Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням

Шумилина, Дарья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

Шумилина Дарья Владимировна

Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-^йс/^аис-изомеразы МКЗ, индуцирующей устойчивость растений к болезням.

06 01 11 - защита растений

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидат*» биологических наук

Большие Вяземы - 2007

003159694

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН в 2002-2007 гг

Научный руководитель- кандидат биологических наук

Виталий Георгиевич Джавахия

Официальные оппоненты ведущий научный сотрудник

Института Биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва

доктор биологических наук Наталия Ивановна Васюкова

ведущий научный сотрудник Центра "Биоинженерия" РАН, Москва доктор биологических наук Александр Николаевич Игнатов

Ведущая организация Российский государственный

аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится « » UOJi&pSL 2007 г в часов на заседании диссертационного совета К-006-064-01 при Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу 143050, Московская обл , Одинцовский район, р.п Б Вяземы, ул. Институт, ВНИИФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института и на сайте ВНИИФ www phytonet ru

Автореферат разослан « XT » сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н. Яковлева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы.

Болезни растений, вызываемые патогенными грибами, бактериями и вирусами продолжают наносить серьезный ущерб сельскому хозяйству, несмотря на его интенсивное развитие Современные направления в защите растений от болезней включают в себя методы биологического контроля и индуцированной устойчивости растений к патогенам

Бактерия Pseudomonas fluorescens способна индуцировать устойчивость растений к патогенным грибам и нематодам (Siddiqui and Shaukat, 2002) В процессе исследования защитных свойств Р fluorescens во ВНИИ Фитопатологии было показано, что одним из факторов, позволяющим данной бактерии защищать растения от патогенов, является низкомолекулярный (16,9 кДа) термостабильный белок, названный Микробным Фактором 3 (MF3) Выделенный белок индуцировал устойчивость листьев табака к вирусу табачной мозаики Ген, кодирующий MF3 белок, был клонирован и секвенирован (Dzhavakhia et al, 2005) Для того, чтобы наиболее полно раскрыть механизмы действия данного белка было решено провести его всестороннее изучение как в качестве возможного биопестицида, так и при применении гена mß для создания трансгенных растений цветной капусты и рапса

1.2. Дели и задачи исследований.

Целью наших исследований было изучение защитного действия MF3 Другой целью данной работы был анализ первичной структуры MF3-белка и идентификация аминокислотной последовательности, ответственной за индуцирующую активность Кроме того, была поставлена цель выяснить способен ли белок обеспечивать устойчивость трансгенных растений, в которых экспрессируется ген mß Задачи исследований

1. Создание штамма Е coli - суперпродуцента MF3-белка,

2 Оценка способности MF3 защищать растения от вирусных и грибных патогенов,

3 Изучение способности хитозана образовывать комплекс с MF3 и способствовать его проникновению внутрь растительных тканей;

4. Изучение структуры MF3 и определение его фрагмента, достаточного для индуцирования устойчивости,

5. Оценка способности синтетического пептида MF3-29aK индуцировать устойчивость растений в системе табак - ВТМ

6 Анализ устойчивости к фитопатогенам трансгенных растений, в которых экспрессируется ген mf3

1.3. Научная новизна исследований.

1 Впервые была обнаружена гомология между аминокислотной последовательностью MF3 белка и пептидил-пролил-^ис/ю/кгнс-изомеразами FKBP-типа Впервые показано, что белок, относящийся к этому семейству, способен индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам.

2 Впервые показана способность MF3 образовывать комплекс с хитозаном, в результате чего усиливается защитный эффект данного белка в таких системах растение-хозяин - патоген, как белокочанная капуста - вирус мозаики турнепса, пшеница - Stagonospora nodorum

3 Впервые показано, что MF3 имеет активный центр - пептид IIPGLEKALE GKAVGDDLEVAVEPEDAYG (MF3 - 29 ак), определяющий защитные функции данного белка Показано, что синтезированный химическим путем MF3 - 29ак обладает способностью вызывать устойчивость табака к ВТМ

4 Впервые показано, что растения рапса, экспрессирующие ген mfS, обладают повышенной, по сравнению с нетрансгенными растениями, устойчивостью к вирусу мозаики турнепса и грибу Plasmodiophora brassicae.

1.4. Практическая значимость работы.

1 Показано, что MF3 белок способен защищать растения от вирусных и грибных патогенов Данные результаты могут служить предпосылкой для создания средств защиты растений на основе MF3.

2 Создан штамм Е coli — суперпродуцент MF3 с продуктивностью 200 мг бежа/л Этот штамм может быть использован в качестве источника MF3 в случае применения данного белка как средства для защиты растений Разработана простая схема выделения и очистки MF3

3 При создании препаративных форм биопестицидов на основе белка может быть использован хитозан, образующий комплекс с MF3 и усиливающий защитный эффект последнего. Кроме того, установлено, что применение хитозана совместно с белком позволяет расширить круг защищаемых растений

4. Поскольку установлено, что фрагмент MF3 (пептид MF3-29 ак) способен защищать растения табака от ВТМ, для разработки биопестицидов и для создания трансгенных растений можно использовать как целый белок, так и его индуцирующую часть

5 Повышенная устойчивость трансгенных растений рапса к вирусу мозаики турнепса и к грибному патогену PI brassicae делает растения, несущие ген т/3 перспективными для использования в дальнейшей селекции сортов с широким спектром устойчивости к вирусным и грибным патогенам

6. Структура МРЗ-белка и его защитные функции были защищены международным патентом Dzhavakhia V, Filipov A., Skryabin К, Voinova Т, Kouznetsova М, Shulga О , Shumilma D, Kromina К, Pndaimikov M, Battchikova N., Korpela T Protems inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests Patent PCT W02005/061533 Al, дата публикации 2005-07-07

1.5. Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и конгрессах

1 Шестая международная конференция Европейского хитинового общества, проходившая в Познани (Польша) с 31 августа по 3 сентября 2004 г,

2 Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование, Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда», проходившая в Пущино 10-13 мая в 2005 г,

3 Десятый МНТЦ/Корея семинар «Industrial applications of Russia's new Ью-technologies», проходивший в Мокпо (Корея) 14-15 марта 2006 г,

4 Восьмой конгресс "New achievements m biological control of plant diseases", проходивший в Быдгощи (Польша) 25-26 апреля 2006 г,

5 Восьмая международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», проходившая в Казани 12-17 июня 2006 г,

6 Третья международная конференция «Наука и Бизнес», проходившая в Пущино 19-21 июня 2006 г,

7 Всероссийская научно-практическая конференция «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур — важное направление в защите растений», проходившая в Голицыно 15-16 ноября 2006 г,

8 Объединенное международное совещание «PR-Proteins and Induced Resistance against Pathogens and Insects», проходивший в Дорне (Голландия) 10-14 мая 2007 г

По материалам диссертации опубликовано 12 работ и получен один международный патент

1.6, Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 20 рисунков Список литературы включает 122 работы

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материалы и методы. Бактериальные штаммы и плазмиды.

В работе использовали штамм 197 Pseudomonas fluorescens В качестве источника гена mß для трансформации клеток Е coli штамма BL21(DE3) была использована плазмида pMF, сконструированная сотрудником лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии А А. Шульгой

Фитопатогенные микроорганизмы.

Грибы Aiternana longipes (изолят ml 8/10/99) и Plasmodiophora brassicae (раса W), а также вирус мозаики турнепса (ВМТ) (изолят II) были предоставлены доктором Р Кремером из Института декоративных растений (Германия) Гриб Stagonospora nodorum (изолят ВУЗ) был получен из коллекции отдела грибных болезней зерновых культур ВНИИ

Фитопатологии. Вирус табачной мозаики (ВТМ) поддерживали на растении табака Nicotiana tabacum (сорт Samsun), Y и X вирусы картофеля поддерживали на растениях картофеля (сорт Удача)

Пептид MF3-29aK был синтезирован сотрудниками группы инструментальных методов синтеза под руководством М Б Бару (Отдел биоинженерии филиала Института биоорганической химии РАН, Пущино).

Хитозаны были любезно предоставлены В П Варламовым, Центр «Биоинженерия», РАН, Москва

Методы трансформации клеток Е, coli и выделения MF3. Для трансформации клеток Е. coli плазмидным вектором pMF использовали методику Kunen (Kurien and Scofield, 1995) Трансформированные клетки Е coli выращивали в жидкой питательной среде ТВ с добавлением ампициллина Клетки осаждали центрифугированием, промывали и суспендировали в лизирующем буфере, инкубировали во льду в течение 30 мин Затем колбу с суспензией помещали на 20 мин в кипящую водяную баню (100°С) Белок MF3, находящийся в надосадочной жидкости, очищали на колонке, заполненной Chelating-Sepharose (Ni2+), элюцию осуществляли линейным градиентом имидазола ("Pharmacia", Швеция)

Иммуно-ферментный анализ (ИФА) проводили по стандартной методике. Для определения вирусов использовали диагностические наборы из ВНИИ картофельного хозяйства им А. Г Jlopxa Антитела к MF3 были получены Свешниковым ПГ и Городецкой СБ в отделе гибридомной технологии Всероссийского центра молекулярной диагностики и лечения

Оценка фнтотоксичности проводилась в вегетационных опытах путем наблюдения за развитием растений после инфильтрации белка в листья табака и проращивания семян пшеницы и ячменя, предварительно обработанных растворами MF3

Методика оценки способности MF3 оказывать прямое действие на ВТМ включала в себя инкубацию ВТМ в растворе MF3, очистку вируса от белка дифференциальным ультрацентрифугированием и последующую инокуляцию этим вирусом растений табака

Метод оценки способности MF3 и пептидов защищать растения от вирусов включал натирание половинок листьев табака сорта Xanthy NN белком и водой (контроль) с карборундом, инокуляцию всего листа вирусом

табачной мозаики, спустя сутки или другой промежуток времени, и учет образовавшихся некрозов спустя 3-4 дня после инокуляции Для оценки способности индуцировать системную устойчивость белком натирали лист первого яруса растения, а инокулировали ВТМ листья 1, 2 и 3 ярусов спустя сутки и двое после обработки Для оценки активности MF3 против Y-BK и ВМТ, растения табака сорта Samsun nn и капусты сорта Krautman опрыскивали белком, нижний лист инокулировали вирусом Y-BK или ВМТ, а накопление вируса в растительном соке оценивали с помощью ИФА

Фунгитоксичность MF3 оценивали по его влиянию на прорастание спор грибов Sí nodorum и A longipes в растворе бежа и по развитию колоний рядом с дисками из фильтровальной бумаги, пропитанными раствором MF3

Изучение способности MF3 индуцировать устойчивость листьев пшеницы к Sí. nodorum проводили по модифицированному методу Пыжиковой и соавторов (Пыжикова и др, 1989)

Метод оценки влияния MF3 на устойчивость табака к A. longipes. Изолированные листья табака опрыскивали с нижней стороны раствором MF3 На следующий день верхнюю сторону всех листьев опрыскивали суспензией спор патогена (De Bolle et al, 1996) Через 7 дней подсчитывали количество образовавшихся на листьях некрозов

Оценку биологической эффективности MF3 против корневых гнилей пшеницы и ячменя проводили по методике, описанной в ГОСТ Р 50459-92

В работе использовали стандартные методы молекулярного анализа трансгенных растений, которые проводили согласно методическим руководствам Sambrook et al, 2001

Методы оценки устойчивости трансгенных растений к патогенам. Нижний лист каждого трансгенного растения рапса инокулировали ВМТ Количество вируса в суммарной пробе с листьев определяли с использованием ИФА.

Проростки рапса и цветной капусты инокулировали Plasmodiophora brassicae, внося суспензию спор в почвенную смесь Степень развития болезни оценивали на 50-й день после инокуляции по 9-ти бальной шкале

Статистичекая обработка данных проводилась с использованием дисперсионного анализа и t-критерия Стьюдента, при 5 или 10% уровне значимости.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение количества MF3 в клетках Р. fluorescens (197).

Для определения количества MF3, синтезирующегося в клетках Р fluorescens, бактериальную культуру штамма 197 лизировали в буфере с лизоцимом и, поскольку ранее было показано, что MF3 термостабилен, прогревали суспензию 20 мин при 100°С Методом ИФА определили, что 1 л культуральной жидкости Р fluorescens 197 содержал около 50 мкг MF3

3.2. Создание штамма Е. coli - суперпродуцента MF3.

Для трансформации клеток Е coli использовали плазмидный вектор, содержавший rnß-ген и ген устойчивости к ампициллину (маркерный ген) Трансформированный штамм Е coli был способен синтезировать MF3 в количестве до 200 мг/л, что значительно превышало содержание данного белка в культуре Р fluorescens

Была разработана простая схема выделения и очистки белка из штамма-суперпродуцента, в основу которой легла его термостабильность (стр 5)

3.3. Исследование фитотоксичности MF3.

Изучение влияния MF3 на растения табака.

После инфильтрации в листья табака сорта Xanthy NN водных растворов с концентрациями MF3 от 1 до 1000 мкг/мл обработанные белком листья внешне не отличались от контрольных на протяжении двух недель эксперимента, не было отмечено некротических пятен, деформации либо изменения цвета листовой пластины

Изучение влияния MF3 на растения пшеницы и ячменя.

Инкубация здоровых семян яровой пшеницы и ячменя в водных растворах, содержавших 0,1, 1, 10 или 100 мкг/мл белка не приводила к изменению их всхожести, а также длины корней и листьев проростков по сравнению с соответствующими показателями в контрольном варианте

3.4. Изучение влияния ¡N№3 на вирусные патогены растений. 3.4.1. Вирус табачной мозаики.

Определение способности МГЗ оказывать прямое действие на ВТМ Для того, что бы определить, оказывает ли МБЗ прямое действие на вирусы, была исследована способность ВТМ инфицировать растения табака после 24-часовой инкубации в растворе белка.

Количество образовавшихся некрозов на листьях табака сорта ХапШу МК, инокулированных интактным препаратом вируса или ВТМ, прошедшим инкубацию с белком, существенно не различалось, в то время как после применения вируса и белка совместно некрозы на листьях не образовывались В растениях табака сорта ватвгш пп, инокулированных вирусом, прошедшим инкубацию в воде или в растворе МБЗ, содержание ВТМ в соке как инокулированного листа, так и верхних листьев было высоким и между собой статистически не различалось В то же время, инокуляция растений табака смесью ВТМ и МБЗ не приводила к развитию вирусной инфекции в растении

Влияние МРЗ на устойчивость листьев табака к ВТМ На половинках листьев, обработанных растворами белка с концентрацией от 0 до 1 мкг/мл, после инфицирования наблюдалось снижение количества образовавшихся некрозов При применении более высоких концентраций МБЗ на обработанных половинках некрозы не образовывались, в то же время было отмечено достоверное снижение количества некрозов на контрольных половинках листьев, то есть наблюдался трансламинарный эффект (рис 1)

8 а

е §

¡1 3 *

I §

Т___1

Ч ^ 5

--,-,-,- Т—-1-А---А-г——, г—¡-—3

а. в о

0,1 1 10 20 30

Концентрация МБЗ, мкг/мл

- Половинки листьев, обработанные МРЗ -Соседние (необработанные) половинки листьев

Рисунок 1 Влияние обработки половинок листьев табака раствором МБЗ на образование некрозов после инокуляции ВТМ

Продолжительность защитного действия МБЗ на растения Было показано, что однократно обработанные раствором МБ'З (1мкг/мл) половинки листьев табака сорта ХшйЬу NN сохраняли устойчивость к ВТМ на протяжении всего времени эксперимента (три недели), в то же время на контрольных половинках и контрольных листьях некрозы образовывались в большом количестве (рис 2).

150

100

5 1 50

✓

т ^

6 9 12 15

Дни после обработки МРЗ

А Половинки листьев, обработанные МГЗ (1мкг/мл) ■■ X Соседние (необработанные) половинки листьев ♦ Половинки контрольных, необработанных листьев

Рисунок 2 Продолжительность защитного действия обработки растений табака сорта Хап&у NN раствором МБЗ от ВТМ

Исследование способности МБЗ индудировать системную устойчивость к

ВТМ у растений табака некрозообразующего сорта.

Один лист первого яруса каждого растения табака сорта Хап&у NN обрабатывали раствором МБЗ (100 мкг/мл) После инокуляции ВТМ, на обработанных белком листьях первого яруса некрозы отсутствовали, количество некрозов, образовавшихся на листьях второго и третьего ярусов опытных растений, было существенно меньшим, чем на соответствующих листьях контрольных растений. Уровень защиты растений от ВТМ через сутки и двое после обработки белком существенно не различался

Влияние обработки растений табака сорта Батзгш пп раствором МБЗ на

развитие ВТМ

Растения табака опрыскивали растворами с различным содержанием МЕЗ Нижний лист, изолированный во время опрыскивания, на следующий день инокулировали ВТМ Контрольные растения накапливали высокое количество вирусных частиц в соке уже спустя 2 недели после инокуляции В

то же время на растениях, обработанных даже низкими концентрациями белка (10мкг/мл), развитие болезни значительно задерживалось (рис. 3)

-«-Вода -*-МРЗ (10 мкг/мл) -&-М1'3 (50 мкг/мл) -е- МЬ'З (100 миУми)

Рисунок 3 Влияние обработки растений табака растворами МБЗ на развитие ВТМ

3.4.2. У- вирус картофеля

Обработку растений табака МБЗ и инокуляцию вирусом проводили по методике, описанной ранее для табака и ВТМ Содержание вируса в соке инокулированных листьев контрольных растений спустя 13 дней после заражения было высоким, в то время как в листьях опытных растений, обработанных белком, УВК накапливался в существенно меньших количествах. Динамику развития болезни оценивали еженедельно с помощью ИФА верхних неинокулированных листьев (рис 4)

вода №3 (10 мкг/мл) -А— МИ (50 мкг/мл) —е—МБЗ (100 мкг/мл)

Рисунок 4 Влияние обработки растений табака раствором МБЗ на накопление в соке УВК

К 21-ому дню асе контрольные растения были сильно поражены УВК, а у растений, обработанных МРЗ (10 мкг/мл и 50 мкг/мл), наблюдалась существенная задержка в развитии болезни и полное отсутствие вируса при применении раствора с концентрацией МРЗ 100 мкг/мл. Таким образом, как и в случае с ВТМ, обработка МЕЗ вызывала системную устойчивость табака к УВК.

3.5. Изучение влияния MF3 на грибные патогены растений

3.5.1. Оценка фуш нтоксичности IV1F3 in vitro.

Ингибирования прорастания спор A. longipes в растворах с концентрациями MF3 0,7; 7 и 70 мкг/мл отмечено не было. Во всех опытах, независимо от использованной концентрации белка, прорастание спор, длина и толщина гиф были сходными между собой и не отличались от контроля. В процессе наблюдений за развитием гриба не было отмечено изменений в скорости роста мицелия в местах внесения белка, цвет и форма колонии не изменялись, следовательно, MF3 не ингибировал рост A. longipes и не изменял его культу рал ьно-морфологические свойства,

3.5.2. Исследование влияния MF3 на развитие A. longipes на ритнйЯ! габака.

Чтобы исключить прямой контакт между белком и патогеном, опрыскивание растворами MF3 проводили с нижней стороны листьев, а спустя сутки, верхние стороны листьев инокулировали спорами A, longipes. Учёт на Ю сутки опыта показал, что на листьях, обработанных растворами белка с концентрацией 7 и 70 мкг/мл, образовалось достоверно меньшее количество некрозов по сравнению с контрольными листьями {рис, 5),

Рисунок 5. Влияние предобработки листьев табака раствором МРЗ в различных концентрациях на поражение А. ¡опррез.

3.5.3. Влияние MF3 на развитие фузариозной корневой гнили пшеницы.

Оценку влияния MF3 на развитие фузариозной корневой гнили (возбудители-виды рода Fusarium) осуществляли с помощью рулонного теста. Семена яровой пшеницы сорта Энита, инфицированные в природных условиях, инкубировали три часа в растворах, содержавших 0,1, 1, 10 или 100 мкг/мл MF3. На 10-й день проращивания семян в рулонах распространенность фузариозной корневой гнили в контроле составила 36,7%, а развитие болезни 13,2%. В вариантах с обработкой MF3 существенного снижения распространённости и развитая фузариозной гнили по сравнению с контролем отмечено не было. Вместе с тем было обнаружено, что замачивание инфицированных семян пшеницы в растворах МРЗ-белка способствовало развитию нормальной корневой системы у пораженных проростков. Так, корни проростков, выросших из семян, обработанных раствором MF3 с концентрацией 0,1 мкг/мл и выше, были развиты лучше, чем у контрольных растений (рис. 6).

Рисунок 6. Влияние обработки семян пшеницы сорта Энита водой и раствором МРЗ на длину корней у развившихся проростков.

3-5.4, Исследование влияния МРЗ па развитие гельминтоспориозной корневой гнили (Щро1ап5 зогоктита) ячменя.

Оценку эффективности действия МРЗ против гельминтоспориозной корневой гнили проводили на яровом ячмене сорта Зазерский 85, Было выявлено, что инфекционный фон гельминтоспориозной гнили в контроле составил 63,3 % по распространенности и 22,5 % по развитию болезни. В вариантах с обработкой веществами максимальное снижение распространенности (до 30% по сравнению с контролем) и развития

Опыт. Замачивание семян пшеницы в растворе MF3 с концентрацией 0,1 мкг/мл.

Контроль. Замачивание семян пшеницы в поде.

гельминтоспориоза (до 35 % по сравнению с контролем) было отмечено после инкубации семян в растворе с концентрацией МБЗ 1 мкг/мл Замачивание семян ячменя в растворах с концентрацией МБЗ выше 10 мкг/мл приводило к развитию более длинных корней у проростков по сравнению с контрольными Длина листьев во всех вариантах опыта различалась несущественно Кроме того, в варианте с обработкой семян ячменя раствором МБЗ в концентрации 10 мкг/мл было отмечено увеличение всхожести на 4,5 %

Обработка заражённых семян растворами МРЗ, наряду со снижением распространенности и уровня развития гельминтоспориоза при применении белка в концентрации 1 мкг/мл, стимулировала развитие корневой системы у пораженных проростков ячменя и пшеницы, что может оказать положительное влияние на общий уровень выносливости и устойчивости злаковых растений к корневым гнилям

3.6. Изучение возможности использования низкомолекулярных хитозанов для улучшения проникновения МЕЗ в растительные ткани.

Для разработки биопрепаратов на основе белковых элиситоров необходимо учитывать, что для индуцирования устойчивости они должны связаться с рецепторами растений, которые могут находиться как на внешних, так и на внутренних мембранах клеток (БЫга^Ьх е? а1,2001)

Мы предположили, что низкомолекулярный хитозан, благодаря своим положительно заряженным аминогруппам, мог бы образовывать комплекс с отрицательно заряженным МБЗ за счет электростатических связей и способствовать транспорту белка к клеточным рецепторам Кроме того, применение двух элиситорных веществ разной химической природы, вероятно, могло бы иметь синергетический эффект

С помощью электрофореза в 10% ПААГ было установлено, что комплексообразование происходит, если МБЗ и хитозан присутствуют в соотношении 10.3

Изучение способности раствора МЖЗ в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость пшеницы к St пойогит

Для изучения прямого влияния МБЗ (100 мкг/мл), хитозана 6 кДа (30 мкг/мл) и смеси этих веществ на развитие пос1огит диски фильтровальной бумаги, пропитанные исследуемыми веществами, помещали по периметру растущей колонии гриба Было показано, что МРЗ, хитозан, а так же их смесь

в испытуемых концентрациях при контакте с патогеном не оказывали действия на его рост и развитие (рис. 7). Аналогичные опыты были поставлены с использованием МИЗ и хитозанов с молекулярными весами 10 и 17 кДа, а так же смесей белка и этих хитозанов. Ингибирования роста мицелия не было отмечено ни в одном из вариантов опытов.

Рисунок 7, Влияние растворов MF3, хитозана и смеси MF3 с хитозаном на развитие мицелия St. nodorum.

После того, как было показано, что изучаемый белок, как сам по себе, так и в смеси с хитозанами не оказывает влияния на St. nodorum in vitro, были проведены опыты с использованием растений пшеницы. Оказалось, что на участках листьев пшеницы 1Мироновская 808, обработанных смесями белка с хитозанами, развитие болезни было существенно меньшим по сравнению с контрольными участками листьев (рис. 8), Обработка же листьев растворами индивидуальных веществ, как белком, так и хитозанами, не приводила к подавлению развития болезни. Наилучший эффект был получен при применении белка в смеси с хитозаном 17 кДа, что возможно связано с соответствием их молекулярных масс.

Воаа MF3 (1мГ/мл) Хит. й кДа {0,3 vr/чл) »гг. 6 кДа * MF3 Хкг. 10 кДа(0^ яг/мл) Хит. 10 кДа + MF3 Хит. 17кДи (tU Mríuif) Хнт, 17 h-Дй +MF3

V...1.. . ■■

■ЕШ

20 40 60 Ж) 100 Уровень развития болечнн. %

130

Контроль

№3 балок

Ць./

' ^^¿¿^ЦГ MF3 *

Хитозан Й кДв Хитозвн в кДа

Рисунок 8. Способность раствора MF3 в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость пшеницы к St. nodorum.

Влияние обработок растений белокочанной капусты раствором МРЗ в смеси с низкомолекулярным хитозаном на заражение ВМТ.

Было показано, что опрыскивание молодых растений белокочанной капусты сорта КгаШхпап раствором бежа в смеси с хитозаном не вызывало полного подавления болезни, но накопление в них ВМТ происходило с задержкой, по меньшей мере, на неделю Развитие вируса на растениях, обработанных чистым белком или хитозаном, происходило столь же быстро, как и в контрольных растениях (рис.9)

о, и

аз

§ а

U. в

2 о

К кп

8* В

2,2

1,4 1 0,6 0,2 -0,2

/О4

5 10 15 20

Дни после инокуляции растений капусты ВМТ

-Вода

-MF3 +хитозан 17кДа

-44-MF3 (10мкг/мл)

-А— Хитозан 17кДа (Змкг/мл)

Рисунок 9 Влияние обработки растений белокочанной капусты раствором MF3 в смеси с низкомолекулярным хитозаном на заражение ВМТ

3.7. Анализ нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной последовательности белка MF3.

Чтобы определить к какому классу белков принадлежит MF3, проводили поиск гомологичных последовательностей среди имеющихся в GenBank данных, находящихся на сервере NCBI (http //www.ncbi nlm nih gov, Altschul et al, 1987) Последовательность аминокислотных остатков MF3 анализировали с помощью программы ScanProsite

(http //www expasv ch/prosite, Bairoch et al, 1997)

Последовательность аминокислот MF3 оказалась высоко гомологичной последовательностям ферментов пептадил-пролил-г/ие/тяране-изомераз (ППИ-аз) FKBP-типа Самое большое соответствие MF3 наблюдалось с аминокислотными последовательностями ППИ-аз из Pseudomonas fluorescens штаммов Pf-5 и PfO-1 (93%) Кроме того, высокая степень гомологии белка

была отмечена и для ИЛИ-аз из других организмов, например из Azotobacter vinehndii (81%) и Chromokalobacter salexigens DSM 3043 (57%).

Поиск и изучение элиситорного центра MF3 белка.

Для многих белков, индуцирующих устойчивость растений, было показано, что индуцирующей активностью могут обладать не только целый белок, но и его фрагменты. Так, растения арабидопсиса специфично распознают N конец бактериального фактора элонгации Tu (EF-Tu) в результате чего начинается запуск системы защитных ответов. Для активации же этого процесса достаточно пептида elflS, состоящего из 18 аминокислотных остатков (Kunze et al., 2004),

Поиск консервативных участков MF3 белка.

В процессе изучения МЮ-белка нами было выдвинуто предположение, что у MF3 могут существовать последовательности, ответственные за индукцию устойчивости в растениях. В результате проведённого поиска белков, гомологичных MF3, с помощью программы ScanProsite нами было найдено более 45 сходных по составу белков. Следующим этапом работы стал поиск консервативных последовательностей внутри MF3 белка, который привёл к обнаружению в его составе 2-х консервативных областей (рис. 10),

TrvtJB

тгура !

Tryps

Тг'/СЗ

тщг I ISffi» ~ [ [

_________J.....I I . !.

lil ------- ---------+ _ Ifil

Рисунок 10. Схематическое изображение действия трипсина на MF3 белок. Серым цветом выделены консервативные области, чёрным - наиболее консервативный фрагмент (MF3-29 ак)

Чтобы проверить, не содержат ли данные области последовательность, с которой ассоциирована активность, индуцирующая устойчивость к болезням, был проведён частичный протеолиз белка трипсином, который расщеплял белок нз 9 частей, в том числе и внутри консервативных областей (рис. 10).

Потеря или снижение индуцирующей активности MF3 после протеолиза могли свидетельствовать о том, что центр, ответственный за его защитную активность расположен внутри консервативных областей.

Проверка биологической активности пептидов - фрагментов MF3.

Активность пептидов, полученных в результате расщепления MF3, проверили с использованием тест системы табак - ВТМ. Было показано, что предобработка листьев табака раствором пептидов, полученных после действия трипсина, не препятствовала развитию на них некрозов после заражения ВТМ То есть, расщепление MF3 внутри консервативных областей лишало его способности индуцировать устойчивость в листьях табака, что свидетельствовало о повреждении той части белка, которая ответственна за индукцию устойчивости

Изучение влияния синтетического олигопептида (MF3 - 29 ак) на устойчивость табака к ВТМ

В состав одной из наиболее консервативных областей входил пептид длиной в 29 аминокислотных остатков IIPGLEKALE GKAVGDDLEV AVEPEDAYG (MF3 - 29 ак) Этот пептид был химически синтезирован для проверки его способности индуцировать в растениях устойчивость Опыты были проведены на паре табак - ВТМ. В результате проведенных исследований было показано, что предобработка половинок листьев табака растворами MF3-29aK в трех различных концентрациях индуцировала устойчивость к ВТМ как обработанных половинок, так и соседних (трансламинарный эффект).

После сравнения эффективностей действия пептида и исходного белка, было показано, что синтетический пептид обладает такими же защитными свойствами, как и целый MF3 белок

3.8. Изучение трансгенных растений, несущих ген MF3 белка.

3.8.1. Молекулярный анализ трансгенных растений.

В работе изучалось потомство от самоопыления (Т1) трансгенных растений цветной капусты сорта Korso и рапса сорта Westar со вставкой mfi гена и гена nptll в качестве маркерного Поскольку в Т1-потомстве происходит расщепление растений на трансгенные и нетрансгенные, то выросшие из семян растения анализировали методом ПЦР с генспецифическими праймерами на наличие в них mfl гена Для каждой линии были проанализированы в общей сложности от 30 до 60 растений Расщепление в Т1- потомстве трансгенных растений приведено в таблице 1

Классическое меиделевское расщепление 3 1 было выявлено только у линии рапса Т25/3 Возможно, материнское трансгенное растение содержало 1 вставку целевого гена В остальных случаях расщепление было отличным от классических. В потомстве некоторых трансгенных растений, например Т32/6 и 1а1, растения со вставкой гена отсутствовали, что может говорить о том, что материнские растения были химерными, то есть содержали клетки как со вставкой целевого гена, так и без нее.

Таблица 1 Характеристика потомства от самоопыления трансгенных растений

Линия трансгенного растения Соотношение растений со вставкой т/3 гена и без вставки Средний уровень экспрессии MF3 в растениях, пг/ мг растительной ткани

Westar нетрансгенный контроль О/все без вставки 0

1а1 О/все без вставки 0

1а/3 8/3 3

1а/7 Все со вставкой/0 30

Т25/3 3/1 33

Т25/8 8/1 34

Т25/9 Все со вставкой/0 3

Т25/12 11/1 26

Korso нетрансгенный контроль О/все без вставки 0

Т32/6 О/все без вставки 0

Т32/7 15/1 37

Известно, что в результате трансформации чужеродная ДНК встраивается случайным образом в хромосомы растения, причем в один локус может встраиваться несколько копий гена (Bhat and Srimvasan, 2002) Для того, чтобы определить количество локусов, содержащих целевой ген, некоторые растения из Т1- потомства трансгенных линий были проанализированы при помощи гибридизации по Саузерну.

Оказалось, что в большинстве растений содержится более чем одна вставка mf3 гена При этом у растений, выросших из семян одного растения, количество локусов с mf3 геном было как одинаковым (линия Т32/7 - 6

локусов, линия 1аЗ-5 локусов), так и различным (линия Т25/3-1 или 3 локуса, линия Т25/1 - один или 2 локуса)

Присутствие целевого гена в геноме растения еще не гарантирует, что данный ген будет экспрессироваться Поэтому следующим этапом работ стал анализ уровня синтеза целевого белка МБЗ в растениях, который проводили при помощи ИФА с антителами к МБЗ Было показано (табл 1), что уровень экспрессии бежа в растениях рапса и цветной капусты составлял от 0 до 37 пг на мг сырой растительной ткани.

3.8.2. Оценка устойчивости трансгенных растений рапса и цветной капусты к фитопатогенам.

Изучение устойчивости трансгенных растений рапса к ВМТ.

Вирусом инокулировали нижний лист трансгенных растений Кроме того, проводили заражение и растений, у которых ген т/3 не был обнаружен (эти растения служили контролем) Спустя 2 недели после инокуляции все растения рапса линий Т1-1аЗ и Т1-Т25/12 были достоверно меньше поражены вирусом (табл 2)

Таблица 2 Уровень устойчивости трансгенных растений рапса к ВМТ

Линия Количество растений, шт Количество растений с достоверно меньшим развитием вирусной инфекции по сравнению с контролем, %

14 день опыта 20 день опыта

Т1-1аЗ 6 100 83,3

Т1-1а7 10 50 0

Т1-Т25/3 6 33,3 16,7

Т1-Т25/12 5 100 60

Контроль 5 Оптическое поглощение при 450 нм

0,91±0,2 2,6±0,11

К 20-му дню эксперимента у некоторых растений вышеуказанных линий было зафиксировано увеличение содержания вируса, но по-прежнему, большая часть трансгенных растений не была поражена ВМТ В растениях линий Т1-1а7 и Т1-Т25/3 накопление вируса происходило существенно менее интенсивно по сравнению с контрольными растениями Задержка в развитии вируса составляла около недели Следует отметить, что не всегда более высокий уровень экспрессии МБЗ обеспечивал более высокую степень устойчивости Так, растения, у которых содержание бежа различалось в 8

раз, обладали одинаково высокой устойчивостью к ВМТ. Возможно, для приобретения устойчивости растениям рапса достаточно и небольших количеств МРЗ.

Изучение устойчивости трансгенных растений рапса и цветной капусты к Р1аятос!юркот Ьгаззкае.

Для определения влияния экспрессии гена МРЗ белка в растениях на уровень их устойчивости к Р1. Ьгая${сае, так же как и в предыдущем опыте, использовали трансгенные проростки семенного потомства трансформированных растений в качестве опытных, а нетрансгенные проростки в качестве контроля. Анализ развития болезни проводили через 50 дней после инокуляции.

Для каждого семенного потомства был рассчитан процент поражённых растений. Было показано, что лишь растения рапса линии Т25/9 интенсивно поражались Р1. ЬгаБзгсае, развитие болезни на корнях остальных трансгенных растений было существенно ниже, чем у контрольных растений (рис. I!).

с ю га за 60 ю до ео ЕШ

Кол:п1 ыггао ■ ЛражДявьк рч^тгиЧ. %

Рисунок 11. Устойчивость трансгенных растений рапса и цветной капусты

к Р. Ьгазтсае.

Семенное потомство трансгенной цветной капусты не показало высокого уровня устойчивости к Р1. Ьга&гсае, что, впрочем, может быть связано с недостаточным количеством испытуемых линий.

Большинство растений рапса, экспрессирующих ген от/3, в меньшей

степени поражались ВМТ и Р1. Ьга$$1сае, что делает их, несомненно,

привлекательными для использования в дальнейшей селекции сортов,

устойчивых к вирусным и грибным патогенам.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты исследования показали многогранность действия МРЗ на растения МБЗ не оказывал фитотоксичного действия на растения табака, ячменя и пшеницы, более того, на проростках пшеницы и ячменя, зараженных корневыми гнилями, было показано, что обработка белком способствовала развитию нормальной корневой системы Продемонстрированная способность МТЗ индуцировать в растениях устойчивость к ряду вирусных и грибных патогенов без прямого влияния на вредный организм может быть использована для разработки новых средств защиты от болезней. Первым шагом к созданию препаративных форм биопестицидов на основе МБЗ может стать использование хитозана, как возможного носителя белка, обеспечивающего его доступ в растительные ткани Экспериментальным путем удалось подобрать оптимальное соотношение белка и хитозана для формирования активного комплекса Использование такого комплекса позволило повысить защитный эффект белка и расширить спектр его действия против патогенов

Сравнительный анализ первичной структуры МБЗ позволил отнести данный белок к ППИ-азам РКВР-типа и идентифицировать в нем фрагмент, ответственный за индуцирующую активность данного белка Изучение защитных свойств синтезированного пептида, являющегося функциональным центром белка, ответственным за индукцию устойчивости, показало, что он не менее эффективно защищал растения табака от ВТМ, чем исходный белок

Результаты исследования семенного потомства трансгенных растений рапса и цветной капусты дают основание заключить, что экспрессия гена МРЗ не оказывала негативного влияния на морфологию и развитие растений Трансгенные растения рапса показали повышенный уровень устойчивости к грибному (Р1аято^оркога Ъгазясаё) и вирусному (вирус мозаики турнепса) фитопатогенам Это означает, что данные растения могут быть включены в процесс селекции новых сортов, устойчивых к этим патогенам

Таким образом, МБЗ может быть использован для контроля ряда болезней растений как в качестве основы для разработки новых экологически безопасных биопестицидов, так и для создания устойчивых трансгенных растений

5. ВЫВОДЫ.

1. Создан штамм Е coli - суперпродуцент MF3 и оптимизирована схема выделения и очистки данного белка.

