Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав жирных кислот и флуоресцирующих белков и их роль в акклиматизации у герматипных кораллов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав жирных кислот и флуоресцирующих белков и их роль в акклиматизации у герматипных кораллов"

На правахрукописи

ГРИБОВА МАРИНА ЮРЬЕВНА

СОСТАВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ И ИХ РОЛЬ В АККЛИМАТИЗАЦИИ У ГЕРМАТИПНЫХ КОРАЛЛОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК - 2004

Работа выполнена в лаборатории экологии Университета Рюкю, Окинава, Япония и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: академик РАН

Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты: д.б.н. Челомин Виктор Павлович

к.б.н. Латышев Николай Алексеевич

Ведущая организация: Дальневосточный государственный университет

Защита состоится_декабря 2004 года в_на заседании

диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159. Факс: (4232)314-050

С диссертацией можно ознакомиться в филиале центральной библиотеки (г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХДВОРАН).

Автореферат разослан 12 ноября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.х.н. Прокопенко Г.И.

У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Массовое обесцвечивание кораллов (утрата симбиотических водорослей и/или их пигментов) — один из основных показателей ухудшения состояния коралловых рифов - происходит вследствие резкого изменения параметров окружающей среды, например, таких как освещенность и температура. Понимание механизмов акклиматизации - приспособительных изменений -симбиотических герматипных кораллов позволит предвидеть изменения состояния коралловых рифов в зависимости от меняющихся условий окружающей среды, и, возможно, сыграет свою роль в спасении некоторых из них от разрушения.

Обесцвечивание герматипных кораллов часто бывает обусловлено нарушением фотосинтетического аппарата симбиотических зооксантелл. При этом функционирование фотосинтетического аппарата в значительной степени зависит от состояния липидного матрикса тилакоидных мембран симбиотических микроводорослей, в которых он локализован. Освещенность и температура являются наиболее важными факторами среды, которые влияют не только на фотосинтетические процессы зооксантелл, но косвенно, через трофические взаимоотношения, они оказывают существенное влияние на содержание жирных кислот и коралла-хозяина. Состав жирных кислот в симбиотическом сообществе герматипных кораллах известен. Однако не изучен состав жирных кислот коралла-хозяина отдельно от симбиотических зооксантелл. Процессы изменения состава жирных кислот при акклиматизации герматипных кораллов на данный момент не исследованы.

Еще не изучена роль флуоресцирующих белков (ФБ) - пигментов коралла - в акклиматизации герматипных кораллов. Более того, даже сама функция ФБ в герматипных кораллах еще остается во многом

неясной и составляет предмет

БИБЛИОТЕКА

о» шоу

а»

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение состава и динамики жирных кислот и флуоресцирующих белков при акклиматизации симбиотических герматипных кораллов к изменениям освещенности. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод разделения симбиотического сообщества «коралл-зооксантеллы» Montipora digitata на клетки зооксантелл и ткани коралла-хозяина.

2. Провести анализ и сравнить составы жирных кислот в тканях коралла-хозяина и в симбиотических микроводорослях в процессе акклиматизации у симбиотических кораллов, находящихся в различных условиях освещенности.

3. Исследовать состав и интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков кораллов при заданных режимах освещенности.

4. Определить спектральные характеристики и некоторые биохимические свойства флуоресцирующих белков из герматипных кораллов. Провести полипараметрический анализ с пикосекундным разрешением флуоресцентных спектров эмиссии флуоресцирующих белков и фотосинтетических пигментов зооксантелл в тканях кораллов in vivo.

5. Изучить индуктивно-резонансный Ферстеровский перенос энергии между флуоресцирующими белками герматипных кораллов.

Положения, выносимые на защиту.

• Изучен состав жирных кислот в коралле Montipora digitata и его симбиотических водорослях и показано, что жирные кислоты в коралле-хозяине и зооксантеллах аналогичны в качественном отношении. При этом симбиотические водоросли отличаются повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот, в

особенности специфичных для динофлагеллят.

• Исследовано влияние различных режимов освещения и температуры на содержание жирных кислот в коралле-хозяине и зооксантеллах.

• Разработан метод выделения и количественного определения флуоресцирующих белков в герматипных кораллах.

• Изучены спектральные характеристики флуоресценции флуоресцирующих белков из герматипных кораллов.

• Проведены определения с пикосекундным разрешением флуоресцентных спектров эмиссии флуоресцирующих белков и хлорофилла зооксантелл в тканях кораллов in vivo.

• Интенсивно флюоресцирующие белки в кораллах выполняют защитную роль для фотосистемы II зооксантелл и тканей коралла от избытка видимого и ультрафиолетового света.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые установлен состав жирных кислот отдельно в тканях рифостроящего коралла Montipora digitata и в клетках симбиотических водорослей. Особенности состава жирных кислот указывают на трофическую зависимость животного-хозяина от симбиотических водорослей.

Впервые показана динамика изменений пропорций жирных кислот в коралле и зооксантеллах в процессе акклиматизации к различным интенсивностям света.

Разработан метод для количественного и качественного анализа интенсивно флюоресцирующих белков в кораллах.

Впервые проведен одновременный анализ с пикосекундным разрешением флуоресцентной эмиссии кораллов Acropora digitifera, A. nasuta и Plesiastrea versipora во времени и по длинам волн.

Впервые показан перенос энергии с голубых флюоресцирующих белков на зеленые флюоресцирующие белки в кораллах.

Полученные характеристики интенсивно флюоресцирующих белков показывают, что флуоресцирующие белки не играют значительной роли в возбуждении хлорофилла симбиотических водорослей. Однако, поглощая и рассеивая излишнее излучение в видимой и ультрафиолетовой области, флюоресцирующие белки в кораллах выполняют защитную функцию для ФС II зооксантелл и тканей.

Качественный и количественный состав флюоресцирующих белков может быть индикатором состояния герматипных кораллов. Изученные физиологические аспекты жизнедеятельности кораллов могут являться основой для разработки стратегии их сохранения. Кроме того, полученные результаты и разработанные методы могут быть полезными для использования флуоресцирующих белков кораллов в качестве генетических маркеров в молекулярной биологии и биотехнологии по аналогии с зеленым флуоресцирующим белком из Aequorea spp.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях: «Traditions, merges and shifts in biological research» Singapore, 2000, «30tt Annual marine benthic ecology meeting» Durham, NH, USA, 2001, «Australian biochemistry meeting USPP» Sydney, Australia, 2002, а также на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и

списка цитируемой литературы (176 работы, в том числе 173 иностранных). Работа изложена на 87 страницах, содержит 23 рисунка и 6 таблиц.

Работа выполнена в лаборатории экологии Университета Рюкю, Окинава, Япония и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований были герматипные кораллы Montipora digitata, Acropora nasuta, A. listei, A. poly stoma, A. valida, A.formosa, A. tenuis, A. aspera, A. secale, A. digitiferaи Plesiastreaversipora. Образцы M. digitata собрали на коралловом рифе острова Сесоко, Окинава, Япония. Колонии P. versipora собрали в порту Джексон, Австралия.

Эксперимент по влиянию режима освещения на содержание жирных кислот кораллов проводили, размещая ветви коралла М. digitata в условиях освещенности 95, 30 и 7 % ФАР в 50-л аквариумах. Эксперимент проводили в течение 5 недель. Еженедельно из каждого варианта и контроля собирали по две ветви коралла и немедленно замораживали.

Эксперимент по влиянию режима освещения на интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков проводили, помещая небольшие колонии A. nasuta, A. listei, A. polystoma, A. valida, A. formosa и A. tenuis в полную темноту в течение 8 дней, каждые 2 дня от колоний коралла брали образцы для исследования.

Разделение клеток зооксантелл и тканей коралла осуществляли при помощи многократного переосаждения центрифугированием, фильтрования через планктонные сеточки, а также разделения в градиенте сахарозы.

Содержания жирных кислот определяли после экстракции

липидов по модифицированному методу Блая и Даера (Bligh, Dyer, 1959), их метилирования и очистки метиловых эфиров жирных кислот при помощи высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Метиловые эфиры жирных кислот, растворенные в гексане, анализировали на газовом хроматографе GC 14В («Shimadzu», Япония) с кварцевой капиллярной колонкой FFAP (30мх0,32ммх0,25мкм) («Supelco», США). Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили сравнением их относительного времени удерживания со стандартами. Структуру подтверждали при помощи газовой хроматографии-масс спектрометрии на GCMS QP-1000EX («Shimadzu», Япония).

Статистический анализ содержания жирных кислот выполнен с помощью программы «Statistica 5.5».

Измерение спектров возбуждения и эмиссии осуществляли при помощи спектрофлуорофотометра RF-5300PC (Shimadzu, Япония). Спектральные характеристики флуоресцирующих белков, разделенных с помощью ДСН-ПАГ электрофореза, определяли после экстракции белков из полосок геля с 1 мл 62,5 тМ Трис буфера (рН 6,8).

ДСН-ПАГ электрофорез проводили в 4-7%-ном полиакриламидном геле в модификации Laemmli (1970) и Ikeuchi и Inoue(1988).

Полипараметрический анализ эмиссионных спектров флуоресцирующих белков и хлорофилла зооксантелл образцов А. digitifera, A. nasuta и P. versipora (синей и зеленой окраски) проводили с помощью SLM 8100 спектрофлуорофотометра «Spectronic Instruments» (США). Спектры эмиссии флуоресценции с разрешением во времени получали при помощи спектрографа Hamamatsu 4334 («Hamamatsu», Япония).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Состав жирных кислот клеток коралла-хозяина и зооксантелл

Метод, примененный в настоящем исследовании, позволил отделить ткани коралла-хозяина от симбиотических водорослей и определить состав жирных кислот (ЖК) каждого из симбионтов (Таблица 1).

