Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и стабильности белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вирионов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и стабильности белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вирионов"

На правах рукописи

НЕМЫХ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И СТАБИЛЬНОСТИ БЕЖА ОБОЛОЧКИ Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ В СВОБОДНОМ СОСТОЯНИИ И В СОСТАВЕ ВИРИОНОВ

03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

□ Ü344GÜOE3

003446889

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе физических методов измерений НИИ физико-химической биологии имени АН Белозерского Московского государственного университета имени М В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Чирков Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор Левицкий Дмитрий Иванович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им Академиков М.М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится 2008 года в У-/ часов на заседании

Совета Д 501.001 76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 40, НИИ физико-химической биологии имени А.Н Белозерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан <«££»

года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук —И А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Потексвирусы представляют собой особую группу среди всех вирусов растений. Несмотря низкую стабильность вирионов, многие вирусы этой группы накапливаются в растениях в очень больших количествах, уступая в этом отношении, наверное, только вирусу табачной мозаики (ВТМ)

Кроме того, потексвирусы (как и другие гибкие вирусы растений) не поддаются исследованию современными методами структурного анализа, такими как ядерный магнитный резонанс, дифракция рентгеновских лучей на нитях и криоэлектронная микроскопия Поэтому, несмотря на то, что репликация потексвирусов в зараженных клетках изучена в степени недоступной для большинства других групп вирусов растений, о тонкой структуре частиц потексвирусов и их свободных белков оболочки известно немного

Все это в полной мере относится к типовому представителю данной 1руппы - Х-вирусу картофеля (ХВК) Кроме того, белок оболочки (БО) ХВК обладает немалым числом собственных аномалий Среди них можно назвать аномальную электрофоретическую подвижность и аномальные гидродинамические свойства БО (Koenig, 1972, Goodman, 1975), неспособность осаждаться в изоэлектрической точке и формировать вирусоподобные спиральные агрегаты (Новиков и др, 1972; Goodman, 1975) и ряд других особенностей

Несколько лет назад было показано, что субъединицы БО ХВК в составе вириона могут находиться в двух разных функциональных состояниях «покоящемся» (когда внутривирусная РНК не способна к трансляции) и «активированном» (когда РНК приобретает способность к трансляции in vivo и т vitro после взаимодействия 5'-конца вириона с вирус-специфическим белком ТБ1) Переход вириона в активированное состояние («ремоделирование») сопровождается дестабилизацией всей вирусной частицы (Atabekov et al, 2000, Rodionova et al, 2003) Вероятно, способность субъединиц БО ХВК к существованию в вирионах в нескольких разных состояниях должна приводить к повышенной структурной

Список сокращений. ВТМ - вирус табачной мозаики, ХВК - Х-вирус картофеля, БО - белок (" оболочки, АВК - А-вирус картофеля, Ат - оптическая плотность при 320 нм, ,Д .

ДЛС ~ динамическое лазерное светорассеяние, ДСК - дифференциальная сканирующая ( V калориметрия, КД - круговой дихроизм, ДСН - додецилсульфат натрия, у :

ЦТАБ-цетилтриметиламмонийбромид

лабильности этого белка как т situ, так и в свободном состоянии Трансляционная активация может вызываться также фосфолирированием внутривирусного БО ХВК (Atabekov et al., 2001) Какие именно структурные перестройки происходят в субъединицах БО ХВК при трансляционной активации, остается неизвестным Данная ситуация делает необходимым получение информации о структуре свободного и внутривирусного БО ХВК с помощью всех доступных подходов Этого же требуют и широко обсуждаемые в последние годы перспективы использования ХВК (и других потексвирусов) в различных нанотехнологических разработках типа антигенного дисплея, экспрессии целевых белков и целого ряда других вариантов

Одним из таких подходов является сравнительное изучение действия различных разупорядочивающих агентов на свободный и внутривирусный БО ХВК с помощью максимально широкого набора методов

В ходе этой работы нами было обнаружено, что инкубация вирионов ХВК при -20 °С в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,5 приводит к резкому понижению их стабильности Понижение стабильности, по всей вероятности, определяется некой структурной перестройкой, претерпеваемой внутривирусным БО в этих условиях Результаты исследования дестабилизации вирионов ХВК при -20 °С и данные о ремоделировании, о которых говорилось выше, побудили нас модифицировать предложенную в 1992 году (Baratova et al, 1992) модель трехмерной структуры субъединиц БО ХВК в составе вирионов

Целью данной работы было сравнительное изучение структуры и стабильности изолированного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать действие различных разупорядочивающих агентов на вирионы ХВК и его изолированный БО.

2 Исследовать влияние инкубации при отрицательной температуре на стабильность вирионов ХВК по отношению к действию различных агентов

3 Предложить модифицированный вариант модели БО ХВК в составе вирионов

Научная новизна. Исследовано действие нагревания и действие

детергентов двух разных групп на свободный БО ХВК и БО в составе вирионов

Показано, что при комнатной температуре субъединицы БО ХВК в растворе

обладают фиксированной третичной структурой, но эта структура является весьма

нестабильной, и разрушается уже при 35 °С или под действием низких (24-40 мкМ)

2

концентраций анионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) или катионного детергента цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) В то же время, при таких воздействиях вторичная структура молекул свободного БО ХВК не изменялась Включение субъединиц БО в состав вирионов приводило к резкому повышению их стабильности по отношению к нагреванию и действию детергентов

Обнаружено, что двухчасовая инкубация при -20 °С в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5 приводит к переходу цельных вирионов ХВК в дестабилизированное состояние, в котором они разрушаются низкими (миллимолярными) концентрациями LiCl и СаС12 (но не NaCl) БО, освобождающийся из вирионов ХВК при совместном действии низкой температуры и LiCl или СаС12, ни по каким из исследованных гидродинамических характеристик, ни по оптическим свойствам не отличался от обычных препаратов свободного БО. Действие температуры -20 °С на вирионы ХВК в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5 являлось полностью обратимым после прогрева от -20 °С до +4 СС или до комнатной температуры вирионы ХВК по всем исследованным критериям не отличались от исходного вируса Такое необычное действие инкубации при -20 °С специфично для ХВК ВТМ не подвергался дестабилизации в аналогичных условиях

Обсуждается возможный механизм дестабилизации структуры вирионов ХВК при -20 °С и их разрушения низкими концентрациями LiCl и СаС12, но не NaCl

Предложена модифицированная модель трехмерной структуры субъединиц БО ХВК в составе вирионов, сходная с ранее предложенной моделью БО А-вируса картофеля (АВК), принадлежащего к другой группе нитевидных вирусов - группе потивирусов (Baratova et al, 2001). Согласно модифицированной модели субъединица БО ХВК т situ состоит из двух отдельных доменов - пучка из четырех а-спираяей и так называемого РНП-фолда с пристыкованным к нему ррсх сегментом Новый двухдоменный вариант модели структуры БО ХВК в составе вириона позволяет лучше объяснить высокую лабильность структуры свободных молекул БО и обнаруженные структурные перестройки частиц этого вируса (ремоделирование и «-20 °С эффект»)

Практическая значимость работы Многие из потексвирусов (включая

ХВК) являются важными патогенами для большого числа видов культивируемых и

дикорастущих растений Поэтому цивилизованное растениеводство невозможно без

разработки методов диагностики потексвирусных инфекций и борьбы с ними Знание

3

структуры и механизмов репликации вирусов является необходимым условием успеха в такой борьбе Однако в настоящее время дело уже не ограничивается этими очевидными соображениями В силу целого ряда причин именно потексвирусы на сегодня представляются оптимальным объектом для различных нанотехнологических разработок, таких как накопление и презентация антигенных пептидов и белков на поверхности вирионов или для относительно легкого и быстрого получения самых разных «посторонних» белков в зараженных или трансформированных растениях

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2006), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на III Международном симпозиуме под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва, Дубна, 2007), на XIX Зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), на Третьем европейском вирусологическом конгрессе (Нюрнберг, Германия, 2007), на Конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию со дня рождения С И Вавилова (Киев, Украина, 2007), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) Работа была апробирована на совместном заседании Учёного Совета Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ и Отдела физических методов измерений НИИ ФХБ им. А.Н Белозерского МГУ и на заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ

Публикации. По материалам исследования опубликовано 13 печатных

работ

Структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 12 таблиц и 35 рисунков Список литературы включает 169 литературных источника

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Действие нагревания и детергентов на структуру и стабильность изолированного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов.

Ранее методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было показано, что изолированный БО ВТМ полностью и необратимо денатурируется при 41 °С, тогда как температура плавления БО в составе вирионов ВТМ составляет 72 °С Методом КД-спектроскопии было показано, что фиксируемая денатурация БО ВТМ является частичной, поскольку сохраняется около 50% от исходного количества а-спиралей и эти а-спирали не «плавятся» вплоть до 90 °С (Orlov et al, 1998, Орлов и др, 2001) Поэтому мы решили начать нашу работу с изучения действия нагревания на ХВК и его БО с использованием того же набора методов.

Для определения термостабильности цельных вирионов ХВК и его БО, мы подвергали эти ДСК На рисунке 1 представлена кривая плавления БО ХВК в 10 мМ HEPES-NaOH рН 7,5. Как видно из рисунка, изолированный БО ХВК подвергался «плавлению» одним узким пиком с максимумом при всего 33,5 °С, калориметрической энтальпией Д#= 190 кДж/моль, ДТ= 6,4°С (кривая 1)

Включение субъединиц БО в состав вирионов приводило к существенному повышению температуры денатурации и энтальпии процесса. Из рисунка 1 видно (кривая 2), что температура плавления БО в составе вирионов ХВК составляет 64,0 °С, величина калориметрической энтальпии

Рис. 1. Кривые теплопоглощения 40 мкМ возрастает до 480 кДж/моль, а величина

изолированного БО ХВК (1) и вирионов _

ХВК (2) в 10 мМ HEPES-NaOH, РН 7,5 полуширины немного уменьшается (ДТ =

Скорость сканирования 1 град/мин 5,2 °С), что свидетельствует об

увеличении кооперативности процесса И в случае свободного белка и в случае вирионов, процесс денатурации являлся необратимым

Оказалось, что БО ХВК, как и БО ВТМ обнаруживает сильную склонность к термоиндуцированной агрегации даже в растворах с низкой ионной силой

Для изучения процесса термоиндуцированной агрегации БО ХВК и

5

20 30 40 50 60 70 80 f,° С

вирионов ХВК использовали ступенчатый прогрев На рисунке 2 представлена зависимость прироста Л32о препаратов ХВК и изолированного БО ХВК от температуры.

