Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, модифицированной по аргининовым остаткам

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, модифицированной по аргининовым остаткам"

МОСКОВСКИЙ ОРДОД ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.Ломоносова

Кафедра биохимия Биологического факультета МГУ и

Лаборатория биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

На правах рукописи

КУЗЬМИНСКАЯ ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

УДК Б77.1Б2.121

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГЛШ1ЕРШаШЩЧЗ-^ООФАТДЕ™ДРОШ{АаЬ, МОДИФИЦИРОВАННОЙ по АРГИНИНОВЫМ ОСТАТКАМ (03.00.04-БИохкмия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук «

Москва 1993

(

Работа выполнена в лаборатории биохимии животной клетки института Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, 'профессор Н.К.Наградова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н.Л.Клячко кандидат биологических наук, Т.Б.Еронина

Бедувее учреждение:

Институт биологической и медицинской химии РАМН

Защита состоится "_" __ 1993 г. в часов на

васедании Специализированного Совета Д. 053. Об. 32. при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по Адресу: г. Москва 119699, Ленинские горы. Биологический факультет.

С диссертацией можно Биологического факультета МГУ. 'Автореферат разослан _

ознакомиться в библиотеке

1993 г.

и.„\ Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наух. профессор

Н.Б.Гусев

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

о-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа в течение многих лет является предметом интенсивных энзимологических исследований. Интерес к »тому ферменту определяется не только его важной ролью как поставщика энергии в процессе гликолиза, ко также тек обстоятельством,что он традиционно служит модельным объектом для выяснения механизмов межсубъединичной кооперативное™ в белках-олкгомерах. На ГАФД впервые описан феномен отрицательной кооперативное«! по связыванию лигандов, что послужило экспериментальным обоснованием соответствующей модели, предложенной Кошландом. Этот фермент был также экспериментальным "инструментом" для проверки справедливости разных моделей, объясняющих эффект "полуцентровой реактивности". И наконец, на нем продемонстрированы различные проявления взаимодействия активных центров в ходе катализа.

Обширная и разнообразная информация, накопленная относительно кооперативных свойств тетрамерной молекулы ГАФД, не позволяет пока ответить на важнейший вопрос, касающийся молекулярных механизмов рассматриваемых явлений. Выяснение этих механизмов, которое можно считать основной проблемой па современной этапе развития исследований ГАФД, требует детального структурно-функционального анализа различных ковариационных состся-

Список сокращений: ГАФД - П-глтдаральдегвд-З-фоофвт-дегидрогеназа; 3-4ГА - З-фосфэгяицершювий альдегид; ДГНВ -дитионвтробензойная кислота; р-ю?л - р-нитрофенилацвтат, ДГТ-дитиотреитол.

ний фермента - начиная от его перехода из ало- в холоконфор-мацию и кончая образованием и превращением тройного комплекса фермент-кофермент-суОстрат. При этом результаты, полученные при рентгеноструктурном анализе различных форм белка, должны дополняться исследованиями, проведенными в растворе. Принципиально важным является вопрос о том вкладе, который вносят отдельные функциональные группы активного центра в стабилизацию переходного состояния реакции. Данный аспект проблемы остается пока экспериментально не разработанным из-за отсутствия рентгено-структурных данных.-характеризующих комплексы фермента с аналогами переходного состояния. Модельные построения, основанные на кристаллографических исследованиях холоферыента, выявили совокупность аминокислотных остатков, которые могут.быть вовлечены В формирование каталитической области активного центра, образуя различные контахты с молекулой субстрата. Специальное внимание среди них привлекает Арг-231, вероятная функция которого послужила предметом дискуссий. Имепциеся в настоящее время рентгено-структурные данные не позволяют исключить участие этого остатка в связывании фосфатной группы субстрата: вместе с тем, ряд соображений (и в первую очередь бросаэдаяся в глаза аналогия архитектура каталитических областей активных центров ГАФД я лактатдэгндрогйназы, также содержащей аргиыиновый остаток в сходно» положении), заставляют приписать ему иную функцию.