Таблица 1. Содержание ж.к. в клетках зооксантелл и тканях

Жирные кислоты Зооксантеллы Коралл-хозяин

14:0 3,61±2,00 2,44±0,92

16:0 32,69±7,51 50,20±2,64

16:1 5,47±2,27 12,20±9,54

18:0 5,82±5,05 7,13±2,06

18:1оо9 5,91±2,67 6,91±2,27

18:1со7 _ 0,41±0,19

18:2ю 6 1,90±0,37 1,14±0,38

18:3<о6 8,26±6,40 4,08±1,20

18:4соЗ 5,73±4,60 1,46±0,11

20:3со6 0,5±0,71 1,30±0,33

20:4ю6 1,4±0,88 2,70±0,36

20:5(оЗ 3,89±2,94 0,60±0,30

22:4(о6 2,24±1,53 3,21±0,41

22:5«вЗ 0,82±0,74 0,70±0,54

22:6шЗ 4,48±2,90 0,68±0,54

ЕНЖК 43,11±11,16 60,10±1,56

2МНЖК 13,21±6,19 16,30±5,79

Е ПНЖК 32,55± 16,34 16,95±3,01

£ Специфические

бактериальные ЖК 0,43±0,25 1,49±1,72

Есоб 12,06±7,37 9,21±2,26

ЕсоЗ 14,91±9,69 3,03±1,16

Симбиотические водоросли характеризовались большим

содержанием полиненасыщенных ЖК (ПНЖК), суммы ооЗ ЖК, 18:2га6 и 22:6юЗ ЖК (/-тест, р < 0,05), но меньшим уровнем 16:0 ЖК (/-тест, р < 0,05) по сравнению с тканями коралла. Присутствие в тканях

коралла ЖК, специфичных для динофлагеллят (18:4о>3, 22:5юЗ и 22:6шЗ) (Уо1кшап й а1., 1989), является доказательством того, что симбиотические зооксантеллы обеспечивают хозяина не только насыщенными ЖК (НЖК), но и ПНЖК.

2.2. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот коралла-хозяина и зооксантелл

В процессе акклиматизации кораллов к свету и температуре происходит изменение концентрации ЖК в их организме. Мы провели эксперимент по влиянию освещения различной интенсивности (7, 30 и 95 % ФАР) на симбиотический коралл Montipora digitata. В процессе работы, одновременно с повышением летней температуры и освещенности, мы наблюдали в последние две недели эксперимента обесцвечивание по сравнению с контролем коралла Montipora digitata в условиях как высокой (95 % ФАР), так и низкой (7 % ФАР) освещенности.

Результаты двухфакторного анализа ЛКОУЛ показали значимые за время эксперимента изменения в содержании жирных кислот (18:2со6 и при возрастании температуры и в вариантах с разной

освещенностью (18:1со9 и 18:2ю6) (Рис. 1).

Содержание 18:2оо6 снизилось во всех вариантах после первой недели эксперимента и осталось на низком уровне в течение всего последующего эксперимента. Наиболее заметное изменение наблюдали в варианте В противоположность этой тенденции

отмечали увеличение содержания в ходе эксперимента. В

зооксантеллах наблюдали значительно меньшие уровни

и пониженное суммарное содержание мононенасыщенных ЖК (МНЖК) (Р = 4,211, р < 0,01, Б = 6,662, р < 0,01 и Б = 3,199, р < 0,05, соответственно), в условиях 7 % ФАР по сравнению с вариантом 95 % ФАР (Рис. 1,2).

Рис. 1. Относительное содержание 18:2(об от общего количества ЖК в зооксантеллах коралла М. сИфМа в течение 35 дней в световых вариантах и контроле (п =2).

Рис. 2. Относительное содержание 18:1со9 от общего количества ЖК в зооксантеллах коралла М. digitata в течение 35 дней. Данные в каждом из вариантов суммированы, так как по результатам двухфакторного анализа ANOVA в них отсутствуют значимые различия (п = 8).

Изменения интенсивности освещения приводят к изменению скорости фотосинтеза и, следовательно, влияют на метаболическое и энергетическое состояние организма. Биосинтез ЖК находится в зависимости от процесса фотосинтеза (Sasaki et al., 1997). Таким образом, изменения содержания ЖК в зооксантеллах в соответствии с условиями освещенности, скорее всего, являются ответом на различия в скорости процесса фотосинтеза и качества фотосинтетических продуктов.

2.3. Влияние режима освещения на состав жирных кислот коралла-хозяина

По результатам двухфакторного анализа ANOVA в тканях коралла-хозяина уровень ЖК 18:Зсо6, 18:4шЗ, 22:5н>3, 22:6<вЗ и суммарное содержание шЗ ЖК уменьшилось в течение эксперимента с повышением температуры (Рис. 3, 4), в то время как содержание 20:4со6 и 22:4со6 возросло. Изменения интенсивности освещенности привели к значимым изменениям относительного содержания ПНЖК 18:Зсо6 и 22:6соЗ. Наименьшую концентрацию этих ЖК наблюдали при 7 % ФАР, а наибольшую при 95 % ФАР.

1 7 14 21 28 35

Время, дни

Рис. 3. Относительное содержание 18:Зсо6 от общего количества ЖК в тканях коралла-хозяина М. digit at а в течение 35 дней в трех вариантах освещенности и контроле (п = 2).

Однофакторный анализ ANOVA показал, что в тканях коралла при 95 % ФАР после четырех недель эксперимента произошло уменьшение содержания ЖК 20:4ю6, 20:5юЗ, 22:5соЗ и 22:4а>6 (Рис. 5, 6). Уровень ЖК 20:4со6 и 22:4со6 увеличился к окончанию эксперимента, в то время как содержание осталось на низком уровне.

Время, дни

Рис. 4. Относительное содержание 18:4<вЗ и 22:5соЗ от общего количества ЖК в тканях коралла-хозяина М. digitata в течение 35 дней. Данные в каждом из вариантов суммированы, так как по результатам двухфакторного анализа ANOVA в них отсутствуют значимые различия (п = 8).

Время дни

Рис. 5. Изменение относительного содержания 20:4со6 и 22:4<в6 от общего количества ЖК в тканях коралла-хозяина М. digitata в варианте 95 % ФАР в течение 35 дней (п = 2).

В варианте 7 % ФАР содержание 22:5а>3 значительно снизилось в

течение эксперимента (Рис. 7). Уровень ЖК 18:3ю6 значительно уменьшился в течение последних трех недель эксперимента (Рис. 3). В конце экспериментального периода наблюдали возрастание содержания 20:4а>6 (Рис. 7). Данные изменения в тканях коралла-хозяина совпали с обесцвечиванием кораллов в условиях 95 и 7 % ФАР. В контроле наблюдали уменьшение суммарного содержания после четырех недель эксперимента.

и

Время, дни

Рис. 6. Изменение относительного содержания 20:5<»3 and 22:5о>3 от общего количества ЖК в тканях коралла-хозяина М. digitata в варианте 7 % ФАР в течение 35 дней (п = 2).

■ 20Ч«6

Рис. 7. Изменение содержания 20:4<а6 and 22:5иЗ от общего количества ЖК в тканях коралла-хозяина М. digitata в варианте 7 % ФАР в течение 35 дней (п = 2).

При повышении температуры происходит накопление НЖК (Wada et al., 1994). В нашем исследовании увеличение интенсивности освещения и температуры в процессе эксперимента сопровождалось уменьшением уровня нескольких ПНЖК (18:Зоа6, 18:4юЗ, 22:5соЗ, и суммарного содержания в тканях коралла-хозяина. При этом изменения содержания ЖК 18:Зсо6 и 22:6соЗ связаны со световыми вариантами, в то время как вариации и

суммарного содержания шЗ происходили благодаря увеличению температуры. ПНЖК более подвержены окислению по сравнению с насыщенными жирными кислотами (Romalho et al., 1998). Исходя из

этого, можно предположить, что понижение содержания ПНЖК направлено на сохранение структуры и функций мембран и на уменьшение окисления и повреждения ткани при повышении интенсивности света и температуры.

Влияние режима освещения на интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков

До настоящего времени полностью отсутствовали экспериментальные данные об эффекте изменения освещенности на комплекс пигментов коралла-хозяина - флуоресцирующих белков (ФБ). В то же время имеются сведения, что в естественной среде кораллы, обладающие ФБ, менее подвержены обесцвечиванию в повреждающих условиях по сравнению с кораллами без ФБ (Salih et al., 2000).

В данной работе показана динамика изменения интенсивности ФБ в кораллах в полной темноте. Исследованные виды можно разделить на две группы:

1) группа, в которой отмечено увеличение интенсивности возбуждения и флуоресцентной эмиссии в течение первых четырех дней эксперимента с последующим понижением данных параметров (A. nasuta, A. tenuis, A. listeimA.polystoma) (Рис. 8);

2) группа, проявляющая только понижение интенсивности возбуждения и флуоресцентной эмиссии во время всего эксперимента (A. validamA.formosa) (Рис. 8).

Так как интенсивность флуоресценции изменяется в зависимости от условий окружающей среды, то она может не отражать действительную концентрацию ФБ, а указывать на изменения в молекулярном окружении белков. Поскольку достоверный метод определения концентрации ФБ необходим для исследования изменений ФБ при различных условиях среды, в данном исследовании

был разработан метод выделения и количественного определения флуоресцирующих белков из герматипных кораллов.

Рис. 8. Изменение спектров возбуждения (а, в) и эмиссии (б, г) интактных кораллов A. nasuta (а, в) и A. valida (б, г) в морской воде при содержании в полной темноте. Пять измерений ( 1 - 5 ) произвели с интервалами в 2 дня.

2.5. Разделение флуоресцирующих белков при помощи ДСН-ПАГ электрофореза

Мы применили ДСН-ПАГ электрофорез для разделения ФБ в

растворимых бесклеточных экстрактах A. tenuis, A. nasuta и A. secale.

Обнаружена одна зеленая полоса ФБ в A. tenuis, A. nasuta и A. secale.