2. Показано что у MF3 отсутствуют

- фунгитоксичность по отношению к St noäorum и А longipes,

- прямое влияние на инфекционность ВТМ,

- фитотоксичность по отношению к табаку и злаковым растениям

3. Показана способность MF3 защищать растения табака от ВТМ, Y-BK и А longipes а так же растения ячменя от В sorohmana

4. Обнаружено стимулирующее действие MF3 на развитие корневой системы у растений пшеницы и ячменя, зараженных фузариозной и гельминтоспориозной корневыми гнилями

5 Впервые показана способность MF3 образовывать комплекс с хитозаном, что усиливает защитный эффект данного белка в таких системах растение-хозяин - патоген, как белокачанная капуста - вирус мозаики турнепса, пшеница - St nodorum

6 Найдена гомология между MF3 и пептидил-пролил-г^ие/даракс-изомеразами FKBP-типа

7 В результате анализа первичной структуры MF3-белка идентифицирована последовательность, состоящая из 29 аминокислотных остатков, ответственная за способность MF3 индуцировать устойчивость табака к ВТМ

8. Установлено, что трансгенные растения рапса обладают повышенной устойчивостью к патогенному грибу PI brasswae и вирусу мозаики турнепса

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Shumilina D.V, Vomova Т М, Battchikova N А, Korpela Т , Dzhavakhiya V G Elicitor activity of MF-3 protein from Pseudomonas fluorescens and combination MF3-protein with chitosan in different host-pathogen pairs Euchis '04, 6th International Conference of the European Chitin Society, Poznan, Poland, August 31-September 3,2004-P 39

2 Shumilina D.V., Il'ma A V , Kulikov S N , Dzhavakhiya V G Elicitor activity of MF-3 protein from Pseudomonas fluorescens and combination of MF3-protein with chitosan m different host-pathogen pairs "Advances m Chitin Sciences" Poznan, Poland, 2005 vol VIII - P 275-278

3 Шумилина Д.В., Кромина К A, Джавахия В Г Индуктор неспецифической устойчивости растений - Мшфобный Фактор 3 (MF3) - выделенный из ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens может быть использован как высокоэффективный биопестицид широкого спектра действия // Материалы 2-ой Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование, Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» 10-13 мая 2005, Пущино -С 151-152

4 Daria Shumilina, Vitaly Dzhavakhiya A New Approach to Development and Practical Application of Bio-pesticides Based on the Pseudomonas fluorescens Protem - Inductor non Specific Plant Resistance to Fungal, Vrral and Bacterial Disease The 10 ISTC/Korea workshop Industrial applications of Russia's new biotechnologies, March 14-15, 2006 - P 64-67

5 Daria Shumilina, Maria Kuznetsova and Vitaly Dzhavakhiya Studing the elicitor activity of mf3 protem from Pseudomonas fluorescens m different host - pathogen pairs ХП1 Conference "New achievements ш biological control of plant diseases", Bydgoszcz, Poland, 25-26 April 2006 - P 79-82

6 Куликов С H , Чирков С Н, Ильина А В , Лопатин С А , Шумилина Д.В., Джавахия В Г Использование хитозана для защиты растений от вирусных инфекций Материалы восьмой международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Казань 12-17 июня 2006-С 330-332

7 Daria Shumilina, Ksenia Kromina, Vitaly Dzhavakhiya A New Approach to Development and Practical Application of Bio-pesticides Based on the bacterial protems - Inductors of Non Specific Plant Resistance to Fungal, Viral and Bacterial Pathogens Материалы 3-ей Международной конференции «Наука и Бизнес» -2006 -19-21 июня - г Пущино - С 161-164

8 Шумилина Д.В., Воинова Т М, Джавахия В Г Микробный факторЗ-база для создания новых биопестицидов Защита и карантин растений- №10 - 2006 - С 20-21

9 Куликов С Н, Шумилина Д.В., Джавахия В Г, В П Варламов, К Г Скрябин Изучение комплексообразования между МРЗ-белком из Pseudomonas fluorescens и низкомолекулярным хитозаном и исследование элиситорных свойств оптимизированного комплексного препарата «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур - важное направление в защите растений» 15 -16 ноября 2006, ВНИИФ Голицыне - С 26-28

10 Shumilina D., Kramer R, Klocke E, Dzhavakhiya V MF3 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of FKBP type from Pseudomonas fluorescens) - an ehcitor of nonspecific plant resistance against pathogens Phytopathol Pol, 2006 V 41 - P 39-49

11 Daria V. Shumilina, Alia V Пуша, Valery P Varlamov, Vitaly G Dzhavakhiya Studmg the protection activity of MF3 protein from Pseudomonas fluorescens m different host - pathogen pairs Joint International Workshop on PR-P rotems and mduced resistance against pathogens and insects Doom, the Netherlands, May 1014,2007 - P.104

12 Д.В. Шумилина, В Г Джавахия Изучение способности MF3 (пептидил-пролил цис-транс изомеразы FKBP типа) из Pseudomonas fluorescens повышать устойчивость растений табака к вирусным и грибным патогенам Агро 21 век в печати 27 02 2007

Патент:

Dzhavafchia V, Filipov А , Skryabm К, Voinova Т, Kouznetsova М, Shulga О, Shumilina D., Kromina К, Pndanmkov M, Battchikova N, Korpela T Proteins mducmg multiple resistance of plants to phytopathogens and pests Patent PCT W02005/061533 Al, дата публикации 2005-07-07

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Виталию Георгиевичу Джавахия за поддержку в ходе выполнения работы, а также Ларисе Александровне Щербаковой за внимательное чтение рукописи диссертации и обсуждение результатов работы Т Б Костальевой и Н В Гирсовой автор благодарен за помощь при проведении дифференциального центрифугирования ВТМ, Л Л Дорофеевой - за помощь в проведении рулонных тестов, В П Варламову и С Н Куликову - за предоставление препаратов хитозанов и консультации при работе с ним.

Особую благодарность автор выражает К.А Кроминой, М.В Приданникову и всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ за поддержку, советы и дружеское участие, а так же тем, кто стал его учителем во время стажировки в Институте декоративных растений (Германия), а именно: Эвелин Клоке, Мартине Малони и Элке Зьяба

Подписано в печать 21 09 2007 г Исполнено 21 09 2007 г г Печать трафаретная

Заказ № 758 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шумилина, Дарья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Белки и их роль во взаимоотношениях хозяин-патоген.

1.1.1. Индуцирование устойчивости растений неспецифическими элиситорами.\ j

1.1.2. Индукция устойчивости растения продуктами R-генов специфических элиситоров).

1.2. Индуцированная устойчивость растений к болезням.

1.3. Применение веществ белковой природы для защиты растений от патогенов и вредителей.

1.3.1. Белки-токсины бактериального происхождения.

1.3.2. Растительные белки.

1.4. Трансгенные растения, устойчивые к вирусам.

1.5. Изменение метаболизма растительных тканей, как способ повышения устойчивости растений к патогенам.

1.6. Пептидил-пролил-г/мс//иря//с-изомеразы.

1.6.1. ППИ-азы растений.

1.6.2. ППИ-азы паразитических организмов.

1.6.3. Влияние ППИ-аз хозяина на развитие патогенов.

1.6.4. Использование ППИ-аз для подавления развития патогенов.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Определение количества MF3 в клетках P.fluorescens (197).

3.2. Создание штамма E.coli- суперпродуцента MF3.

3.3. Исследование фитотоксичности MF3.

3.4. Изучение влияния MF3 на вирусные патогены растений.

3.4.1. Вирус табачной мозаики.

3.4.2. Y- вирус картофеля.

3.5. Изучение влияния MF3 на грибные патогены растений.

3.5.1. Alternaria longipes.

3.5.2. Возбудители корневых гнилей злаковых.

3.6. Изучение возможности использования хитозанов для улучшения проникновения MF3 в растительные ткани.

3.6.1. Изучение способности MF3 в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость пшеницы к патогенному грибу Stagonospora nodorum. if.') ' Изучение способности MF3 в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость растений белокочанной капусты к вирусу мозаики турнепса.уу

3-7. Анализ нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной последовательности белка MF3.

3.7.1. Поиск и изучение элиситорного центра MF3 белка - ППИ-азы

FKBP-типа, выделенного из P.jluorescens.gg

3.8. Изучение трансгенных растений, несущих ген MF3 белка.

3.8.1. Молекулярный анализ трансгенных растений.

3.8.2. Оценка устойчивости трансгенных растений рапса и цветной капусты к фитопатогенам.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням"

Болезни растений, вызванные патогенными грибами, бактериями и вирусами продолжают наносить серьёзный ущерб сельскому хозяйству, несмотря на его интенсивное развитие. Применение химических средств защиты растений является эффективным способом борьбы с возбудителями болезней, однако пестициды имеют целый ряд недостатков, наиболее важными из которых являются негативное воздействие на экологию, а также появление резистентных к ним рас патогенов и вредителей. В связи с этим ведётся постоянный поиск новых средств и методов защиты сельскохозяйственных культур. Важно отметить, что генетика патогенов чрезвычайно пластична, что позволяет им достаточно быстро приобретать устойчивость к новым химическим пестицидам. Современная защита растений от патогенов включает в себя методы биологического контроля и индуцированной устойчивости растений к патогенам.

Применение живых культур бактерий и грибов, как средств защиты растений, зачастую лимитировано условиями окружающей среды, поэтому многие исследователи пытаются определить факторы, за счёт которых микроорганизмы помогают справиться растению с патогенными организмами. Показано, что такими факторами являются антибиотики, а также ферменты, например хитиназы и глюканазы. Оказалось, что довольно часто вещества, вызывающие устойчивость растений к патогенам, имеют белковую природу.

Применение белков для защиты растений сопряжено с рядом трудностей, обусловленных как лёгкой деградацией этих веществ под влиянием окружающей среды, так и сложностью проникновения больших белковых молекул внутрь растительных тканей. Для защиты растений сейчас в основном применяют белки двух типов действия. Прежде всего, это белки, оказывающие токсичное действие на патогены. Для создания трансгенных растений, в основном используют гены, кодирующие токсичные белки и пептиды. Такие трансгенные растения сами синтезируют белки-токсины и становятся несъедобными для патогенов и вредитей. Ярким примером могут служить трансгенные растения сои, картофеля и других культур, несущие гены эндотоксинов из Bacillus thuringiensis, которые уже широко применяются в сельском хозяйстве Канады, США и некоторых других стран. К сожалению, последние исследования показывают, что появились новые штаммы вредных организмов, устойчивые к данным токсинам (Tabashnik, 2001). Белками с иным механизмом действия являются индукторы устойчивости растений. Они запускают в растениях каскад собственных защитных ответов, что позволяет преодолеть инвазию патогенных организмов. Уникальность и привлекательность индукторов устойчивости заключается в том, что защитный ответ не экспонируется конститутивно, а реализуется в растении только после внедрения патогена. Это позволяет надеяться, что вредный организм не будет приобретать устойчивость к защитным веществам растений. Примером таких белков-индукторов, наиболее интенсивно используемых в сельском хозяйстве, могут служить харпины. Первым был описан харпин из Erwinia amylovora являющийся продуктом гена hrpN. HrpN - это кислый, термостабильный, богатый глицином белок с молекулярной массой 44 кДа (Beer et al., 1991). Харпины вызывают реакцию сверхчувствительности в растениях и способны индуцировать их устойчивость к болезням (Wei et al., 1998). Сейчас создано множество препаратов на их основе, способных защищать широкий круг культурных растений от ряда патогенов и вредителей.

