Изучение свойств гамма-интерферон- и TNF- связывающих белков ортопоксвирусов

Непомнящих, Татьяна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств гамма-интерферон- и TNF- связывающих белков ортопоксвирусов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств гамма-интерферон- и TNF- связывающих белков ортопоксвирусов"

На правах рукописи

Непомнящих Татьяна Сергеевна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГАММА-ИНТЕРФЕРОН- И TNF СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ОРТОПОКСВИРУСОВ

03.00.03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2006

Работа выполнена & Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвитш России

Научный руководитель

кандидат биологических наук Гилева Ирина Павловна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Загребельн ый Станислав Николаевич кандидат биологических наук Серегин Сергей Викторович

Ведущая организация

ГУ Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится <ф> декабря 2006 г. в Ц часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ В Б «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан «1» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г.Малыгин

Общая характеристик« работы

Актуальность проблемы. Интерферон гамма (IFNy) и фактор некроза опухолей

(TNF) являются важными регуляторами всех аспектов функционирования иммунной системы, включая дифференцировку лимфоидных клеток, воспаление, развитие адаптивного иммунного ответа, иммунологической памяти, толерантности (Mach et al, 1996; Boehra et a!., 1997; Blam et al., 2001; Schottelius et al, 2004; Schroder et al., 2004; Яршган, 1999). Именно из-за центральной роли в регуляции защитных реакций организма, а также большого разнообразия своих биологических активностей, гиперпродутада* TNF и IFNy приводит к развитию патологических состояний человека и животных, сопровождающихся хроническими воспалительными и/или аутоиммунными реакциями (Keffer et al, 1991; Okamoto et al, 1998; Mease, 2002; Sbealy et al., 2002; Schroder et a}., 2004; Baccala etaL, 2005).

Эффективной стратегией терапии таких состояний является применение препаратов, способных ннгибнроват* экспрессию и/или биологическую активность этих штгоюшов. Б последние годы в клинической практике широко применяются антагошклы шгтокииов, полученные на основе растворимых рецепторов или моноклональных антител. Биологическая терапия ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, псориаза и других заболеваний показала свою эффективность, высокую специфичность действия и безопасность (Feldmacn et al, 2001; Breedveld and Kalden, 2004; De Keyser el al, 2006; Sandbom and Faubion, 2004; Knieger and Caltis, 2004; Skurkovich and Skurkovich, 2003, 2006). Однако антицигокнновые препараты обладают различной терапевтической эффективностью при лечении различных патологий (Chung el al., 2009; Kwon et al, 2003; Henriksen and Newby, 2003; Mpofu et al, 2005), и, кроме того, эффективность терапии, по-видимому, зависит и от индивидуальных особенностей пациентов (Aug and Helfgott, 2003; Moots eta!., 2003; van Vollenbovea et al., 2003a,b; Mpofu et al., 200S), поэтому необходимо расширение спектра аити-ГРЫу и анти-TNF препаратов, применяемых в клинической практике.

Геномы поксвирусов кодируют белковые факторы, эффективно нейтрализующие антивирусный ответ организма-хозяина, внгибнруя процессы апотюа, продукцию ингерферонов, хемокинов и воспалительных цигокннов, активность системы комплемента (Seet et al, 2003). TNF- н IFNy-связывающие белки ©ртопоксвирусов могут стать основой для создания новых терапевтических цитокин-связывающнх препаратов.

Цели и задачи исследования. Цепью настоящего исследования было сравнительное изучение физико-химических и биологических свойств ортопоксекрусных TNF- и IFNy-св взывающих белков для оценки их терапевтического потенциала

Дня достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: ]. компьютерный анализ аминокислотных последовательностей TNF- и IFNy-связывающих белков ортопоксвнрусов с целью выявления видоспецнфическнх отличий и выбор белков для последующего изучения их биологических свойств;

2. получение бакуловирусов, детерминирующих синтез в клетках насекомых IFNy-свяэьюающего белка вируса оспы обезьян и химерных иммуноадгезивных TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров;

3. оптимизация экспрессии IFNy- и TNF- связывающих белков ортопоксвнрусов в клетках насекомых и разработка методов их выделения;

. 4, сравнительное изучение физико-химических н (итологических свойств р.екомбинанпшх [РКу-сввзываюших белков ортопоксвнрусов;

5. сравнительное изучение физико-химических, нымунохимических к биологических свойств рекомбинантиых TNF-яязывающвх белков ортопоксвнрусов;

6. оценка потенциала TNF-связывающих белков ортопоксвнрусов как возможных TNF-шггагоннстов,

Научная новизна и прикгнчюкяя значимость работы. Получены и депонированы в музее ГНЦ ВБ «Вектор» бакуловврусы, детерминирующие синтез в клетках насекомых IFNy-связывающего белка вируса оспы обезьян и химерных иммуноадгезивных TNF-свтьюающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров. Показано, что рекомбинантные IFNy-связываюшие белки вирусов натуральной оспы и оспы обезьян нейтрализуют антивирусную активность IFNy человека in vitro. Показано, что TNF-свящванЛцис белки вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян различаются по эффективности лнгибнрованияцнтотокснческого действия человеческого, мышиного, кроличьего TNF и человеческого лимфотоксина а на клетках мышиных фибробластов L929; TNF-связывающий белок ' вируса натуральной оспы и его иммуноадгеэивный вариант обладают достоверным терапевтическим эффектом, ослабляя морфологическую картину проявления зндотоксического шока у мышей и способствуя выживаемости животных. In vitro показано, что TNF-иеЙтралнэующа* активность TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы превышает аналогичные эффекты поликпоыальных антител к TNF, растворимых клеточных TNF-рецепторов первого и второго типов, TNF-нейтрализующего моиоклоиального антитела МАК 195.

Положения, выиоеимые на защиту. ]. Получены бакуловнрусы, детерминирующие синтез в клетках насекомых IFNy-связывающего белка вируса оспы обезьян и химерных нммуноадгезивных вариантов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров.

2, Специфичные аминокислотные замены TNF-связывающтс белков ортопоксвирусов реализуются в различных физико-химических свойствах рекомбинаятных белков,

3. TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы обладает терапевтическим эффектом, способствуя выживаемости мышей с эндотоксическнм шоком; In vitro TNF -нейтрализующая активность злого белка превышает аналогичные эффекты пояикдояалыаых антител к hTNF, растворимых клеточных TNF-рецепторов и соизмерима с активностью TNF-нейтрализующего моноклональвого антитела МАК 195.

Апробация работы и пу&ликации. По результатам работы опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, получена справка в приоритете на патеят, а также сделано 10 сообщений на всероссийских и международных научных конференций.

Структура в объем диссертации. Диссертационная работа состоит аз введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов н указателя цитируемой литературы (325 источников на английском языке, 16 на русском). Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 39 рисунков и 15 таблиц.

Вклад автора. Автором лично осуществлен компьютерный анализ аминокислотных последовательностей; получены рекомбинангаые бакуловнрусы, продуцирующие интерферон гамма связывающий белок (IFNyBP) вируса оспы обезьян (MPXV), иммуноадгезивные варианты TNF-связывающих белков (CimB/IgGl) вирусов оспы коров (CPXV) и натуральной оспы (VARV); проведено изучение экспрессии генов TNF-связывающего белка (СппВ) VARV, CPXV-QtoB, MPXV-CnnB, VARV-CrmB/IgGl, CPXV-CrmB/IgGl, VARV-tFNyBP и MPXV-IFNyBP в линии клеток насекомых SEI; проведена характернзация рекомбинантных вирусных белков методами веслерн-блот анализа и электрофореза; проведено изучение биологической активности вирусных рекомбинатных белков tu vitro. Иммунизация кроликов и получение иммунных сывороток осуществлено Рязаикшым И. А. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии осуществлена Лебедевым Л.Р. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Изучение биологической активности вирусных CrmB itt vivo проводилось ГражданцевоЙ A.A., КочневоЙ ГЛ. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») при участии автора. Клонирование фрагмента IgGl

осуществлено Муршпевым Б.В. (Институт особа чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург). Характеризашя рекомбииангных CrmB методом твердофазного нммунофермеитвого анализа (ИФА) проводилась Афиногеновой Г.Н., Пусгошиловой U.M. {ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Гистологические исследования осуществлены Малковой Е.М., Виноградовым И.В., Рябчиковой ЕЛ. (ФГУН ГНЦ BE «Вектор»),

Основное содержание работы 1, Компьютерный ян алии аминокислотных последовательностей IFN7-связывяющнх белков ортопокевирусов

Гены, кодирующие IFNyBP, обнаружены практически у всех представителей рода Orthopoxvirus. Для проведения настоящего исследования был проведен поиск в международном банке данных (GenBank) всех известных структур генов IFNyBP ортопокевирусов, принадлежащих видам VARV, CPXV. MPXV II вируса осиовакцины (VACV). В качестве референса для поиска использовали CPXV-BRI (AF482738), Последовательности генов IFNyBP на момент поиска были известны для 35 штаммов указанных видов. С помощью программы MUSCLE Э.б.(Edgar, 2004) было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей (рис. 1).

Проведенный компьютерный анализ аминокислотных последовательностей IFNfBP ортопокевирусов показал, что процент внутривидовой гомологии аминокислотных последовательностей составляет 98-100 % для VARV, 91-100% для CPXV, 98-100 % дм MPXV, 98-100W для VACV. Межвидовая гомология составляет 8689 % для VARV и VACV, 89-94 У. да* VARV и CPXV, 89-90 % для VARV и MPXV, 8997 % для VACV и CPXV, 90-94 % дня CPXV и MPXV, 93-96 % для VACV и MPXV. Из этих данных следует, что различил в первичной структуре белков не очень значительны, однако некоторые из имеющихся видоспецифичкых аминокислотных замен неконсервативны и ' потенциально могут обуславливать вадоспецифнчяые различия в биологических свойствах бепховых молекул. Большинство аминокислотных замен наблюдается в сигнальных пептидах к в С-концевых районах анализируемых белков. Поскольку сослать вывод о различиях биологической . активности на основании проведенного анализа аминокислотных последовательностей не представляете« возможным, для дальнейшей работы выбраны IFNyBP наиболее патогенных для человека ортопокевирусов VARV и MPXV.

CPXV1 Af48 27 581 SRI cm 1Ï943531ЙЙ1-1ЭЭ0 VARVI ¡£691981IND-1967 WVIÏ1208il£3ui-196i КШГ lAF38 01361Zai re-19 9 6 МЯПГ ¡оа(!1Ш41СОК-200Э VaCVIM35027|COP VACViAï243312lim

cpxviw4a27SBiBRi CFXV1X94355IGRI-i990 VMVixi3i38im>-i967 vmv i xT2 08 e i saa-ш 6 MfXV IAF3 m Э maire-1996 HPXV ийошмюгамооз

VKVIM3502Tf£MP 1/ЮЛ AT2433121 Nft

MRS -VILTVLLIU5 ^SÏKIXSVWBSKIEMTGO£n,l

1J1S1 KOTGIKTf»OHWITMVFESTïm^GFEKNBmftm:FEQGOTmKÏCTGLCTlV

.,YII. .A. .F.. ..Н к...................... .........г...........I.................................

..YII..A. .F....H

kicpmtlte ïeminlïlehpïatwkixipiïkrnemccrïllïk preit5idi)m^tgcside5ittekvcwaûgategfi,bkit

........■.....................................

:::::::T:::::.il,:;::::::::.;;;:::::::.::::.

.......s____d.....1..................g...........

cew|an827s9 ibm cpwix943s5igai-1990 t№v |x69190 пн&-ш7 VMVIXT2 0 8 61GHR-1 >6 6

MSSEVCLTPKKHVYTC«ra№IWHFKI»H№WKRKniKœ^

....................................................g......t.г.....ltkîs

mpxvijuf3atn38iz»ijt«-i996 ..............................................g......т.е.,s,.----

нипг|ю0ш54|си(-2003 ...............................|____it...............g......t.f..ï..-----

тает i mjs0271 сор ....................................................g......т. f____hltkïs

таст1А1243Пг|»к ....к.......s.......................................s......т. г....hltkïs

271 266 266 266 167 267

272 272

Ряс. 1. Сравнительный анализ амянокяшггных ооследовлтельвостеВ ортопокхвирусиьп IFNt-* называющих белков.

Аминокислотные остатки, идентичные CPXV | AF4827581 BRI, обозначены точками, делении - прочерком. Амияогаслотвые последовательности подписаны следующим образом: вид ортоноксвируса | номер в GeaBank | штаым ортопоксвируса. Серыми и черными блоками, жирным шрифтом обозначены ввдоспецифичные аминокислотные замены для вируса оспы обезьян, вируса натуральной оспы и вируса осповакшшы, соответственно. Потенциальные сайты N-гликозщшровашм заключены в рамку. Вертикальной линией обозначены потенциальные сайты отщепления сигнальных пептидов.