В • исследованиях нашей группы предпринята первая попытка экспериментальной проверки роли аргининошх остатков в функционировании ГДСД. При втом оказалось, что гомологичные ферменты, з'.золнроаанныв из разных источников ( скелетные мшпцы крысы, кролика, пахарские дрожжи) подвергаются значительной кнакти-

вацки, связанной с модификацией аргининовых остатков. Дальнейшие исследования позволили заключить, что в ферменте, изолированном из мышц кролика, модифицируемый аргининовый остаток вовлечен в функционально важные конформационные изменения Оелка, связанные с проявлением межсубъединичной кооперативное™.

Цель работы состояла в дальнейшем развитии этих исследований для * выяснения структурной взаимосвязи между механизмами катализа и межсубъединичной кооперативностью. Для этого предстояло разработать метод избирательной химической модификации функционально ванного аргининового остатка ГАФД и исследовать свойства модифицированного фермента.

Научная новизна.При помощи избирательной химической модификации единственного арганинового остатка на субъединицу удалось получить фермент, стабилизированный в асимметричном состоянии, з котором только два активных центра тетрамера способны осуществлять катализ реакции окисления З-фосфоглицеринового альдегида, а также взаимодействовать с псевдосубстратами и модификаторами. Показано, что полуцентровая реактивность модифицированного тетрамера является следствием его конфорыационной асиммат-рии. Рассмотрены возможные механизмы возникновения полуцентровой реактивности как следствия изменения микроокружения вргинн-нового остатка и нарушения межсубъедкничиых- контактов.

Практическое значение работы определяется тем, что ее результаты, углубляющие представления о механизмах иежсубъеди-ничных взаимодействий в молекуле ГАФД. могут быть использованы при чтении спецкурсов на кафедре биологического факультета МГУ.

Апробация. Результаты работы были доложены на 8 Все сошной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1969), на 27

съезде Польского Биохимического Общества ( Люблин, 1991), на 7 Симпозиуме по инженерной анзимологии (Москва, 1991) и на международной конференции "Современная энзимология: проблемы и тенденции" (Санкт-Петербург, 1992).

Публикации. Результаты исследования изложены в 7 печатных работах.

Объем работы.Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( 100 источника). Работа изложена на 117 стр. машинописного текста, содержит 6 таблиц и 20 рисунков.

Изложение полученных результатов и их обсуждение составляют содержание экспериментальной части диссертации. Обзор литературы посвящен рассмотрению вопросов, непосредственно связанных с предметом настоящего исследования.

экспепментальная часть.

Натьриа/и и нет ода.

D-глицеральдегид-З-фосфат получали по методу Шевчук tßeewauk et al., 1961].

ГАФД выделяли из пехарсхих дрожжей по методу КгеЬв iEreba,l953) и на мышц кролика по методу Hill (Bill et al., 19751%

о

ЫодвХмкацдо аргшшновых остатков проводили при 20 0 в 50 мм мэдвналовом буфере, содержащем 5 ЭДГА и 2 мЫ дитиотрентол, ори pH 8,3. в присутствии 20-30 tdl бутандиоаа. Реакцию начинали добаадением бутандиона к раствору фермента. Через определенные

интервалы времени отбирали пробы для определения активности в стандартных условиях. Инкубацию заканчивали после достижения постоянного уровня остаточной активности, который составлял обычно 5-7J5 от исходного.

Число аргининовых остатков, модифицируемых на тетрамер, определяли по методу Сакагуши [Tomlinaon at al, 1974].

Определение числа SH-групп в нативной и шдайицироваыной ГАФД проводили по методу Эллмана [Kliman, 1959].

Модификацию цистеинов активного центра иодацетатом и иод-ацетамидом регистрировали двумя методами: I) по убыли активности; 2) по тушению полосы Рэкера в присутствии HAD+ при 370 нм. Измерения проводили на спектрофотометре Hitaohl-557.

