно влияющих на рост, развитие и продуктивность с/х культур. Растения отвечают на абиотические воздействия экспрессией стресс-специфических генов, что может сопровождаться повышением их устойчивости [Thomashow, 1999; Viswanathan, 2002; Трунова, 2007].

Ключевая роль в регуляции экспрессии генов принадлежит трансфакторным белкам [Latchman, 2007; Du and et al., 2009], которые объединены в семейства. Одним из них является семейство myb генов, все члены которого имеют консервативный ДНК-связывающий домен, характерный для животных, растений и дрожжей. К семейству myb генов трансфакторных белков относится ген Ostnyb4 (Y11414) риса [Pandolfi et al., 1997]. Гетерологическая суперэкспрессия этого гена в растениях арабидопсиса и яблони приводила к повышению холодо- и засухоустойчивости, а также устойчивости к биопатогенам [Vannini et al, 2004, 2006; Mattana et al., 2005]. По данным авторов, в основе повышения стресс-устойчивости этих растений лежит интенсивная аккумуляция совместимых осмолитов.

Для повышения устойчивости в настоящее время растения, как правило, трансформируют генами функциональных белков (ферментов синтеза и деградации защитных макромолекул и низкомолекулярных органических соединений,

транспортеров, шаперонов и т.п.). Значительно более эффективным является использование для этой цели генов транс-факторов, в частности, гена Osmyb4 риса. В этом случае один трансген контролирует «работу» целой кассеты стресс-регулируемых генов, что и приводит к повышению устойчивости растений к стрессорам различной природы, в том числе и к низкой температуре.

Как известно, холодовой стресс негативно влияет на растения, ингибируя скорость протекания метаболических реакций, а также вызывая осмотический и окислительный стресс. В процессе адаптации растений к холоду наблюдается накопление стресс-протекторных соединений [Dionne et al., 2001; Трунова, 2007; Groppa, Benavides, 2008; Синькевич и др., 2009], таких как аминокислоты, четвертичные ионы, растворимые сахара, сахароспирты и другие метаболиты [Hare etal., 1998; Dionne et ah, 2001; Patton et ah, 2007].

Эти результаты делают крайне актуальным изучение влияния гетерологической суперэкспрессии трансгена Osmyb4 на функционирование защитных систем и холодоустойчивость растений рапса. Тем более экспрессия гена Osmyb4 риса в растениях не всегда приводит к повышению их холодоустойчивости [Vannini al., 2007], что говорит о видоспецифичности данного признака.

В этой связи было важно выяснить, сопровождается ли активная экспрессия гена Osmyb4 риса в растениях рапса формированием защитных механизмов и повышением их устойчивости к холоду. Исследование данной проблемы представляет как большой теоретический, так и значительный практический интерес и позволяет не только лучше понять механизмы адаптации растений к низким положительным температурам, но и содействовать разработке современных технологий повышения стресс-толерантности растений.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в том, чтобы выяснить, сопровождается ли суперэкспрессия гена Osmyb4 транс-фактора риса в растениях рапса повышением устойчивости к низкотемпературному стрессу и, в случае позитивного ответа, исследовать возможные механизмы.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

(1) Исследовать, наследуется ли в растениях рапса трансген Osmyb4 риса, и

экспрессируется ли он в процессе холодовой адаптации.

(2) Оценить уровень холодоустойчивости трансгенных растений рапса, экспрессирующих ген Osmyb4 риса.

(3) Исследовать динамику изменений совместимых осмолитов (растворимых Сахаров и пролина) в трансгенных растениях рапса в процессе низкотемпературного стресса.

(4) Изучить аккумуляцию общих фенолов и флавоноидов, а также антоцианов, обладающих антиоксидантными свойствами, в трансгенных растениях рапса в условиях низкотемпературного стресса.

Научная новизна работы. Показано, что в процессе генеративного размножения трансгенных растений рапса ген трансфакторного белка Osmyb4 наследуется и активно экспрессируется в процессе адаптации к низкотемпературному стрессу. Установлено, что экспрессия трансгена Osmyb4 в растениях рапса сопровождается повышением устойчивости к низким положительным и отрицательным температурам. В основе повышения устойчивости растений к гипотермии лежит снижение интенсивности окислительного стресса в результате аккумуляции низкомолекулярных органических антиоксидантов и увеличения активности антиоксидантных ферментов, с одной стороны, и накопления совместимых осмолитов, с другой. Впервые установлено, что интенсивная экспрессия гена Osmyb4 трансфактора риеа в растениях рапса в ответ на гипотермию сопровождается активацией «работы» генов различных метаболических путей, реализация которых на уровне физиологических функций обеспечивает формирование важных защитных механизмов и повышение устойчивости к неблагоприятным температурам.

Практическая ценность работы. Полученные трансгенные растения рапса с интенсивной экспрессией гена транс-фактора Osmyb4 риса являются прекрасной модельной системой для изучения стресс-толерантности растений к различным повреждающим абиотическим факторам. Кроме того, эти растения могут быть полезны в селекционной практике в качестве исходных линий для создания новых сортов растений с повышенной устойчивостью к гипотермии. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы экспериментальные данные и сделанные па их основе обобщения могут быть использованы в университетах и ВУЗах страны в

курсах лекций по технологии создания генетически модифицированных стресс-толерантных растений.

Апробация работы. Результаты работы были представлены: на I Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых и аспирантов аграрных вузов РФ; на Международной научной конференции "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера" (Апатиты, Россия, 2009), на 10-й молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2010), на III Всероссийском симпозиуме "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" (Москва, 2010), на Всероссийском симпозиуме "Растение и стресс" (Москва, 2010), на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), на Научной молодежной конференции ИФР РАН (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них одна статья вышла из печати, вторая принята в печать в журналы, включенные в перечень ВАК РФ.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и списка цитированной литературы. Объем работы составляет страниц. В диссертации содержится рисунков, 2 таблицы.

Список цитированной литературы содержит источников, в том числе М) на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом исследования были трансгенные и ^трансформированные растения Brassica napus var. napus ярового рапса сорта Вестар канадской селекции. Трансформированные растения рапса с геном Osmyb4 были созданы ранее в ИФР РАН. Полученные через культуру тканей растения размножали черенкованием in vitro на модифицированной среде Мурасиге Скуга и после укоренения помещали в условия гидропонной культуры на среду Хогланда-Снайдерс. В возрасте 5-6 листьев растения делили на группы, одни из которых служили контролем и постоянно находились при температуре 24°С, фотопериоде 12/12, освещенности 2,5 клк, тогда как другие растения перемещали в холодную камеру фитотрона с температурой 4°С, тем же фотопериодом и освещенностью 1,2 клк. Третью группу растений помещали в климатическую камеру, где температура

изменялась согласно программе от +4°С до -6°С; освещенность составляла 2,0 клк, фотопериод - 12/12 ч.

Методы исследования. Биомассу и содержание воды в растительном материале оценивали, используя гравиметрический метод. Сухую массу определяли после фиксации при 90°С и высушивания (при 70°С) до постоянного веса. Содержание воды (%) рассчитывали, исходя из разности свежей и сухой биомасс [Пустовой и др., 1995].

Растворимые сахара определяли, экстрагируя сахара из растительной ткани 80% этанолом. Количественное определение фруктозы и сахарозы проводили с резорцином по Рое [Туркина и др., 1971]. Глюкозу определяли глюкозооксидазным методом, используя готовый набор реактивов (Sigma, № 510, USA).

Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Heath and Packer [1968], активность СОД - по методу Beauchamp and Fridovich [1971]. Определение активности пероксидазы проводили по методу, предложенному Ridge, Osborne [1971], свободного пролина - по методу Bales et а!. [1973]. Определение растворимых фенольных соединений проводили по методу Фолина-Деписа [Загоскина и др., 2003], содержание флавоноидов - по методу Gage [Gage, Wendei, 1950], содержание антоцианов - по методу Mabry [Mabry et al., 1970], содержание белка - по методу Esen [1978]. Тотальную ДНК выделяли по методу Fulton [Fulton et al., 1995], обрабатывали РНКазой (Serva, Германия) и оценивали качество ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Тотальную РНК выделяли фенольным методом по Westhoff et al. [1981]. Очистку от примесей ДНК, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием реактивов фирм «Fermentas» (Литва) и «СибЭнзим» (Россия). Подбор праймеров осуществляли с помощью программ Oligo 6.71. Для ПЦР использовали праймеры, синтезированные фирмой «Литех» (Россия): Myb-1(+) 5 'CGGGAGGACGGACAACGAG3'; Myb-2(-)

5'GGATGGCGGCGCGACGAAC3'; NPT-1(+) 5'GTGGAGAGGCTATTCGGCTA3'; NPT-2(-) 5 'CCACCATGATATTCGGCAAG3'; R18-1 (+) 5' G AGTG ATGTG CC AG ACCTAGG AATT3'; R18-2 (-) 5'ATGCTGATCCGCGATTACTAG C3'.

Все опыты были поставлены в трехкратной биологической повторности. Аналитическая повторность для каждой из них равна 3. Результаты обработаны с использованием пакета программ Windows Exel. Бары показывают относительную ошибку среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Наследование траисгена Osmyb4 в процессе генеративного развития растений рапса н регуляция его экспрессии в условиях гипотермии

Изучение стрессорного ответа растений рапса с геном Osmyb4 риса на

действие низкой положительной температуры проводили на трансгенных растениях-потомках, поскольку в растениях первого поколения наследуемый ген в меньшей мере подвержен сайленсингу. По этой причине необходимо было получить растения рапса первого поколения и доказать их трансгенность. Ранее в ИФР РАН были получены трансгенные растения рапса нулевого поколения с геном Osmyb4 риса под контролем COR15 промотора [Родионов и др., 2007], трансформируя плазмидой COR15Myb4, любезно предоставленной итальянскими коллегами [Vannini et al., 2004].

Трансгенные растения рапса нулевого поколения с геном Osmyb4 риса размножали черенкованием. Черенки укореняли и высаживали в почву. В этих условиях они нормально росли и развивались и морфологически не отличались от исходных ^трансформированных растений. Для дальнейшей работы нами было выбрано растение с наибольшей семенной продуктивностью. Семена, собранные с этого растения, проращивали в условиях in vitro до состояния проростков. Из семядолей полученных проростков выделяли ДНК, и с помощью ПЦР проводили скрининг на наличие в проростках трансгенов Osmyb4 и npt\I.

Результаты скрининга показали (табл. 1), что целевой ген Osmyb4 присутствовал в геноме 50 тестированных проростков (52,6%), селективный ген устойчивости к Км nptll - в геноме 19 проростков (20.3%), тогда как оба эти трансгена одновременно обнаруживались в 26 проростках (27.3%). Эти данные свидетельствуют о том, что трансген Osmyb4 наследуется в процессе генеративного развития рапса.

В дальнейшем исследовали экспрессию на уровне транскриптов гена Osmyb4 в трансгенных растениях рапса, одновременно содержавших гены Osmyb4 и nptll.

Таблица 1. Наследование трансгенов Osmyb4 и nptll

Число Число Число Число Число Число растений,

высажен исследо- растепнП с растений с растений с экспресснровавших

пых ванных геном геном nptll генами ген Osmyb4

семян растений Osmyb4 Osmyb4 и nptll

150 95 50 19 26 19

100% 52,6% 20,3% 27,3%

В связи с тем, что целевой ген Osmyb4 риса стоит под COR15 промотором, то перед выделением РНК все растения в течение суток подвергали действию холода (24 час, 4°С). Уровень индивидуальных транскриптов гена Osmyb4 оценивали с помощью ОТ-ПЦР. С этой целью из листьев трансгенных растений выделяли тотальную РНК и использовали ее для синтеза кДНК. Полученные кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами к гену Osmyb4. В качестве контрольного использовали фрагмент гена R18 (рис.1).

(а)

3 К+ К- 1

It к *2

pi., 1, 1 SHI . Г-

(б)

500 п.н.

1 2 :::: .....■ :: 3 к-

484 п.н.

500 п.н.

Рис.1. Экспрессия генов OsMyb4 и R18 у трансгенных растений рапса при низкой положительной температуре.

