Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных основ протеолитической активности пепсина на основе рентгеноструктурных исследований комплексов фермента с ингибиторами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гущина, Алла Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МЕХАНИЗМА. ПРОТЕОЛИСШЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Аспартатные протеиназы. Основные характеристики различных представителей этого класса ферментов

1.1.1. Аминокислотный состав и сравнительный анализ первичных структур

1.1.2. Сравнительная характеристика пространственных структур

1.1.3. Некоторые представления об эволюционном развитии ферментов этого класса на основе сведений об их трехмерной структуре

1.2. Общие цредставления о строении активного центра аспартатных протеиназ.

1.2.1. Специфические ингибиторы.

1.2.2. Каталитически активные остатки

1.3. Структурные особенности изменения протеолитж-ческой активности аспартатных протеиназ при различных химических модификациях функционально важных групп фермента

1.4. Специфичность аспартатных цротеиназ.

1.5. Рентгеноструктурные подходы к выяснению механизма действия аспартатных протеиназ

1.5.1. Изучение фермент-субстратных взаимодействий на основе исследований комплексов с ингибиторами и модельных построений с гипотетическими субстратами.

1.5.2. Конформационная подвижность некоторых сегментов молекул аспартатных протеиназ

1.5.3. Некоторые представления о возможных механизмах действия аспартатных про-теиназ.

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Получение необходимого набора фаз для расчета разностных синтезов Фурье

2.1.1. Поиски новых тяжелоатомных производных пепсина.

2.1.2. Получение трехмерного набора рентгеновских дифракционных данных для производного пепсина с соединением

2.1.3. Определение координат тяжелых атомов для производного пепсина с соединением

W(vh3)A

Финальный синтез Фурье пепсина, рассчитанный по фазам, полученным методом изоморфных замещений

2.2. Получение рентгеновских экспериментальных данных для кристаллов комплексов пепсина с различными ингибиторами'.

2.2.1. Получение комплексов пепсина с соединениями: пара-бром1)еноцилбромидом, 1,2-эпокси-3-пара-изофеноксицропаном (ЭПШ), метиловым эфщюм дииод- <f-r иро з ил-дииод-- ^тирозина (Тир^-Тир^-ОМе), метиловым эфиром фенилаланил-дииод- иро з ина

Фен-Тир12-0Ме)

2.2.2. Сбор рентгеновских дифракционных данных для кристаллов комплексов пепсина с ингибиторами. Построение разностных синтезов Фурье.

ГЛАВА III. АКТИВНЫЙ ЦЕНТР ПЕПСИНА И СРАВНЕНИЕ ЕГО С ДРУГИМИ

АКТИВНЫМИ ЦЕНТРАМИ АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ

3.1. Описание структуры активного центра пепсина

3.2. Сравнение структур активных центров пепсина и аспартатных цротеиназ из Rkisopus Ch'uiensis и PeniciUum jantineiium,

3.3. Связывание этанола в активном центре пепсина

ГЛАВА 1У. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ

ПЕПСИНА С ИНГИБИТОРАМИ.

4.1. Интерпретация разностных синтезов электронной плотности, рассчитанных по фазам, полученным методом изоморфных.замещений, для комплексов пепсина с ингибиторами.

4.1.1. Комплексы пепсина с ЭПИП, п-бром|ено-цилбромидом, TnpIg-TnpIg-OMe.

4.1.2. Комплексы пепсина с Фен-Тир^-ОМе

4.2. Использование уточненных фаз для построения разностного синтеза электронной плотности ингибитора и уточнение модели ингибитора в молекуле пепсина.

ГЛАВА У. СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ИНГИБИРОВАНШ ПЕПСИНА МАЛЫМИ МОЛЕКУЛАМИ И ИЗМЕНЕНИЯ ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИНЫ СУБСТРАТА.

5.1. Ингибирувдие свойства этанола.

5.2. Структурные особенности строения первичных мест связывания аспартатных протеиназ, определяющие их каталитические свойства по отношению к дипептидным субстратам.

5.3. Структурные аспекты изменения каталитических свойств пепсина в зависимости от длины субстрата

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурных основ протеолитической активности пепсина на основе рентгеноструктурных исследований комплексов фермента с ингибиторами"

Исследование методами рентгеноструктурного анализа комплексов ферментов с ингибиторами позволяет определить особенности фермент-субстратных взаимодействий и понять механизмы функционирования этих систем. Данные рентгеноструктурного анализа являются наиболее твердым фундаментом для построения теорий каталитической активности ферментов различных классов.

К аспартатным протегоазам относится группа ферментов, выполняющих важные функции в организме, начиная от метаболизма клеточных белков (катепсины), кончая такими физиологическими процессами, как пищеварение (пепсин, химозин), регуляция давления крови (ренин) . Последние годы ознаменовались интенсивным развитием исследований различных представителей этого класса. Для пяти из них, с помощью методов рентгеноструктурного анализа, установлены трехмерные структуры высокого разрешения, две из них - пепсин и химо зин решены в лаборатории рентгеноструктурного анализа ИМБ Ш СССР. Естественным продолжением этих исследований являются рентгено-структурные исследования комплексов пепсина с субстратоподобными ингибиторами, позволяющие установить стереохимические параметры ферментативной реакции, катализируемой аспартатными протеиназами. Для ферментов этого класса установлено, что они осуществляют общий основной катализ присоединения молекулы воды к гидролизуемой связи. Однако для построения точной теории о механизме действия ферментов необходимо прежде всего знание структуры активного центра фермента в терминах атомных координат и представления о количественных характеристиках фермент-субстратных взаимодействий.