Связывание nad+c апоформой ГАФД регистрировали двумя

?

методами: 1) образование холоформы при добавлении HAD+k раствору апофермента регистрировали по образованию полосы Рэкера. Измерения проводились в двухлучевом режиме при 360 минус БООнм на спектрофотометре Amlnoo Dff-2000; 2) связывание 1UD регистрировали по изменению собственной белковой флуоресценции ГАФД iSoheek et al, 1978]. Флуориыетрическое титрование проводили на спектрофлуориметре мрг-4 (Япония).

Образование комплекса ацил-ферыент-NADH измеряли в пред-стационарном режиме, регистрируя накопление НАШ пра 340 нм . Измерения проводились на спектрофотометра stopped-Flow Modal RA-401 .с объемом пробы 0,2 мл и мертвым временем 2 мсек. За протеканием реакции гидролиза р-нитрофенилацетата следили спектрофотометрически при 400 нм, считая Е400 для р-нитрофенолят-иона равным 16500 И-1 см-1 [Soukri et al, 1989J.

- а -

Обработка экспериментальных данных производилась на персональном компьютере по программе Graph PAT in Plot/Verelon Э.о N с применением метода нелинейной регрессии.

Значения констант Михаалиса и максимальной скорости реакции рассчитывали непосредственно из кривых зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, используя уравнение

y=YS/(Km+S) .где Y- наблюдаемая скорость реакции; Б - концентрация субстрата.

Константы скорости модификации аргининовых остатков бутан-дкоаох рассчитывали из кривых инактивации фермента, используя уразнение Y «= a e~kt+ в , где

Y - активность в момент времени t, А + В - исходная активность. В - остаточная активность.

Константы скорости модификации цистеннов йодацетатом или Содацетамидом рассчитывали из кривых инактивации фермента или ез кинетики тушения полосы Рэкера, используя уравнение

у - A e"kt .где ' - —-

Y - активность ( или оптическая плотность раствора при 370 нм) в момент времени t; А - исходная активность (исходная оптическая плотность раствора).

Для определения значений рК различных групп и построения кривых рН-зависамости использовали известное следствие из уравнения Гендерсона-Хассельбаха:

а ■ к /(к +(н+]) . где а - степень диссоциации группы -231. К - константа диссоциации, цГ]- концентрация ионов водорода; при втом считали, что константа скорости модификация группы -ХН пропорциональна степени диссоциации а.

Результаты и их сбодедрние.

1 Изучение кинетики инактивации ГАФД в присутствии 2,3-Оутандиона.

- Инкубация ГАФД из различных источников с 2,3-бутандионсм приводит к потере 90-95? дегидрогеназной активности. Модафцци-рованный фермент характеризуется остаточным уровнем активности, который остается.постоянным при концентрации бутандиона выве 20 ММ и составляет обычно 5-756 от исходного уровня активности.Инактивация ГАФД в присутствии 2,3-бутандиона может быть описана кинетикой псевдо-первого порядка, следовательно, все субъединицы модифицируются независимо друг от друга с одной и той же константой.- Константа скорости реакции ГАФД с 2,3-бутандионом возрастает с ростом рН, однако остаточный уровень активности остается постоянным для данного препарата фермента независимо от рН среды (рис.1).

Данные результаты позволяют предполагать, что наблюдаемая нами остаточная активность является характеристикой фермента с модифицированными аргининами, который сохраняет способность катализировать реакцию окисления 3-ФГА с низкой скоростью.

мяигты

в

10

Рис.1. Инактивация холофер-мента ГАФД в присутствии 2,3-бутандиона. Реакционная смесь содержала 50 мМ мединаловый буфер, 5 Ш ЭДТА, 0,2 м N»01, 20 мМ бутандион и 9 мкМ холо-фермента. I- рН 7,5; 2- рН 8,0; 3- рН 8,25; 4- рН 8,5; 5- рН 9,0; 6- рН 9.5.

2. Определение числа аргининовых остатков, модифицируемых бутандионом в ферменте из мышц кролика.