Уровень индивидуальных транскриптов генов Osmyb4 (а) и R18 (б) оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Для этого из листьев трансгенных растений, подвергнутых холодовой обработке (24 час, 4°С), выделяли тотальную РНК, на ней синтезировали кДНК и амплифицировали их с помощью ПЦР со специфическими праймерами к генам ОшуЬ4 и R18. Фрагмент гена R18 использовали в качестве контрольного для нормализации результатов. Обозначения: "М" - маркер молекулярной массы фрагментов ДНК; "К+" -положительный контроль (использовали плазмиду CORMyb4 для проведения ПЦР); "К-" - отрицательный контроль (кДНК синтезировали на РНК из нетрансгенных растений); 1 (Вп-1), 2 (Вп-2), 3 (Вп-3) - кДНК синтезировали на РНК из различных линий растений-трансформантов.

Проведенный анализ показал, что из 26 полученных трансгенных растений, содержавших оба встриваемых гена, экспрессия гена OsmybA на уровне образования транскриптов наблюдалась у 3 растений, тогда как у остальных 19 растений ген Osmyb4 не экспрессировался, несмотря на его присутствие в геноме (Табл.1). Для дальнейших исследований нами были выбраны 3 линии растений с разным уровнем экспрессии Osmyb4 гена. При этом одно из трансгенных растений обнаруживало слабую (Вп-1), другое среднюю (Вп-2) и, наконец, третье - сильную интенсивность экспрессии гена OsmybA (Вп-3) (рис. 1а).

Ранее было показано, что не все трансгенные растения с интенсивной

экспрессией гена OsmybA обнаруживали повышение холодоустойчивости [Vannini et ah, 2004, 2007]. Это делало целесообразным исследование влияния низкотемпературного стресса на трансгенные растения рапса с геном OsmyM.

2. Трансгенные растения рапса с геном Osmyb4 обнаруживают большую холодоустойчивость по сравнению с исходной формой.

О более высокой холодоустойчивости трансгенных растений рапса свидетельствовала (1) их способность к более активной аккумуляции биомассы при температуре 4°С, (2) поддержание водного статуса и (3) меньшая интенсивность окислительного стресса при гипотермии.

Полученные результаты показали (рис. 2), что трансгенные растения рапса обнаруживали меньшую (на 15%) степень ингибирования накопления сырой биомассы при гипотермии по сравнению с ^трансформированными формами, что свидетельствует в пользу их более высокой холодоустойчивости

Известно, что при охлаждении растения испытывают водный дефицит из-за снижения их водопоглотительной способности. Нами было исследовано содержание воды в листьях растений при оптимальных условиях (+24°С) и при +4°С. Полученные результаты показали (рис. 3), что оводненность листьев растений, находившихся 48 час при +4°С, в большей мере снижалась у нетрансформированных растений (на 10%), чем у трансгенных (на 6%), тогда как на пятые сут гипотермии эти значения составляли 14% и 10% соответственно. Перенос растений на +24°С приводил к восстановлению оводненности листьев.

Рис.2. Влияние низкой положительной температуры на накопление сырой биомассы в трансгенных и нетрансформированных растениях рапса I - растения при 24°С; II -растения при 4°С; 1 - нетрансформированные растения; 2 - трансгенные растения линии Вп-1; 3-трансгенные растения линии Вп-2; 4 - трансгенные растения линии Вп-3.

Рис. 3. Влияние низкой положительной температуры на содержание воды в листьях растений рапса

А - растения выращивали при 24°С; Б - растения выдерживали 5 сут при 4°С; 1 - нетрансгенные растения; 2 - трансгенные растения линии Вп-1; 3- трансгенные растения линии Вп-2; 4 - трансгенные растения линии Вп-3

Уровень малонового диальдегида (МДА) говорит об интенсивности

протекания процесса перекисного окисления липидов мембран, в свою очередь

свидетельствующего о степени повреждающего действия стрессора. В трансгенпых

и исходных линиях рапса при температуре 4°С накопление МДА было различным.

При адаптации к холоду уровень МДА в листьях ^трансформированных растений

возрастал в 1.7 и 2.3 раза через 2 и 5 суток гипотермии соответственно, тогда как у

трансгенных растений его содержание практически не изменялось (рис. 4). Спустя

4 суток после переноса растений, подвергнутых воздействию 4°С, в оптимальные

для роста условия (24°С), содержание МДА восстанавливалось практически до

исходных значений у всех исследованных генотипов, что говорит об отсутствие

серьезных повреждений метаболизма растений в условиях гипотермии.

Рис. 4. Накопление МДА в трансгенных и нетрансформи-рованных растениях рапса

I - растения при +24°С;

II - растения при +4°С I - нетрансформированные растения; 2-трансгенные растения линии Вп-1; 3-трансгенные растения линии Вп-2; 4-трансгенные растения линии Вп-3

3. Аккумуляция совместимых осмолнтов трансгенпыми растениями рапса при гкпотермпн

Одной из универсальных защитных реакций растений в ответ на действие

холода, засухи, засоления и других абиотических факторов, нарушающих водный статус, является аккумуляция совместимых осмолитов, обладающих осморегуляторным и стресс-протекторным эффектом.

ЗА. Аккумуляция растворимых Сахаров растениями рапса Сравниваемые линии трансгенных и ^трансформированных растений рапса существенно различались по содержанию растворимых Сахаров в условиях гипотермии, несмотря на то, что при оптимальной температуре роста они имели близкие уровни сахарозы, глюкозы и фруктозы, которые незначительно изменялись при +24°С в течение всего эксперимента (рис. 5 а,б,в,г).

^трансформированные растения на вторые сутки экспозиции на холоде обнаруживали значительные изменения содержания сахарозы, фруктозы и глюкозы. На 5 сутки адаптации растений к +4°С количество сахарозы уменьшалось, тогда, как содержание моносахаров несколько возрастало (рис. 5а). На этапе восстановления содержание сахарозы падало в 3 раза, фруктозы - в 5 раз, глюкозы - более чем в 15 раз.

Трансгенные растения, в отличие от растений дикого типа, не обнаруживали на холоде выраженных изменений в содержании растворимых Сахаров (рис. 56, 5в, 5г). Так, в трансгенных линиях рапса содержание сахарозы изменялось от 2-х до б, фруктозы - от 0.8 до 3.2 и глюкозы - от 0.2 до 1.0 мкмолей/г сырой массы. Существенно отметить, что все сравниваемые трансгенные линии Вп-1, Вп-2 и Вп-3, различающиеся интенсивностью экспрессии Osmyb4 гена, несколько отличались по реакции на понижение температуры. У растений линии Вп-1 содержание сахарозы в течение всей холодовой обработки возрастало в 1,4 раза (рис. 56), у растений линии Вп-2 оно увеличивалось почти в 1,9 раза (рис. 5в), а у растений Вп-

3 возрастало в 2,2 раза (рис. 5г). При возвращении адаптированных к низкой температуре растений на 24°С содержание сахарозы снижалось (рис. 5 б,в,г). В ответ на действие низкой положительной температуры растения линии Вп-1 реагировали почти 3-х кратным увеличением содержания фруктозы, тогда как уровень этого сахара у растений линии Вп-2 и Вп-3 уменьшался приблизительно в

4 раза. На этапе восстановления у трансгенных растений Вп-1 содержание фруктозы уменьшалось почти до первоначальных значений, у растений линии Вп-2

падало в 2 раза (рис. 56), а у растений линии Вп-3 содержание фруктозы почти не изменялось (рис.5г).

(а)

(6)

Экспозиция (сутки)

Рис. 5. Накопление растворимых Сахаров в трансгенных и нетрансформированных растениях рапса

1 - сахароза; 2 - фруктоза; 3- глюкоза

а) сахара в нетрансформированных растениях; б) сахара в трансгенных растениях линии Вп-1; в) сахара в трансгенных растениях линии Вп-2; г) сахара в трансгенных растениях линии Вп-3;

1 - растения при 24°С; II - растения при 4°С;

3.2. Аккумуляция свободного пролина

Накопление пролина в нетрансформированных растениях несколько возрастало в процессе адаптации к холоду, достигая максимума ко 2 суткам (около 1 мкмоля/на г сырой массы), и затем оставалось на одном и том же уровне (рис. 6). В отличие от растворимых Сахаров, содержание пролина во всех сравниваемых линиях трансгенных растений возрастало весьма значительно, увеличиваясь на 2 сутки примерно в 8 раз, а на 5 сутки - почти в 20 раз. При этом просматривалась

Экспозиция (сутки)

некоторая тенденция к более активному накоплению пролина при холоде трансгенными растениями линии Вп-3 с более интенсивной экспрессией гена Osmyb4 (рис. 6). На этапе восстановления наблюдалось резкое падение содержания пролина у растений всех трансгенных линий.

Рис. 6. Влияние низкой положительной температуры на накопление пролина в трансгенных растениях рапса

I - растения при 24°С; II -растения при 4°С; 1 - нетрансформированные растения; 2 - трансгенные-растения линии Вп-1; 3- трансгенные растения линии Вп-2, 4 - трансгенные растения линии Вп-3

4. Аккумуляция фенолов и антоцианов, а также изменение активности антиоксидантных ферментов в растениях рапса в процессе холодовой адаптации

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что трансгенные растения рапса с геном OsmybA характеризуются меньшей интенсивностью окислительного стресса при +4°С по сравнению с [«трансформированными растениями (рис. 4). Это позволило предположить, что одной из причин сохранения внутриклеточного окислительного статуса трансгенных растений в условиях гипотермии является аккумуляция антиоксидантных соединений, к которым могут быть отнесены, прежде всего, растворимые фенолы и антоцианы.

4.1. Накопление фенолов

Результаты, представленные на рис. 7, показывают, что трансгенные растения рапса линии Вп-3, характеризующиеся наиболее интенсивной экспрессией Osmyb4 гена, обнаруживают значительную аккумуляцию общих фенолов и флавоноидов в процессе холодовой адаптации. Существенно отметить, что нетрансформированные и трансгенные растения рапса в исходном состоянии не различались по уровню флавоноидов и общих фенолов (рис. 7 а, б). Более того, их содержание практически не изменялось в процессе адаптации нетрансгенных

растений к холоду (4°С). Растения линии Вп-1 реагировали на действие температуры 4°С увеличением содержания общих фенолов и флавоноидов лишь в 1.3-1.4 и в 1.8 раза через 2 и 5 суток соответственно, тогда как в листьях растений двух других линий Вп-2 и Вп-3 и на 2 и 5 сутки адаптации к холоду содержание фенолов возрастало значительно сильнее (в 2 и 3 раза у Вп-2 и в 2.6 и 3.7 раза у Вп-3 соответственно). Еще более интенсивно накаливались флавоноиды, содержание которых на вторые сутки действия холода составляло 18.6 мкг/г сырой массы, тогда как на пятые сутки - 21.0 мкг/г сырой массы; при этом содержание флавоноидов в тех же самых растениях, но не подвергнутых воздействию холода, составляло лишь 5.2 мкг/г сырой массы (рис. 76). На этапе восстановления содержание фенолов и флавоноидов в нетрансгенных растениях и в растениях линии Вп-1 не отличалось от исходного уровня, тогда как растения линий Вп-2 и Вп-3 реагировали на возвращение их на температуру 24°С интенсивным снижением уровня фенольных соединений, хотя и в этом случае содержание флавоноидов и общих фенолов в 1.5 раза превосходило исходный уровень.

Рис. 7. Накопление общих фенолов и флавоноидов в трансгенных и нетрансформированных растениях рапса

1 - растения при +24°С; И - растения при +4°С; 1 - ^трансформированные растения;

2 - трансгенные растения линии Вп-1; 3- трансгенные растения линии Вп-2, 4 - трансгенные растения линии Вп-3

4.2. Аккумуляция антоцианов

Характер изменения содержания антоцианов в сравниваемых линиях растений в процессе их адаптации к низкой положительной температуре (рис. 8) практически не отличался от изменения содержания исследованных выше фенольных соединений (рис. 7). При этом содержание антоцианов в растениях линии Вп-1 увеличивалось в 1.9-2.1 раза в течение 5 суток действия холода.

Наиболее интенсивное накопление антоцианов наблюдалось в процессе адаптации трансгенных растений линий Вп-2 и Вп-3 к температуре 4°С. В этом случае через 2 и 5 суток содержание антоцианов возрастало в 3.5 и 5.3 раза соответственно (рис. В). Возвращение растений, подвергнутых действию температуры +4°С, на 24°С сопровождалось резким снижением содержания антоцианов в растениях линии Вп-1 и частичным падением их уровня в растениях линий Вп-2 и Вп-3.