В задачу данной работы входило выявление особенностей структуры активного центра пепсина, определяющих его специфичность и каталитические свойства по отношению к пептидным субстратам. Для этого проводились рентгеноструктурные исследования комплексов пепсина с ингибиторами и сравнение трехмерных структур активных центров нескольких представителей этого класса ферментов, а также установление структурных основ ингибирования пепсина малыми молекулами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гущина, Алла Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Получен набор фаз структурных амплитуд кристаллов пепсина, необходимых для расчета разностных синтезов фурье комплексов пепсина с ингибиторами. Для этого в дополнение к использованным ранее тяжелоатомным производным методом без экранной прецессии были собраны экспериментальные данные для нового производного пепсина с соединением Р^(Л/Н3)г(Хя и проведены соответствующие расчеты.

2. Получены кристаллы комплексов пепсина с ингибитором Фен-ТирЗ^-ОМе и для них собраны экспериментальные данные в зоне о разрешения 50-3 А на дифрактометре КАД-4Ф.

3. Проведено сопоставление трехмерных структур активных центров пепсина и двух других аспартатных протеиназ (Penicidium

Janiinetlum и RkiSopujg chmengi^ ) на основе данных уточне0 ния атомных координат при разрешении 2 А. Описаны характерные особенности зоны активного центра фермента, включая область расположения активных аспарагиновых кислот и участки и связывания субстрата.

4. Установлено, что в активном центре пепсина вблизи и мест связывания субстрата находятся три молекулы этанола.

Определены связи, которые они образуют с группами фермента. Объяснены ингибирующие свойства этанола.

5. На основе рентгенографических данных построена модель связывания дипептида Фен-ТирЗ^-ОМе молекулой фермента. Проведено совместное уточнение структуры комплекса пепсина с ингибитором и определены контакты дипептида с группами бежа.

6. Объяснены ингибирующие свойства Фен-Тир12~0Ме на основе построенной модели.

7. На основе результатов исследований комплексов пепсина с эпоксисоединениями и дипептидом ТирЗ^-Тщ^-ОМе показано, что связывание фенольных колец в участке сопровождается достаточно большими конформационными изменениями в структуре пепсина, которые приводят к нарушению изоморфизма моноклинных кристаллов.

8. Предложено объяснение изменения каталитических свойств пепсина в зависимости от длины субстрата на основании анализа особенностей зон связывания субстрата пепсином и изучения структур его комплексов с ингибиторами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гущина, Алла Евгеньевна, Москва

1. Foltmann В. and Pedersen V.B. Comparison of the primary structures of acid proteinases and of their zymogens. - Adv.Exp. Med.Biol., 1977, v.95, p.3-22.

2. Poltmann B. Gastric Proteinases Structure, Function, Evolution and Mechanism of Action. - Essay in Biochemistry, 1981, v.17, p.52-84.

3. Seyffers M.J., Miller L.L. and Segal H.L. Partial Characterization of Human Pepsin I, Pepsin II A, Pepsin II В and Pepsin III. Biochemistry, 1964, v.3, N 9, p.1203-1209.

4. Antonini J. and Ribacleau Dumas B. Isolement, purification et proprietes de deux zymogenes gastriques bovins. Biochimie, 1971, v.53, U 3, p.321-329.

5. Tang J. Gastricsin and Pepsin. In: Methods in Enzymology, 1970, v.19, p.406-421.

6. Barret A.J. Cathepsin D and other carboxyl proteinases. -Res.Monogr.Cell Tissue Physiol., 1977, v.2, p.209-248.

7. Inagami Т., Murakami K., Misono K., Workman I.J., Cohen S., Suketa Y. Renin and precusors: purification characterization and studies on active center. Adv.Exptl.Med.Biol., 1977, v.95, p.225-248.

8. Sardinas J.L. Adv.Appl.Microbiol.,1972,v.l5, p.39-73.

9. Hoffmann T. Structure, function and evolution of acid proteases. Adv.in Chem.Ser., 1974, v.136, p.146-185.

10. Лобарева Л.С., Степанов В.М. Карбоксильные протеиназы плесневых грибов. Успехи биол.наук, 1978, т.19, с.83-105.

11. Umezawa Н., Aoyagi Т., Morishima Н,, Matsuzaki М., Hamada М., Takeuchi Т. Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by ac-tinomycetes. J.Antibiot., 1971, v.23, N 5, p.259-262.

12. Tang J., Sepulveda P., Marciniszym J. et al. Amino-Acid Sequence, of Porcine Pepsin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1973, v.70, N12, p.3437-3439.

13. Hsu I.-N., Delbaere L.T.J., James M.N.G., Hofmann T. Peni-cillopepsin from Penicillium janthinellum crystal structure at 2.8 A resolution and sequence homology with porcine pepsin. Nature, 1977, v.266, N5597, p.140-145.

14. Foltmann В., Pedersen V.B., Kaufman D., Wybrandt G. The primary structure of Calf Chymosin. J.Biol.Chem., 1979, v.254, N17, p.8447-8456.

15. Котлова E.K. Исследование первичной структуры аспергиллопепси-на А карбоксильной протеиназы из Aspergillus awamori : Авто-реф. дис. на соискание уч. ст. канд. хим. наук. М.:Московский университет, 1981, 19 с.

16. Gripon J.С., Rhee S.H., Hofmann Т. N-terminal amino acid sequence of acid proteases: Rhizopus chinensis and alignment v/ith penicillopepsin and mammalian proteases. Canad.J.Bio-chem., 1977, v.55, N5, p.504-506.

17. Sepulveda P., Jackson K., Tang J. The Amino terminal sequences of acid proteases human pepsin and gastricsin, and the protease of Rhizopus chinensis. - Biochem.and Biophys.Res. Commun., 1975, v.63, N4, p.1106-1112.

18. Takahashi K., Chang V/.-J., Arima K. The structure and function of Acid proteases. J.Biochem., 1976, v.80, N1, p.61-67.

19. Котлова Е.К.,Остославская В.И.,Ревина Л.П. и др. Первичнаяструктура аспергиллопепсина А карбоксильной протеиназы из Aspergillus awamori .II.Аминокислотные последовательности химо-триптических пептидов. - Биоорган.химия, 1981, т.7, ЖЕ,с,58-67.

20. Степанов В.М.,Лавренева Г.И.,Руденская Г.Н.Гончар М.В.,Лобаре-ва Л.С.,Котлова Е.К.,Стронгин А.Я.,Баратова Л.А.,Белякова Л.П. Исследование пепсинов лошади. Биохимия,1976,т.41,№7,с.1285-90,

21. Ichishima Е., Yoshida Р. Conformation of aspergillopeptida-se A in aqueous solution. Biochim.et Biophys.Acta, 1966, v. 128, N 1, p.130-135.

22. Ichishima E., Yoshida P. Ultraviolet optical rotatory dispersion of Aspergillopeptidase A. Agr.Biol.Chem., 1967, v.31, N4, p.507-510.

23. Tsuru D., Hattori A., Tsuj H., Fukumoto J. Studies on mold protease of Rhizopus chinensis acid protease. J.Biochem., 1970, v.67, N3, p.415-420.

24. Mcbride-Warren P.A., Rickert W.S. Structural and functional determinants of Mucor michei protease.II.Circular dichroic studies on the native and periodata oxidized enzyme. Biochim.et biophys.acta, 1973, v.328, N1,p.52-60.

25. Jirgensons B. The far-ultraviolet cotton effects and conformation of ribonuclease and pepsin. J.Amer.Chem.Soc., 1967, v.89, N23, p.5979-5981.

26. Perlmann G.E. Effect of solvents and the temperature on the optical rotatory properties of pepsin. Proc.^atl.Acad.Sci. USA, 1959, v.45, N7, p.915-922.

27. Jirgensons В., Ikenaka Т., Gorguraki V. Chromatographic fractionation of crystallized rennin. Macromol.Chem., 1958, v. 28, N2,p.96-102.

28. Bernal J.D., Crowfoot D. X-ray photographs of crystalline

29. Pepsin. Nature, 1934, v.133, p.794-795.

30. Андреева H.С.,Борисов В.В.,Мелик-Адамян В.Р. и др. Определение трехмерной структуры пепсина с разрешением 5.5-5.0 А. Молекулярная биология,1971,т.5,№6,с.908-916.

31. Андреева Н.С.,Федоров А.А.,Гущина А.Е.Рискулов P.P.,Шуцкевер Н.Е.,Сафро М.Г. Рентгеноструктурный анализ пепсина.У.Конформаци; главной цепи фермента.-Молекулярная биология, 1978, т. 12, М, с. 922-935.

32. Andreeva U.S., Gustchina А.Е., Pedorov A.A., Shytzkever N.E. and Volnova T.V. X-Ray crystallographic studies of pepsin. -Adv.Exptl.Med.Biol., 1977, v.95, p.23-31.

33. James M.N.G., Sielecki A.R. Structure and Refinement of Peni-cillopepsin at 1.8 A Resolution. J.Mol.Biol., 1983, v.163, N2, p.299-361.

34. Subramanian E., Liu M., Davies D.R. The crystal structure ofоan acid protease from Rhizopus Chinensis at 2.5 A resolution. Adv.Exptl.Med.Biol., 1977, v.95, p.33-43.

35. Subramanian E., Swan I.D.A., Liu M., Davies D.R., Jenkins

36. J.A., Tickle I.J. and Blundell T.L. Homology among acid pro0tease: comparison of crystal structures at 3 A resolution of acid proteases from Rhizopus Chinensis and Endothia Parasitica. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1977, v.74, N2, p.556-559.

37. Wong C.-H., Lee I.-Y., Lu T.-H., Yang L.-H. Structure of acid protease from Endothia parasitica in cross-linked form at

38. A resolution. Biochemistry, 1979, v.18, N8, p.1638-1640.

39. Jenkins J.A., Tickle I.J., Sewell Т., Ungaretti L., Wollmer A. and Blundell T.L. X-Ray analysis and circular dichroism of the acid protease from Endothia parasitica and chymosin. -Adv.Exptl.Med.Biol., 1977, v.95, p.43-59.

40. Tang J., James M.N.G., Hsu I.-N. et al. Structural evidence for gene duplication in the evolution of the acid protease.- Nature, 1978, v.271, N 5614, p.618-621.

41. Andreeva U.S., Gustchina A.E., Fedorov A.A., Zdanov A.S.

42. Structure of Porcine Pepsin complexes with methyl ester of

43. Phenylalanile-Diiodtyrozine at 3 A resolution. in press.

44. Федоров А.А. Рентгеноструктурнык анализ конформации молекулы пепсина: Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд. хим. наук. М.:Ин-т молекулярной биологии, 1979, 21 с.

45. Andreeva U.S., Gustchina A.E. On the supersecondary structure of acid proteases. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1979, v.87,N1,p.32-42.

46. Sternberg M.J., Thornton J.M. On the conformation of Proteins: The handedness of the connection between parallel -strands.- J.Mol.Biol., 1977, v.ll0,N2, p.269-283.

47. Blundell T.L., Sewell B.T. and McLachlan A.D. Pour-fold structural repeat in the acid proteases. Biochim.et Biophys.Acta, 1979, v.580, N1, p.24-37.

48. Tang J. Evolution in the structure and function of carboxyl proteases. Molec.and Cellular Biochem., 1979, v.26, N2, p. 93108.

49. Levitt M., Ghothia C. Structural patterns in globular proteins.- Nature, 1978, v.261, N 5561, p.552-557.

50. Андреева H.C.,Федоров А.А.,Гущина A.E. и др. Определение трехмерной структуры пепсина при разрешении 2.7 А. Докл.АН СССР, 1976, т.228, Ш, с.480-483.

51. James М., Hsu I.-N., Delbaere L. Mechanism of acid proteases catalysis based on the crystal structure of penicillopepsin.- Nature, 1977, v.267, N 5614, p.808-814.

52. Subramanian E., Swan I.D.A., Davies D. The crystal structureat 5.5 A resolution of an acid protease from Rhizopus chinensis. Biochem.Biophys Res.Com., 1976, v.68, N3,p.875-880.

53. Bott R., Subramanian E. and Davies D.R. The three-dimensional structure of the complex of the Rhizopus chinensis Carboxyl Proteinase and Pepstatin at 2.5 A resolution. Biochemistry, 1982, v.21, N26, p.6956-6962.

54. Hollands T.R. , Pruton J.S. Kinetic of the hydrolysis of synthetic substrate by pepsin and by acetylpepsin. Biochemistry, 1968, v.7, N6, p.2045-2053.

55. Hollands T.R., Pruton J.S. On the mechanism of pepsin action. Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 1969, v.62, N4,p.1116-1120.

56. Kunimoto S., Aoyagi T. Morishima H., Takeuchi T. and Umezawa H. Mechanism of inhibition of pepsin by pepstatin. J.Anti-biot., 1972, v.25, N4, p.251-255.

57. Hofmann Т., Shaw R. Proteolytic enzymes of Penicillium janthi-nellum.I.Purification and properties of a trypsinogen activating enzyme (peptidase A) . Biochem.et Biophys.Acta, 1964, v.92, N3, p.543-557.

58. Ichishima E., Yoshida P. Molecular weight and amino acid composition of Aspergillus saitoi. Biochim.et Biophys.Acta, 1965,y.110, N1, p.155-161.

59. Tomoda K.?Acid protease produced by Trametes sanquinea, a wod-destroying fungus. Part II. Physical and enzymological properties of the enzyme. Agr.and Biol.Chem., 1964, v.28, N11, p. 774-778.

60. Delpierre G.R., Pruton J.S. Inactivation of pepsin by diphe-nyldiazomethane. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1965, v.54,N4,p.1161-1167.

61. Локшина Л.А.,Лика Г.В.,Гинодман Л.М.,Валуева Т.А. и Орехович

62. В.Н. Изучение взаимодействия куриного пепсина с диазокарбониль-ными ингибиторами. Биохимия,1971,т.36,М,с.799-805.

63. Landblad R.L., Stein W.H. On the reaction of diazoacetyl compound with pepsin. J.Biol.Chem., 1969, v.244, N1, p.154-160.

64. Fry K, Kim 0.-Ш., Spona J., Hamilton G.A. Site of reaction of a specific diazo inactivator of pepsin. Biochemistry, 1970, v.9, N24, p.4624-4632.

65. Bayliss R.S., Knowls J.R., Wybrandt G.B. An aspartic acid residue at the active site of pepsin.The isolation and sequence of the heptapeptide. Biochem.J., 1969, v.113, p.377.

66. Chang W.J., Takahashi K. The structure and function of acid proteases.III.Isolation and characterization of the active site peptides from bovine rennin. Biochem.J., 1974, v.76, N3, p.467-474.

67. Sodek J., Hofmann T. Amino acid sequence around the active site aspartic acid in penicillopepsin. Canad.J.Biochem.,1970, v.48, N9, p.1014-1016.

68. Tang J. Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate like epoxides. J.Biol.Chem., 1971, v.246, N14, p.4510-4517.

69. Hartsuck J.A. and Tang J. The carboxylate ion in the active center of pepsin. J.Biol.Chem., 1972, v.247, N8, p.2575-2580.- 134

70. Kirk C.S. Chen and Tang J, Amino acid sequence around the Epoxidreactive residues in pepsin. J.Biol.Chem., 1972, v.247, N8, p.2566-2574.

71. Nakamura S., Takahashi K. Amino acid sequence around 1,2-epo-xy-3-(p-nitrophenoxy) propane reactive residues in Rhizopus chinensis acid proteases; homology vd.th pepsin and rennin. -J.Biochem., 1977, v.81, N3,p.805-807.

72. Kunimoto S., Aoyagi Т., Nishizawa R., Komai.T,1, Takeuchi Т., Umezawa H. Mechanism of inhibition of pepsin by pepstatin. -J.Antibiot., 1974, v.27, N6, p.413-418.

73. Marginiszyn J., Hartsuck J., Tang J. Mode of inhibition of acid proteases by pepstatin. J.Biol.Chem., 1976, v.251, N22, p.7088-7094.

74. Workman R.J., Burkitt D.W. Pepsin inhibition by a high specific activity radioiodinated derivative of pepstatin. Arch. Biochem.Biophys., 1979, v.194, N1, p.157-164.

75. Rich D.H., Sun E., Singh J. Synthesis of dideoxy-pepstatin. Mechanism of inhibition of porcine pepsin. Biochem.Biophys. Res.Commun., 1977, v.74, N2, p.762-767.

76. Pruton J.S. Specificity and mechanism of pepsin action. -Adv.Enzymol., 1970, v.33, p.401-443.

77. Tang J. Pepsin and pepsinogen; model for carboxyl (acid) proteases and their zymogens. Trends Biochem.Sci., 1976, v.l, N9, p.205-208.

78. Knowls J.R. On the mechanism of action of pepsin. Phil. Trans.Roy.Soc.London, 1970, B257, 135-146.

79. Denburg J.L., Nelson R., Silver M.S. The effect of pH on the rates of hydrolysis of the three acylated dipeptides by pepsin. J.Amer.Chem.Soc., 1968, v.90, N2,p.479-486.

80. Козлов Л.В.,3авада Л.Л. Зависимость от величины рН механизмадействия пепсина. Молек.биол., Г975, т.9с.735-741.

81. James M.N.G., Williams G.Y.B. A refinement of the crystal structure of maleic acid. Acta Cryst., 1974, v.B30, N5, p.1249-1257.

82. Ross W.C.G. The reactions of certain epoxides in aqueous solutions. J.Chem.Soс., 1950, N6, p.2257-2272.

83. Erlanger B.P., Y/ratsanos S.M., Wassermann N. and Cooper A.G. Specific and Reversible inactivation of Pepsin. J.Biol.Chem., 1965, v.240, N8, p.3447-3448.

84. Erlanger B.F., Wratsanos S.M., Wassermann N. and Cooper A.G. A chemical investigation of the active center of pepsin. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1966, v.23, N3, p.243-245.

85. Erlanger B.P. , Wratsanos S.M., V/assermann N. and Cooper A.G. Stereochemical investigation of the active center of pepsin using a new inactivator. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1967, v.28, N2, p.203-208.

86. Tang J. Specific and irreversible inactivation of Pepsin by substrate-like epoxide. J.Biol.Chem., 1971, v.246, N14, p.4510-4517.

87. Kunimoto S., Aoyagi Т., Nishizawa R., Komai Т., Takushi T. and Umezawa H. Mechanism of inhibition of pepsin by pepstatin.- J.Antibiot., 1974, Ser.B, v.27, N6, p.413-418.

88. Tarasova N.I., Lavrenova G.I., Stepanov V.M. -Bromo-4amino--3-nitroacetophenone, a new reagent for protein modification. Modification of the methionine-290 residue of porcine pepsin.- Biochem.J., 1980, v.187, N2, p.345-352.

89. Perlmann G.E. Acetylation of pepsin and pepsinogen. J.Biol. Chem., 1966, v.241, N1, p.153-157.

90. Локшина Л.А.,0рехович В.И. Изучение действия ацетилимцдазолана пепсин. Биохимия, 1966, т.31, вып.1, с.143-150.

91. Humphreys R.E., Fruton J.S. The substrate binding site of pepsin. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1968, v.59, N2, p.519-525.

92. Hollands T.R., Fruton J.S. Kinetics of the hydrolysis of Synthetic substrates by pepsin and by acetylpepsin. Biochemistry, 1968, v.7, N6, p.2045-2053.

93. Raji Е.У., Humphreys R.E. and Fruton J.S. Gel filtration studies on the binding of peptides to pepsin. Biochemistry, 1972, v.11, N19, p.3533-3536.

94. Локшина Л.А.Дюклова Т.А.,0рехович B.H. Сравнительное исследование реакций пепсинов курицы и свиньи с различными ингибиторами. Биохимия, 1972, т.37, $2, с.275-282.

95. Rimon S., Perlmann G.E. Carbamylation of pepsinogen and pepsin. J.Biol.Chem., 1968, v.243, N13, p.3566-3572.

96. Herriot R.M. Inactivation of pepsin by iodine and isolation of diiodtyrosine from iodinated pepsin. J.Gen.Physiol., 1937, v.20, N2, p.335-352.

97. Herriot R.M. Inactivation of pepsin by iodine. Isolation of crystalline L-monoiodotyrosine from partially iodinated pepsin. J.Gen.Physiol., 1941, v.25, N1, p.185-195.

98. Mains G., Burchell R.H., Hofmann T. Identification of the iodine sensitive tyrosines in porcine pepsin. Biochem.Biophys. Res.Commun., 1973, v.54, N1, p.275-282.

99. Yu J., Tamura G., Arima K. Milk-clotting enzyme from microorganisms. VIII. Active center of milk-clotting enzyme (microren-nin) isolated from Mucor pustllus. Agr.Biol.Chem., 1971, v.35, N8, p.1194-1199.

100. Blundell T.L., Jenkins J.A., Khan G., Chwdhury P.R., Sev/ell Т., Tickle I.J. and Wood E.A. The threedimensional structures of acid proteinases. In: Proc.of 12th FEBS Meeting, Pergamon Press, 1977, v.52, p.81-94.

101. Завада Л.Л,Козлов Л.В.,Коган Г.А.Нитрование тирозиновых остатков в пепсине тетраяитрометаном.-Биохимия,1969,т.34,М1,с.1257-{

102. Завада Л.Л.,Козлов Л.В.,Волкова Л.И.Антонов В.К. Остаток тирозина в субстратсвязывающем центре активного центра пепсина. -Биоорган.химия, 1977, т.З, М2, С.1671-168Г.

103. Tsuru D., Fujiwara К., Watanaba R., Yoshimoto Т., Hayashida S., Tomomatsu M,, Okoshi Y. Inactivation of Rhizopus chinensis and protease by some diazo compounds. J.Biochem., 1974, v.75,N2, p.261-268.

104. ЮС. Тарасова Н.И. Химическая модификация карбоксильных протеиназ: Авторе®, дис. на соискание уч. ст. канд. хим. наук. М.:Московский университет, 1981, 18 с.

105. Sepulveda P., Marciniszyn J., Liu D., Tang J. Primary structure of porcine pepsin. J.Biol.Chem., 1975, v.250, N13,p. 5082-5088.

106. James M.N.G. An X-ray crystallographic approach to enzyme structure and function. Can.J.Biochem., 1980, v.58, N4, p.251-271.

107. Trout G.E. and Fruton J.S. The side-chain specificity of pepsin. Biochemistry, 1969, v.8, N10, p.4183-4190.

108. Fruton J.S. Pepsin. The Enzymes (3rd edition) , 1971, v.3, p.119-164.

109. Fruton J.S. Mechanism of the catalytic action of pepsin and related acid proteases. Adv.Enzymol., 1976, v.44, p.1-36.

110. Fruton J.S. Specificity and mechanism of pepsin action on synthetic substrates. Adv.ExptI.Biol.Med., 1977, v.95, p. 131-140.

111. Clement G.E. Catalytic activity of pepsin. In: Progress in bioorganic chemistry/Eds. Kaiser E.T., Kezdy F.J.N.-Y.:

112. John Wiley and Sons, 1973, v.2, p.177-238.

113. Powers J.C., Harley A.Dale, Myers D.V. Subsite specificity of porcine pepsin. Adv.Exptl.Biol.Med., 1977, v.95, p.141-157.

114. Schechter, Berger. On the size of the active site in proteases.I.Pepsin. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1967, v.27, N1, p.157.

115. Pruton J.S. The specificity of proteinases toward protein substrates. In: Proteases and Biological Control/ Eds. Reich E., Rifkin D.B., Shaw E. Cold Spring Harbor Laboratory, 1975, v.2, p.33-50.

116. Tang J. Specificity of Pepsin and its dependence oh a possible "hydrophobic binding site". Nature, 1963, v.199, N4898, p.1094-1095,

117. Hill R.L. Hydrolysis of proteins. Adv.Prot.Chem., 1965, v.20, p.37-107.

118. Зинченко А.А.,Румш JI.Д.,Антонов В.К. Статистический анализ специфичности пепсина в отношении гидролиза белков. Биоорганическая химия, 1976, т.2, 1Г6, с.803-810.

119. Tanford С. Contribution of hydrophobic interactions of proteins to the stability of the globular conformation of proteins. J.Amer.Soc., 1962, v.84, N22, p.4240-4247.

120. Tatsushi Oka and Kazuyuki Morihara. Comparative specificity of microbial acid proteinases for synthetic peptides.I.Primary specificity. Arch.Biochem.Biophys., 1973, v.156, H2, P.543-551.

121. Mains G., Takahashi M., Sodek J. and Hofmann T. The specificity of penicillopepsin. Can.J.Biochem., 1971, v.49, N10, p.1134-1149.

122. Simons E.R., Pasman G.D., Blout E.R. The pepsin-catalysedhydrolysis of the -helical form of Poly- , L-glutamic acid. J.Biol.Chem., 1961, v.236, N12, p.PC64-PC65.

123. Sodek J. and Hofmann T. Microbial acid proteinases. Methods Enzymol., 1970, v.19, p.372-396.

124. Morihara К., Oka T. Comparative specificity of microbial acid proteinases for synthetic peptides.III.Relationship with their trypsinogen activating ability. Arch.Biochem.Biophys., 1973, v.157, N2, p.561-572.

125. Tatsushi Oka and Kazuyki Morihara. Comparative specificity of microbial acid proteinases for synthetic peptides.Primary specificity with Z-tetrapeptides. Arch.Biochem.Biophys., 1974, v.165, N1, p.65-74.

126. Зинченко А.А.,Румш Л.Д.Антонов В.К. Кинетический и термодинамический анализ специфичности пепсина. Биоорган.химия, 1977, т.З, Ж2, с.1663-1670.

127. Medzihradszkyl.K. ,Voynick I.M. ,Medzihradszky-Schweiger H. .Fruton J.S. Effect of secondary enzyme-substrate interactions on the clevage of synthetic peptides by pepsin. Biochemistry, 1970, v.9, N5, p.1154-1162.

128. Tatsushi Oka and Kazuyuki Morihara. Comparative specificity of microbial acid proteinases for synthetic peptides.II.Effect of secondary interaction. Arch.Biochem.Biophys., 1973, v.156, N2, p.552-559.

129. Voynick I.M., Fruton J.S. The comparative specificity of acid proteinase. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1971, v.68, N2, p.257-259.

130. Ken Inouge, Voynick I.M., Delpierre G.R., Fruton J.S. New synthetic substrates for pepsin. Biochemistry, 1966, v.5, N7, p.2473-2483.

131. Blundell T.L., Jones H.B., Khan G et al. The active site ofacid proteinases. In: Trends in enzymology. Eds.Mildner P., Ries B. N.-Y.:Pergamon Press, 1979, v.60, p.281-288.

132. Pruton J.S. Fluorescence studies on the active sites of proteinases. Mol.Cell.Biochem., 1980, v.32, N2, p.105-114.

133. Perlmann G.E., Kerwar G.A. Conformational change of pepsin induced by its substrate N-acetyl-l-Phenylalanyl-1-3,5-di-iodoTyrosine. Arch.Biochem.Biophys., 1973, v.157, N1, p.145-147.

134. Takahashi M., Hofmann T. Acyl intermediates in penicillopepsin. Catalysed reactions and a discussion of the mechanismof action of pepsin. Biochem.J., 1975, v.147, N3, p.549-563.

135. Newmark A.K., Knowles J.R. Acyl- and amino-transfer routesin pepsin-catalysed reactions. J.Amer.Chem.Soc., 1975, v.97, N12, p.3557-3559.

136. Pruton J.S., Fujii S., Knappenberger M.N. The mechanism of Pepsin action. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1961, v.47, N5, p.759-761.

137. Антонов В.К. Специфичность и механизм действия протеолитичес-ких ферментов. Биоорган.химия,1980,т.6,№6,с.805-839.

138. Antonov V.K., Ginodman Ъ.М., Kapitannikov Yu.V., Barshevskaya Т.Ш., Gurova A.G., Rumsh L.D. Mechanism of pepsin catalysis: general base catalysis by the active-site carboxylate ion. FEBS Lett., 1978, v.88, HI, p.87-90.

139. Бакулина В.M.,Борисов В.В.,Мелик-Адамян В.Р. ,П1уцкевер Н.Е., Андреева Н.С. Рентгеноструктурные исследования пепсина.I. Кристаллизация и получение изоморфных производных. Кристаллография, 1968, т.13, вып.1, с.44-48.

140. Perlmann G.E. The nature of phosphorus linkages in phosphoro-proteins. Adv.in Prot.Chem., 1955, v.10, p.lv30.

141. Матяш Л.Ф. Ртутноорганические реагенты для модифицирования белков:Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд. хим. наук. М.: Ин-т биоорганической химии, 1966, 22 с.

142. Андреева Н.С.,Мелик-Адамян В.Р., Шуцкевер Н.Е. Рентгеноструктурные исследования пепсина.1У.Определение параметров тяжелых атомов в трех производных пепсина. Кристаллография, 1972,т. 17, )?3, с.533-536.

143. Борисов В.В.,Мелик-Адамян В.Р.,Шуцкевер Н.Е.,Сотникова Л.Е., Аццреева Н.С. Структура пепсина: проекция электронной плоскости с разрешением 5.5 А. Молекулярная биология, 1967, т.1, вып.4, с.596-602.

144. Petsko G.A., Phillips D.C., Williams R.J,P. Wilson I.A. On the protein crystal chemistry of chlorplatinite ions: general principles and interactions with Triose Phosphate Isomerase. J.Mol.Biol., 1978, v.120, N3, p.345-359.

145. Xuong Ng.H., Krant J., Seely 0., Freer S.T. and Wright C.S. Rapid measurement of large numbers of reflection intensities for proteins. Acta Cryst., 1968, v.B24, N2, p.289-291.

146. Xuong Ng.H., Freer S.T. Reflection Intensity measurement by screenless precession photography. Acta Cryst., 1971, v. B27, N12, p.2380-2387.

147. Xuong Ng.H. An automatic scanning densitometer and its application to X-ray crystallography. J.Sci.Instrum., 1969, v.2, p.485-489.

148. Abrahamsson S. A computer-controlled film scanner. J.Sci. Instrum., 1966, v.43,N12, p.931-933.

149. Arndt U.W., Crowther R.A. and Mallett J.F.W. A computer-linked cathode-rya tube microdensitometer for x-ray cryctallogra-phy. J.Sci.Instrum., 1968, v.l, N5, p.510-516.

150. Buerger M.J. The precession method in X-ray crystallography. N.-Y.: John Wiley and Sons, 1964.

151. Arndt U.W. and Wonacott A.J./ Eds. The rotation method in crystallography. Amsterdam New-York - Oxford: North-Holland Publishing Company, 1977, 275 p.

152. Rulmann A., Kukla D., Schwager P., Bartels K., Huber R. Structure of the complex formed by Bovine Trypsin and Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor. J.Mol.Biol., 1973, v.77, N3,p.417-436.

153. Bode W., Schwager P. The refined crystal structure of Bovine -Trypsin at 1.8 A resolution. J.Mol.Biol., 1975, v.98, N4, p.693-717.

154. Гущина A.E., Андреева H.C. Опыт работы с фотосканом фирмы "Оптроникс". Аппаратура и методы рентгеновского анализа, 1977, вып.18, с.142-148.

155. Hamilton W.C., Rollet J.S., Sparks R.A. On the relative scaling of X-ray photographs. Acta Cryst., 1965, v.18, N1, p.129.130.

156. Андреева Н.С.,Федоров А.А.,Сафро М.Г. Тр. совещание по программированию и математическим методам решения физических задач, .1977, Дубна: ОИЯИ, с.25-33.

157. Мелик-Адамян В.Р. Рентгеноструктурные исследования пепсина: Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд. ф.-м. наук. М.: Институт кристаллографии АН СССР, 1969, 16 с.

158. Шуцкевер Н.Е. Некоторые этапы исследования трехмерной структуры пепсина: Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд. ф.-м. наук. М.:Московский университет, 1972, 23 с.

159. Muirhead Н., Сох J.M., Mazzarella L., Perutz M.F. Structure and function of Haemoglobin.III. A Three-dimensional fourier synthesis of Human Deoxyhaemoglobin at 5.5 A resolution. -J.Mol.Biol., 1967, v.28, N1, p.117-156.

160. Бланделл Т.,Джонсон JI.Кристаллография белка. М. :Мир, 1979.

161. Андреева Н.С.,Гущина А.Е.Федоров А.А.,Жданов А.С. Структура активного центра карбоксильных протеиназ по данным структурного анализа. В мат. У Всесоюзного симпозиума по химии и физике белков и пептидов, Баку, 1980, с.7.

162. Гущина А.Е., Федоров А.А. Рентгеноструктурные исследования комплексов пепсина с фенилаланилдииодтирозином. В мат. III Советско-Шведского симпозиума по физико-химической биологии, Тбилиси, 1981, с.115.

163. Андреева Н.С.,Федоров А.А.Жданов А.С.,Гущина А.Е. Последние данные о структуре и функции карбоксильных протеиназ. В мат. III симпозиума СССР-ФРГ по химии пептидов и белков, Махачкала, 1980, с.16.

164. Lee В., Richards F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. J.Mol.Biol., 1971,v.55, N3, p.379-400.

165. Shrake A., Rupley J.A. Environment and exposure to solvent of protein atoms. Lysozyme and Insulin. J.Mol.Biol., 1973, v.79, N2, p.351-371.

166. Жданов А.С.,Андреева H.C. Кристаллографическое уточнение трехмерной структуры пепсина при разрешении 2 А. ДАН СССР, 1983,. т.272, М, с.109-112.

167. Tang J. Competitive inhibition of pepsin by aliphatic alcohols. J.Biol.Chem., 1965, v.240, N10, p.3810-3815.

168. Antonov V.K.,New data of Pepsin mechanism and Specificity. Adv.Exptl.Med.Biol., 1977, v."95, p.179-178.

169. Андреева H.C.,Гущина A.E.,Федоров А.А. Рентгенострутиурные исследования связывания фенилаланилдииодтирозина пепсиноМ( при разрешении ЗА. ДАН СССР, 1981, т.259, №5, с.1261-1264.

170. Nakatani Н., Kitagishi К., Hiromi К. Studies on the binding between acid proteinases and aliphatic alcohols with dyes as probes . J.Biochem., 1980, v.87, N2, p.563-571.

171. Kitagishi K., Nakatani H., Hiromi K. Static and kinetic studies on the binding between Pepsin and Streptomyces Pepsin inhibitor with a fluorescent probe. J.Biochem., 1980, v.87, N2, p.573-579.

172. Richards P.M. The matching of physical models to three-dimensional electron-density maps: a simple optical device. J. Mol.Biol., 1968, v.37, N1, p.225-230.

173. Jack A. Levitt M. Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R-factor. Acta Cryst., 1978, A34, p.931-935.

174. Jack A., Lauder J., Klug A. Crystallographic refinement ofсyeast phenylalanine transfer RNA at 2.5 A resolution. J. Mo1.Biol., 1976, v.108, N4, p.619-649.

175. Levitt M. Energy refinement of hen egg-white Lysozyme. J. Mol.Biol., 1974, v.82, N3, p.393-420.

176. Jorgensen W.L., Madura J.D. Solvation and conformation of methanol in water. J.Amer.Chem.Soc., 1983, v.105, N6, p. 1407-1413.

177. Гущина A.E.Андреева H.C.,Антонов B.K. Расположение молекул этанола в активном центре пепсина. Биоорганическая химия, 1983, т.9, ЖЕ2, с.1620-1624.

178. Jacson V/.Т., Schlamowitz М., Shaw A. Kinetics of the Pepsin-catalyzed hydrolysis of N-Acetyl-l-phenylalanyl-l-diiodotyro' sine. Biochemistry, 1965, v.4, N8, p.1537-1543.

179. Bohak Zvi. Chicken pepsinogen and chicken Pepsin. Methods in Enzymology, 1970, v.19, p.347-357.

180. Friedman L. Properties of remain. Diss.Abstr., I960, v.20, p.4510.

181. Bandys M., Kostka V. Covalent structure of chicken pepsinogen. Eur.J.Biochem., 1983, v.136, N1, p.89-99.

182. Левчук Т.П.,0рехович B.H. Получение и некоторые свойства куриного пепсина. Биохимия, 1963, т.28, вып.6, стр. 10041010.

183. Becker R., Shechter Y., Bohak Z. Activation of chicken pepsin by modification of its cysteine residue with o-nitrophe-nyl sulfenyl chloride. FEBS letters, 1973, v.36, N1, p.49-52.

184. Shechter Y., Rubinstein M., Becker R., Bohak Z. Modylationof the enzymic activity of chicken pepsin by the covalent modification of its single -SH group. Eur.J.Biochem., 1975, v.58, N1, p.123-131.

185. Pohe J., Bandys M., Kostka V. Amino acid sequence around the reactive cysteinyl residue of chicken pepsin. Collection of Czechoslovak Chem.Commun., 1982, v.47, N12, p.3470-3474.