Выявлена желтовато-зеленая окраска флуоресцирующей полосы А.

tenuis, в то время как сине-зеленые полосы ФБ получили при анализе

A. tenuis и A. nasuta., A. aspera содержала три интенсивно ФБ: два

оранжевых и один зеленый.

2.6. Спектральные характеристики нативных кораллов и выделенных флуоресцирующих белков

У интактного коралла A. tenuis максимум возбуждения регистрировали при 505 нм, и основной пик эмиссии при 517 нм (Таблица 2). Максимум возбуждения A. nasuta и A. secale отмечали при 451 и 450 нм, соответственно. У A. nasuta идентифицировали «плечо» при 430 нм, а у A. secale обнаружен дополнительный пик при 502 нм. Спектры эмиссии у этих двух видов были почти идентичны, и имели с основной пик при 482 и 484 нм, соответственно (Таблица 2). Спектральные характеристики A. aspera похожи на таковые у А. tenuis, основное различие заключалось в позиции дополнительных пиков и «плеч» возбуждения и эмиссии (Таблица 2).

Таблица 2. Длины волн возбуждения и эмиссии кораллов и ФБ,

выделенных ДСН-ПАГ электрофорезом._

Название вида и цвет_Пики (нм)_

флуоресцентной Возбуждение Эмиссия полосы_

A. tenuis

интактный коралл зеленая полоса

465,505* 470,504*

485,517*, 555" 480,515*

A. nasuta интактный коралл зеленая полоса

430пл, 451* 427*, 451Л

482*, 515" 483*

A. secale

интактный коралл зеленая полоса

450*, 502 425,452*, 500а

484*, 515" 482*,515"

А. aspera интактный коралл зеленая полоса оранжевая полоса I оранжевая полоса II * ,

480,501* 481*

475пл, 500* 475пл,501*

490™, 514* 480*, 510 476*,510пл,575п 478*, 510,575го1

основной пик, «плечо» Каждый ФБ выделили из геля и определили его спектральные характеристики. Они оказались близки к спектральным характеристикам соответствующего коралла, за исключением А.

aspera, где различные полосы с электрофоретического геля проявляли лишь частичное сходство со спектром интактного коралла (Таблица 2).

Наши исследования показали, что молекулярный вес ФБ составлял 200 кДа для сине-зеленых ФБ из A. nasuta и A. secale, 140 кДа для зелено-желтого белка из A. tenuis, 120 и 115 кДа для двух оранжевых белков из A. aspera, соответственно. Так как эти значения молекулярного веса не изменялись в присутствии 0,1% ДСН, мы полагаем, что изученные белки являются мономерами. Нам не удалось определить молекулярный вес ФБ в A. aspera вследствие его очень низкой концентрации.

2.7. Полипараметрический анализ эмиссионных спектров ФБ коралла и хлорофилла зооксантелл

Для проверки гипотезы о защитной роли ФБ в кораллах, которая заключается в трансформации коротковолнового излучения в свет, обеспечивающий протекание фотосинтетического процесса в зооксантеллах, проводилось изучение спектрально-кинетических особенностей возбуждения и испускания флуоресценции голубыми и зелеными ФБ кораллов Plesiastreaversipora, A. digitifera иA. nasuta. На рис. 9 представлены данные анализа разрешения по времени и длинам волн флуоресцентной эмиссии ФБ и хлорофилла (ХЛ) зооксантелл из коралла P. versipora с зеленой окраской. Рис. 9а иллюстрирует кинетику затухания эмиссии ФБ и зооксантелл. ФБ (максимум 515 нм) испускали свет с большими амплитудами (левая часть рисунка) и медленнее угасали по сравнению с полосами флуоресценции ХЛ водорослей. На рис. 9 б представлены данные и их соответствие модели в логарифмическом масштабе, чтобы продемонстрировать сравнение более медленного компонента эмиссии ФБ с более быстрой эмиссией фотосистемы II (ФС И).

Основной режим распространения эмиссии ХЛ значительно шире и центрирован на более короткую продолжительность по сравнению с

узкими компонентами эмиссии ФБ. Все модели показывают отсутствие кинетических компонентов, указывающих на то, что ФБ коралла в возбужденном состоянии проявляют какую-либо значительную взаимосвязь с возбужденным состоянием ХЛ, за исключением изначального возбуждения от импульса лазера. Начальная фаза кинетического подъема возбуждения ФБ, в течение и сразу после возбуждения лазером (0-300 пС), связана с небольшим воспроизводимым зеленым сдвигом флуоресценции. Мы интерпретируем этот сдвиг как согласующийся с быстрым индуктивно-резонансным Ферстеровским переносом энергии (ИРПЭ) от голубых к зеленым флуоресцирующим белкам. Доказательства ИРПЭ рассмотрены более детально ниже. В целом, рис. 9 указывает на отсутствие доказательств в виде обратных амплитуд или длительного возбуждения как для прямого резонансного, так и для непрямого возбуждения ХЛ эмиссией ФБ.

дшмимиы.ша время, пС

Рис. 9. Одновременное определение зависимости по времени и длинам волн флуоресцентной эмиссии ФБ и ХЛ зооксантелл в коралле Р. угтрога зеленой окраски. Рисунок (а) иллюстрирует компоненты эмиссии ФБ и ХЛ, построенные в линейном масштабе. Рисунок (б) показывает кинетические профили интегрированных длин волн для всех данных изображений, суммарную модель и два подкомпонента модели, а именно компоненты эмиссии ФБ и ХЛ зооксантелл.

В таблице 3 представлены параметры спектральных полос и продолжительности флуоресценции для основных функций угасания

эмиссионных пиков ФБ и ФС II водорослей с одновременным

разрешением. Полосы ФБ (после завершения ИРПЭ) становятся шире

по длинам волн, и при этом значительно увеличивается

продолжительность параметров центра (> 1990 пС) по сравнению с ФС

II, которую освещали лазером менее 800 пС.

Таблица 3. Характеристики флуоресценции основных спектральных полос ФБ и ФС II зооксантелл в А. digitifera и Р. versipora с голубой и зеленой окраской

Макси Ширина Среднее время Дисперсия времени

Образец Полоса мум1, полосы, жизни жизни

нм нм возбужденного возбужденного

состояния, пС состояния, пС

ФБ

495

IИ&Н/ега ФС II 683

ФБ

515

\ersipora (зеленая)

ФС II 683

ФБ

482

ФС II 683

53 20 36 22

55 18

2341 639 2793 762

1984 676

205

141

8 102

\ersipora

(голубая) ________________

Максимум — наблюдаемая длина волны пика эмиссии основных ФБ после завершения всех ИРПЭ

2 Ширина полосы - наблюдаемая ширина полосы при половине высоты пика ФБ после завершения всех ИРПЭ

2.8. Карты спектров возбуждения и эмиссии флуоресцирующих белков и хлорофилла зооксантелл

На рис. 10 показано отношение длины волны возбуждающего света

и эмиссии ФБ (справа) и ФС II водорослей (слева), измеренные в

состоянии покоя при помощи спектрофлуориметра. Сравниваются

данные, полученные для голубой и зеленой формы P. versipora. Мы

полагаем, что если действительно происходил перенос энергии между

ФБ и ФС II водорослей, то должно бы наблюдаться соответствие

между спектрами возбуждения и интегральными спектрами ФБ и ХЛ

зооксантелл.

Рис. 10. Карты контуров и интегрированные профили спектров возбуждения и эмиссии ФБ и ХЛ зооксантелл в Р. уетрога с голубой (а, б) и зеленой (в, г) окраской. Рис. д-е показывают соответствующие нормализованные интегралы для возбуждения (сплошная линия) и эмиссии (пунктирная линия) графиков, представленных на верхних рисунках, цвет линий соответствует окраске образца. Ет ОЯ Хх -спектр эмиссии зооксантелл из зеленого образца коралла, Ех ОЯ Хх -спектр возбуждения зооксантелл из зеленого образца, Ет БЬ Хх -спектр эмиссии зооксантелл из голубого образца и Ех БЬ Хх - спектр возбуждения зооксантелл из голубого образца.

Карты спектров указывают, что возбуждения ФС II двух кораллов (область 683 нм) имеют незначительные отличия, помимо перекрытия (~ 20 % при 650 нм) широкого «хвоста» эмиссии голубых ФБ со всем спектром эмиссии ХЛ. У зеленых ФБ наблюдали меньше перекрытие эмиссии ФБ с ФС И, так как зеленые ФБ имеют более узкую полосу эмиссии. Нормализованный интегральный спектр (Рис. 10д, е) возбуждения (непрерывная линия) и эмиссии (пунктирная линия) зооксантелл и ФБ подтверждает выводы, сделанные на основе карт спектров. Наиболее важно, что контуры эмиссии и возбуждения ХЛ не различаются для кораллов разной окраски, что указывает на то, что не происходит значительного возбуждения ХЛ от ФБ.

Таким образом, можно полгать, что в соответствии с предположением 8аШ й а1. (2000), абсорбция ФБ в ультрафиолетовой и голубых областях спектра служит для блокирования и рассеивания излишнего видимого и потенциально опасного ультрафиолетового излучения, для предупреждения его попадания на зооксантеллы и жизненно важные органеллы коралла.

2.9. Доказательства ИРПЭ

Для изучения индуктивно резонансного переноса энергии (ИРПЭ) между ФБ был проведен анализ кинетических последовательностей эмиссии ФБ с интервалами 31,25 пС для образцов А. digitifera и зеленой формы Р. \ersipora. Спектры показали отличия между конечным спектром при 281,25 пС и всеми предшествующими спектрами, таким образом, иллюстрируя разрешение во времени различий между изначальным донором и конечным акцептором в ФБ. Каждый ФБ проявлял аналогичный характер с зависимым от времени сдвигом от голубой к зеленой флуоресценции, которая представлялась завершенной менее чем за 200 пС. Наибольший сдвиг наблюдали у А. digitifera и наименьший у зеленой формы Р. уетрога. Спектральные

изменения совпадали с 3-10 нм сдвигом пика эмиссии и соответствовала зеленой части спектрального контура. После завершения данного процесса не наблюдалось дальнейших • спектральных изменений в области ФБ, что предполагает передачу возбуждения конечной группе акцепторов.