2. Компьютерный |ииш1 аминокислотных последовательностей TNF-связывающих белков ортопоксвирусов

В геноме CPXV, характеризующегося наиболее широким кругом хозяев, выявлены несколько генов, белковые продукты которых в той или иной степени гомологичны клеточному рецептору TNF. В геномах VARV и MPXV присутствует только один такой ген - сгтВ. Для определенна вндоспецифичных особенностей аминокислотной последовательности CimB в международном банке данных (GenBaiik) был осуществлен поиск всех известных структур этих генов ортопоксвирусов, принадлежащих видам VARV, CPXV, и MPXV. В качестве референеа для поиска использовали CPXV-BRI (AF482738). Структуры CrmB для этих видов ортопоксвирусов на момент поиска были известны для 46 штаммов. С помощью программы MUSCLE 3.6 (Edgar, 2004) было осуществлено выравнивание аминокислотных последовательностей. Процент внутривидовой гомологии эрих последовательностей составляет 98-100 % дм VARV, 85100 % для CPXV, 99-100% для MPXV. Межвидовая гомология составляет 82-91 % для

VARV и CPXV. 84-96 % дом VARV и MPXV, 82-92 % для CPXV и MPXV. Таким образом, 1

отличия первичной структуры анализируемых белков не столь велики, однако разлитая в аминокислотном составе лидервых пептонов могут обуславливать различное положение сайга отщепления лндерного петида — между 22 и 23 либо 21 и 22 аминокислотными остатками у VARV, между 18 и 19 либо 20 и 21 аминокислотными остатками у CPXV, между 18 и 19 аминокислотными остатками' у MPXV; имеющиеся аминокислотные замены могут обуславливать вцдоспецифичные различия в характере N-гликоэилироваяня белковых молекул; некоторые из имеющихся неконсервативных вндоспецифичных аминокислотных замен расположены в лиганд-свяэываюших участках я потенциально могут обуславливать видоспецнфические разлитая в биологических свойствах этих CrmB.

Гомология VARV-, CPXV- и MPXV-CrmB с экстраклеточнымн доменами TNF рецептора (R) 1 и TNFRII составляет около 47 % и 54 %, соответственно. Используя базу данных консервативных доменов CDD (March! er-Bauer et aL, 2005), в составе CrraB были найдены участка, гомологичные 50s-и 90s- петлям домена «100185 белков, объединенных в обширное семейство TNF-рецепторов (табл. 1). Это семейство белков при относительно низкой гомологии аминокислотных последовательностей (не более 20 %) имеет сходную пространственную структуру лнганд-связывающего участка. Проведенный анализ выявил, что VAR.V-, CPXV- и MPXV-CrmB имеют в этих районах видоспецафичиые аминокислотные замены, и некоторые из них являются неконсервативными, что позволяет прогнозировать различную эффективность взаимодействия вирусных белков с лнгандаын. Данные проведенного компьютерного анализа убедили в необходимости сравнительного изучения VARV-, CPXV- и MPXV-CrmB.

Табл. I. Лиганд-связывжющве участки "ШК-рецепториого домен*

мрху]Агэв01зе| гм-1996-1-161 ИРХУ 1^8854 Л гы-1996-171 МРХУ1ив78411гА:£-1996-16| Н£ХУЩ87В47 12А1-191 9-00051 МРКУ (ад 111551 гм-т9-ой51 МР*У|ивв142|гМ-1970| ирстюоо11154|сс<н-2003-з5а| ИРХУ108784 51 197 7-0 6 661 МРХУ|АГМ15Я1 !К1Ы МИСУ1087 31 97 0-0 2 661 М№|Сд011153|и£А-20аЭ-044| ИРХУ)АУ603973!1ЩАЫ17-«| ИРШ 0001115 €! 1,1В-197 0-184 I НР)Г<> I и87 99 51 СОР-1958} тху|иа7 942|ыв-197а-01а7| иеху | [>00111571 ЖА-гООЗ-ОЗЭ! НРХУ|ив7994 1СОР-1959 I МРХУ|ЛУ753185|СОР-1958| ИР5СУ|Ц8814 415ТС-йо«вгс1ат-1965 I ОТХУ|ОВа143|ИИР-1961| _

_50з 1оор

+ 4- +

таг емнитьсьас-вКСг

ТЕКНКШ.РАСЬЕСИ1ЖСа

_ЭОз 1оор

#«#*# Ье кдеОСТ*1>САр1 г

иссззескдсузат

Аминокислотные остатки, идентичные СРХУ-ВЫ, обозначены точками, делении -прочерком. Последовательности подписаны следующим образом: вид | помер в ОепВапк | пггамм. Вндоспецифнчные неконсервативные аминокислотные замены отмечены «■+» вверху строки. Серыми и черными блоками обозначены видоснецифичлые аминокислотные замены дли вируса оспы обезьян и вируса натуральвой. оспы, соответственно. Знаком «#» обозначены аминокислоты, важные для связывания диганда (МагсЫет-Ваиегееа(, 2005).

3, Получение рекомбиияятных бякуловируеоа, продуцирующих IFNf-связываю шнй белок MPXV и хн мерные нммуноядгезявные варианты TNF-связывающих белков CPXV и VARV

Фрагмент ДНК, содержащий ген Ь9г MPXV (штамм Zaire-96) получили с помощью ПЦР из вирусного генома, клонировали в пдазмиде интеграции pFastBacl («Invitrogen», США), затем посредством сайт-специфической транспозиции в клетках Е, coli DHlOBac получили рекомбинаипгую бакмиду.

Как правило, химерные белки, содержащие IgO-фрагмеит, представляют собой диеульфидно-связанные гомодимеры, которые напоминают молекулу IgG, но не содержат CHI-домен и легкую цепь. Для получения иммуноадгезнвкых CtmB, выбрали фрагмент тяжелой цепн иммуноглобулина человека, включающий в себя шарнирный район, СН2- и СНЗ-домены (рис. 2). Сохранение шарнирного района тяжелой цепи IgG при конструировании химерного бедка способствует правильной укладке доменов и помогает сохранить функции обеих частей молекулы (Chajnow and Ashkenazi, 1996).

Рис. 1. Схема строения молекул CrmB (A), IgGl человека(Б) и химерной молекулы С г т B/Ig Gl (В).

Фрагменты ДНК, содержащие гены g2r вируса натуральной оспы (штамм India-1967) и i4r вируса оспы коров (штамм GRI-90) без терминирующих кодонов, получали с помощью ПЦР, используя в качестве матриц созданные нами ранее коллекции гибридных плазмцд, содержащих фрагменты ДНК VARV (Щелкунов и др., 1992) и CPXV (Рязанкнна и др., 2000). ПЦР-фрагмевты а фрагмент IgGl, выделенный из плаэмкды pBluescriptllSK-IgGl, клонировали в пдазмиде интеграции pFastBacl («Invitrogen», США), затем посредством сайт-специфической транспозиции в клетках Е. coli DHlOBac получили режомбинашиые бакыиды.

После трансфекдии полученными рекомбннакшыми бакмндными ДНК н векторной бакмидной ДНК линия клеток SOI отобрали рекомбинантные бахуловирусы BvB9RZ, BvG2RIgO и BvMRIgG н векторный бакуловнрус Bv, Подученные рекомбинантные бакуловирусы были депонированы в музее ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

4. Экспрессия IFN-f- h TNF-связываюшнх белков ортопокс вн pyto в в клетках насекомых линии Sf21

Наличие рекомбинантных белков в культуральной среде клеток Sf2î, зараженных рекомбннантными бакуловирусами, подтверждали определением специфической биологической активности. Показано, что культуральная среда клеток SÎ21, зараженных рекомбннантными Вакуловируеамя BvG2RIgG, BvMEIgG, ВТШ67, BTRz96 или BTRgt90, обладает дозозависимой TNF-нейтралнзующей активностью, культурадьная среда клеток SOI, зараженных рскомбинантными бакуловирусами BvBSRZ или BvB9RI обладает дозозависимой IFNy-неЙтрагиэующей активностью (данные не приведены).

Продукцию рекомбинантных белков в клетках насекомых оптимизировали, варьируя множественность заражения рскомбинантными бакуловирусами и продолжительность инфекции. Клетки пинии SOI заражали рекомбннантными бакуловирусами при множественности заражения 1, ОЛ и 0.01 БОЕ/клетку н иа 1-8 сутки после заражения отбирали аликвоты культуральных сред. Динамику накопления рекомбинантных продуктов в среде культивирования инфицированных клеток изучали при помощи дот-блот анализа. Обработку мембран проводили сыворотками, полученными иммунизацией кроликов очищенным белком GEX/VARV-OmB (Ryazankina et al., 1998) либо очищенным рекомбинамным бактериальным VARV-IFN-yBP (Seregiû et ai, 1996). Для рекомбинантных бакуловирусов, экспресснрующих гены CrmB, максимальный выход продукта наблюдали при множественности заражении 0.01 БОЕ/клетку на шестые сутки после заражения (на рис. 3 приведены данные для MPXV-CrmB), для рекомбинантных бакуло вирусов, экслрессирующих гены IFNyBP, — при множественности заражения 0.01 БОЕ/клетку на шестые-седьмые сутки после заражения (данные не приведены).

сутки инфекции 1 3 4 5 6 7 8 с* Дот-блот анализ .....,..... • ~™,,г,. культуральной среды клеток

0.01 бое/ ;"- V К Т'йй ^» V7**^soi, зараженных клетег • ' • .. w : рекомбннантнын

к1 i '„"; j: ''' L" " ■¿¿Ф^ - ' 5 бакуловн русом,

м БОЕ/ ?нрадудирующн« MPXV-****** ? ; . ■-,- на 1-8 сутки после

I вое/ ' ;fe ;5v-г - '»pw^M««»-

5. Очистка рекомбинаитиых белков

Рекоыбннантвые белки выаемлн из кульгуральной среды с помощью аффинной хроматографии. В качестве аффинных сорбентов использовали ультрагель АсА34 с иммобилизованным IFNy человека (h) либо hTNP иди сефарозу CL-6B с иммобилизованным белком А. Выход целевых белков из 1 я культуральной жидкости инфицированных клеток составил 0.7-1.0 мг для MPXV-IFNyBP, 0.8-1.2 мг для VARV-IFNyBP, 0.2-0.3 мг для MPXV-CrmB, 0.4-0.6 мг дм CPXV-CrmB, 0.9-1.2 мг дм VARV-СппВ, 4.0-5.5 мг для CimB/IgGl.

6. Элекгрофорети ческое фракционирование рекомбинактных VARV-IKNyBP и MPXV-IFNyBP

Результаты злепрофоретического анализа аффинкоачищенных препаратов рекомбинаитных VARV-IFNyBP и MPXV-lFNyBP представлены на рис. 4. В редуцирующих условие* (в присутствии 2-меркато этанола) эяектрофоретическая подвижность рекомбннантных белков соответствует попипептидам с молекулярными массами около 35 кДа (рис. 4, дорожки 3, 4), а в нередуцирующнх (в отсутствии 2-меркаптоэтаиола) - около 65 кДа (рис. 4, дорожки 1,2), что соответствует мономерным н димерным формам IFNyBP, соответственно. Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными (Alcami «id Smith, 2002) для IFNyBP VACV, который также образует гомодимеры с молекулярной массой около 68 кДа. В этом заключается существенное отличие вирусных интерферон-связываюших белков от клеточных аналогов, димеризация которых происходит только в присутствии лиганда (Goodboum et ol, 2000). Д»мерная форма IFNy-смзывающих вирусных белков, возможно, увеличивает их способность связывать и ингибировать действие IFNy по сравненшо с клеточными

Ряс. 4. Электрофоретическое фракционирование препаратов рстбшпиш IFNyBP.

Электрофоретическос фракционирование препаратов рекомбинаитных MPXV-IFNyBP (дорожки 1, Э) и VARV-IFNyBP (дорожки 2,4) в редуцирующих (+) и нередуцирующнх (-) условиях. М—маркерные белки из набора «Prcstained SDS-PAGE Standards» («BioRad, США»), кДа

рецепторами.

7. Изучение биологической акта в мост к УАКУ.1П(тВР н МРХУг-1ИЧ-уВР//» \iiro Для того чтобы показать способность полученных рекомбинантных вирусных белков предотвращал, взаимодействие ЫШу с соответствующими рецепторами эукарнотнческих клеток, нсследоваля их способность янгибнровать защитное действие ЫРМу при заражении вирусом энцефаломиокардита мышей (ВЭМКМ) клеток линии Ь68. Результаты проведенного анализа, представленные на рис. 3, свидетельствуют, что вирусные белки нейтрализуют активность ЫГОт дозозависимым образом, причем 50 % нейтрализация действия ЫЕЗДу (4 нг/мл) долагасш прн концентрациях, равных 40-70 нг/мл и 100-140 нг/мл для УАЛУ-1ШгВР и МРХУ-1ШуВР, соответственно. Для контроля специфичности обнаруженных биологических эффектов вирусных интерферон-связывающих белков использовали синтезированный в бакулоенрусвой системе н выделенный методом аффняной хромеггографии УАКУ-СппВ. Добавление этого белка в реакционную смесь вместо ¡ЕТ^у-связываницнх белков не снимало защитный эффект ЫП+г.

Рис. 5. Иптнвнрованне рекомбии антн ыма 1 ИЧуБР антп вирусн ого действии ЫПЧу. По оси

абсцисс указаны концентрации соответствующих рекомбинантных

си> по но и и.и 9.4 *л вирусных белков в

княгатрнн |ГГ4[ВГ> мя УАЯУ-СгтВ, шт/тл ЛуНКв 96-ЛуНОЧНОГО

планшета; по оси —+ 1РМеВР1 ордашат - процент

-в-ь«8 + вэмкм + ыррц + УАНУ-1ГКкВР жизнеспособных клеток.

—о— 1.6 Я + ВЭМКМ + ЫР^ + МРХУ-1Г[Ч(ВР + ВЭМКМ + ЫРМ» + УА1*У-СгиВ

в. Иммунохнмнческяя характеристика аффнниооч пшенных белков СгтВ 8.1. Электрофоретическое фракционирование и оеперп-блог анализ белков

СгтВ

Результаты элехтрофоретнческого фракционированна полученных препаратов рекомбинантных СгтВ и СгтВ/1е01 представлены на рис. 6. В редуцирующих условиях эдектрофоретаческая подвижность аффинноочищенных препаратов УАЛУ-СлпВЛеО I и СРХУ-СтгаВЛ^ 1 соответствует полинептидаы с молекулярной массой около 90 кДа (рис.