Представленные выше данные однозначно свидетельствуют о том, что способность трансгенных растений рапса аккумулировать растворимые фенолы и антоцианы в процессе адаптации к холоду зависит от интенсивности экспрессии трансгена Osmyb4 риса.

Рис. 8. Накопление антоцианов в трансгенных и нетрансформированных растениях рапса I - растения при 24°С; II -растения при 4°С; 1 - нетрансформированные растения; 2 - трансгенные растения линии Вп-1;

3 - трансгенные растения линии Вп-2;

4 - трансгенные растения линии Вп-3

4.4. Изменение активностей супероксиддисмутазы (СОД) и гваяколыюй пероксидазы при холодовом стрессе

Уровень активности гваяколовой пероксидазы при 4°С у трансгенных растений рапса практически не изменялся в течение первых 2-х суток, тогда как у нетрансформированных растений повышался почти в 2 раза; через 5 суток гипотермии активность пероксидазы у всех исследуемых генотипов резко падала. На 4-е сутки переноса растений на +24°С активность пероксидазы восстанавливалась в большей степени у трансгенных растений, чем у нетрансформированных (рис. 9а).

Активность СОД при +24°С у нетрансформированных растений была выше, чем у трансгенных (рис. 96). Через 2 суток гипотермии активность СОД падала у нетрансформированных линий в 1,8 раза, а у трансгенных растений - в 2,5 раза. На 5 сутки действия температуры +4°С активность СОД возрастала у всех

исследованных генотипов; при этом у трансгенных растений значения активности были ближе к исходным.

Совокупность представленных данных свидетельствует о том, что наибольший клад в поддержание окислительного статуса трансгенных растений при гипотермии вносили фенольные соединения и антоцианы, но никак не СОД или пероксидаза.

Рис. 9. Активность гваяколовой пероксидазы (а) и супероксиддисмутазы (б) в трансгенных и нетрансформированных растениях рапса. I - растения выращивали при +24°С; II - растения выращивали при +4°С; 1 - нетрансформированные растения; 2 -трансгенные растения линии Вп-1; 3- трансгенные растения линии Вп-2; 4 - трансгенные растения линии Вп-3

5. Стрессорнып ответ трансгенных растений рапса на действие отрицательной температуры

Для изучения ответа растений на действие отрицательных температур 3-х недельные растения рапса всех исследуемых линий (24°С, фотопериод 12/12), делили на 3 равные группы: растения первой группы постоянно находились при 24°С, растения второй группы сначала адаптировали к температуре 4°С (5 сут), затем снижали температуру и выдерживали их при -6°С (2 сут). После этого растения переносили на 4°С (6 час) и, наконец, - на 24°С; растения третьей группы без предварительной адаптации помещали при -6°С, а затем, так же как и растения 2-ой группы, последовательно переносили на +4°С (б час) и на 24°С. Биологические пробы брали после промораживания, спустя 6 час экспозиции растений при 4°С.

5. /. Накопление МДЛ

Как показывают полученные результаты (рис. 10), трансгенные и нетрансформированные растения, подвергнутые последовательному действию

температуры -6°С (2 сут) и 4°С (6 час), существенно различались по содержанию

МДА. Так, у нетрансформированных неадаптированных растений содержание

МДА возрастало в 2.5, тогда как у адаптированных растений - лишь в 1.6 раза. При

этом у трансгенных растений всех трех линий накопление МДА было намного

менее интенсивным, чем у нетрасформированных. Причем, содержание МДА было

примерно одинаковым для адаптированных при +4°С трансгенных растений и

растений не адаптированных. Существенно, что наименьшее количество МДА

наблюдалось у растений линии Вп-3 с наибольшей интенсивностью экспрессии

гена Osmyb4. Полученные данные говорят в пользу большей устойчивости к

отрицательным температурам трансгенных растений рапса с гетерологической

экспрессией гена транс-фактора OSMYB4 риса.

Рис. 10. Накопление МДА в листьях трансгенных и петранс

формированных растений рапса после воздействия отрицатель- ной температуры

I - растения при 24°С;

II - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С без предварительной холодовой адаптации при 4°С; III - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С после предварительной холодовой адаптации; I - ^трансформированные растения; 2

- трансгенные растения линии Вп-1; 3- трансгенные растения линии Вп-2; 4

- трансгенные растения линии Вп-3

5.2. Аккумуляция растворимых Сахаров и пролина трансгенными растениями рапса при воздействии отрицательной температуры

Сравниваемые линии трансгенных и нетрансформированных растений рапса различались по содержанию растворимых Сахаров после воздействия температуры -6°С (2 сут), несмотря на то, что в оптимальных условиях они имели примерно одинаковый уровень (рис. 11 а,б,в,г). Причем, у всех адаптированных к +4°С линий растений, содержание растворимых Сахаров было выше, чем у неадаптированных.

Интересно, что количество сахарозы почти не изменялось у нетрансформированных растений и у растений линии Вп-1 со слабой интенсивностью экспрессии гена Osmyb4, а содержание фруктозы и глюкозы у подвергнутых холодовой адаптации растений возрастало более чем в 2 раза. При

Экспозиция (сутки)

этом следует отметить, что абсолютные значения содержания Сахаров в трансгенных растениях линии Вп-1 были в 1,5 раза ниже, чем у ^трансформированных растений (рис. 11а и рис. 116).

Накопление Сахаров в растениях 2-х других групп после воздействия отрицательной температуры несколько отличалось. У растений линии Вп-2, прошедших холодовую адаптацию, было почти в 2 раза больше сахарозы, чем у растений линии Вп-3 (рис. 11 в и рис. 11г). В свою очередь у растений линии Вп-3, адаптированных к +4°С, содержание фруктозы было в 1,4 раза выше, чем у неадаптированных растений. Содержание глюкозы в растениях обеих линий резко падало после воздействия отрицательной температуры.

(а)

2 л о '5

X С «

о. О 2 Ю 2 ^

ОТ: ГШ

Экспозиция (сутки)

(6)

Экспозиция (сутки)

Экспозиция (сутки)

Экспозиция (сутки)

Рнс. 11. Накопление растворимых Сахаров в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса. Обозначения: 1 - сахароза; 2- фруктоза; 3- глюкоза:

I - растения при 24°С; II - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С без предварительной холодовой адаптации; III - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С после предварительной холодовой адаптации;

а) сахара в нетрансформированных растениях; б) сахара в трансгенных растениях линии Вп-1; в) сахара в трансгенных растениях линии Вп-2; г) сахара в трансгенных растениях линии Вп-3; I - растения при 24°С; II - растения при 4°С

Накопление пролина в листьях растений после воздействия отрицательной температуры происходило точно так же, как и в опытах по адаптации растений к

4°С (рис. 12). У нетрансформированных растений содержание пролина увеличивалось примерно в 2 раза, тогда как у трансгенных растений всех трех линий его содержание возрастало значительно интенсивнее. Это касалось как растений, прошедших предварительную холодовую адаптацию, так и неадаптированных. Абсолютные значения содержания пролина зависели от интенсивности экспрессии гена Osmyb4\ чем интенсивнее экспрессировался трансген, тем больше накапливалось пролина. При этом увеличение содержания пролина было значительнее у растений, прошедших холодовую адаптацию.

Рис. 12. Накопление свободного пролина в листьях растений рапса. I - растения при 24°С; II - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С без предварительной холодовой адаптации; III - растения, подвергнутые замораживанию при —6°С после холодовой адаптации;

1 - нетрансформированные растения;

2 - трансгенные растения линии Вп-1;

3 -трансгенные расте-ния линии Вп-2;

4 - трансгенные растения линии Вп-3

5.3. Аккумуляция общих фенолов и антоцианов

Данные, представленные на рис. 13а и 136, подтверждают результаты, полученные нами ранее по накоплению общих фенолов и антоцианов в процессе адаптации растений рапса к 4°С (рис. 7 и рис. 8). Конститутивные уровни как общих фенолов (рис. 13а), так и антоцианов (рис. 136) у всех линий растений были одинаковы при температуре 24°С. Понижение температуры вызывало повышение уровня накопления этих соединений; абсолютное значение которых зависело от специфики линии и характера температурной обработки. В нетрансформированных растениях накопление как общих фенолов (рис. 13а), так и антоцианов было незначительным. Похожие результаты были и при изучении накопления антоцианов (рис. 146).

В трансгенных растениях рапса уровень накопления фенолов и антоцианов условиях холодовой обработки зависел от интенсивности экспрессии гена OsmybA. Так, если в неадаптированных и адаптированных растениях линии Вп-1 содержание общих фенолов увеличивалось в 1,5 и в 2,1 раза, а антоцианов - в 2,5 и

2,7 раза, соответственно, то в растениях линий с большей интенсивностью экспрессии трансгена накопление фенолов и антоцианов было значительно выше. Растения линии Вп-3, неадаптированные к 4°С, накапливали в 3 раза больше общих фенолов и в 5.5 раза больше антоцианов по сравнению нетрансформироваипыми растениями, тогда как аккумуляция этих соединений в растениях, прошедших холодовую адаптацию, возрастала в 4 (рис. 13а) и в 7,4 раза (рис. 136) соответственно.

Рис. 13. Накопление общих фенолов (а) и антоцианов (б) в листьях трансгенных и нетрансформированных растений рапса

I - растения при 24°С; II - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С без предварительной холодовой адаптации при 4°С; 111 - растения, подвергнутые замораживанию при -6°С после предварительной холодовой адаптации. 1 - нетрансформированные растения; 2 - трансгенные растения линии Вп-1; 3 -трансгенные растения линии Вп-2; 4 - трансгенные растения линии Вп-3

Представленные выше данные однозначно свидетельствуют о том, что способность трансгенных растений рапса, подвергнутых действию отрицательной температуры, аккумулировать пролин, растворимые фенолы и антоцианы в процессе адаптации к холоду зависит от интенсивности экспрессии трансгена Osmyb4 риса. Однако этого нельзя сказать о динамике содержания растворимых Сахаров (рис. 11) и, тем более, об активности антиоксидантных ферментов (данные не приведены). Если принять во внимание тот факт, что трансгенные растения рапса с суперэкспрессией гена Osmyb4, предварительно адаптированные к 4°С, сохраняли, в отличие от нетрансгенных растений, свою жизнеспособность после жесткого низкотемпературного воздействия (-6°С, 2 сут), то вклад пролина,

растворимых фенолов и антоцианов в повышение устойчивости представляется достаточно убедительным.

Заключение

На основании полученных в работе экспериментальных результатов можно сделать заключение, что трансформация растений рапса геном Osmyb4 приводит к снижению способности полученных трансгенных линий аккумулировать растворимые сахара при гипотермии. Снижение способности этих растений накапливать сахара при низкой температуре компенсируется их способностью интенсивно накапливать пролин, который, подобно сахарам, обладает осморегуляторным и множественным стресс-протекторным действием (Кузнецов, Шевякова, 1999). Содержание пролина в процессе холодовой адаптации трансгенных растений возрастало в 20 -30 раз (рис. 6 и 12).

Вполне вероятно, что снижение способности траснгенных растений рапса, экспрессирующих Osmyb4 ген риса, аккумулировать растворимые сахара с антиоксидантными свойствами может сопровождаться стимуляцией биосинтеза вторичных метаболитов, обладающих, например, антиоксидантными свойствами (Michalak, 2006; Chalker-Scott, 1999). В пользу этого свидетельствует тот факт, что трансгенные растения рапса при температуре 4°С испытывали значительно меньший окислительный стресс, чем растения дикого типа (рис. 4 и рис. 10).

Проверка этого предположения показала, что в процессе адаптации к низкотемпературному стрессу растения рапса с гетерологической суперэкспрессией Osmyb4 гена обнаруживают способность к интенсивной аккумуляции общих фенолов и флавоноидов (рис. 7а, б; рис. 13а), а также антоцианов (рис. 8, 136), обладающих мощным антиоксидантным эффектом (Michalak, 2006; Chalker-Scott, 1999). Причем, растения линий Вп-2 и Вп-3, обладающие более интенсивной экспрессией гена Osmyb4, в отличие от линии Вп-1, обнаруживали повышенную способность к аккумуляции фенольных соединений и антоцианов в условиях гипотермии (рис. 7, 8 и 13), что достаточно прямо указывает на возможную связь между интенсивностью экспрессии гена Osmyb4 транс-фактора риса с проявлением его биологической активности. Все эти закономерности проявляются не только в процессе низкотемпературной холодовой адаптации растений, но и в стрессорном ответе нетрансформированных и трансгенных растений на действие отрицательной температуры.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что гетерологичеекая экспрессия Osmyb4 гена риса в растениях рапса сопровождается повышением их устойчивости к действию низких положительных и отрицательных температур. В основе этого явления лежит способность транскрипционного фактора OSMYB4 стимулировать аккумуляцию совместимых осмолитов, прежде всего, пролина, а также антиоксидантных соединений фенолыюй природы и антоцианов. Это подтверждает идею, согласно которой продукт Osmyb4 гена играет особую интегрирующую роль в стрессорном ответе растений па повреждающее воздействие, координируя экспрессию многих генов различных метаболических путей, следствием чего является формирование защитных механизмов и повышение стресс-толерантности.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в процессе генеративного размножения растений рапса с гетерологической суперэкспрессией гена Osmyb4 транс-фактора риса трансген наследуется и экспрессирустся.

2. Представлены экспериментальные доказательства того, что полученные трансгенные растения рапса обладают повышенной устойчивостью к низким положительным и отрицательным температурам, о чем свидетельствует: (а) более активное, по сравнению с растениями дикого типа, накопление биомассы при +4°С; (б) сохранение трансгенными растениями, в отличие от нетрасформировапных растений, жизнеспособности после 2-х суток экспозиции при -6°С; (в) меньший окислительный стресс, который испытывают трансгенные растения при +4°С по сравнению с формами дикого типа, и, наконец, (г) способность поддерживать водный статус при гипотермии.

3. Впервые продемонстрировано, что суперэкспрессия гена транс-факторного белка риса в растениях рапса в процессе холодовой адаптации сопровождается интенсивной аккумуляцией общих фенолов и флавоноидов; что, очевидно, лежит в основе снижения уровня МДА в условиях низкотемпературного стресса и повышения холодоустойчивости.

4. Показано, что при низкой положительной температуре трансгенные растения рапса накапливают пролина в 20-30 раз больше, чем ^трансформированные растения. При этом, в отличие от ранее исследованных трансгенных растений

арабидопсиса, яблони и томатов с геном Osmyb4, в условиях гипотермии содержание растворимых Сахаров в трансгенных растениях рапса было ниже по сравнению с растениями дикого типа.

5. Полученные результаты свидетельствуют о том, что интенсивная гетерологическая экспрессия гена Osmyb4 в растениях рапса сопровождается не только интенсивной аккумуляцией совместимых осмолитов, но и биосинтезом антиоксидаитиых соединений фенольной природы. Отсюда следует, что в условиях низкотемпературного стресса транскрипционный фактор OSMYB4 регулирует гены различных метаболических путей, интегрируя тем самым защитные системы организма, которые лежат в основе повышения холодоустойчивости растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. Гомаа, Н.В. Радионов, Г.Н. Ралдугина. Наследование генов npt\\ и OsmybA, встроенных в растения рапса (Brassica napus L.). // Тезисы докладов Международной научной конференции "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера" Апатиты, Мурманская обл. 2009. С.97.

2. Гомаа А., Радионов Н.В., Ралдугина Г.Н. Действие пониженных температур на трансгенные растения рапса (Brassica napus L.), содержащих ген трансфакторного белка Osmyb4 // Тезисы докладов X молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 7 апреля 2010 г., Москва. С.19.

3. Гомаа А., Бурмистрова Н.А., Радионов Н.В., Ралдугина Г.Н. Влияние низкой положительной температуры на трансгенные растения рапса (Brassica napus L.), содержащие ген трансфакторного белка Osmyb4. // Тезисы докладов III Всероссийского симпозиума "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" Москва. 2010. С.34.

4. Гомаа А., Бурмистрова Н.А., Радионов Н.В, Ралдугина Г.Н. Ответ трансгенных растений рапса (Brassica napus L.), содержащих встроенный ген риса Osmyb4, на действие пониженной положительной температуры // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Растение и стресс". Москва. 2010. С.419.

5. Gomaa A., Burmistrova N.A., Radionov N.V., Raldugina G.N. The response of transgenic brassica napus plants expressing Osmyb4 gene from rice (Oryza sativa) to low

temperature // VI Moscow international congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development" (Moscow, march 21 -25, 2011), Moscow, 2011, p. 236.

6. Бурмистрова H.A., Гомаа А., Ралдугина Г.Н. Содержание растворимых Сахаров и холодоустойчивость растений рапса со встроенным геном Osmyb<\ II Международная конференция «Структурные и функциональные отклонения от нормального роста и развития растений под воздействием факторов среды» (Петрозаводск 20-24 июня 2011 г.) Петрозаводск, 2011 (в печати).

7. Ралдугина Г.Н., Гомаа A.M., Бурмистрова Н.В., Радионов Н.В. Экспрессия гена Osmyb4, встроенного в растения рапса (Brassica napus L.), увеличивает устойчивость трансгенных растений к охлаждению и замораживанию, VII съезд Общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», (Нижний Новгород, Россия, 4-10 июля, 2011), Нижний Новгород, Россия, 2011 (в печати).

8. Бурмистрова Н.А., Гомаа A.M., Ралдугина Г.Н., Изменение содержания растворимых Сахаров и пролина при адаптации к холоду растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OsmybA, VII съезд Общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», (Нижний Новгород, 4-10 июля 2011), Нижний Новгород, Россия, 2011 (в печати).

9. Гомаа A.M. Бурмистрова Н.А., Радионов Н.В., Ралдугина Г.Н. Влияние низкой положительной температуры на трапсгенные растения рапса (Brassica napus L.) с геном трансфакторного белка OsMybA I/ Вестник РУДН. 2011. №2. С. 51-60

10. Гомаа A.M., Ралдугина Г.Н., Бурмистрова Н.А., Радионов Н.В., Кузнецов Вл.В. Стрессорный ответ трансгенных растений рапса с геном Osmyb4 трансфакторного белка риса на действие низкой положительной температуры // Физиология растений. 2011. Т. 58. № 6 (принято к печати).

Подписано в печать: 19.05.2011

Заказ № 5575 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Айман Мохамед Эль Саед Гомаа

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематика и происхождение, ботаническое описание и.особенности, биологии рапса.

Г.2.Общие представления о механизмах устойчивости растений к неблагоприятным факторам:.

1.3. Современные представления о повреиздающем действии холода и механизмах адаптации растений к низкотемпературному стрессу.

1.3.1. Повышение текучести клеточных мембран при холодовом стрессе.

1.3.2. Аккумуляция в растениях совместимых осмолитов при действии пониженных температур.

1.3.2.1. Аккумуляция углеводов.

1.3.2.2. Аккумуляция пролина в ответ на гипотермию.

1.3.3. Окислительный стресс и антиоксидантная система.

1.3.3.1. Ферменты антиоксидантного комплекса.

1.3.3.2. Неферментативные антиоксиданты.

1.3.3.3. Аккумуляция фенольных соединений и антоцианов под действием охлаждения.

1.3.3.4. Синтез фенилпропаноидов.

1.4. Регуляция экспрессии генов в процессе холодовой адаптации.

1.4.1. Стрессорные белки.

1.5. Факторы транскрипции.

1.5.1. Гены транс-факторов, регулируемые низкотемпературным стрессом.

1.5.2. Гены транс-факторов МУВ семейства.

1.5.3. Характеристика и классификация факторов транскрипции МУВ семейства.

1.5.4. Многофункциональность растительных факторов транскрипции МУВ.

1.5.5. Участие факторов транскрипции МУВ типа в стрессорных ответах.

1.5.6. МУВ трансфакторы вовлечены в регуляцию фенилпропаноидного биосинтетического пути.

1.5.7. Тканеспецифичная регуляция туЬ-телов.

1.6. Получение трансгенных холодустойчивых растений с использованием генов транскрипционных факторов.

ГЛАВА П. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

П.1. Реактивы, использованные в работе.

11.2. Растительный материал.

11.3. Среды для культивирования растений.

П.4. Выращивание растений рапса.

П.4.1. Выращивание растений рапса в условиях in vitro.

11.4.2. Выращивание растений рапса в водной культуре.

11.4.3. Выращивание растений из семян.

11.4.4. Условия роста при холодовой адаптации.

11.4.5. Условия роста в опытах по промораживанию растений.

11.5. Биометрические исследования растений.

II.5.1. Измерение биомассы и содержания воды.

11.6. Биохимическое исследование растений.

11.6.1. Определение содержания Сахаров.

11.6.2. Определение содержания МДА.

11.6.3. Определение активности СОД.

11.6.4. Определение активности пероксидазы.

11.6.5. Определение эндогенного содержания пролина.

11.6.6. Определение содержания растворимых общих фенолов.

11.6.7. Определение содержания флавоноидов.

11.6.8. Определение содержания антоцианов.

И.6.9. Определение содержания белка.

И.6.10. Определение холодоустойчивости растений по выходу электролитов.

11.7. Молекулярный анализ трансформированных растений-потомков.

11.7.1. Описание конструкции, использованной для трансформации растений рапса.

11.7.2. Трансформация растений.

И.7.3. Выделение тотальной ДНК.

11.7.4. Подбор праймеров для полимеразной цепной реакции.

11.7.5. Полимеразная цепная реакция.

11.7.6. Электрофорез в агарозном геле.

11.7.7. Выделение тотальной РНК.

11.7.8. Электрофорез РНК в агарозном геле.

11.7.9. Синтез кДНК.

11.8. Математическая обработка данных.

ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Ш.1. Наследование трансгена Osmyb4 в процессе генеративного развития растений рапса и регуляция его экспрессии при гипотермии.

Ш.2. Трансгенные растения рапса с геном Osmyb4 обнаруживают большую холодоустойчивость по сравнению с исходной формой.

1П.2.1. Накопление сырой биомассы и оводнённость растений.

Ш.2.2. Накопление МДА.

Ш.З. Аккумуляция совместимых осмолитов трансгенными растениями рапса при гипотермии.

Ш.З .1. Аккумуляция растворимых сахаров растениями рапса.

Ш.З .2. Аккумуляция свободного пролина.

Ш.4. Аккумуляция фенолов и антоцианов,аггакже изменение активности антиоксидантных ферментов в растениях рапса* в процессе холодовойадаптации.

1П.4.1. Накопление фенолов.

Ш.4.2. Аккумуляция антоцианов.

Ш.4.3. Изменение активностей супероксиддисмутазы (СОД) и гваякольной пероксидазы при холодовом стрессе.

Ш.5. Стрессорный ответ трансгенных растений рапса на действие отрицательной температуры.

Ш.5.1. Накопление биомассы в опыте по воздействию на растения отрицательной температуры.

Ш.5.2. Накопление МДА.

111.5.3. Аккумуляция растворимых Сахаров и пролина трансгенными растениями рапса при воздействии отрицательной температуры.

111.5.4. Аккумуляция общих фенолов и антоцианов.

111.5.5. Активность гваяколовой пероксидазы и супероксиддисмутазы.

Ш.5.6. Определение холодустойчивости по выходу электролитов из тканей растений рапса, подвергнутых воздействию отрицательной температуры.

Ш.5.7. Рост растений восстановленных после воздействия отрицательной температуры.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OSMYB4"

Актуальность проблемы. На протяжении онтогенеза растения подвергаются действию различных неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как низкие положительные температуры, засуха, засоление, тяжелые металлы и другие, негативно влияющие на рост, развитие и продуктивность важнейших сельскохозяйственных культур. Растения отвечают на абиотические воздействия экспрессией стресс-специфических генов, продукты которых вызывают физиологические и биохимические изменения (Thomashow, 1999; Viswanathan, 2002), повышая устойчивость растений к неблагоприятным воздействиям.