Несмотря на то, что физиологическое значение процесса ИРПЭ остается неопределенным, наши данные позволяют понять его потенциальное значение в отношении структурной организации ФБ и возможного механизма их функционирования. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на понимание роли ФБ в фотозащите, их молекулярных изменениях в стрессовых ситуациях и других физиологически значимых процессах.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен состав жирных кислот тканей герматипного коралла Moritipora digitata и его симбиотических микроводорслей (зооксантелл). Состав жирных кислот коралла и зооксантелл подобны; их основное отличие заключается в большем количестве полиненасыщенных жирных кислот в клетках симбиотических зооксантелл. Присутствие в тканях коралла жирных кислот, специфичных для отдела, к которому относятся зооксантеллы (динофлагелляты) дает основание считать, что зооксантеллы поставляют кораллу-хозяину полиненасыщенные жирные кислоты.

2. Показана динамика изменения содержания жирных кислот в коралле Montipora digitata и в зооксантеллах в процессе акклиматизации к измененной освещенности и повышению температуры. Снижение содержания полиненасыщенных жирных кислот у симбионтов происходило в направлении, способствующему сохранению структурной целостности и физиологических функций

мембран в процессе повышения температуры и интенсивности освещения.

3. Разработан метод для количественного и качественного анализа интенсивно флюоресцирующих белков в кораллах, который позволяет разделять флуоресцирующие белки и определять их содержание.

4. Изучены закономерности флуоресценции интенсивно флюоресцирующих белков в кораллах Acropora aspera, A. nasuta, A. secale иЛ. tenuis.

5. Впервые проведен полипараметрический анализ в пикосекундном разрешении флуоресцентной эмиссии кораллов Acropora digitifera, A. nasuta и Plesiastrea versipora во времени и по длинам волн. Угасание эмиссии флюоресцирующих белков происходило в течение 1900-2800 пС после возбуждения.

6. Показан индуктивно-резонансный перенос энергии с группы голубых интенсивно флюоресцирующих белков на зеленые интенсивно флюоресцирующие белки в кораллах. Продолжительность переноса составила 100 - 200 пС.

7. Полученные характеристики интенсивно флюоресцирующих белков показывают, что данные белки не играют значительной роли в возбуждении хлорофилла симбиотических водорослей. Можно предположить, что интенсивно флюоресцирующие белки в кораллах являются защитными веществами для фотосистемы II зооксантелл и тканей коралла от избытка видимого и ультрафиолетового света. Таким образом, выявленные изменения в составе жирных кислот и особенности флуоресцентных белков можно расценивать как приспособительные реакции симбиотических кораллов в условиях изменившихся температуры и освещенности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Papina (Gribova) M., Meziane Т., Van Woesik R. Fatty acids mark the status of the symbiotic relationships in corals: a case study of Montipora digitata. Abstracts of 5th International Congress on Biology, National University ofSingapore. Singapore. 2000. P. 13.

2. Papina (Gribova) M., Meziane Т., Van Woesik R. Fatty acids reflect the status of the symbiotic relationships in corals: a case study of Montipora digitata. Abstracts of The 30th Annual Marine Benthic Ecology Meeting in the University ofNew Hampshire. Durham, NH, USA. 2001. P. 130.

3. Papina (Gribova) M., Sakihama Y., Bena C, van Woesik R., Yamasaki H. Separation of highly fluorescent proteins by SDS-PAGE in Acroporidae corals // Comparative Biochemistry and Physiology Part В 2002. V. 131. P. 767-774.

4. Gilmore A.M., Larkum A.W.D., Salih A., Itoh S., Shibata Y., Bena C, Yamasaki H., Papina (Gribova) M., van Woesik R. In vivo time-resolution of the emission spectra of fluorescent proteins and zooxanthellae photosystem II in reef-building corals. Abstracts of Australian Biochemistry meeting USPP. Sydney, Australia. 2002. P. 26.

5. Gilmore A.M., Larkum A.W.D., Salih A., Itoh S., Shibata Y., Bena C, Yamasaki H., Papina (Gribova) M., van Woesik R. Simultaneous time resolution of the emission spectra of fluorescent proteins and zooxanthellar chlorophyll in reef-building corals // Photochemistry and Photobiology 2003. V. 77. P. 515-523.

6. Papina (Gribova) M., Meziane Т., Van Woesik R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids // Comparative Biochemistry and Physiology Part В 2003. V. 135. P. 533-537.

Соискатель yn Грибова М.Ю.

ЗАО «Фартоп» г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 11.11.2004

fZ24§3

РНБ Русский фонд

2005-4 23899

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грибова, Марина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ф Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Жирные кислоты как таксономические маркеры и их биосинтез в морских организмах

1.2. Изменение состава жирных кислот при акклиматизации к температуре и 10 освещенности

1.3. Состав жирных кислот герматипных кораллов

1.4. Передача липидов зооксантеллами кораллу

1.5. Роль жирных кислоты в акклиматизации кораллов 15 " 1.6. Зеленый флуоресцирующий белок

1.7. Белки подобные зеленому флуоресцирующему белку

1.8. Белки подобные зеленому флуоресцирующему белку в герматипных кораллах 20 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реактивы и вспомогательные материалы

2.2. Приборы и оборудование

2.3. Биологические объекты

2.4. Эксперименты

2.4.1. Эксперимент по влиянию режима освещения на содержание жирных кислот ^ кораллов

2.4.2. Эксперимент по влиянию режима освещения на интенсивность флуоресценции 24 флуоресцирующих белков

2.5. Аналитические и физико-химические методы

2.5.1. Подготовка образцов и разделение клеток зооксантелл и тканей коралла

2.5.2. Методы обработки лшшдного материала

2.5.2.1. Экстракция липидов

2.5.2.2. Приготовление метиловых эфиров жирных кислот

2.5.2.3. Газо-жидкостная хроматография и масс спектрометрия метиловых эфиров 27 жирных кислот ф 2.5.3. Статистический анализ содержания жирных кислот

2.5.4. Измерение спектров возбуждения и эмиссии

2.5.5. Подготовка образцов и электрофорез

2.5.6. Измерение концентрации белка

2.5.7. Регистрация спектров эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и хлорофилла зооксантелл

2.5.7.1. Исследование продолжительности флуоресценции

2.5.7.2. Полипараметрический анализ эмиссионных спектров и индуктивно- 31 резонансного переноса энергии с использованием метода двойной интегральной свертки

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Состав жирных кислот клеток коралла-хозяина и зооксантелл

3.2. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот коралла-хозяина и 36 зооксантелл

3.2.1. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот зооксантелл

3.2.2. Влияние режима освещения на содержание жирных кислот коралла-хозяина

3.3. Влияние режима освещения на интенсивность флуоресценции флуоресцирующих 48 белков

3.4. Выделение флуоресцирующих белков

3.4.1. Внешний вид кораллов в видимом и ультрафиолетовом свете

3.4.2. Спектральные характеристики интактных кораллов

3.4.3. Электрофорез флуоресцирующих белков

3.5. Полипараметрический анализ эмиссионных спектров флуоресцирующих белков 56 кораллов и хлорофилла зооксантелл

3.5.1. Полипараметрическое разрешение спектров эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и фотосистемы II зооксантелл

3.5.2. Карты спектров возбуждения и эмиссии флуоресцирующих белков кораллов и 60 фотосистемы II зооксантелл

3.5.3. Доказательства индуктивно-резонансного переноса энергии 64 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70 ВЫВОДЫ 73 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин ДИС - двойная интегральная свертка

ДСН-ПАГ - додецил сульфит натрия - полиакриламидный гель

ЗФБ - зеленый флуоресцирующий белок

ЖК - жирные кислоты

НЖК - насыщенные жирные кислоты

МНЖК - мононенасыщенные жирные кислоты

МЭЖК - метиловые эфиры жирные кислоты

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ХЛ - хлорофилл

ФАР - фотосинтетически активная радиация ИРПЭ - индуктивно резонансный перенос энергии ФБ - флуоресцирующий белок ФС II - фотосистема II СоА - Кофермент А

Ро - минимальная интенсивность флуоресценции Рш - максимальная интенсивность флуоресценции Ру - изменяющаяся интенсивность флуоресценции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состав жирных кислот и флуоресцирующих белков и их роль в акклиматизации у герматипных кораллов"

К рифообразующим или герматипным кораллам (образующие биогермы - биогенные карбонатные постройки) относятся представители типа Coelenterata (кишечнополостные), в основном класса Anthozoa (кораллы), подкласса Hexocorallia (шестилучевые кораллы), отряда Scleractinia (истинные известковые кораллы). Широкое распространение герматипных кораллов в бедных питательными элементами тропических и субтропических водах стало возможным благодаря их симбиотическим взаимоотношениям с одноклеточными микроводорослями из отдела динофлагеллят - зооксантеллами (Титлянов, 1999).

Коралловые рифы, сформированные преимущественно герматипными кораллами, считаются наиболее разнообразными, сложными и продуктивными морскими экосистемами. Вследствие антропогенного воздействия на данный момент коралловые рифы оказались одной из наиболее уязвимых морских экосистем (Brown, 1997). Массовое обесцвечивание кораллов (утрата симбиотических водорослей и/или их пигментов) - один из основных показателей ухудшения состояния коралловых рифов (Van Woesik et al., 2001). Обесцвечивание кораллов происходит вследствие резкого изменения параметров окружающей среды, например, таких как мутность воды, освещенность и температура (Hoegh-Guldberg, 1999). В последние годы уделяется повышенное внимание механизмам акклиматизации - приспособительных изменений - симбиотических герматипных кораллов. Понимание данных процессов позволит предвидеть изменения состояния коралловых рифов в зависимости от меняющихся условий окружающей среды, и, возможно, сыграет свою роль в спасении некоторых из них от разрушения.