Анализ препаратов модифицированного фермента методом Сакагуши показал, что в ферменте, изолированном из мышц кролика, модифицируется только один аргининовый остаток на субъединицу, что отличает его от ферментов, выделенных из мышц крысы [Nagradova et al., 1976], из мышц свиньи [Вапав et al., 1983] и из дрожжей (Nagradova et al, 1975]. Сравнительный анализ ферментов, выделенных из различных источников (из дрожжей и из мышц кролика),а также сопоставление наших данных с литературными позволяет предполагать, что единственным остатком, модифицирующимся в ферменте из мышц кролика, скорее всего является аргинин активного центра ( Арг-231).

3. Исследование взаимодействия модифицированной апоформы с NAD?

На рис.2 показано образование полосы Ракера при насыщении коферментом апоформы нативного и модифицированного ферментов.

Препараты нативного и модифицированного ферментов, различные по своим каталитическим свойствам, мало отличаются в отношении способности связывания had! Коэффициент екстинкции комплекса был найден равным 800 м-1см-1в обоих случаях; насыщение коферментом наблюдается в одном и том же концентрационном диапазоне для нативного н модифицированного ферментов - это гово- -рит о том, что модификация аргинина не изменяет существенно сродства к Nil)! Стехиометрия связывания кофермента модифицированным ферментом близка к тахово£ для нативного. Подученные

25 50 NA0+ мкМ

Рис.2. Титрование нагивнаго(•) в модифицированного (л) алофермента раствором kad+. Реакционная смесь содержала БО мм мединаловый буфер <рН 8.5). I М ЭДТА, 2мМ ДГГ, 8 ккЫ алофермента. Образец с модифицированным ферментом содержал также 30 мМ бутандион.

данные свидетельствуют о нативности ВЯ-гругш активного центра, что проявляется в и* способности взаимодействовать с пю* о образованием комплекса с переносом заряда.

Коэнзим-связывавдие свойства модифицированной ГАФД Лия исследованы также флуориметрическим методом. Обработка данных в координатах Скэтчарда дает одинаковое число участков связывания для иативного и модифицированного ферментов ( 4 моль МАО* на тетрамер ГАФД); значения Ка для третьего и четвертого участков связывания, равны 0,38 и 2.2 мк1/ для нативного фермента ■ 0,52 в 3,6 мкМ для модифицированного фермента. Полученные результаты свидетельствуют о том, что связывание характеристики не

изменяется при модификации аргининовых остатков: сохраняется стехиометрия связывания Ш>+ и отрицательный характер

кооперативное™ по отношении к коферменту.

4. Исследование взаимодействия цистеинов активного центра с субстратами и модификаторами.

Было показано, что модифицированные мышечный фермент проявляет полу центровую реактивность по отношению к естественному субстрату (3-ФГА ), а также по отношению к ряду SH-peагентов, которые не являются полуцентровыми для нативного фермента. На рис.3, представлены результаты титрования активных центров нативного и модифицированного ферментов субстратом: при добавлении 3-ФГА к раствору нативной ГАФД в присутствии had* образуется ацил-фермент в комплексе с nadh , который, при отсутствии неорганического фосфата в среде и при нейтральном рН сравнительно устойчив и может быть зарегистрирован по увеличению поглощения при 340 нм.

i,

а ,

«

---1 1

н

Рис.3.Титрование активных центров нативной (!) и модифицированной (2) ГАФД 3-фоофогли-цериновым альдегидом. Реакционная смесь содержала 50 Ш меданаловый буфер (рН 7,0), 5 М ЭДГА, I м» ДГТ. 0,5 Mi HADÍ 0.5 Ш «ГА. 6.2 Midi ГА«Д.

Ках видно хз рисунка, в случае модифицированной ГШ только два активных центра реагирует с субстратом.