Как видно из рисунка, в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5 БО ХВК обнаруживал сильную склонность к агрегации при температурах, превышающих температуру плавления (~35 °С) При ступенчатом прогреве 8 мкМ БО ХВК температура, соответствующая 50% от максимального «поглощения» при 320 нм составляла 47 °С, а при температурах >55 °С наступала коагуляция белка, сопровождающаяся падением

величины А}2о При более высоких концентрациях (30 мкМ) агрегация БО происходила при еще более низких температурах (рис 2) Для 8 мкМ цельных вирионов ХВК агрегация носила некооператавный характер Температура соответствующая 50% прироста Л320 оказалось равной 60 °С, а коагуляция наступала только при температурах выше 80 °С Такая склонность БО ХВК к индуцированной нагреванием агрегации делает невозможным исследование его структуры с помощью оптических методов при температурах выше 40 °С

Молекула БО ХВК русского штамма ХВК (длиной 236 аминокислотных остатков) содержит пять остатков триптофана (65, 80, 134, 136, 147) и два остатка тирозина (103, 129) (Морозов и др , 1983) и поэтому является удобным объектом для изучения методами собственной флуоресценции и ближней КД-спектроскопии

В последние годы спектры КД белков в ближнем УФ-свете (250-300 нм) широко используются в качестве критерия сохранности третичной структуры белков БО ХВК отличается от большинства других белков отрицательными величинами КД в этой области (рис За). Разупорядочивание структуры белка приводило к уменьшению (отрицательной) интенсивности Температурная зависимость спектров кругового дихроизма БО ХВК в ближнем УФ-свете представлена на рисунке За Температура плавления по данному критерию (33 °С) оказалась близкой к

Рис. 2. Аморфная агрегация свободного БО ХВК и вирионов ХВК при нагревании в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5 Препараты при указанных температурах инкубировали в течение 15 минут (1) 8 мкМ БО ХВК, (2) 30 мкМ БО ХВК, (3) 8 мкМ ХВК

температуре плавления белка по данным ДСК Из рисунка За видно, что сигнал КД в этой области почти полностью исчезает уже при 35 °С.

Далее мы изучили влияние температуры на спектры КД БО ХВК в дальнем (198-250 нм) УФ-свете Такие спектры используются для оценки вторичной структуры белков Полученный нами спектр, свободного БО ХВК характерен для белков с высоким содержанием ос-спиралей (рис 36) Главный отрицательный максимум располагался при 208 нм ([0]го8 = -17100°), дополнительный -при 222 нм ([0]г22 = -10500°), точка перехода (Ло) - при 200 нм Величина содержания а-спиралей в свободном БО ХВК, определенная с помощью классической формулы Greenfield и Fasman (Greenfield & Fasman, 1969), равнялась 45 %.

Нагревание до 35-40 °С не приводило к существенным изменениям в дальнем спектре КД (рис 36) Из этого следует, что (как и в случае БО ВТМ) наблюдаемая денатурация является лишь частичной и затрагивает только третичную структуру субъединиц, не затрагивая их вторичной структуры При более высоких температурах измерить спектры дальнего КД БО ХВК не удается из-за сильной а1регации(см рис 2)

Изучение термической денатурации препаратов вирионов ХВК показало, что этот процесс является некооперативным и сопровождается агрегацией и коагуляцией вирусных частиц и свободного БО (рис 2), полученного в ходе их разрушения и осаждением РНК Это обстоятельство делает невозможным регистрацию структурных изменений происходящих в ходе денатурации БО в составе вирионов

Л, нм

Рис. 3. Температурная зависимость спектров КД в (а) ближнем и (б) дальнем УФ-свете препарата БО ХВК в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5. Концентрации белка 28 мкМ и 8 мкМ соответственно Препарат инкубировали при указанных температурах по 15 минут (а) - (1) 16 °С, (2) 20 °С, (3) 25 °С, (4) 30 "С, (5) 35 °С, (б) 40 °С, (7) 45 °С, (б) - (1) 25 °С, (2) 32 "С, (3) 38 °С

5

>о о

U

о я Н я а о а s

и Ч

0123456789 10 молярное соотношение

Кроме термической денатурации

нами также было проведено изучение

денатурации свободного БО ХВК и БО в

составе вирионов под действием детергентов

двух разных групп (анионного

додецилсульфата натрия (ДСН) и катаонного

цетшприметиламмонийбромида (ЦТАБ)).

Оказалось, что, как и по

отношению к температуре, третичная Рис. 4. Денатурация БО ХВК по действием „

ДСН и ЦТАБ в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 при структура свободного БО ХВК по данным

25 °С Процент денатурированного БО ближнего КД и спектров флуоресценции ХВК вычислялся из спектров КД в

ближнем и дальнем УФ-свете (1) Ает характеризуется низкой стабильностью и в

ЦТАБ, (2) А£578 ДСН, (3) [0]2о8 ЦТАБ, (4) охношении детергентов Для полного [®Ьо8 ДСН

разрушения третичной структуры БО оказалось достаточным присутствия трех молекул ЩАБ или пяти молекул ДСН (рис 4) При этом использование даже миллимолярных концентраций детергентов не приводило к каким-либо изменениям вторичной структуры белка Тот факт, что примерно одинаковые и очень низкие концентрации ДСН и ЦТАБ вызывают быстрое разрушение третичной структуры изолированного БО ХВК при комнатной температуре, говорит о том, что, внроятно, это разрушение происходит за счёт гидрофобного связывания хвостов трех - пяти молекул детергентов (12 и 16 углеводородных групп, соответственно) с каким-то гидрофобным сайтом (сайтами) на субьединице белка В любом случае ясно, что при столь низких концентрациях действие этих детергентов на БО ХВК никак не может быть связано с формированием мицелл

Для разрушения вирионов ХВК оказались необходимы значительно более высокие концентрации детергентов Полное разрушение препаратов ХВК при +25 °С происходило в присутствии 5,4 мМ ДСН, при этом спектры дальнего КД и флуоресценции препаратов приобретали форму и интенсивность, характерные для свободного БО Известно, что стабильность структуры вирионов ХВК обеспечивается как за счет гидрофобных (в основном белок-белковых) так и электростатических (в основном РНК-белковых) взаимодействий (Goodman, 1975, Goodman, 1977)

Таблица 1. Разрушение вирионов ХВК и ВТМ Механизм разрушения

под действием ЦТАБ Концентрации

препаратов ХВК и ВТМ 0,2 мг/мл вирионов ХВК под действием ДСН

вероятно основан на связывании хвостов молекул детергента с гидрофобными сайтами на молекулах белка В результате происходит нарушение гидрофобных

взаимодействий в вирионе и вирион разрушается

ЦТАБ разрушал вирионы ХВК при более низких концентрациях, чем ДСН Для полного разрушения частиц ХВК (как и вирионов ВТМ) оказалось достаточно 160 мкМ этого детергента Такое различие между катионным ЦТАБ и анионным ДСН в отношении разрушения ХВК связано с различиями в механизмах их действия Как известно ЦТАБ является агентом, эффективно осаждающим нуклеиновые кислоты (Zhu & Evans, 2006) В основе механизма действия ЦТАБ на частицы ХВК лежит вероятно высокое сродство катионов ЦТАБ к фосфатным группам РНК Исходя из полученных данных можно заключить, что оптимальным соотношением ЦТАБ с фосфатными группами РНК, при котором происходит разрушение вирионов является соотношение 4-4,5 1 Таким образом, при взаимодействии ЦТАБ с вирионами ХВК (и ВТМ) имеет место ослабление электростатических взаимодействий, участвующих в поддержании стабильность вириона. Также как и в случае ДСН спектр КД препарата ХВК после разрушения ЦТАБ (рис 5) идентичен спектру изолированного нативного БО

Таким образом, при использовании двух разных детергентов, действующих по различным механизмам, мы получаем препараты БО с одинаковой вторичной и третичной структурой, идентичной структуре БО, изолированного стандартным литиевым методом

В то же время спектр дальнего КД БО в составе вирионов (рис 5, кривая 1) резко отличается от спектра свободного белка (вклад РНК в спектр КД ХВК в области 198-250 нм крайне незначителен (Homer & Goodman, 1975) Величина отрицательного максимума [0]м8 У свободного белка оказываются почти в 2 раза выше, чем у белка в составе вирионов (-17100 и -9200 соответственно) Кроме того, второй отрицательный

препарат % от содержания в исходном образце

супернатант осадок

БО РНК БО РНК

ЦТАБ ХВК =10 1 40 15 45 56

ЦТАБ.ХВК = 20.1 67 0 30 62

ЦТАБ:ВТМ = 14 1 70 0 24 59

Супернатанты и осадки от центрифугирования при 15000 g 15 мин

пик в спектре цельного ХВК располагается при 228 нм, а не при 222 нм как у других белков, с высоким содержанием a-спиралей (рис 5)

Чем же может обуславливаться такое различие между дальними спектрами КД свободного БО ХВК и белка в составе вирионов? Нам представляется, что оно может иметь два возможных объяснения Первое сводится к тому, что наблюдаемые различия отражают действительно имеющее место резкое изменение вторичной структуры субъединиц БО при их переходе из состава вирионов в раствор. Если пользоваться формулой Greenfield и Fasman (Greenfield & Fasman, 1969), то содержание а-спиралей в молекулах БО в составе вирионов должно составлять всего 18% и увеличиваться до 45% при освобождении субъединиц в раствор Однако такое превращение не согласуется с резким уменьшением стабильности белка при его переходе в раствор Кроме того, остается не понятным, почему второй отрицательный максимум в спеюре внутривирусного белка располагается при 228 нм вместо обычных 222 нм

Поэтому нам представляется более вероятным другое предположение Ранее, в нашей лаборатории было показано (Арутюнян и др, 2001), что спектр КД вирионов ВТМ в дальнем ультрафиолете имеет вид, характерный для ß-структурных белков, хотя по данным рентгено-структурного анализа, этот белок и в свободном состоянии, и в составе вириона содержит около 50 % a-спиральных участков и всего около 5 % ß-струкгуры (Namba et al, 1989) Значит, дальний спектр КД вирионов ВТМ имеет искаженную природу Это искажение связанно либо с дифференциальным рассеянием право- и лево-поляризованного света, либо с взаимодействием между a-спиральными пучками плотно упакованных соседних субъединиц (Арутюнян и др, 2001) Сдвиг второго отрицательного максимума с 222 к 228 нм и сильно уменыпанная интенсивность обоих пиков (208 и 228 нм) у вирионов ХВК по сравнению со свободным БО заставляют предположить, что и в случае потексвирусов заметный вклад в дальний КД вносят искажения, связанные с

200 210 220 230 240 250

Л, им

Рис. 5. Спектры КД в дальнем УФ-свеге (1) цельного ХВК, (2) БО ХВК, выделенного литиевым методом и (3) БО ХВК, выделенного ЦТАБ в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5 Концентрации препаратов 8 мкМ

наличием светорассеяния и/или межъсубъединичных взаимодействий в цельных вирусных частицах

Сравнивая результаты действия детергентов на свободный и внутривирусный БО можно заключить, что, так же как и по отношению к нагреванию, свободный БО ХВК обладает низкой стабильностью по отношению к детергентам БО в составе вирионов ХВК, обладают более стабильной структурой, в поддержании которой важную роль играют межсубъединичные белок-белковые и РНК-белковые взаимодействия

Точно такие же результаты были нами получены и для БО ХВК, выделенного ацетатным методом (Бгаепке1-Сопга1, 1957, Тоггнп й а1, 1994) Это обстоятельство свидетельствует о том, что независимо от способа выделения БО ХВК характеризуется некой фиксированной, но нестабильной третичной структурой

Таким образом, результаты проведенных экспериментов по действию разупорядочивающих агентов на изолированный БО ХВК и БО в составе вирионов показывают, что включение субъединиц БО в состав вирионов ХВК приводит к существенной стабилизации их структуры как по отношению к нагреванию, так и по отношению к действию детергентов В наибольшей мере это относится к третичной структуре молекул, которая сильно дестабилизируется после выхода субъединиц из вирионов В то же время вторичная структура (и прежде всего а-спиральные участки) белка сохраняют высокую стабильность и после освобождения из вирионов а-спиральные участки БО ХВК не разрушаются даже высокими концентрациями детергентов Такое сочетание лабильной укладки и стабильной вторичной структуры, вполне может являться структурным основанием способности этого белка находиться в составе вирионов в двух разных состояниях

Дестабилизация частиц ХВК при -20 °С.

Обычно для выделения БО ХВК из вирионов применяют классический солевой метод (Атабеков, 2002) сводящийся к инкубации вирионов при -20 °С с >2 М 1лС1 в течение 5 часов с последующим центрифугированием и диализом В ходе изучения действия различных концентраций 1ЛС1 на вирионы ХВК при -20 °С мы обнаружили, что разрушение вирионов происходит и при существенно более низких концентрациях этой соли. Инкубация препаратов интактных вирионов ХВК в 10 мМ

Трис-НС1 рН 7,5 при -20 °С, приводит к довольно быстрому (за 2 часа) изменению их струиуры, делающему их чувствительными к разрушению (при -20 °С) при разных весьма слабых воздействиях

За процессом разрушения вирионов мы наблюдали с помощью нескольких методов. Хорошо известно, что разрушение вирионов ХВК сопровождается значительными изменениями спектра собственной флуоресценции (300-400 нм) и спектров ближнего (250-300 нм) и дальнего (200-250 нм) КД Если не происходит вторичной аморфной агрегации, освобожденного из вирионов БО, то это разрушение сопровождается сильным падением светорассеивающей способности, приводящим к резкому (иногда почти до нуля) уменьшению кажущегося поглощения при Л>310 нм Также, цельные (но не разрушенные) вирионы ХВК полностью осаждаются 90-минутным центрифугированием при 105000 Кроме того, если в ходе разрушения вирионов происходит полное или частичное осаждение Б О или РНК, это хорошо видно на спектрах поглощения Также, для котроля за разрушением вирионов ХВК, мы использовали метод ДСК и метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

Препараты ХВК инкубировали при -20 0 в присутствии или отсутствии 1лС1 и затем подвергали размораживанию при +4 °С или +25 °С и центрифугировали при 18000 g. Осадки ресуспендировали в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5 и измеряли спектры истинного поглощения с использованием метода экстраполяции (Ксенофонтов и др, 2006), КД и флуоресценции супернатантов и осадков при комнатной температуре. В некоторых случаях супернатанты от 18000 g подвергали центрифугированию при 105000 g в течение 90 минут и вновь измеряли спектры истинного поглощения супернатантов 2 и осадков 2

Следует отметить, что при центрифугировании при 18000 g препаратов интактного вируса большая часть материала остается в супернатанте, но 15-18% подвергается осаждению, что является обычным для препаратов ХВК Компоненты разрушенного ХВК в обычных условиях не осаждаются при 18000 g, но если либо свободная РНК, либо БО формируют крупные агрегаты, то они осаждаются в этом режиме. При высокоскоростном центрифугировании при 105000 § к осаждению способны только цельные вирионы, разрушенные частицы остаются в супернатанте В таблицах цифра 1 в случае супернатантов и осадков соответствует

низкоскоростному центрифугированию, цифра 2 - высокоскоростному центрифугированию, содержание РНК и белка в супернатанте 2 и осадке 2 рассчитывались в процентах к супернатанту 1.

В многочисленных экспериментах такого рода мы наблюдали, что двухчасовая инкубация препаратов ХВК при -20 °С с 1ЛС1 в концентрациях от 50 мМ до 3 М приводит к полному разрушению вирионов (рис. 6, 7) до свободных БО и РНК. При концентрациях 1ЛС1 >1 М освобождающаяся из вирионов РНК осаждалась

Инкубация

вирионов ХВК в растворе с

низкой ионной силой (10 мМ

Трис-НС1 рН 7,5) в

отсутствие ПС1 или других

добавок при -20 °С не

приводила к их разрушению.

Даже продолжительная (в

течение месяца) инкубация

препаратов ХВК при -20 °С

в этом буфере не вызывала

каких-либо изменений в

спектрах КД и собственной

флуоресценции или в

поведении частиц при

ультрацентрифугировании.

Но при добавлении к вирионам низких концентраций 1ЛС1 (50 мМ) или СаСЬ (25 мМ)

и последующей двухчасовой инкубации при -20 °С наблюдалось полное разрушение

вирусных частиц (рис. 6, 7, таблица 2).

Разборка вирионов ХВК при -20 °С наблюдалась и в 3 М 1лС1 (таблица 2),

где вирусные суспензии не замерзают, то есть образование льда не является

необходимым условием для разрушения.

В то же время, инкубация препаратов ХВК в течении двух часов при +4 °С

или при +25 °С в присутствии 1дС1 или СаС12 в различных концентрациях (от 25 мМ

до 2 М) не вызывала разрушения (рис. 6, 7, таблица 2). Эти данные свидетельствуют о

13

______ __

при низкоскоростном центрифугировании (таблица 2).

-20000 ь—--'---'—'—'—*—'—-—^

200 210 220 230 240 250

Л, нм

Рис. 6. Спектры КД в дальнем УФ свете 8 мкМ ХВК после двухчасовой инкубации при -20 °С (+4 °С) и центрифугирования при 18000 £ в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5 в присутствии разных концентраций 1лС1, №С1, СаС12. (1) - ХВК, (2) - ХВК+50 мМ ЫС1, (3) - ХВК+1 М 1ЛС1, (4) -ХВК+1 М 1лС1 (+4 °С), (5) - ХВК+1 М №С1, (6) - ХВК+50 мМ СаС12, (7) БО ХВК.

том, что необходимым условием разрушения вирионов является совместное действие двух факторов - температуры -20 °С и присутствие соответствующих концентраций LiCl или СаС12

Следует также сказать, что процесс дестабилизации вирионов в 10 мМ Трис-HCl pH 7,5 при -20 °С в отсутствие добавок являлся полностью обратимым по всем использованным нами критериям КД спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия и спектры поглощения Иными словами, вирионы ХВК подвергшиеся длительной инкубации при -20 °С в отсутствие LiCl после прогревания до +4 °С или +20 °С ни по одному из исследованных нами параметров не отличались от интактных вирионов

Использование NaCl вместо LiCl или СаС12 в концентрациях от 50 мМ до 2 М не приводило к разрушению вирионов при -20 °С (рис 6, кривая 5) Кроме того данный эффект специфичен к ХВК' двухчасовая инкубация вирионов ВТМ при -20 °С в

присутствии LiCl или СаС12 рис. 7. Спектры собственной флуоресценции 8 мкМ

не вызывала каких-либо вирионов ХВК после двухчасовой инкубации при -20 °С

или +4 °С в 10 мМ Трис-HCl pH 7,5 в присутствии изменений в их структуре различных концентраций LiCl (I) ХВК, (2) ХВК+50 мМ

LiCl, (3) ХВК+250 мМ LiCl, (4) ХВК+1 М LiCl, (5) Хорошо известно, ХВК+1 М LiCl (+4 °С), (б) изолированный БО ХВК

что понижение температуры

приводит к существенному ослаблению гидрофобных взаимодействий Вероятно, общая стабильность вирионов ХВК при -20 °С уменьшается до такой степени, что небольших концентраций LiCl или СаС12 оказывается достаточным для разрушения остаточных электростатических взаимодействий

Специфичность действия ионов Li+ и Са2+, вероятно, может объясняться их способностью к сильному взаимодействию с фосфатными группами РНК Давно известно, что 2 М LiCl осаждает свободные РНК (Colowick & Kaplan, 1968). Ионы Na+, вероятно, взаимодействуют с молекулами РНК не так сильно 2М NaCl не

14

Таблица 2. Разрушение вирионов ХВК в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5 после двухчасовой инкубации при -20 СС в присутствии 1лС1 или СаСЬ Процент РНК и БО рассчитывался из спектров истинного поглощения препаратов

№ препарат центрифугирование 18000 g центрифугирование 105000 g

супернатантI осадок I супернатант II осадок II

% РНК % БО % РНК % БО %РНК % БО %РНК % БО

1 ХВК (2 часа) 84 84 15 15 0 0 100 100

2 ХВК (месяц) 83 83 16 16 0 0 100 100

3 +50 мМ LiCl 96 96 4 4 75 75 7 7

4 +250 мМ LiCl 91 91 5 5 94 94 5,5 5,5

5 +IML1CI 0 100 100 0 0 100 0 0

6 +3MLiCl* 0 100 100 0 0 100 0 0

7 +50 mM СаС12 0 100 100 0 0 90 0 11

8 +2МСаС12 0 100 25** 0 0 91 0 7

* Замерзания препаратов не происходило

** Большая часть РНК не растворялась в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5

вызывает осаждения свободных молекул РНК Возможно, в основе механизма разрушения вирионов ХВК при -20 °С LiCl и СаС12 (но не NaCl) лежит способность ионов Li+ и Са2+ конкурировать с внутривирусным БО за фосфатные группы РНК Более высокое сродство ионов Li+ и Са2+ к фосфатным группам РНК может объясняться в два раза более высокой плотностью заряда этих двух ионов по сравнению с ионами Na+ (Greenwood & Eamshaw, 1997) Различия в размере гидратной оболочки и в энтальпии гидратации, между Li+ и Са44, с одной стороны, и Na+ - с другой, также могут вносить вклад в наблюдаемый эффект

Таким образом, при понижении температуры до -20 °С гидрофобные (в основном белок-белковые) взаимодействия в частицах ХВК сильно ослабляются (а возможно, и полностью исчезают), и стабильность вирионов поддерживается только электростатическими взаимодействиями каких-то остатков аргинина/лизина вирионного белка с фосфатными группами РНК. Катионы 1л+ и Са^ (но не Na+) даже в низких концентрациях успешно конкурируют с Arg/Lys за эти группы, что и приводит к разборке вирионов ХВК

Инкубация препаратов ХВК при -20 °С приводила к их дестабилизации также и по отношению к ДСН Выше говорилось, что ХВК разрушается при комнатной температуре ДСН в концентрации 5,4 мМ. Оказалось, что при -20 °С ДСН оказывает на вирионы ХВК более сильный разрушающий эффект, чем при комнатной

температуре В этих условиях вирионы ХВК полностью разрушались в присутствии 1 мМ ДСН Таким образом, при -20 °С происходит дестабилизация вирионов ХВК не только по отношению к определенным катионам, но и к другим агентам, действующим, вероятно, по другим механизмам

Нами также были изучены свойства БО ХВК, освобожденного из вирионов после их двухчасовой инкубации при -20 °С с различными концентрациями LiCl или СаС1г. Для этого нами были измерены спектры КД (рис б) и собственной флуоресценции (рис. 7) препаратов разрушенного вируса и проведено их сравнение со спектрами БО ХВК, выделенного стандартным методом (с использованием 2 М LiCl) По данным всех исследованных методов, БО ХВК, полученный в результате двухчасовой инкубации при -20 "С в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5 с низкими концентрациями LiCl, обладал вторичной и третичной структурой, идентичной структуре БО, выделенного стандартным методом

Кроме того, нами были измерены размеры молекул БО ХВК и вирионов ХВК в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5 при помощи метода ДЛС Результаты измерений такого рода характеризовались хорошей

воспроизводимостью (рис 8) Полученная величина гидродинамического диаметра Д, для свободных молекул БО ХВК (7,0 нм) оказалась существенно выше, чем предполагаемая величина Д, для глобулярного белка длиной в 236 аминокислотных остатков, но точно совпадала с результатом, полученным Goodman еще в 1975 году (Rh = 3,5 нм). Следует также сказать, что измеренная нами величина константы седиментации БО ХВК оказалась равной 2,5 S, что также превышает величины характерные для глобулярного белка с молекулярной массой 25 кД Ранее

1000 10000

2)ь,нм

Рис. 8. Размер частиц ХВК, БО ХВК и препаратов ХВК, инкубировавшихся при -20 СС или +4 °С в присутствии 1лС1, измеренный ДЛС (1) ХВК, (2) ХВК+50 мМ 1лС1, (3) ХВК+1 М 1лС1, (4) ХВК+1 М 1лС1 (+4 °С), (5) интактный ХВК, (б) нативный БО ХВК

эти аномалии объясняли либо частичным формированием димеров, либо развернутой структурой молекул БО ХВК. Мы склоняемся ко второму объяснению В настоящее время появилось большое количество работ, посвященных так называемым природно-развернутым белкам (Receveur-Brechot et al, 2006, Сердюк, 2007), определяющей характеристикой которых являются необычные гидродинамические свойства и пониженная компактность третичной структуры Такие же свойства присущи и БО ХВК Кроме того, программа предсказания разупорядоченных участков белковой молекулы FoldUnfold (httpV/skuld protres ru/~mlobanov/ogu/ogu cgi) предполагает наличие трех разупорядолченных областей у свободного БО ХВК -остатки 1-29, 144-156, 180-191 В сумме разупорядоченные участки составляют 25% от общей длины полипептидной цепи этого белка Мы полагаем, что необычно высокие величины константы седиментации и гидродинамического радиуса молекул БО ХВК и другие аномалии поведения этого белка объясняются тем, что несмотря на высокий процент a-спиральных участков (45%) изолированный БО ХВК принадлежит к особой группе природно-развернутых белков

Как видно из рисунка 8, размер молекул БО ХВК, полученных путем инкубации вирионов при -20 °С с низкими концентрациями LiCl, был равен 7 нм, как и в случае БО, выделенного стандартным методом

Измеренная нами с помощью ДЛС величина гидродинамического диаметра А, цельных вирионов ХВК оказалась равной -50 нм На самом деле длина частицы ХВК составляет 515 нм, а диаметр 13 нм Несоответствие определяется гибкой нитевидной структурой частиц ХВК, тогда как программное обеспечение метода ДЛС предназначено для более или менее сферических объектов Тем не менее, величина в 50 нм оказалась хорошо воспроизводимой, для всех использованных нами препаратов ХВК Поэтому данный критерий мы могли использовать для оценки целостности препарата

С помощью метода КД-спекгроскопии также было изучено действие высоких концентраций LiCl, СаСЬ и NaCl на свободные БО ХВК и ВТМ при комнатной температуре Обнаружено, что LiCl в концентрациях до 2 M практически не влияет ни на третичную, ни на вторичную структуру БО ХВК Однако, при более высоких концентрациях LiCl происходит сильное падение величины [0]2os (рис. 9а), а величина [©]г7з стремится к нулевому значению (рис 96), то есть наблюдается

параллельное разрушение вторичной и третичной структуры БО ХВК. Полное разрушение третичной структуры БО ХВК происходило в 5 М 1ЛС1, а вторичная структура разрушалась почти на 50% (при этом величина [®]2о8 выходит на плато на уровне -10000 0 против -17000 0 для исходного белка) (рис. 9а). Аналогичное действие оказывал и СаС12, но при более низких концентрациях. Так, для полного разрушения третичной структуры БО ХВК было достаточно 2 М СаС12 (рис. 96). Таким образом, высокие концентрации 1лС1 или СаС12 является первыми агентами, вызывающими разрушение (пусть и неполное) сс-спиральных участков свободного БО ХВК, в отсутствие агрегации или других каких-либо нежелательных эффектов. Кроме того, оказалось, что в отличие от ситуации, наблюдающейся для цельных вирионов при -20 °С, данный эффект не является специфическим для 1лС1 и СаС12: высокие концентрации ИаС1 также вызывали денатурацию БО ХВК. Эти результаты подтверждают наше предположение о существенных различиях в структуре внутривирусного и свободного БО ХВК. Более того, оказалось, что такое же разрушение вторичной структуры высокие концентрации 1ЛС1 и ЫаС1 вызывают и в случае свободного БО ВТМ (рис. 9а). Следует напомнить, что вирионы ВТМ не разрушаются 1лС1 при -20 °С.

Новый вариант трехмерной структуры БО ХВК как объяснение структурных перестроек.

В 1992 году была предложена модель пространственной организации БО ХВК в составе вирионов (Вага1дуа е1 а1., 1992), а в 2001 году - модель третичной

I -10000

" -15000

-20000

0 -20

с -40

й

ЦТ -60 -80 -100

б 1 / 3 / -^4

-? ___* -о- 5

I . '

0 1

2 3 [соль]

Рис. 9. Денатурация БО ХВК и БО ВТМ под действием высоких концентраций солей при 25 °С в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5. (а) - дальний УФ-свет ([©Ьов), (б) -ближний УФ-свет ([©]273), концентрации белков 0,2 мг/мл и 0,7 мг/мл, соответственно. (1) - БО ХВКШС1, (2) - БО ВТМ+1ЛС1, (3) - БО ХВК+СаС12, (4) - БО ХВК+№С1, (5) -БО ВТМ+ЫаС1.

структуры БО в составе частиц представителя другой группы нитевидных вирусов растений (потивирусов) - А-вируса картофеля (АВК) (ВагаЮуа е1 а1., 2001), состоящая из двух доменов. Концепция ремоделирования вирионов ХВК (ЯосЦопоуа й а!., 2003) и полученные нами в данной работе результаты подтолкнули нас к модификации модели БО ХВК, предложенной в 1992 году в сторону двухдоменной структуры. В соответствии с модифицированной моделью в молекуле БО ХВК предполагается существование семи а-спиральных участков: а1 (25-34), а2 (40-51), аЗ (55-70), а.4 (72-102), а5 (109-135), аб (157-175) и а7 (206-220) и шести (3-тяжей: (51 (1-8), возможно, р2 (15-22), рЗ(145-152), (34 (185-191), Р5 (195-202) и рб (228-234). Подавляющее большинство этих элементов вторичной структуры совпадает с соответствующими участками, предсказанными в модели 1992 года (ВагаШуа е1 а1., 1992), но их взаимное расположение оказывается иным и близким к модели БО потивируса (Вага1оуа е1 а!.. 2001).

Рис. 10. Схематическое изображение пространственной организации субъединиц БО ХВК в составе вирионов. Длинная ось вириона располагается вертикально справа, а-спирали представлены как цилиндры, Р-тяжи - как стрелки, начала и концы а-спиралей и Р-тяжей пронумерованы; петли 35-39 и 136-144 выделены более ярко; обозначены Ы- и С-концы полипептидной цепи.

Предлагаемая модель третичной структуры БО ХВК в составе вириона выглядит следующим образом (рис.10). Вблизи оси частицы располагается типичный пучок из четырех а-спиралей, образованный а-спиралями а2 и аЗ (верхняя пара) и а4 и а5 (нижняя пара). Этот домен связан неструктурированной петлёй 136-144 с хорошо известным РНП-фолдом со структурой раррсс (этот фолд называют также

RRM, RBD или abCd) В нашем случае РНП-фолд образован участками 145-152 (ß3), 157-175 (аб), 185-191 (ß4), 195-202 (ß5) и 206-220 (сс7) (рис 10) Сбоку к нему прилегает ßßa сегмент, сформированный остатками 1-8 (ßl), 228-234 (ß6) и 25-34 (al) Спираль al ßßa сегмента соединяется со спиралью а2 четырехспирального пучка через петлю 35-39 Возможно, ß-тяж формирует и участок 15-22 (ß2?), соединенный с ßl (рис 10)

Следует отметить, что предложенная нами модифицированная модель структуры БО ХВК в составе вириона гораздо лучше согласуется с результатами оптических исследований последних лет (Shanmugam et al, 2005; Zhu et al, 2006) В то же время содержание а-спиралей во внутривирусном БО ХВК по модифицированной модели (55%) оказывается большим, чем рассчитанное нами из данных КД для свободного белка Поэтому мы не исключаем, что структура выделенного всеми использовавшимися нами методами БО ХВК в растворе может отличаться от его структуры в вирусных частицах.

Модифицированная модель струюуры БО ХВК предполагает существование у этого белка ВТМ-подобного пучка их четырех а-спиралей, наличие которого ранее постулировалось рядом авторов (Sawyer et al, 1987; Shukla & Ward, 1989). Пучок из четырех а-спиралей обычно представляет собой весьма стабильную структуру. Однако а-спиральный пучок свободного БО ВТМ характеризуется низкой стабильностью (Тт = 41 °С) (Rafikova et al, 2003) Причиной этого является наличие больших гидрофобных «пятен» на поверхности молекул БО ВТМ (Namba et al, 1989) Эти гидрофобные участки необходимы БО ВТМ для взаимодействия с соседними субъединицами в составе вирионов (Butler, 1984) Поэтому представляется не слишком удивительным, что и нарушение третичной структуры четырехспирального пучка БО ХВК происходит при еще более низкой температуре (~ 35 °С).

Следует подчеркнуть, что и у потеке-, и у потивирусов в предлагаемых моделях общая длина субъединицы оказывается больше радиуса вирусной частицы Мы предполагаем, что в составе вирионов субъединицы либо имеют излом, либо уложены в вирионе под довольно большим углом к длинной оси вириона В последней работе лаборатории Stubbs (Kendall et al, 2007) сообщалось, что внешний диаметр частиц потексвирусов составляет 110 А, а не 130 А, как считалось на протяжении 40 лет и, что в вирионах потексвирусов имеется центральный канал

диаметром 40 А, существование которого ранее подвергалось сомнению Принимая во внимание эти результаты, мы не исключаем, что субъединица БО ХВК может быть уложена в виде «сэндвича» с РНП-фолдом, располагающимся над (или под) четырех-спиральным пучком. Отводимый по такой структуре радиус (55-20 = 35 А) и высота (шаг спирали в 34,5 А) субъединицы соответствуют приводимым Stubbs размерам вириона

Модифицированный вариант модели позволяет предложить возможный механизм ремоделирования вирионов ХВК Ремоделирование может осуществляться по механизму обмена доменами между субъединицами БО в составе вириона. Идеальным местом для такого обмена могли бы являться шарнир (остатки 136-144) между четырехспиральным пучком и РНП-фолдом и шарнир между четырехспиральным пучком и (ЗРсс-мотивом (остатки 35-39). Последовательность аминокислот БО ХВК в предполагаемых сайтах обмена доменами имеет вид i36WMLTNNSPPi44 и 35PDGDF39 и содержит два и один остаток Pro, соответственно. Последовательности остатками пролина часто являются местами, по которым происходит обмен доменами у белковых молекул (Bergdoll et al, 1997, Ding et al, 2006)

На основании всех полученных в ходе данной работы результатов можно заключить, что для изолированного БО ХВК характерно сочетание лабильной третичной и стабильной вторичной структуры. Включение субъединиц БО в состав вирионов приводит к резкому повышению их стабильности При -20 °С вирионы ХВК переходят в какое-то особое структурное состояние, в котором они утрачивают значительную часть своей стабильности и приобретают способность разрушаться низкими концентрациями солей и ДСН Предложенная двухдоменная модель структуры БО ХВК в составе вириона с одной стороны позволяет объяснить высокую лабильность структуры свободных субъединиц БО, а с другой - лучше согласуется с двумя группами данных о структурных перестройках в частицах этого вируса («ремоделирование» и «-20 °С эффект»)

выводы

1 Свободные субъединицы БО ХВК обладают фиксированной, но весьма нестабильной третичной структурой Разрушение этой структуры происходит под действием микромолярных концентраций детергентов (24-40 мкМ) или при незначительном повышении температуры (до 33 °С)

2 Вторичная структура изолированного БО ХВК характеризуется значительной стабильностью Из всех использованных нами разупорядочивающих агентов частичное разрушение а-спиралей вызывали только высокие концентрации хлоридов лития, натрия и кальция (2-5 М)

3 В составе вириона субьединицы БО ХВК характеризуются значительно более высокой стабильностью за счет возникновения межсубъединичных белок-белковых и РНК-белковых взаимодействий, как гидрофобной, так и электростатической природы

4 Инкубация вирионов ХВК при -20 °С (в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5) вызывает их обратимую структурную перестройку, приводящую к значительному понижению стабильности вирионов и появлению у них способности к разрушению низкими концентрациями солей и детергентов

5 Предложен вероятный механизм дестабилизации структуры вирионов ХВК при -20 °С и их разрушения низкими концентрациями хлористого лития и кальция.

6. Предложена модифицированная модель структуры БО ХВК в составе вириона Согласно этой модели субъединица БО ХВК in situ состоит из двух отдельных доменов - типичного пучка из четырех а-спиралей и РНП-фолда с присоединенной сбоку р Pa-единицей Предлагаемая модель лучше объясняет высокую лабильность третичной структуры свободного БО ХВК и структурные превращения, претерпеваемые этим белком в составе вириона

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Немых М А, Козловский В С «Изучение структуры белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вириона» Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Секция биология Москва, 12-15 апреля 2006, стр 165

2 Немых МА, Добров ЕН, Арупонян AM «Изучение структуры белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вириона» 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, 17-21 апреля 2006 Сборник тезисов, стр 115

3 М А Немых, Е Н Добров «Новые данные о стабильности вирионов Х-вируса картофеля и его белка оболочки». Тезисы докладов III международного симпозиума под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» Москва, Дубна, 24-28 января, 2007, стр 52-53

4 Немых МА, Добров ЕН «Стабильность Х-вируса картофеля и его белка оболочки действие разупорядочивающих агентов» Труды III международного симпозиума под эгидой ЮНЕСКО «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященного 100-летию со дня рождения академика Н. М. Сисакяна Дубна, 2007, стр. 174-178

5 Немых М А «Действие ионногенных ПАВ на частицы Х-вируса картофеля и его свободный белок оболочки» XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 7-9 февраля 2007 Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр 49

6. М.А. Немых, В.К. Новиков, А М Арутюнян, П.В. Калмыков, В.А Драчев, Е Н Добров «Сравнительное исследование стабильности структуры субъединиц белка оболочки Х-вируса картофеля в растворе и в составе вирусных частиц» Молекулярная биология, 2007, том 41, № 4, стр 697-705

7. ЕН Добров, МА. Немых, ЕВ. Лукашина, Л А Баратова, В А Драчев, A.B. Ефимов «Модифицированная модель струюуры белка оболочки Х-вируса картофеля» Молекулярная биология, 2007, том 41, № 4, стр 706-710

8 М A Nemykh, А V Efimov, Е N Dobrov "Low stability of free potato virus X coat protem subunits and a new model of their structure" Third European Congress of Virology. Nürnberg, Germany, September 1-5, 2007 Programme and Abstracts, p 57.

9 Е V Lukashina, М A Nemykh, N.V Fedorova, G A Badun, V К Novikov, O.V Karpova, NP Rodionova, LA Baratova, EN Dobrov "Search for structural alterations determining different functional states of coat protein m potato virus X virions" Third European Congress of Virology Nurnberg, Germany, September 1-5, 2007 Programme and Abstracts, p 59

10.Немых MA, Добров EH, Ефимов A.B «Изучение стабильности вирионов XBK при -20 °С и модифицированная модель его белка оболочки» III Российский симпозиум «Белки и пептиды» Пущино, 2007 Тезисы стендовых сообщений, стр 48

11 Nemykh MA "Incubation at -20 °C induces conformational transitions in Potato virus X virions". Conference for young scientists, Phd students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of MI Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine Abstract book, p 136

12 M A Nemykh, A V Efimov, V К Novikov, V N Orlov, A M Arutyunyan, V A Drachev, E V Lukashina, L A Baratova, E N Dobrov "One more probable structural transition in potato virus X virions and revised model of virus coat protein" Virology, 2008, volume 373, issue 1, pp. 61-71

13 Немых MA, Добров EH «Структурная перестройка вирионов Х-вируса картофеля при -20 °С» IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск, 2008 Тезисы докладов, стр 83

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, гранты 05-04-48745,05-04-49503

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 27 Об 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 80 экз Заказ 372 Тел 939-3890 Тел /Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Немых, Мария Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура потсксвпрусов

1.1. Общая характеристика потексвирусов

1.2. Структура вирионов потексвирусов

1.2.1. Изучение структуры ХВК и других потексвирусов методом „ 14 дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии

1.2.2, Изучение структуры ХВК оптическими методами

2. Структура и свойства белков оболочки потексвирусов

2.1. Первичная структура белка оболочки ХВК и посттрансляционные модификации

2.2. Протеолиз и аномальная электрофоретическая подвижность БО ХВК

2.3. Антигенные свойства ХВК и БО ХВК

2.4. Гидродинамические свойства БО ХВК

2.5. Оптические характеристики изолированного БО ХВК

2.6. Трехмерная модель БО ХВК в составе вириона

3. Реконструкция ХВК и ВМП

4. «Ремоделирование» вирионов ХВК

4.1. «Ремоделирование» вирионов ХВК под действием ТБ1 белка

4.2. Фосфолирирование БО ХВК и котрансляционная разборка

4.3. Роль N-концевого пептида в активации трансляции вирусной РНК

4.4. Механизм ближнего транспорта ХВК-инфекции 5) ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

2. Накопление и выделение вирионов ХВК

3. Накопление и выделение вирионов ВТМ

4. Выделение белка оболочки ХВК

5. Выделение белка оболочки ВТМ

6. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS

7. УФ-спектроскопия

8. Определение истинного поглощения светорассеивающих систем методом экстраполяции

9. Турбидиметрия

10. Флуоресцентная спектроскопия "

11. Спектроскопия кругового дихроизма

12. Аналитическое ультрацентрифугирование

13. Динамическое лазерное светорассеяние

14. Дифференциальная сканирующая калориметрия б

15. Изотермическая титрующая калориметрия 5 \

16. Инкубация вирионов ХВК-20 °С

17. Математические расчёты 52 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Действие нагревания на структуру и стабильность изолированного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов

1.1. Определение температуры денатурации БО ХВК в свободном состоянии и в составе вириона методом ДСК

1.2. Термоиндуцированная агрегация ХВК и его белка оболочки

1.3. Влияние нагревания на БО ХВК

1.4. Влияние нагревания на вирионы ХВК

2. Действие ионных детергентов на структуру и стабильность свободного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов

2.1. Анионный детергент ДСН

2.1.1. Действие ДСН на БО ХВК

2.1.2. Действие ДСН на вирионы ХВК

2.2. Катионный детергент ЦТАБ

2.2.1. Действие ЦТАБ на БО ХВК

2.2.2. Действие ЦТАБ вирионы ХВК

2.2.3. Действие ЦТАБ вирионы ВТМ

2.3. Определение стехиометрии и энергетики процесса взаимодействия БО ХВК с детергентами методом изотермической титрующей калориметрии

2.4. Определение константы седиментации нативного БО ХВК и БО ХВК, подвергшегося действию нагревания и детергентов

3. Сравнительное исследование препаратов БО ХВК, выделенных солевым и ацетатным методами

4. Дестабилизация частиц ХВК при -20 °С 87 4.1. Разрушение вирионов ХВК при -20 °С низкими концентрациями 1ЛС

4.1.1. Действие инкубации при -20 °С на вирионы ХВК

4.1.2. Свойства БО ХВК освобождающегося из вирионов действием 1ЛС при -20 °С *

4.1.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия интактных препаратов ХВК и препаратов, инкубированных при -20 °С в присутствии

4.1.4. Инкубация ВТМ при -20 °С в присутствии и в отсутствии 1ЛС1 \ о

4.2. Действие ЫаС1 и -20 °С на вирионы ХВК 1 о

4.3. Разрушение вирионов ХВК при -20 °С низкими концентрациями СаСЬ Ю

4.4. Разрушение вирионов ХВК при -20 °С ДСН Ю7 4.5. Действие высоких концентраций 1ЛС1, СаСЬ и ЫаС1 на изолированные БО ХВК и БО ВТМ

5. Модифицированная модель структуры БО ХВК в составе вириона \

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Сравнение стабильности свободного БО ХВК и БО в составе вирионов по отношению к нагреванию и действию детергентов

2. Возможный механизм дестабилизации вирионов ХВК при -20 °С [

3. Новый вариант трехмерной модели БО ХВК как объяснение структурных перестроек

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры и стабильности белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вирионов"

Потексвирусы представляют собой достаточно уникальную группу среди всех вирусов растений. Несмотря на все же более редкую среди вирусов гибкую спиральную морфологию частиц и весьма низкую стабильность вирионов, многие вирусы этой группы накапливаются в растениях в очень больших количествах (до 1,5 грамм на килограмм сырого веса), уступая в этом отношении, наверное, только вирусу табачной мозаики (ВТМ).

Кроме того, потексвирусы (как и другие гибкие вирусы растений) не поддаются исследованию современными методами структурного анализа, такими как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), дифракция рентгеновских лучей на нитях и криоэлектронная микроскопия. И поэтому, хотя репликация потексвирусов в зараженных клетках изучена в степени недоступной для большинства других вирусов растений, о тонкой структуре частиц потексвирусов и их свободного белка оболочки известно немного.

Все это в полной мере относится к типовому представителю данной группы и объекту наших исследований - Х-вирусу картофеля (ХВК). Кроме всех этих групповых особенностей, ХВК (и его белок оболочки (БО)) обладают и немалым числом собственных аномалий (или аномалий про которые неизвестно насколько широко они распространены в этой группе). Среди них можно назвать аномальные гидродинамические характеристики БО и его неспособность формировать вирусоподобные спиральные агрегаты в отсутствие РНК.

Но, пожалуй, главной на сегодня особенностью ХВК является механизм активации трансляции его впутривирусной РНК. В начале 2000-х годов в лаборатории И.Г. Атабекова было обнаружено, что трансляция вирионов ХВК осуществляется не по ВТМ-подобному механизму котрансляционной разборки, а по двум другим (действующим на разных стадиях инфекционного процесса) механизмам.

Один из этих механизмов («ремоделирование»), индуцируется связыванием нескольких молекул вирус-специфического транспортного ТБ1 белка с концом вириона ХВК, содержащим 5'-конец РНК. Ремоделирование приводит к резкому понижению стабильности вирионов и появлению у них способности разбираться на свободные РНК и БО сразу после инициации трансляции. Второй механизм активации трансляции индуцируется фосфолирированием одного или нескольких остатков серина и/или треонина в экспонированном на поверхности вириона И-концевом участке молекул БО. После этого частицы ХВК приобретают способность к трансляции по механизму котрансляционной разборки. Этот процесс не приводит к существенным изменениям стабильности вириона, но, несомненно, сводится к некой структурной перестройке внутривирусного БО.

Однако, вследствие упомянутого выше острого дефицита информации о структуре БО ХВК в вирионах (и в растворе), конкретная природа структурных перестроек в вирусных частицах, происходящих при «ремоделировании» и при фосфолирировании БО остается неизвестной.

Данная ситуация делает остро необходимым получение информации о структуре свободного и внутривирусного БО ХВК с помощью всех доступных подходов. Этого же требуют и широко обсуждаемые в последние годы перспективы ХВК (и других потексвирусов) в различных нанотехнологических разработках типа антигенного дисплея, экспрессии целевых белков и целого ряда других применений.

Одним из таких подходов является сравнительное изучение свободного и внутривирусного БО ХВК по отношению к действию различных разупорядочивающих агентов с помощью максимально широкого набора методов. В ходе такой работы нами было обнаружено, что инкубация вирионов ХВК при -20 °С в 10 мМ Трис-НС1 буфере рН 7,5 приводит к резкому понижению их стабильности. Понижение стабильности, по всей вероятности, определяется некой структурной перестройкой, претерпеваемой внутривирусным БО в данных условиях. Полученные результаты, а также данные о ремоделировании вирионов ХВК, о которых говорилось выше, побудили нас модифицировать, предложенную в 1992 году, модель трехмерной структуры субъединиц БО ХВК в составе вирионов.

Целью данной работы было сравнительное изучение структуры и стабильности изолированного БО ХВК и БО ХВК в составе вирионов. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие различных разупорядочивающих агентов на вирионы ХВК и его изолированный БО.

2. Исследовать влияние инкубации при отрицательной температуре на стабильность вирионов ХВК по отношению к действию различных агентов.

3. Предложить модифицированный вариант модели БО ХВК в составе вирионов.

Научная новизна

Проведено сравнительное изучение структуры и стабильности БО ХВК в свободном состоянии и в составе вирионов. Показано, что структура БО ХВК в составе вирионов отлична от структуры БО в свободном состоянии. Находясь в составе вирионов БО ХВК характеризуется высокой стабильностью, в то время как изолированный БО обладает низкой стабильностью. Инкубация вирионов ХВК при -20 °С приводит к их структурной перестройке, вызывающей понижение стабильности вирионов.

Исследовано действие детергентов двух разных групп при комнатной температуре и действие нагревания на свободный БО ХВК и БО в составе вирионов. Показано, что при комнатной температуре (25 °С) субъединицы БО ХВК в растворе обладают фиксированной третичной структурой, но эта структура является нестабильной, и разрушается уже при 35 °С. Кроме того, БО ХВК утрачивает свою третичную структуру при действии очень низких (24-40 мкМ) концентраций ДСН или ЦТАБ. Для такого разрушения оказывается достаточным 3-5 молекул детергентов на молекулу белка В то же время при данных воздействиях вторичная структура молекул свободного БО ХВК не изменяется. Включение субъединиц БО в состав вирионов приводит к резкому повышению их стабильности по отношению к нагреванию и действию детергентов.

Обнаружено также, что двухчасовая инкубация при -20 °С приводит к переходу цельных вирионов ХВК в дестабилизированное состояние, в котором они (в отличии от +4 °С или 25 °С) разрушаются в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5 низкими (миллимолярными) концентрациями 1лС1 и СаСЬ (но не ЫаС1). БО, освобождающийся из вирионов ХВК, при совместном действии низкой температуры и 1ЛС1 или СаСЬ ни по каким из исследованных нами гидродинамических характеристик, ни по оптическим свойствам не отличается от обычных препаратов свободного БО. Действие температуры -20 °С на вирионы ХВК является полностью обратимым: в 10 мМ Трис-НС1 рН 7,5 после прогрева от -20 °С до +4 °С или до комнатной температуры вирионы ХВК по всем исследованным критериям идентичны интактному ХВК. Такое необычное действие инкубации при -20 °С специфично для ХВК, вирус табачной мозаики не подвергается дестабилизации в аналогичных условиях.

Показано, что при -20 °С понижается стабильность вирионов ХВК не только по отношению к солям, но и по отношению к детергентам. Если для разрушения вирионов ХВК при комнатной температуре необходимо 5,4 мМ ДСН, то при -20 °С для полного разрушения вирионов оказывается достаточным 1 мМ детергента.

Предложен возможный механизм дестабилизации структуры вирионов ХВК при -20 °С и их разрушения низкими концентрациями ЫС1 и СаСЬ (но не №С1).

Представлена модифицированная модель трехмерной структуры субъединиц БО ХВК в составе вирионов, сходная с ранее предложенной моделью БО А-вируса картофеля, принадлежащего. .к другой группе нитевидных вирусов - группе г потивирусов. По модифицированной модели субъединица БО ХВК in situ состоит из двух отдельных доменов - четырехспиралного пучка и РНП-фолда с РРа единицей. Новый двухдоменный вариант модели структуры БО ХВК в составе вириона с одной стороны позволяет объяснить высокую лабильность структуры свободных субъединиц БО, а с другой - лучше согласуется с двумя группами данных о структурных перестройках частиц этого вируса (ремоделирование и «-20 °С эффект»).

Практическая значимость работы

Многие из потексвирусов (включая ХВК) являются важными патогенами для большого числа видов культивируемых и дикорастущих растений. Поэтому цивилизованное растениеводство невозможно без разработки методов диагностики потексвирусных инфекций и борьбы с этими инфекциями. Знание структуры и механизмов репликации вирусов является необходимым условием успеха в такой борьбе.

Однако сегодня дело уже не ограничивается этими очевидными соображениями. В силу целого ряда причин именно потексвирусы на сегодня представляются оптимальным объектом для различных нанотехнологических разработок, таких как накопление и презентация антигенных пептидов и белков на поверхности вирионов. Или просто для относительно легкого и быстрого получения самых разных «посторонних» белков в зараженных или трансформированных растениях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура потексвирусов

Потексвирусы - одна из самых известных групп спиральных вирусов растений. Изучение этой группы вирусов продолжается уже более полувека. Данная глава литературного обзора будет включать в себя как общую характеристику потексвирусов, так и более подробное описание отличительных особенностей отдельных представителей этой группы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Немых, Мария Александровна

выводы

1. Свободные субъединицы БО ХВК обладают фиксированной, но весьма нестабильной третичной структурой. Разрушение этой структуры происходит под действием микромолярных концентраций детергентов (24-40 мкМ) или при незначительном повышении температуры (до 33 °С).

2. Вторичная структура изолированного БО ХВК характеризуется значительной стабильностью. Из всех использованных нами разупорядочивающих агентов частичное разрушение а-спиралей вызывали только высокие концентрации хлоридов лития, натрия и кальция (2-5 М).

3. В составе вириона субъединицы БО ХВК характеризуются значительно более высокой стабильностью за счет возникновения межсубъединичных белок-белковых и РНК-белковых взаимодействий, как гидрофобной, так и электростатической природы.

4. Инкубация вирионов ХВК при -20 °С (в 10 мМ Трис-HCl рН 7,5) вызывает их обратимую структурную перестройку, приводящую к значительному понижению стабильности вирионов и появлению у них способности к разрушению низкими концентрациями солей и детергентов.

5. Предложен вероятный механизм дестабилизации структуры вирионов ХВК при -20 °С и их разрушения низкими концентрациями хлористого лития и кальция.

6. Предложена модифицированная модель структуры БО ХВК в составе вириона. Согласно этой модели субъединица БО ХВК in situ состоит из двух отдельных доменов — типичного пучка из четырех а-спиралей и РНП-фолда с присоединенной сбоку рра единицей. Предлагаемая модель лучше объясняет высокую лабильность третичной структуры свободного БО ХВК и структурные превращения, претерпеваемые этим белком в составе вириона.

БЛАГОДАРНОСТИ

Сердечно благодарю своего научного руководителя Евгения Николаевича Доброва за всестороннюю поддержку, знания и опыт, полученные мною за время работы, а также за бесконечное терпение.

Благодарю всех сотрудников отдела физических методов измерений НИИ ФХБ МГУ: к.ф.-м.н. В.А. Драчева, к.б.н. В.Н. Орлова, к.ф.-м.н. B.C. Козловского, П.В. Калмыкова, В.Н. Мичурину и H.H. Магретову, а также к.б.н. Ю.В. Панюкова за поддержку и помощь в экспериментальной работе.

Выражаю глубочайшую признательность к.б.н. [В.К. Новикову] за помощь в накоплении и выделении вируса. Благодарю к.ф.-м.н. A.M. Арутюняна за помощь в измерениях спектров кругового дихроизма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Немых, Мария Александровна, Москва

1. Арутюнян A.M., Рафикова Э.Р., Драчев В.А., Добров E.H. 2001. Появление ß-подобного спектра кругового дихроизма при агрегации белка, не сопровождающейся переходом в ß-структуру. Биохимия. 66, 1702-1705.

2. Атабеков И.Г. 2002. Практикум по общей вирусологии. Издательство МГУ, Москва.

3. Бобкова А.Ф., Гольдштейн М.И., Кафтанова A.C. 1989. Сравнение антигенных свойств Х-вируса картофеля и его белка оболочки. Влияние протеолитического расщепления на антигенные характеристики. Молек. Генет. Микробиол. Вирусол. 2,35-41.

4. Богачева E.H., Шишков A.B. 2000. Тритиевая планиграфия как инструмент исследования пространственной структуры белков и их комплексов. Молекулярная биология. 34, 839-853.

5. Гольдштейн М.И., Куст C.B., Добров E.H. 1987. Различия в механизмах сборки in vitro ВТМ и Х-вируса картофеля. Молек. Генет. Микробиол. Вирусол. 12, 45-49.

6. Добров E.H., Ефимов A.B., Баратова JI.A. 2004. Исследование структуры рибонуклеопротеидов спиральных вирусов растений методами тритиевой плапиграфии и теоретического моделирования. Молекулярная биология. 38, 945958.

7. Донсон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика. Издательство «Мир», Москва.

8. Козловский C.B., Карпова О.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. 2003. Влияние N-концевой области белка оболочки Х-вируса картофеля на структуру вирусных частиц. Докл. Акад. Наук. 391, 117-119.

9. Ксенофонтов A.JL, Козловский B.C., Кордюкова JI.B., Радюхин В.А., Тимофеева A.B., Добров E.H. 2006. Определение концентрации и размера агрегатов в препаратах вируса гриппа про спектрам истинного поглощения в УФ-свете. Молекулярная биология. 40,172-179.

10. Морозов С.Ю., Захарьев В.М., Чернов В.К., Прасолов B.C., Козлов Ю.В., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. 1983. Первичная структура и локализация гена белка оболочки в геномной РНК Х-вируса картофеля. Докл. Акад. Наук СССР. 271, 211-215.

11. Новиков В.К., Кимаев В.З., Атабеков И.Г. 1972. Реконструкция нуклеопротеида вируса X картофеля. Докл. Акад. Наук СССР. 204, 1259-1262.

12. Орлов В.Н., Арутюнян A.M., Куст С.В., Литманович Е.А., Драчев В.А., Добров Е.Н. 2001. Макроскопическая агрегация белка оболочки вируса табачной мозаики. Биохимия. 66, 154-162.

13. Привалов П.Л. 1987. Стабильность белка и гидрофобные взаимодействия. Биофизика. 32, 742-759.

14. Рафикова Э.Р., Панюков Ю.В., Арутюнян A.M., Ягужинский Л.С., Драчёв В.А., Добров Е.Н. 2004. Низкие концентрации Ds-Na ингибируют аморфную агрегацию белка оболочки вируса табачной мозаики и влияют на стабильность белка. Биохимия. 69, 1683-1690.

15. Сердюк И.Н. 2007. Структурированные белки и белки с внутренней неупорядоченностью. Молекулярная биология. 41, 297-313.

16. Серебрякова М.В, Лукашина Е.В., Федорова Н.В., Грачев С.А., Добров Е.Н., БаратоваЛ.А. 2004. Масс-спектрометрическое определение положения углеводных остатков в молекуле белка оболочки X вируса картофеля. Масс-спектрометрия. 1, 191-198.

17. Abou-Haidar М., Bancroft J.B. 1978. The initiation of papaya mosaic virus assembly. Virology. 90, 54-59.

18. Abou-Haidar M., Erickson J.W., Bancroft J.B. 1979. The inhibition of papaya mosaic virus assembly related to the effect of cations on its RNA. Virology. 98, 116-120.

19. Abou-Haidar M.G., Bancroft J.B. 1980. The polarity of assembly of papaya mosaic virus and tobacco mosaic virus RNAs with PMV-protein under conditions of nonspecificity Virology. 107, 202-207.

20. Abou-Haidar M.G. 1988. Nucleotide sequence of the capsid protein gene and 3' non-coding region of papaya mosaic virus RNA. J. Gen. Virol. 69, 219-226.

21. Angell S.M., Davies C., Baulcombe D.C. 1996. Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells ofNicotiana clevelandii. Virology. 216, 197-201.

22. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Poljakov V.Yu. 2000. The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology. 271, 259-263.

23. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov V.K., Arkhipenko M.V. 2001. Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology. 286, 466-474.

24. Bancroft J.B., Abou-Haidar M., Erickson J.W. 1979. The assembly of clover yellow mosaic virus and its protein. Virology. 98, 121-130.

25. Bancroft B., Hills G.J., Richardson J.F. 1980. A re-evaluation of the structure of narcissus mosaic virus and polymers made from its protein. J. Gen. Virol. 50, 451-454.

26. Bancroft J.B., Rouleau M., Johnston R., Prins L., Mackie G.A. 1991. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. J. Gen. Virol. 72, 2173-2181.

27. Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T., Forster R.L. 1991. Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology. 183, 695-702.

28. Bernal J.D., Fankuchen I. 1941. X-ray and crystallographic studies of plant virus preparations. I. Introduction and preparation of specimens. II. Modes of aggregation of the virus particles. J. Gen. Physiol. 25, 111-146.

29. Bhyravbhatla B., Watowich S.J., Caspar D.L. 1998. Refined atomic model of the four-layer aggregate of the tobacco mosaic virus coat protein at 2.4 A resolution. Biophys. J. 74, 604-615.

30. Chapman S., Hills G., Watts J., Baulcombe D. 1992. Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity Virology. 191,223-230.

31. Chen Y.H., Yang J.T., Martinez H.M. 1972. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. Biochemistry. 11, 41204131.

32. Colowick S.P., Kaplan N.O. 1968. Nucleic Acids. In: Methods in enzymology. Eds. Crossman, L., Moldave, K. Academic Press, New York and London. Vol. 12, part B, pp. 129-104,728-732.

33. Dawson R.M., Elliot D.C., Elliot W.II., Jones K.M. 1986. Data for biochemical research.

34. Clarendon Press, Oxford. Dobrov E.N, Atabekov J.G. 1989. Reconstitution of plant viruses. In: Plant Viruses. Ed.

35. Dobrov E.N., Kust S.V., Yakovleva O.A., Tikchonenko T.I. 1977. Structure of single-stranded virus RNA in situ. II. Optical activity of five tobacco mosaic-like viruses and their components. Biochim. Biophys. Acta. 475, 623-637.

36. Edsall J.T., McKenzie H.A. 1978. Water and proteins. I. The significance and structure of water: its interaction with electrolytes and non-electrolytes. Adv. Biophys. 10, 137-207.

37. Efimov A.V. 1984. A novel super-secondary structure of proteins and the relation between the structure and the amino acid sequence. FEBSLett. 166, 33-38.

38. Efimov A.V. 1993. Standard structures in proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol. 60, 201-239.

39. Efimov A.V. 1995. Structural similarity between two-layer a/p and P-proteins. J. Mol. Biol. 245,402-415.

40. Efimov A.V. 1999. Complementary packing of a -helices in proteins. FEBS Lett. 463, 3-6.

41. Erhardt M., Stussi-Garaud C., Guilley H., Richards K.E., Jonard G., Bouzoubaa S. 1999. The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology. 264, 220-229.

42. Erickson J.W., Bancroft J.B., Home R.W. 1976. The assembly of papaya mosaic virus protein. Virology. 72, 514-517.

43. Erickson J.W., Abou-Haidar M., Bancroft J.B. 1978. The specificity of papaya mosaic virus assembly. Virology. 90, 60-66.

44. Erickson J.W., Bancroft J.B. 1978. The self-assembly of papaya mosaic virus. Virology. 90, 36-46.

45. Erickson J.W., Bancroft J.B. 1981. Melting of viral RNA by coat protein: Assembly strategies for elongated plant viruses. Virology. 108, 235-240.

46. Erickson J.W., Bancroft J.B., Stillman M.J. 1981. Circular dichroism studies of papaya mosaic virus coat protein and its polymers. J. Mol. Biol. 47, 337-439.

47. Erickson J.W., Hallett F.R., Bancroft J.B. 1983. Subassembly aggregates of papaya mosaic virus protein. Virology. 129,207-211.

48. Finney J.L., Gellatly B.J., Golton I.C., Goodfellow J. 1980. Solvent effects and polar interactions in the structural stability and dynamics of globular proteins. Biophys J. 32, 17-33.

49. Fraenkel-Conrat H. 1957. Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology, 4, 1-4.

50. Francki R.I. 1985. Plant virus satellites. Annu. Rev. Microbiol. 39, 151-174.

51. Franklin R.E., Klug A. 1956. The nature of the helical groove on the tobacco mosiac virus particle; x-ray diffraction studies. Biochim. Biophys. Acta. 19, 403-416.

52. Francki R.I., McLean G.D. 1968. Purification of potato virus X and preparation of infectious ribonucleic acid by degradation with lithium chloride. Aust. J. Biol. Sci. 21, 1311-1318.

53. Ghosh S., Banerjee A. 2002. A multitechnique approach in protein/surfactant interaction study: Physicochemical aspects of sodium dodecyl sulfate in the presence of trypsin in aqueous medium. Biomacromolecules. 3, 9-16.

54. Gilmer D., Bouzoubaa S., Hehn A., Guilley H., Richards K., Jonard G. 1992. Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 31 proximal genes located on RNA 2. Virology. 189,40-47.

55. Goodman R.M. 1975. Reconstitution of potato virus X in vitro. I. Properties of the dissociated protein structural subunits. Virology. 68, 287-298.

56. Goodman R.M., Home R.W., Hobart J.M. 1975. Reconstruction of potato virus X in vitro. II. Characterization of the reconstituted product. Virology. 68, 299-308.

57. Goodman R.M., McDonald J.G., Home R.W., Bancroft J.B. 1976. Assembly of flexuous plant viruses and their proteins. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 276, 173-179.

58. Goodman R.M. 1977. Reconstitution of potato virus X in vitro. III. Evidence for a role for hydrophobic interactions. Virology. 76, 72-78.

59. Greenfield N., Fasman G.D. 1969. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry. 8, 4108-4116.

60. Greenwood N.N., Earnshaw A. 1997. Chemistry of the elements. Butterworth-Heinemann, Oxford.

61. Guttenplan J.B., Calvin M. 1973. Tertiary and quaternary structure of tobacco mosaic virus and protein. I. Effect of pH on fluorescence and 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfonate binding. Biochim. Biophys. Acta. 322, 294-300.

62. Harrison B.D., Finch J.T., Gibbs A.J., Hollings M., Shepherd R.J., Valenta V., Wetter C. 1971. Sixteen groups of plant viruses. Gen. Virol. 12, 175-178.

63. Hiscox J. A, Ball L.A. 1997. Cotranslational disassembly of flock house virus in a cell-free system. J. Virol. 71, 7974-7977.

64. Homer R.B., Goodman R.M. 1975. Circular dichroism and fluorescence studies on potato virus X and its structural components. Biochim. Biophys. Acta. 378, 296-304.

65. Homer R.B., Dalton D.I. 1976. A pH-dependent conformational change in the coat protein subunits from potato virus X. Biochim. Biophys. Acta. 44, 542-546.

66. Horwitz J., Strickland E.H., Billups C. 1969. Analysis of vibrational structure in the near-ultraviolet circular dichroism and absorption spectra of phenylalanine and its derivatives. J. Am. Chem. Soc. 91, 184-190.

67. Horwitz J., Strickland E.H., Billups C. 1970. Analysis of the vibrational structure in the near-ultraviolet circular dichroism and absorption spectra of tyrosine derivatives and ribonuclease-A at 77.deg. K. J. Am. Chem. Soc. 92, 2119-2129.

68. Huang Y.L., Han Y.T., Chang Y.T., Hsu Y.H., Meng M. 2004. Critical residues for GTP methylation and formation of the covalent m7GMP-enzyme intermediate in the capping enzyme domain of bamboo mosaic virus. J. Virol. 78, 1271-1280.

69. Huisman M.J., Linthorst H.J., Bol J.F., Cornelissen J.C. 1988. The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses. J. Gen. Virol. 69, 1789-1798.

70. Jagadish M.N., Huang D., Ward C.W. 1993. Site-directed mutagenesis of a potyvirus coat protein and its assembly in Escherichia coli. J. Gen. Virol. 74, 893-896.

71. Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K., Atabekov J.G. 1975. Structure of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X. Virology. 67, 283-287. ■

72. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela T., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. 1996. Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBSLett. 397, 75-78.

73. Kalinina N.O., Rakitina D.A., Solovyev A.G., Schiemann J., Morozov S.Yu. 2002. RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology. 296,321-329.

74. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. 1997. Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology. 230, 11-21.

75. Kelloniemi J., Makinen K., Valkonen J.P. 2006. A potyvirus-based gene vector allows producing active human S-COMT and animal GFP, but not human sorcin, in vector-infected plants. Biochimie. 88, 505-513.

76. Kendall A., Bian W., Junn J., McCullough I., Gore D., Stubbs G. 2007. Radial density distribution and symmetry of a Potexvirus, narcissus mosaic virus. Virology. 357, 158-164.

77. Kim K.H., Hemenway C. 1996. The 5' nontranslated region of potato virus X RNA affects both genomic and subgenomic RNA synthesis. J. Virol. 70, 5533-5540.

78. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. 2003. AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J. Mol. Biol. 332, 321-325.

79. Koenig R., Stegemann H., Francksen H., Paul H.L. 1970. Protein subunits in the potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta. 207, 184-189.

80. Koenig R. 1972. Anomalous behavior of the coat proteins of potato virus X and cactus virus X during electrophoresis in dodecyl sulfate-containing polyacrylamide gels. Virology. 50, 263-266.

81. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. 1978. In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini J. Gen. Virol. 38, 329-337.

82. Koenig R. Torrance L. 1986. Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies J. Gen. Virol. 67,2145-2151.

83. Koonin E.V., Dolja V.V. 1993. Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 375-430.

84. Mandahar C.L. 1989. Monopartite elongated viruses. In: Plant Viruses. Ed. Mandahar C.L. Boca Raton, Florida: Inc.: CRCPress, 12-15.

85. Mattice W.L., Riser J.M., Clark D.S. 1976. Conformational properties of the complexes formed by proteins and sodium dodecyl sulfate. Biochemistry. 15, 4264-4272.

86. Morozov S.Yu, Lukasheva L.I., Chernov B.K., Skriabin K.G., Atabekov I.G. 1987. Primary structure of the potato virus X genome: the region preceding the capsid protein cistron. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 3, 32-38.

87. Morozov S.Yu., Dolja V.V., Atabekov J.G. 1989. Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol. 29, 52-62.

88. Morozov S.Y., Miroshnichenko N.A., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovijev A.G., Lukasheva L.I., Atabekov J.C. 1990. Expression of RNA transcripts of potato virus X full-length and subgenomic cDNAs. Biochimie. 72, 677-684.

89. Morozov S.Yu. , Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukasheva L.I., Karasev A.V., Dolja V.V., Atabekov J.G. 1991. Expression strategy of the potato virus X triple gene block. J. Gen. Virol. 72, 2039-2042.

90. Morozov S.Y., Solovyev A.G., Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Schiemann J., Atabekov J.G. 1999. Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein. Virology. 260, 55-63.

91. Morozov S.Y., Solovyev A.G. 2003. Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. J. Gen. Virol. 84, 1351-1366.

92. Namba K., Pattanayek R., Stubbs G. 1989. Visualization of intact tobacco mosaic virus at 2.9 A resolution by X-ray fiber diffraction. J. Mol. Biol. 208, 307-325.

93. Ohtsubo K., Marth J.D. 2006. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126, 855-867.

94. Orlov V.N, Kust S.V, Kalmykov P.V, Krivosheev V.P, Dobrov E.N, Drachev V.A. 1998. A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Lett. 433, 307-311.

95. Panyukov Y., Yudin I., Drachev V., Dobrov E., Kurganov B. 2007. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127,9-18.

96. Parker L., Kendall A., Stubbs G. 2002. Surface features of potato virus X from fiber diffraction. Virology. 300, 291-295.

97. Parker L., Kendall A., Berger P.H., Shiel P.J., Stubbs G. 2005. Wheat streak mosaic virus -structural parameters for a Potyvirus. Virology. 340, 64-69.

98. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., Gusev N.B. 2005. Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1548-1553.

99. Privalov P.L., Gill S.J. 1988. Stability of protein structure and hydrophobic interaction. Adv. Protein. Chem. 39, 191-234.

100. Qu C., Liljas L., Opalka N., Brugidou C., Yeager M., Beachy R., Fauquet C., Johnson J., Lin T. 2000. 3D domain swapping modulates the stability of members of an icosahedral virus group. Structure. 8, 1095-1103.

101. Rafikova E.R., Kurganov B.I., Arutyunyan A.M., Kust S.V., Drachev V.A., Dobrov E.N. 2003. A mechanism of macroscopic (amorphous) aggregation of the tobacco mosaic virus coat protein. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 1452-1460.

102. Receveur-Brechot V., Bourhis J.M., Uversky V.N., Canard B., Longhi S. 2006. Assessing protein disorder and induced folding. Proteins. 62, 24-45.

103. Richardson J.F., Tollin P., Bancroft J.B. 1981. The architecture of the potexviruses. Virology. 112, 34-39.

104. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. 2003. Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J. Mol. Biol. 333, 565-572.

105. Santa Cruz S., Roberts A.G., Prior D.A.M., Chapman S., Oparka, K.J. 1998. Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant Cell. 10, 495-510.

106. Sawyer L., Tollin P., Wilson H.R. 1987. A comparison between the predicted secondary structures of potato virus X and papaya mosaic virus coat protein. J. Gen. Virol. 68, 1229-1232.

107. Schuck P. 2000. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling. Biophys. J. 78, 1606-1619.

108. Shalla T.A., Shepard J.F. 1970. An antigenic analysis of potato virus X and of its degraded protein. II. Evidence for a conformational change associated with the depolymerization of structural protein. Virology. 42, 835-847.

109. Shanmugam G., Polavarapu P.L., Kendall A., Stubbs G. 2005. Structures of plant viruses from vibrational circular dichroism. J. Gen. Virol. 86, 2371-2377.

110. Shapiro A.L., Vinuela E., Maizel J.V.Jr. 1967. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820.

111. Shepard J.F., Secor G.A. 1972. The effects of enzymatic digestion on the moleculat weight and antigenic specificity of potato virus X protein. Phytopathology. 62, 1154-1160.

112. Short M.N., Davies J.W. 1983. Narcissus mosaic virus: a potexvirus with an encapsidated subgenomic messenger RNA for coat protein. Biosci. Rep. 3, 837-846.

113. Short M.N., Turner D.S., March J.F., Pappin D.J.C., Parente A., Davies J.W. 1986. The primary structure of papaya mosaic virus coat protein. Virology. 152, 280-283.

114. Shukla D.D., Ward C.M. 1989. Structure of potyvirus coat proteins and its application in the taxonomy of the potyvirus group. Adv. Virus Res. 36, 273-314.

115. Simpson A.A., Chipman P.R., Baker T.S., Tijssen P., Rossmann M.G. 1998. The structure of an insect parvovirus (Galleria mellonella densovirus) at 3.7 Â resolution. Structure. 6, 1355-1367.

116. Sit T.L., Abouhaidar M.G., Holy S. 1989. Nucleotide sequence of papaya mosaic virus RNA. J. Gen. Virol. 70, 2325-2331.

117. Skryabin K.G., Kraev A.S., Morozov S.Yu., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I., Atabekov J.G. 1988. The nucleotide sequence of potato virus X RNA. Nucleic Acids Res. 16, 10929-10930.

118. Schepetilnikov M.V., Manske U., Solovyev A.G., Zamyatnin A.A. Schiemann J., Morozov S.Y. 2005. The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking. J. Gen. Virol. 86,2379-2391.

119. Strickland E. H., Horwitz J., Billups C. 1969. Fine structure in the near-ultraviolet circular dichroism and absorption spectra of tryptophan derivatives and chymotrypsinogen A at 77 °K. Biochemistry. 8, 3205-3213.

120. Stubbs G., Warren S., Holmes K. 1977. Structure of RNA and RNA binding site in tobacco mosaic virus from 4 Â map calculated from X-ray fiber diagrams. Nature. 267,216-221.

121. Stubbs G. Developments in fiber diffraction. 1999. Curr. Opin. Struct. Biol. 9, 615-619.

122. Tate J., Liljas, L., Scotti P., Christian P., Lin T., Johnson J.E. 1999. The crystal structure of cricket paralysis virus: the first view of a new virus family. Nat. Struct. Biol. 6, 765-774.

123. Tollin P., Wilson H.R., Young D.W., Cathro J., Mowat W.P. 1967. X-ray diffraction and electron microscope studies of narcissus mosaic virus, and comparison with potato virus X. J. Mol. Biol. 26, 353-355.

124. Tollin P., Bancroft J.B., Richardson J.F., Payne N.C., Beveridge T.J. 1979. Diffraction studies of papaya mosaic virus. Virology. 98, 108-115.

125. Tollin, P & Wilson, H. R. 1988. Particle structure. In: The Plant Viruses: The Filamentous Plant Viruses. Ed. Milne R.C. N.Y.: Plenum Press. 4, 51-83.

126. Tomashevskaya O.L., Solovyev A.G., Karpova O.V., Fedorkin O.N., Rodionova N.P., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. 1993. Effects of sequence elements in the potato virus

127. X RNA 5' non-translated alpha beta-leader on its translation enhancing activity. J. Gen. Virol. 74, 2717-2724. Tozzini A.C., Ek B., Palva E.T., Hopp H.E. 1994. Potato virus X coat protein: a glycoprotein. Virology. 202, 651-658.

128. Zamyatnin A.A., Solovyev A.G., Bozhkov P.V., Valkonen J.P., Morozov S.Y., Savenkov E.I. 2006. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154.

129. Zhang H., Todderud E., Stubbs G. 1993. Crystallization and preliminary X-ray analysis of papaya mosaic virus coat protein. J. Mol. Biol. 234, 885-887.

130. Zhu D.M., Evans R.K. 2006. Molecular mechanism and thermodynamics study of plasmid