Обесцвечивание герматипных кораллов часто бывает обусловлено нарушением фотосинтетического аппарата симбиотических зооксантелл (Hoegh-Guldberg, 1999). При этом функционирование фотосинтетического аппарата в значительной степени зависит от состояния липидного матрикса тилакоидных мембран симбиотических микроводорослей, в которых он локализован. Такая связь между липидами и фотосистемами указывает на возможность регулирования фотосинтеза через изменение состава жирных кислот тилакоидных мембран (Mock, Koon, 2002). Освещенность и температура являются наиболее важными факторами среды, которые влияют не только на фотосинтетические процессы, но косвенно, через трофические взаимоотношения, они оказывают существенное влияние на содержание жирных кислот и коралла-хозяина. Поэтому важно изучать одновременно приспособительные изменения содержания жирных кислот в симбиотических микроводорослях и в коралле-хозяине.

В настоящее время известно ограниченное количество работ по составу жирных кислот в герматипных кораллах (Latyshev et al., 1991; Meyers, 1977; Yamashiro et al., 1999). Однако только в работе Бишопа и Кенрика (Bishop, Kenrick, 1980) был приведен состав жирных кислот симбиотических зооксантелл из рифообразующих кораллов, но в этом исследовании не определяли состав жирных кислот коралла-хозяина. Процессы изменения состава жирных кислот при акклиматизации герматипных кораллов на данный момент не исследованы.

Другой не менее важный механизм акклиматизации герматипных кораллов - это качественное и количественное варьирование содержания флуоресцирующих белков-пигментов коралла-хозяина. Установлено, что степень обесцвечивания симбиотических кораллов в естественной среде коррелирует с содержанием флуоресцирующих белков (Dove et al., 1995; Salih et al., 2001). Существуют две противоположные гипотезы о роли флуоресцирующих белков в жизнедеятельности герматипных кораллов. С одной стороны, эти белки рассматриваются как возможные фотопротекторы эндосимбиотических микроводорослей и тканей коралла-хозяина от излишнего видимого и ультрафиолетового излучения (Salih et al., 2000). С другой стороны, высказывается предположение, что флуоресцирующие белки поглощают свет в коротковолновой области спектра и излучают энергию с большими длинами волн, следовательно, обеспечивая симбиотические зооксантеллы дополнительным светом для фотосинтеза (Schlichter et al., 1994). Таким образом, однозначно роль флуоресцирующих белков в акклиматизации герматипных кораллов к изменениям освещенности не определена.

Целью настоящей работы было изучение состава и динамики жирных кислот и флуоресцирующих белков при акклиматизации симбиотических герматипных кораллов к изменениям освещенности. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод разделения симбиотического сообщества «коралл-зооксантеллы» Montipora digitata на клетки зооксантелл и ткани коралла-хозяина.

2. Провести анализ и сравнить составы жирных кислот в тканях коралла-хозяина и в симбиотических микроводорослях в процессе акклиматизации у симбиотических кораллов, находящихся в различных условиях освещенности.

3. Исследовать состав и интенсивность флуоресценции флуоресцирующих белков кораллов при заданных режимах освещенности.

4. Определить спектральные характеристики и некоторые биохимические свойства флуоресцирующих белков из герматипных кораллов. Провести полипараметрический анализ с пикосекундным разрешением флуоресцентных спектров эмиссии флуоресцирующих белков и фотосинтетических пигментов зооксантелл в тканях кораллов in vivo.

5. Изучить индуктивно-резонансный Ферстеровский перенос энергии между флуоресцирующими белками герматипных кораллов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Грибова, Марина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен состав жирных кислот тканей герматипного коралла Montipora digitata и его симбиотических микроводорслей (зооксантелл). Состав жирных кислот коралла и зооксантелл подобны; их основное отличие заключается в большем количестве полиненасыщенных жирных кислот в клетках симбиотических зооксантелл. Присутствие в тканях коралла жирных кислот, специфичных для отдела, к которому относятся зооксантеллы (дино флагеллят) дает основание считать, что зооксантеллы поставляют кораллу-хозяину полиненасыщенные жирные кислоты.

2. Показана динамика изменения содержания жирных кислот в коралле Montipora digitata и в зооксантелл ах в процессе акклиматизации к измененной освещенности и повышению температуры. Снижение содержания полиненасыщенных жирных кислот у симбионтов происходило в направлении, способствующему сохранению структурной целостности и физиологических функций мембран в процессе повышения температуры и интенсивности освещения.

3. Разработан метод для количественного и качественного анализа интенсивно флюоресцирующих белков в кораллах, который позволяет разделять флуоресцирующие белки и определять их содержание.

4. Изучены закономерности флуоресценции интенсивно флюоресцирующих белков в кораллах Acropora aspera, A. nasuta, A. secale и A. tenuis.

5. Впервые проведен полипараметрический анализ в пикосекундном разрешении флуоресцентной эмиссии кораллов Acropora digitifera, A. nasuta и Plesiastrea versipora во времени и по длинам волн. Угасание эмиссии флюоресцирующих белков происходило в течение 1900 - 2800 пС после возбуждения.

6. Показан индуктивно-резонансный перенос энергии с группы голубых интенсивно флюоресцирующих белков на зеленые интенсивно флюоресцирующие белки в кораллах. Продолжительность переноса составила 100 - 200 пС.

7. Полученные характеристики интенсивно флюоресцирующих белков показывают, что данные белки не играют значительной роли в возбуждении хлорофилла симбиотических водорослей. Можно предположить, что интенсивно флюоресцирующие белки в кораллах являются защитными веществами для фотосистемы П зооксантелл и тканей коралла от избытка видимого и ультрафиолетового света. Таким образом, выявленные изменения в составе жирных кислот и особенности флуоресцентных белков можно расценивать как приспособительные реакции симбиотических кораллов в условиях изменившихся температуры и освещенности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из симбиотического сообщества «коралл-зооксантеялы» МогШрога выделены клетки зооксантелл и ткани коралла-хозяина. Проведено сравнение состава жирных кислот собственно коралла и эндосимбиотических динофлагеллят (зооксантелл). В зооксантелл ах преобладали жирные кислоты 16:0, 18:Зоо6, 18:1©9, 18:0, 18:4юЗ, 16:1, 22:6озЗ и 20:5<вЗ, в то время как в тканях коралла-хозяина отмечено наибольшее содержание следующих жирных кислот: 16:0,16:1,18:0,18:1со9,18:Зсо6,22:4ю6 и 20:4со6. Основное различие между составом жирных кислот у клеток хозяина и у симбиотических водорослей заключалось в большем содержании полиненасыщенных жирных кислот в зооксантелл ах. Присутствие в тканях коралла жирных кислот, специфичных для динофлагеллят (18:4юЗ, 22:5соЗ и 22:6соЗ), является доказательством более значимой функции симбиотических водорослей в кораллах, поскольку ранее считалось, что зооксантеллы обеспечивают хозяина только насыщенными жирными кислотами. Полученные данные позволяют сделать вывод, что зооксантеллы поставляют кораллу-хозяину и полиненасыщенные жирные кислоты.

Жирные кислоты играют ключевую роль в процессах акклиматизации. Тем не менее, на них часто не обращают должного внимания при изучении влияния стрессовых условий среды на кораллы. Мы изучили влияние различных интенсивностей освещенности и повышения температуры на состав жирных кислот коралла-хозяина и его симбиотических водорослей - зооксантелл. В ходе эксперимента мы поместили ветви коралла МогШрога Ш£Ша в условия освещенности 7, 30 и 95% фотосингетически активной радиации (ФАР) и наблюдали за изменениями в течение 35 дней на фоне повышения температуры. Изменение интенсивности освещенности и температуры значительно повлияли на содержание жирных кислот в коралле-хозяине и зооксантелл ах. Например, низкая освещенность (7 % ФАР), приводящая к уменьшению скорости фотосинтетического процесса, вызвала снижение содержания жирных кислот 18:1 <»9 и 18:2<о6 в зооксантелл ах. В этих условиях в коралле-хозяине наблюдается понижение содержания жирной кислоты 18:Зсо6, для которой 18:2со6 является предшественником. Подобную закономерность взаимосвязи состава жирных кислот симбиотических водорослей и коралла отмечали и для изменений содержания жирной кислоты 22:6<аЗ, являющейся маркером динофлагеллят.

Регулирование состава жирных кислот у обоих симбионтов происходило в основном благодаря изменению содержания полиненасыщенных кислот. Снижение содержания полиненасыщенных жирных кислот симбионтами происходило в направлении способствующему сохранению структурной целостности и физиологических функций мембран в процессе повышения температуры и интенсивности освещения.

Нами выявлено, что смена режима освещенности приводит также к изменениям интенсивности флуоресценции флуоресцирующих белков в кораллах. Однако интенсивность флуоресценции не позволяла судить о количестве флуоресцирующих белков, что инициировало наши исследования, направленные на более детальное изучение спектральных характеристик кораллов и разработку метода количественной оценки флуоресцирующих белков в герматипных кораллах.

Изучены спектральные характеристики кораллов Acropora tenuis, A. nasuta, A. secale и А. aspera, каждый из которых показал интенсивную флуоресценцию под воздействием ультрафиолетового света. Максимальную эмиссию флуоресценции от интактных кораллов наблюдали при 517, 482, 484, и 514 нм в A. tenuis, A. nasuta, A. secale и A. aspera, соответственно. Для разделения флуоресцирующих белков применили метод ДСН-ПАГ электрофореза к водорастворимой свободной от клеток фракции кораллов. Во всех исследованных акропоридах выявлены зеленые интенсивно флуоресцирующие белки, при этом их молекулярная масса и количество в разных кораллах значительно различались. В дополнение к зеленому белку у A. aspera выявлено два оранжевых флуоресцирующих белка. Основные пики возбуждения и эмиссии оранжевых флуоресцирующих белков были аналогичны, однако они имели разный молекулярный вес и спектральный контур.

Мы использовали спектрограф Hamamatsu, оснащенный пульсирующим синим лазерным диодом (50 пС, 405 нм), для полипараметрического анализа спектров флуоресценции и кинетики флуоресцирующих белков и хлорофилла зооксантелл. Основные флуоресцирующие белки излучали свет в синей, сине-зеленой и зеленой областях спектра, при этом каждый вид кораллов имел разную окраску и спектральные характеристики. У всех кораллов отмечали затухания синей и соответствующие увеличения компонентов зеленой эмиссии, указывающие на Ферстеровский индуктивно-резонансный перенос энергии (ИРПЭ) между группами флуоресцирующих белков. Перенос энергии происходил в течение 250 пС, и основное затухание флуоресцирующего белка акцептора обычно составляло 1900 - 2800 пС. Спектры и кинетика эмиссии симбиотических зооксантелл из всех изученных нами видов кораллов оказались одинаковы: с пиком эмиссии 683 нм в основном от хлорофилла фотосистемы П. Возбуждение эмиссии хлорофилла фотосистемы II по времени сходно с эмиссией флуоресцирующих белков, но характеризовалось более быстрым затуханием, примерно 640 - 760 пС. Сопоставление кинетики и возбуждения флуоресценции с эмиссией показало, что эмиссия флуоресцирующих белков играла незначительную роль в возбуждении хлорофилла зооксантелл. Таким образом, мы полагаем, что флуоресцирующие белки могли играть роль косвенно в абсорбции, экранировании и рассеивании излишнего видимого и ультрафиолетового света для защиты фотосистемы II зооксантелл и

73

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грибова, Марина Юрьевна, Владивосток

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клепси. Москва: Мир, 1986.313 с.

2. Лабас Ю.А., Гордеева А.В., Фрадков А.Ф. Флуоресцирующие и цветные белки // Природа 2003. Т. 3. № 3. С. 69-78.

3. Титлянов Э.А. Зооксантеллы в герматипных кораллах: жизненная стратегия. Владивосток: Дальнаука, 1999. 61 с.

4. Ackman R.G., Tocher C.S., Mclachlan J. Marine phytoplankton fatty acids // J. Fish. Res. Board Can. 1968. V. 25. P. 1603-1620.

5. Alcala J.R., Gratton E., Prendergrast F.G. Fluorescence life distributions in proteins // Biophys. J. 1987a. V. 51. P. 597-604.

6. Alcala J.R., Gratton E., Prendergrast F.G. Resolvability of fluorescence life distributions using phase fluorometry // Biophys. 1987b. V. 51. P. 587-596.

7. Allakhverdiev S.I., Kinoshita M., Inaba M., Suzuki I., Murata N. Unsaturated fatty acids in membrane lipids protect the photosynthetic machinery against salt-induced damage in Synechococcus И Plant. Physiol. 2001. V. 125. P. 1842-1853.

8. Al-Moghrabi S., Allemand D., Couret J.M. Fatty acids of the scleractinian coral Galaxea fascicularis: effect of light and feeding // Сотр. Physiol. В 1995. V.165. P. 183192.

9. Baker A.C. Flexibility and specificity in coral-algal symbiosis: diversity, ecology, and biogeography of Symbiodinium II Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 2003. V. 34. P. 661-689.

10. Barnes D.J., Chalker B.E. Calcification and photosynthesis in reef-building corals and algae // In: Ecosystems of the world Coral Reefs. Elsevier. 1990. P. 109-132.

11. Battey J.F., Patton J.S. A réévaluation of the role of glycerol in carbon translocation in zooxanthellae-coelenterate symbiosis//Mar. Biol. 1984. V. 79. P. 27-38.

12. Bhagooli R., Hidaka M. Comparison of stress susceptibility of in hospite and isolated zooxanthellae among five coral species // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. V. 4153. P. 1-17.

13. Bishop D.G., Kenrick J.K. Fatty acids composition of symbiotic zooxanthellae in relation to their hosts // Lipids 1980. V. 15. P. 799-804.

14. Bligh E.G., Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Bioch. Physiol. 1959. V. 37. P. 911-917.

15. Borgeson C.E., Kurtti T.J., Munderloh U.G., Blomquist G.J. Insect tissues, not microorganisms, produce linoleic-acid in the house cricket and the american cockroach // Experientia 1991. V. 47. P. 238-241.

16. Boutaud O., Brash A.R. Purification and catalytic activities of the two domains of the aliéné oxide synthase-lipoxygenase fusion protein of the coral Plexaura homomalla II J. Biol. Chem. 1999. V. 247. P. 33764-33770.

17. Brown B.E. Adaptations of reef corals to physical environmental stress // Advan. In Mar. Biol. 1997. V. 31. P. 221-299.

18. Carlson B.A. Organism responses to rapid change what aquaria tell us about nature // Am. Zool. 1999. V. 39. P. 44-55.

19. Catala R.L. Effets de fluorescence provoquée sur les coreaux par l'action des rayons ultravioletes // Comptes. Rendus. Acad. Sci. Paris 1958. V. 247. P. 1678-1679.

20. Chalfïe M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science 1994. V. 263. P. 802 805.

21. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. Ultrafast excited state dynamics In green fluorescent protein: multiple states and proton transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. V. 93. P. 8362-8367.

22. Chuecas L., Riley J.P. Component fatty acids of the total lipids of some marine phytoplankton // J. Mar. Biol. Assoc. UK 1969. V. 49. P. 97-116.

23. Connor W.E., Neuringer M. The effects of n-3 fatty acids deficiency and repletion upon the fatty acid composition and function of the brain and retina // Prog. Clin. Biol. Res. 1988. V. 282. P. 275-294.

24. Conway N., Capuzzo J.M. Incorporation and utilisation of bacterial lipids in the Solemya velum symbiosis // Mar. Biol. 1991. V. 108. P. 277-291.

25. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 448-455.

26. DeLong E.F., Yayanos A.A. Biochemical function and ecological significance of novel bacterial lipids in deep-sea procaryotes // Applied and Env. Microbiol. 1986. V. 51. P. 730-737.

27. Denwick P.M. The acetate pathway: fatty acids and polyketides // In: Medicinal natural products. John Wiley and Sons Publ, New York, 1997. P. 1022-1032.

28. Dove S.G., Takabayashi M., Hoegh-Guldberg O. Isolation and partial characterization of the pink and blue pigments of Pocilloporid and Acroporid corals // Biol. Bull. 1995. V. 189. P. 288-297.

29. Dove S.G., Hoegh-Guldberg O., Ranganathan S. Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins // Coral Reefs 2001. V. 19. P. 197— 204.

30. Draper N.R., Smith H. Applied regression analysis. Wiley and Sons Inc., New York, USA, 1998.

31. Dubinsky Z., Falkowski P.G., Porter J.W., Muscatine L. Absorption and utilization of radiant energy by light- and shade-adapted colonies of the hermatypic coral Stylophora pistillata I I Proc. R. Soc. Lond. B 1984. V. 222. P. 203-214.

32. Domotor S.L., D'Elia C.F. Cell-size distributions of zooxanthellae in culture and symbiosis // Biol. Bull. 1986. V. 170. P. 519-525.

33. Duerden J.E. West Indian Madreporarian polyps // Mem. Nat. Acad. Sci. Washington 1902. V. VIII. P. 399-648.

34. Fitt W.K., Brown B.E., Warner M.E., Dunne R.P. Coral bleaching interpretation of thermal tolerance limits and thermal thresholds in tropical corals // Coral Reefs 2001. V. 20. P. 51-65.

35. Fitt W.K., Warner M.E. Bleaching patterns of four species of Caribbean reef corals // Biol. Bull. 1995. V. 189. P. 298-307.

36. Frauenfelder H.A., Parak F., Young R.D. Conformational substrates in proteins // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1988. V. 174. P.51-79.

37. Frauenfelder H.A., Leeson D.T. The energy landscape in non-biological and biological molecules // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 757-759.

38. Gilmore A.M., Ball M.C. Protection and storage of chlorophyll in over wintering evergreens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 11098-11101.

39. Gilmore A.M., Itoh S., Govindjee M. Global spectral-kinetic analysis of room temperature chlorophyll a fluorescence from light-harvesting mutants of barley // Phil. Trans. R. Soc. Land. B 2000. V. 355. P. 1371-1384.

40. Gilmore A.M., Yamamoto H.Y. Tune-resolution of the antheraxanth- and ApH-dependent chlorophyll a fluorescence components associated with photosystem II energy dissipation in Mantoniella squamata II Photochem. Photobiol. 2001. V. 74. P. 291-302.

41. Glynn P.W. Coral reef bleaching: ecological perspectives // Coral Reefs 1993. V. 12. P. 1-17.

42. Govindjee M., Van de Ven C., Preston M., Seibert M., Gratton E. Chlorophyll a fluorescence life distributions in open and closed photosystem II reaction center preparations// Biochim. Biophys. Acta 1990. V. 1015. P. 173-179.

43. Graeve M., Kattner G., Hagen W. Diet-induced changes in the fatty acid composition of Arctic herbivorous copepods: Experimental evidence of trophic markers // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1994. V. 182. P. 97-110.

44. Grant A. J., Remond M., People J., Hinde R. Effect of host-tissue homogenate of the scleractinian coral Plesiastrea versipora on glycerol metabolism in isolated symbiotic dinoflagellates // Mar. Biol. 1997. V. 128. P. 665-670.

45. Grant A.J., Remond H.R. Low molecular-weight factor from Plesiastrea versipora (Scleractinia) that modifies release and glycerol metabolism of isolated symbiotic algae 11 Mar. Biol. 1998. V. 130. P. 553-557.

46. Harland A.D., Spencer Davies P., Fixter L.M. Lipid content of some Caribbean corals in relation to depth and light // Mar. Biol. 1992. V. 113. P. 357-361.

47. Harland A.D., Navarro J.C., Spencer Davies P., Fixter L.M. Lipids of some Caribbean and Red Sea corals: total lipid, wax esters, triglycerides and fatty acids // Mar. Biol. 1993. V. 117. P. 113-117.

48. Harrington G.W., Beach D.H., Dunham J.E., Holz G.G. The polyunsaturated fatty acids of marine dinoflagellates // J. Protozool. 1970. V. 17. P. 213-219.

49. Harwood J.L. Fatty acid metabolism // Ann. Rev. of Plant Phys. and Plant Mol. Biol. 1988. V. 39. P. 101-138.

50. Hecks B, Wilhelm C., Tnssl H.W. Functional organization of the photosynthetic apparatus of the primitive alga Mantomella squamata II Biochim. Biophys. Acta 1996. V. 121. P. 21-30.

51. Hoegh-Guldberg O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs // Mar. Freshwater Res. 1999. V. 50. P. 839 866.

52. Hoek C., Mann D.G., Jahns H.M. Algae. An introduction to phycology. Cambridge university press, Cambridge, 1995. pp. 263.

53. Hulbert A.J. Life, death and membrane bilayers // J. Exper. Biol. 2003. V. 206. P. 2303-2311.

54. Ikehara N., Isa Y., Yamazato K. The separation of photosynthetically active zooxanthellae from a coral, Euphyllia glabrescens (Chamisso and Eysenhardt) // Sesoko Mar. Sci. Lab. Tech. Rep. 1981. V. 8. P. 1-5.

55. Ikeuchi M., Inoue Y. A new 4.8-K^a polypeptide intrinsic to the PS II reaction center, as revealed by modified SDS-PAGE with improved resolution of low-molecular-weight proteins // Plant. Cell. Physiol. 1988. V. 29. P. 1233 1239.

56. Imbs A.B., Vologotskaya A.V., Nevshupova N.V., Khotimchenko S.V., Thlyanov E.A. Response of prostaglandin content in the red alga Gracilaria verrucosa to season and solar irradiance // Phytochem. 2001. V. 58. P. 1076-1072.

57. Inouye S., Tsuji F.I. Evidence for redox forms of the Aequorea green fluorescent protein // FEBS Lett. 1994. V. 351. P. 211 214.

58. Ishikura M., Adachi K., Maruyama T. Zooxanthellae release glucose in the tissue of a giant clam, Tridacna crocea II Mar. Biol. 1999. V. 133. P. 665-673.

59. Ito M.K., Simpson K.L. The biosynthesis of o>3 fatty acids from 18:2to3 in Artemia spp // Comp. Biochem. Physiol. 1996. V. 115B. P. 69-76.

60. Jeffcoat N., James T. The regulation of desaturation and elongation of fatty acids in mammals // In: Fatty Acid Metabolism and Its Regulation (ed: Noma S. Elsivier) 1984. P. 10-25.

61. Johnson F.H., Shinomura O., Saiga Y., Gershman L.C., Reynolds G.T., Waters J.R. Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. V. 60. P. 85-104.

62. Johannes R.E., Weibe W.J. A method for determination of coral tissue biomass and composition // Limnol. Oceanogr. 1970. V. 21. P. 540-547.

63. Jones R.J., Hoegh-Guldberg O., Larkum A.W.D., Schreiber U. Temperature-induced bleaching of corals begins with impairment of the CO2 fixation mechanism in zooxanthellae // Plant. Cell Environ. 1998. V. 21. P. 1219-1230.

64. Kaether C., Gerdes H. Visualisation of protein transport along the secretary pathway using green fluorescent protein // FEBS Lett. 1995. V. 369. P. 267-271.

65. Kawaguti S. On the physiology of reef corals. VI. Study on the pigments // Palao Trop. Biol. Stat. Stud. 1944. V. 2 P. 617-673.

66. Kawaguti S. Electron microscopy on the fluorescent green of reef corals with a note on mucous cells // Biol. J. Okayama Univ. 1966. V. 12. P. 69-80.

67. Kawaguti S. Effect of the green fluorescent pigment on the productivity of the reef corals // Micronesica S 1969. V. 5. P. 313.

68. Kayama M., Araki S., Sato S. Lipids of marine plants // In Ackman R.G. (ed) Marine biogenic lipids, fats, and oils. 1989. V. 2. P. 3-48.

69. Kellogg R.B., Patton S. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: a model coral polyp // Mar. Biol. 1983. V. 75. P. 134-149.

70. Kis M., Zsiros O., Farkas T., Wada H., Nagy F., Gombos Z. Light-induced expression of fatty acid desaturase genes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1998. V. 95. P. 42094214.

71. Koon Tan C., Johns M.R. Fatty acid production by heterotrophic Chlorella saccharophyla // Hydrobiol. 1991. V. 215. P. 13-19.

72. Kostal V., Simek P. Changes in fatty acid composition of phospholipids and triacylglycerols after cold-acclimation of an aestivating insect prepupa // J. Comp. Physiol. B 1998. V. 168. P. 453-460.

73. Knowlton N. The future of coral reefs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 5419-5425.

74. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. V. 227. P. 680-685.

75. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99. P. 4256-4261.

76. Latyshev N.A., Naumenko N.V., Svetashev V.I., Latypov Y.Y. Fatty acids of reef-building corals // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1991. V. 76. P. 295-301.

77. Lee R.F. Lipids of zooplankton from Bute Inlet, British Columbia // J. Fish. Res. Bd. Can. 1974. V.31. P.1577-1582.

78. Lee R.F., Nevenzel J.C., Paenho G.A. Importance of wax esters and other lipids in the marine food chain: phytoplankton and copepods // Mar. Biol. 1971. V. 9. P. 99-108.

79. Lesser M.P. Depth-dependent photoacclimatization to solar ultraviolet radiation in the Caribbean coral Montastrea faveolata II Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. V. 192. P. 137-151.

80. Logan A., Halcrow K., Tomascik T. UV Excitation-fluorescence in polyp tissue of certain scleractinian corals from Barbados and Bermuda // Bui. Mar. Sci. 1990. V. 46. P. 807-813.

81. Lounis B.J., Deich F.I., Rosell S.G., Boxer W., Moemer E. Photophysics of DsRed a red fluorescent protein from the ensemble to the single-molecule level // J. Phys. Chem. B 2001. V. 105. P. 5048-5054.

82. Loya Y., Sakai K., Yamazato, K., Nakano Y., Sambali H., Van Woesik R. Coral bleaching: the winners and the losers // Ecol. Lett. 2001. V. 4. P. 122-131.

83. Lukyanov K.A., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Matz M.V. Natural animal coloration can be determined by a nonfluorescent GFP homolog // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 25879-25882.

84. Lovern J.A. The lipids of marine organisms // Oceanogr. Mar. Biol. Anu. Rev. 1964. V. 2. P. 169-191.

85. Marsh Y.A. Primary productivity of reef-building calcareous and red algae // Ecology 1970. V. 55. P. 225-263.

86. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species // Nature biotech. 1999. V. 17. P. 969-973.

87. Mazel C.H. Spectral measurements of fluorescence emission in Caribbean cnidarians // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1995. V. 120. P. 185-191.

88. Meyers P.A. Fatty acids and hydrocarbons of Caribbean corals // In: Proc 3d Int. Coral Reef Symp. Florida. USA 1977. P. 529-536.

89. Meyers P. A., Porter J.W. Chad R.L. Depth analysis of fatty acids in two Caribbean reef corals // Mar. Biol. 1978. V. 49. P. 192-202.

90. Meyers P.A. Polyunsaturated fatty acids in coral: indicators of nutritional sources // Mar. Biol. Lett. 1979. V. 1. P. 69-75.

91. Meziane T., Tsuchiya M. Fatty acids as tracers of organic matter in the sediment and food web of a mangrove/intertidal flat ecosystem, Okinawa, Japan // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. V. 200. P. 49-57.

92. Mock T., Kroon B.M.A. Photosynthetic energy conversion under extreme conditions II: the significance of lipids under light limited growth in Arctic sea ice diatoms // Phytochem. 2002. V. 61. P. 53-60.

93. Morin J.G., Hastings J.W. Energy transfer in a bio luminescent system // J. Cell. Physiol. 1977. V. 77. P. 313-318.

94. Morise J.G., Shinomura O., Johnson F.H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bio luminescent system ofAequorea II Biochem. 1974. V. 13. P. 2656-2662.

95. Muller-Parker G., D'Elia C.F. Interactions between corals and their symbiotic algae // In: Life and death of coral reefs. Chapman Hall Publ. 1997. P. 3-17.

96. Muller-Parker G., McCloskey L.R., Hoegh-Guldberg O., McAuley P.J. Effect of ammonium enrichment on animal and algal biomass of the coral PociUopora damicornis II Pac. Sci. 1994. V. 48. P. 273-283.

97. Murata N., Wada H. Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria // Biochem. J. 1995. V. 308. P. 1-8.

98. Muscatine L. Glycerol excretion by symbiotic algae from corals and Tridacna and its control by the host // Science 1967. V. 156. P. 516-519.

99. Muscatine L., Gates R.D., La Fontaine I. Do symbiotic dinoflagellates secrete lipid droplets?//Limnol. Oceanogr. 1994. V. 39. P. 925-929.

100. Myers M.R., Hardy J.T., Mazel C.H., Dustan P. Optical spectra and pigmentation of Caribbean reef corals and macroalgae // Coral Reefs 1999. V. 18. P. 179-186.

101. Nakamura T., Van Woesik R. Water-flow rates and passive diffusion partially explain differential survival of corals during the 1998 bleaching event // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2001. V. 212. P. 301-304.

102. Nicholos P.D., Jones G.J., Leeuw J.W., Johns R.B. The fatty acid and sterol composition of two marine dinoflagellates // Phytochem. 1984. V. 23. P. 1043-1047.

103. Ormo M., Cubbit A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsin R.Y., Reminington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science 1996. V. 273. P. 1392-1395.

104. Patton J.S., Abraham S., Benson A.A. Lipogenesis in the intact coral Pocillopora capitata and its isolated zooxanthellae: evidence for a light-driven carbon cycle between symbiont and host // Mar. Biol. 1977. V. 44. P. 235-244.

105. Patton J.S., Burns J.E. Lipid synthesis and extrusion by freshly isolated zooxanthellae (symbiotic algae) // Mar. Biol. 1983. V. 75. P. 131-136.

106. Pohl P., Zurheide F. Fatty acids and lipids of marine algae and the control of their biosynthesis by environmental factors. // In: Hoppe HA, Levring T, Tanaka Y (eds) Marine algae in pharmaceutical science. Gruyter, Berlin, 1979. P. 473-523.

107. Prasher D., Eckenrode V., Ward W., Prendergast F., Cormier M. Primary structure of Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene 1992. V. 111. P. 229-233.

108. Quinn P.J., Williams W.P. Environmentally induced changes in chloroplast and their effects on photosynthetic function // In: Photosynthetic mechanisms and environment. Elsevier. Amsterdam 1985. P. 4-56.

109. Radwan S.S., Shaaban A.S., Gebreel H.M. Arachidonic acid in the lipids of marine algae maintained under blue, white and red light // Z. Naturforsch. 1988. V. 43. P. 15-18.

110. Ralph P.J., Gademann R., Larkum A.W.D., Schreiber U. In situ underwater measurements of photosynthctic activity of coral zooxanthellae and other reef-dwelling dinoflagellate endosymbionts//Mar. Ecol. Prog. Ser. 1999. V. 180. P. 139-147.

111. Ratledge C. Single cell oils have they a biotechnological future? // Trends in Biotechnology 1993. V. 11. P. 278-284.

112. Reuss N., Poulsen L.K. Evaluation of fatty acids as biomarkers for natural plankton community. A field study of a spring bloom and a post bloom period of West Greenland // Mar. Biol. 2002. V. 141. P. 423-434.

113. Ritchie R.J., Eltringham K., Hinde R. Glycerol uptake by zooxanthellae of the temperate hard coral, Plesiastrea versipora (Lamarck) // Proc. R. Soc. Lond. B 1993. V. 253. P. 189-195.

114. Sargent J.R. The structure, metabolism and unction of lipids in marine organisms // In: Biochemical and biophysical perspectives in marine biology. Malins D.C., Sargent J.R. (ed.) Academic Press, New York, 1976. V. 3. P. 149-212.

115. Sargent J.R., Parkes R.J., Mueller-Harvey I., Henderson R.J. Lipid biomarkers in Lipid ecology // In: Sleigh M.A. (ed) Microbes in the sea. Harwood, Chichester. 1987. P. 119-138.

116. Sargent J., Bell G., McEvoy L., Tocher D., Estevez A. Recent developments in the essential fatty acid nutrition of fish // Aquaculture 1999. V. 177. P. 191-199.

117. Salih A. Mechanisms of light and temperature-induced bleaching of corals and the sunscreening role of their fluorescent pigments // Ph.D. dissertation, University of Sydney, Sydney, Australia, 2000, 189 p.

118. Salih A., Larkum A., Cox G., Kühl M., Hoegh-Guldberg O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective // Nature 2000. V. 408. P. 850-853.

119. Sasaki Y., Kozaki A., Hatano M. Link between light and fatty acid synthesis: Thioredoxin-liked reductive activation of plastidic acetyl-CoA carboxylase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 11096-11101.

120. Schlichter D., Fricke H.W., Weber W. Light-harvesting by wavelength transformation in a symbiotic coral of the Red Sea twilight zone // Mar. Biol. 1986. V. 91. P. 403-407.

121. Schlichter D., Weber W., Fricke H.W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia) // Mar. Biol. 1985. V. 89. P. 143-147.

122. Schlichter D., Meier U., Fricke H.W. Improvement of photosynthesis in zooxanthellate corals by autoluorescent chromatophores // Oceanología 1994. V. 99. P. 124-131.

123. Schflttngkeit T.A., Zachanae U., Von Feilitzsch T., Wiehler J., Von Hummel J., Steipe B., Michel-Beyerle M.E. Picosecond ume-resolved FRET in the fluorescent protein from Discosoma Red (wt DsRed) // Chemphys. 2001. V. 5. P. 325-328.

124. Schmitz K., Kremer B.P. Carbon fixation and analysis of assimilates in a coral-dinoflagellate symbiosis // Mar. Biol. 1977. V. 42. P. 305-313.

125. Shick M.J., Lesser M.P., Jokiel P.L. Effect of ultraviolet radiation on corals and other coral reef organisms// Global Change Biol. 1996. V. 2. P. 527-545."

126. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. V. 59. P. 223-240.

127. Smith G.J. Ontogenetic influences on carbon flux in Aulactinia stelloides polyps (Anthozoa: Actiniaria) and their endosymbiotic algae // Mar. Biol. 1986. V. 92. P. 361-369.

128. Somerville C., Browse J. Dissecting desaturation: plants prove advantageous // Trends in Cell Biol. 1996. V. 6. P. 148-153.

129. Stumpf P.K. Fatty acid biosynthesis in higher plants // In: Fatty Acid Metabolism and Its Regulation. Numa S. (ed.) New Comprehensive Biochemistry Elsevier, Amsterdam -New York Oxford V.7. P. 155-179.

130. Stimson J.S. Location, quantity and rate of change in quantity of lipids in tissue of Hawaiian hermatypic corals // Bui. Mar. Sci. 1987. V. 41. P. 889-904.

131. Straume M., Johnson M.L. Analysis of residuals catena for determining goodness of fit // Methods Enzymol. 1992. V. 210. P. 87-105.

132. Sukenik A., Carmeli Y. Regulation of eicosapentaenoic acid content by light in the marine Eustigmatophyte Nannochloropsis sp // In Intern. Biotech. Conference. Tokyo, Japan, Miyachi S., Karube I., Ishida Y. (ed.) 1989. P. 127-130.

133. Sukenik A., Wahnon R. Biochemical quality of marine unicellular algae with special emphasis on lipid composition. I. Isochrysis galbana II Aquaculture 1991. V. 97. P. 61-72.

134. Sutton D.C., Hoegh-Guldberg O. Host-zooxanthellae interactions in four temperate marine invertebrate symbioses: assessment of effect of host extracts on symbionts // Biol. Bull. 1990. V. 178. P. 175-186.

135. Takabayashi M., Hoegh-Guldberg O. Ecological and physiological differences between two colour morphs of the coral Pocillopora damicornis II Mar. Biol. 1995. V. 123. P. 705-714.

136. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time // Science 2000. V. 290. P. 1585-1588.

137. Titlyanov E.A. Light adaptation and production characteristics of branches differing by age and illumination of the hermatypic coral Pocillopora verrucosa II Symbiosis 1991. V.10. P. 249-260.

138. Titlyanov E.A., Titlyanova T.V., Leletkin V.A., Tsukahara J., Van Woesik R., Yamazato K. Degradation of zooxanthellae and regulation of their density in hermatypic corals // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1996. V. 139. P. 167-178.

139. Tsien R.Y. The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 509-544.

140. Van Kooten O., Snel J.F.H. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology//Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 147-150.

141. Van Woesik R. Coral bleaching: transcending spatial and temporal scales // Trends Ecol. Evol. 2001. V. 16. P. 119-121.

142. Veron J. Corals of Australia and the Indo-Pacific // Angus Robertson Publ. Sydney, Australia, 1986. pp. 286.

143. Viso A.C., Marty J.C. Fatty acids from 28 marine microalgae // Phytochem. 1993. V. 34. P. 1521-1533.

144. Volkman J.K. Australian research on marine natural products: chemistry, bioactivity and ecology II Mar. Freshwater Res. 1999. V. 50. P. 761-779.

145. Volkman J.K., Jeffrey S.W., Nichols P.D., Rogers G.I., Garland C.D. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1989. V. 128. P. 219-240.

146. Wada H. Contribution of membrane lipids to the ability of the photo synthetic machinery to tolerate temperature stress // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. P. 42734277.

147. Wada H., Gombos Z., Murata N. Contribution of membrane lipids to the ability of the photosynthetic machinery to tolerate high irradiance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. P. 4278-4283.

148. Walsh K., Jones G.J., Dunstan R.H. Effect of irradiance on fatty acid, carotenoid, total protein composition and growth of Microcystic aeruginosa II Phytochemistry 1997. V. 44. P. 817-824.

149. Ward W., Prentice H., Roth A., Cody C., Reeves S. Spectral perturbations of the Aequoria green fluorescent protein // Photochem. Photobiol. 1982. V. 35. P. 803-808.

150. Warner M.E., Fitt W.K., Schmidt G.W. Damage to photosystem II in symbiotic dinoflagellates a determinant of coral bleaching // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V. 96. P. 8007-8012.

151. Weinert J., Blomquist G.J., BorgesonC.E. De-novo biosynthesis of linoleic-acid in 2 non-insect invertebrates the land slug and the garden snail // Experientia 1993. V. 49. P. 919-921.

152. Yamashiro H., Oku H., Higa H., Chinen I., Sakai K. Composition of lipids, fatty acids and sterols in Okinawan corals // Comp. Biochem. Physiol. B 1999. V. 122. P. 397407.

153. Yang F., Moss L.G., Phyllips N.G. The molecular structure of green fluorescent protein//Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 1246-1251.

154. Yarbrough D., Wachler R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed a red fluorescent protein from coral, at 20 A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 462-467.

155. Yazawa K. Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria // Lipids 1996. V.31.P. 297-300.

156. Yonge C.M. The significance of the relationships between corals and zooxanthellae // Nature 1931. V. 128. P. 309-310.

157. Zhukova N.V., Aizdaicher N.A. Fatty acid composition of 15 species of marine macroalgae II Phytochem. 1995. V. 39. P. 351-356.