Таким образом, индукция в растении защитных реакций выглядит как наиболее перспективный путь развития методов контроля патогенов. Способность индуцировать устойчивость растений к патогенным грибам и нематодам обнаружена и у бактерии Pseudomonas fluoresceins (Siddiqui and Shaukat, 2002-a,b). В процессе исследования защитных свойств P. fluorescens во ВНИИ Фитопатологии было показано, что одним из факторов, позволяющим данной бактерии защищать растения от патогенов, является низкомолекулярный (16,9 кДа) термостабильный белок, названный Микробным Фактором

3 (MF3). Выделенный белок был способен индуцировать в листьях табака устойчивость к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Ген, кодирующий MF3 белок, был клонирован и секвенирован, была определена полная аминокислотная последовательность белка MF3 (Dzhavakhia et al., 2005). Для того чтобы наиболее полно раскрыть механизмы действия данного белка, было решено провести его всестороннее изучение как в качестве возможного биопестицида, так и при применении гена mf3 для создания трансгенных растений цветной капусты и рапса. Цели и задачи исследований.

Целью наших исследований было изучение защитного действия MF3. Другой целью данной работы был анализ первичной структуры МРЗ-белка и идентификация аминокислотной последовательности, ответственной за индуцирующую активность. Кроме того, была поставлена цель выяснить способен ли белок обеспечивать устойчивость трансгенных растений, в которых экспрессируется ген mfS. Задачи исследований:

1. Создание штамма E.coli - суперпродуцента МРЗ-белка;

2. Оценка способности MF3 защищать растения от вирусных и грибных патогенов;

3. Изучение способности хитозана образовывать комплекс с MF3 и способствовать его проникновению внутрь растительных тканей;

4. Изучение структуры MF3 и определение его фрагмента, достаточного для индуцирования устойчивости;

5. Оценка способности синтетического пептида MF3-29aK индуцировать устойчивость растений в системе табак - ВТМ.

6. Анализ устойчивости к фитопатогенам трансгенных растений, в которых экспрессируется ген mfS.

Научная новизна исследований.

1. Впервые была обнаружена гомология между аминокислотной последовательностью MF3 белка и пептидил-пролил-г/мс/тронс-изомеразами FKBP-типа. Впервые показано, что белок, относящийся к этому семейству, способен индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам.

2. Впервые показана способность MF3 образовывать комплекс с хитозаном, что усиливало защитный эффект данного белка в таких системах растение-хозяин -патоген, как белокачанная капуста - вирус мозаики турнепса, пшеница -Stagonospora nodorum.

3. Впервые показано, что MF3 имеет активный центр - пептид IIPGLEKALE GKAVGDDLEVAVEPEDAYG (MF3 - 29 ак), определяющий его защитные функции. Показано, что синтезированный химическим путём MF3 - 29 ак обладает способностью вызывать устойчивость табака к ВТМ.

4. Впервые показано, что растения рапса, экспрессирующие ген MF3, обладают повышенной по сравнению с нетрансгенными растениями устойчивостью к вирусу мозаики турнепса и грибу Plasmodiophora brassicae.

Практическая значимость работы.

1. Показано, что MF3 белок способен защищать растения от вирусных и грибных патогенов. Данные результаты могут служить предпосылкой для создания средств защиты растений на основе MF3.

2. Создан штамм E.coli - суперпродуцент MF3 с продуктивностью 200 мг белка/л. Данный штамм может быть использован в качестве источника MF3 в случае применения данного белка как средства для защиты растений. Разработана простая схема выделения и очистки белка.

3. Показано, что при создании препаративных форм биопестицидов на основе белка может быть использован хитозан, образующий комплекс с MF3 и усиливающий защитный эффект последнего. Кроме того, установлено, что применение хитозана совместно с белком позволяет расширить круг защищаемых растений.

4. Показано, что фрагмент MF3 (пептид MF3-29 ак) способен защищать растения табака от ВТМ. Таким образом, для разработки биопестицидов и для создания трансгенных растений можно использовать как целый белок, так и его индуцирующую часть.

5. Показано, что трансгенные растения рапса, несущие ген mfi, обладают повышенной устойчивостью к вирусу мозаики турнепса и к грибному патогену PL brassicae. Данные свойства делают их перспективными для использования в дальнейшей селекции сортов с широким спектром устойчивости к вирусным и грибным патогенам.

6. Структура МРЗ-белка и его защитные функции были защищены международным патентом Dzhavakhia V., Filipov A., Skryabin К., Voinova Т., Kouznetsova М., Shulga О., Shumilina D., Kromina К., Pridannikov M., Battchikova N., Korpela T. Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests. Patent PCT W02005/061533 Al, дата публикации 2005-07-07.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и конгрессах:

1. Шестая международной конференция Европейского хитинового общества, проходившая в Познани (Польша) с 31 августа по 3 сентября 2004 г;

2. Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование, Биотехнология -Биомедицина - Окружающая среда», проходившая в Пущино 10-13 мая в 2005г;

3. Десятый МНТЦ/Корея семинар: «Industrial applications of Russia's new biotechnologies», проходивший в Мокпо (Корея) 14-15 марта 2006 г;

4. Восьмой конгресс "New achievements in biological control of plant diseases", проходивший в Быдгощи (Польша) 25-26 апреля 2006 г;

5. Восьмая международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», проходившая в Казани 12-17 июня 2006 г;

6. Третья международная конференция «Наука и Бизнес», проходившая в Пущино 19-21 июня 2006 г;

7. Всероссийская научно-практическая конференция «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур - важное направление в защите растений», проходившая в Голицыне 15-16 ноября 2006 г;

8. Объединенное международное совещание «PR-Proteins and Induced Resistance against Pathogens and Insects», прходивший в Дорне (Голландия) 10-14 мая 2007 г.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ и получен один международный патент.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 122 работы, из которых 108 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Шумилина, Дарья Владимировна

5. ВЫВОДЫ.

1. Создан штамм E.coli - суперпродуцент MF3 и оптимизирована схема выделения и очистки данного белка.

2. Показано что у MF3 отсутствуют:

- фунгитоксичность по отношению к St. nodorum и A. longipes,

- прямое влияние на инфекционность ВТМ,

- фитотоксичность по отношению к табаку и злаковым растениям.

3. Показана способность MF3 защищать растения табака от ВТМ, Y-BK и A. longipes а так же растения ячменя от В. sorokiniana.

4. Обнаружено стимулирующее действие MF3 на развитие корневой системы у растений пшеницы и ячменя, заражённых фузариозной и гельминтоспориозной корневыми гнилями.

5. Впервые показана способность MF3 образовывать комплекс с хитозаном, что усиливает защитный эффект данного белка в таких системах растение-хозяин - патоген, как белокачанная капуста - вирус мозаики турнепса, пшеница - St. nodorum.

6. Найдена гомология между MF3 и пептидил-пролил-г/ис/т/?днс-изомеразами FKBP-типа.

7. В результате анализа первичной структуры МРЗ-белка идентифицирована последовательность, состоящая из 29 аминокислотных остатков, ответственная за способность MF3 индуцировать устойчивость табака к ВТМ.

8. Установлено, что трансгенные растения рапса обладают повышенной устойчивостью к патогенному грибу PL brassicae и вирусу мозаики турнепса.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Shumilina D.V., Voinova Т.М., Battchikova N.A., Korpela Т., Dzhavakhiya V.G. Elicitor activity of MF-3 protein from Pseudomonas fluorescens and combination MF3-protein with chitosan in different host-pathogen pairs. Euchis '04, 6th International Conference of the European Chitin Society, Poznan, Poland, August 31 - September 3,2004.- P. 39.

2. Shumilina D.V., Il'ina A.V., Kulikov S.N., Dzhavakhiya V.G. Elicitor activity of MF-3 protein from Pseudomonas fluorescens and combination of MF3-protein with chitosan in different host-pathogen pairs. "Advances in Chitin Sciences" Poznan, Poland, 2005 vol. VIII.- P.275-278.

3. Шумилина Д.В., Кромина K.A., Джавахия В.Г. Индуктор неспецифической устойчивости растений - Микробный Фактор 3 (MF3) - выделенный из ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens может быть использован как высокоэффективный биопестицид широкого спектра действия // Материалы 2-ой Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование, Биотехнология - Биомедицина -Окружающая среда». 10-13 мая 2005, Пущино. - С. 151-152.

4. Daria Shumilina, Vitaly Dzhavakhiya A New Approach to Development and Practical Application of Bio-pesticides Based on the Pseudomonas fluorescens Protein - Inductor non Specific Plant Resistance to Fungal, Viral and Bacterial Disease. The 10 ISTC/Korea workshop: Industrial applications of Russia's new bio-technologies, March 14-15, 2006.-P.64-67

5. Daria Shumilina, Maria Kuznetsova and Vitaly Dzhavakhiya Studing the elicitor activity of mf3 protein from pseudomonas fluorescens in different host - pathogen pairs XIII Conference "New achievements in biological control of plant diseases", Bydgoszcz, Poland, 25-26 April 2006.- P. 79-82.

6. Куликов C.H., Чирков C.H., Ильина A.B., Лопатин С.А., Шумилина Д.В., Джавахия В.Г. Использование хитозана для защиты растений от вирусных инфекций. Материалы восьмой международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана, Казань 12-17 июня 2006.- С.330-332

7. Daria Shumilina, Ksetiia Kromina, Vitaly Dzhavakhiya A New Approach to Development and Practical Application of Bio-pesticides Based on the bacterial proteins - Inductors of Non Specific Plant Resistance to Fungal, Viral and Bacterial Pathogens-Материалы 3-ей Международной конференции «Наука и Бизнес». - 2006. - 19-21 июня. - г. Пущино. -С.161-164.

8. Шумилина Д.В., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Микробный факторЗ-база для создания новых биопестицидов. Защита и карантин растений- №10.- 2006 .- С. 20-21.

9. Куликов С.Н., Шумилина Д.В., Джавахия В.Г., В.П. Варламов, К.Г. Скрябин Изучение комплексообразования между МРЗ-белком из Pseudomonas fluorescens и низкомолекулярным хитозаном и исследование элиситорных свойств оптимизированного комплексного препарата. «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур - важное направление в защите растений» 15-16 ноября 2006, ВНИИФ Голицыно.- С. 26-28

10. Shumilina D., Kramer R,, Klocke E., Dzhavakhiya V. MF3 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase of FKBP type from Pseudomonas fluorescens) - an elicitor of non-specific plant resistance against pathogens. Phytopathol. Pol., 2006. V.41.- P. 39-49.

11. Daria V. Shumilina, Alia V. Ilyina, Valery P. Varlamov, Vitaly G. Dzhavakhiya Studing the protection activity of MF3 protein from Pseudomonas fluorescens in different host -pathogen pairs. Joint International Workshop on: PR-P roteins and induced resistance against pathogens and insects Doom, the Netherlands, May 10-14,2007.- P. 104.

12. Д.В. Шумилина, В.Г. Джавахия Изучение способности MF3 (пептидил-пролил цис-транс изомеразы FKBP типа) из Pseudomonas fluorescens повышать устойчивость растений табака к вирусным и грибным патогенам. Агро 21 век в печати 27.02.2007

Патент:

Dzhavakhia V., Filipov A., Skryabin К., Voinova Т., Kouznetsova М., Shulga О., Shumilina D.,

Kromina К., Pridannikov M., Battchikova N., Korpela T. Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests. Patent PCT W02005/061533 Al, дата публикации

2005-07-07.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Шумилина, Дарья Владимировна, Большие Вяземы

1. Гост Р 50459-92 Методы оценки семян с/х растений на наличие грибных и бактериальных инфекций, Москва.-1992-Стр. 13-18.

2. Дорохов Д.Б., и Клоке Е. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. // Генетика. 1997. - т. 33. - № 4 - С. 476-483.

3. Дьяков Ю. Т., Озерецковская О. JI., Джавахия В. Г. и Багирова С. Ф. Общая и молекулярная фитопатология. Учеб. пособие. М. - Общество фитопатологов. -2001.-302 с.

4. Кромина К. А. и Джавахия В. Г. Экспрессия бактериального гена CspD в растениях табака приводит к их повышенной устойчивости к грибным и вирусным фитопатогенам. Молекулярная генетика, вирусология и микробиология, 2006, №1, стр. 31-34.

5. Кузьмина Н. А. Основы биотехнологии. Учебное пособие- Омск-Омский государственный педагогический университет.- 2006,-электронная книга.-http://www.biotechnolog.ru/aboutbook.htm

6. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. / Влияниемолекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Прикладная Биохимия и Микробиология. 2006-а, Т.42, №2, с. 224-228.

7. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства.//Генетика.-1998. Том 34 - № 6-С. 719-729.

8. Метлицкий JI.B., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Давыдова М.А., Сегаль Г.М., Роль стеринов во взаимоотношениях картофеля и Phytophthora infestans.ll Докл.АН СССР -1976.- Т. 227.- №1.-С. 244-247.

9. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Как растения защищаются от болезней.//М. -Наука.-1985.-190с.

10. Наградова Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков. // Соросовский образовательный журнал. -1996-№7. -С.10-18.

11. Озерецковская О.Л. и Васюкова Н.И. при использовании элиситоров для защиты сельскохозяйственных растений необходима осторожность. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Том 38.- № 3.- С. 322-325.

12. Пыжикова Г.В., Санина А.А., Супрун Л.М., Курахтанова Т.И., Гогаева Т.И., Мепаришвили С.У., Анциферова Л.В., Кузнецов Н.С., Игнатов А.Н., Кузьмичев А.А. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу. М. -1989. - 44 С.

13. Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. 368с.

14. Abramovitch R.B., Kim Y.- J, Chen S., Dickman M.B. and Martin G.B. Pseudomonas type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host programmed cell death // The EMBO Journal. 2003. - V. 22. - P. 60-69.

15. Alfano J. and Collmer A The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria: trafficking harpins, Avr proteins, and death // J Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 56555662.

16. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - № 17. - P. 3389-3402.

17. Bae W., Xia В., Inouye M., Severinov K. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 5. - № 97 (14). - P. 7784-7789.

18. Bairoch A., Bucher P., Hofmann K. The PROSITE database, its status in 1997 // Nucleic Acids Res. 1997. -V. 25. - No. 1. - P. 217-221.

19. Bauer D.W., Zumoff, C.H., Theisen T.M., Bogdanove A.J. and Beer S.V. Optimized production of Erwinia amylovora harpin and its use to control plant disease and enhance plant growth // Phytopathology. 1997. - V. 87. - P. S7.

20. Bernhardt Thomas G., Roof William D. and Young Ry The Escherichia coli FKBP-type PPIase SlyD is required for the stabilization of the E lysis protein of bacteriophage fX174.// Molecular Microbiology.-2002.-V.45(l).-P. 99-108.

21. Bhat S.R., Srinivasan Molecular and genetic analyses of transgenic plants: considerationsand approaches // Plant Science. 2002. - V. - 163. - P. 673-681.

22. Blasi U, Henrich B, Lubitz W. Lysis of Escherichia coli by cloned phi XI74 gene E depends on its expression. // J Gen Microbiol. 1985. - V.l31- N.5. - P.l 107-1114.

23. Blecher 0, Erel N, Callebaut I, Aviezer K, Breiman A. A novel plant peptidyl—prolyl cis-trans-isomerase (PPiase): cDNA cloning, structural analysis, enzymatic activity and expression.// Plant Mol. Biol. -1996. V.32. - P. 493-504.

24. Carlinia Ce'li R., Grossi-de-Sa Maria Fa'tima, Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides // Toxicon -2002-V. 40. P. 1515-1539.

25. Chen YG, Liu F, Massagu.e J. Mechanism of TGF- и receptor inhibition by FKBP12, // EMBO J 1997.- V. 16 - P.3866—3876.

26. Coaker Gitta, Arnold Falick, Brian Staskawicz. Activation of a Phytopathogenic Bacterial Effector Protein by a Eukaryotic Cyclophilin. // Science. 2005. -V. 308. - P. 548-550.

27. Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering // Nucl. AcidsRes.-1988.- V. 16.1.22.-P. 10881-10890.

28. Deuerling E., Schulze-Specking A., Tomoyasu Т., Mogk A. and Bukau B. Trigger factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins. // Nature -1999. V. 400 -P.693-696.

29. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1986.

30. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1986.

31. Durrant W.E. and Dong X. Systemic acquired resistance. // Annu. Rev. Phytopathol. -2004.-V. 42.-P. 185-209.

32. Dzhavakhia V., Filipov A., Skryabin K., Voinova Т., Kouznetsova M., Shulga O.,

33. Shumilina D., Kromina K., Pridannikov M., Battchikova N„ Korpela T. Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests. Patent PCT W02005/061533 Al, publication date 2005-07-07.

34. Erickson F.L, Holzberg S., Calderon-Urrea A., Handley V., Axtell M., Corr C., Baker B. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco // Plant J. 1999. - V. 18. - № 1. - P. 67-75.

35. Felix G. and Boiler T. The highly conserved RNA-binding motif RNP-1 of bacterial cold shock proteins is recognized as an elicitor signal in tobacco // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278.-P. 6201-6208.

36. Felix G., Duran J.D., Volko S., Boiler Т. Plants recognize bacteria through the most conserved domain of flagellin. // Plant J. 1999. -V.18. - P.265-276.

37. Fischer G.H., Bang H. and Mech C. Detection of enzyme catalysis for cis-trans isomerization of peptide bonds using prolin-containing peptides as substrates.// Biomed. Biochim. Acta. -1984. V. 43 - P. 1101 -1111.

38. Forst S., Clarke D. Bacteria-nematode symbiosis. II In: Gaugler, R. (Ed.), Entomopathogenic Nematology. CAB International, London.- 2002.- P. 57-77.

39. Gomez-Gomez L. and Boiler T. Flagellin perception: a paradigm for innate immunity // Trends Plant Sci. 2002. - V. 7. - Issue 6. - P. 251-256.

40. Handschumacher R.E., Harding M.W., Rice J., Grugge R.J. and Speicher D.W. Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporine A. // Science. -1984. V. 226 - P.544-546

41. Harding M.W., Galat A., Uehling D.E. and Schreiber S.L. A receptor for the immunosuppressant FK-506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. 11 Nature. -1989. V. 341 -P.761-763.

42. Harding M.W., Handschumacher R.E. and Speicher D.W Isolation and amino acid sequence of cyclophilin. // J. Biol. Chem. -1986. V. 261 - P.8547-8555.

43. Harrar Y., Bellini C. and Faure J.D. FKBPs: at the crossroads of folding and transduction // Trends in Plant Science. 2001. -V.6. - N.9. - P.426-431.

44. He S.Y., Huang H.C. and Collmer A. Pseudomonas syringae pv. syringae harpinpss: a protein that is secreted via the Hrp pathway and elicits the hypersensitive response in plants // Cell. 1993. - V. 73. - P. 1255-1266.

45. He Z., Li L. and Luan S. Immunophilins and parvulins. Superfamily of peptidyl prolyl isomerases in Arabidopsis. // Plant Physiol. -2004. V.134. -P. 1248-1267.

46. Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Sheerman S.E., Baker R.F. and Boulter D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco.// Nature 1987 - V. 330. - P. 60163.

47. Holmes F.O. Inheritance of resistance to tobacco mosaic disease in tobacco // Phytopathol. 1938.-V. 28.-P. 553-561.

48. James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops in 2005. Fromhttp://w4vw.isaaa.0rg. 2005.

49. Jayaraman K.S., Fox J.L., Jia H., Orellana C. Indian Bt gene monoculture, potential time bomb.// Nat. Biotechnol.- 2005.- V. 23.- P. 158.