6, дорожки 9), препаратов УАКУ-СппВ, СРХУ-ОтВ, МРХУ-СпиВ (рис. б, дорожки 3,

7, 10) соответствует полипептидам с молекулярной массой около 45-47 кДа. В нередуцнруюншх условиях электрофоретическая подвижность УА1№СппВ/1£01, СРХУ-

ОтВ/ДО 1 и УАЯУ-СппВ соответствует димерным формам белков (молекулярная масса около 170 кДа н 90 кДа, соответственно) (рис. 6, дорожки 4, 8, 6), тогда как препараты МРХУ-СгтВ (рис. 6, дорожка 11) и СРХУ-СппВ (рис. 6, дорожка 2) при используемой схеме очистки выделяются преимущественно в ыовомерной форме.

Ркс.6.

Электрафоретическое фрдецвонировавм« препаратов рекомбивактиых CTXV-OrmB (дорожки 2,3), CPXV-CrmB/IgGl (дорожки 4, S), VARV-CrmB (порожки б, 7), VARV-CrmB/IgGl (цорожкв 8,9), MPXV-СгтВ (дорожки 10,11) ■ редуцирующих (+) и всрсяуцнрушщих (-) условна!, ] — маркерные белки т вабора «Fratolitd SDS-PAGE Standards» («BioRad, США»), кДа.

Для проведения весгерн-блот анализа использовали сыворотку, полученную иммунизацией кроликов очищенным белком VARV-CrmB (abvarv-ошв), и коньюгвт перокспдазы хрена с антителами козы против иммуноглобулинов человека (Abj,) («BioRad, США»), Результаты весгерн-блот анализа полученных препаратов рекомбннантых белков выявили дополнительные олигомерные формы иммуко адгезивных белков с молекулярной массой более 170 «Да в нередуцируюших условиях (рис. 7, дорожка 1).

Рис. 7. Вестерн-блот анализ аффнпоочищенных препаратов CPXV-CrtnB (дорожки 3,4) и CPXV-CrmB/IgGl (дорожки 1,2) в редуцирующих (+) и нереду пирующих (-) условиях.

а - использовались Abi,; б— использовались АЬуш^пв- 3 — маркерные белки из набора «Ptestained SDS-PAGE Standards» («BioRad, США»), «Да.

Таким образом, как и предполагалось, добавление фрагмента тяжелой цепи IgGl человека к белкам CrmB привело к влагомер из ации последних.

8.2. Твердофазный ИФА белков СггаВ

Для того чтобы сравнить эффективность взаимодействия вирусных TNF-связывающих белков с hTNF использовали метол конкурентного твердофазного иммунофернентного анализа, оценивая уровень связывания hTNF с полученными АЬьткр в присутствии различных количеств очищенных препаратов ортопоксвнрусных CrmB. Добавленные в реакционную смесь вирусные бедки препятствуют образованию комплекса иммуноглобулинов с hTNF, Данные, представленные на рис! 8, свидетельствуют, что рекомбкнантные CrmB эффективно препятствуют образованию комплекса hTNF/АЬьткр н эффективность такого взаимодействия (% ннгибврования) уменьшается в следующем порядке: VARV-CrmB - CPXV-CrmB - MPXV-CrmB.

Рис. 8. Ингнбирование вирусными СгшBs связывания поли клоналЫ1ых антител АЬымг с hTNF. Преастявле ны результаты одного из четырех параллельных опытов.'

»де i« |> м vi * i* i« и

квнцнпрацп! CntB, иг/мл

I VARV-CimB □ CBCV-CmB

IMHCV-СгшВ

9. Изучение биологической а irr и внести вирусных CrmB белков in vitro Для того. чтобы продемонстрировать взаимодействие рекомбинантных VARV-, CPXV-, MPXV-CrmB, VARV-, CPXV-CrmB/lgGI с TNF, исследовали их способность нейтрализовать цитопатическое действие hTNF, TNF мыши - (га), TNF кролика (г), человеческого лнмфотокенна о (hLT-a) на культуре клеток L929, Предварительно для каждого цигокяна определили концентрации, обеспечивающие 50 % цнтопатическое действие (LDjh). На рис. 9А представлены зависимости выживаемости клеток L929 в присутствии в культуральной среде hTNF (б LD») и последовательных двукратных разведений CrmB белков (начиная с 0.2 мыт/мл). Для контроля специфичности обнаруженных биологических эффектов вирусных CrmB использовали синтезированный в бакуловирусной системе и аффинноочщценный VARV-IFNyBP, Добавление этого белка в реакционную смесь вместо CrmB пе влияло на цитотоксические эффекты hTNF (данные

не приведены). Аналогичные данные получены для всех использованных типов TNF (данные не приведены). На рис. 9Б представлена интегральная картина эффективности ингнбироваиия цитопатического действия гетерологичных TNF СппВ белками. Можно видеть, что VARV-CrmB практически с одинаковое эффективностью ннгибирует цитолатнческое действие человеческого, мышиного и кроличьего TNF. CPXV-CrmB эффективно ннгибирует действие mTNF, но не hTNF и rTNF. MPXV-CnoB обладает паименее выраженным ингибируюшим действием в отношении всех используемых лнгандов. Также можно* видеть; что добавление иммуноглобулинового домена не оказывает существенного влияния на эффективность нейтрализации in vitro циютоксическогд действия hTNF, mTNF, rTNF н hLT-o белками VARV-CrmB и CPXV-

Гиг. 9. НнгнбнроваавеСппВ иктФпитического «kenn TNF Ы vitro.

А. Ингибирование вирусными TNF-свяэывакнцимн белками цнтопатяческого действия hTNF на культуре клеток L929. Б. Интегральная картина эффективности ингибнрошних щггопатического действия гетерологичных TNF CrmB белками. Концентрация VARV-CrmB, обеспечивающая 50 % защитный эффект err действия б LD» TNF на культуре клетож L929 взята за 100 %. Остальные значения рассчитаны по формуле: (1/IVARV-СгтВ]аоц)/(14СгтВ])х 100%. В работе использовали препараты рекомбншштяых hTNF tt hLTo (Коробко 1994; Коробю в др., 1993), mTNF и (TNF (Рекомбинантние плазм иды, содержащие гены m-TNF и r-TNF, предоставлены В. В. Кравченко, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Выделение рекомбинантиьк цнгокинон проводили по технологии, разработанной в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Пустошияова и др., 1994), из штаммов £ coli SG2W50 - продуцентов TNF И hLTo.

200 10« SO И 12,S 6,25 3,11 1,9 кппюприка ГгшВ, нг/мл

- 1мттк PtVARV-CnaB

- итьти rwpKV-Ст-в

- IMHiTHItMPKV-CMB

1И

ХИ»+кТИГ

CPXV- CPXV- MfXV. Спив%С1 СгпВ

□ hTNF В mTNF PrTNF Я LT-»

Таким образом, показано, что синтезированные в клетках насекомых рекомбняатные вирусные СгтВ обладают способностью связывать TNF, препятствуя его взаимодействию с рецепторами клеток линии L929.

10. Изучение биологической активности вирусных CrmB белков in vivo

Иидукцня эндатокенческого шока. Для изучения биологической активности СппВ in vivo использовали модель эндотоксического шока, вызванного введением лнгюполиевхарида (ЛПС) (Möhler eí oí., 1993).

Предварительно провели подбор доз ЛПС. вызывающих 80-100 % гибель Экспериментальных животных, определили динамику продукции TNF в сыворотках крови животных и патоморфологическую картину изменений внутренних органов животных в условиях выбранной экспериментальной модели. Для использованных в эксперименте SPF-мышей линии BALB/c 80-100% гибель вызывалась введением сенсибилизирующей (300 мкг/мышь) и. через 16 ч, разрешающей доз ЛПС (3S0 мкг/ыышь). Мыши, получившие инъекции ЛПС, становились вялыми и малоподвижными, с взъерошенной и влажной шерстью. Среди контрольных животных не было зафиксировано ни одного случая падежа (рнс. 10, 11), поведение и внешний вил животных не изменялись но сравнению с интакгнымн животными.

8 л

too

90 so 70 60 50 40 30 20 10 Ф

Рис. 10. Показатели выживаемости мышей с J1 ПС-икду цнрованн ым эидотоксическнм шоком при введении рскомбинантного белка VARV-CrinB. Эксперимент повторялся 4 раза. В группах было по Й-10 мышей.

* - достоверность определена по критерию Фишера (р < 0.05)

- fhs+vakv-отов (2 мкх/|*.т1..)

------ лпоеса

------„hk:+varv-ötnb (2 икз/мьш»,)

............. ЛПС+VARV-CfroB (ttl жг/>иш)

Дня изучения динамики продукции TNF и IFNy в используемой модели определили методом НФА уровень цитоккнов в сыворотках крови мышей контрольных и экспериментальных групп. В сыворотках крови животных, получивших инъекции ЛПС, через 1 ч после индукции шока концентрация TNF резко возросла н составила 750 + 150 пг/мл, затем постепенно снижалась и достигала уровня контрольных образцов к 24 ч. Уровень TNF в сыворотке крови контрольных животных, уровень IFNy во всех исследованных образцах сыворотки крови мышей бьш ниже уровня чувствительности используемой тест-системы (5 пг/мл) па протяжении всего периода наблюдения.

Полученные результаты'свидетельствуют, что в используемой вами экспериментальной модели развитие эндотокснческого шока сопровождается резким ростом продукции TNF.

too

™ 80

а 70 с

в 60

i 50

§ <0 ; 30

20 10 о

Рис. 11. Показатели выживаемости мышей с Л ПС-и вдуц нроваи ним эндетокенческн м шоком при введении рекомбннаитного белка СРХУ-СгтВ. Эксперимент повторялся 2 раза. В группах было по 8-10 мышей.

PBS+CPXV-CrmB (1 мкг/мышь) ЛПС+BSA

ЛПС+СРХУ-СгтаВ (2 м кг/мышь) ЛПС+CPXV-CrmB {O.I мкг/мышь)

Проведенное гистологическое исследование внутренних органов и брыжейки мышей, получивших инъекции ЛПС, выявило нарушения микроцнркудяции и развитие умеренно . выраженного геморрагического синдрома; дистрофически-некротические . изменения в клетках паренхиматозных органов; повреждение эндотелия сосудов и развитое важулнта в сосудах системы легочной артерии; явления лейкостаза и формирование фибриновых тромбов; развитие бронхоспазма и ранней стадии острой почечной недостаточности.

Полученные данные соответствуют описанной в литературе картине (Пермяков и др., 1989; Баршгейн и др., 1990; Черствой и др., 1990) и свидетельствуют, что использованная нами экспериментальная модель действительно обеспечивает развитие эндотокснческого шока.

Изучение эффектов введении рекомбннватных белков CrmB янтактиым мышам и мышам на фоне эндотоксического шока. Исследуемые белки VARV-CmoB, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB вводили мышам внутрнбрюшинно за 30 мин до введения разрешающей дозы ЛПС в дозе 0.2 мкг/мышь или 2 мкг/мышь в PBS; VARV-CnnB/IgGI и CPXV-CrmB/IgC 1 -в дозе 0.4 мкг/мышь или 4 мкг/мышь.

При введении рекомбинантных белков VARV-CnaB (в Дозе 0.2 мкг/мышь или 2 мкг/мышь) и VARV-CnnB/IgGI (в дозе 0.4 мкг/мышь или 4 мкг/мыщь) выживаемость животных увеличилась до уровня 47 ± 6.7 % и 62 + 8.6 % (рис. 10), соответственно, или 56

+ 7.2% и 70 + 9.7%, соответственно, в отличие от рекомбинантных CPXV-CrmB (рис. 1IX MPXV-CrmB и CFXV-CrmB/IgGl (данные не приведены) введение которых не увеличивало выживаемость животных по сравнению с животными, которым вводился только ЛПС.

Хотя полученный нами химерный белок VARV^nriB/lgGl не изменяет свою активность по нейтрализации щгготоксического действия TNF in vitro, при терапевтическом воздействии па модели эндотоксического шока он проявляет больший эффект по сравнению с прототипным белком VARV-СгшВ. Возможно, это обусловлено большей стабильностью химерного белка in vivo, как это было показано для рада других химерных белков (Chamov and Ashkenazi, 1996; Quiggefa!., 1998; Harris etat., 2002).

Гистологическое изучение эффектов введения рекомбяиаитного белка VARV-CrniB нктактиым мышам и мышам на фоне эндотоксического шока. Проведено изучение гистологического строения и состояния кровеносного русла внутренних органов, брыжейки и головного мозга мышей, умерщвленных через 1, 3, 6, 24, 30 и 48 ч после введения рекоыбинантного вирусного белка VARV-CrmB (в дозе 2 мкг/мышь). Показано, что гистологическое строение и состояние кровеносного русла не отличались от аналогичных показателей у мышей, которым вводили PBS. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии токсического действия данного белка на организм при использованной схеме введения.

Гистологическое исследование показало, что введение реко мбниантного белка VARV-CrmB мышам с индуцированным ЛПС эндотоксическим шоком приводит к отчетливому улучшению патогисгологаческой структуры внутренних органов по сравнению с животными, не получавшими этого белка. Введение белка предупреждает появление инфарктов в сердце, снижает степень нарушений кровообращения в сосудах брыжейки, приводит к нормализации микроциркуляции и кровоснабжения головного мозга и внутренних органов, предупреждает развитие острой почечной недостаточности.

11. Сравнение ТОТ-нейтрялизуиидей активности СгюВ белков с некоторыми известными антагонистами TNF/n vitro

Для того чтобы оценить потенциал изучаемых белков как возможных TNF-антагонисгов, сравнили эффективность нейтрализации in vitro щгготоксического действия hTNF вирусным белком VARV-CrmB с коммерческими препаратами моиокпоиальных Ab (МАК 195, «Boehrjnger Mannheim»), растворимых (s) рекомбинантных человеческих рецепторов TNF первого и второго типа («R&D system», США) и поликлональными антителами, а также эффективность нейтрализации in vitro щгготоксического действия mTNF вирусным белком CPXV-CrmB и коммерческими препаратами растворимых

рекомбинантных мышиных рецепторов TNF первого и второго типа («R&D system», США) на культуре клеток L929.