Восстановление активности, наблюдаемое при удалении бутандиона гель-фильтрацией или при многократном разведении модифицированного фермента в щелочной среде, сопровождается увеличением числа субъединиц, способных реагировать с субстратом с образованием ацил-фермента (рис.4). Полученные результаты говорят о том, что наблюдаемая неэквивалентность субъединиц обратима.

14

£ 3

"ч

и 10 30 40 50 м сскшы

Рис. 4. Обратимость полу центровой реактивности, вызываемо! модификацией аргининовых остатков. Титрование активных центров нативной и модифицированной ГА4Щ 3-ФГА. Условия проведения реакции даны в подписи к рис.3. I- нативный фермент; 2 - модифицированный фермент, сохранивший Б* остаточной активности; 3- модифицированный фермент поело удаления бутандиона в «елочной среде (рН 8,3),восстановивший БОХ активности.

'На рис.5 показана реакция нативной к модифицированной ГАфЦ с ДТНБ. В соответствии с установленным механизмом реакции, первая стадия заключается в модификации цистеина-иэ, что влечет за собой конформационные изменения в молекуле белка, *»-

лащие доступными остальные цистеины (Barate et al. 1976]. Таким образом происходит постепенное "разворачивание* молекулы белка, приводящее в итоге к модификации 16 цистеинов на тетрамер. Недоступность цистеинов-149 для ДТНВ (например, в результате кар-боксиметилироования) приводит к полному блокированию реакции. В случае модификации аргининового Остатка мы видим защиту половины от общего числа SH-груш, титруемых ДТНБ у нативногр белка (рис.Б, кривая 2), что говорит о недоступности двух цистеинов-149 для ДТНБ в тетрамере модифицированной ГАФД.

Рис.5. Титрование БН-групп нативной и модифицированной ГАФД ДТНБ. Реакционная смесь содержала 50 мМ меданаловый буфер (рН 8,3). 0,1 Ш ДТНБ, 6,4 мкЫ ГАФД. Образец с модифицированной ГАФД содержал также 20 мМ бутандион. Кривая I - нативная ГАфЦ; кривая 2 - модифицированная .ГАФД. Стрелкой хюказан момент

добавления мочевины до конечной концентрации 6 М. *

Наблюдаемая защита в данном случав не связана с ковадентной модификацией цистеинов, а скорее объясняется ах хонформационной недоступностью, поскольку недоставдие БН-грушш оттитровываются в присутствии 6 Ы мочевины, вызыващэй денатурацию фермента.

На рис.6, показано тушение полосы Рэкера в результате включения йодацетамяда в активный' центр нативиой в модифицированной ГЛФД. В случае модифицированного фермента йодацетамнд включается в половину активных центров. Аналогичные результаты были получены при модификации ГАФД йодацетатом.

ел*

®

и о

5

о с

Рис .'6. Включение йодацетамяда в активный центр натавной (I) И модифицированной (2) ГАОД.

Реакционная смесь содержала. 50 ММ мединаловый буфер (рН 8.0), О,Б М НЛО*. 7 юМ ГАфД. Реакцию начинали добавлением 0.2 1*1 Яодацетамада.

минуты

На рис.7 показано включение ацетиыаа груш в актхзшй центр натавной я модафщироваиной ГАОД в холе реакции с р-нжтрсфенклацвтатом. Реакция включает две стада: Систров аця-тшшровавме ая-групп (реакция I) в медгенный пиролиз ацетил-фвриеита (реакция 2):

В-в-ОЧЯд —СНз-О-ЧИ + Я-вЯ (й)

Иодабихацвя аргтажноэого остатка ираэодат к уменьями» взитеешя вдимыи груш в езстюкый цгктр иртЛжгятвлызо

J

вдвое,, ве оказывая существенного влияния на скорость реакции (табл.1). Особенность данной реакции заключается в том, что она катализируется только апоформой ГАОД, поскольку NAD* ингибирует ацетилирование . Следовательно, образование тройного комплекса не является обязательным для проявления асимметрии тетра-мера. С другой стороны, влияние исследуемого аргишшового остатка на катализ заметно только при образовании тройного комплекса.

таблица i.

Параметры реакции гидролиза р-нитрофенилацетата, катализируемой нативной и модифицированной ГАФД из мышц кролика. Условия реакции: 40 мм mops рН 7,4, I vU pNPA, 6 мкм ГАФД. Измерения проводились при 20°0.

препарат включение ацетильных к ацетила- к гидролиза, фермента груш, моль/тетрамер рования.ыин-1 мин-1

1. нативный 3,04 4,17 0,067

2, модвфщ. 1,64 2,08 0,069 '

Учитывая полученные результаты, можно заключить, что модифицированный фермент оказывается зафиксированным в асимметричном состоянии, в котором две субъединицы тетрамера ве реагируют с sh-peагентами, в том числе с естественным субстратом -з-фга.

1 2 3 4 5 6

МИНУТЫ

Рис.7. Реакция апофермэнта ГАЗЩ о р~нитрофенилацетатом. Реакционная смесь содержала 40 мМ НОРЗ (рН 7,4), I мЫ рНРА, 6 мхЫ ГАФД. 1- нативный фермент; 2- модифицированный фермент.

5. Исследование влияния модификации аргининов на каталитические свойства функционирующих активных центров.

Одно мэ направлений работы было связано о исследованием свойств суС-ьединиц, сохранивших способность катализировать окисление 3-ФГА. с цель» получения шформацйи о влиянии модификации аргининового остатка на состояние данных активных центров было исследовано влияние рН на инактивацию нативяой и модвфици-рованной ГАФД йодацетамидом. Значения рК для цис?генна-14Э, определенные из кривых ¡^-зависимости анахтивацци нативной н моди&вдфовенной холо-ГАЗД йодацетамидом, оказались равными

9,17 и 9,4 соответственно: для нативного а аодгфпззрэзанного

• 2

апоферманта были получены значения рК 9,17 и Юс0. Пз гаченные результата позволили сделать шэод, что иодввишщя арпшивового сстатка практически е» влшгэт ва резкщгоннус способность зн-грушш активного центра з хаталитичеаи актквзюй хояокав&ор-

мации; влияние модификации аргинина на свойства цистеина-149 заметно только в аноформе. Таким образом, изменение каталитических свойств Функционирующих субъедкниц не связано с изменением свойств цистеинов. По-видимому, существуют какие-то другие факторы, позволяющие влиять на эффективность катализа, не затрагивая свойств SH-rpynn. Возможно вту роль выполняет арга-ниновый остаток.

Дальнейшие исследования были связаны с изучением возможной роли гуанидиновой группы аргинина в каталитическом механизме ГА4Д. Реакция окисления 0-глицеральдегид-З-фоофата включает следующие стадии: акт океидоредукции, происходящий после образования тиополуацеталя и аавершапцийся ацилированием Оув-149, протонированием Н1в-17б и образованием №ШН, прочно связанного с белком (I); ковариационный переход, сопровождающий аамену НАШ, связанного' о Эгфоофоглицероил-ферментом, на NAD* (г) н стадию фосфоролиза, сопряженную с дапротонированием Н1а-17б О)»

E-SH + R-(ÍH —г-в NAD* NAD

NACH

E-fi-^H +H1D1 B-8-

МАШ NAD+

2- HOPO-

P 3

B-S-O-ft B-SH + R

KADf NAD*

И

А

(1)

R (2)

-C-O-PO3 (3)

Ыы исследовали, как отражается модификация аргининового

остатка на способности фермента осуществлять отдельные стадии реакций. Скорость реакции (I) измеряли в предстационарном режиме..В табл.2, приведены величины констант скорости первого порядка окислительной стадии реакции, рассчитанные из кинетических кривых, полученных с нативным и модифицированным ферментами. Из таблицы видно, что модификация аргишшового остатка резко сказывается на скорости оксидоредукции, уменьяая коне- . танту скорости этой стадии в 20-25 раз в случае фермента из мышц кролика и в 60 раз в случав дрожжевого фермента. Для сравнения в таблице приведены величины констант скорости окислительного фосфоралирования »-глицеральдегад -3-фосфата, набя»-

ТАБЛИЦА 2.

Влияние модификации ергиниаовых остатков ГДФД на параметры дегидрогчназной реакции.

препарат включение константа скорости константа скорости

фермента яцццьянх групп. окислительной стадии полной реакция.

моль/тетрамер 1Ц, о-1 V о"1

фермент

из шшц

кролика:

натнвяый 3,8 101 во

иодяфиц. 2,2 3,7 . 3,4

фэршн? из *

дрожжей:

ЦЕТНвгшй 3.7 72 36

тдв$8ц. 3,2 1.3 1,6

даемые в стационарном режиме. В случае модифицированного фер мента константа скорости окислительной стадии реакции близка по величине к константе скорости полной реакции. Возможно, именно окислительная стадия (I) исследуемой реакции становится лимитирующей. ■

ТАБЛИЦА 3.

Влияние модификации аргининовых остатков глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на скорость фосфоролиза ацил-фермента. Условия реакции: 50 мМ мединаловый буфер, рН 8,3; I мМ NACt 1 мЫ 3-ФГА, 5 мМ ЭДТА; концентрация К3РОд изменялась в пределах 0,1 - 0,5 мМ. Каждая проба содержала 5-10 мкг нативной ГАФД или

50-100 мкг модифицированной.

" i '

константа скорости фосфоролиза ацил-фермента, М-1с~1

препарат -

фермента фермент из мышц кролика фермент из дрожжей

з з

30*10 40*10

э з

3,6'Ю I.M0

Возможность участия аргининового остатка на стадии фосфоролиза ацил-фермента исследовали с использованием экспериментального подхода, предложенного е работе Армстронга и Трентхэма [Armstrong and Trentham, 1976]. Реакцию окислительного фосфорилирования Гьглицеральдегид-З-фзсфата про-

кативши модифиц.

слежнвали в стационарном режиме, измеряя скорость образования №ШН в присутствии низких концентраций неорганического фосфата ( в пределах 0,1-0,5 Кт). Скорость реакции в условиях эксперимента прямо пропорциональна концентрации фосфата. Величина констант скорости второго порядка, рассчитанные из экспериментальных данных, приведены в табл. З.-Из этих данных можно заключить, что модк&жация аргининового Остатка оказывает существенное влияние на стадию фосфоролиза ацил-фермента.

Из приведенных результатов следует, что модификация вргины-нового остатка заметно влияет на эффективность различных стадий дегидрогеназной реакции; особенно ярко выражено влияние на первую (окислительную) стадии.

Сравнивая данные, характеризуйте влияние модификации аргининов на эффективность катализа двух разных реакций - эсторазной и дегидрогеназной, нетрудно заметить, насколько суврствен-ным оказывается это влияние в случае реакции окисления 3-ФГА и, наоборот, практически незаметным в случае реакции гидролиза р-ннтрофенилацетата. Влияние модификации аргнниновых остатков на скорость реакции цнстеинов активного центра с модификаторами также мало выражено: константа скорости инактивации цнстеинов при инкубации шдзфщированиой ГАФД с йодацэтатсм ила йодоцет-аквдом незначительно ниже таковсЯ для натжиого формента. Эта данные позволял?? предполагать, что функция аргинина в катализо реализуется только а тройной комплексе и спэцкЗочяа только для дэгпдрогеаззной реакции: однско асзосютрия »з/гЗгцзревешого тетрамера проявляется во всех рассмотренных нкан козфориациях -а оиофсрмо, в холоформо а также в тройном комплексе.

>

- 22 -выводу:

¡.Инкубация ГАФД из мышц кролика с 2.3-бутандионом приводит к модификации одного аргининового остатка на субъединицу, что сопровождается потерей 95$ дегидрогеназной активности. Наблюдаемая остаточная активность не зависит от условий модификации и является постоянной для данного препарата величиной, характеризующей свойства фермента, модифицированного по аргининовым остаткам.

2. Сопоставление полученных данных с литературными позволяет предполагать, что модифицируемым аргининовым остатком является аргинин активного центра арг-231.

3. Модифицированный фермент сохраняет способность к связыванию HAS*: - сохраняется стехиометрия связывания и отрицательный характер кооператишорти. Значения Кд для третьего и четвертого , участков связывания равны 0,038 мкМ и 2,2 мкМ в случае нативной ГАФД и 0,052 мкМ и 3,6 мкМ в случае модифицированной ГАФД.

4. Модификация аргининового остатка приводит к возникновению асимметричной структуры тетрамера ГАФД, в которой половина активных центров не способна взаимодействовать с естественным субстратом (3-ФГА), а такие с псевдосубстратами и модификаторами (р-нитрофенилацетат, ДГНБ, йодацетат, йодацетамид). Другая половина активных центров модифицированного тетрамера сохраняет способность взаимодействовать с SH-peагентами, . а также осуществлять катализ- дегидрогеназной и встеразной реакций. Таким образом, разработан новый подход для изучения явления □олуцентровой реактивности ГАФД путем стабилизации фермента в асимметричном состоянии.-

6. Модификация аргининовых остатков не оказывает существенного влияния на рК функционирующих зя-групп в холоконформации. 6. Модификация аргшшновых остатков существенно влияет па различные стадии дегидрогеназвой реакции; особенно выражено влияние на окислительную стадию реакции, которая возможет стано-• вится скоростьлимитирупзей. При в том модайнкацяя арстшнов вэ оказывает влияния на параметры встерйзной реакции. Полученные данные позволяют заключить, что функция аргинина в катализе реализуется только в тройном комплексе ( фермент-1Ш>+-суСстрат) в специфична для дегидрогеназной реакции.

Список работ. апиЫЖОВАННЫХ ПО теме диссертации:

1. R.A. Aaryants, E.U.Kuzminekaya, V.I.Tlehkov, 1.7. Douzhen-kova and N.K.Nagradova "An examination of the role of arginino residues In the functioning or D-glyoeraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase", BBA, Y. 997. P.159 -166 (1989).

2. E.U.Kuzrainskaya, R.A. Asryants and N.K.Nagradova "Rabbit musole tetramerlo D-glyoeraldehyde-3-phoBphate dehydrogenase 1в looked In the aeysmetrlo state by ohemioal modification of a 8Ingle arglnlne per subunlt", BBA. V. 1075. P. 123-130 (1991).

3. N.K.Nagradova, E.U.Kuzmlnskaya, R.A. Aaryants "D-glyoeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Studlee on the functional asynmetry of the tetramer", Abst. of the 27-th Annual Hatting of Polish Bloohemloal Soolety, Lublin, p. R-30, (1991).

4. Наградова H.K., Ку8Ьминская E.B."функциональные свойства О-глицеральдегвд-З-форфатдегидрогенази из мыщ кролика, модифицированной по аргдаиновым остаткам", Тезисы докладов 6 Всесоюзной конференции по биохимии ыышц, Тбилиси, с. 198, П98Э)

5. Кузьминская Е.В., Асриянц P.À., Тишков В.И., Наградова Н.К. "Аргининовый остаток в активном центре В - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Участив в отдельных стадиях катализа". Биохимия, 55. 938-945 (1990).

6. N.K.Nagradova, R.A. Asryante, E.U.Kuzmlnekaya, T.I.Huronets M D-glyoeraldehyde-3 -phoephate dehydrogenase", Abstr.7 symposium "Enzyme engenlerlng", p.6 (1991).

7. E.Y.Kuzmlnskaya, R.A.Asryants, N.K.Nagradova, "Rabbit musole D-glyoeraldehyde-3-phoaphate dehydrogenase. Half of the sites reactivity of the enzyme modified at arglnlne residues", Bioohem.Blophys.Ree. Сошп., V. 187, N 2, P. 577-583 (1992).