Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и свойств желтого флуоресцирующего белка zFP538 из кораллов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и свойств желтого флуоресцирующего белка zFP538 из кораллов"

На правах рукописи

Зубова Надежда Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ЖЕЛТОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО БЕЛКА гГР538 ИЗ КОРАЛЛОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. МВ Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Савицкий А.П.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Вржещ П.В кандидат биологических наук Лукьянов К А.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

Защита состоится «20» июня 2006 года в 16м час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им М.В Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. МВ.Ломоносова

Автореферат разослан « » мая 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^

кандидат химических наук Сакодынская И.К

' ^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время зеленый флуоресцирующий белок (ОБР) и его гомологи широко используются в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров, позволяющих исследовать многообразные процессы, происходящие в живых клетках, тканях и организмах. Использование таких индикаторов позволяет изучать локализацию и транспорт различных белков внутри клетки, уровень экспрессии генов, взаимодействия между белками в клетке, определять концентрацию низкомолекулярных метаболитов, некоторых физиологически важных ионов (Са2+, СГ), рН и редоксипотенциал внутренней среды, изучать сигнальные пути и взаимодействия рецептор-лиганд, определять ферментативную активность в живых клетках. Флуоресцирующие белки могут быть гетерологически экспрессированы в любых клетках, и для наблюдения их флуоресценции не требуется каких-либо дополнительных ферментов или кофакторов, за исключением кислорода.

Поглощение и флуоресценция желтого флуоресцирующего белка гРР538, выделенного из ротового диска донного полипа 2ост1кив (рифовые кораллы), лежат в диапазоне длин волн между флуоресценцией зеленых и поглощением красных белков. Это дает возможность использовать гКР538 для индуктивно-резонансного переноса энергии, лежащего в основе многих методов анализа с использованием цветных белков. Желтый белок гЕР538, как и многие другие цветные белки из кораллов, образует тетрамеры и более высокомолекулярные агрегаты, однако влияние агрегации на спектральные свойства не исследовано, и нельзя исключить важность этих процессов для функциональности цветных белков в природе. Цветные флуоресцирующие белки обычно используются для исследования живых биологических систем, рН внутри которых может сильно изменяться даже в пределах одной клетки, поэтому представляет интерес оценить влияние рН на яркость и стабильность гЕР538.

Цели и задачи исследования:

- изучить рН-зависимостъ спектральных свойств гРР538;

- оценить степень агрегации гРР538;

- изучить влияние агрегации на спектральные свойства гРР538.

Научная новизна. Впервые изучены рН-зависимости поглощения и

флуоресценции гРР538; впервые показано влияние агрегации на яркость и устойчивость гРР538 в кислых средах; оценены размеры агрегатов гРР538 в

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ✓

ОЭ 200 ¿акт

растворах и в пленках; впервые проведено исследование пленок zFP538 методом сканирующей зондовой микроскопии.

Практическая значимость работы. Полученные данные по рН-зависимостям и агрегации желтого белка zFP538 позволяют построить стратегию разработки новых молекулярных и клеточных сенсоров на основе этого белка. Влияние агрегации на яркость и стабильность zFP538 к кислотной денатурации позволяет сформулировать гипотезу о регуляции в фотопротекторных свойствах желтого белка в кораллах.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных симпозиумах и конференциях Biomedical optics 2003, 2Ö04, 2005 и 2006 (Сан-Диего, США), «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), «Biocatalysis-2005» (С.-Петербург-Кижи-Валаам, 2005), всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (пансионат «Юность», 2005), конференции молодых ученых «Инженерная энзимология», посвященной 80-летию И.В. Березина (химический факультет МГУ, Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего {S0 ссылок. Работа изложена на /¿т2, страницах, содержит рисунков и $ таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка рекомбинантного zFP538. Белок был экспрессирован в клетках Е. coli (штамм JM-109) в виде полипептида, содержащего MRGS(H)6GSAQ последовательность на N-конце, за которой идет последовательность аминокислот zFP538 дикого типа с 3-го по 231-й остаток (плазмида pQE30-zFP538 была любезно предоставлена член. корр. РАН, д.б н. Лукьяновым С.А. (ИБХ)). Очистку рекомбинантного zFP538 из осветленного центрифугированием клеточного экстракта проводили методом аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке (металл-аффинная смола TALON, Clontech). Полученные гомогенные препараты, по данным электрофореза в поли акр иламидном геле в денатурирующих условиях, хранили при +4°С.

Хромофорсодержащие пептиды, выделенные из zFP538, были предоставлены к.х.н. Винокуровым J1.M. (ФИБХ, г. Пупщно).

Измерения светорассеяния рекомбинантного zFP538 (4x10"5 М, в буфере 50 мМ Трис, 50 мМ бистриспропан, рН 9) были выполнены с помощью DynaPro Molecular Sizing Instrument (Protein Solution Ltd., Англия) в термостатируемой кювете (25 °С). Полученные данные были обработаны с использованием программы Dynamics V6.

Подготовку образца для сканирующей зондовой микроскопии осуществляли двумя способами. По первому способу 5 мкл раствора белка в воде помещали на покровное стекло и высушивали на воздухе не менее суток. Поверхность образца сканировали с помощью атомно-силового микроскопа «Смена» (NT-MDT, Зеленоград). По второму способу 200 мкл растворов ZFP538 (1,1х10~7 М, 1,1х10~8 М и 1,1х10"9 М в 50 мМ фосфатно-натриевом буфере с рН 7,4) были помещены в лунки 96-луночного планшета и инкубировались при комнатной температуре более суток. В эти растворы помещали специально подготовленные пластинки графита (NT-MDT, Зеленоград) и инкубировали не менее часа. Затем пластинки промывали в деионизованной воде, обдували воздухом и высушивали в эксикаторе. Поверхность пластинок сканировали с помощью атомно-силового микроскопа P47-SPM-MDT (NT-MDT, Зеленоград).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. рН-з а висим ости поглощения zFP538 Поглощение zFP53S зависит от рН, при этом вид рН-профиля изменяется в зависимости от концентрации бежа. При нейтральных и слабощелочных значениях рН в спектрах поглощения zFP538 (С = 5,9х10"5 М) наблюдается главный узкий пик в видимой области с максимумом при 529 нм и минорный пик с максимумом при 497 нм. При уменьшении рН раствора до рН 3 эти пики переходят в более широкую полосу поглощения с максимумом при 408-410 нм, которая становится главным пиком при рН<5 (рис. 1). Данный переход полностью обратим, поскольку при обратном титровании из кислой области в щелочную интенсивность поглощения при 529 нм восстанавливается (рис. 2А), а пик при 410 нм исчезает. При движении в щелочную область до рН~12 двойной пик 497 - 529 нм переходит в более широкий пик с максимумом в районе 472 нм (рис. 1), который становится главным при рН>11. Данный

переход практически необратим (спектр поглощения не восстанавливается при обратном подкислении), ему соответствует изобестическая точка при 488±2 нм и кажущееся значение рКа=11,18±0,02 с коэффициентом Хиллап=2,9+0,3.

рН8,7

350

450 550

Длина волны, нм

650

350

450 550

Длина волны, нм

650

Рис. 1. Спектры поглощения г£Р538 при разных рН Концентрация белка 5,9x10-5 М, буфер 10 мМ ЭДТА, 0,4 мМ (3-меркаптоэтиламин, 0,15 М ШС1 Спектры записаны в процессе прямого последовательного титрования раствора белка из слабощелочной области от рН 8,7 в кислую область до рН 3 (слева) и в щелочную область до рН 12 (справа) Спектры корректированы на рассеяние света

£

х

О

Й £

с

а>

X

4)

3" о с

I—

о с

0,06

0,04

0,02

7 8 9 10 11 12

РН

Рис 2. рН-профили поглощения при 529 нм для концентрированного (А) и разбавленного (Б) растворов гРР538. Стрелками указаны направления титрования (А) Концентрация белка 5,9х10"5 М, условия как на рис 1 ♦- прямое титрование кислотой, о - прямое титрование щелочью, Д - обратное титрование из кислой области в щелочную, ■ - обратное титрование из щелочной области в нейтральную. (Б) Концентрация белка 5,5х10"7 М, буфер. 1 мМ ЭДТА (Маг-соль), 0,4 мМ {5-меркаптоэтиламин и 0,15 М №С1 Длина оптического пути 5 см ♦ -прямое титрование кислотой, Д - обратное титрование щелочью

Если белок в растворе существует в виде агрегатов (олигомеров), то уменьшение концентрации белка должно приводить к их полной или частичной диссоциации. Чтобы проверить, как повлияет уменьшение концентрации белка на рН-зависимость спектров поглощения, в аналогичных условиях было проведено титрование гЕР538 с более чем в сто раз меньшей концентрацией (5,5х10'7 М). рН-профиль поглощения разбавленного раствора гРР538 сдвинут

вправо примерно на 0,5-1 ед. рН относительно аналогичного профиля для концентрированного раствора белка. Основное различие наблюдается в диапазоне рН 4-8, где на рН-профиле концентрированного белка есть плато при рН 6,5-8, а поглощение разбавленного раствора плавно уменьшается уже от рН 7,8 (рис. 2Б). Это выражается в изменении определяемых кажущихся значениях рКа, которые суммированы в табл. 1. Кроме того, уменьшение поглощения гРР538 в кислой области становится частично необратимым, в отличие от раствора с высокой концентрацией белка, и амплитуда главной полосы поглощения при возвращении к нейтральным условиям восстанавливается только на 50% (рис. 2Б).

Таблица 1. Кажущиеся значения рКа, рассчитанные по рН-профилям поглощения и флуоресценции концентрированных растворов гРР538 (значения рКа приведены для отдельного титрования вместе со стандартными

Титрование рК, РК2

Данные по поглощению при 529 нм, С = 5,9x10"5 М (рис. 2 А)

Прямое от рН 8,75 дорНЗ 4,48 ± 0,05 5,71 ±0,12

Данные по поглощению при 530 нм, С = 5,5x10"7 М (рис. 2Б)

Прямое от рН 7,8 до рН 3,1 4,92 ±0,05 6,6 ±0,1

Данные по флуоресценции (возбуждение при 520нм, эмиссия при 540 нм), С = 2,8x10"5 М (рис. 4)

Прямое от рН 8,3 до рН 3,1 4,45 ±0,03 6,28 ± 0,16

Обратное от рН 3,1 до рН 9,6 4,48 ± 0,07 5,73 ±0,14

2. рН-зависимости флуоресценции гРР538

Возбуждение гРР538 светом 480-520 нм приводит к интенсивной желтой флуоресценции с максимумом при 538-540 нм и плечом в районе 580 нм (рис 3). При изменении рН не наблюдается переходов между разными спектральными формами, г¥?5Ъ2> всегда флуоресцирует желтым светом, интенсивность которого изменяется в зависимости от рН Форма спектра флуоресценции также не зависит и от концентрации белка, за исключением очень концентрированных растворов гРР538, в которых спектр искажается за счет эффектов перепоглощения и внутреннего фильтра.

£

S

к со X X со со

а

S 2

а. о X

1,0 |о,8

z %

cfo.6

аз

CL

|0,4 0,2 0,0

526-529 539-540

300 400 500 600 Длина волны, нм

Рис 3 Нормированные на максимальную интенсивность спектры возбуждения (пунктир) и эмиссии (сплошная линия) ZFP538 при нейтральных pH При записи спектра эмиссии длина волны возбуждения была 480 нм, при записи спектра возбуждения длина волны регистрации эмиссии была 550 нм

Концентрационный эффект. Флуоресценция растворов с концентрацией 2,8-3,Зх10"5 М плавно уменьшается, начиная с рН ~7, а в диапазоне рН 5,5-3 происходит резкое падение практически до нуля (~3% от максимального значения) (рис. 4). При титровании до рН ~2 восстановление исходного нейтрального значения рН приводит лишь к небольшому восстановлению флуоресценции (~3%), если же титрование закончить при рН >3, то при обратном титровании наблюдается полное восстановление флуоресценции (рис. 4). При рН -12 флуоресценция необратимо уменьшается практически до нуля.

рН-профили поглощения при 529 нм и возбуждаемой при 520 нм флуоресценции практически совпадают (рис. 2А и рис. 4), следовательно, квантовый выход флуоресценции не зависит от рН, а изменение флуоресценции определяется изменением поглощения на длине волны возбуждения Таким образом, и уменьшение флуоресценции, и уменьшение поглощения при подкислении концентрированных растворов гРР538 до рН ¿3 - обратимые процессы, которые контролируются двумя переходами, одному из которых соответствует рКа в районе 4,5, а другому - в районе 5,7-6,3 (таблица 1).

8

Расхождение рК2 при прямом и обратном титровании связано, по-видимому, с процессами агрегации белка, что будет обсуждено позднее.

§• 800

о ^ & а

■е-1

600

400

> <п

1 а 8 =

200

6

рН

8 9 10

Рис 4 рН-профили флуоресценции желтого белка гРР538 при 540 нм, длина волны возбуждения 520 нм. Концентрация белка 2,8х10"5 М; буфер- 5 мМ ЭДТА, 2 мМ 0-меркаптоэтиламин, 0,15 М ЫаС1. Прямое титрование от рН 8,3 в кислую область (♦), обратное титрование этого же образца в щелочную область (д). Линии соответствуют теоретическим кривым, описывающим последовательное титрование двух ионогенных групп (АН2оАНоА) с рК1=4,45±0,03 и рКг=6,28±0,16 (прямое титрование), рК1=4,48±0,07 и рК2=5,73±0,14 (обратное титрование).

По мере понижения концентрации белка зависимость его флуоресценции от рН среды меняется: рН-профиль флуоресценции сдвигается в щелочную область, при этом в определенном концентрационном диапазоне (10"7 М) появляется дополнительный максимум (колокол) в области кислых значений рН (рис. 5). При дальнейшем уменьшении концентрации белка этот колокол сдвигается в более кислую область и исчезает при понижении концентрации до ~8х10"9 М. Рассчитанные из этих данных кажущиеся значения рКа, проявляющиеся как перегибы на рН-профилях флуоресценции, суммированы в табл. 2.

Рис. 5. Влияние концентрации белка на рН-профили флуоресценции й?Р538 при 540 нм, полученные при прямом титровании из нейтральной области в кислую. Возбуждение при 490-520 нм, интенсивность флуоресценции

нормирована на интенсивность при рН 8 Концентрация белка: 3,3x10"' М (1), 1,7x10""5 М (2), 3,3x10"* М (3), 5,2х10-7 М (4), 1,3х10"7 М (5), 8x10^ М (6) Буфер: 5 мМ глицин, 5 мМ цитрат натрия, 5 мМ фосфат (ЫазНРОД 0,15 \INaCl.

Таблица 2. Кажущиеся значения рКа, рассчитанные из рН-профилей флуоресценции, записанных при разных концентрациях гРР538 (рис. 5) (значения рКа приведены для отдельного титрования вместе со стандартными отклонениями)._____

Концентрация М РК! рк2 рК3 рК4 рК5

З.ЗХЮ4 4,60±0,02 6,30±0,06

1,7x10'5 4,47±0,01 6,17±0,01

З.ЗхЮ'6 4,56±0,01 6,20±0,01 7,69±0,01

5,2x10'7 3,85±0,01 6,57±0,01

1,3х10"7 3,41±0,01' 5,52±0,02 6,87±0,01

8х10'9 4,51±0,02 6,16±0,02 7,89±0,03

коэффициент Хилла п-2.

Важно отметить, что уменьшение флуоресценции, как и поглощения, разбавленных растворов при подкислении частично необратимо, по крайней мере, во временной шкале эксперимента. При возвращении к нейтральным условиям флуоресценция не восстанавливается полностью, при этом степень восстановления флуоресценции выше для растворов с более высокой концентрацией белка (рис. 6).

Рис. 6. Влияние концентрации белка на степень восстановления флуоресценции г]?Р538 в ходе обратного титрования из кислой области в щелочную после прямого титрования белка от рН 8 до рН 3. Концентрация белка: 1,7х1(Г5 М (1), 8,3x10"* М (2), 3,3x10"6 М (3), 1,0x10"® М (4), 8,0x10"' М (5) Возбуждение при 490-520 им, регистрация флуоресценции при 540 нм. Буфер. 5 мМ глицин, 5 мМ цитрат натрия, 5 мМ фосфат (КагНРОД 0,15 М ЫаС1 По оси ординат отложена интенсивность флуоресценции при обратном титровании, выраженная в долях максимальной интенсивности при прямом титровании.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных по рН-зависимостям спектральных свойств гРР538 можно сделать вывод о том, что в растворах желтого белка гРР538 существуют различные состояния агрегации, характеризующиеся разной чувствительностью яркости к изменению рН. Эти состояния определяются не только концентрацией белка,

но и значением рН раствора, в результате чего наблюдается изменение неравновесных рН-профилей поглощения и флуоресценции при разбавлении белка. Изучение таких неравновесных рН-зависимостей представляет интерес потому, что клеточные процессы могут протекать на такой же временной шкале, и это важно для интерпретации получаемых данных.

Нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции гРР538 от концентрации. Влияние концентрации желтого белка гРР538 и, следовательно, состояния агрегации, на его яркость четко прослеживается по зависимости интенсивности флуоресценции или удельной интенсивности от концентрации белка. Эта зависимость нелинейна в исследованном диапазоне концентраций (6х10"*-5,5х1(Г7 М) при рН 5-9 (рис. 7). Такая зависимость соответствует существованию разных состояний агрегации, при этом состоянию, наблюдаемому при более высокой концентрации гЕР538, отвечает более высокая яркость флуоресценции.

250

s

X ф

8 ф 200

с 5 150

feS 100 ? *

£ о. S с 50

о

X

ф „ I- п

X

5

рН6.5

0 1 2 3 4 5 6 Концентрация хЮ7, М

j> -X о

IS

4x10

3x10°

2x10

« Ж

X ф

£ 3

Is. f

1x10°

0 1 2 3 4 5 6 Концентрация х107, М

Рис 7 Нелинейная зависимость интенсивности флуоресценции гРР538 (слева) и удельной интенсивности флуоресценции (1/С) (справа) от концентрации белка при рН 6,5. Буфер- 50 мМ ЭДТА, 0,15 М N80, 2 мМ (З-меркаптоэтиламин Длина волны возбуждения - 500 нм

3. Оценка размеров агрегатов zFP538

Размеры агрегатов zFP538 оценены методами гель-фильтрации, светорассеяния и сканирующей зондовой микроскопии.

По данным гель-фильтрации zFP538 на сефакриле S1000 SF (Pharmacia) молекулярная масса агрегатов белка при рН 8 и концентрации 3,88x10'5 М составляет 3,0x108 г/моль, что в 104 раз превышает молекулярную массу мономера zFP538 (27429 Да). Это значение получено в приближении, что

и

форма, плотность и степень гидратации агрегатов ¿РР538 совпадают с таковыми для наночастиц, с помощью которых построена калибровка (сферы плотностью 1,05 г/мл). Определяемый гель-фильтрацией гидродинамический диаметр агрегатов гРР538 равен 97 нм. Он уменьшается при понижении концентрации белка (рис. 8).

Согласно данным гель-фильтрации размер агрегатов уменьшается не только при уменьшении концентрации белка, но и при уменьшении рН от 8,38 до 6,33 (рис. 9).

1,2 0,8 -0,4-

8

гГРЬЪЪ ,120 нм

210 нм

304 нм

8,8

9,6

10,4

1_дМг

£

I

=г

X

&

га у

е-0) г

(О х «=Г

99 98 97 96 95 94 93 92

0.0 5,0x10'5 1,0x10" Концентрация белка, М

Рис 8 Калибровочная прямая в координатах логарифм молекулярной массы - коэффициент распределения для определения молекулярной массы (слева), цифрами указаны диаметры наночастиц, □ - коэффициент распределения для гРР538 при рН 8,0 и концентрации белка 3,88х10"5 М Элюирующий буфер 50 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-НС1, 0,15 М КаС1, 2 мМ Р-меркаптоэтиламин Зависимость диаметра частиц от концентрации белка (справа)

с; 5

х со ш о о.

X

9 с; со

5 Ф А Ю

О

25,2-,

24,8

24,4-

24,0

рН 8,38 рН 6,33

1x10'7 1x10"® 1x10"® 1x10"* Концентрация белка, М

Рис 9 Зависимость объема элюирования от концентрации белка при гель-фильтрации аРР538 на Сефакриле 8500 НИ при рН 8,38 (о) и рН 6,33 (А). Ось концентрации представлена в логарифмическом виде Элюирующий буфер 50 мМ ЭДТА, 10 мМ Тт-НС!, 0,15 М N801, 2 мМ >3-меркаптоэтиламин Объем

элюирования увеличивается с уменьшением концентрации белка и рН

По данным светорассеяния в растворе с высокой концентрацией белка (~1,1 мг/мл, или 4x10"5 М) при рН 9 гРР538 существует в виде крупных

агрегатов диаметром 94 нм, что практически совпадает с данными гель-фильтрации.

Определяемые методами светорассеяния и гель-фильтрации размеры агрегатов являются гидродинамическими и зависят не только от истинного размера частиц, но и от формы и размера гидратной оболочки, таким образом, они являются завышенными по сравнению с истинными значениями.

Оценить форму агрегатов можно методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ). Для исследования агрегации гБР538 этим методом необходимо нанести белок на твердую подложку. При высушивании капли водного раствора гРР538 на предметном стекле желтый белок образует флуоресцирующую пленку в виде кольца. В отличие от гРР538, мономерный зеленый белок ЕвРР в подобных условиях кристаллизуется, а не образует пленку. Исследование поверхности пленок гРР538 с помощью СЗМ показало, что они состоят из гранул эллиптической формы, большая ось которых лежит в диапазоне -50-300 нм, а малая ось - в диапазоне ~30-130 нм (рис. 10).

Рис 10 СЗМ-изображение поверхности пленки, образованной гКР538 на поверхности предметного стекла (просветление соответствует увеличению высоты) (слева) Распределение числа агрегации гРР538, рассчитанного как отношение объема агрегатов к объему мономера на основании 146 СЗМ-изображений гранул белка (справа)

При получении СЗМ-изображений реальный рельеф поверхности может искажаться, что обусловлено конечными размерами зонда и взаимодействием зонда с образцом. Поверхности, СЗМ-изображения которых приведены на рис 10, не являются однослойными. Они образованы частицами, лежащими друг на друге, в результате чего трудно учесть эффекты устарения профиля и занижения высот. По этой причине размеры гранул гРР538 оценивали без

введения каких-либо поправок. Объемы гранул рассчитывали в приближении, что гранулы являются эллипсоидами вращения, при этом большая и малая оси эллипсоидов оценивали из продольных размеров гранул, а высоту (т.к. она занижена на СЗМ-изображениях) приняли равной малой оси эллипсоидов. Для оценки числа агрегации объем гранул разделили на объем мономера (цилиндр объемом 19 нм3). Распределение числа агрегации (рис. 10) является, по крайней мере, бимодальным, при этом главный пик (которому принадлежат 50% гранул) соответствует числам агрегации порядка 5-9 тысяч. Средневзвешенное число агрегации равно 3,5x104.

Таким образом, три независимых метода показывают существование крупных агрегатов в концентрированных растворах гРР538 при рН 8-9 (табл. 3).

Таблица 3. Размеры агрегатов гРР538, определенные разными методами.

Метод Гель-фильтрация Светорассеяние Микроскопия

С ~1 мг/мл, рН 8-9

Диаметр частиц 97 нм 94 нм 50x150' нм

Молекулярная масса агрегата ЗхЮ5 кДа

Число агрегации 104 масс мономера 104 объемов мономера

Приведены размеры эллипсоидальных гранул, принадлежащих главному лику диаграммы распределения

Для получения изображений отдельных агрегатов гРР538 на гладкой поверхности использовали метод адсорбции белка из растворов с разной концентрацией при рН 7,4 на специально подготовленной графитовой пластинке. Продольные размеры агрегатов оценивали с учетом радиуса закругления кончика зонда (10 нм), высоту учитывали без поправки, объем рассчитывали по формуле для эллипсоида (4/ЗяаЬс, где а, Ь и с - полуоси). Рассчитанные таким образом размеры агрегатов приведены в табл. 4.

Таблица 4. Средневзвешенные размеры агрегатов гРР538, сорбированных на графитовой пластинке (рН 7,4).___

Концентрация белка, М Размер выборки Объем, нм3 Число агрегации (объемов мономеров)

1,1х10'7 370 частиц 2,2x103 114

МхЮ-8 427 частиц 9.0Х102 46

1,1x109 106 частиц 4,0x102 20

Таким образом, оцененные разными методами размеры агрегатов гРР538 в концентрированных растворах при рН 8-9 и пленках составляют ~104 мономеров, а в разбавленных растворах при рН 7,4 порядка 20+100 мономеров.

4. Кинетика кислотной денатурации гРР538

Вышеописанные значения рКа являются кажущимися, поскольку они определялись из неравновесных рН-профилей, отражающих не только изменение состояния ионизации агрегатов гРР538, но и постепенную денатурацию белка при низких значениях рН. Поэтому была исследована кинетика кислотной денатурации гРР538 при различных рН и различных концентрациях белка.

Для всех исследованных концентраций бежа (1,36x10'8 М, 1,36x10"7 М и 1,33x10"6 М) интенсивность флуоресценции гРР538 уменьшается со временем при инкубации белка при рН 3,5-^5,5, при этом степень уменьшения зависит от рН раствора (рис. 11). Интенсивность флуоресценции уменьшалась по двухэкспоненциальному закону при значениях рН в диапазоне 3,75+4,24:

А = А1ехр(-к^) + А2ехр(-к21) + Ао, где Ао - остаточная флуоресценция при бесконечном времени. При рН 4,5+5,5 на начальных участках кинетических кривых наблюдалось плато (интенсивность флуоресценции слабо уменьшалась в течение первых 200-300 с, а затем резко падала по двухэкспоненциальному закону). Кинетические константы имеют порядок к|=10'2+10'3 с"1 и к2=10"3-Ч0^ с"'. При самом низком значении рН 3,5 кинетические зависимости описывались уравнением с тремя экспонентами:

А = А^хрС-М) + А2ехр(-к20 + А3ехр(-к30 + Ао, где кинетические константы имеют порядок к1=(3+6)х10"2 с'1, к2=(5+8)х10'3 с"' и кз=(0,26+1,1 )х 10'3 с'1.

Для всех исследованных концентраций гЕР538 начальная скорость уменьшения флуоресценции увеличивается с ростом кислотности среды, и эта зависимость линеаризуется в логарифмических координатах с тангенсом угла наклона ~2 в диапазоне рН 3,5-4,5 (рис. 11).

Рис. 11. Кинетические кривые затухания флуоресценции ¿РР538 (1,36х10"7 М; длина волны возбуждения 500 нм), нормированные на интенсивность флуоресценции в начальный момент времени (слева) Буфер 50 мМ ЭДГА, 0,15 М №01, 2 мМ Р-меркаптоэтиламин Зависимость логарифма начальной скорости уменьшения флуоресценции от рН (справа), рассчитанная по данным кинетических кривых, приведенных слева.

Величина относительной остаточной флуоресценции при бесконечном времени тем больше, чем больше концентрация белка во всем диапазоне исследованных значений рН (рис 12) Таким образом, агрегация делает желтый белок гРР538 более стабильным к кислотной денатурации.

£

РН

Рис 12. Зависимость относительной остаточной флуоресценции гРР538 при бесконечном времени от рН раствора, в котором инкубируется белок. Кривые соответствуют трем разным концентрациям белка: 1,33x10-6 М (А), 1,36x10-7 М (•), 1,36x10-8 М(0).

Полученные данные не позволяют предложить точный механизм кислотной денатурации гРР538, однако можно сделать некоторые предположения. Кинетика денатурации в диапазоне рН 3,75^-4,24 описывается двумя экспонентами, поэтому существуют, по крайней мере, три формы белка, две из которых флуоресцируют. Поскольку при уменьшении концентрации гРР538 флуоресценция и поглощение (рис. 2 и рис. 6) не восстанавливаются

полностью при возвращении к нейтральным условиям, то существует, по крайней мере, один необратимый переход (необратимая денатурация белка) При высокой концентрации белка (-3x10-5 М) изменение флуоресценции в ходе непрерывного титрования кислотой полностью обратимо, что означает отсутствие необратимой денатурации (рис. 4). На основании этого можно предположить, что сначала происходит дезагрегация белка (концентрационно-зависимый процесс), после которой становится возможной денатурация белка Таким образом, имеет место диссоциативная денатурация белка Размеры агрегатов, в свою очередь, определяют различия в кинетике денатурации при различных концентрациях белка Для объяснения кинетики кислотной денатурации гБР538 можно предложить следующую простейшую схему

грр538пс>2рр538т-»2рр538<1, где пит- разные числа агрегации, а гРРбЗва - необратимо денатурированный белок. Полипептидная цепь в гРР538 подвергается разрыву в процессе формирования хромофора, поэтому потеря нативной структуры белка может приводить к необратимой денатурации гРР538 за счет нарушения процесса рефолдинга. Следует отметить, что переходов между различными состояниями агрегации может быть несколько, с чем, например, может быть связано появление 3-й экспоненты в кинетике кислотной инактивации при рН 3,5. Кинетически незаметные ранее стадии могут проявляться при изменении рН. Появление плато на начальных участках кинетических кривых при рН >4,24 может быть обусловлено медленным протеканием процессов, приводящих к образованию промежуточной формы, только после накопления которой в достаточной концентрации уменьшение флуоресценции становится заметным.

Инкубация гРР538 при низких рН приводит к изменениям спектров возбуждения и флуоресценции, наиболее существенным из которых является изменение соотношения флуоресценции при 580 и 540 нм. Это соотношение увеличивается со временем инкубации, что наиболее заметно при рН 3,5 и более низких концентрациях белка (рис. 13).

Ö s

i 5-

S Ir

rr О

I & st

& X

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

500 550 600 Длина волны, нм

_ 2,0 s

i 1i5i

5 X

о 8

650

1,0

0,5

500 1000 Воемя. с

Рис. 13 Нормированные на интенсивность при 540 нм спектры флуоресценции ;гРР538 (концентрация белка 1,36x10'7 М, длина волны возбуждения 480 нм) в зависимости от времени инкубации при рН 3,5 (слева) Отношение интенсивностей флуоресценции при 540 и 580 нм в зависимости от времени инкубации при рН 3,5 (справа). Концентрация белка 1,36хЮ"7М (о) и 1,36x10-® М (■).

Наблюдаемое изменение может быть обусловлено катализируемым кислотой гидролизом иминной связи в структуре хромофора zFP538 с образованием кето-формы хромофора (рис. 14), которая в изолированном состоянии в растворе флуоресцирует при 580 нм, тогда как циклическая имино-форма флуоресцирует при 539 нм (рис. 15 и рис. 16).

0 °ч\

у—Aap-Arg

О H,N

Рис 14. Катализируемое кислотой превращение иминной формы хромофора в нативном FP538 (слева) в кето-форму хромофора в денатурированном белке (справа).

Значения рКа, рассчитанные из кислых ветвей рН-профилей поглощения и флуоресценции имино- и кето-форм хромопептида гЕР538, приведены в табл. 5.

0

1

к

8

©

У

0,16

0,12 -

0,08

0,04

370 470 570 Длина волны, нм

л &

к я

ф У

300 400 500 600 700 Длина волны, нм

Рис 15. Спектры поглощения (сплошные линии) и флуоресценции (пунктир; длина волны возбуждения 420 нм) циклической имино-формы хромопептида zFP538, структура которого показана на рис 14 слева Спектральная форма с максимумом при 426 нм наблюдается при рН 2,3, 406 нм - при рН 6,8, 480 нм - при рН 8,7 Переходу между спектральными формами 426 и 406 нм соответствует pKi=5,70±0,02 Переходу между формами 406 и 480 нм соответствует рК2=7.75±0,03 Увеличению

флуоресценции при 539 нм соответствует рКа=7,44±0,03 с коэффициентом Хилла п=1,34±0,08

Рис 16 Спектры поглощения (сплошные линии) и флуоресценции (пунктир, длина волны возбуждения 511 нм) кето-формы хромопептида zFP538, структура которого показана на рис 14 справа. Спектральная форма с максимумом при 411 нм наблюдается при рН 3, 512 нм - при рН 9, переходу между ними и увеличению флуоресценция при 581 нм соответствует рК,~7 Спектральная форма 343 нм наблюдается при рН 12, переходу между формами 512 и 343 нм соответствует рКа= 10,92+0,02 с коэффициентом Хилла п=1,8±0,1

Таблица 5. Кажущиеся значения рКа для имино- и кето-форм хромопептида гРР538, рассчитанные из кислых ветвей рН-профилей поглощения и флуоресценции, записанных в ходе прямого титрования из кислой области в щелочную (значения приведены для отдельных титрований вместе со

Поглощение Флуоресценция

Имино-форма рК,=5,70±0,02 (n=l') рК2=7,75±0,03 (п=1) рК]=5,55±0,06 (п=0,8±0,1) рКа=7,44±0,03 (п=1,3±0,1)

Кето-форма рКа=7,01±0,01 (п=1) рКа=6,90±0,01 (п=1)

'п - коэффициент Хилла

5. Механизмы стабилизации структуры гРР538 за счет агрегации

Приведенные выше данные указывают на существование в растворе гРР538 агрегатов, размер которых зависит от концентрации белка и рН раствора. При этом разные состояния агрегации характеризуются разной яркостью и чувствительностью к рН. Происходящие при изменении рН процессы агрегации-дезагрегации не являются равновесными во временной шкале эксперимента, в результате чего размер и форма частиц гРР538 при прямом и обратном титровании могут не совпадать. Это приводит к явлению гистерезиса и проявляется в виде несовпадения рН-профилей прямого и обратного титрования.

Влияние агрегации на спектральные свойства гРР538 может быть вызвано разными причинами. Например, формирование высокомолекулярных агрегатов может привести к увеличению жесткости белкового окружения хромофора, в результате чего подвижность хромофора уменьшится. Это приведет к более яркой флуоресценции потому, что уменьшается вероятность безизлучательной релаксации возбуждения за счет колебаний и вращений вокруг экзоциклической двойной связи (рис. 17). Увеличение жесткости белка может быть важно для гРР538, так как при образовании его хромофора происходит разрыв полипептидной цепи, в результате которого хромофор образует с белком только одну ковалентную связь, в отличие от многих других флуоресцирующих белков (вРР, ОвЯес! и др).

Рис. 17. Цис-транс изомеризация в структуре хромофора гПМЗв, приводящая к безизлучательной дезактивации возбуждения.

Другим возможным механизмом влияния агрегации на спектральные свойства гРР538 является изменение микроокружения хромофора при образовании агрегатов. На рис. 18 показана трехмерная структура мономера гРР538, которая четко показывает, что хромофор доступен растворителю. При

о

этом образование тетрамера не закрывает этот канал. В высокомолекулярных агрегатах молекулы белка контактируют с соседними молекулами белка, в отличие от тетрамеров (олигомеров) и мономеров, в которых молекулы белка окружены молекулами растворителя Таким образом, образование агрегатов приводит к уменьшению тушения флуоресценции растворителем В пользу этого говорит тот факт, что из рН-профилей разбавленных растворов гРР538 определяются рКа, значения которых близки к определяемым для изолированного хромопептида гРР538 в имино-форме (рКа 7,44+7,75; табл 1 и табл 5), тогда как в концентрированных растворах рКа смещены влево по шкале рН.

Рис 18 Трехмерная структура мономера гРР538 Темным цветом показано тирозиновое кольцо хромофора со стороны ОН-группы

2Л>538

Агрегация не только влияет на яркость, но и делает гРР538 более стабильным к кислотной инактивации Поскольку устойчивость увеличивается при повышении концентрации белка, т.е. при увеличении размеров агрегатов, то определенную роль в кислотной денатурации белка могут играть поверхностные слои, так как доля молекул бежа, лежащих на поверхности, уменьшается с увеличением размера частиц. Кроме того, внутренние слои могут служить структурной поддержкой, облегчающей образование нативного белка из обратимо денатурированного.

В кораллах многие цветные белки также образуют гранулы размером до 1 мкм. Поскольку мы наблюдали образование подобных гранул в растворе гРР538, то можно предположить, что агрегация является внутренним свойством флуоресцирующих белков из кораллов и важна для выполнения их природной функции.

Туг-ОН группа хромофора

выводы

1. Методами гель-фильтрации, светорассеяния и сканирующей зондовой микроскопии показано, что желтый флуоресцирующий белок гРР538 образует агрегаты в водных растворах и в пленках. Размеры агрегатов для концентрированных растворов (1 мг/мл) белка при рН 8-9 составляют порядка 94-97 нм, а в пленке 50x150 нм. Размеры агрегатов уменьшаются при понижении рН и концентрации белка.

2 Спектральная чувствительность гРР538 к рН зависит от концентрации белка, при этом растворы с максимальной концентрацией менее всего чувствительны к рН. Чем выше концентрация белка (больше размер агрегата), тем выше удельная яркость флуоресценции ¿РР538, что проявляется в нелинейности зависимости флуоресценции гРР538 от концентрации белка в диапазоне рН 5-9.

3. Изменение удельной яркости агрегатов белка может быть обусловлено изменением жесткости белка и, как следствие, изменением вероятности цис-транс изомеризации хромофора, ведущей к безизлучательной дезактивации. Кроме того, при уменьшении размеров агрегатов может увеличиваться степень доступности хромофора для молекул воды, как следствие, приводящая к локальному изменению рН и протонированию хромофора.

4. Кислотная инактивация гРР538 полностью обратима при подкислении растворов с высокой концентрацией белка (¿3x10"5 М) до рН 3, как по спектрам поглощения, так и по флуоресценции. Степень обратимости кислотной инактивации уменьшается при понижении концентрации белка. В диапазоне рН 3,75-5,5 кинетика инактивации описывается двумя экспонентами, а при рН 3,5 тремя экспонентами Предложен механизм кислотной денатурации гБР538, основанный на последовательной диссоциации агрегатов. Агрегаты более крупного размера делают желтый белок более устойчивым к тушению флуоресценции при подкислении раствора.

5. Структура хромофора в гРР538 химически лабильна и может изменяться при экстремальных значениях рН. При кислых значениях рН происходит гидролиз основания Шиффа в структуре хромофора с образованием кетона. Такое производное флуоресцирует при 580 нм.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Zubova, N. К., Korolenko, V. A., Astafyev, A. A., Petrukhin, А. N, Vinokurov, L М., Sarkisov, О. М., and Savitsky, А. Р. (2005) "Brightness of yellow fluorescent protein from coral (zFP538) depends on aggregation", Biochemistry, 44(10), 39823993.

2. Korolenko, V. A., Evtushenko, E., Rusanov, A. L., Zubova, N. N., Kurochkin, I N, and Savitsky, A. P. (2006) "Multipopulation disaggregation behavior of zFP538 upon dilution ", in Proceedings of SPIE Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications IV, (Savitsky, A. P., and Wachter, R.M. Eds), Vol. 6098, pp. 156-165. SPIE, Bellingham, WA.

3. Zubova, N. N., Korolenko, V. A., and Savitsky, A. P. (2005) "Kinetics of denaturation of the yellow fluorescent protein from coral zFP538", in Proceedings of SPIE Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications III, (Bomhop, D. J., Achilefu, S. I., Raghavachari, R., and Savitsky, A. P., Eds.), Vol. 5704, pp. 206-213. SPIE, Bellingham, WA.

4. Zubova, N. N., Astafyev, A. A., Petrukhin, A. N., Sarkisov, О. M., and Savitsky, A. P. (2005) "Atomic force and near-field scanning microscopy of solid zFP538 films", in Proceedings of SPIE Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications III, (Bornhop, D J., Achilefu, S. I., Raghavachari, R., and Savitsky, A. P., Eds.), Vol. 5704, pp. 200-205. SPIE, Bellingham, WA.

5. Zubova, N. N., Vinokurov, L. M., and Savitsky, A. P. (2004) "Aggregation of the yellow fluorescent protein zFP538 is pH-dependent", in Proceedings of SPIE Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications II, (Savitsky, A. P., Brovko, L. Y., Bornhop, D. J., Raghavachari, R., and Achilefu, S. I., Eds.), Vol. 5329, pp. 187-191. SPIE, Bellingham, WA.

6. Зубова H.H, Савицкий А.П. «Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. I. Сенсоры рН, ионов С1-, Са2+, Zn2+, Си2+», Успехи биологической химии, т. 45, 2005, с. 391-454. Обзор

7. Зубова Н.Н., Булавина А.Ю., Савицкий А.П. «Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков», Успехи биологической химии, т 43, 2003, с. 163-224. Обзор

8. Zubova, N. N, Ozerova, М. А, Korolenko, V. A., and Savitsky, А. P., "Spectral properties of yellow (zFP538) and red (dsFP583) fluorescent proteins from coral at

different pH and concentrations", in book' International conference "Biocatalysis-2005- fundamentals and applications", dedicated to 250th Anniversary of MSU, P. 122. June 19-23,2005, St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russia.

9 Зубова H.H., Короленко, B.A. «Стабилизация желтого флуоресцирующего белка zFP538 за счет агрегации», тез докладов международ, конф. студентов и аспирантов «Ломоносов-2005», секция Химия, М: МГУ, 12-15 апреля 2005, т.1, с. 76.

10. Зубова Н.Н., Савицкий А.П. «Влияние агрегации на флуоресценцию желтого белка из кораллов zFP538», тез. докл. и стенд, сообщ. XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-13 февраля 2004, с.ЗЗ.

11. Zubova, N. N., Rudenko, N. V., and Savitsky, A. P. (2003) "Aggregation strongly influences the pH-profile of fluorescence of the yellow fluorescent protein zFP538", in Proceedings of SPIE Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications (Savitsky, A. P., Barnhop, D. J., Raghavachari, R., and Achilefu, S. I., Eds.), Vol. 4967, pp. 88-99. SPIE, Bellingham, WA.

12. Зубова H.H., Савицкий А.П «Влияние агрегации на спектральные свойства желтого флуоресцирующего белка zFP538», материалы конф. молодых ученых «Инженерная этимология», поев. 80-летию И.В. Березина, Москва, МГУ, 2003, с. 17.

Принято к исполнению 11/05/2006 Исполнено 12/05/2006

Заказ №383 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

' /S7¿л

№15 12 2

«

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Зубова, Надежда Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЦВЕТНЫХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ.

1.1. Стабильность GFP -подобных белков.

1.1.1. Влияние температуры.

1.1.2. Влияние рН.

1.1.3. Действие протеаз.

1.2. Третичная структура GFP и его гомологов.

1.3. Спектральное разнообразие GFP-подобных белков.

1.4. Основные типы хромофоров GFP-подобных белков.

1.4.1. Зеленый хромофор GFP-типа.

1.4.2. Структура красного хромофора DsRed типа.

1.4.3. Структура хромофора asFP595.

1.4.4. Структура хромофора Kaede.

1.4.5. Структура хромофора zFP538.

1.5. Формирование хромофора GFP, DsRed и zFP538.

1.5.1. Формирование структуры «зеленого» хромофора.

1.5.2. Формирование ацилимина в хромофоре DsRed-типа.

1.5.3. Формирование желтого хромофора zFP538.

ГЛАВА 2. ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ И АГРЕГАЦИЯ ЦВЕТНЫХ

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ.

2.1. Олнгомсрпзацпя цветных флуоресцирующих белков.

2.1.1. GFP из кишечнополостных Hydrozoa.

2.1.2. Цветные белки из кораллов.

2.1.3. Структура тетрамеров DsRed и zFP538.

2.2. Агрегация цветных белков из кораллов.

2.3. Биологическая функция GFP-подобных белков.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ рН НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ И ПОГЛОЩЕНИЕ ЦВЕТНЫХ БЕЛКОВ.

3.1. Взаимодействие меяаду хромофором и белковым окружением.

3.2. Влияние рН на спектральные свойства GFP.

3.3. Влияние рН на спектральные свойства хромонептндов GFP.

3.4. Протоппрованпые состояния хромофора GFP.

3.4.1. Теоретические расчеты.

3.4.2. Экспериментальные данные.

ГЛАВА 4. ФОТОФИЗИКА И ФОТОХИМИЯ GFP-ПОДОБНЫХ БЕЛКОВ.

4.1. Перенос протопа в возбужденном состоянии.

4.2. Поворот хромофора в возбужденном состоянии. Цпс-транс изомеризация.

4.2.1. Изучение модельных хромофоров.

4.2.2. Модель фотоизомеризации.

4.2.3. Изучение белков.

4.3. Копформацноппая подвижность /7-бочонка GFP.

ГЛАВА 5. АППАРАТУРА, РЕАГЕНТЫ, МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

5.1. Использусмые реагенты н оборудование.

5.2. Экспрессия и выделение zFP538.

5.3. Выделение хромонентндов из zFP538.

5.4. Спектроскоппя н рН-метрня.

5.4.1. Титрование хромопептидов.

5.4.2. Титрование белка zFP

5.5. Динамическое рассеяние света.

5.6. Гель-фильтрация.

5.7. Подготовка образца для сканирующей зондовон микроскопии.

5.7.1. На поверхности стекла.

5.7.2. Сорбция на поверхности графита.

5.8. Кинетические измерения.

5.9. Расчет значении рКа из рН-профилси.

5.9.1. Одностадийная схема 1.

5.9.2. Двустадийная схема 2.

5.9.3. Трехстадийная схема 3.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ рН-ЗАВИСИМОСТЕЙ ХРОМОПЕПТИДОВ.

6.1. Имнно-форма хромопептнда zFP538. Поглощение.

6.2. Имнно-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция.

6.3. Кето-форма хромопептнда zFP538. Поглощение.

6.4. Кето-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция.

ГЛАВА 7. АНАЛИЗ рН-ЗАВИСИМОСТЕЙ ЖЕЛТОГО БЕЛКА zFP538.

7.1. рН-завнснмостн поглощения желтого белка zFP538.

7.1.1. Поглощение концентрированного раствора.

7.1.2. рН-зависимость поглощения разбавленного раствора zFP538.

7.2. рН-зависимости флуоресценции zFP538.

7.2.1. Флуоресценция растворов с высокой концентрацией белка.

7.2.2. Флуоресценция разбавленных растворов zFP538.

7.2.3. Эффект начального значения рН.

7.2.4. Анализ полных рН-профилей флуоресценции разбавленных растворов zFP538.

7.2.5. Нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции zFP538 от концентрации белка.

ГЛАВА 8. ОЦЕНКА РАЗМЕРОВ АГРЕГАТОВ zFP538.

8.1. Светорассеяние.

8.2. Гель-фильтрация.

8.3. Исследование агрегации zFP538 с помощью микроскопии.

8.3.1. На поверхности стекла.

8.3.2. На поверхности графита.

ГЛАВА 9. КИНЕТИКА КИСЛОТНОЙ ДЕНАТУРАЦИИ zFP538.

9.1. Кинетические кривые.

9.2. Спектральные изменения, наблюдаемые при кислотной денатурации zFP

9.3. Предполагаемая схема кислотной инактивации zFP538.

ГЛАВА 10. МЕХАНИЗМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУРЫ zFP538 ЗА СЧЕТ

АГРЕГАЦИИ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры и свойств желтого флуоресцирующего белка zFP538 из кораллов"

Многие годы GFP изучался очень небольшой группой исследователей как белок, являющийся частью биолюмииесцентной системы стрекающих кишечнополостных Hydrozoa. Лишь в 1992 году была установлена его аминокислотная последовательность [1]. Решающий прорыв в практическом применении GFP произошел после того, как зеленый белок был клонирован [1], и было показано, что экспрессия гена GFP в других организмах также приводит к появлению флуоресцирующего белка [2, 3]. Следовательно, ген содержит всю информацию, необходимую для посттрансляционного синтеза хромофора.

После этого открытия интерес к GFP чрезвычайно возрос, и этот белок стали активно использовать для фундаментальных исследований в клеточной биологии, онтогепетике (биологии развития), пейробиологии и экологии. Начиная с 1999 года, разнообразные разноцветные гомологи GFP были выделены из многочисленных организмов Anthozoa (кораллы, морские актинии и др.), и даже из ракообразных. В настоящее время зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его гомологи широко используются в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров, позволяющих исследовать многообразные процессы, происходящие в живых клетках, тканях и организмах. Использование таких индикаторов позволяет изучать локализацию и транспорт различных белков внутри клетки, уровень экспрессии генов, взаимодействия между белками в клетке, определять концентрацию низкомолекулярных метаболитов, у, некоторых физиологически важных ионов (Са , СГ), рН и редоксипотенциал внутренней среды, изучать сигнальные пути и взаимодействия рецептор-лиганд, определять ферментативную активность в живых клетках [4, 5, 6, 7]. Флуоресцирующие белки могут быть гетерологически экспрессированы в любых клетках, и для наблюдения их флуоресценции не требуется каких-либо дополнительных ферментов или кофакторов, за исключением кислорода. Особые преимущества молекулярных сенсоров проявляются при исследовании Ферстеровского переноса энергии (FRET) - широкий выбор донорно-акцепторных пар обеспечивается хорошим перекрыванием спектров флуоресценции и поглощения в постоянно пополняющемся ряду цветных белков.

Цветные белки из Anthozoa (кораллы, актинии, зоантиды и др.) превосходят GFP по спектральному разнообразию и стабильности, однако проигрывают в том, что являются облигатными олигомерами, более медленно созревают и обладают ярко выраженной склонностью к агрегации. Агрегация является общим свойством этих белков, что можно объяснить высокой степенью гомологии между ними. Образование олигомеров не мешает применению этих белков для наблюдения за уровнем экспрессии генов, но может быть помехой использованию белков в качестве репортерпых генов для изучения белок-белковых взаимодействий (методы на основе FRET) и внутриклеточной локализации белков. Агрегация ФБ внутри клеток вообще может привести к токсическому эффекту. Если олигомеризация и агрегация цветных белков из кораллов являются нежелательными с точки зрения их применения, то нельзя исключить возможную важность этих процессов для формирования спектральных свойств и функциональности этих белков в природе. Так, например, димеризация GFP из Aequorea victoria влияет на форму спектра поглощения. Красный флуоресцирующий белок из кораллов Discosoma drFP583 (также известный как DsRed) существует в виде облигатного тетрамера, стабильного даже в растворах с очень низкой концентрацией белка. Полученный методами генной инженерии мономер этого белка характеризуется не только сдвигом спектров поглощения и флуоресценции, но и уменьшением квантового выхода флуоресценции. Однако в литературе нет прямых данных о влиянии олигомеризации DsRed на его спектральные свойства, а наблюдаемые различия могут быть следствием интенсивного мутагенеза (33 мутации), необходимого для получения мономерного флуоресцирующего белка, а не следствием олигомерного состояния.

Поглощение и флуоресценция желтого флуоресцирующего белка zFP538, выделенного из ротового диска пуговичного полипа Zoanthus (рифовые кораллы) [8], лежат в диапазоне длин волн между флуоресценцией зеленых и поглощением красных белков. Это дает возможность использовать zFP538 для индуктивно-резонансного переноса энергии, лежащего в основе многих методов анализа с использованием цветных белков. Желтый белок zFP538, как и многие другие цветные белки из кораллов, образует тетрамеры и более высокомолекулярные агрегаты, однако влияние агрегации на спектральные свойства не исследовано, и нельзя исключить важность этих процессов для функциональности цветных белков в природе. Цветные флуоресцирующие белки обычно используются для исследования живых биологических систем, рН внутри которых может сильно изменяться даже в пределах одной клетки, поэтому представляет интерес оценить влияние рН па яркость и стабильность zFP538.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зубова, Надежда Николаевна

выводы

1. Методами гель-фильтрации, светорассеяния и сканирующей зондовой микроскопии показано, что желтый флуоресцирующий белок zFP538 образует агрегаты в водных растворах и в пленках. Размеры агрегатов для концентрированных растворов (1 мг/мл) белка при рН 8-9 составляют порядка 94-97 нм, а в пленке 50x150 нм. Размеры агрегатов уменьшаются при понижении рН и концентрации белка.

2. Спектральная чувствительность zFP538 к рН зависит от концентрации белка, при этом растворы с максимальной концентрацией менее всего чувствительны к рН. Чем выше концентрация белка (больше размер агрегата), тем выше удельная яркость флуоресценции zFP538, что проявляется в нелинейности зависимости флуоресценции zFP538 от концентрации белка в диапазоне рН 5-9.

3. Изменение удельной яркости агрегатов белка может быть обусловлено изменением жесткости белка и, как следствие, изменением вероятности цис-транс изомеризации хромофора, ведущей к безызлучательной дезактивации. Кроме того, при уменьшении размеров агрегатов может увеличиваться степень доступности хромофора для молекул воды, как следствие, приводящая к локальному изменению рН и протонированию хромофора.

4. Кислотная инактивация zFP538 полностью обратима при подкислении растворов с высокой концентрацией белка (s3xl0"5 М) до рН 3, как по спектрам поглощения, так и по флуоресценции. Степень обратимости кислотной инактивации уменьшается при понижении концентрации белка. В диапазоне рН 3,75-5,5 кинетика инактивации описывается двумя экспонентами, а при рН 3,5 тремя экспонентами. Предложен механизм кислотной денатурации zFP538, основанный на последовательной диссоциации агрегатов. Агрегаты более крупного размера делают желтый белок более устойчивым к тушению флуоресценции при подкислении раствора.

5. Структура хромофора в zFP538 химически лабильна и может изменяться при экстремальных значениях рН. При кислых значениях рН происходит гидролиз основания Шиффа в структуре хромофора с образованием кетона. Такое производное флуоресцирует при 580 нм.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу свою благодарность д.ф.-м.н., профессору О.М. Саркисову, к.ф.-м.н. А.Н. Петрухину и А.А. Астафьеву (Институт химической физики РАН им. Н.Н. Семенова), а также д.х.н. И.Н. Курочкину и Е. Евтушенко (химический факультет МГУ) за помощь в проведении экспериментов по сканирующей зондовой и ближнепольной оптической микроскопии; к.х.н. JT.M. Винокурову (Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН) за предоставленный штамм-продуцент zFP538 и образцы хромопептидов; д.х.н., профессору А.В. Немухину (химический факультет МГУ) за проведение квантово-химических расчетов значений рКа хромофоров ZFP538 и GFP.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Зубова, Надежда Николаевна, Москва

1. Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G., and Cormier, M.J. (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein, Gene, 111, 229-233.

2. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science, 263, 802-805.

3. Inouye, S., and Tsuji, F.I. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein, FEBS Lett., 341,277-280.

4. Tsien, R.Y. (1998) The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-544.

5. Zimmer, M. (2002) Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior, Chem. Rev., 102(3), 759-781.

6. Miyawaki, A. (2003) Fluorescence imaging of physiological activity in complex systems using GFP-based probes, Curr. Opin. Neurobiol., 13(5), 591-596.

7. Verkhusha, V.V., and Lukyanov, K.A. (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins, Nat. Biotechnol., 22,289-296.

8. Shaner, N.C., Steinbach, P.A., and Tsien, R.Y. (2005) A guide to choosing fluorescent proteins, Nat. Methods, 2(12), 905-909.11. http://www.evrogen.com/pl .shtml

9. Shaner, N.C., Campbell, R.E., Steinbach, P.A., Giepmans, B.N., Palmer, A.E., and Tsien, R.Y. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein, Nat. Biotechnol., 22(12), 1567-1572.

10. Ward, W.W., and Bokman, S.H. (1982) Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: Physical separation and characterization of the renatured protein Biochemistry, 21,4535-4540.

11. Makino, Y., Amada, K., Taguchi, H., and Yoshiba, M. (1997) Chaperonin-mediated folding of green fluorescent protein, J. Biol. Chem., 272, 12468-12474.

12. Topell, S., Hennecke, J., and Glockshuber, R. (1999) Circularly permuted variants of the green fluorescent protein, FEBSLett., 457, 283-289.

13. Bokman, S.H., and Ward, W.W. (1981) Renaturation of Aequorea green-fluorescent protein, Biochem. Biophys. Res. Commun., 101, 1372-1380.

14. Penna, T.C.V., Ishii, M., Pessoa, A. Jr., and Cholewa, O. (2004) Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values, Appl. Biochem. Biotech., 113-116, 469-483.

15. Ward, W.W. (1981) Properties of the coelenterate green fluorescent proteins. In: Bioluminescence and Chemiluminescence (DeLuca, M., and McElroy, D.W., eds.) Academic Press, New York, pp. 235-242.

16. Youvan, D.C., and Michel-Beyerle, M.-E. (1996) Structure and fluorescence mechanism of GFP, Nat. BiotechnoL, 14,1219-1220.

17. Verkhusha, V.V., Akovbian, N.A., Efremenko, E.N., Varfolomeyev, S.D. and Vrzheshch, P.V. (2001) Kinetic analysis of maturation and denaturation of DsRed, a coral derived red fluorescent protein, Biochemistry (Moscow), 66(12), 1342-1351.

18. Cody, C.W., Prasher, D.C., Westler, W.M., Prendergast, F.G., and Ward, W.W. (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein, Biochemistry, 32,1212-1218.

19. Ward, W.W., and Cormier, M.J. (1979) An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein, J. Biol. Chem., 254(3), 781-788.

20. Yang, F., Moss, L.G., and Phillips, G.N. Jr. (1996) The molecular structure of green fluorescent protein, Nat. Biotechnol., 14, 1246-1251.

21. Dopf, J., and Horiagon, T.M. (1996) Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene, 173, 39-44.

22. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S.R., and Huang, C.C. (1997) Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence, J. Biol. Chem., Ill, 28545-28549.

23. Remington, S.J., Wachter, R.M., Yarbrough, D.K., Branchaud, B.D., Anderson, C., Kallio, K., and Lukyanov, K.A. (2005) zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore, Biochemistry, 44, 202-212.

24. Bulina, M.E., Chudakov, D.M., Mudrik, N.N., and Lukyanov, K.A. (2002) Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and nonfluorescent proteins by mutagenesis, BMC Biochem., 3:7.

25. Gurskaya, N.G., Fradkov, A.F., Terskikh, A., Matz, M.V., Labas, Y.A., Martynov, V.I., Yanushevich, Y.G., Lukyanov, K.A., and Lukyanov, S.A. (2001) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins, FEBS Lett., 507(1), 16-20.

26. Gurskaya, N.G., Savitsky, A.P., Yanushevich, Y.G., Lukyanov, S.A., and Lukyanov, K.A. (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis, BMC Biochem., 2:6.

27. Remington, S.J. (2000) Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein, Methods Enzymol., 305, 196-211.

28. Heim, R., Cubitt, A.B., and Tsien, R.Y. (1995) Improved green fluorescence, Nature, 373, 663-664.

29. Heim, R., Prasher, D.C., and Tsien, R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 12501-12504.

30. Ehrig, Т., O'Kane, D.J., and Prendergast, F.G. (1995) Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra, FEBS Lett., 367, 163-166.

31. Patterson, G.H., and Lippincott-Schwartz, J.A. (2002) A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells, Science, 297, 1873-1877.

32. Ormo, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gross, L.A., Tsien, R.Y., and Remington, S.J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Science, 273, 1392-1395.

33. Chudakov, D.M., Feofanov, A.V., Mudrik, N.N., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2003) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle, J. Biol. Chem., 278, 7215-7219.

34. Terskikh, A., Fradkov, A., Ermakova, G., Zaraisky, A., Tan, P., Kajava, A.V., Zhao, X., Lukyanov, S., Matz, M., Kim, S., Weissman, I., and Siebert, P. (2000) "Fluorescent timer": protein that changes color with time, Science, 290, 1585-1588.

35. Gross, L.A., Baird, G.S., Hoffman, R.C., Baldridge, K.K., and Tsien, R.Y. (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97,11990-11995.

36. Wall, M.A., Socolich, M., and Ranganathan, R. (2000) The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed, Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138.

37. Yarbrough, D., Wachter, R.M., Kallio, K., Matz, M.V. and Remington, S.J. (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98,462-467.

38. Baird, G.S., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2000) Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 11984-11989.

39. Prescott, M., Ling, M., Beddoe, Т., Oakley, A.J., Dove, S., Hoegh-Guldberg, O., Devenish, R. J., and Rossjohn, J. (2003) The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation, Structure, 11, 275-284.

40. Quillin, M.L., Anstrom, D.M., Shu, X., O'Leary, S., Kallio, K., Chudakov, D.M., and Remington, S.J. (2005) Kindling fluorescent protein from Ammonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution, Biochemistry, 44, 5774-5787.

41. Wilmann, P.G., Petersen, J., Devenish, R.J., Prescott, M., and Rossjohn, J. (2005) Variations on the GFP Chromophore, J. Biol. Chem., 280, 2401-2404.

42. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 12651-12656.

43. Mizuno, H., Mai, Т.К., Tong, K.I., Ando, R., Furuta, Т., Ikura, M., and Miyawaki A. (2003) Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein, Mol. Cell, 12, 1051-1058.

44. Cubitt, A.B., Heim, R., Adams, S.R., Boyd, A.E., Gross, L.A., and Tsien, R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins, Trends Biochem. Sci., 20, 448455.

45. Reid, B.G., and Flynn, G.C. (1997) Chromophore formation in green fluorescent protein, Biochemistry, 36, 6786-6791.

46. Kojima, S., Hirano, Т., Niwa, H., Ohashi, M., Inouye, S., and Tsuji, F.I. (1997) Mechanism of the redox reaction of the Aequorea green fluorescent protein (GFP), Tetrahedron Lett., 38(16), 2875-2878.

47. Branchini, B.R., Nemser, A.R., and Zimmer, M. (1998) A computational analysis of the unique protein-induced tight turn that results in posttranslational chromophore formation in green fluorescent protein, J. Am. Chem. Soc., 120(1), 1-6.

48. Kane, J.F., and Hartley, D.L. (1988) Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli, Trends Biotechnol., 6(5), 95-101.

49. Palm, G.J., Zdanov, A., Gaitanaris, G.A., Stauber, R., Pavlakis, G.N., and Wlodawer, A. (1997) The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein, Nat. Struct. Biol., 4,361-365.

50. Siegbahn, P.E.M., Wirstam, M., and Zimmer, M. (2001) Theoretical study of the mechanism of peptide ring formation in green fluorescent protein, Int. J. Quantum Chem., 81(2), 169-186.

51. Zhang, L., Patel, H.N., Lappe, J.W., and Wachter, R.M. (2006) Reaction progress of chromophore biogenesis in green fluorescent protein, J Am. Chem. Soc., 128(14), 4766-4772.

52. Wiehler, J., von Hummel, J., and Steipe, B. (2001) Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore, FEBS Lett., 487, 384-389.

53. Verkhusha, V.V., Chudakov, D.M., Gurskaya, N.G., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2004) Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins, Chem. Biol., 11, 845-854.

54. Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In: Green Fluorescent protein: properties, applications, and protocols (Chalfie, M., and Kain, S. eds.), Wiley-Liss, New York, pp. 45-75.

55. Zacharias, D.A., Violin, J.D., Newton, A.C., and Tsien, R.Y. (2002) Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells, Science, 296, 913-916.

56. Vrzheshch, P.V., Akovbian. N.A., Varfolomeyev, S.D., and Verkhusha, V.V. (2000) Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions, FEBS lett., 487,203-208.

57. Jakobs, S., Subramaniam, V., Schonle, A., Jovin, T.M., and Hell, S.W. (2000) EFGP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy, FEBS Lett., 479(3), 131-135.

58. Wiedenmann, J., Vallone, В., Renzi, F., Nienhaus, K., Ivanchenko, S., Rocker, C., and Nienhaus, G.U. (2005) Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants, J. Biomed. Opt., 10(1), 14003/1-7.

59. Lounis, В., Deich, J., Rosell, F.I., Boxer, S.G., and Moerner, W.E. (2001) Photophysics of DsRed, a red fluorescent protein, from the ensemble to the single-molecule level, J. Phys. Chem. В., 105, 5048-5054.

60. Beddoe, Т., Ling, M., Dove, S., Hoegh-Guldberg, O., Devenish, R.J., Prescott, M., and Rossjohn, J. (2003) The production, purification and crystallization of a pocilloporin pigment from a reef-forming coral, Acta Crystallogr. D, 59(3), 597-599.

61. Karasawa, S., Araki, Т., Yamamoto-Hino, M., and Miyawaki A. (2003) A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling, J. Biol. Chem., 278(36), 34167-34171.

62. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., and Nienhaus, G.U. (2004) Identification of GFP-like proteins in nonbioluminescent, azooxanthellate Anthozoa opens new perspectives for bioprospecting, Mar. Biotechnol., 6(3), 270-277.

63. Sacchetti, A., Subramaniam, V., Jovin, T.M., and Alberti, S. (2002) Oligomerization of DsRed is required for the generation of a functional red fluorescent chromophore, FEBS Lett., 525(1-3), 13-19.

64. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2002) A monomeric red fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 12, 78777882.

65. Ando, R., Yonezawa, A., Watanabe, C., and Kawamura, S. (2004) Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting, Science, 306, 13701373.

66. Полторак, O.M., Чухрай, E.C., Торшин, И.Ю. (1998) Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов, Биохимия, 63, 360-369.

67. Verkhusha, V.V., Kuznetsova, I.M., Stepanenko, O.V., Zaraisky, A.G., Shavlovsky, M.M., Turoverov, K.K., and Uversky, V.N. (2003) High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP, Biochemistry, 42(26), 7879-7884.

68. Lauf, U., Lopez, .P, and Falk, M.M. (2001) Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins, FEBS Lett., 498(1), 1115.

69. Mizuno, H., Sawano, A., Eli, P., Наша, H., and Miyawaki, A. (2001) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer, Biochemistry, 40,2502-2510.

70. Bevis, B.J., and Glick, B.S. (2002) Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed), Nat. Biotechnol., 20, 83-87.

71. Wiedenmann, J., Elke, C., Spindler, K.D., and Funke, W. (2000) Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria), Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA., 97(26), 14091-14096.

72. Wiedenmann, J., and Lorenz, U. (2000) Fluoreszenz- und elektronenmicroskopische Untersuchungen an der seeanemone Anemonia sulcata Pennant (Cnidaria, Anthozoa), Mikrokosmos, 89, 1-6.

73. Matz, M.V., Labas, Y.A., and Ugalde, J. (2005) Evolution of function and color in GFP-like proteins. In: Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols (Chalfie, M., and Kain, S.R., eds), Wiley, New-Jersea, pp. 139-161.

74. Morin, J.G., and Hastings, J.W. (1971) Energy transfer in a bioluminescent system, J. Cell. Physiol., 77,313-318.

75. Partridge, J.C., and Hilder, P.E. (1990) The colour sensitivity and vision of fishes. In: Llight and life in the sea (Herring, P.J., Campbell, A.K., Whitfield, M., and Maddock, L., eds.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 167-184.

76. Labas, Y.A., Gurskaya, N.G., Yanushevich, Y.G., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A., and Matz, M.V. (2002) Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99(7), 4256-4261.

77. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kiihl, M., and Hoegh-Guldberg, O. (2000) Fluorescent pigments in corals are photoprotective, Nature, 408, 850-853.

78. Kawaguti, S. (1969) Effect of the green fluorescent pigment on the productivity of the reef corals, Micronesica, 5,313.

79. Schlichter, D., Fricke, H.W., and Weber, W. (1986) Light harvesting by wavelength transformation in a symbiotic coral of the Red Sea twilight zone, Mar. Biol., 91, 403-407.

80. Hohenester, E., and Engel, J. (2002) Domain structure and organisation in extracellular matrix proteins, Matrix Biol., 21(2), 115-128.

81. Wachter, R.M., Elsliger, M.A., Kallio, K., Hanson, G.T., and Remington, S.J. (1998) Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Structure, 6, 1267-1277.

82. Elsliger, M.A., Wachter, R.M., Hanson, G.T., Kallio, K., and Remington, S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH, Biochemistry, 38(17), 5296-5301.

83. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., and Verkman, A.S. (1998) Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator, Biophys. J., 74, 1591-1599.

84. Llopis, J., McCaffery, J.M., Miyawaki, A., Farquhar, M.G., and Tsien, R.Y. (1998) Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 6803-6808.

85. Griesbeck, O., Baird, G.S., Campbell, R.E., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2001) Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications, J. Biol. Chem., 276(31), 29188-29194

86. Ward, W.W., Cody, C.W., Hart, R.C., and Cormier, M.J. (1980) Spectrophotometric identity of the energy transfer chromophores in Renilla and Aequorea green-fluorescent proteins, Photochem. Photobiol., 31, 611-615.

87. Niwa, H., Inouye, S., Hirano, Т., Matsuno, Т., Kojima, S., Kubota, M., Ohashi, M., and Tsuji, F.I. (1996) Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 13617-13622.

88. Nielsen, S.B., Lapierre, A., Andersen, J.U., Pedersen, U.V., Tomita, S., and Andersen, L.H. (2001) Absorption spectrum of the green fluorescent protein chromophore anion in vacuo, Phys. Rev. Lett., 87(22), 228102(1-4).

89. Laino, Т., Nifosi, R., and Tozzini, V. (2004) Relationship between structure and optical properties in green fluorescent proteins: a quantum mechanical study of the chromophore environment, Chem. Phys., 298, 17-28.

90. Voityuk, A.A., Kummer, A.D., Michel-Beyerle, M.-E., and Rosch, N. (2001) Absorption spectra of the GFP chromophore in solution: comparison of theoretical and experimental results, Chem. Phys., 269, 83-91.

91. Yazal, J.E., Prendergast, F.G., Shaw, D.E., and Pang, Y.-P. (2000) Protonation states of the chromophore of denatured green fluorescent proteins predicted by ab initio calculations, J. Am. Chem. Soc., 122, 11411-11415.

92. Bell, A.F., He, X., Wachter, R.M., and Tonge, P.J. (2000) Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy, Biochemistry, 39(15), 4423-4431.

93. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.-E., Rosch, N. (1997) Protonation effects on the chromophore of green fluorescent protein. Quantum chemical study of the absorption spectrum, Chem. Phys. Lett., 272,162-167.

94. Xie, D., and Zeng, J. (2005) Electronic excitations of green fluorescent proteins: protonation states of chromophore model compound in solutions, J. Comput. Chem., 26, 14871496.

95. Chattoraj, M., King, B.A., Bublitz, G.U., and Boxer, S.G., (1996) Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93(16), 8362-8367.

96. Chen, M.C., Lambert, C.R., Urgitis, J.D., and Zimmer, M. (2001) Photoisomerization of green fluorescent protein and the dimensions of the chromophore cavity, Chem. Phys., 270, 157— 164.

97. Nifosi, R., and Tozzini, V. (2006) Cis-trans photoisomerization of the chromophore in the green fluorescent protein variant E2GFP: A molecular dynamics study, Chem. Phys., 323, 358368.

98. Webber, N.M., Litvinenko, K.L., and Meech, S.R. (2001) Radiationless relaxation in a synthetic analogue of the green fluorescent protein chromophore, J. Phys. Chem. B, 105, 80368039.

99. Mandal, D., Tahara, Т., Webber, N.M., and Meech, S.R. (2002) Ultrafast fluorescence of the chromophore of the green fluorescent protein in alcohol solutions, Chem. Phys. Lett., 358, 495-501.

100. Martinez, T.J. (2006) Insights for light-driven molecular devices from ab initio multiple spawning excited-state dynamics of organic and biological chromophores, Acc. Chem. Res. 39(2), 119-126.

101. Martin, M.E., Negri, F., and Olivucci, M. (2004) Origin, nature, and fate of the fluorescent state of the green fluorescent protein chromophore at the CASPT2//CASSCF resolution, J. Am. Chem. Soc., 126, 5452-5464.

102. Waldeck, D.H. (2000) The role of solute-solvent friction in large-amplitude motions. In: Conformational Analysis of Molecules in Excited States (Waluk, J„ ed.), Wiley-VCH, pp. 113176.

103. Bublitz, G., King, B.A., and Boxer, S.G. (1998) Electronic structure of the chromophore in green fluorescent protein (GFP), J. Am. Chem. Soc., 120, 9370-9371.

104. Toniolo, A., Olsen, S., Manohar, L., and Martinez, T.J. (2004) Conical intersection dynamics in solution: the chromophore of green fluorescent protein, Faraday Discuss., 127, 149163.

105. Weber, W., Helms, V., McCammon, J.A., and Langhoff, P.W. (1999) Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96,6177-6182.

106. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.-E., and Rosch, N. (1998) Structure and rotation barriers for ground and excited states of the isolated chromophore of the green fluorescent protein. Chem. Phys. Lett., 296, 269-276.

107. He, X., Bell, A.F., and Tonge, P.J. (2003) Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore, FEBS Lett., 549, 35-38.

108. Maddalo, S.L., and Zimmer, M. (2006) The role of the protein matrix in GFP fluorescence, Photochem. Photobiol., 82(2), 367-372.

109. Seifert, M.H.J., Ksiazek, D., Azim, M.K., Smialowski, P., Budisa, N., and Holak, T.A. (2002) Slow exchange in the chromophore of a green fluorescent protein variant, J. Am. Chem. Soc., 124(27), 7932-7942.

110. Abrash, S., Repinec, S. and Hochstrasser, R.M. (1990) The viscosity dependence and reaction coordinate for isomerization of cis-stilbene, J. Chem. Phys., 93, 1041-1053.

111. Seifert, M.H.J., Georgescu, J., Ksiazek, D., Smialowski, P., Rehm, Т., Steipe, В., and Holak, T.A. (2003) Backbone dynamics of green fluorescent protein and the effect of histidine 148 substitution, Biochemistry, 42, 2500-2512.

112. Miesenbock, G., De Angelis, D.A., and Rothman, J.E. (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins, Nature, 394, 192-195.

113. Ugarova, N.N., Savitsky, A.P., and Berezin I.V. (1981) The protoporphyrin apoperoxidase complex as a horseradish peroxidase analog. A fluorimetric study of the heme pocket, Biochim. Biophys. Acta, 662, 210-219.

114. Щукин, Е.Д., Перцов, A.B., Амелина, E.A. (2004) Коллоидная химия (3-е изд.) М: Высшая школа, 445 с.

115. Andreu, J.M., and Timasheff, S.N. (1986) The measurement of cooperative protein self-assembly by turbidity and other techniques, Method. Enzymol., 130, 47-59.

116. Yu, M.-H., Glazer, A.N., and Williams, R.C. (1981) Cyanobacterial phycobilisomes. Phycocyanin assembly in the rod substructures of Anabaena variabilis phycobilisomes, J. Biol. Chem., 256, 13130-13136.

117. Lundell, D.J., Williams, R.C., and Glazer, A.N. (1981) Molecular architecture of a light-harvesting antenna. In vitro assembly of the rod substructures of Synechococcus 6301 phycobilisomes, J. Biol. Chem., 256, 3580-3592.

118. Stec, В., Troxler, R.F., and Teeter, M.M. (1999) Crystal structure of C-phycocyanin from Cyanidium caldarium provides a new perspective on phycobilisome assembly, Biophys. J., 76, 2912-2921.

119. Стадничук, И.Н. (1990) Фикобилипротеины, Итоги науки и техники, Серия Биологическая химия, 40, 1-196.

120. Glazer, A.N., Fang, S., and Brown, D.M. (1973) Spectroscopic properties of C-phycocyanin and of its a and subunits, J. Biol Chem., 248, 5679-5685.

121. MacColl, R., Csatorday, K., Berns, D.S., and Traeger, E. (1980) Chromophore interaction in allophycocyanin, Biochemistry, 19, 2817-2820.

122. Foguel, D., and Weber, G. (1995) Pressure-induced dissociation and denaturation of allophycocyanin at subzero temperatures, J. Biol. Chem., 270, 28759-28766.

123. MacColl, R„ Malak, H., Cipollo, J., Label, В., Ricci, G., MacColl, D., and Eisele, L.E. (1995) Studies on the dissociation of cryptomonad biliproteins, J. Biol. Chem., 270, 2755527561.

124. Liu, J.-Y., Jiang, Т., Zhang, J.-P., and Liang, D.-C. (1999) Crystal structure of allophycocyanin from red algae Porphyra yezoensis at 2.2-A resolution, J. Biol. Chem., 274, 16945-16952.

125. Sugimoto, Т., Kikushima, M., Saito, M., and Suzuki, H. (1984) Models for the change in chromophore structure of allophycocyanin corresponding to its observed reversible change in absorbance, J. Phys. Soc. Jpn, 53, 873-881.

126. Berns, D.S., and MacColl, R. (1989) Phycocyanin in physical-chemical studies, Chem. Rev., 89, 807-825.

127. Blauer, G., and Wagnier, G. (1975) Conformation of bilirubin and biliverdin in their complexes with serum albumin, J. Am. Chem. Soc., 97, 1949-1954.

128. Schirmer, Т., Bode, W., and Huber, R. (1987) Refined three-dimentional structures of two cyanobacterial C-phycocyanins at 2.1 and 2.5 A resolution. A common principle of phycobilin-protein interaction, J. Mol. Biol., 196, 677-695.

129. Greene, B.I., Lamola, A.A., and Shank, C.V. (1981) Picosecond primary photoprocesses of bilirubin bound to human serum albumin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 2008-2012.

130. Оптическая плотность при 445 нмел о оо Ъзо Ъзо00