Низкотемпературный стресс действует на растения как непосредственно, ингибируя метаболические реакции, так и косвенно, через индуцируемые холодом осмотический, а также окислительный и другие стрессы. Однако если растения предварительно адаптированы под воздействием низких положительных температур, то они приобретают устойчивость за счёт образования соединений, понижающих водный потенциал клеток, защищающих ферменты от инактивации и поддерживающих структурную целостность белковых макромолекул {Groppa, Benavides, 2008; Gusta et al., 1996; Dionne et al., 2001). К стресс-протекторным молекулам принадлежат аминокислоты (пролин, аланин), четвертичные ионы (бетаин, глицин бетаин), сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза), сахароспирты (маннит, сорбит, трегалозы, и инозит) и другие углеводы {Dionne et al., 2001; Hare et al., 1998; Patton et al., 2007).

Экспрессию многих генов индуцируют трансфакторные белки, которые регулируют транскрипцию, специфически взаимодействуя с ДНК либо с другими белками, способными образовывать комплекс белок-ДНК (Latchman, 2007). Гены трансфакторных белков объединены в семейства по строению кодируемых ими белков. Одним из таких семейств является семейство MYB генов, общей особенностью белков которых является присутствие функционального ДНК-связывающего домена, консервативного среди животных, растений и дрожжей. К семейству MYB генов трансфакторных белков относится ген Osmyb4 (Y11414), выделенный из,генома растений риса (Pandolfi et al., 1997). Роль этого гена в холодовой адаптации и засухоустойчивости была выяснена по его-сверхэкспрессии в трансгенных растениях А. thaliana, показавших повышенную устойчивость к- холоду и засухе за счёт различных биохимических изменений, наблюдавшихся во время адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды {Vannini et al., 2004; Mattana et al., 2005). Кроме того, сравнение транскриптомов растений дикого типа и растений со сверхэкспрессией гена Osmyb4 показало, что экспрессия этого гена влияет на экспрессию других генов, которые могут регулироваться и другими абиотическими стрессорами (Vannini et al, 2006). При сравнении трансгенных растений Arabidopsis и растений дикого типа было обнаружено значительное повышение уровня ряда аминокислот, участвующих в процессах адаптации, а также было обнаружено активирование синтеза других осмолитов, что позволяет предположить, что Osmyb4 представляет собой важный узел в каскаде стрессовых ответов (Latchman, 2007).

Использование современных методов клеточной и молекулярной биологии, биотехнологии и генетической инженерии позволило достичь крупных успехов в повышении устойчивости растений к гербицидам и биопатогенам, но не к повреждающим абиотическим факторам. Это делает актуальным разработку теоретических основ для создания безопасных стресс-толерантных сельскохозяйственных растений. Одной из таких культур является рапс (.Brassica napus L. var. napus), который находит самое широкое применение в мире во многих сферах человеческой деятельности. Он является одной из основных масличных сельскохозяйственных культур, которая наряду с подсолнечником, соей и хлопком служит источником как: пищевого, так и технического масла. Масло рапса содержит самое низкое количество вредных для здоровья насыщенных жирных кислот и широко используется в пищевых и технических целях. Кроме того, рапс - ценная! кормовая- культура; содержащая большое; количество легкоусвояемых белков: От других: масличных растений рапс выгодно отличается способностью расти в зонах умеренного климата,, где у других подобных сельскохозяйственных культур семена не вызревают.

В настоящее время для повышения устойчивости к повреждающим воздействиям растения, как правило, трансформируют генами функциональных белков (ферментов синтеза и деградации защитных макромолекул и низкомолекулярных органических соединений, транспортеров, шаперонов и т. п.). Значительно более эффективным является использование для трансформации растений генов трансфакторов, в частности, гена ОзтуЬ4 риса. В этом случае один трансген контролирует целую кассету стресс-регулируемых генов и тем самым повышает устойчивость растений к различным абиотическим воздействиям, в том числе и к низким положительным и отрицательным температурам. Это сделало крайне актуальным изучение влияния экспрессии трансгена ОзтуЪ4 на функционирование защитных систем в растениях рапса при гипотермии. Тем более до сих пор данный ген использовали только для трансформации арабидопсиса, томатов, табака и яблони, что сопровождалось повышением их устойчивости к водному дефициту и биопатогенам. Однако повышение холодоустойчивости в данном случае носило видоспецифичный характер.

В этой связи было важно исследовать, сопровождается ли активная экспрессия гена ОзтуЪ4 риса в растениях рапса формированием защитных механизмов и повышением их устойчивости к холоду. Исследование данной проблемы представляет как большой теоретический, так и значительный практический интерес и позволяет не только лучше понять механизмы адаптации растений к низким положительным температурам, но и содействовать разработке современных технологий повышения стресс-толерантности растений.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в том, чтобы выяснить, сопровождается ли суперэкспрессия гена ОзтуЪ4 транскрипционного* фактора риса в трансгенных растениях рапса повышением устойчивости к низкотемпературному стрессу и, в случае если холодоустойчивость этих растений повышается, то исследовать ее возможные механизмы.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать, передается ли в процессе генеративного развития растений рапса и экспрессируется ли трансген, кодирующий трансфакторный белок 08МУВ4 риса.

• Оценить уровень холодоустойчивости трансгенных растений рапса, экспрессирующих ген О8туЬ4 риса.

• Исследовать динамику изменений совместимых осмолитов (растворимых Сахаров и пролина) в трансгенных растениях рапса в процессе низкотемпературного стресса.

• Изучить аккумуляцию общих фенолов и флавоноидов, а также антоцианов, обладающих антиоксидантными свойствами, в трансгенных растениях рапса в процессе холодовой адаптации.

• Изучить действие отрицательной температуры.

Научная новизна работы. Показано, что в процессе генеративного размножения трансгенных растений рапса ген трансфакторного белка ОяпгуЬ4 наследуется и активно экспрессируется. Установлено, что экспрессия трансгена ОзтуЬ4 в растениях рапса сопровождается повышением устойчивости к низким положительным и отрицательным температурам. В основе повышения устойчивости растений к гипотермии лежит снижение интенсивности окислительного стресса в результате увеличения активности антиоксидантных ферментов и аккумуляции низкомолекулярных органических антиоксидантов, с одной стороны, а также накопление совместимых осмолитов, с другой. Впервые установлено, что интенсивная экспрессия гена ОятуЬ4 трансфактора риса в растениях рапса в ответ на гипотермию сопровождается активацией «работы» генов различных метаболических путей, реализация которых на уровне физиологических функций обеспечивает формирование важных защитных механизмов и повышение устойчивости к неблагоприятным температурам.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2,4Д 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

АБК абсцизовая кислота

БАЛ 6-бензиламинопурин

ДТТ дитиотрейтол

ИУК индолилуксусная кислота кДНК комплементарная ДНК

Кл клафоран

Км канамицин мРНК матричная РНК

МДА малоновый диальдегид

НУК нафтилуксусная кислота пдг пролиндегидрогеназа

Про пролин пол реакция перекисного окисления липидов

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЬЕА гидрофильные полипептиды

ЫОБ нопалинсинтаза

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Айман Мохамед Эль Саед Гомаа

выводы

1. Показано ; что в процессе генеративного размножения растений рапса с гетерологической суперэкспрессией гена ОвтуЬ4 транс-фактора риса трансген наследуется и экспрессируется:

2. Представлены экспериментальные доказательства того, что полученные трансгенные растения рапса обладают повышенной устойчивостью к низким положительным и отрицательным температурам, о чем свидетельствует: (а) более активное, по сравнению с растениями дикого типа, накопление биомассы при +4°С; (б) сохранение трансгенными растениями, в отличие от нетрасформированных растений, жизнеспособности после 2-х суток экспозиции при -6°С; (в) меньший окислительный стресс, который испытывают трансгенные растения при +4°С по сравнению с формами дикого типа, и, наконец, (г) способность поддерживать водный статус при гипотермии.

3. Впервые продемонстрировано, что суперэкспрессия гена трансфакторного белка риса в растениях рапса в процессе холодовой адаптации сопровождается интенсивной аккумуляцией общих фенолов и флавоноидов; что, очевидно, лежит в основе снижения уровня МДА в условиях низкотемпературного стресса и повышения холодоустойчивости.

4. Показано, что при низкой положительной температуре трансгенные растения рапса в 20-30 раз больше накапливают пролина, чем ^трансформированные растения. При этом, в отличие от ранее исследованных трансгенных растений арабидопсиса, яблони и томатов с геном ОятуЬ4, в условиях гипотермии содержание растворимых Сахаров в трансгенных растениях рапса было ниже по сравнению с растениями дикого типа.

5. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гетерологическая суперэкспрессия гена ОБтуЪ4 в растениях рапса сопровождается не только интенсивной аккумуляцией совместимых осмолитов, но и биосинтезом антиоксидантных соединений фенольной природы. Отсюда следует, что в условиях низкотемпературного стресса транскрипционный фактор 08МУВ4 регулирует гены различных метаболических путей, интегрируя тем самым защитные системы организма, которые лежат в основе повышения холодоустойчивости растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что гетерологическая экспрессия ОБтуЬ4 гена риса в растениях рапса сопровождается повышением их устойчивости к низкотемпературному стрессу. В основе этого явления лежит способность транскрипционного фактора 08МУВ4 стимулировать аккумуляцию совместимых осмолитов, прежде всего, пролина, а также антиоксидантных соединений фенольной природы и антоцианов. Это подтверждает идею, согласно которой продукт ОзтуЪ4 гена играет 0006500 интегрирующую роль в ответе растений на повреждающее воздействие, координируя экспрессию многих генов различных метаболических путей, обеспечивающих формирование стресс-защитных механизмов, следствием чего является формирование защитных механизмов и повышение стресс-толерантности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Айман Мохамед Эль Саед Гомаа, Москва

1. Барабой В.А. (1991) Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии, 111, 21-28

2. Бараненко.В; В. (2006) Супероксиддисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

3. Белоус A.M., Бондаренко В.А. (1982) Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев. наук. Думка, С. 255.

4. Вавилов П.П., Гриценко В.В., Кузнецов B.C., Третьяков H.H. (1986) Растениеводство М: Агропромиздат, С. 512

5. Гималов Ф.Р., Чемерис A.B., Вахитов В.А. О (2004) восприятии растением холодового сигнала. Успехи современной биологии, 124, 185196.

6. Жолкевич В.Н. К (1955) вопросу о причинах гибели растений при низких положительных температурах. Тр. Ин-та физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР, 9,3-8.

7. Жуковский П.М. (1971) Культурные растения и их сородичи. Л. Колос, С. 8-62.

8. Загоскина Н.В., Дубравина Г. А., Алявина А. К., Гончарук Е. А.2003) Влияние ультрафиолетовой (УФ-Б) радиации на образование и локализацию фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения. Физиология растений, 50, 302-308

9. Зайцев Г. Н. (1963) Математическая статистика. в экспериментальной ботанике. Методика биометрических расчетов. Москва: Издательство Наука, С. 424.

10. Касперска-Палач А. (1983) Механизм закаливания травянистых растений. / Холодостойкость растений, под. Ред. Г.А. Самыгина, М.: Колос. С. 112-123.

11. Колупаев Ю.В., Трунова Т.И. (1992) Особенности метаболизма и защитные функции углеводов растений в условиях стрессов. Физиология и биохимия культурных растений, 24, 523-533.

12. Красавцев О. А. (1988) Свойства плазмалеммы морозостойких растительных клеток. Успехи соврем. Биологии, 106, 143-157.

13. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г. А. (2006) Физиология растений. Издание второе переработанное и дополненное. Учебник для вузов. М.: «Высшая школа». 742.

14. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиология растений, 46, 321-336.

15. Лось Д.А. (2005) Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестник Российской Академии Наук, 75, 338-345.

16. Малышенко С.И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д., Ралдугина Г.Н. (2003) Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfp. Физиология растений, 5Q, 309-315.

17. Половникова М.Г. (2010) Экофизиология стресса. Марийский, государственный университет, кафедра экологии, http://new.marsu.ru/GeneralInforniation'

18. Пустовой и:в:, Филин ВЖ, Корольков A.B. (1995) Практикум по агрохимии. М.: Колос, С. 336.

19. Пыльнев В.В., Коновалов Ю.Б., Хупацария Т.И. (2005) Частная селекция полевых культур. М: Колос, С. 552

20. Радионов Н.В., Волков К.С., Холодова В.П. (2007)Сравнительный анализ устойчивости растений рапса к повышенным концентрациям меди и цинка. Вестник РУДН, 4, 21-30.

21. Синькевич М.С., Дерябин А.Н., Трунова Т.И. (2009)0собенности окислительного стресса растений картофеля с измененным углеводным метаболизмом. Физиология растений, 56, 186-192.

22. Третьякова H.H., Карнаухова Т.В., Паничкин Л.А. (1990) Практикум по физиологии растении. М. Агропромиздат, С. 271.

23. Трунова Т.И. (2007) Растение и низкотемпературный стресс., 64-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, С. 54.

24. Трунова Т.И. (1984) Физиологические и биохимические основы адаптации растений к морозу. С-х. биология, 6, С.3-10.

25. Туманов И.И. (1979) Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука, С. 352,

26. Туркина М.В., Соколова С.В. (1971) Методы определения моносахаридов и олигосахаридов, В» сб. «Биохимические методы в физиологии растений» под редакцией О.А. Навлиновой. Москва, Наука. С. 7-34

27. Фердман ДЛ; (1966) Учебник «Биохимия». М.; изд. Наука, С. 588.

28. Шевякова Н.И. (1983) Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе. Физиология растений, 30, 743-751.

29. Abe Н., Urao Т., Ito Т., Seki М., Shinozaki К., Yamaguchi-Shinozaki К. (2003) Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic signaling. Plant Cell, 15, 63-78.

30. Ahmad J., Hellebust J.A. (1988) The Relationship between Inorganic Nitrogen Metabolism and Proline Accumulation in Osmoregulatory Response of Two Euryhaline microalgae. Plant Physiol, 88, 348-354.

31. Alia P., Sardhi P., and Mohanty P. (1993) Proline in relation to free radical production in seedlings of Brassica juncea raised under sodium chloride stress. Plant Soil, 155, 497-500.

32. Anchordoguy TJ, Rudolph AS, Carpenter JF, Crowe JH. (1987) Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing. Cryobiol, 24, 324-331.

33. Araki S., Ito M., Soyano Т., Nishihama R., Machida Y. (2004) A-myb is Expressed in Bovine Vascular Smooth Muscle Cells during the Late Gl-to-S Phase Transition and Cooperates with с-myc to Mediate Progression to S Phase. Biol Chem. J, 279, 32979-32988.

34. Arrigoni O. (1994) Ascorbate system in plant development. J. Bioenerg. Biomembr, 26, 407-419

35. Asada K. (1992) Ascorbate Peroxidase a hydrogen peroxide scavenging enzymesinpIants.P/zj/szo/. Plant. 85, 235-241.421: . AsKrafti Ml (1994); Breeding for salinity tolerance: in plants. Grit: Rev: plant Sci, 13, 17-42.

36. Bates L.S. Waldren R.P., Teare I D. (1973) Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39, 205-207.

37. Baudry A., Hcim M.A., Dubreucq B., Caboche M., Weisshaar B., Lepiniec L. TT2, TT8, and TTG1 (2004) synergistically specify the expression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant J, 39, 366-380.

38. Beauchamp Ch., Fridovich I. (1971) Superoxide dismutase improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 44, 276-287

39. Berbezy P., Legendre L.; (1997) Maujean, A. Alfa-amylase isoform pattern changes during the winter season in the winter-resting stem internodes of Vitis vinifera. Plant Physiol Bioch, 35, 685-691.

40. Borevitz, J.O., Xia, Y., Blount* J., Dixon, R.A., and Lamb, C. (2000) Activation Tagging Identifies a Conserved MYB Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis. Plant Cell, 12, 2383-2394.

41. Burbulis N., Kupriene R., Blinstrubiene A. (2008) Investigation of Cold Resistance of Winter Rapeseed in Vitro. Sodinink. Darzinink, 27, 223232.

42. Chalker-Scott L. (1999) Environmental Significance of Anthocyanins in Plant Stress Responses. Photochem. Photo bio I, 70, 1-9.

43. Chen Y., Patterson B.D, (1998) The effect of chilling temperature on the level of superoxide dismutase, catalase and hydrogen m some plant leaves Actaphytophysiol. Sin, 14; 323-328.

44. Chinnusamy V., Zhu J:, Zhu J.K. (2006) Gene Regulation, under Cold' Acclimation in Plants. Physiol. Plant, 126, 52-61.

45. Choi SM, Jeong SW, Jeong WJ, Kwon SY, Chow WS, Park YI. (2002) Chloroplast Cu/Zn-superoxide dismutase is a highly sensitive site in cucumber leaves chilled in the light. Planta, 216,315-324.

46. Choi Dong-Woog; Rodriguez E.M., Close T.J. (2002) Barley Cbf3 gene identification, expression pattern, and map locaiiori.Plant Physiology, 129, 1781-1787.

47. Choudhary NL, Sairam RK, Tyagi A. (2005) Expression of deltal-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene during drought in rice (Oryza sativa L.). J. Biochem. Biophys., 42, 366—370

48. Cordoba* F., Gonzalez-Reyes J.A. (1994) Ascorbate and plant-cell growth. J. Bioenerg.Biomemb, 26,399-405.

49. Couee I., Sulmon L., Gouesbet G., Amrani A. (2006) nvolvment of soluble sugars in reactive oxygen species balance and responces to oxidative stress in plants. J. Exp. Bot., 57, 449-459.

50. Crowe JH, Crowe LM, Carpenter JF, Rudolph AS, Wistrom CA, Spargo BJ, Anchordoguy TJ. (1988) Interactions of sugars with membranes. Biochem. Biophy. Acta, 947, 367-384.

51. Cushman J, Bohnert HJ. (2000) Genomic approaches to plant stress tolerance. Curr. Opin. Plant Biol, 3,117-124.

52. Dalton D.A. (1995) Antioxidant defences of plants and fungi. In: Oxidant-induced stress and antioxidant Defences in biology. Ahman S. (Ed.)« Chapman & Hall: New York, pp. 298-355.

53. Deiting TJ.; Zrenner R.; Stitt M. (1998) Similar temperature requirement for sugar accumulation and for the induction of new forms of sucrose phosphate syntheses and amylase in cold-stored potato tubers. Plant, Cell and Environment, 21, 127-138.

54. Denekamp M., Smeekens S.C. (2003) Integration of Wounding and Osmotic Stress Signals Determines the Expression of the AtMYB102 Transcription Factor Genel. Plant Physiol., 32, 1415-1423.

55. Dionne J., Castonguay Y., Nadeau P., Desjardins Y. (2001) Freezing Tolerance and Carbohydrate Changes during Cold Acclimation of Green-Type Annual Bluegrass (Poa annua L.). Crop Science, 41, 443-451.

56. Dixon N., Paiva L. (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism. The Plant Cell, 7, 1085- 1097.

57. Du H., Zhang L., Tang X.-F., Yang W.-J., Wu Y.-M., Huang Y.-B., Tang Y.-X. (2009) Biochemical and Molecular Characterization of Plant MYB Transcription Factor Family. Biochemistry (Moscow), 74, 1-11.

58. Duthie G., Crozier A. (2000) Plant-derived phenolic antioxidants. Curr. Opin. Lipidol, 11, 43-47.

59. Eagles CF, Williams J, Louis DV (1993) Recovery after freezing effect of sugar concentration on cold acclimation in Avena sativa L., Lolium perenne L. and L. multiorum lam. New Phytol., 123, 477-483.

60. Ellerstrom S. (1977) Interspecific hybrydisation in breeding work. Artkorsuingar i foradlingsorbeter. Sveriges Utsadesforenings Tibskrif, 87, 363367.

61. Esen A.A. (1978) Simple Method for Quantitative, Semiquantitative, and Qualitative Assay of Protein. Anal. Biochem, 89, 264-273.

62. Espley R.V., Hellens R.P., Putterill J., Stevenson D.E., Kutty-Amma S., Allan A.C. (2007) Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor, MdMYBlO. Plant J., 49, 414-427.

63. Fabro G., Kovacs I., Pavet V., Szabados L. Alvarez M. E. (2004) Proline accumulation and AtP5CS2 gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis. Mol. Plant-Microbe Interact, 17, 343-350

64. Foyer C.H. (1993) Ascorbic Acid. In: Antioxidant in Higher Plants Alscher R.G., Hess J.L. (Eds) Boca Raton (FL); CRC Press., pp. 31-58.

65. Frankel E.N. (1985) Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Progress in lipid research, 23, 197-221.

66. Fridovich J. (1986) Biological effect of the superoxide radical. Arch. Biochem. Biophys., 2470, 1-11.

67. Fu P., Singh J., Keller W., Mc Gregor I. (1999) Sucrose content and freezing tolerance of Brassica napus canola (rapeseed) seedlings overexpressing an Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. X Internat.

68. Rapeseed Congress, Canberra, Australia,http://www.regional.org.aU/au/gcirc/4/122.htm

69. Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. (1995) Micropreparative Protocol for Extraction of DNA from Tomato and Other Herbaceous Plants. Plant Mol. Biol. Rep., 13; 207-209.

70. Gage TvB;, Wendei S. H. (1950) Quantitive determination of certain flavonol 3-glycosides. Anal. Chem., 22, 708-711.

71. Gamborg OL, Eveleigh DE. (1968) Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley. Can J. Biochem., 46, 417-421.

72. Gao M-J; Allard G.; Byass L.; Flanagan A.M, Singh J. (2002) Regulation and characterization of four CBF transcription factors from Brassica napus. Plant Molecular Biology, 49, 459-471.

73. Gichohi E.G.; Pritchard M.K. (1995) Storage temperature and maleic hydrazide effects on sprouting, sugars, and fry color of Shepody potatoes. Am. Potato J., 72, 737-747.

74. Gilmour S.J.; Fowler S.G., Thomashow M.F. (2004) Arabidopsis transcriptional activators CBF1, CBF2, and CBF3 have matching functional activities. Plant Molecular Biology, 54, 767-781.

75. Gilmour S.J., Sebolt A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F. (2000) Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation. Plant Physiology, 124, 1854-1865

76. Griffith M, Ala P, Yang DSC, Hon WC, Moffat B. (1992) Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves. Plant Physiol., 100, 593596.

77. Groppa M.D., Benavides M.P. (2008) Polyamines and Abiotic Stress: Recent Advances. Amino Acids, 34, 35-45

78. Gusta L.V., Wilen R.W., Fu P. (1996) Low Temperature Stress Tolerance: The Role of Abscisic Acid, Sugars, and Heat-Stable Proteins. HortScience, 31; 39-46.

79. Guy C. (1990) Gold Acclimation andFreezing Stress Tolerance: Role of Protein metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 41, 187-223.

80. Guy C., LI Qin Bao. (1998) the organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family. Plant Cell, 10, 539-556.

81. Hajela RK, Horvath DP, Gilmour SJ, Thomashow MF. (1999) Molecular cloning and expression of cor (cold regulated) genes in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 93, 1246-1252

82. Hare P.D., Cress W.A., van Staden J. (1998) Dissecting the Roles of Osmolytes Accumulation during Stress. Plant Cell Environ, 21, 535-553.

83. Hare P. Cress W. (1997) metabolic implications of stress induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regul. 21, 79—102

84. Haudecoeur E., Planamente S., Cirou A., Tannieres M., Shelp B. J., Morera S., Faure D. (2009) Proline antagonizes GABA-induced quenching of quorum-sensing in Agrobacterium tumefaciens. Proc. Natl. Acad. Sci. JJ. S. A.,106, 14587-14592

85. Heath R.L., Packer L. (1968) Photoperoxidation in Isolated Cloroplasts. Kinetics and Stoichiometry of Fatty Acid Peroxidation. Arch. Biochem. Biophys, 125, 189-198.

86. Hepburn H.A., Naylor F.L., Strokes D.I. (1986) Electrolyte leakage from winter barley tissue as indicator of winterhardiness. Ann. Appl. Biol. 108, 164-165.

87. Herman P.L., Marks M.D. (1989) Trichoma Development in Arabidopsis thaliana. I. Isolation and Complementation of the glabrousi Gene. Plant Cell,1, 1051-1055.

88. Hess J.L. (1993)^ Vitamin E, a-tocopherol*. In: Antioxidant in Higher Plants, Alscher R.G., Hess J.L. (Eds) Boca Raton (FL): CRC Press, pp. 131134.

89. Higginson T., Li S.F., Parish R.W. (2003) AtMYB103 regulates tapetum and trichome development in Arabidopsis thaliana. Plant J., 35, 177179.

90. Higginson T., Li S.F., Parish R.W. (2003) AtMYB103 regulates tapetum and trichome development in Arabidopsis thaliana. Plant. J., 35. 177192.

91. Hincha D K., Heber U., Schmitt J. M. 1990Proteins from frost-hardy leaves protect thylakoids against mechanical freeze-thaw damage in vitro. Planta, 180, 416-419.

92. Holmberg N., B. (1998) Improving stress tolerance in plants by gene transfer. Trends in Plant Science, 3, 61-66.

93. Howarth CJ, Ougham HJ. (1993)Gene expression under temperature stress. New Phytologist, 125, 1-26.109. http://www.bio-soft.net/pcr/01igo. страница Канадского отделения

94. Hughes, М:А, Dun MIA. (1996) The molecular biology of plant acclimation to low temperature. J. Exp. Bot., 47, 291-305.

95. Ingram, J., Bartels D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403.

96. Inomata N. (1983)Hybrid progenies of the cross, Brassica campestris x

97. B.oleracea II. Crossing ability of F1 hybrids and their progenies. Jap. J. of Genet., 58; 433-449.

98. Ito M., Araki S., Matsunaga S., Itoh T., Nishihama R., Machida Y, Doonan J.H., Watanabe A. (2001) A Novel cis-Acting Element in Promoters of Plant В-Type Cyclin Genes Activates M Phase-Specific Transcription. Plant Cell, 13, 1891-1905.

99. Iturriaga G., Schneider K., Salamini F., Bartels D. (1992) Expression of desiccation-related proteins from the resurrection plant Craterostigma plantagineum in transgenic tobacco. Plant Molecular Biology, 20, 555-558.

100. Jin H., Cominelli E., Bailey P., Parr A., Mehrtens F., Jones J., Tonelli

101. C., Weisshaar В., Martin C. (2000) Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis. EMBO J., 19, 6150-6161.

102. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology, 17, 287-291.

103. Kaye C., Neven L., Hofig A., LI Qin-Bao, Haskell D., Guy C. (1998) Characterization of a gene for spinach CAP 160 and expression of two spinach cold-acclimation proteins in tobacco. Plant Physiology., 116, 1367-1377.

104. Kholodova V., Volkov K., Kuznetsov YI. (2010) Plants under Heavy Metal Stress in Saline Environments. In: Soil Heavy Metals, Series "Soil

105. Biology", Heidelberg, Dordrecht, London New York: Springer-Verlag., 19; pp. 163-183.

106. Klempnauer K.-1I., Gonda T.J., Bishop J.M. (1982) Nucleotide sequence of the retroviral leukemia gene v-myb and its cellular progenitor c-myb: the architecture of a transduced oncogene: Cell, 31, 453-463.

107. Kohl D., Schubert K.R., Carter M.B., Hagedorn C.H:, Shearer G. (1988) Proline metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 85, 2036-2040.

108. Koster KL, Lynch DV (1992) Solute accumulation and compartmentation during the cold acclimation of puma rye. Plant Physiol., 98; 108-113.

109. Kuk Y. I., Shin J. S., Burgos N., Hwang T., Han O., Cho B. H., Jung S., Guh J. O. (2003) Antioxidative enzymes offer protection from chilling damage in rice plants. Crop Sei., 43, 2109—2117.

110. Larsson R.A. (1988) The antioxidants of higher plants. Phytochem., 27, 969-978.

111. Latchman D.S. (2007) Eukaryotic Transcription Factors. Academic Press. New York. pp. 488.

112. Lee M.M., Schiefelbein J. (2001) Developmental^ distinct MYB genes encode functionally equivalent proteins in Arabidopsis. Development, 128, 1539-1546.

113. Lee M-Ml, Schiefelbein J;, Werewolf A. (1999) MYB-Related Protein' m> Arabidopsis is a Position-Dependent Regulatorof Epidermal Cell Patterning. Cell, 99, 473-4831

114. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C., (1994) H202 from the oxidative burst orchestrates the plant' hypersensitive disease resistance response. Cell, 79, 583- 593.

115. Levitt J. (1980) Responses of plants to environmental stresses. Chilling freezing and high temperatures stresses. New York etc. Acad. Press, 1, 426.

116. Lewin S. (1976) Vitamin C its molecular biology and medical potential. In: Plant cold hardiness, Li P.H. & LISS-ALAN R. (Eds) Academic Press, New York, pp. 5-39.

117. Leyva A., Jarrillo J.A., Salinas J., Marnez-Zapater M. (1995) Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase mRNA of Arabidopsis thaliana in light-dependent manner. Plant Physiol, 10, 839-846.

118. Li, J., Yang, X., Wang, Y., Li, X., GAO, Z., Pei, M., Chen, Z., Qu, L.J., and GU, H. (2006) Two groups of MYB transcription factors share a motif which enhances trans-activation activity. Biochem. Biophys. Res.Commun., 341, 1155-1163.

119. Lipsick J.S. (1996) One billion years of Myb. Oncogen, 13, 223-235.

120. Liu J., Zhu J.K. (1997) Proline accumulation and salt-stressinduced gene expression in a salt-hypersensitive mutant of Arabidopsis. Plant Physiol., 114, 591-596

121. Livingston D.P, Henson C.A. (1998) Apoplastic sugars, fructans, fructan exohydrolase, and invertase in winter oat: responses to second-phase cold hardening. Plant Physiology, 116, 403-408.

122. Lyons J.M. (1973) Chilling injury in plants. Annu. Rev. Plant. Physiol., 24, 445-466.

123. Mabry T.J., Markham K.R., Thoma M B. (1970) The Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag Publication, New York, pp. 261266.

124. Mandaokar A., Thines B., Shin Bi, Lange B.M., Choi G., Koo Y.J., Yoo YJ., Choi YD:, Choi G,. Browse J. (2006) Transcriptional regulators of stamen development in Arabidopsis identified by transcriptional profiling. Plant J., 46, 984-1008.

125. Mann T., Keilin D. (1938) Hemocuprein and hepatocuprein copperprotein compounds of blood and liver in mammals. Proc. R. Soc. Lond. B., 126,303—315.

126. Matsui, K., Hiratsu, K., Koyama, T., Tanaka, H., and Ohme-Takagi,

127. M. A. (2005) chimeric AtMYB23 repressor induces hairy roots, elongation of leaves and stems, and inhibition of the deposition of mucilage on seed coats in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 46,147-155.

128. Mattana M., Biazzi E., Consonni R., Locatelli F., Vannini C., Provera S., Coraggio I. (2005) Overexpression of Osmyb4 Enhances Compatible Solute Accumulation and Increases Stress Tolerance of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant, 125, 212-223.

129. Mattioli R., Marchese D., D'Angeli S., Altamura M.M., Costantino P., Trovato M. (2008) Modulation of intracellular proline levelsaffects flowering time and inflorescence architecture in Arabidopsis. Plant Mol. Biol, 66,277-288.

130. McKersie B.D., Leshem Y.Y. (1994) Stress and Stress Coping in Cultivated Plants. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, the Netherlands, pp. 104-131

131. McKown R, Kuroki G, Warren G. (1996) Cold responses of Arabidopsis mutants impaired in freezing tolerance. J. Exp. Bot., 47, 19191925.

132. Mehrtens, F., Kranz, Hi, Bednarek, P., and Weisshaar, B: (2005) The Arabidopsis Transcription Factor MYB12 is a Flavonol-Specific Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis. Plant Physiol, 138, 1083—1096.

133. Miyake K., Ito T., Sends M. (2003) Isolation of a subfamily of genes for R2R3-MyB transcription factors showing up reguranted expression under nitrogen nutrient-limited conditions. Plant Mol. Biol., 53, 237-245

134. Hughes M.A., Dunn M.A. (1996) The molecular biology of plant acclimation to low temperature. J. Exp. Bot., 47,291-305.

135. Monroy A.F., Castonguay Y., Leberge S., Sarhan F., Vezina L.P., Dhindsa R.S. (1993) A new cold-induced alfalfa gene is associated with enhanced hardening at subzero temperature. Plant Physiol., 102, 873-879.

136. Morris L.L. (1982) Chilling injury of horticultural crops: An overview. Hort Sei., 11, 161-162.

137. Moyano, E., Martinez-Garcia, J.F., Martin, C. (1996) Apparent redundancy in myb gene function provides gearing for the control of flavonoid biosynthesis in Antirrhinum flowers. Plant Cell, 8, 1519-1532.

138. Mullen R.T., Trelease R.N. (2000) The sorting signals for peroxisomal membrane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal tail. J. Biol Chem., 275, 16337-16344

139. Müller-Thurgau H. (1882) Über Zuckerhäufung in Pflanzenteilen in Folge niederer Temperatur. Landw. Jahrb, 11, 751-828.

140. Mullineaux P.M., Creissen G.P. (1997) Glutathione reductase: regulation and role in oxidative stress. In: Oxidative stress and the molecularbiology of antioxidant defences, Scandalios J.G. (Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 667-714.

141. Murashige T., Skoog F.A. (1962) Revised medium for rapid growth and-bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15, 473-482.

142. Nagaoka S., Takano T. (2003) Salt tolerance-related protein* STO binds to a Myb transcription factor homologue and confers salt tolerance in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 54; 2231-2237.

143. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y. Yamaguchi Shinozaki K. and. Shinozaki K. (1999) Antisense suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 461, 205-210.

144. NDong C., Danyluk J.,. Wilson K.E., Pocock T., Huner N.P.A., Sarhan F. (2002) Cold-Regulated Cereal Chloroplast LEA-Like Proteins. Molecular Characterization and Functional Analyses. Plant Physiology, 129, 1-14.

145. Nesi N., Jond C., Debeaujon I., Caboclie M., Lepiniec L. (2001) The Arabidopsis TT2 Gene Encodes an R2R3 MYB Domain Protein That Acts as a Key Determinant for Proanthocyanidin Accumulation in Developing Seed. Plant Cell, 13,2099-2114.

146. Nishawar J., Mahboob-ul-Hussain, Khurshid I.A. (2009) Cold resistance in plants: A mystery unresolved. Electronic Journal of Biotechnology, 12, 1-43

147. Nomura K.; Ogasawara Y.; Uemukai H.; Yoshida M.; Hyodo H.; Watada A.E. (1995) Change of sugar content in chestnut during low temperature storage. Acta Hortic, 398, 265-276.

148. Nordin K, Vahala T, Palva ET. (1993) Differential expression of two related, low-temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.). Plant MolBiol., 21, 641-653.

149. Novillo F.A., Ecker J.M.; Joseph R, Salinas J. (2004) CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBFl/DREBlBand CBF3/DREB1A expression andplays a central role in stress tolerance in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101, 3985-3990.

150. Pandolfi D., Solinas G., Valle G., Coraggio I. (1997) Cloning of a cDNA Encoding a Novel myb Gene (accession no. yl 1414) Highly Expressed in Cold Stressed Rice Coleoptiles (PGR PGR97-079). Plant Physiol, 114; 747.

151. Pasquali G., Biricolti S., Locatelli F., Baldoni E., Mattana M. (2008) Osmyb4 Expression Improves Adaptive Responses to Drought and Cold Stress in Transgenic Apples. Plant Cell Rep., 27,1677-1686.

152. Patton A.J., Cunningham S.M., Yolenec J.J., Reicher Z.J. (2007) Differences in Freeze Tolerance of Zoysiagrasses: II. Carbohydrate and Proline Accumulation. Crop Sci., 47, 2170-2181.

153. Paul MJ, Driscoll SP, Lawlor DW. (1991) The effect of cooling on photosynthesis, amounts of carbohydrate and assimilate export in sunflower. J. Exp. Bot., 42, 845-852.

154. Paul MJ, Lawlor DW, Drisco. SP. (1990) The effect of temperature on photosynthesis and carbon fluxes in sunflower and rape. J. Exp. Bot., 41, 547555.

155. Pawlowski K., Kunze R., de Vries S., Bisseling T. (1994) Isolation of Total, poly(A) and Polysomal RNA from Plant Tissues. In: Plant Molecular Biology. Manual D5, Gelvin S.B., Schilperoort R.A. (Eds) the Dordrecht, Netherlands: Kluwer, pp. 1-13.

156. Paz-Ares, J., Ghosal D., Wienand U., Peterson P., Saedler H.1987)Molecular analysis of the C 1-1 allele from Zea mays:a dominant mutant of the regulatory C 1 locus. EMBOJ., 6, 3553-3558.

157. Penfield S., Meissner R.C., Shoue D.A., Carpita N.G., Bevan M.W. (2001)* MYB61 is required' for Mucilage Deposition and Extrusion in the Arabidopsis Seed Coat. Plant Cell, 13, 2777-2791.

158. Pennycooke JC, Cox S, Stushnoff C. (2005) Relationship of cold acclimation total phenolic content and antioxidant capacity with chilling tolerance in petunia (Petunia x hybrida). Environ Exp Bot., 53,225-32.

159. Pfannschmidt T., Nilsson A., Tullberg A., Link G., Allen J.F. (1999).Direct transcriptional control of the chloroplast genes psbA and psaAB adjusts photosynthesis to light energy distribution in plants. IUBMB Life, 48, 271-276.

160. Platt-Aloia K.A., Thomson W.W. (1987) Freeze-fracture evidence for lateral phase separation in the plasmalemma of chilling-injured avocado fruit. Protoplasma, 136, 71-80.

161. Prasad T.K., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. (1994) Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatore role for hydrogen peroxide. Plant Cell, 6, 65-74.

162. Preston J., Wheeler J., Heazlewood J., Li S.F., Parish R.W. (2004) AtMYB32 is required for normal pollen development in Arabidopsis thaliana. Plant J., 40, 979-995.

163. Quaedvlieg, N., Dockx, J., Keultjes, G., Kock, P., Wilmering, J., Weisbeek, P., and Smeekens, S. (1996) Identification of a light regulated

164. MYB gene from an Arabidopsis thaliana transcription factor gene collection. Plant. Mol. Biol., 32, 987-993

165. Rains D.W. (1989) Plant tissue and protoplast culture: application to stress physiology and biochemistry .In: Plants under Stresses. Biochemistry. Physiology and Ecology. Their Application to Plant Improvement, pp. 181196.

166. Rice-Evans CA, Miller NJ; Paganga G. (1997).Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends Plant Sci., 2, 151.

167. Ridge I., Osborne D.J. (1971) Role of peroxidase when hydroxyproline-rich protein in plant cell wall is increased by ethylene. Nature, New biol., 229 205-208

168. Ristic LA, Ashworth EN. (1993) Changes in leaf ultrastructure and carbohydrates in Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cv. Columbia during rapid cold acclimation. Protoplasma, 172, 111-123.

169. Rivero R.M., Ruiz J., Bretones G., Baghour M., Ragala A., Belakbir A., Romero L. (1998) Relationship between boron and phenolic metabolism in tobacco leaves. Phytochemistry, 48, 269-272.

170. Rivero R.M., Ruiz J.M., Garci a P.C., Lo'pez-Lefebre L.R., Sa'nchez E., Romero L. (2001) Resistance to cold and heat stress: accumulation of phenolic compounds in tomato and watermelon plants. Plant Science, 160, 315-321

171. Rutten D, Santarius KA. (1992) Relationship between frost tolerance and sugar concentration of various bryophytes in summer and winter. Oecologia, 91, 260-265.

172. Saradhi P.P., Arora A.S., Prasad K.V. 1995Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation. Biochem. Biophys. Res. Commun, 209, 1—5.

173. Sasaki H., Ishimura K. Odo M. (1996) Changes in Sugar Content during Cold Acclimation and Deacclimation of Cabbage Seedlings. Ann. Bot., 78, 365-369.

174. Sasaki, H., Ichimura, K. and Oda; M. (1996) Changes in sugar content during cold acclimation and deacclimation of cabbage seedlings. Annals of Botany, 78, 365-369.

175. SasakiiH., IcKimura K., Okada K., ©da M. (1998) Freezing tolerance and soluble sugar contents affected, by water stress during cold-acclimation, and deacclimation in cabbage seedlings. Scientia Horticulturae, 16, 161-169;

176. Scandalios J.G. (1990) Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress. Adv. Genet., 28, 1-41.

177. Schat, H., Sharma S.S, Voous R. (1997) Heavy metal-induced accumulation of free proline in a metal-tolerant and a nontolerant ecotype of Silene vulgaris. Physiol. Plant, 101, 477-482.

178. Schiefelbein J. (2003) Cell-fate specification in the epidermis: a common patterning mechanism in the root and shoot. Plant Biol., 6, 74-78.

179. Schijlen E.G., Ricde V.C.H., van Tunen A.J., Bovy, A.G. 2004Modefecation of flavonoid biosynthesis in corp plants. Phytochemistry, 65,2631-2648.

180. Schmitz G., Tillmann E., Carriero F., Fiore C., Theres K. (2002) The tomato Blind gene encodes a MYB transcription factor that controls the formation of lateral meristems. Proc. Natl. Acad. Sci. XJSA., 99, 1064-1069.

181. Seki M., Shinozaki K., Yamaguchl-Shinozaki K. (2003) OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought, high-salt- and cold-responsive gene expression. The Plant Journal, 33, 751763.

182. Sen A.G., Heinen J.L., Holaday A.S., Burke J.J., Allen R.D. (1993) Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpresschloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc. Natl. Sci. USA., 90, 16921633.

183. Shalaev EY, Steponkus PL. (2001) Phase behavior and glass transition of 1,2-dioleoylphosphaditylethanolamine (DOPE) dehydrated in the presence of sucrose. Biochem. Biophy. Acta-Biomembr, 1514, 100-116.

184. Shao HB; Jiang SY, EiiFMJ Gliu LY, Zhao GX, Shao MA, Zhao XN, Li F. (2007) Some advances in plant stress physiology and their implications in the systems biology. Era. Biointer, 54, 33-36.

185. Shao HB, Shao MA, Liang ZS. (2006) Osmotic adjustment comparison of 10 wheat (Triticum aestivum L.) genotypes at soil water deficits. Colloids Surf B Biointerfaces, 47, 132-139.

186. Sharma P.1, Sharma N., Deswal R. (2005) The molecular biology of the low-temperature response in plants. Bioessays, 27, 1048-1059.

187. Shaw B.P., Rout N.P. (2002) Hg and Cd induced changes in proline content and activities of proline biosynthesizing enzymes in Phaseolus aureus and Triticum aestivum. Biol. Plantarum, 45, 267—271.

188. Shin B., Choi G., Yi H., Yang S., Cho I., Kim J., Lee S., Paek N.C., Kim J.H., Song P.S., Choi G. (2002) AtMYB21, a gene encoding a flower-specific transcription factor, is regulated by COR1. Plant J., 30,23-32.

189. Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr Opin Plant Biol., 3, 217-223.

190. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003) Monitoring expression profiles of rice genes under cold, drought, and high-salinity stresses and abscisic acid application using cDNA microarray and RNA gel-blot analyses. Plant Physiology, 133, 1755-1767.

191. Solecka D, Boudet AM, (1999) Kacperska A. Phenylpropanoid and-anthocyanin.changes in low temperature treated winter oilseed rape leaves. Plant Physiol Biochem37, 491-496.

192. Solecka D, Kacperska A. (1995) Phenylalanine ammonia-lyase activity in leaves of winter oilseed rape plants as affected by acclimation of plants to low temperature. Plant Physiol Biochem., 33, 585—91.

193. Steiner-Lange, S., Unte, U.S., Eckstein, L., Yang, C., Wilson, Z.A., Schmelzer, E., Dekker, K., and Saedler, H. (2003) Disruption of Arabidopsis thaliana MYB26 results in male sterility due to non-dehiscent anthers. Plant J., 34. 519-528.

194. Steponkus, P.L. (1984) Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant Physiol, 35, 543-584.

195. Stracke, R., Werber, M., and Weisshaar, B. (2001) The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Curr. Opin.Plant Biol, 4; 447-456.

196. Thomashow M.F. (1999) Plant Gold Acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol., 50, 571-599.

197. Thomashow M.F. (2001) So what's new in the field of plant cold acclimation? Lots!. Plant Physiology, 125, 89-93.

198. Timmermans, M.C., Hudson, A., Becraft, P.W., and Nelson, T. (1999) Rough Sheath2: A Myb protein that represses Knox homeobox genes in maize lateral organ primordial. Science, 284, 151-153:

199. Trunova T. I. (1982) Mechanisms of winter wheat hardening at low temperature. In: Plant cold hardiness and freezing stress, Li PH, Sakai A. (ed.) New York: Academic Press, pp. 41-47.

200. Uemura M, Joseph RA, Steponkus PL. (1995) Cold acclimation of Arabidopsis thaliana: Effect on plasma membrane lipid composition and freeze-induced lesions. Plant Physiol., 109, 15-30.

201. Vagujfalvi A., Galiba G., Cattivelli L., Dubcovsky J. (2003) The cold regulated transcriptional activator Cbf3 is linked to the frost-tolerance locus

202. Fr-A2 on wheat chromosome 5A. Molecular Genetics and Genomics, 269- 6067.

203. Van Camp* W., Capiau K., van Montagu M., Inze D., Slooten* L. (1996) Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiol., 1, 1703-1714.

204. Van Hasselt P.R., van Berlo H.A.C. (1980) Photooxidative damage to the photosynthetic apparatus during chilling. Physiol. Plantarum, 50, 52-56.

205. Vannini C, Locatelli F, Bracale M, Magnani E, Marsoni M, Osnato M, Mattana M, Baldoni E, Coraggio I. (2004) Overexpression of the Rice Osmyb4 Gene increases Chilling and freezing Tolerance of Arabidopsis thaliana Plants. Plant J. 31, 115-127.

206. Vannini C., Campa M., Iriti M., Genga A., Faoro F., Carraviere S., Rotino G.L., Rossoni V., Spinardi A., Bracale M. (2007) Evaluation of Transgenic Tomato Plants Ectopically Expressing the Rice Osmyb4 Gene. Plant Sci., 173, 231-239.

207. Verbruggen N. and Hermans G. (2008) Proline accumulation in plants. A Review. Amino Acids, 35, 753-759.

208. Viswanathan C., Zhu J.K. (2002) Molecular Genetic Analysis of Cold-Regulated Gene Transcription, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B357, 877-886.

209. Wang, Si, Wang, J.W, Yu, N., Li, G.H;, Luo, B:, Gou, JiY., Wang; L.J., Chen, X.Y. (2004) Control- of plant trichome development by a cotton fiber MYB gene. Plant Cell, 16, 2323-2334.

210. Westhoff P., Nelson N., Bunemann H., Herrman B.G. (1981) Localization of genes for coupling factor subunits on the spinach plastid chromosome. Curr. Genet., 4, 109-120.

211. Weston K. (1998) Myb proteins in life, death and differentiation. Curr. Opin Genet. Dev. 8, 76-81.

212. Wingsle G, Hiillgren J.-E. (1993) Influence of S02 and N02 exposure on glutathione, Superoxide dismutase and glutathione reductase activities in Scots pine needles. J. Exp. Bot., 44, 463-470.

213. Wise, R.R. (1995) Chilling-enhanced photooxidation: The production, action and study of reactive oxygen species during chilling in the light. Photosynthesis Research, 45. P. 79-97.

214. Wu F., Zhang G., Dominy P. (2003) Four barley genotypes respond differently to cadmium: lipid peroxidation and activities of antioxidant capacity. Environ. Exp. Bot., 50, 67-78.

215. Xin, Z. and Browse, J. (1998) Eskimo 1 mutants of Arabidopsis are constitutively freezing-tolerant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 7799-7804.

216. Xue G-P. (2003) The DNA-binding activity of an AP2 transcriptional activator HvCBF2 involved in regulation of low-temperature responsive genes in barley is modulated by temperature. The Plant Journal, 33, 373-383.

217. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2005) Organization of cis-Acting Regulatory Elements in Osmotic and Cold Stress Responsive Promoters. Trends Plant Sci., 10, 88-94.

218. K. (1995) Correlation between the induction of a gene for delta l-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana under osmotic stress. Plant J., 7, 751—760.

219. Zrenner, R., Willmitzer L., Sonnewald U. (1993) Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA. Planta, 190, 247-252.

Информация о работе
  • Айман Мохамед Эль Саед Гомаа
  • кандидата биологических наук
  • Москва, 2011
  • ВАК 03.01.05
Диссертация
Изучение свойств трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OSMYB4 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Изучение свойств трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) со встроенным геном OSMYB4 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы