Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и принципа работы митохондриальной трансгидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабурова, Лариса Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Структура и свойства трансгидрогеназ.

1. Физико-химические свойства трансгидрогеназы.Ю

2. Стереохимия трансгидрогеназной реакции.

3. Субстратная специфичность пиридиннуклеотидтранс-гидрогеназы.

4. Обратимые ингибиторы трансгидрогеназной реакции.

5. Кинетика трансгидрогеназной реакции.

6. Механизм сопряжения трансгидрогеназной реакции с процессом преобразования энергии.

7. Стехиометрия транслокации протонов трансгидрогенаэойузз

8. Регуляция трансгидрогеназной реакции электрохимическим потенциалом ионов водорода.

9. Функциональные группы пиридиннуклеотидтрансгидро-геназы.

10. Парциальные реакции.

11. Физиологическая роль пиридиннуклеотидтрансгид-рогеназы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ.

1. Выделение митохондрий из сердца быка.

2. Получение субмитохондриальных частиц.

3. Выделение митохондрий из мечени крысы.

4. Получение субмитохондриальных частиц из митохондрий печени крысы.

-35. Определение трансгидрогеназной активности в субмитохон-дриальных частицах.

6. Модификация митохондриальной трансгидрогеназы

-хлормеркурибензоатом (ПХМБ).

7. Обработка митохондрий цистеином.

8. Обработка субмитохондриальных частиц цистеином.

9. Синтез арильных производных кофермента А (КоА) и дефосфо-кофермента А (дфКоА). а) Синтез б -7-нитробензофуразан~4ильного производного КоА (НБФ-КоА). б) Синтез Б -7-нитробензофуразан~4ильного производного дфКоА. в) Синтез б -2,4-динитрофенильного производного КоА. г) Синтез б-2,4-динитрофенильного производного дфКоА.

10. Модификация митохондриальной трансгидрогеназы пири-доксаль-5'-фосфатом.

11. Определение концентрации белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выяснение роли сульфгидрильных групп трансгидрогеназы, расположенных на внешней стороне внутреней мембраны митохондрий в активности фермента.

2. Взаимодействие трансгидрогеназы с арильными производными КоА и дфКоА. а) Синтез и свойства арильных производных КоА и дфКоА. б) Ингибирование арильными производными КоА митохондриальной трансгидрогеназы.

3. Взаимодействие трансгидрогеназы с пиридокеаль-5'-фосфатом.

ЗШЮЧЕНЙЕ. ИЗ

ВЫВОДЫ. II?

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры и принципа работы митохондриальной трансгидрогеназы"

Важным этапом в развитии современной биоэнергетики явилось подтверждение хемиосмотической концепции энергетического сопряжения, выдвинутой Митчеллом / I /. Согласно хемиосмотическому механизму, перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий сопряжен с возникновением трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода-д^Н+ на сопрягающей мембране. Энергия, запасенная в виде д^ Н+, используется протонной аденозинтрифосфата-зой для синтеза АТФ, а также трансгидрогеназой для накопления НАДФН.

Трансгидрогеназа, локализованная во внутренней мембране митохондрий, может катализировать и обратную реакцию.

При окислении НАДФН с помощью НАД4*, катализируемом трансгидрогеназой в субмитохондриальных частицах, наболюдаетея защелачива-ние внешней среды, поглощение субмитохондриальными частицами липо-фильных анионов и синтез АТФ. Полученные данные указывают на то, что трансгидрогеназа может функционировать как генератор а $

Таким образом, митохондриальная трансгидрогеназа может осуществлять генерацию Ауй Н+ с одновременным образованием НАДН за счет НАДФН. В результате этой реакции в дыхательную цепь митохондрий поступают восстановительные эквиваленты от проникающих или образующихся в митохондриях НАДФ-зависимых субстратов. Эти процессы могут иметь большое значение для энергетики митохондрий в условиях ограниченной доступности субстратов, поставляющих восстановительные эквиваленты для первого и второго пунктов сопряжения. С другой стороны, осуществляемое трансгидрогеназой в условиях больших значений дН+ поддержание высокой степени восстановленнос-ти НАДФН имеет большое значение для протекающих в митохондриях реакций восстановительного биосинтеза. Учитывая, что восстановительные эквиваленты с внутримитохондриального пула НДДФН в результате функционирования переносчиков передаются на внемитохондри-альный пул НДДФН, трансгидрогеназа может играть значительную роль и во внемитохондриальных реакциях биосинтеза.

Из : вышеизложенного следует, что в настоящее время изучение механизма функционирования трансгидрогеназы является актуальным направлением исследований современной биохимии и биоэнергетики. Одним из подходов к изучению принципов работы трансгидрогеназы и ее роли в метаболизме . клетку в целом является исследование структуры фермента и поиск эффективных специфических ингибиторов. Имеющиеся в настоящее время данные о свойствах трансгидрогеназы в целом и о структуре ее активного центра являются далеко неполными и недостаточными для понимания механизма ее функционирования. С целью расширить представление о свойствах трансгидрогеназы мы исследовали роль различных функциональных групп в работе фермента. Нами были получены новые эффективные ингибиторы трансгидрогеназы и исследовано их взаимодействие с ферментом.

В нашей работе было показано наличие сульфгидрильной группы (групп),расположенной на внешней поверхности внутреней мембраны митохондрий; эта группа контролирует трансгидрогеназную реакцию и, по-видимому, принимает участие в трансмембранной транслокации ионов Н+, сопряженной с трансгидрогеназной реакцией. Кроме того, обнаружение такой поверхностно расположенной сульфгидрильной группы доказывает трансмембранное расположение фермента.

С помощью пиридоксаль-5 '-фосфата нами впервые также было показано, что в трансгидрогеназе имеется & -аминогруппа с рК~7.^, существенная для функционирования фермента. Тот факт, что субстраты (НДЦФ+ и НДЦФН) трансгидрогеназы, но не ингибиторы, способные связываться в НДЦФ(Н)-связывающем центре, защищают фермент от ин-гибирования пиридоксальфосфатом, не позволяет с уверенностью сказать находится ли остаток лизина в активном центре или вне его. Однако,необычно низкое значение рК аминогруппы позволяет предположить, что эта группа может принимать участие в формировании протонного канала.

С целью изучения кинетических особенностей трансгидрогеназ-ной реакции нами были синтезированы производные кофермента А и дефосфо-кофермента А, снабженные репортерными группами - хромофорными и флуорофорными. Эти производные,как и сами КоА и дфКоА являются специфическими конкурентными ингибиторами трансгидроге-назы. В качестве репортерных групп были использованы динитрофе-нильный остаток (ДНФ-остаток) и нитробензофуразан-4-ильный остаток (НБФ-остаток). Специфичность взаимодействия арильных производных КоА и дфКоА определялась не только отсутствием или присутствием 3 -фосфатного остатка в молекуле КоА, но также структурой арильного остатка. Полученные с помощью этих ингибиторов данные позволяют уточнить кинетические особенности трансгидрогеназной реакции. Тот факт, что НШ-дфКоА является конкурентным ингибитором в отношении обоих субстратов одновременно свидетельствует о случайном порядке связывания субстратов в ходе трансгидрогеназной реакции. Кроме того,нам удалось с помощью этих ингибиторов оценить расстояние между субстрат-связывающими центрами в трансгид-рогеназе. Из полученных результатов следует, что НШ-дфКоА способен связываться в обоих нуклеотидсвязывающих центрах фермента одновременно, что означает, что расстояние между ними в трансгидроо геназе не превышает длины молекулы НБФ-дфКоА, т.е. ~ 30 А. Этот факт означает, что никотинамидные остатки НДЦ(Н) и НДДФ(Н) могут находиться в непосредственной близости друг от друга при образовании тройного комплекса с ферментом. Такая ситуация хорошо согласуется с высказываемым в литературе предположением /2,3 / о прямом переносе ГГ-иона к Н+-иона между никотинамидными кольцами субстратов в ходе трансгидрогеназной реакции.

Таким образом, полученные в работе результаты проливают свет на такие важные особенности строения трансгидрогеназы как расположение молекулы фермента в мембране, природа групп, участвующих в реакции, свойства нуклеотид-связывающих центров. Разработанные в диссертации подходы по модификации трансгидрогеназы в митохондриях не проникающими через мембрану агентами с последующим получением вывернутых фрагментов мембраны (субмитохондриальных частиц) могут быть использованы для изучения других мембранных ферментов. Синтезированные в работе новые производные кофермента А могут найти применение для изучения структуры и функции широкого класса НДЦ(Н)- и НДЩБ(Н)-зависимых ферментов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ТРАНСГИДРОГЕНАЗ. I. Физико-химические свойства трансгидрогеназ.

Пиридиндинуклеотидтрансгидрогеназа (НАДФН : НДЦ+ оксидоредук-таза, КФ 1.6.1.1.) - фермент, катализирующий обратимый перенос гидрид-иона между восстановленными и окисленными формами нуклеотидов НАД и НДЦШ:

НДДН + НАДФ4" . ^ НАД+ + НАДФН (I)

Впервые активность трансгидрогеназы была обнаружена Коловиком и Капланом /4/ в экстракте из Pseudomonas fluoreans' . Позднее Кап-лан с соавт. /5/ показали, что эта активность присутствует и в тканях млекопитающих, где она локализована во внутреней мембране митохондрий /6-8/.

В интактных митохондриях уровень восстановленности НАД® значительно превышает уровень восстановленности НАД /9/, причем восстановление эндогенного НДДф+ за счет НДДН в митохондриях ингибируется разобщителями окислительного фосфорилирования /10,11/. Эти результаты указывают на зависимость функционирования трансгидро-геназы от энергетического состояния митохондрий.

В настоящее время трансгидрогеназа вьщелена из большого числа объектов: из митохондрий млекопитающих /12-17/, из хроматофо-ров фото синтезирующей бактерии Rhodospirilluia rubrum /18-21/, из бактерии Azotobacter v±aelandii/22-24/, бактерий рода Pseudomonas /25-28/, из Escherichia coli /29-34/ и др.

В некоторых лабораториях получен гомогенный препарат транс-гидрогеназы из митохондрий сердца быка /13,14,16,17/. Каплан /12/ показал, что молекулярная масса частично очищенной трансгидрогена-зы из сердца быка составляет 250000-300000. По независимым данным Ридстрема и Фишера,очищенная трансгидрогеназа из митохондрий сердца быка состоит из одного типа субъединиц с молекулярным весом 97 000 /14/ или 120 000 /13/.

Большое различие в данных о величине молекулярной массы фермента, полученных Каштаном /12/, а также Фишером /13/ и Ридстремом /14/ объясняется, по-видимому, недостаточной очисткой препарата трансгидрогеназы, полученного Капланом, а также возможной ассоциацией мономеров трансгидрогеназы вследствие отсутствия детергентов в среде выделения.

По данным SDS -электрофореза обработка гомогенного препарата трансгидрогеназы, встроенного в липосомы, бифункциональными сшивающими агентами димитилсуберимидатом, диметиладипимидатом, диметил-пимелимидатом и дитио-бис-(сукцинимидилпропионатом) приводит к образованию димеров /35/. Имеются также данные о том, что модификация трансгидрогеназы в липосомах дициклогексилкарбодиимидом (ДЦЦЦ) вызывает образование димеров, наблюдаемых при SDS-электрофорезе /36/. Эти данные указывают на то, что митохондриальная трансгидрогеназа, по-видимому, обладает димерной структурой.

По данным аминокислотного анализа /17/ митохондриальная трансгидрогеназа содержит меньше полярных остатков, чем типичный растворимый глобулярный белок.

В системе, состоящей из водной фазы и фазы, содержащей тритон X—114, большая часть белка трансгидрогеназы (76%) концентрировалась в гидрофобной фазе /17/. Эти данные хорошо согласуются с представлением о трансгидрогеназе, как об интегральном белке митохондриальной мембраны.

Физико-химические свойства трансгидрогеназы из других источников изучены в меньшей степени. В очищенном препарате из E.coli преимущественно обнаружены пептиды с молекулярной массой 94 ООО и 50 ООО /34/.

Трансгидрогеназа из хроматофоров R. rubrum состоит из двух факторов - мембранного и растворимого /18/, причем молекулярная масса растворимого фактора составляет 70 ООО /18/.

Препарат трансгидрогеназы из P. aeruginosa обладает молекулярной массой в несколько миллионов и состоит из агрегатов разме-о , ром 500-5000 А /37/. 2 -АМФ или НДЦФ вызывают диссоциацию агрегатов на фрагменты с молекулярной массой 900 000, состоящих из 20 субъединиц с молекулярной массой 40 000-45 000 дальтон /37/.

Препарат трансгидрогеназы из A. vinelandii также диссоциирует в присутствии НДД®+ на субъединицы с молекулярной массой 58 000 /38/.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сабурова, Лариса Александровна

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы и охарактеризованы новые арильные производные КоА, являющиеся эффективными ингибиторами митохондриальной трансгидрогеназы.

2. Изучен механизм ингибирования трансгидрогеназы этими производными КоА. Показано, что связывание субстратов в ходе транс-гидрогеназной реакции является неупорядоченным.

3. В митохондриальной трансгидрогеназе обнаружена сульфгидрильная группа, расположенная на наружной поверхности внутреней мембраны митохондрий и контролирующая трансгидрогеназную активность.

4. Впервые показано, что пиридоксаль-5'-фосфат является ковалент-ным ингибитором трансгидрогеназы. Вызываемое пиридоксальфосфа-том ингибирование определяется модификацией одной аминогруппы (с рК~7,0) на активный центр фермента. НАДФ и НДЦВД защищают фермент от ингибирования пиридоксальфосфатом. НАД и НАДН и ингибиторы, конкурентные по отношению НАДФ(Н), не защищают трансгидрогеназу от ингибирования.

5. Из полученных с помощью модифицирующих агентов данных следует, что митохондриальная трансгидрогеназа расположена трансмембран-но, так что она контактирует не только с матриксом, но и с меж-мембранным:тпространством митохондрий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Митохондриальная трансгидрогеназа в энерго-зависимой НАДН— НАДФ+ трансгидрогеназной реакции способна утилизировать энергию, запасаемую за счет дыхания или гидролиза АТФ. В тоже время известно, что энергия, генерируемая в ходе трансгидрогеназной НАДФН—^НАД+ реакции, энергизует мембрану /I/. Однако, механизм этих процессов до настоящего времени не известен. Как указывалось в литературном обзоре, было предложено несколько моделей, объясняющих механизм работы трансгидрогеназы. Согласно одним из них, перенос гидрид-иона в ходе трансгидрогеназной реакции осуществляется опосредованно через стадию образования фермент-интер-медиатного комплекса /73/. Другие схемы /2,3,74/ предусматривают осуществление трансгидрогеназной реакции прямо, без вовлечения в нее интермедиата. Имеющиеся в литературе данные не исключают ни той, ни другой возможности. При изучении стереометрии НАДФН

НАДФ4" трансгидрогеназной реакции было показано, что гидрид-ион переносится из 4В-положения окисляемого субстрата в 4В-положение восстанавливаемого субстрата. Такая стереометрия согласуется с представлением о том, что в ходе трансгидрогеназной реакции происходит последовательное связывание субстратов в НДДФ(Н)-связывающем центре, и предполагает образование восстановленного фермент-интермедиатного комплекса. В то же время»согласно схемам Фишера /90/ и Ридстрема /68/ в ходе НДДН—^НАД+ трансгидрогеназной реакции перенос гидрид-иона осуществляется непосредственно, без интерледи ата.

В связи с тем, что вопрос о механизме трансгидрогеназной реакции остается открытым, большое внимание уделяется изучению функциональных групп трансгидрогеназы. В нашей работе было впервые показано наличие аминогруппы, существенной для функционирования ми-тохондриальной трансгидрогеназы. С помощью непроникающего /136/ мидифицирующего агента пиридоксаль-5' -фосфата была модифицирована аминогруппа, доступная для модификации со стороны матрикса митохондрий.

С помощью непроникающего агента ГОШБ была модифицирована суль-фгидрильная группа, расположенная на внешней стороне внутреней мембраны митохондрий, контролирующая трансгидрогеназную активность. Таким образом, в работе было показано, что трансгидрогеназа является трансмембранным ферментом.

Изучение кинетических параметров трансгидрогеназной реакции с помощью синтезированных нами аналогов КоА и дфКоА, снабженных ре портерными группами (хромафорными и флуорофорными), позволило оценить расстояние между субстрат-связывающими центрами трансгидрогеназы. Тот факт, что молекула НБФ-дфКоА одновременно связывается в НДДФ(Н)- и НАД(Н)-связывающих центрах фермента, указывает на то, что расстояние между этими центрами не превышает длины молекуо лы НШ-дфКоА, т.е. 30 А. Кроме того, полученные нами данные об одновременном связывании НШ-дфКоА в обоих субстрат-связывающих дают возможность различить какому кинетическому механизму подчиняется трансгидрогеназная реакция (механизму Теорелла-Чанса с упорядоченным связыванием субстратов /61/ или неупорядоченному механизму тройного комплекса с быстро устанавливающимся равновесием /31/). Тот факт, что НЩ-дфКоА является конкурентным ингибитором в отношении обоих субстратов одновременно, указывает на случайный порядок связывания субстратов в ходе трансгидрогеназной реакции.

Как отмечалось в литературном обзоре, митохондриальная трансгидрогеназа содержит 4 сульфгидрильные группы /90/, две из которых доступны для модификации 5,5-дитиобис-(нитробензойной кислоты) со стороны матрикса митохондрий /76,94/. Однако, ни одна из этих сульфгидрильных групп не существенна для функционирования трансгидрогеназы. Модификация с помощью ПХМБ обнаруженной нами сульфгидрильной группы (групп), расположенной на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий, инактивирует трансгидрогеназу. Однако, ввиду того, что нуклеотид-связывающие центры трансгидрогеназы обращены в матрикс, представляется маловероятным участие этой сульфгидрильной группы (групп) фермента в переносе гидрид-иона между пиридиннуклеотидами. Более вероятно, что эта сульфгидрильная группа принимает участие в трансмембранной транслокации ионов сопряженной с трансгидрогеназной реакцией.

Нам представляется также вероятным, что обнаруженная нами аминогруппа с рК 7,0 принимает участие в формировании протонного канала. Тот факт, что модификация остатка лизина пиридоксаль-5'-фосфатом предотвращалась субстратами (ЕАДФН и НДЦФ+),но не ингибиторами, конкурентными к НДДФ(Н), указывает на вероятную локализацию остатка лизина вне активного центра. Необычно низкое для аминогруппы рК указывает на возможность ее участия в транслокации протонов, сопряженной с трансгидрогеназной реакцией.

Как указывалось выше, нами были синтезированы новые конкурентные ингибиторы трансгидрогеназы. Эти ингибиторы являются арильны-ми производными кофермента А обладающими хромофорными и флуорофор-ными свойствами. В качестве репортерных групп были использованы динитрофенильный остаток и нитробензофуразан-4-ильный остаток. Было показано, что НБФ-КоА и ДНФ-дфКоА являются конкурентными ингимкМ биторами в отношении НДЩБШ) и НАД(Н) с К; 2,6 и 3,0, соответственно. НБФ-дфКоА, являющийся конкурентным ингибитором в отношении обоих субстратов, имеет К^ 0,3 мкМ. Следует отметить, что в отличие от известных уже ингибиторов (производных КоА и дфКоА), специфичность взаимодействия арильных производных КоА и дфКоА определяется не только присутствием или отсутствием 3-фосфатного остатка, но также структурой арильного остатка.

Следует отметить, что полученные нами арильные производные КоА могут быть использованы для изучения структуры и механизма функционирования ферментов, для которых КоА и его производные являются субстратами или кофакторами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабурова, Лариса Александровна, Москва

1. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosyn-thetic phosphorylation. Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc., 1966, v.41, 445-502.

2. Kozlov I.A. Mitochondrial transhydrogenase: general principles of functioning. In: Current Topics in Membranes and Transport, New-York, Academic Press, 1982, v.16, pp.383-392.

3. Козлов И.А. Митохондриальная трансгидрогеназа: общие принципы функционирования. Биохимия, 1979, т.44, вып.10, I73I-I737.

4. Colowick S.P., Kaplan И.О., Neufeld Е.Р., Ciotti М.М. Pyridine nucleotide transhydrogenase. 1. Indirect evidence for the reaction and purification of the enzyme. J.Biol.Chem., 1952, v.195, N 2, 95-Ю5.

5. Kaplan N.O., Colowick S.P., Neufeld E.P. Pyridine nucleotide transhydrogenase. 3. Animal tissue transhydrogenase. J.Biol., 1953, v.205, N 1, 1-15.

6. Hymphrey G.P. The distribution and properties of transhydrogenase from animal tissues. Biochem. J., 1957, v.65, N 2, 546-550.

7. Kaplan N.O., Swartz M.N., Prech M.E. , Ciotti M.M. Phosphoryla-tive and nonphosphorylative pathways of electron transfer in rat liver mitochondria. Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1956, v.42, N 8, 481-487.

8. Danielson L., Ernster L. Demonstration of a mitochondrial energy-dependent pyridine nucleotide transhydrogenase reaction;--Biochem.Biophys. Res. Commun., 1963, v.10, N 1, 91-96.

9. Klingenberg M., Slenczka W. Pyridinnucleotide in Lebermitochon-drien. Eine Analyse ihrer Redox-benziehungen. Biochem. Z.,-1191959» v.331, N 6, 486-492.

10. Klingenberg M., Schollmeyr P. Zur Reversibilität der oxydati-ven Phosphorylierung. 2. Der Einflub von Adenosintriphosphat auf die Atmungskette in atmenden Mitochondrien. Biochem. Z., 1961, v.335, K 3, 231-242.

11. Klingenberg M., Schollmeyer P. Zur Reversibilität der oxydati-ven Phosphorylierung. 3» Dsr Einflub von adenosintriphosphat auf die Atmungskette in atmungsgehenimten Mitochondrien. -Biochem Z., 196I, v.335, N 3, 243-262.

12. Kaplan N.O. Beef heart TPMH-DPN pyridine nucleotide trans-hydrogenases. In: Methods in Enzymology/Estabrook N.W., Pullman M.E. eds., New-York: Academic Press, 1967, v.10, pp.317-322.

13. Anderson W.M., Fisher R.R. Purification and partial characterization of bovine heart mitochondrial pyridine dinucleotide transhydrogenase. Arch.Biochem.Biophys., 1978, v.187, N 1, 180-190.

14. Höjeberg B., RydstrSm J. Purification and molecular properties of reconstitutively active nicotinamide nucleotide transhydrogenase from beef heart mitochondria. Biochem.Biophys. Res. Commun., 1977, v.78, I\T 4, 1183-1190.

15. Höjeberg B., Rydstrüm J. Purification of mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase from beef heart. In: Methods in Enzymology/Fleischer S. and Packer eds, New-York: Academ. Press, 1979, v.55, pp275-283.

16. McFadden B.J., Pisher R.R. ResaLition and reconstitution of Rhodospirillum rubrum pyridine dinucleotide transhydrogenase: localization of substrate binding sites. Arch. Biochem. Biophys., 1978, v.190, N 2, 820-828.

17. Jacobs E., Pisher R.R. Resolution and reconstitution of Rhodospirippum rubrum pyridine dinucleotide transhydrogenase: chemical modification with N-ethylmaleimide and 2,4-pentane-dione. Biochemistry, 1979, v.18, N 20, 43^5-4321.

18. Pisher R.R., Guillory R.J. Resolution of enzymes catalyzing energy-linked transhydrogenation. 2. Interaction of transhydrogenase factor with the Rhodospirillum rubrum chromato-phore membrane. J. Biol. Chem., 1971, v.246, N 15, 46794686.

19. Yoordouw G., Veeger C., van Breemen J.P.L., van Bruggen E.P.J. Structure of pyridine nucleotide transhydrogenase from Azoto bacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 1979, v.98, N 2, 447454.

20. Voordouw G., van der Vies S., Scholten J.W., Veeger C. Pyridine nucleotide transhydrogenase from Azotobacter vinelandii:

21. Differences in properties between the purified and the cellfree extract enzyme. Eur. J. Biochem., 1980, v.107, N 2, 337-344.

22. Cohen P.T., Kaplan N.N. Kinetic characterization of the pyri-■ dine nucleotide transhydrogenase from Pseudomonas aeruginosa. -J. Biol. Chem., 1970, v.245, N 18, 4666-4672.

23. Berger T.J., Orlando J.A. Purification and some properties of protein factor required for light-dependent transhydrogenase in Rhodopseudomonas spheroides. Arch. Biochem. Biophys., 1973, v.159, N 1, 25-31.

24. Cohen P.T., Kaplan N.O. Kinetic characteristics of the pyridine nucleotide transhydrogenase from Pseudomonas aeruginosa. -J. Biol. Chem., 1970, v.245, N 11, 2825-2836.

25. Zahl K.J., Rose C., Hanson R.L. Isolation and partial characterization of a mutant of Escherichia coli lacking pyridine nucleotide transhyrdogenase. Arch. Biochem. Biophys., 1978, v.190, N 2, 598-602.

26. Bragg P.D. Recconstitution of an energy-linked reaction (reduced pyridine nucleotide transhydrogenation) in fractionated

27. Escherichia coli membranes with purified ATP-ase. In: Methods in Enzymology ed., New-York: Academ. Press, 1979, v.55, pp.787-800.

28. Hanson R.L. The kinetic mechanism of pyridine nucleotide transhydrogenase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1979, V.254, N 3, 888-893.

29. Hanson R.L., Rose C. Genetic mapping of a mutation affecting pyridine nucleotide transhydrogenase in Escherichia coli. -J. Bacteriol., 1979, v.38, N 3, 783-787.

30. Homyk M., Bragg P.D. Steady-state kinetics and the inactiva-tion by 2,3-butandione of the energy-independent transhydrogenase of Escherichia coli cell membranes. Biochim. Biophys. Acts, 1979, v.571, N 2, 201-217.

31. Liang A., Houghton R.L. Structural aspect of the membrane-bound Escherichia coli pyridine nucleotide transhydrogenase (EC 1.6.1.1.). PEBS Lett., 1980, v.109, N 2, 185-188.

32. Andersson W.M., Fisher R.R. The subunit structure of bovine mitochondrial transhydrogenase. Biochim. Biophys. Acta,1981T v.635, N 1, 194-199.

33. Pennington R.M., Fisher R.R. Dicyclohexylcarbodiimide modification of bovine heart mitochondrial transhydrogenase. -J. Biol. Chem., 1981, v.256, N 17, 8963-8969.

34. Louie D.D., Kaplan N.O., McLean J.D. Allosteric effect of 2'-adenylic acid on the Pseudomonas pyridine nucleotide transhydrogenase. J. Mol. Biol., 1972, v.70, N 3, 651-664.

35. Keister D.L., Yike N.J. Studies on an energy-linked pyridine nucleotide transhydrogenase in photosynthetic bacteria. -Biochem. Biophys. Res. Coimnun., 1966, v.24, N 4, 519-525.

36. Fisher R.R., Guillory R.J. Resolution of enzymes catalyzing energy-lined transhydrogenation. 3. Preparation and properties of Phodospirillum rubrum transhydrogenase factor. J. Biol. Chem., 1971, v.246, N 15, 4687-4693.

37. Fisher R.R., Kaplan N.O. Studies on themitochondrial energy-linked pyridine nucleotide transhydrogenase. Biochemistry, 1973, v.12, N 6, 1182-1188.

38. Hoek J.B., Rydstrom J., HSjeberg B. Comparative studies on nicotinamide nucleotide transhydrogenase from different sources. Biochi. Biophys. Acta, 1974, v.333, N 2, 237-245.

39. Rydström J. Evidence for a proton-dependent regulation of mitochondrial nicotinamide-nucleotide transhydrogenase. -Eur. J. Biochem., 1974, v.45, N 1, 67-76.

40. Blazyk J.P., Lam D., Fisher R.R. Effect of substrate and inhibitor "binding on thermal and proteolytic inactivation of rat liver transhydrogenase. Biochemistry, 1976, v.15, N 13, 2843-2848.

41. Rydström J. Energy-linked nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.463, N 1, 155-184.

42. Stein A.M., Kaplan N.O., Ciotti M.M. Pyridine nucleotide transhydrogenase. 7. Determination of the reaction with coenzyme analogues in mammalian tissues. J. Biol. Chem., 1959, V.234, N 4, 979-986.

43. Ernster U., Lee C.-P., Energy-linked pyridine nucleotide transhydrogenase. In: Methods in Enzymology/Estabrook N.W., Pullman M.E., eds., New-York: Academic Press, 1967, v.10,p.738-744.

44. Rydström J., Panov A.V., Paradies C. Inhibition of mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase by CoA-thio-esters of long-chain fatty acide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v.45, N 6, 1389-1397.

45. Rydström J. Site-specific inhibitors of mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Eur. J. Biochem., 1972, N 2, 496-504.

46. O'Neal S.G., Earle S.R., Fisher R.R. The effect of metal ions on mitochondrial pyridine dinucleotide transhydrogenase.-125

47. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v.589, N 2, 217-230.

48. Irving H., Williams R.J.P. The stability of transition-metal complexes. J. Chem. Soc. (Lond), 1953, v.1, 3192-3210.

49. Rydström J., Teixeira da Cruz A., Ernster L. Factor governing the kinetics and steady-state of the mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase system Eur. J. Biochem.,1970, v.17, N 1, 56-62.

50. Van de Stadt R.J., Nieuwenhuis F.J.R.M., van Dam K. On the reversibility of the energy-linked transhydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v.243, N 2, 173-176.

51. Van Dam K., Welle H.F. The energy-linked transhydrogenase of mitochondria. In: Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria. Amsterdam-London-New-York, 1966, B.B.A. Libraryv.7, pp.235-246.

52. Donstov A.E., Grinius L.L., Jasaitis A.A., Severina I.I., Skulachev V.P. A study on the mechanism of energy coupling in the redox chain. 1. Transhydrogenase: the fourth site of the redox chain. Bioenergetics, 1972, v.3, N 4, 277-303.

53. Гринюс JT.A., Скулачев В.П. Генерация мембранного потенциала сопряженная с переносом водорода. Биохимия, J97I, т.36, вып.2, 430-433.

54. Enander К., Rydstrom J. Energy-linked nicotinamide nucleotide transhydrogenase. Kinetics and regulation of purified and reconstituted transhydrogenase from beef heart mitochondria. -J. Biol. Chem., 1982, v.257, N 24, 14760-14766.

55. Slater E.C. Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. Nature (London), 1953, v.172, N 7, 975-978.

56. Boyer P.D. A model for conformational coupling of membrane potential and to proton translocation to ATP synthesis and to active transport. FEBS Lett., 1975, v.58, N 1, 1-6.

57. Mitchell P. Vectorial chemiosmotic processes. In: Annual Review of Biochemistry/Snell E. ed., California, Palo Alto,-1271977, v.46, pp.996-1005.

58. Skulachev V.P. Energy coupling in biological membranes: current state and prospects. In: Energy Transducing Mechanisms /E.Racker ed., London: Univ. Park Press, 1975, pp.31-73.

59. Ohaniance L.D., Hatefi Y. Oxidation of NADPH by submitochon-drial particles from beef heart in complete absence of trans-hydrogenase activity from NADPH to NAD+. J. Biol. Chem., 1975, v.250, N 23, 9397-9403.

60. O'Neal S.G., Fisher R.R. Studies on sulfhydryl group modification of mitochondrial pyridine dinucleotide transhydrogena-se. J. Biol. Chem., 1977, v.252, N 13, 4552-4556.

61. Earle S.R., Fisher R.R. A direct demonstration of proton translocation coupled to transhydrogenation in reconstituted vesicles. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N 3, 827-830.

62. Papa S. Proton translocation reaction in the respiratory chains. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.456, N 1, 39-84.

63. Mitchell P., Moyle J. Evidence discriminating between the chemical and chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorylation. Nature (London), 1965, v.208, N 5016, 1205-1206.

64. Moyle J., Mitchell P. The proton- translocating nicotinamide-adenine dinucleotide (phosphate) transhydrogenase of rat livermitochondria. Biochem. J., 1973, v.132, N 3, 571-585.

65. Earle S.R., Pisher R.R. Reconstitution of bovin heart mito-condrial transhydrogenase: a reversible proton pump. Biochemistry, 1980, v.19, N 3, 561-569.

66. Deamer D.W., Prince R.C., Crofts A.R. The response of fluorescent amine to pH gradients across liposome membranes, -Biochim. Biophys. Acta, 1972, v.274, N 2, 323-335.

67. Hoek J.B., Rydstrô'm J., Ernster L. The HAD-linked isocitrate dehydrogenase activity in rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.305, N 3, 669-674.

68. Smith C.M., Plaut G.W.E. Activities of NAD-specific and NADP-specific isocitrate dehydrogenases in rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem., 1979, v.97, H 1, 283-295.

69. Haas D.W., The stoicheiometry of the energy-dependent reduction of NADP+ by NADH in digitonin fragments of beef heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1964, v.82, H 1, 200-202.

70. Lee C.-P., Ernster L. Demonstration of a mitochondrial energy-dependent pyridine nucleotide transhydrogenase reaction.1.: Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria/Tager J.M., et al., eds., Amsterdam: Elsevier, 1966, pp.218-234.

71. Papa S., Alifano A., Tager J.M., Quagliariello E. Stoicheio-metry of the energy-linked nicotinamide nucleotide transhydrogenase reaction in intact rat-liver mitochondria. -Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.153, N 1, 303-305.

72. Fisher R.R., Earle S.R. Membrane-"bound pyridine dinucleotide transhydrogenases. IN: The Pyridine Nucleotide Coenzymes /Everse J. ed., New-York: Academic Press, 1982, pp.280-320.

73. Sweetman A.J., Griffiths D.E. Studies on energy-linked reactions. Energy-linked transhydrogenase reaction in Escherihia coli. Biochem. J., 1971, v.121, N 1, 125-330.

74. Fisher R.R., Guillory R.J. Inhibition of the energy conversion reactions of Rhodospirillum rubrum by Dio-9. Biochim. Biophys. Acta, 1967, v.143, N 3, 654-656.

75. Kaufman B., Kaplan N.O. Pyridine nucleotide transhydrogenase. 8. Properties of the transhydrogenase reactions of an enzyme complex isolated from beef heart mitochondria. J. Biol. Chem., 1961, v.236, N 7, 2133-2139.

76. Earle S.R., O'Neal S.G., Fisher R.R. Chemical midification of mitochondrial transhydrogenase: evidence for two classes of sulfhydryl groups. Biochemistry, 1978, v.17, N 22, 46-834690.

77. Honghton R.L., Fisher R.J., Sanadi D.R. Dependence of Escherichia coli pyridine nucleotide transhydrogenase on phospholipids and its sensitivity to N-cthylmaleimide. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1976, v.73, N 3, 751-757.

78. Voordouw G., van der Yies S., Veeger C., Stevenson K.J. Modification of the thiol residues of pyridine nucleotide transhydrogenase from Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 1981, v.118, N 3, 541-546.

79. Gilbert H.F., O'Learry I.i.II. Modification of arginine and lysine in proteins with 2,4-pentadione. Biochemistry, 1975» v.14, N 23, 5194-5198.

80. Pisher R.R., Rampey S.A., Sadighi A., Fisher K. Restiktion and reconstitution of Phodospirillum rubrum pyridine dinucleotide transhydrogenase. Proteolytic and thermal inactivation of the membrane component. J.Biol. Chem., 1975, v.250, N 3, 819825.

81. Blazyk J.P., Pisher R.R. Evidence for substrate-induced conformational changes in mitochondrial transhydrogenase; PEBS Lett., 1975, v.50, N 2, 227-231.

82. UOO.Galante Y.M., Lee Y., Hatefi Y. Effect of pH on the mitochondrial energy-linked and non-energy-linked transhydrogenation reactions. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N 20, 9641-9646.

83. Casey R.P., Thelen M., Azzi A. Dicyclohexylcarbodiimide binds specifically and covalently to cytochrome c oxidase, while inhibiting its H+-transloeating activity. J. Biol., Chem., 1980, v.225, N 9, 3994-4000.

84. Wikstr6'm M., Krab K. Proton-pumping cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.549, N 2, 177-222.

85. Krab K., Wikstrb'm M. Pro ton-translocating cytochrome c oxidase in artificial phospholipid vesicles. Biochim. Biophy.s Acta, 1978, v.504, N 1, 200-214.

86. Phelps D.S., Hatefi Y. Inhibition of the mitochondrial nicotinamide nucleotide transhydrogenase by dicyclohexylcarbodiimide and diethylpyrocarbonate, J. Biol. Chem., 1981,v.256, N 15, 8217-8221.

87. Rydström J., Hook J.B., Ernster L. On the oxidation of reduced nicotinamide particles from beef heart. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.305, N 3, 694-698.

88. Hatefi Y., Galante Y.M. Dehydrogenase and transhydrogenase. Properties of the soluble NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, v.74, N 3, 846-850.

89. Hatefi Y., Phelps D.O., Galante Y.M. Energy-linked transhyd-rogenation from NADPH to |j4c. NADP. J. Bio. Chem., 1980, v.255, N 20, 9526-9529.

90. Phelps D.C., Galante Y.M., Hatefi Y. Energy-linked mitochondrial transhydrogenation from NADPH to NADP analogs. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N 20, 9647-9652.

91. Wu L.N.Y., Fisher R.R. Stereochemistry of NADPH NADP+ transhydrogenation catalysed by bovine heart mitochondrial pyridine dinucleotide transhydrogenase. J. Biol. Chem., 1982, V.257, N 19, 11680-11683.

92. Wu L.N.Y., Earls S.R., Fisher R.R. Bovine heart mitochondrial transhydrogenase catalyzes an exchange reaction between NADH and NAD+. J. Biol. Chem., 1981, v.256, N 14, 7401-7408.

93. Uli.Skulachev V.P. Electric fields in coupling membranes. FEBS Lett., 1970, v.11, N 5, 301-308.

94. Tager J.M. Synthesis of glutamate from -oxoglutarate and , ammonia in rat-liver mitochondria. 3. Malate as hydrogen donor. Biochim. Biophys. Acta, 1963, v.77, N 2, 258-265.

95. Скулачев B.II. Трансформация энергия в биомембранах. Москва: Наука 1972. -319 с.

96. Keister D.L., Hemmes R.B. Pyridine nucleotide transhydrоgenäse from Chromatium. J. Biol. Chem., 1966, v;241, N 12, 2820-2825.

97. Bragg P.D., Davis P.L., Hou C. Function of energy-dependent transhydrogenase in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972, v.47, N 5, 1248-1254.

98. Crane F.L., Glenn J.L., Green D.E. Studies on the electron transfer system in the electron transferring particles. -Biochim.Biophys. Acta, 1956, v.22, N 3, 475-488.

99. Löw H., Vallin J. Succinate-linked dephosphopyridine nucleotide reduction in submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta, 1963, v.69, N 3, 361-374.

100. Johnson D., Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria. In: Methods in Enzymology/Estabrook N.W., Pullman M.E. eds., New-York, Academic Press, 1967, v.10, pp.94-96.

101. Rydström J. Assay of nicotinamide nucleotide transhydrogenase in mammalian, bacterial, and reconstituted systems. In Methods in Ensymology. /Fleisher S. and Packer L. eds.,

102. New-York: Academic Press, 1979, pp.261-275.

103. Birkett D.J., Price N.C., Radda G.K., Salmon A.G. The reactivity of SH groups with a fluorigenic reagent. FEBS Lett., 1970, v.6, N 4, 346-348.

104. Lowry O.H., Rosenbrough N.G., Farr A.L., Randall R.J. Proteinmeasurments with the Polin phend reagent. J.Biol. Chem., 1951, v.193, N 1, 265-276.

105. Gornell A.G., Bardowill Ch.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J.Biol. Chem., 1949, v.177, II 2, 751-767.

106. Vansteveninck J., Weed R.J., Rothstein A. Localization of erithrocite membrane sulfhyril groups essential for glucose transport. J. Gen. Physiol., 1965, v.48, И 4, 617-632.

107. Pennington R.M., Fisher R.R. Reconstituted mitochondrial transhydrogenase is a transmembrane protein FEBS Lett., 1983, V.164, N 2, 345-349.

108. Nitta K., Bratcher S.C., Kronoman M.J. Anamalous reaction of 4-chloro-7-nitrobensofurazan with thiol compounds. -Biochem. J., 1979, v.177, N 2, 385-392*

109. Козлов И.А., Мильгром Я.М., Сабурова I.A., Соболев АЛО. sh-группа, контролирующая активность трансгидрогеназы, расположена на внешней поверхности митохондриальной мембраны. ейол. мембр., 1984, т.1, ß 4, 435-437.

110. Козлов И.А., Мильгром Я.М., Сабурова Л.А. sh группа, контролирующая активность трансгидрогеназы, расположена на внешней поверхности митохондриальной мембраны. - Материалы 16-ой конфер. ФЕБОМ., 1984, 287.

111. Rifkin D.B., Compans R.W., Reich Е. А specific labelling procedure for proteins on the outer surface of membranes.

112. J. Biol. Chem., 1972, v.247, N 20, 6432-6437. ?33.Scholnick P.L., Hammaker L.E., Marver U.S. Soluble-E-amino-levulinic acid synthetase of rat liver. J. Biol. Chem., 1972, v.247, N 13, 4132-4137.

113. Kozlov I.A., Milgrom Y.M., Saburova L.A., Sobolev A.Yu. The interaction of mitochondrial transhydrogenase with coenxyme A derivatives. Eur. J. Biochem., 1984,145 , N 3, 413-416,

114. Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю Игорю Анатольевичу Козлову за постоянное внимание к работе, помощь в постановке задач и обсуждении результатов.

115. Выражаю искреннюю признательность Якову Михайловичу Мильгро-му за всестороннюю помощь в планировании экспериментов и обсуждение полученных результатов, за внимательное и критическое прочтение рукописи диссертации.

116. Искренне благодарю Ирину Ефимовну Дробинскую, Ирину Анатольевну Смирнову и Елену Ивановну Дубинскую за критическое обсуждение рукописи диссертации, за дружескую помощь и поддержку.

117. Благодарю всех сотрудников и аспирантов отдела биоэнергетики и отдела изотопного анализа за товарищеское отношение и поддержку.