Оказалось, что VARV-CimB нейтрализует шгготоксическое действие hTNF с эффективностью, соизмеримой с эффективностью TNF-нейгрализующето моноклоналыюго антитела МАХ 195, превосходит эффективность поликлональньга антител на порядок, hsTNFRl и hsTNFRH на два порядка (рис. 12). CPXV-CrmB превосходит эффективность msTNFRI и msTNFRII по нейтрализации roTNF на два порядка (данные не приведены).

Таким образом, показано, что в используемой экспериментальной системе VARV-CrmB является более эффективным антагонистом действия hTNF, чем моноклональные и полнклональные антитела к hTNF, hsTMFRJ и hsTNFRII, a CPXV-CrmB является более эффективным антагонистом действия mTNF, чем msTNFRI и msTNFRII.

100 -г ... 90 -

ё 80 ■ й 70 -| 60S 50 -| 40-

10 -о -

ТОТ-антагонистами и УА11У-□ УАКУ-СгтВ ■ ЬатаРКГ СгтВ.

■ Ь1Т4Ш1 @ иолнклональиые ЛЬ

@ мояокл ональиое АЬ

Выводи:

1. Методами генетической инженерии созданы и депонированы в музее ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» бакуловирусы, детерминирующие синтез в клетках насекомых 1ГЫт-связывающего белка, вируса оспы обезьян и химерных нммуноадгезивных вариантов ТМ^связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров. Выявлено, что наибольший уровень продукции ортопохсвирусных белков в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами достигается на 6-7 сутки культивирования.

2, Показано, что ШЫу-связываюшие белки вирусов натуральной оспы и оспы обезьян, в отличие от клеточных аналогов продуцируются в виде гомодимеров и эффективно нейтрализуют антивирусную активность ХРКу человека ¿п уиго.

Рнс. 12. Иигнбнрование иитопатвческого действия TNF

3. Сравнительный анализ свойств оргопоксвирусных TNF-связывающих белков показал, что:

- TNF-связывающнй белок вируса натуральной ослы, в отличие от аналогичных белков вирусов оспы обезьян и оспы коров, обладает способностью к диыернзации;

- TNF-связывающие белки ортопоксвируеов ингибируют связывание человеческого TNF с пояиклоналмшми антителами к нему; эффективность этого ннгибированна уменьшается в ряду вирус натуральной оспы — вирус оспы коров — вирус оспы обезьян;

- TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы, эффективно ингибирует шггатоксическое действие человеческого, мышиного, кроличьего TNF и человеческого лиыфотоксина а на клетках мышиных фибробласгов L929, в то время как аналогичный белок вируса оспы норов эффективен лишь против мышиного TNF, аналогичный белок вируса оспы обезьян проявляет на порядок меньшую эффективность ингнбнрования активности всех изученных TNF.

- TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы, в отличие от TNF-связывающих белков вирусов оспы обезьян и ослы коров, обладает достоверным терапевтическим эффектом, ослабляя натоморфологическую картину проявления эвдотокснческого шока у мышей и способствуя выживаемости животных.

4. Показано in vitro, что TNF-иеЙтралпэующа* активность TNF-свяэ ывающего белка вируса натуральной оспы на 1-3 порядка превышает аналогичные эффекты поликлональных антител к TNF и растворимых клеточных TNF-рецеггторов первого и второго типов, соизмерима с активностью TNF-нейтрапиэующего моиоклонального антитела МАК 195.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях

1. Гилева И.П., Разанкин RA., Непомнящих Т.е.. Тогменин A.B., Махеютов ЗА, Лебедев Л.Р., Афиногенова Г.Н., Пусто Шилова Н.М., Щелкунов С.Н. 2005. Экспрессия генов TNF-связаваккцих белков оргопоксвирусов в клетках насекомых и изучение свойств рекомбинашиых белков. Молекуляр. биология. Т. 39, С. 245-254.

2. Непомнящих Т.С., Лебедев Л.Р, Ряэанкин ИХ, Поздняков С.Г., Гилева И.П., Щелкунов С.Н. 2005. Сравнительное изучение рекоыбинантиых нитерферон-'у-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян. Молекуляр. биология. Т.39,С. 1055-1062.

3. Гилева И.П., Малкова Е.М., Непомнящих Т.С., Виноградов И.В., Лебедев Л.Р., Кочневн Г,В., Гражданке ва АЛ,, Рябчиков» Е.И., Щелкунов С.Н. 2006, Изучение

действия TNF-связываклпего белка вируса натуральной оспы на развитие ЛПС-квдуциро ванного эндотоксического шока. Цитокины и воспаление. Т. 5, С. 44-48.

4. Непомнящих Т.С., Гилева ЦП., Рязанкин И.А., Щелкунов CJi Рекомбинангная шюзмшшая днк pfastbag-b9rz, содержащая фрагмент генома вируса оспы обезьян, кодирующий интерферон гамма связывающий белок, и штамм бакуловируса t>vb9rz, продушфующий растворимый интерферон гамма связывающий белок вируса оспы обезьян. Рос, Пат., справка о приоритете № 2006113756 от 21.04.2006.

5. Непомнящих Т.С., Гнлева И.П., Рязанкин И.А., Тотмення А.В., Лебедев Л.Р., Агеенко В.А., Щелкунов С.Н. 2002. Экспессня ортопоксвирусных аналогов рецептора интерферона гамма в клетках насекомых. Международная научно-практическая школа-конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия, 23-26 июня. Цитокины и воспаление. Т. 1, С. 23.

6. Gileva I.P., Ryazankin LA., Maxutov ZA, Nepomnyashduh T.S., Totmenin A.V., Lebedev L.R., Ageenko V.A., Nesterov A.E., Shdidkuoov S.N. 2002. Expression of Orthopoxvirus Analogues of tumor Necrosis Factor Receptor and Gamma-Interferon receptor in Insects Cells. 1-st International Congress Biotechnology-Stale of the Art and Prospects of Development, Moscow, Russia, 14-18 October. Abstract book, P. 26.

7. Gileva LP., Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdanlsseva A., Afmogenova G.A., BaldanovN.V., Pustoshilova N.M., SbcheDcunov S.N. 2004, TNF-Binding Proteins of Pathogenic Orthopoxviruses: Purification and Some Characteristics. International Conference «Chemical and Biological Problems of Proteotnics», Novosibirsk, Russia, 5-9 July. Abstract book, P. 83.

8. Gileva LP., Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdanlsseva A., Afmogenova G.A., Baldanov N.V., Pustoshilova N.M., Shchelkunov S.N. 2004, TNF-Binding Proteins of Human-Pathogenic Orthopoxviruses: Purification and Some Characteristics. XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference, Oxford, Great Britain, 3-8 September. Abstract book, P. 143

9. Nepomnyashchih TJS., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grajdantceva A.A., Malkova E.M., Vinogradov I.V, Ryabchikova E.I., Ryazatddn LA., Shchelkunov S.N., Gileva LP. 2005. Orthopoxvirus Tumor Necrosis Factor binding proteins and Gamma-Interferon binding proteins: expression, purification and some characteristics. 7th Jonh Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. Moscow, Russia, September 5-9. Abstract book, P. 34.

10. Непомнящих T.C., Лебедев Л.Р., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Гилева И.П., Щелкунов С.Н. 2005. Ортопоксвирусные TNF-связываюпше белки: экспрессия, очистка и некоторые свойства. Всероссийский научный симпозиум с международным участием

кЦитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия, 19-21 июля 2005. Цитокины и воспаление. Т, 4, С. 121.

11. Nepomnyashchih T.S.. Lebedev L.R., Koctmeva G.V., Grajdantceva A.A., Ryazankln I-A., Shchelkunov S.N., Gileva I.P, 2005. Orthopoxvirus Tumor Necrosis Factor binding proteins and Qamma-lnterferon binding proteins: expression, purification and some characteristics. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, July 2-7. FEBS Journal. V. 272 (si), L1-031P.

12. Nepomnyashchih T.S., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grajdantceva A.A., Malkova E.M., Vinogradov I.V., Ryabchfruva E.I., Ryazanktn I.A., Gileva I J1., Sbchelfcunov S.N. 2005. Comparative studies of orthopoxviral immunomodulators. Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, Россия, 4-8 сентября. Abstract book, P. 99.

13. Непомнящих Т.С., Плева 1.П., Кочнша Г.В., Граждаицева А.В., Малковд С.М., Виноградов I.B., Рябчиков» СЛ., Щелкунов С.Н. 2006, Вивчення вдастивостей рекомбинаишого TNF-зв'юуючого бшка aipycy натурально! втспи в якосп блокатора бюлопчноГ активности TNF. Научно-практическая конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», УкраТни, Xapnis, 29-30 марта. Abstract book, P. 164.

14. Непомнящих Т.С., Гилева И.П., Лебедев Л.Р., Граждаицева А.А., Малкова Е.М., Виноградов И.В., Рябчикоаа Б.И., Щелкунов С.Н. 2006. Оргопоксвирусные иммуномодуляторные белш как новые средства антицитокиновой терапии. Ш Российская конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах сибнрн, дальнего востока и крайнего севера». Новосибирск, Россия, 27-29 сентября. Сборник материалов конференции, С. 174.

Непомнящих Татьяна Сергеевна ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ГАММА-ИНТЕРФЕРОН-И TNF-СВЯЗЫВЛЮЩИХ БЕЛКОВ ОГГОПОКСВИРУСОВ. Автореф. днсс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 18.10.2006, Заказ № II},-Формат 60x90/16. Усл. пет. л. 1, Тираж 100 экз. Типография Института катаяиэа им. ГЛС Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Непомнящих, Татьяна Сергеевна

• 1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

2.1. Актуальность проблемы.

2.2. Цели и задачи исследования.

2.3. Публикации по теме диссертации.

2.4. Вклад автора.

2.5. Положения, выносимые на защиту.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Молекулярные факторы вирулентности вирусов.

3.2. Вирусные гомологи рецепторов TNF и их свойства.

3.3. Поксвирусные ингибиторы действия интерферонов.

3.4. Болезни, обусловленные нарушением продукции TNF и IFNy.

3.5. Препараты, ингибирующие действие TNF и IFNy.

3.5.1. Aumu-WF препараты. ф 3.5.2. Анти-IFNyпрепараты.

3.6. Применение вирусных белков для лечения воспалительных и аутоиммунных состояний.

3.6.1. Вирусные ингибиторы хемокинов.

3.6.2. Вирусные ингибиторы комплемента.

3.6.3. Вирусные анаяоги хемокинов.

3.6.4. Вирусные анаюги IL-10.

3.6.5. Вирусные ингибиторы сериновых протеаз.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы.

4.1.1. Штаммы бактерий, линии клеток, вирусы и плазмиды, использованные в работе.

4.1.2. Ферменты.

4.1.3. Цитокины, рецепторы цитокинов, антитела к цитокинам.

4.1.4. Программное обеспечение.

4.1.5. Олигонуклеотидные праймеры.

4.1.6. Буферные растворы, используемые в работе.

4.2. Методы.

4.2.1. Культивирование клеток.

4.2.2. Получение рекомбинантных плазмид.

4.2.3. Клонирование фрагмента IgGl.

4.2.4. Получение рекомбинантных бакуловирусов.

4.2.5. Аффинная очистка белков CrmB, CrmB/IgGl и IFNyBP.

4.2.6. Получение иммунных сывороток и политональных кроличьих антител.

4.2.7. Дот-блот-аначиз.

4.2.8. Электрофорез и вестерн-блот-анализ.

4.2.9. Твердофазный шшуноферментный анализ.

4.2.10. Определение биологической активности TNF-связывающих белков.

4.2.11. Определение биологической активности вирусных IFNyBP.

4.2.12. Изучение действия CrmB in vivo.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей IFNy-связывающих белков ортопоксвирусов.

5.2. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей TNFсвязывающих белков ортопоксвирусов.

5.3. Получение рекомбинантных бакуловирусов, продуцирующих MPXV-IFNyBP, CPXV-CrmB/IgGI, VARV-CrmB/IgGI.

5.4. Экспрессия TNF- и IFNy-связывлющих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых линии Sf21.

5.5. Очистка рекомбинантных белков.

5.6. Характеристика рекомбинантных VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP ф электофорезом И вестерн-блот-анализом.

5.7. Изучение биологической активности VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP in vitro

5.8. Иммунохимическая характеристика аффинноочищенных рекомбинантных CrmB.

5.8.1. Электрофоретический анализ.

5.8.2. Вестерн-блот-анализ CrmB.

5.8.3. Твердофазный ИФА CrmB.ИЗ

5.9. Изучение биологической активности вирусных CrmB in vitro.

5.10. Изучение биологической активности вирусных CrmB in vivo.

5.10.1. Индукция эпдотоксического шока.

5.10.2. Изучение эффектов введениярекомбинантных белков СгтВ интактным мышам и на фоне эпдотоксического шока.

5.10.3. Гистологическое изучение эффектов введениярекомбинантного белка VARV-СгтВ интактным мышам и на фоне эпдотоксического шока.

5.11. Сравнение CrmB с известными антагонистами TNF.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств гамма-интерферон- и TNF- связывающих белков ортопоксвирусов"

2.1. Актуальность проблемы

Интерферон гамма (IFNy) и фактор некроза опухолей (TNF) являются одними из важнейших регуляторов всех аспектов функционирования иммунной системы, включая дифференцировку лимфоидных клеток, воспаление, развитие адаптивного иммунного ответа, иммунологической памяти, толерантности и многие другие (Mach et al., 1996; Boehm et al, 1997; Blam et al., 2001; Schottelius et al, 2004; Schroder et al., 2004; Ярилин, 1999). Именно из-за центральной роли в регуляции защитных реакций организма, а также большого разнообразия своих биологических активностей, гиперпродукция TNF и IFNy приводит к развитию патологических состояний, сопровождающихся хроническими воспалительными и/или аутоиммунными реакциями (Keffer et al., 1991; Okamoto et al, 1998; Mease, 2002; Shealy et al, 2002; Schroder et al, 2004; Baccala et al, 2005).

Одной из наиболее эффективных стратегий для терапии таких состояний является применение препаратов, способных ингибировать экспрессию и/или биологическую активность этих цитокинов. В настоящее время в клинической практике широко применяются антагонисты цитокинов, полученные на основе растворимых рецепторов или моноклональных антител. Биологическая терапия таких заболеваний как ревматоидный артрит (РА), болезнь Крона, язвенный колит, псориаз и другие показала свою эффективность, высокую специфичность действия и безопасность (Feldmann et al„ 2001; Breedveld and Kalden, 2004; De Keyser et al, 2006; Sandborn and Faubion, 2004; Krueger and Callis, 2004; Skurkovich and Skurkovich, 2003, 2006). Однако антицитокиновые препараты обладают различной терапевтической эффективностью при лечении различных патологий (Chung et al, 2003; Kwon et al, 2003; Henriksen and Newby, 2003; Mpofu et al., 2005), и кроме того, эффективность терапии, по-видимому, зависит и от индивидуальных особенностей пациентов (Ang and Helfgott, 2003; Moots et al, 2003; van Vollenhoven et al., 2003a,b; Mpofu et al, 2005), поэтому необходимо расширение спектра анти-IFNy и анти-TNF препаратов, применяемых в клинической практике.

Геномы поксвирусов кодируют белковые факторы, эффективно нейтрализующие антивирусный ответ организма хозяина, ингибируя процессы апоптоза, продукцию интерферонов, хемокинов и воспалительных цитокинов, активность системы комплемента (табл. 1) (Seet et al, 2003). TNF- и IFNy-связывающие белки ортопоксвирусов могут стать основой для создания новых терапевтических цитокин-связывающих препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Непомнящих, Татьяна Сергеевна

130 6. Выводы

1. Методами генетической инженерии созданы и депонированы в музее ФГУН ГНЦ ВБ г «Вектор» бакуловирусы, детерминирующие синтез в клетках насекомых IFNyсвязывающего белка вируса оспы обезьян и химерных иммуноадгезивных вариантов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы коров. Выявлено, что наибольший уровень продукции ортопоксвирусных белков в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами достигается на 6-7 сутки культивирования.

2. Показано, что IFNy-связывающие белки вирусов натуральной оспы и оспы обезьян, в отличие от клеточных аналогов продуцируются в виде гомодимеров и эффективно нейтрализуют антивирусную активность IFNy человека in vitro.

3. Сравнительный анализ свойств ортопоксвирусных TNF-связывающих белков показал, что:

- TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы, в отличие от аналогичных белков вирусов оспы обезьян и оспы коров, обладает способностью к димеризации;

- TNF-связывающие белки ортопоксвирусов ингибируют связывание человеческого TNF с поликлональными антителами к нему; эффективность этого ингибирования уменьшается в ряду вирус натуральной оспы - вирус оспы коров - вирус оспы обезьян;

- TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы эффективно ингибирует цитотоксическое действие человеческого, мышиного, кроличьего TNF и человеческого лимфотоксина а на клетках мышиных фибробластов L929, в то время как аналогичный белок вируса оспы коров эффективен лишь против мышиного TNF, аналогичный белок вируса оспы обезьян проявляет на порядок меньшую эффективность ингибирования активности всех изученных TNF.

- TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы, в отличие от TNF-связывающих белков вирусов оспы обезьян и оспы коров, обладает достоверным терапевтическим эффектом, ослабляя патоморфологическую картину проявления эндотоксического шока у мышей и способствуя выживаемости животных.

4. Показано in vitro, что TNF-нейтрализующая активность TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на 1-3 порядка превышает аналогичные эффекты поликлональных антител к TNF и растворимых клеточных TNF-рецепторов первого и второго типов, соизмерима с активностью TNF-нейтрализующего моноклонального антитела МАК195.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Непомнящих, Татьяна Сергеевна, Кольцово

1. Adam С., Thoua Y., Ronco P., Verroust P., Tovey M., Morel-Maroger L. 1980. Theeffect of exogenous interferon: acceleration of autoimmune and renal diseases in (NZB/W) F1mice. Clin. Exp. Immunol. 40,373-382.

2. Aggarwal B.B., Eessalu Т.Е., Hass P.E. 1985. Characterization of receptors for human tumour necrosis factor and their regulation by gamma-interferon. Nature. 318, 665-667.

3. Aicher A., Shu G.L., Magaletti D., Mulvania Т., Pezzutto A., Craxton A., Clark E.A. 1999. Differential role for p38 mitogen-activated protein kinase in regulating CD40-induced gene expression in dendritic cells and В cells. J. Immunol. 163, 5786-95.

4. Akassoglou K., Probert L., Kontogeorgos G., Kollias G. 1997. Astrocyte-specific but not neuronspecific transmembrane TNF triggers inflammation and degeneration in the central nervous system of transgenic mice. J. Immunol. 158,438-445.

5. Alejo A., Ruiz-Arguello M.B., Ho Y., Smith V.P., Saraiva M., Alcami A. 2006. A chemokine-binding domain in the tumor necrosis factor receptor from variola (smallpox) virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103,5995-6000.

6. Alcami A., Koszinowski U.H. 2000. Viral mechanisms of immune evasion. Mol. Med. Today. 9,365-372.

7. Alcami A., Smith G.L. 1996. Receptors for gamma-interferon encoded by poxviruses: implications for the unknown origin of vaccinia virus. Trends Microbiol. 4, 321-326.

8. Alcami A., Smith G.L. 1996. Soluble interferon-gamma receptors encoded by poxviruses. Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 19, 305-317.

9. Alcami A., Symons J.A., Khanna A., Smith G.L. 1998. Poxviruses: capturing cytokines and chemokines. Sem. Virol. 8,419^127.

10. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215,403^110. http://ncbi.nih.gov/BLAST/index.shtml.

11. Anderson J.B., Smith S.A., van Wijk R., Chien S., Kotwal G.J. 2002. Vaccinia virus complement control protein ameliorates hyperacute xenorejection by inhibiting xenoantibody binding. Transplant. Proc. 34, 3277-3281.

12. Andreakos E.T., Foxwell B.M., Brennan F.M., Maini R.N., Feldmann M. 2002. Cytokines and anti-cytokine biologicals in autoimmunity: present and future. Cytokine Growth Factor Rev. 13,299-313.

13. Apparailly F., Millet V., Noel D., Jacquet C., Sany J., Jorgensen C. 2002. Tetracycline-inducible interleukin-10 gene transfer mediated by an adeno-associated virus: application to experimental arthritis. Hum. Gene Ther. 13, 1179-1188.

14. Apparailly F., Verwaerde C., Jacquet C., Auriault C., Sany J., Jorgensen C. 1998. Adenovirus-mediated transfer of viral IL-10 gene inhibits murine collagen-induced arthritis. J. Immunol. 160, 5213-5220.

15. Applied Molecular Evolution Annual Report, 2002. http://www.ame.biz/History/ar.htm

16. Araujo D.M., Lapchak P.A. 1994. Induction of immune system mediators in the hippocampal formation in Alzheimer's and Parkinson's diseases: selective effects on specific interleukins and interleukin receptors. Neuroscience. 61, 745-754.

17. Aybay C., Ozel S., Aybay C. 2006. Demonstration of specific antibodies against infliximab induced during treatment of a patient with ankylosing spondylitis. Rheumatol. Int. 26, 473^180.

18. Baccala R., Kono D.H., Theofilopoulos A.N. 2005. Interferons as pathogenic effectors in autoimmunity. Immunol. Rev. 204, 9-26.

19. Bac-to-BacR Baculovirus expression System. Instruction manual, www.invitrogen.com

20. Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. 2003. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Res. 57,13-23.

21. Balomenos D., Rumold R., Theofilopoulos A.N. 1998. Interferon-gamma is required for lupus-like disease and lymphoaccumulation in MRL-lpr mice. J. Clin. Invest. 101, 364-371.

22. Bauditz J., Wedel S., Lochs H. 2002. Thalidomide reduces tumour necrosis factor alpha and interleukin 12 production in patients with chronic active Crohn's disease. Gut. 50, 196-200.

23. Bedard E.L., Kim P., Jiang J., Parry N., Liu L., Wang H., Garcia В., Li X., McFadden G., Lucas A., Zhong R. 2003. Chemokine-binding viral protein M-T7 prevents chronic rejection in rat renal allografts. Transplantation. 76,249-252.

24. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340,783-795. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP

25. Beutler В., Greenwald D., Hulmes J.D., Chang M„ Pan Y.C., Mathison J., Ulevitch R., Cerami A. 1985. Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin. Nature. 316, 552-554.

26. Blam M.E., Stein R.B., Lichtenstein G.R. 2001. Integrating Anti-Tumor Necrosis Factor Therapy in Inflammatory Bowel Disease: Current and Future Perspectives. Am. J. Gastroenterol. 96,1977-1997.

27. Blum-Degen D., Muller Т., Kuhn W., Gerlach M., Przuntek H., Riederer P. 1995. Interleukin-1 beta and interleukin-6 are elevated in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's and de novo Parkinson's disease patients. Neurosci Lett. 202,17-20.

28. Bodmer J.L., Schneider P., Tschopp J. 2002. The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends Biochem Sci. 27,19-26.

29. Boehm U., Klamp Т., Groot M., Howard J.C. 1997. Cellular responses to interferon-gamma. Annu. Rev. Immunol. 15,749-795.

30. Born T.L., Morrison L.A., Esteban D.J., VandenBos Т., Thebeau L.G., Chen N., Spriggs M.K., Sims J.E., Buller R.M. 2000. A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18 and inhibits NK cell response. J. Immunol. 164, 3246-3254.

31. Boyce B.F., Li P., Yao Z., Zhang Q., Badell I.R., Schwarz E.M., O'Keefe R.J., Xing L. 2005. TNF-alpha and pathologic bone resorption. Keio J. Med. Sep. 54, 127—131.

32. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

33. Brandt J., Braun J. 2006. Anti-TNF-alpha agents in the treatment of psoriatic arthritis. Expert. Opin. Biol. Ther. 6,99-107.

34. Braun J., Baraliakos X., Brandt J., Sieper J. 2005. Therapy of ankylosing spondylitis. Part II: biological therapies in the spondyloarthritides. Scand. J. Rheumatol. 34, 178-90.

35. Breedveld F.C., Kalden J.R. 2004. Appropriate and effective management of rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 63, 627-633.

36. Breslauer K.J., Frank R., Blocher H., Marky L.A. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83,3746-3750.

37. Carfi A., Smith C.A., Smolak P.J., McGrew J., Wiley D.C. 1999. Structure of a soluble secreted chemokine inhibitor vCCI (p35) from cowpox virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 12379-12383.

38. Caroff M., Karibian D., Cavaillon J.-M., Haeffner-Cavaillon N. 2002. Structural and functional analyses of bacterial lipopolysaccharides. Microbes and Infection. 4, 915-926.

39. Carrasco R., Smith J.A., Lovell D. 2004. Biologic agents for the treatment of juvenile rheumatoid arthritis: current status. Paediatr Drugs. 6,137-146.

40. Cavaillon J.M., Adib-Conquy M., Fitting C., Adrie C., Payen D. 2003. Cytokine Cascade in Sepsis. Scand. J. Infect. Dis. 35, 535-544.

41. Chamow S.M., Ashkenazi A. 1996. Immunoadhesins: principles and applications. Trends Biotechnol. 14,52-60.

42. Chang J.T., Lichtenstein G.R. 2006. Drug insight: antagonists of tumor-necrosis factor-alpha in the treatment of inflammatory bowel disease. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 3, 220-228.

43. Christadoss P., Goluszko E. 2002. Treatment of experimental autoimmune myasthenia gravis with recombinant human tumor necrosis factor receptor Fc protein. J. Neuroimmunol. 122,186-190.

44. Culy C.R., Keating G.M. 2003. Spotlight on etanercept in rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. BioDrugs. 17,139-145.

45. Cunnion K.M. 1999. Tumor necrosis factor receptors encoded by poxviruses. Mol. Genet. Metab. 67,278-282.

46. Czlonkowska A., Kurkowska-Jastrzebska I., Czlonkowski A., Peter D., Stefano G.B. 2002. Immune processes in the pathogenesis of Parkinson's disease a potential role for microglia and nitric oxide. Med. Sci. Monit. 8,165-177.

47. Dairaghi D.J, Greaves D.R, Schall T.J. Abduction of Chemokine Elements by Herpesviruses. Seminars in Virology. 8, 377-385.

48. De Keyser F., Van den Bosch F., Mielants H. 2006. Anti-TNF-alpha therapy in ankylosing spondylitis. Cytokine. 33,294-298.

49. Debray-Sachs M., Carnaud C., Boitard C., Cohen H., Gresser I., Bedossa P., Bach J.F. 1991. Prevention of diabetes in NOD mice treated with antibody to murine IFN gamma. J. Autoimmun. 4,237-248.

50. DeBruyne L.A., Li K., Bishop D.K., Bromberg J.S. 2000. Gene transfer of virally encoded chemokine antagonists vMIP-11 and MCI48 prolongs cardiac allograft survival and inhibits donor-specific immunity. Gene Ther. 7, 575-582.

51. Decker Т., Stockinger S., Karaghiosoff M., Muller M., Kovarik P. 2002. IFNs and STATs in innate immunity to microorganisms. J. Clin. Invest. 109,1271-1277.

52. Dempsey P.W., Doyle S.E., He J.Q., Cheng G. 2003. The signaling adaptors and pathways activated by TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev. 14, 193-209.

53. Drapier J.C., Wietzerbin J., Hibbs J.B.Jr. 1988. Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce the L-arginine-dependent cytotoxic effector mechanism in murine macrophages. Eur. J. Immunol. 18, 1587-1592.

54. Drazan K.E., Wu L., Olthoff K.M., Jurim O., Busuttil R.W., Shaked A. 1995. Transduction of hepatic allografts achieves local levels of viral IL-10 which suppress alloreactivity in vitro. J. Surg. Res. 59,219-223.

55. Edgar R.C. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32, 1792-1797.

56. Efthimiou P., Schwartzman S., Kagen L. 2006. Possible Role for TNF-Inhibitors in the Treatment of Resistant Dermatomyositis and Polymyositis. Ann. Rheum. Dis. 65,1233-1236.

57. Ehrhart J., Obregon D., Mori Т., Hou H., Sun N., Bai Y., Klein Т., Fernandez F., Tan J., Shytle R.D. 2005. Stimulation of cannabinoid receptor 2 (CB2) suppresses microglial activation. J. Neuroinflammation. 12,2:29.

58. Estrach C., Mpofu S., Moots R.J. 2002. Behcet's syndrome: response to infliximab after failure of etanercept. Rheumatology. 41,1213-1214.

59. Evans C.H. 1995. Nitric oxide: what role does it play in inflammation and tissue destruction? Agents Actions Suppl. 47,107-116.

60. Everett H., McFadden G. 1999. Apoptosis: an innate immune response to virus infection. Trends Microbiol. 7,160-165.

61. Fan J., Watanabe T. 2003. Inflammatory reactions in the pathogenesis of atherosclerosis. J. Atheroscler. Thromb. 10,63-71.

62. Feldmann M. Maini R.N. 2001. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu. Rev. Immunol. 19,163-196.

63. Fox R.I. 2000. Sjogren's syndrome: current therapies remain inadequate for a common disease. Expert. Opin. Investig. Drugs. 9, 2007-2016.

64. Fu S., Chen D., Мао X., Zhang N., Ding Y., Bromberg J.S. 2003. Feline immunodeficiency virus-mediated viral interleukin-10 gene transfer prolongs non-vascularized cardiac allograft survival. Am. J. Transplant. 3, 552-561.

65. Fujisawa K., Saito S., Okada Y., Fujiwara Т., Yagi Т., Iwagaki H., Tanaka N. 2003. Suppression of allogeneic response by viral IL-10 gene transfer. Cell Transplant. 12, 379-387.

66. Fujita Т., Reis L. F., Watanabe N., Kimura Y., Taniguchi Т., Vilcek J. 1989. Induction of the transcription factor IRF-1 and interferon-beta mRNAs by cytokines and activators of second-messenger pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,9936-9940.

67. Gettins P.G. 2002. Serpin structure, mechanism, and function. Chem. Rev. 102, 47514804.

68. Ghirnikar R.S., Lee Y.L., Eng L.F. 2000. Chemokine antagonist infusion attenuates cellular infiltration following spinal cord contusion injury in rat. J. Neurosci. Res. 59, 63-73.

69. Gibson P.R. 2004. Increased gut permeability in Crohn's disease: is TNF the link? Gut. 53,1724-1725.

70. Gitter A.H., Bendfeldt K., Schulzke J.D., Fromm M. 2000. Leaks in the epithelial barrier caused by spontaneous and TNF-alpha-induced single-cell apoptosis. FASEB J. 14, 1749-1753.

71. Goodbourn S., Didcock L., Randall R.E. 2000. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral responses and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 81,2341-2364.

72. Gordon J.N., Trebble T.M., Ellis R.D., Duncan H.D., Johns Т., Goggin P.M. 2005. Thalidomide in the treatment of cancer cachexia: a randomised placebo controlled trial. Gut. 54, 540-545.

73. Groves R.W., Allen M.H., Ross E.L., Barker J.N., Macdonald D.M. 1995. Tumour necrosis factor alpha is pro-inflammatory in normal human skin and modulates cutaneous adhesion molecule expression. Br. J. Dermatol. 132, 345-352.

74. Guha M., Mackman N. 2001. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell. Signall. 13, 85-94.

75. Haas C., Ryffel В., Le Hir M. 1998. IFN-gamma receptor deletion prevents autoantibody production and glomerulonephritis in lupus-prone (NZB x NZW) F1 mice. J. Immunol. 160, 3713-3718.

76. Han Y., Rogers N., Ransohoff R.M. 1999. Tumor necrosis factoralpha signals to the IFN-gamma receptor complex to increase Statl alpha activation. J. Interferon Cytokine Res. 19, 731740.

77. Haraoui В., Cameron L., Ouellet M., White B. 2006. Anti-infliximab antibodies in patients with rheumatoid arthritis who require higher doses of infliximab to achieve or maintain a clinical response. J. Rheumatol. 33,31-36.

78. Harris C.L., Williams A.S., Linton S.M., Morgan B.P. 2002. Cuopling complement regulators to immunoglobulin domains generates effective anti-complement reagents with extended half-life in vivo. Clin. Exp. Immunol. 129,198-207.

79. Hausen В., Boeke K., Berry G.J., Morris R.E. 2001. Viral serine proteinase inhibitor (Serp-l) effectively decreases the incidence of graft vasculopathy in heterotopic heart allografts. Transplantation. 72,364-368.

80. Hengel H., Brune W., Koszinowski U.H. 1998. Immune evasion by cytomegalovirus -survival strategies of a highly adapted opportunist. Trends Microbiol. 6,190-197.

81. Henikoff S., Henikoff J.F. 1992. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89,10915-10919.

82. Henriksen P.A., Newby D.E. 2003. Therapeutic inhibition of tumour necrosis factor a in patients with heart failure: cooling an inflamed heart. Heart. 89,14-18.

83. Hicks R.R., Keeling K.L., Yang M.Y., Smith S.A., Simons A.M., Kotwal G.J. 2002. Vaccinia virus complement control protein enhances functional recovery after traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16,705-714.

84. Hitt A., Graves E., McCarthy D.O. 2005. Indomethacin preserves muscle mass and reduces levels of E3 ligases and TNF receptor type 1 in the gastrocnemius muscle of tumor-bearing mice. Res. Nurs. Health. 28,56-66.

85. Hochberg M.C., Lebwohl M.G., Plevy S.E., Hobbs K.F., Yocum D.E. 2005. The benefit/risk profile of TNF-blocking agents: findings of a consensus panel. Semin. Arthritis Rheum. 34, 819-836.

86. Hoffmann R. 1999. The potential role of cytokines and T cells in alopecia areata. J. Invest. Dermatology. 4,235-238.

87. Howard J., Justus D.E., Totmenin A.V., Shchelkunov S., Kotwal G.J. 1998. Molecular mimicry of the inflammation modulatory proteins (IMPs) of poxviruses: evasion of the inflammatory response to preserve viral habitat. J. Leukoc. Biol. 64,68-71.

88. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup D.J. 1994. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. Virology. 204, 343-356.

89. Huang Y., Krein P.M., Muruve D.A., Winston B.W. 2002. Complement factor В gene regulation: synergistic effects of TNF-alpha and IFN-gamma in macrophages. J. Immunol. 169, 2627-2635.

90. Hulo N., Sigrist C.J.A., Le Saux V., Langendijk-Genevaux P.S., Bordoli L., Gattiker A., De Castro E., Bucher P., Bairoch A. 2004. Recent improvements to the PROSITE database. Nucleic Acids Res. 32, 134-137. http://tw.expasy.org/prosite

91. Hultgren В., Huang X., Dybdal N., Stewart T.A. 1996. Genetic absence of gamma-interferon delays but does not prevent diabetes in NOD mice. Diabetes. 45, 812-817.

92. Hymowitz S.G., Christinger H.W., Fuh G., Ultsch M., O'Connell M., Kelley R.F., Ashkenazi A., de Vos A.M. 1999. Triggering cell death: the crystal structure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor 5. Mol. Cell. 4, 563-571.

93. Isaacs S.N., Kotwal G.J., Moss B. 1992. Vaccinia virus complement-control protein prevents antibody-dependent complement-enhanced neutralization of infectivity and contributes to virulence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 628-632.

94. Jha P., Kotwal G.J. 2003. Vaccinia complement control protein: multi-functional protein and a potential wonder drug. J. Biosci. 28,265-271.

95. Johnston J.B., McFadden G. 2003. Poxvirus immunomodulatory strategies: current perspectives. J. Virol. 77,6093-6100.

96. Kalvakolanu D.V. 1999. Virus interception of cytokine-regulated pathways. Trends Microbiol. 7,166-171

97. Kamijo R., Harada II., Matsuyama Т., Bosland M., Gerecitano J., Shapiro D., Le J., Koh S.I., Kimura Т., Green S.J., et al. 1994. Requirement for transcription factor IRF-1 in NO synthase induction in macrophages. Science. 263, 1612-1615.

98. Karupiah G., Fredrickson T.N., Holmes K.L., Khairallah L.H., Buller R.M. 1993. Importance of interferons in recovery from mousepox. J. Virol. 67,4214-4226.

99. Kavanaugh A., Antoni C., Krueger G.G., Yan S., Bala M., Dooley L.T., Beutler A., Guzzo C., Gladman D. 2006. Infliximab improves health related quality of life and physical function in patients with psoriatic arthritis. Ann. Rheum. Dis. 65,471-477.

100. Kawamoto S., Nitta Y., Tashiro F., Nakano A., Yamato E., Tahara H., Tabayashi K., Miyazaki J. 2001. Suppression of Thl cell activation and prevention of autoimmune diabetes into mice by local expression of viral IL-10. Int. Immunol. 13, 685-694.

101. Keystone E.C. 2004. The utility of tumour necrosis factor blockade in orphan diseases. Ann. Rheum. Dis. 63, ii79-ii83.

102. Khan S.B., Cook H.T., Bhangal G., Smith J., Tam F.W., Pusey C.D. 2005. Antibody blockade of TNF-alpha reduces inflammation and scarring in experimental crescentic glomerulonephritis. Kidney Int. 67,1812-1820.

103. Koilias G., Douni E., Kassiotis G., Kontoyiannis D. 1999. On the role of tumor necrosis factor and receptors in models of multiorgan failure, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and inflammatory bowel disease. Immunol. Rev. 169, 175-194.

104. Kotwal G.J. 2000 Poxviral mimicry of complement and chemokine system components: what's the end game? Immunol. Today. 21, 242-248.

105. Kotwal G.J., Moss B. 1988. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins. Nature. 335, 176-178.

106. Kotwal G.J., Lahiri D.K., Hicks R. 2002. Potential intervention by vaccinia virus complement control protein of the signals contributing to the progression of central nervous system injury to Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad .Sci. 973, 317-322.

107. Krueger G., Callis K. 2004. Potential of tumor necrosis factor inhibitors in psoriasis and psoriatic arthritis. Arch. Dermatol. 140,218-225.

108. Kumar A., Haque J., Lacoste J., Hiscott J., Williams B.R. 1994. Double-stranded RNA-dependent protein kinase activates transcription factor NF-kappa В by phosphorylating I kappa

109. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 6288-6292.

110. Kwon H.J., Cote T.R., Cuffe M.S., Kramer J.M., Braun M.M. 2003. Case reports of heart failure after therapy with a tumor necrosis factor antagonist. Ann. Intern. Med. 138, 807-811.

111. Laemmli U. 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

112. Lalani A.S., Barrett J.W., McFadden G. 2000. Modulating chemokines: more lessons from viruses. Immunol. Today. 21,100-106.

113. Lalani A.S., Graham K., Mossman K., Rajarathnam K., Clark-Lewis I., Kelvin D., McFadden G. 1997. The purified myxoma virus gamma interferon receptor homolog M-T7 interacts with the heparin-binding domains of chemokines. J. Virol. 71,4356-4363.

114. Lamprecht P. 2005. TNF-alpha inhibitors in systemic vasculitides and connective tissue diseases. Autoimmun. Rev. 4,28-34.

115. Liu L.Y., Dai E., Miller L., Seet В., Lalani A., Macauley C., Li X., Virgin H.W., Bunce

116. C., Turner P., Moyer R., McFadden G., Lucas A. 2004. Viral chemokine-binding proteins inhibit inflammatory responses and aortic allograft transplant vasculopathy in rat models. Transplantation. 77,1652-1660.

117. Liu L.Y., Lalani A., Dai E., Seet В., Macauley C., Singh R., Fan L., McFadden G., Lucas A. 2000. The viral anti-inflammatory chemokine-binding protein M-T7 reduces intimal hyperplasia after vascular injury. J. Clin. Invest. 105,1613-1621.

118. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. 2001. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell. 104,487-501.

119. Lomas D.A., Evans D.L., Upton C., McFadden G., Carrell R.W. 1993. Inhibition of plasmin, urokinase, tissue plasminogen activator, and CIS by a myxoma virus serine proteinase inhibitor. J. Biol. Chem. 268,516-521.

120. Loparev V.N., Parsons J.M., Knight J.C., Panus J.F., Ray C.A., Buller R.L., Pickup D.J., Esposito J.J. 1998. A third distinct tumor necrosis factor receptor of orthopoxviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3786-3791.

121. Lucas A., Dai E., Liu L., Guan II, Nash P., McFadden G„ Miller I. 2000. Transplant vasculopathy: viral anti-inflammatory serpin regulation of atherogenesis. J. Heart Lung Transplant. 19,1029-1038.

122. Lucas A., McFadden G. 2004. Secreted Immunomodulatory Viral Proteins as Novel Biotherapeutics. J. Immunol. 173,4765-4774.

123. Ma Y., Thornton S., Duwel L.E., Boivin G.P., Giannini E.H., Leiden J.M., Bluestone J.A., Hirsch R. 1998. Inhibition of collagen-induced arthritis in mice by viral IL-10 gene transfer. J. Immunol. 161,1516-1524.

124. MacEwan D.J. 2002 TNF receptor subtype signalling: differences and cellular consequences. Cell Signal. 14,477—492.

125. Mach В., Steimle V., Martinez-Soria E., Reith W. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14,301-331.

126. Maksymowych W.P., Nation N., Nash P.D., Macen J., Lucas A., McFadden G., Russell A.S. 1996. Amelioration of antigen-induced arthritis in rabbits treated with a secreted viral serine proteinase inhibitor. J. Rheumatol. 23, 878-882.

127. Maksyutov A.Z., Zagrebelnaya E.S. 1993. ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci. 9,291-297.

128. Mamane Y., Heylbroeck C., Genin P., Algarte M., Servant M.J., LePage C., DeLuca C., Kwon H., Lin R., Hiscott J. 1999. Interferon regulatory factors: the next generation. Gene. 237, 1-14.

129. Mamula P., Cohen S.A., Ferry G.D., Kirschner B.S., Winter U.S., Innes A., Patel J., Baldassano R.N. 2004. CDP571, a humanized anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in pediatric Crohn's disease. Inflamm. Bowel Dis. 10,723-730.

130. Martinez-Estrada O.M., Manzi L., Tonetti P., Dejana E., Bazzoni G. 2005. Opposite effects of tumor necrosis factor and soluble fibronectin on junctional adhesion molecule-A in endothelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288,1081-1088.

131. McFadden G., Essani K. 2005. Nucleic acid molecules and polypeptides for immune modulation. U.S. patent №6894155.

132. Meager A. 2002. Biological assays for interferons. Journal of Immunological Methods. 261,21-36.

133. Mease P.J. 2002. Tumour necrosis factor (TNF) in psoriatic arthritis: pathophysiology and treatment with TNF inhibitors. Ann. Rheum. Dis. 61, 298-304.

134. Milne R.S., Mattick C., Nicholson L., Devaraj P., Alcami A., Gompels U.A. 2000. RANTES binding and down-regulation by a novel human herpesvirus-6 beta chemokine receptor. J. Immunol. 164,2396-2404.

135. Miskin J.E., Abrams C.C., Goatley L.C., Dixon L.K. 1998. A viral mechanism for inhibition of the cellular phosphatase calcineurin. Science. 281, 562-565.

136. Montgomery R.I., Warner M.S., Lurn B.J., Spear P.G. 1996. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436.

137. Moots R., Taggart A., Walker D. 2003. Biologic therapy in clinical practice: enthusiasm must be tempered by caution. Rheumatology. 42, 614—616.

138. Moss В., Shisler J.L. 2001. Immunology 101 at poxvirus U: Immune evasion genes. Semin. Immunol., 13, 59-66.

139. Mossman K., Upton C., Buller R.M., McFadden G. 1995. Species specificity of ectromelia virus and vaccinia virus interferon-gamma binding proteins. Virology. 208, 762-769.

140. Mossman K.L. 2002. Activation and Inhibition of Virus and Interferon: The Herpesvirus Story. Viral Immunol. 15,3-15.

141. Mpofu S., Fatima F., Moots R.J. 2005. Anti-TNF-alpha therapies: they are all the same (aren't they?). Rheumatology (Oxford). 44,271-273.

142. Mullick J., Kadam A., Sahu A. 2003. Herpes and pox viral complement control proteins: 'the mask of self. Trends Immunol. 24, 500-507.

143. Munro J.M. Pober J.S., Cotran R.S. 1989. Tumor necrosis factor and interferon-gamma induce distinct patterns of endothelial activation and associated leukocyte accumulation in skin of Papio anubis. Am. J. Pathol. 135, 121-133.

144. Myers D.D.Jr., Hawley A.E., Farris D.M., Chapman A.M., Wrobleski S.K., Henke P.K., Wakefield T.W. 2003. Cellular IL-10 is more effective than viral IL-10 in decreasing venous thrombosis. J. Surg. Res. 112,168-174.

145. Nagatsu Т., Sawada M. 2005. Inflammatory process in Parkinson's disease: role for cytokines. Curr. Pharm. Des. 11, 999-1016.

146. Naismith J.H., Devine T.Q., Brandhuber B.J. Sprang S.R. 1995. Crystallographic evidence for dimerization of unliganded tumor necrosis factor receptor. J. Biol. Chem. 270, 13303-13307.

147. Naismith J.H., Sprang S.R. 1998. Modularity in the TNF-receptor family. Trends Biochem. Sci. 23, 74-79.

148. Nash P., Whitty A., Handwerker J., Macen J., McFadden G. 1998. Inhibitory specificity of the anti-inflammatory myxoma virus serpin, SERP-1. J. Biol. Chem. 273, 20982-209091.

149. Nash P., Barrett J., Cao J.X., Hota-Mitchell S., Lalani A.S., Everett H., Xu X.M., Robichaud J., Hnatiuk S., Ainslie C., Seet B.T., McFadden G. 1999. Immunomodulation by viruses: the myxoma virus story. Immunol. Rev. 168,103-120.

150. Nast C.C., Moudgil A., Zuo X.J., Toyoda M., Jordan S.C. 1997. Long-term allograft acceptance in a patient with posttransplant lymphoproliferative disorder: correlation with intragraft viral interleukin-10. Transplantation. 64,1578-1582.

151. Nii A., Reynolds D.A., Young H.A., Ward J.M. 1997. Osteochondrodysplasia occurring in transgenic mice expressing interferon-gamma. Vet. Pathol. 34, 431^141.

152. Noronha I.L., Fujihara C.K., Zatz R. 2002. The inflammatory component in progressive renal disease are interventions possible? Nephrol. Dial. Transplant. 17, 363-368.

153. Novick D., Rubinstein M. 1993. Interferon-gamma receptor fragment and its production. U.S. patent №5221789.

154. Novick D., Rubinstein M. 1996. Soluble interferon-gamma receptor fragment. U.S. patent №5578707.

155. Novick D., Могу Y., Fischer D.G., Revel M., Rubinstein M. 1998. Recombinant production of interferon-gamma binding proteins. U.S. patent №5763210.

156. Okamoto Т., Yamakawa Т., Yamamura К., Hino О. 1998. Induction of Fas ligand and Fas antigen mRNA expressions in interferon-gamma transgenic mouse liver. Jpn. J. Pharmacol. 78,233-235.

157. Okamoto Т., Yamamura K., Hino O. 2000. Expression of cyclooxygenase mRNA in the livers of mice with interferon-gamma chronic hepatitis. Jpn. J. Pharmacol. 83, 359-361.

158. Okamoto Т., Yamamura K., Hino O. 1999. The mouse interferon-gamma transgene chronic hepatitis model. Int. J. Mol. Med. 3, 517-520.

159. Opal S.M. 2003. Severe Sepsis and Septic Shock: Defining the Clinical Problem. Scand. J. Infect. Dis. 35,529-534.

160. Palladino M.A., Bahjat F.R., Theodorakis E.A., Moldawer L.L. 2003. Anti-TNF-alpha therapies: the next generation. Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 736-746.

161. Paludan S.R. 2000. Synergistic action of pro-inflammatory agents: cellular and molecular aspects. J. Leukoc. Biol. 67,18-25.

162. Panus J.F., Smith C.A., Ray C.A., Smith T.D., Patel D.D., Pickup D.J. 2002. Cowpox virus encodes a fifth member of the tumor necrosis factor receptor family: a soluble, secreted CD30 homologue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 8348-8353.

163. Parry C.M., Simas J.P., Smith V.P., Stewart C.A., Minson A.C., Efstathiou S., Alcami A. 2000. A broad spectrum secreted chemokine binding protein encoded by a herpesvirus. J. Exp. Med. 191,573-578.

164. Peng S.L., Moslehi J., Craft J. 1997. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J. Clin. Invest. 99,1936-1946.

165. Pennline K.J., Roque-Gaffney E., Monahan M. 1994. Recombinant human IL-10 prevents the onset of diabetes in the nonobese diabetic mouse. Clin. Immunol. Immunopathol. 71, 169175.

166. Pesu M., Aittomaki S., Takaluoma K., Lagerstedt A., Silvennoinen O. 2002. p38 Mitogen-activated protein kinase regulates interleukin-4-induced gene expression by stimulating STAT6-mediated transcription. J. Biol. Chem. 277,38254-38261.

167. Piccirillo C.A., Chang Y„ Prud'homme G.J. 1998. TGF-betal somatic gene therapy prevents autoimmune disease in nonobese diabetic mice. J. Immunol. 161, 3950-3956.

168. Podolsky D.K. 1991. Inflammatory bowel disease (1). N. Engl. J. Med. 325,928-937.

169. Puehler F., Weining K.C., Symons J.A., Smith G.L., Staeheli P. 1998. Vaccinia virus-encoded cytokine receptor binds and neutralizes chicken interferon-gamma. Virology. 248, 231240.

170. Pyo R., Jensen K.K., Wiekowski M.T., Manfra D., Alcami A., Taubman M.B., Lira S.A. 2004. Inhibition of intimal hyperplasia in transgenic mice conditionally expressing the chemokine-binding protein M3. Am. J. Pathol. 164,2289-2297.

171. Qin L., Chavin K.D., Ding Y., Tahara H., Favaro J.P., Woodward J.E., Suzuki Т., Robbins P.D., Lotze M.T., Bromberg J.S. 1996. Retrovirus-mediated transfer of viral IL-10 gene prolongs murine cardiac allograft survival. J. Immunol. 156,2316-2323.

172. Qin L., Ding Y., Tahara H., Bromberg J.S. 2001. Viral IL-10-induced immunosuppression requires Th2 cytokines and impairs APC function within the allograft. J. Immunol. 166,2385-2393.

173. Quigg R.J., Kozono Y., Berthiaume D., Lim A., Salant D.J., Weinfeld A., Griffin P., Kremmer E., Holers V.M. 1998. Blockade of antibody-induced glomerulonephritis with Crry-Ig, a soluble murine complement inhibitor. J. Immunol. 160,4553^560.

174. R&D system catalog, www.rndsystems.com

175. Rabinovitch A. 1998. An update on cytokines in the pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes Metab. Rev. 14,129-151.

176. Ray C.A., Black R.A., Kronheim S.R., Greenstreet T.A., Sleath P.R., Salvensen G.S., Pickup D.J. 1992. Viral inhibition of inflammation: cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-lb converting enzyme. Cell. 69, 597-604.

177. Reading P.C., Khanna A., Smith G.L. 2002. Vaccinia virus CrmE encodes a soluble and cell surface tumor necrosis factor receptor that contributes to virus virulence. Virology. 292, 285-298.

178. Reimold A.M. 2003. New indications for treatment of chronic inflammation by TNF-alpha blockade. Am. J. Med. Sci. 325, 75-92.

179. Reynolds D.N., Smith S.A., Zhang Y.P., Lahirl D.K., Morassutti D.J., Shields C.B., Kotwal G.J. 2003. Vaccinia virus complement control protein modulates inflammation following spinal cord injury. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1010, 534-539.

180. Rincon M., Enslen H., Raingeaud J., Recht M., Zapton Т., Su M.S., Penix L.A., Davis R.J., Flavell R.A. 1998. Interferon-gamma expression by Thl effector T cells mediated by the p38 MAP kinase signaling pathway. EMBO J. 17,2817-2829.

181. Rodseth L.E., Brandhuber В., Devine T.Q., Eck M.J., Hale K., Naismith J.H., Sprang S.R. 1994. Two crystal forms of the extracellular domain of type I tumor necrosis factor receptor. J. Mol. Biol. 239,332-335.

182. SaederupN., Lin Y.C., Dairaghi D.J., Schall T.J., Mocarski E.S. 1999. Cytomegalovirus-encoded beta chemokine promotes monocyte-associated viremia in the host. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 10881-10886.

183. Salgar S.K., Yang D., Ruiz P., Miller J., Tzakis A.G. 2004. Viral interleukin-10 gene therapy to induce tolerance to solid organ transplants in mice. Transplant. Proc. 36, 397-398.

184. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning. Laboratory manuals. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

185. Samuel C.E. 2001. Antiviral Actions of Interferons. Clin. Microbiol. Rev. 14,778-809.

186. Sandborn W.J., Faubion W.A. 2004. Biologies in inflammatory bowel disease: how much progress have we made? Gut. 53,1366-1373.

187. Sandborn W.J. 2003. Strategies for targeting tumour necrosis factor in IBD. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 17,105-117.

188. Sanders D.S. 2005. Mucosal integrity and barrier function in the pathogenesis of early lesions in Crohn's disease. J. Clin. Pathol. 58,568-572.

189. Sany Y. 1998. Cytokine expression during orthothopic allograft rejection in mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39,1953-1957.

190. Saraiva M, Alcami A. 2001. CrmE, a novel soluble tumor necrosis factor receptor encoded by poxviruses. J. Virol. 75,226-233.

191. Sarvetnick N., Shizuru J., Liggitt D., Martin L., Mclntyre В., Gregory A., Parslow Т., Stewart T. 1990. Loss of pancreatic islet tolerance induced by beta-cell expression of interferon-gamma. Nature. 346,844-847.

192. Scallon B.J., Trinh H., Nedelman M., Brennan F.M., Feldmann M, Ghrayeb J. 1995. Functional comparisons of different tumour necrosis factor receptor/IgG fusion proteins. Cytokine. 7, 759-770.

193. Schottelius A.J.G., Moldawer L.L., Dinarello C.A., Asadullah K., Sterry W., Edwards III C.K. 2004. Biology of tumor necrosis factor-a implications for psoriasis. Exp. Dermatol. 13, 193-222.

194. Schreiber M., Sedger L., McFadden G. 1997. Distinct domains of M-T2, the myxoma virus tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog, mediate extracellular TNF binding and intracellular apoptosis inhibition. J. Virol. 71,2171-2181.

195. Schreiber M., McFadden G. 1996. Mutational analysis of the ligand-binding domain of M-T2 protein, the tumor necroses factor homologue of myxoma virus. J. Immunol. 157, 4486— 4495.

196. Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi Т., Hume D.A. 2004. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. 75,163-189.

197. Schwacha M.G., Chaudry I.H., Alexander M. 2003. Regulation of macrophage IL-10 production postinjury via beta2 integrin signaling and the P38 MAP kinase pathway. Shock. 20, 529-535.

198. Schwarting A., Wada Т., Kinoshita K., Tesch G., Kelley V.R. 1998. IFN-gamma receptor signaling is essential for the initiation, acceleration, and destruction of autoimmune kidney disease in MRL-Fas (lpr) mice. J. Immunol. 161,494-503.

199. Scott M.J., Burch P.T., Jha P., Peyton J.C., Kotwal G.J., Cheadle W.G. 2003. Vaccinia virus complement control protein increases early bacterial clearance during experimental peritonitis. Surg. Infect. 4,317-326.

200. Seery J.P. 2000. IFN-gamma transgenic mice: clues to the pathogenesis of systemic lupus erythematosus? Arthritis Res. 2,437-440.

201. Seet B.T., Johnston J.B., Brunetti C.R., Barrett J.W., Everett H., Cameron C., Sypula J., Nazarian S.H., Lucas A., McFadden G. 2003. Poxviruses and immune evasion. Annu. Rev. Immunol. 21, 377-423.

202. Seregin S.V., Babkina I.N., Nesterov A.E., Sinyakov A.N., Shchelkunov S.N. 1996. Comparative studies of gamma-interferon receptor-like proteins of variola major and variola minor viruses. FEBS Lett. 382,79-83.

203. Sesin C.A., Bingham C.O. 3rd. 2005. Remission in rheumatoid arthritis: wishful thinking or clinical reality? Semin. Arthritis Rheum. 35,185-196.

204. Sharma R., Anker S.D. 2002. Cytokines, apoptosis and cachexia: the potential for TNF antagonism. Int. J. Cardiol. 85,161-171.

205. Shealy D.J., Wooley P.H., Emmell E., Volk A., Rosenberg A., Treacy G., Wagner C.L., Mayton L., Griswold D.E., Song X.Y. 2002. Anti-TNF-alpha antibody allows healing of joint damage in polyarthritic transgenic mice. Arthritis Res. 4: R7.

206. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. 1993. Genes of variola and vaccinia viruses necessary to overcome the host protective mechanisms. FEBS Lett. 319, 80-83.

207. Sieper J., Braun J. 2001. New treatment options in ankylosing spondylitis: a role for anti-TNFalpha therapy. Ann. Rheum. Dis. 60, iii58-iii61.

208. Skurkovich В., Skurkovich S. 2003. Anti-interferon-gamma antibodies in the treatment of autoimmune diseases. Curr. Opin. Mol. Ther. 5, 52-57.

209. Skurkovich В., Skurkovich S. 2006. Inhibition of IFN-gamma as a method of treatment of various autoimmune diseases, including skin diseases. Ernst. Schering. Res. Found. Workshop. 56,1-27.

210. Smith C.A., Davis Т., Wignall J.M., Din W.S., Farrah Т., Upton C., McFadden G., Goodwin R.G. 1991. T2 open reading frame from the Shope fibroma virus encodes a soluble form of the TNF receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 176,335-342.

211. Smith G.L., Symons J.A., Alcami A. 1998. Poxviruses: interfering with interferons. Sem. Virol. 8,409-418.

212. Smith C.A., Hu F.Q., Smith T.D., Richards C.L., Smolak P., Goodwin R.G., Pickup D.J. 1996. Cowpox virus genome encodes a second soluble homologue of cellular TNF receptors, distinct from CrmB, that binds TNF but not LT alpha. Virology. 223,132-147.

213. Smith G.L., Symons J.A., Khanna A., Vanderplasschen A., Alcami A. 1997. Vaccinia virus immune evasion. Immunol. Rev. 159,137-154.

214. Smith V.P., Bryant N.A., Alcami A. 2000. Ectromelia, vaccinia and cowpox viruses encode secreted interleukin-18-binding proteins. J. Gen. Virol. 81,1223-1230.

215. Spriggs M.K. 1996. One step ahead of the game: viral immunomodulatory molecules. Annu. Rev. Immunol. 14,101-130.

216. Streblow D.N., Soderberg-Naucler C., Vieira J., Smith P., Wakabayashi E., Ruchti F., Mattison K., Altschuler Y., Nelson J.A. 1999. The human cytomegalovirus chemokine receptor US28 mediates vascular smooth muscle cell migration. Cell. 99,511-520.

217. Strunk V., Hahnenkamp K., Schneuing M., Fischer L.G., Rich G.F. 2001. Selective iNOS inhibition prevents hypotension in septic rats while preserving endothelium-dependent vasodilation. Anesth. Analg. 92, 681-687.

218. Stuber D., Friedlein A., Fountoulakis M., Lahm H.W., Garotta G. 1993. Alignment of disulfide bonds of the extracellular domain of the interferon gamma receptor and investigation of their role in biological activity. Biochemistry. 32, 2423-2430.

219. Takami S., Minami M., Nagata I., Namura S., Satoh M. 2001. Chemokine receptor antagonist peptide, viral MIP-II, protects the brain against focal cerebral ischemia in mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21,1430-1435.

220. Tannenbaum C.S., Major J.A., Hamilton T.A. 1993. IFN-gamma and lipopolysaccharide differentially modulate expression of tumor necrosis factor receptor mRNA in murine peritoneal macrophages. J. Immunol. 151,6833-6839.

221. Того J.R., Finlay D., Dou X., Zheng S.C., LeBoit P.E., Connolly M.K. 2000. Detection of type 1 cytokines in discoid lupus erythematosus. Arch. Dermatol. 136,1497-1501.

222. Tortorella D., Gewurz B.E., Furman M.H., Schust D.J., Ploegh H.L. 2000. Viral subversion of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 18,861-926.

223. Travis S., Yap L.M., Hawkey C., Warren В., Lazarov M., Fong Т., Tesi R.J. 2005. RDP58 is a novel and potentially effective oral therapy for ulcerative colitis. Inflamm. Bowel Dis. 11,713-719.

224. Tsujimoto M., Yip Y. K., Vilcek J. 1986. Interferon-gamma enhances expression of cellular receptors for tumor necrosis factor. J. Immunol. 136, 2441-2444.

225. Turner P.C., Moyer R. 2001. Serpins enable poxviruses to evade immune defenses. ASM News. 67,201-210.

226. Turner P.C., Moyer R.W. 1998. Control of apoptosis by poxviruses. Sem. Virol. 8, 453469.

227. Upton C., McFadden G. 1986.Tumorigenic poxviruses: analysis of viral DNA sequences implicated in the tumorigenicity of Shope fibroma virus and malignant rabbit fibroma virus. Virology. 152,308-321.

228. Upton C., Mossman K., McFadden G. 1995. The myxoma virus soluble interferon-gamma receptor homolog, M-T7, inhibits interferon-gamma in a species specific manner. Biol. Chem. 69,3031-3038.

229. Vasoo S., Hughes G.R. 2005. Theory, targets and therapy in systemic lupus erythematosus. Lupus. 14,181-188.

230. Veerhuis R., Boshuizen R.S., Familian A. 2005. Amyloid associated proteins in Alzheimer's and prion disease. Curr. Drug Targets CNS. Neurol. Disord. 4, 235-248.

231. Wajant H., Grell M., Scheurich P. 1999. TNF receptor associated factors in cytokine signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 10, 15-26.

232. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. 2003. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death and Differentiation. 10,45-65.

233. Walsh S.R., Shear N.H. 2004. Psoriasis and the new biologic agents: interrupting a T-AP dance. CMAJ. 170,1933-1941.

234. Winterfield L.S., Menter A., Gordon K., Gottlieb A. 2005. Psoriasis treatment: current and emerging directed therapies. Ann. Rheum. Dis. 64, ii87-ii90.

235. Wong D., Dorovini-Zis K., Vincent S.R. 2004. Cytokines, nitric oxide, and cGMP modulate the permeability of an in vitro model of the human blood-brain barrier. Exp. Neurol. 190,446-455.

236. Xiang Y., Moss B. 1999. IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human poxvirus-encoded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,11537-11542.

237. Xu X., Nash P., McFadden G. 2000. Myxoma virus expresses a TNF receptor homolog with two distinct functions. Virus Genes. 21,97-109.

238. Yang Z., Chen M., Wu R., Fialkow L.B., Bromberg J.S., McDuffie M., Naji A., Nadler J.L. 2002. Suppression of autoimmune diabetes by viral IL-10 gene transfer. J. Immunol. 168, 6479-6485.

239. Ye S., Goldsmith E.J. 2001. Serpins and other covalent protease inhibitors. Curr. Opin. Struct. Biol. 11,740-745.

240. Zhang S., Kaplan M.H. 2000. The p38 mitogen-activated protein kinase is required for IL-12-induced IFN-gamma expression. J. Immunol. 165,1374-1380.

241. Zhu Z., Stevenson D„ Schechter J.E., Mircheff A.K., Ritter Т., Labree L., Trousdale M.D. 2004. Prophylactic effect of IL-10 gene transfer on induced autoimmune dacryoadenitis. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 45,1375-1381.

242. Барштейн Ю.А., Персидский Ю.В., Грутман М.И. 1990. Взаимосвязь структурной перестройки эндотелия микрососудов печени с изменениями в клетках Купфера и гепатоцитах при развитии грамотрицательной инфекции. Арх. патол. 12, 33-38.

243. Коробко В.Г., И.В. Давыдов, В.Н. Добрынин, Н.М. Пустошилова, JI.P. Лебедев, И.П. Гилева, В.А. Петренко. 1993. Получение и бактериальная экспрессия мутантного гена лимфотоксина человека. Биоорганическая химия, 19,414—419.

244. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Шингарова Л.Н., Чувпило С.А., Болдырева Е.Ф., Кравченко В.В., Шахов А.Н., Недоспасов С.А., Турецкая Р.И. 1994.

245. Рекомбинантная плазмидная ДНК промежуточный продукт для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF311, кодирующая полипептид со свойствами TNF человека, и штамм Е. coli продуцент полипептида со свойствами TNF человека. Рос. пат. № 1445193.

246. Кэтти Д. 1991. Антитела. Методы (книга 1). М.: Мир, с. 106.

247. Лебедев Л.Р., Рязанкин И.А., Сизов А.А., Агеенко В.А., Одегов В.Н., Афиногенова Г.Н., Щелкунов С.Н. 2001. Способ очистки антагонистов фактора некроза опухолей и исследование их некоторых свойств. Биотехнология. 6,14-18.

248. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd., М., 1998. 386 с.

249. Мирошников П.И., Лебедев Л.Р., Терещенко Т.А. 2005. Получение интерферона-гаммаи его аналога дельтаферона. Биотехнология. 1,11-18.

250. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1991. с.248-249.

251. Пермяков Н.К., Яковлев М.Ю., Галанкин В.Н. 1989. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита. Арх. патол. 5, 3-11.

252. Пустошилова Н.М., Килева Е.В., Денисова Л.Я., Шингарева Н.В., Масычева В.И., Коробко В.Г., Денисов Л.А., Сандахчиев Л.С., Калинин Ю.Т. 1994. Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей. Рос. пат. № 1438240.

253. Черствой Е.Д., Сятковский В.А., Григорьев Д.Г. 1990. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при эндотоксиновом шоке. Арх. патол. 9,51-56.

254. Щелкунов С.Н. 2003. Иммуномодуляторные белки ортопоксвирусов. Молекуляр. биология. 37,41-53.

255. Эпштейн О.И., Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M. 2001. Лекарственное средство и способ лечения патологического синдрома. Рос. патент №2192888.

256. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Москва. Мир. 1999. 608 с.

257. Applied Molecular Evolution Files Investigational New Drug Application for AME-527, Next-Generation Remicade, in Rheumatoid Arthritis. 2003. November, 24. (http://arthritis.about.eom/b/a/045412.htm)

258. Clinical study of a Humanized Anti-Interferon-y Monoclonal Antibody (HuZAF) for treatment of Moderate to Severe Crohn's Disease. (http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00072943)

259. A Phase 2 Study to Evaluate the Safety, Tolerability, and Activity of Fontolizumab in Subjects With Active Rheumatoid Arthritis. (http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00281294)

260. Clinical study of CNI-1493 for Treatment of Moderate to Severe Crohn's Disease. (http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00038766)

261. The New TNF Nomenclature Scheme (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/tnftop.html)

262. GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)

263. MPXV|DQ011154ICON-2003-358|1. MPXV|AY753185|COP-1958I1. MPXV|AY741551||SLN

264. MPXV|DQ011157|USA-2003-039|

265. MPXV|AF380138|ZAI-1996-I-16I

266. MPXV|DQ011156ILIB-1970-184|

267. MPXV|DQ011153|USA-2003-044|

268. MPXV|AY603973|MPXV-WRAIR7-61I

269. MPXV|DQ011155IZAI-1979-005|

270. MPXV|AJ404662|SLN-70-0266|

Информация о работе