50. Jiang W, Hou Y, Inouye M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. // J Biol Chem. -1997. V. 272 - P. 196-202.

51. Kang С. В., Feng L., Chia J., Yoon H. S. Molecular characterization of FK-506 binding protein 38 and its potential regulatory role on the anti-apoptotic protein Bcl-2 // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. -V.337. - P. 30-38.

52. Karlson D, Nakaminami K, Toyomasu T, Imai R. A Cold-regulated nucleic acid-binding protein of winter wheat shares a domain with bacterial cold shock proteins. // J Biol Chem. 2002. - V. 277. - P.35248-35256.

53. Keen N.T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions // Ann. Rev. Genet. 1990. - V. 24. - P. 421-440.

54. King E. О., M. K. Ward and D. C. Raney. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.// J. Lab. Clin. Med. -1954. V. 44.-P. 301-307.

55. Kingsley P.D., Palis J. GRP2 Proteins Contain Both CCHC Zinc Fingers and a Cold Shock Domain. // Plant Cell. -1994. -V. 6. P. 1522-1523.

56. Kino Т., Hatanaka H., Hashimoto M., Nishiyama M., Goto Т., Okuhara M., Kosaka M., Aoki H. and Imanaka H. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces.ll The Journal of Antibiotics-1987. V.XL. - № 9. - P. 1249-1255.

57. Kumar R., Adams В., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S. The FK506-binding protein of the malaria parasite, Plasmodium falciparum, is a FK506-sensitive chaperone with

58. FK506-independent calcineurin-inhibitory activity.// Molecular & Biochemical Parasitology 2005. -V. 141 -P. 163-173.

59. Kunze G., Zipfel C., Robatzek S., Niehaus K., Boiler Т., Felix G. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants // Plant Cell. -2004.-V. 16.-P. 3496-3507.

60. Kurien B.T., Scofield R.H. Polyethylene glycol-mediated bacterial colony transformation // BioTechniques. 1995. - V.18. -1. 6,- P. 1023-1026.

61. Laemmli, U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature.-1970.-V. 227.-P.680-685.

62. Liu D., Burton S., Glancy Т., Li Z.S., Hampton R., Meade Т., Merlo D.J. Insect resistance conferred by 283-kDa Photorhabdus luminescens protein TcdA in Arabidopsis thaliana.// Nat. Biotechnol. -2003. V.21.- P. 1307-1313.

63. Luan S., Kudla J., Gruissem W., Schreiber S.L. Molecular characterization of a FKBP-type immunophilin from higher plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1996. V.93. - P. 6964-6969.

64. Lugtenberg B.J.J., Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V. 81. - P. 373-383.

65. Mackey D., Belkhadir Y., Alonso J. M., Ecker J.R. and Dangl J.L. Arabidopsis RIN4 Is a Target of the Type III Virulence Effector AvrRpt2 and Modulates RPS2-Mediated Resistance. // Cell. 2003. - V. 112. - P.379-389.

66. Molina A., Mena M., Carbonero P., Garcia-Olmedo F. Differential expression of pathogen-responsive genes encoding two types of glycine-rich proteins in barley // Plant Mol. Biol. -1997.-V. 33.-P. 803-810.

67. Navia M. A. Protein-drug complexes important for immunoregulation and organ transplantation. // Current Opinion in Structural Biology. -1996. V. 6. - I. 6. - P. 838847.

68. Pratt WB, Toft DO. Regulation of signalling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. // Exp Biol Med. 2003. - V. 228 — P.I 11— 133.

69. Rahfeld J.U., Schierhorn A., Mann K. and Fischer G. A novel peptidyl-prolyl cis-trans isomerase from Escherichia coli. H FEBS Lett. -1994. V. 343 - P.65-69.

70. Romano P.G.N., Horton P., Gray J.E. The Arabidopsis cyclophilin gene family // Plant Physiology-2004.-V. 134.-P. 1268-1282.

71. Ronald P.C., Salmeron J.M., Carland F.M., Staskawicz B.J. The cloned avirulence gene avrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 1604- 1611.

72. Samatey F.A., Imada K., Nagashima S., Vonderviszt F., Kumasaka Т., Yamamoto M., Namba K. Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling //Nature. -2001. V. 410. - P. 331-337.

73. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

74. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.

75. Samuel M.A., Hall H., Krzymowska M., Drzewiecka K., Hennig J., Ellis B.E. SIPK signaling controls multiple components of harpin-induced cell death in tobacco // Plant J. -2005.- V. 42. No 3.-P. 406-416.

76. Schiene-Fischer, and C., Yu, C. Receptor accessory folding helper enzymes: the functional role of peptidyl prolyl cis/trans isomerases.// FEBS Lett. -2001. V. 495 - P. 1-6.

77. Schisler D.A., N.I. Khan, M.J. Boehmc, P.E. Lipps, P.J. Slininger, S. Zhang. Selection and evaluation of the potential of choline-metabolizing microbial strains to reduce Fusarium head blight. // Biological Control- 2006. V. 39. - P. 497-506.

78. Schmid F.X., Freeh C., Scholz C. and Walter S. Catalyzed and assisted protein folding of ribonuclease T1. // Biol. Chem. -1996. V. 377 - P.417-424.

79. Siddiqui I., Shaukat S. Rhizobacteria-mediated induction of systemic resistance (1SR) in tomato against Meloidogyne javanica. III. Phytopathol. -2002-a.-V.150.-P. 469^473.

80. Siekierka J.J., Staruch M.J., Hung S.H. and Sigal N.H. FK-506, a potent novel immunosuppressive agent, binds to a cytosolic protein which is distinct from the cyclosporine A- binding protein, cyclophilin.// J. Immunol. -1989. V. 143 - P.l580-1583

81. Tabashnik B.E. Breaking the code of resistance. // Nat. Biotechnol. 2001.- V. 19.-P. 922

82. Tavladoraki P, Benvenuto E, Trinca S, De Martinis D, Cattaneo A, Galeffi P. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack.//Nature.-l993.- V366(6454)-P.469^172.

83. Terras, F.R.G., Torrekens, S., Van Leuven, F., Broekaert, W.F. A six cysteine type thionin from the radish storage organ displays weak in vitro antifungal activity against Fusarium culmorum. //Plant Physiol. Biochem.-1996.- V.34.-P. 599-603.

84. Thieringer H A, Jones P G, Inouye M. Cold shock and adaptation. // Bioessays-1998. -V.20. -P.49-57.

85. Vaeck M., Reynaerts A., Hofte H., Jansens S., de Beuckleer M., Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature. 1987. -V.328.-P. 33-37.

86. Van Gijsegem F., Vasse J., Camus J.C., Marenda M. and Boucher C. Ralstonia solanacearum produces hrp-dependent pili that are required for PopA secretion but not for attachment of bacteria to plant cells // Mol. Microbiol. 2000. - V. 36. - P. 249-260.

87. Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2000. V. 271- P. 54-58.

88. Viaud Muriel C., Balhadere Pascale V. and Talbot Nicholas J. A Magnaporlhe grisea cyclophilin acts as a virulence determinant during plant infection.// The Plant Cell.-2002.-Vol. 14.-P. 917-930.

89. Vucich, V.A. and Gasser, C.S. Novel structure of a high molecular weight FK506 binding protein from Arabidopsis thaliana.ll Mol. Gen. Genet. 1996. -V.252. -P. 510-517.

90. Wang P., Cardenas M.E., Cox G.M., Perfect J.R., and Heitman J. Two cyclophilin A homologs with shared and divergent functions important for growth and virulence of Cryptococcus neoformans. // EMBO Rep. 2001. -V. 2. -P. 511-518.

91. Wang T, Li BY, Danielson PD, Shah PC, Rockwell S, Lechleider RJ, Martin J, Manganaro T, The immunophilin FKBP12 functions as a common inhibitor of the TGF family type I receptors. // Cell 1996. - V.86. - P.435-444.

92. Wang X.; Bunkers G.J. Potent Heterologous Antifungal Proteins from Cheeseweed (Malva parviflora) // Biochemical and Biophysical Research Communications-2000.-V. 279-N.2-P. 669-673.

93. Watashi K., Ishii N., Hijikata M., Inoue D., Murata Т., Miyanari Y., and Shimotohno K. Cyclophilin В is a functional regulator of hepatitis С virus RNA polymerase. // Molecular Cell-2005.-V. 19.-P. 111-122.

94. Waterfield N.R., Bowen D.J., Fetherston J.D., Perry R.D., ffrench-Constant R.H. The tc genes of Photorhabdus: a growing family. // Trends Microbiol. -2001.-V. 9.- P. 185-191.

95. Wei Z.M., Laby R.J., Zumoff C.H., Bauer D.W., He S.Y., Collmer A. and Beer S.V. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwiniaamylovora H Science. 1992. - V. 257. - P. 85-88.

96. Wei Z.-M., Qiu D., Kropp M.J. and Schading R.L. Harpin, an HR elicitor, actives both defense and growth systems in many commercially important crops // Phytopathology. -1998.-V. 88.-P. 96.

97. Yamanaka K, Fang L., Inouye M. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation // Molecular Microbiology. 1998. - V. 27. - № 2. - P. 247-254.

98. Yang Xingyong, Xiao Yuehua, Wang Xiaowen, and Pei Yan Expression of a Novel Small Antimicrobial Protein from the Seeds of Motherwort (Leonurus japonicus) Confers Disease Resistance in Tobacco // Appl. Environ Microbiol 2007. - V.73 -1.3. - P.939-946.

99. Youle RJ and Huang AHC, Occurrences of low molecular weight and high cysteine containing albumin. Storage proteins in oilseeds of diverse species.// Am J Bot -1981-V.68.- P. 44-48.

100. Автор глубоко признателен своей дорогой маме, М.В. Приданникову и друзьям за моральную под держку и понимание.

Информация о работе

Шумилина, Дарья Владимировна
кандидата биологических наук
Большие Вяземы, 2007
ВАК 06.01.11

Диссертация

Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы