Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах"

На правах рукописи

Храмцов Юрий Викторович

ИЗУЧЕНИЕ САМОСБОРКИ МЕМБРАН

В ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛИПИД-ДЕТЕРГЕНТНЫХ СИСТЕМАХ

Специальность: 03.01.02. - "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва-2011

4845943

Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии Московского физико-технического института

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (Технологический университет)

Защита состоится «26» мая 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Автореферат разослан « 2-1 » апреля 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Научный руководитель:

кандидат химических наук Барсуков Леонид Иванович (ИБХ им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН) доктор физико-математических наук Ефремов Роман Гербертовпч (ИБХ им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН), доктор химических наук, доктор биологических наук Зайцев Сергей Юрьевич (МГАВМиБ им. К. И. Скрябина)

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук

М. Г. Страховская

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение процессов самосборки мембран в смешанных липид-детергентных системах является важной и актуальной проблемой биофизики мембран. Современные представления о структуре и функциях биологических мембран сформировались, во многом, благодаря введению в практику мембранных исследований методов солюбилизации и реконструкции мембран. Образующиеся в результате солюбилизации мембран детергентами термодинамически стабильные мицеллярные растворы исключительно удобны для исследования разнообразными физико-химическими методами. Эти растворы могут быть также использованы для выделения индивидуальных мембранных белков с целью изучения их строения и функциональной активности. Поскольку подавляющее большинство мембранных белков требуют полноценного мембранного окружения для проявления своей функциональной активности, принципиально важное значение приобретают такие методы реконструкции, которые позволяют получать искусственные мембраны с заданным составом, требуемой структурной организацией и необходимыми функциональными свойствами.

В основе процесса самосборки мембран при реконструкции лежит структурный переход между наноразмерными мицеллярными частицами и более крупными (порядка сотен нанометров) мембранными везикулами, обычно называемый переходом мицеллы-везикулы. Ранее проведенные исследования показали, что этот переход протекает с образованием ряда промежуточных надмолекулярных частиц, имеющих различное строение и морфологию. Однако, несмотря на широкое практическое применение данного перехода для реконструкции мембран, его молекулярные механизмы недостаточно изучены и нет определенной ясности и четкого представления о том, действие каких факторов является решающим на отдельных этапах самосборки мембран. Механизмы перехода мицеллы-везикулы удобнее всего изучать в термочувствительных липид-детергентных системах, где его можно индуцировать путём простого изменения температуры. Это позволяет лучше контролировать данный переход, а в изотермическом режиме изучить образующиеся промежуточные структуры.

При изучении самосборки надмолекулярных агрегатов важно понимать, как природа используемых амфифильных молекул определяет строение данных агрегатов. Наиболее простой и наглядный подход к решению данной задачи состоит в изучении упаковки молекул в этих агрегатах, описываемой набором геометрических параметров. Однако, некоторые из этих параметров довольно сложно, а порой и невозможно определить экспериментально, особенно в случае смешанных липид-детергентных систем. Тем не менее, ранее проведенные исследования показали, что даже приблизительные оценки этих параметров во многих случаях позволяют качественно, а иногда и количественно описать структурное поведение различных амфифильных систем. Поэтому важно иметь достаточно простой подход к их количественному определению. Изучение термоиндуцируемого перехода

мицеллы-везикулы в смешанных липид-детергентных системах позволяет разработать такой подход. Однако, процесс самосборки мембран в данных системах зависит от действия целого ряда факторов, во многом ещё не изученных и не систематизированных. Так, например, было не ясно, как природа детергента и липида влияет на характер перехода мицеллы-везикулы, т.к. систематические исследования в этом направлении до сих пор не были проведены.

Цель исследования заключалась в качественном и количественном описании процесса самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах.

Необходимо было решить следующие задачи:

- выявить основные факторы, определяющие процесс самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах;

- изучить влияние структуры липидных и детергентных молекул на характер термоиндуцируемого перехода мицеллы-везикулы в смешанных липид-детергентных системах различного типа;

- изучить тепловые процессы, протекающие в термочувствительных липид-детергентных системах при нагревании, и установить их связь с происходящими при этом структурными превращениями;

- разработать математическую модель перехода мицеллы-везикулы с целью определения параметров молекулярной упаковки и предсказания условий самосборки мембран в смешанных липид-детергентных системах.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое изучение влияния природы липида и детергента на процесс самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах. При этом, были использованы как ионные, так и неионные детергенты с различными размерами полярной головки и объёмом гидрофобной части, а также фосфатидилхолины, отличающиеся длиной и степенью ненасыщенности жирнокислотных цепей. Впервые показано, что самосборка мембран в термочувствительных липид-детергентных системах может быть индуцирована не только изменением состава смешанных агрегатов, но и изменением размера полярной головки детергента. Новым фактом является то, что на самосборку мембран существенное влияние оказывает также строение углеводородных цепей липида и детергента. Для смесей, содержащих соли желчных кислот, обнаружено поглощение тепла в ходе термоиндуцируемого перехода мицеллы-везикулы и предложена молекулярная модель, описывающая этот процесс.

Предложен новый способ определения температурной зависимости состава смешанных липид-детергентных агрегатов в условиях перехода мицеллы-везикулы. Данные зависимости и разработанная математическая модель, описывающая переход мицеллы-везикулы, позволили определить температурную зависимость площади, приходящейся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз, и предсказать условия, необходимые для формирования смешанных мембранных везикул.

Практическая значимость работы. Данные, полученные в представленной работе, могут быть использованы для оптимизации процесса самосборки мембран с требуемыми структурными и функциональными характеристиками, а также для более эффективного контроля включения в везикулы лекарственных препаратов и других веществ, что может найти широкое применение в молекулярной биологии, биотехнологии, медицине, химической и пищевой промышленности и косметологии. В нанотехнологии полученные данные могут быть использованы для целенаправленного создания наноразмериых липид-детергентных агрегатов необходимого строения и состава. Полученные данные о термоиндуцируемом переходе мицеллы-везикулы могут быть использованы для разработки новых систем доставки лекарственных препаратов, позволяющих осуществить контролируемое высвобождение этих препаратов путём простого изменения температуры. Кроме того, их можно применить при анализе условий формирования промежуточных структур этого перехода, например, бицелл - смешанных бислойных липид-детергентных агрегатов, способных ориентироваться в магнитном поле и широко применяющихся для структурного исследования белков с помощью метода ядерного магнитного резонанса. Полученные значения площади, приходящейся на одну молекулу детергента, могут оказаться полезными не только при изучении процесса самосборки мембран, но и при моделировании строения липид-детергентных агрегатов, при анализе межмолекулярных взаимодействий в этих агрегатах, а также при изучении связывания липидов и детергентов с интегральными мембранными белками.

Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на XLII, XLIII XLV научных конференциях МФТИ (Москва-Долгопрудный, 1999, 2000, 2002), XIII-XV международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001-2003), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002) и VI чтениях, посвященных памяти Ю.А. Овчинникова (Москва-Пушино, 2002). Работа также докладывалась в рамках семинаров кафедры физико-химической биологии и биотехнологии факультета молекулярной и биологической физики МФТИ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 в научных российских журналах по списку ВАК, а 5 в тезисах всероссийского съезда и международных школ и чтений.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 227 наименований. Работа изложена на 150 страницах с 45 рисунками и 6 таблицами.

Сокращения, принятые в работе. ХН - холат натрия, ДХН - дезоксихолат натрия, ХДХН - хенодезоксихолат натрия, 5ß-Xoji - Sß-холановая кислота, ДСН - додецилсульфат натрия, ОГ - октилглюкозид, Хол - холестерин, CnEm -алкильные эфиры полиэтиленгликоля, яФХ - яичный фосфатидилхолин, ДМ -

додецилмальтозид, ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин, ДПФХ -дипальмитоилфосфатидилхолин, ДСФХ - дистеароилфосфатидилхолин, ККМ -критическая концентрация мицеллообразования, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, 813 - среднеквадратичное отклонение, г -коэффициент корреляции.

Содержание диссертации 1. Введение

Рассмотрена актуальность изучения самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах. Обоснованы практическая ценность и новизна полученных результатов диссертационной работы, а так же указаны её цели и задачи.

2. Структурные превращения в системах, содержащих амфифильные соединения (обзор литературы)

В первой части обзора рассмотрены современные представления о структурообразовании в однокомпонентных амфифильных системах. Тип агрегатов можно описать как средней кривизной их поверхности, так и безразмерным параметром молекулярной упаковки, задаваемым средними параметрами геометрической упаковки амфифильных молекул. Описано, как на них влияют рН, ионная сила, давление, гидратация и температура.

Во второй части обзора рассмотрены структурные превращения в смешанных липид-детергентных системах. Сначала рассмотрена солюбилизация липидных мембран детергентом. Описаны свойства широко используемых детергентов, а также взаимодействие этих детергентов с липидной фазой. Рассмотрены два предполагаемых механизма солюбилизации липидных мембран детергентом. Согласно одному из них, в процессе солюбилизации сложных промежуточных структур не образуется, а в смеси сосуществуют смешанные мицеллы и насыщенные детергентом везикулы. Однако, наиболее вероятным является другой механизм, согласно которому морфология агрегатов изменяется более плавно с образованием различных промежуточных структур, таких как плоские бислойные агрегаты и сетчатые мицеллярные структуры. Затем рассмотрен переход мицеллы-везикулы в смешанных липид-детергентных системах. Описаны два предлагаемых механизма этого перехода. Согласно одному из них, сначала из мицелл образуются мембранные фрагменты, искривление и замыкание которых приводит к возникновению моноламеллярных везикул. В другом механизме, из нитевидных мицелл вначале образуются сетчатые структуры, превращающиеся

затем в мультислойные мембранные структуры, искривление и замыкание которых приводит к возникновению мультиламеллярных везикул.

В третьей части обзора рассмотрены некоторые практические приложения данных трансформаций, в частности изучение условий существования бицелл, а также солюбилизация мембранных белков и их последующее встраивание в мембраны с заданным составом.

3. Материалы и методы

В работе использовали ХН, ДХН, ДСН, ОГ и Хол (Calbiochem, Германия), ХДХН, 5Р-Хол, С„Ет (рис. 1), яФХ, и синтетические ДПФХ, ДСФХ (Sigma, США) и ДМФХ (Sigma, США и Lipoid, Германия). Используемые 5-10 мМ Трис-НС1-буферы (рН 7,3-8,1) готовили на воде, очищенной с помощью систем Milli-RO®15 и Milli-Q (Millipore Intertech Inc., США). Перед экспериментами рН изучаемых смесей доводили до нужных значений концентрированными растворами НС1 или NaOH. Концентрацию липида в смесях контролировали по содержанию фосфора [Gerlach Е., 1963].

Для наблюдения за ходом термоиндуцируемого перехода мицеллы-везикулы использован метод сканирующей турбидиметрии, который чувствителен к изменению размера частиц. Измерения проводили при длине волны 450 нм на спектрофотометре UVIKON 943 (KONTRON Instruments, США) с термостатируемым кюветным отделением и магнитной мешалкой, нагревая и охлаждая образцы с помощью программируемого термостата Polystat (Cole Parmer Instrument Co., США) в диапазоне 8-85°С со скоростью 0,8°С/мин при постоянном перемешивании. Температуру в кювете спектрофотометра измеряли с помощью термопары с точностью 0,1 "С.

Для изучения тепловых процессов в изучаемых системах использовался метод ДСК. Измерения проводили на микрокалориметре ДАСМ-4А (Россия) со скоростью сканирования 0,3°С/мин в температурном диапазоне 7-105°С при повышенном давлении в измерительной ячейке 2,6-2,8 атм.

ДСН: -^o-jj-o-N

5р-Хол Хол сн)

MxJ нАЛХ ОГ:

н Г"^ОН

он

Рис. 1. Строение ХН, ДХН, ХДХН, 50-Хол, Хол, ДСН, CnEm и ОГ.

4. Результаты и их обсуждение 4.1. Термоиндуцируемые структурные и фазовые переходы в системе ДМФХ-ХН

Для последующего сравнительного анализа система ДМФХ-ХН была выбрана в качестве исходной, т.к. в ней термоиндуцируемый переход мицеллы-везикулы ранее был изучен наиболее полно. Но, недостаточно исследовано влияние концентраций компонентов на этот переход и не охарактеризованы наблюдаемые изменения теплоёмкости смесей.

Изучение смесей ДМФХ-ХН проводили с помощью методов сканирующей турбидиметрии и ДСК в широком диапазоне концентраций ДМФХ и ХН (1-15 мМ) и температур (8-85°С). За переходом мицеллы-везикулы следили по возрастанию оптической плотности смесей при нагревании (рис. 2). Уровень, на который выходит эта оптическая плотность, для смесей разного состава мог сильно отличаться (рис. 2, кривые 1 и 2), что указывает на образование везикул разного размера. Это вполне объясняется двумя предложенными ранее механизмами этого перехода, описывающими образование крупных, мультиламеллярных и небольших, моноламеллярных везикул.

По мере увеличения концентрации детергента в смеси, пик на кривых ДСК, отвечающий основному фазовому переходу липида гель-жидкий кристалл (рис. За, кривая У), постепенно расщеплялся на три пика (рис. 36, кривая J). Низкотемпературный пик наблюдался при тех же температурах, что и падение оптической плотности смеси (рис. 36), отвечающее основному фазовому переходу липида в ламеллярных структурах (рис. За). А при температурах, когда наблюдался средний пик, оптическая плотность смеси существенно не менялась (рис. 36, Зв и Зг). Причём, этот пик наблюдался и для смесей в мицеллярном состоянии (рис. Зв и Зг). Поэтому, скорее всего, он объясняется основным фазовым переходом липида в смешанных мицеллах. Анализ зависимостей температур, энтальпий и ширин этих двух пиков от состава смеси

позволил подтвердить предложенную интерпретацию этих пиков, g Слишком высокие температуры,

2 д IíííhI которые может иметь

высокотемпературный пик на кривых ДСК, указывают на то, что он, скорее всего, вообще не связан с фазовыми переходами липида, а отвечает другому ё 20 40 о 60 эндотермическому тепловому процессу,

Температура, С происходящему при переходе мицеллы-

Рис. 2. Кривые сканирующей везикулы (рис. 3, ср. кривые 1 и 2). Этот

турбидиметрии для смесей тепловой процесс, вероятно, обусловлен

ДМФХ/ХН = 5:5 мМ (/) и 5 : 6 особым строением солей желчных

мМ (2). Схематически показаны кислот, т.к. в смесях с другими

мицеллы, ретикулярная гелевая детергентами он не наблюдался, фаза, моно- и мультиламеллярные Таким образом, механизм

везикулы. термоиндуцируемого перехода мицеллы-

40

О <

(а)

1

10 20 30 40 Температура, °С

■3,0 ^

-О

й

о

2,5 §

2,0

50

20 40 60 80 Температура, °С

10 20 30 Температура,

20 40 60 Температура, °С

Рис. 3. ДМФХ-5 : 8 (г)

Кривые ДСК (/) и сканирующей турбидиметрии (2) для -ХН. Показаны смеси ДМФХ : ХН (мМ): 5 : 0 (я), 5:2 (б), 15 Т,, Т2 и Т3- температуры максимумов пиков на кривых ДСК.

системы : 8 (в) и

везикулы в системе ДМФХ-ХН по-видимому можно изменять, просто варьируя концентрации липида и детергента. Низкотемпературный и средний пики на кривых ДСК для системы ДМФХ-ХН отвечают основному фазовому переходу липида гель-жидкий кристалл в ламеллярных структурах и смешанных мицеллах, соответственно. А высокотемпературный пик не связан с фазовыми переходами липида и отвечает поглощению тепла при переходе мицеллы-везикулы.

4.2. Влияние строения липидов и детергентов на переход мицеллы-везикулы в смешанных системах

Влияние строения жирнокислотных цепей фосфолипидных молекул Влияние строения жирнокислотных цепей фосфолипидных молекул, а также фазового перехода липида гель-жидкий кристалл на процесс самосборки мембран изучали на смесях холата натрия с фосфатидилхолинами разной длины (ДМФХ, ДПФХ и ДСФХ) и степени ненасыщенности жирнокислотных цепей (яФХ).

Температура начала перехода мицеллы-везикулы (рис. 4, Т4) для систем ДМФХ-ХН, ДПФХ-ХН и ДСФХ-ХН была всегда больше или равна температуре основного фазового перехода липида гель-жидкий кристалл в смешанных мицеллах (рис. 3, ср. кривые 1 и 2, средний пик). Однако, фазовый переход не всегда вызывает структурный переход, что видно на примере

0,2

0,1

О

30 60

Температура, °С Рис. 4. Характерная кривая сканирующей турбидиметрии для системы яФХ-ХН. Показана смесь яФХ/ХН = 5:10 мМ. Обозначения: Т4 - температура начала структурного перехода, ААпр -амплитуда структурного перехода, ДТпр - температурный диапазон, в котором наблюдается структурный переход.

жирнокислотных цепей молекул температурный диапазон, в котором на размер образующихся везикул.

системы яФХ-ХН (рис. 4), где липид во всём рабочем диапазоне температур уже находился в жидкокристаллическом состоянии.

По амплитуде структурного перехода ДАпр (рис. 4) было обнаружено, что в смесях ДПФХ-ХН, ДСФХ-ХН и яФХ-ХН, в отличие от смесей ДМФХ-ХН, при нагревании всегда образуются небольшие везикулы.

Температурный диапазон ДТпр (рис. 4) для системы яФХ-ХН (23,2 ± 1,7°С) был существенно шире, чем для систем ДМФХ-ХН (15 ± 3°С), ДПФХ-ХН (12,5 ± 1,7°С) и ДСФХ-ХН (14,8 * 1,0°С).

Итак, основной фазовый переход липида в смешанных липид-детергентных мицеллах является необходимым, но не достаточным условием процесса самосборки мембран при нагревании. Строение

липида может существенно влиять на наблюдается переход мицеллы-везикулы, и

> 1,

0,9

0 мМ

Влияние холестерина Холестерин (Хол) является важным компонентом биологических мембран и его широко используют при реконструкции модельных мембран. Для изучения

его влияния на процесс самосборки мембран изучена тройная система ДМФХ-ХН-Хол.

Добавление 0,5-1 мМ холестерина к смесям ДМФХ-ХН, содержащим 5 мМ ДМФХ, приводило к уширению пиков, отвечающих основному фазовому переходу липида, что обусловлено взаимодействием холестерина с жирнокислотными цепями молекул липида. Холестерин сильно влиял на размер образующихся при нагревании везикул и вид кривых турбидиметрии (рис. 5), что может указывать на изменение механизма перехода мицеллы-везикулы. В то время, как

0

0,5 мМ

0

30 60

Температура,°С

Рис. 5. Кривые сканирующей турбидиметрии, полученные для системы ДМФХ-ХН-Хол в зависимости от концентрации Хол в смеси ДМФХ/ХН = 5:5 мМ.

добавление холестерина, т.е. изменение плотности упаковки липидных молекул, практически не влияло на начало этого перехода (рис. 5). Следовательно, изменение плотности упаковки молекул липида при нагревании не способно вызвать переход мицеллы-везикулы в системе ДМФХ-ХН.

Таким образом, добавление холестерина может существенно влиять на механизм перехода мицеллы-везикулы, но практически не сказывается на температуре, при которой начинается этот переход. Изменение плотности упаковки молекул липида при нагревании не может вызвать самосборку мембран в системе ДМФХ-ХН.

Влияние строения молекул солей желчных кислот

Для изучения влияния размера полярной части ионного детергента на термоиндуцируемый переход мицеллы-везикулы выбрали желчные кислоты с разным числом гидроксильных групп (ХН, ДХН или ХДХН и 5(3-Хол (рис. 1)).

Параметры термоиндуцируемого структурного перехода (рис. 4) для систем ДМФХ-ДХН и ДМФХ-ХДХН в пределах ошибок измерений совпадают, т.е. положение гидроксильных групп в молекулах солей желчных кислот не влияет на данный переход. АТпр для системы ДМФХ-ХДХН (28,3 ± 1,8°С) вдвое больше, чем для системы ДМФХ-ХН (14,5 ± 2,9СС). По амплитуде структурного перехода (рис. 4, ДАпр) показано, что и размер образующихся везикул в системе ДМФХ-ХДХН больше, чем в системе ДМФХ-ХН. Все смеси ДМФХ-5р~Хол при изученных температурах находились в везикулярном состоянии.

Итак, в смесях ДМФХ с солями желчных кислот уменьшение числа гидроксильных групп в молекулах детергента, т.е. уменьшение размера их полярной части, приводит к уширению диапазона температур, в котором наблюдается переход мицеллы-везикулы, и вызывает увеличение размеров образующихся везикул.

Смеси додецилсульфата натрия (ЦСН) с ДМФХ

Кроме солей желчных кислот, были изучены смеси ДМФХ с более сильным электролитом - ДСН (рис. 1). Изучено влияние соли на характер термоиндуцируемого перехода в этой системе.

С помощью метода сканирующей турбидиметрии, для смесей ДМФХ-ДСН разного состава переход мицеллы-везикулы при нагревании был обнаружен только в деионизованной воде (рис. 6а, ККМдсн = 8,73-10,83 мМ [Majhi et al., 2001] и заметно возрастает при нагревании), в то время, как в буфере, содержащем 0,1 М NaCl, он не наблюдался (рис. 66, ККМДСн = 1,57-2 мМ [Tan et al, 2002] и слабо зависит от температуры).

Итак, термоиндуцируемый переход мицеллы-везикулы обусловлен скорее свойствами детергента, а не липида. Одним из факторов, вызывающих этот переход, может быть увеличение водной концентрации детергента при нагревании.

> 0,5

! мМ

12 мМ

40

Температура,

60

3 <

(б) мМ

12 мМ

40 „ 60 Температура, С

Смеси октилглюкозида с фосфатидилхолином Изучены смеси фосфатидилхолина (ДМФХ или яФХ) с неионным детергентом - октилглюкозидом (рис. 1, ОГ), который, как и ДСН, имеет высокую ККМ (ККМог = 20,8-27,9 мМ [Ма]Ы й а!., 2001]), существенно зависящую от температуры.

С помощью метода сканирующей турбидиметрии изучено структурное поведение систем яФХ-ОГ и ДМФХ-ОГ разного состава (рис. 7). Изменение оптической плотности смесей для этих систем во многом коррелировало с ККМ данного детергента, а именно, при нагревании сначала уменьшалось, а потом возрастало. Вероятно, в этих системах наблюдаются

последовательные процессы

термоиндуцируемой солюбилизации и перехода мицеллы-везикулы. На структурное поведение системы ДМФХ-ОГ влияет еще и основной фазовый переход липида в смешанных мицеллах, который также может вызывать переход мицеллы-везикулы (рис. 7, для 20 мМ ОГ максимум среднего пика на кривых ДСК совпадал по температуре с резким ростом оптической плотности смеси).

Итак, в зависимости от изменения водной концентрации детергента, переход мицеллы-везикулы может наблюдаться как при нагревании, так и при охлаждении.

Рис. 6. Кривые сканирующей турбидиметрии, полученные для системы ДМФХ-ДСН в

деионизованной воде (а) и буфере (100 мМ ЫаС1, 10 мМ Трис, рН 7,4) (б) при нагревании в зависимости от концентрации детергента в смеси. В смесях 5 мМ ДМФХ.

2 2

8 0

с О

(а)

21,6 мМ 25 мМ

20 40 60 Температура,°С

80

<'3

с О

■30 мМ

20

40 60 80 Температура,°С

Рис. 7. Кривые сканирующей турбидиметрии, полученные для систем яФХ-ОГ (а) и ДМФХ-ОГ (б) при нагревании, в зависимости от концентрации детергента в смеси. Концентрация яФХ составляет 3 мМ, а ДМФХ - 5 мМ.

Смеси алкильных эфиров полиэтиленгликоля (СпЕп) с фосфатидилхолином

Для алкильных эфиров полиэтиленгликоля (рис. 1, СпЕт) можно изучить влияние размера полярной головки и длины их углеводородной цепи на процесс самосборки мембран, выбирая СпЕт с разными т (изменяли в ряду С12Е8, С12Е7 и С12Е6) и п (изменяли в ряду С|2Е8, С14Е8 и С|6Е8). В смесях с липидом, изменением водной концентрации этих неионных детергентов при нагревании можно было пренебречь (для выбранных СпЕт ККМ < 0,1 мМ), поэтому переход мицеллы-везикулы в этом случае вызван другими факторами.

Когда Т| была больше температуры основного фазового перехода ДМФХ (рис. 8, начиная с 5 : 4), то в смесях ДМФХ-СпЕт высокая амплитуда структурного перехода говорит об образовании крупных везикул, размер которых увеличивался как при уменьшении т, так и при увеличении п. На температуру начала перехода мицеллы-везикулы больше влиял размер полярных головок детергента, чем длина его углеводородной цепи. Поэтому именно изменение размера этих полярных головок может вызывать данный переход.

Для систем ФХ-СпЕт интервал ДТпр (32-43°С) не зависел от длины жирнокислотных цепей молекул липида (ДПФХ и ДМФХ), но заметно уширялся при удлинении алкильных цепей молекул детергента. Размер полярных головок молекул детергента (т) не влиял на ширину этого интервала.

Итак, переход мицеллы-везикулы, т.е. процесс самосборки мембран в системах, содержащих алкильные эфиры полиэтиленгликоля, может быть вызван изменением размера полярной головки молекул этих детергентов при нагревании. Увеличения размера везикул, образующихся в системах ДМФХ-СпЕт в результате этого перехода, можно достичь как выбором детергента с меньшим размером полярной головки, так и с большей длиной алкильной цепи. А выбирая детергент с более длинной алкильной цепью, можно получить заметное уширение температурного интервала, в котором происходит данный переход.

0:20

Рис. 8. Кривые сканирующей турбидиметрии, полученные для системы ДМФХ-С12Е8 при нагревании, в зависимости от

12 8

О

с

0 20 40 60 Температура, °С

8о" соотношения липид : детергент в смеси (в мМ).

4.3. Математическая модель, описывающая переход мицеллы-везикулы

Описание модели

Молекулярные характеристики липида и детергента во многом определяют их параметры геометрической упаковки в смешанных агрегатах (рис. 9). Эти параметры являются ключевыми при изучении и модельном описании процесса самосборки мембран в смешанных липид-детергентных системах. Предложена математическая модель перехода мицеллы-везикулы, которая связывает данные параметры с основными характеристиками этого перехода. В отличие от известных моделей, было учтено наличие гош-конформеров в углеводородных цепях липида и детергента и точнее определены условия, при которых начинается и заканчивается переход мицеллы-везикулы.

Тип образующихся агрегатов можно описать безразмерным параметром молекулярной упаковки, 5, который для случая двухкомпонентной липид-детергентной системы был обобщён [Гольцов и др., 2004] следующим образом: =(у/ 'у<*)/(а/ 'V + 'ас/ 'Ьд) (1)» гДе ^е ~ мольное соотношение детергент/липид в смешанных агрегатах (а,, а(1, V,, и на рис. 9). Для бислоя он равен единице, в то время, как, например, для цилиндрических мицелл - 1/2, т.е. при переходе мицеллы-везикулы этот параметр возрастает. Увеличения 5е„, согласно выражению (1), можно добиться как уменьшением т.е. удалением детергента, так и изменением упаковочных параметров липида и детергента, например, при нагревании. Как показано выше, термоиндуцируемый переход мицеллы-везикулы обусловлен больше свойствами детергента, а не липида, из которых основное влияние на начало этого перехода оказывает размер полярной головки детергента. А он определяет площадь, приходящуюся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз, а,,. Поэтому, только её считали зависящей от температуры, а температурной зависимостью других упаковочных параметров пренебрегли. В предложенной модели считалось, что параметр в начале (Я*0) и при

Липид Детергент Липид-дергентный монослой

Рис. 9. Упаковочные параметры липида и детергента в агрегатах: я, и аа -площадь на границе раздела фаз, V, и — гидрофобный объем, /?,, и к^ -эффективная толщина монослоя.

окончании (R*"') перехода мицеллы-везикулы имеет строго заданные значения SKp и Sv, не зависящие от выбранной липид-детергентной системы. В этих условиях, выражение (1) задаёт связь состава липид-детергентных агрегатов (Re) и упаковочных параметров детергента и липида.

Гидрофобные объёмы липида {v,) и детергента (v,y) рассчитывали на основе ван-дер-ваальсовых объёмов для метильной (54 А3) и метиленовой групп (28,4 А3). За hM принимали среднее из эффективных толщин однокомлонентных липидных и детергентных монослоев с учетом того, что липидная молекула имеет две углеводородных цепи, а детергентная молекула - одну: hdl ={l-h, + R*0' ■ hd)/(2 + Rse°') (2). Длину полностью вытянутой неразветвленной углеводородной цепи, содержащей п атомов углерода, оценивали по формуле Танфорда: hmm=(1,54 + 1,265 ■ п) А (3). Наличие в ней гош-конформеров учли введением параметра ft < I, так что hm = Y\' ■

Используя известные литературные данные для ДМФХ и ДПФХ, считали (точность 3-8 А2), что в жидкокристаллическом состоянии а, = 63 А2 (4) и не зависит от температуры и состава липид-детергентных агрегатов.

Из выражения (1) по полученным зависимостям R®ol(T) для систем ДМФХ-С|2Е7 и ДМФХ-С12Е8 и литературным значениям аа для С12Е7 и С12Е8, определили, что в среднем SKp -ft = 0,554 ± 0,009 (5).

На основании оценок (2), (4) и (5) и выражения (1) было получено: а (ть (v, + Rr'(T) vJ-(2 + Rr'(T)) 63

"V ; 0,554■ Rf(Т)-(2■ hp* + Rf(T)-h™) Kf(т) При этом предполагалось, что ац не зависит от состава смешанных агрегатов.

В силу своего специфического строения, молекулы солей желчных кислот могут находиться как на поверхности липид-детергентных агрегатов (рис. 10я и 106), так и встраиваться в их гидрофобную область (рис. 10s). По молекулярным моделям и литературным данным получено, что в первом случае

(в)

т Т

Рис. 10. Различные варианты ориентации молекул солей желчных кислот относительно молекул липида. (я) Молекулы детергента находятся на границе между гидрофобной областью ацильных цепей липидной фазы и водой; (б) молекулы детергента располагаются в области полярных головок липида; (в) молекулы детергента встроены в гидрофобную область агрегатов.

алх = 120 А2 (110 А2 для ДХН) и vdl = 410 А3, а во втором аа2 = 45 А2 и ^ = 470 А3 (450 А3 для ДХН). Средние а^ =а-ал+(\-а)-а<12 и = а• V,/,+(1-а)-где а - доля молекул солей желчных кислот, плоско лежащих на поверхности липид-детергентных агрегатов. Считая, что Иш я ух-ИГ и используя выражение (1) определили эту долю в зависимости от температуры:

а(т)_ V/ -0,554 ■ ИГ ■ а, + ¡С'(т)- (у,2 - 0,554■ ИГ >) п)

У ЯГ'СГ)- (0,554 ■ - а«)- ЛГ" + V« - V.,,)

При 11"', считая, что для смешанного липид-детергентного бислоя Иа = у2 ■ ИГ, где у2 < 1, из выражения (1) получили:

= (V, -6у-у2-аг ИГШ -Уг-а,- ИГ - V„) (8).

Для достаточно крупных везикул (>100 нм) с ошибкой меньше 4% можно считать, что 5У « 1. Тогда выражение (8) задаёт взаимосвязь параметров Я"' и у2. Используя известные значения Я"', можно оценить параметр у2. А зная у2, по выражению (8) можно определить Я"' для любых липид-детергентных систем.

Итак, разработана математическая модель перехода мицеллы-везикулы, позволяющая для агрегатов известного состава и типа определить упаковочные параметры амфифильных молекул. Если же, наоборот, эти упаковочные параметры известны, то можно, например, определить границы области сосуществования мицелл и везикул (Я"' и 11®°').

Определение состава смешанных липид-детергентных агрегатов В предложенной математической модели нужно знать состав смешанных агрегатов, образующихся на различных стадиях перехода мицеллы-везикулы, например, К;01. Задача его определения особенно актуальна для липид-детергентных систем, содержащих детергенты с высокой ККМ. При анализе термоиндуцируемых переходов нужна также температурная зависимость этого состава. Для этого предложен наименее трудоёмкий способ его определения, описанный ниже на примере системы ДМФХ-ХН.

Липид-детергентные смеси разного состава сравнивали по температуре Т4 (рис. 4). Считалось, что смеси с одинаковой Т4 имеют одинаковый состав агрегатов (11е). Причём, при этой температуре он равен 11®°', а концентрация детергента в воде - .

В координатах липид-детергент смеси с одинаковой Т4 хорошо ложились на одну прямую (рис. 11). Тангенс угла наклона этой прямой задаёт 11®°', а точка её пересечения с осыо ординат - (рис. 11). Иными словами: О = В^'(Т4) + К*°'(Т4)-Ь (9), где Э и Ь - концентрации детергента и липида в

39,7 ± 0,8

4 8 12 16 Димиристоилфосфатидилхолин, мМ

Рис. 11. Линейные зависимости, полученные между концентрациями детергента и липида для смесей ДМФХ-ХН с одинаковой температурой Т4 (указана рядом с прямыми в градусах Цельсия).

смеси. Для наборов смесей с 57,8 ± 1,0 постоянной L и переменной D строили зависимости D(T4) там, где они взаимнооднозначные. Оказалось, что при любой L зависимости D(T4) являются полиномами первой степени. Следовательно, зависимости D™'(T4) и Rf(T4) тоже будут полиномами первой или меньшей степени. Поэтому, интерполяция экспериментальных данных проводилась зависимостью: D = а, + а2 ■ Т4 + (¿, + Ь2 ■ Т4)- L (10). Она хорошо описывала экспериментальные данные (г = 0,998, SD = 0,2 мМ, ошибка приготовления образцов 0,1-0,3 мМ). Зная параметры зависимости (10)

sol/

определили D^(T)= а, + агТ (11) и Rsc0,(t) = 6, + b2 Т (12). А ошибки o"D10, =

0,09-0,21 мМ и о-

0,009-0,019 определены, используя ковариационную

матрицу ошибок а, и .

Состав агрегатов определили предложенным способом также по данным ДСК. В этом случае, смеси разного состава сравнивали по одной из температур максимумов трёх основных пиков на кривых ДСК - Т,, Т2 или Т3 (рис. 3). Совпадение в пределах ошибок эксперимента состава агрегатов, определённого при температурах Т2 и Т3 (отличие десятки градусов), позволило заключить, что в смесях ДМФХ-ХН состав агрегатов и связанная с ним концентрация детергента в воде от температуры не зависят. Следовательно, в этой системе переход мицеллы-везикулы при нагревании вызван не изменением концентрации детергента в воде, а другими факторами.

Итак, предложен новый способ определения температурной зависимости состава смешанных липид-детергентных агрегатов в условиях перехода мицеллы-везикулы. Для смесей ДМФХ-ХН показано, что изменением состава агрегатов при нагревании можно пренебречь.

Использование предложенной модели для определения основных параметров, характеризующих процесс самосборки мембран Зная К"', исходя из предложенной математической модели можно определить площадь аа, а из неё для липид-детергентных систем, содержащих соли желчных кислот, - долю а. Кроме этих основных параметров, характеризующих процесс самосборки мембран, предложенная модель позволяет предсказать условия формирования смешанных везикул, т.е. условия самосборки мембран в смешанных липид-детергентных системах.

Система к?0' эксперимент а, л1 яг'

расчёт эксперимент расчёт эксп.

дмфх-с|2е, 0,70" (25°с) 63 60 + 2 (25°с) 0,45 ±0,12 -

дмфх-с12е7 1,29" (25°с) 52 54 + 3 (25°с) 0,8 ± 0,2 -

дмфх-ог 1,79 (27°с) 48 51 ± 3 (23°с) 1,0 ±0,3 1,56

2,03 (70°с) 47 - 1,1 ±0,4 1,66

дмфх-дсн 0,82" (30°с) 59 55 (30°с) 0,51 ±0,13 -

0,69 (30°с) 63 0,44 ±0,12 0,32

0,63 (60°с) 65 - 0,40 ±0,12 0,59

1,52 (60°с, 0,1 м №с1) 50 - 0,9 ± 0,2 1,05

дмфх-дтаб 0,79 (30°с) 60 68 0,50 ±0,13 0,42

дмфх-ттаб 0,63 (30°с) 66 - 0,40 ±0,12 0,46

дпфх-дтаб 1,0 (45°с) 56 - 0,6 ± 0,2 0,34

дпфх-ттаб 1,0 (45°с) 56 - 0,6 ± 0,2 0,36

дпфх-гтаб 1,0 (45°с) 56 - 0,6 ± 0,2 0,45

дпфх-меоа-8 1,7 (45°с) 49 44,9 (30°с) 1,0 ±0,3 -

ДПФХ-МЕОА-9 1,6 (45°с) 50 46,4 (30°с) 0,9 ± 0,2 -

дпфх-мео а-10 1,6 (45°с) 50 45,2 (30°с) 0,9 ± 0,2 -

дпфх-дм 1,4 (37°с) 51 54 (37°с) 0,8 ± 0,2 -

" Данные настоящей работы

Используя как полученные в настоящей работе, так и литературные значения 11*°', с помощью выражения (6) определили для различных липид-детергентных систем (см. Таблицу). Оказалось, что для детергентов совершенно разного строения эти расчётные значения аа хорошо согласуются с литературными данными, полученными в экспериментах на мономолекулярных пленках или с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния (см. Таблицу, 80 = 4,5 А2 ). Но определение ал предложенным способом имеет целый ряд преимуществ перед другими методами, т.к. позволяет получить эти значения непосредственно в липид-детергентных агрегатах разного строения для разбавленных водных систем и в широком диапазоне температур.

Для ДСН (~0 А2/°С) и ОГ (-0,02 А2/°С) было получено, что ал практически не зависит от температуры. Для систем, содержащих эти детергенты, с температурой существенно изменялось только О™1, поэтому основным фактором, вызывающим самосборку мембран в этом случае, вероятно, является изменение водной концентрации детергента при нагревании. Для многих детергентов наоборот, концентрация детергента в воде не изменялась, в то время, как а3 заметно уменьшалась при нагревании, как, например, для додецилмальтозида (ДМ, -0,5 А2/°С), для изученных СпЕт (-0,3-0,8 А2/°С) и для холата натрия (-0,3 А2/°С для ДМФХ-ХН). Если для СпЕт или ДМ уменьшение

ал можно связать с дегидратацией полярных головок детергента при нагревании, то для холата натрия оно, вероятно, вызвано переориентацией молекул детергента относительно молекул липида (рис. 10).

Из выражения (8), используя экспериментальные значения Я"', получили в среднем, что у2 = 0,59 ± 0,03 (± Бй). Используя это значение в выражении (8), получили зависимость Я"' от а[1. А ал определяли с помощью выражения (6) по Я*0'. Т.е., для любой липид-детергентной системы можно оценить Л"', зная величину Я*0'. Сравнение расчётных значений Я*3' с экспериментальными показывает, что в целом теоретический расчёт даёт разумные оценки Я"1, которые в большинстве случаев достаточно близки к экспериментально найденным величинам (см. Таблицу). Существует достоверная (р < 0,05) корреляция (г = 0,911) между расчётными и экспериментальными значениями

г;'.

Значения параметра у2 уточнили, определив температурный диапазон, в котором наблюдается переход мицеллы-везикулы, ДТпр (рис. 4). Для изученных систем ФХ-СпЕт, где не зависит от температуры, из выражения (8) была определена температура Т5, при которой К(Т5) = т.е. оценен ДТпр =

Т5 - Т4. Оказалось, что при уг = 0,621 расчётные значения ДТпр отличаются от экспериментальных меньше, чем на 9 % от величины АТпр.

Для системы ДМФХ-ДСН, где,

ДНП= 30,2 ± 0,4 кДж/моль наобоРот> существенно зависит от Д8П = 97,9 ± 1,5 Дж/(моль-К) температуры, а а, постоянно, используя

зависимость выражение (8) для

(У2 = 0,621) и считая, что при любой температуре и , в

диапазоне концентраций ДСН 8-12 мМ (5 мМ ДМФХ) был оценен ДТпр = 13,7 ± 1,9°С (± 8Э). По экспериментальным данным ДТпр = 13 ± 3°С (± 50).

Для липид-детергентных систем, содержащих соли желчных кислот, используя экспериментальные

зависимости 11"'(т) (у2 = 0,621) и К*°'(т) по выражению (7) были получены температурные зависимости доли а(Т) (рис. 12). Уменьшение а при нагревании можно объяснить сдвигом равновесия между различными

Температура, °С

Рис. 12. Зависимости доли молекул холата натрия, плоско лежащих на границе раздела фаз в липид-детергентных агрегатах, а, от температуры при Л®3' и Л®0' для системы ДМФХ-ХН. Линиями даны интерполяции зависимостью (13). ДНпи Д8П рассчитаны при (см. текст).

ориентациями молекул солей желчных кислот (рис. 10) в сторону их встраивания в гидрофобную область агрегатов. Предполагая, что между молекулами солей желчных кислот, располагающимися в области полярных головок липида (А), и молекулами этих детергентов, встроенными в гидрофобную область агрегатов (В) существует равновесие вида: А В, зависимость а(Т) можно описать выражением:

¿Н„-ТА5П

/„ч 1 + а0-е кт ....

\ + е ат

где ДНП и Д8„ - изменения энтальпии и энтропии при переориентации молекул холата натрия, соответственно. Считалось, что молекулы детергента, находящиеся на границе между гидрофобной областью ацильных цепей липидной фазы и водой (рис. 10а), в равновесии не участвуют и их доля обозначена за а0. При переходе мицеллы-везикулы а существенно уменьшается (рис. 12, ср. кривые 2 и 1). Используя эту разницу в а и полученные значения ДН„, определили, что при этом переходе должно поглощаться (± БИ): 6,2 ± 1,2 мДж (5 мМ ДМФХ и 5-10 мМ ХН), 6,9 ± 1,8 мДж (5 мМ ДМФХ и 4-6 мМ ДХН) и 14 ± 3 мДж (10 мМ ДПФХ и 7-8 мМ ХН). Эти расчётные значения, полученные на основании данных сканирующей турбидиметрии, хорошо совпадают с экспериментальными значениями, полученными по площади высокотемпературного пика на кривых ДСК (± 8Э): 6,9 ± 1,5, 9,9 ± 1,3 и 14 ± 2 мДж, соответственно. Более того, расчётная зависимость хорошо описывает изменение количества поглощенного тепла от концентрации детергента в смеси.

Итак, основные характеристики структурных переходов, полученные с помощью метода сканирующей турбидиметрии, и модельное описание этих переходов позволяет получить один из ключевых параметров, влияющих на процесс самосборки мембран, - площадь, приходящуюся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз в смешанных агрегатах, а^. При этом, легко получить её зависимость от внешних условий, например, температуры. Причём, предложенный способ определения ал, в отличие от существующих методов позволяет определять эту площадь в широком диапазоне температур, в разбавленных водных системах и для смешанных агрегатов различного строения (например, мицеллы или везикулы). Только этот способ позволил определить среднюю площадь, приходящуюся на одну молекулу солей желчных кислот в смешанных агрегатах. Анализ температурной зависимости этой площади показал, что поглощение тепла, наблюдающееся при переходе мицеллы-везикулы в данных системах, обусловлено процессом переориентации молекул детергента относительно молекул липида. Предложенная модель позволяет также предсказать условия самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах, а именно, определить диапазон температур, в котором наблюдается процесс самосборки мембран, и оценить состав образующихся при этом везикул, К®3'.

Выводы

1. Впервые проведено систематическое исследование влияния различных факторов на процесс самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах.

2. Установлено, что природа липида и детергента оказывает решающее влияние на характер термоиндуцируемого перехода мицеллы-везикулы в смешанных липид-детергентных системах.

3. Показано, что самосборка мембран при повышении температуры может быть вызвана как изменением состава смешанных липид-детергентных агрегатов, так и изменением площади, приходящейся на одну молекулу детергента на поверхности этих агрегатов.

4. Изучены тепловые процессы, протекающие в термочувствительных липид-детергентных системах при нагревании, и установлена их связь с происходящими при этом структурными превращениями. Для смесей, содержащих соли желчных кислот, предложена молекулярная модель, количественно описывающая поглощение тепла при переходе мицеллы-везикулы.

5. Разработана математическая модель, описывающая переход мицеллы-везикулы в липид-детергентных системах, которая позволяет предсказать условия самосборки мембран в этих системах и определять параметры геометрической упаковки липидных и детергентных молекул в смешанных агрегатах разного типа.

6. В рамках этой модели предложен новый способ определения состава смешанных липид-детергентных агрегатов, образующихся на различных этапах самосборки мембран.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Катчан И.В., Храмцов Ю.В. Термозависимая самоорганизация липид-детергентных систем // XIII зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 7-9 февраля 2001, С. 66.

2. Храмцов Ю.В.. Катчан И.В., Барсуков Л.И. Новый метод построения фазовых диаграмм для смешанных липид-детергентных систем // XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 11-15 февраля 2002, С. 79.

3. Барсуков Л.И., Храмцов Ю.В., Гольцов А.Н. Самосборка мембран в термочувствительных липид-детергентных системах // III съезд биохимического общества. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002, С. 328-329.

4. Барсуков Л.И., Храмцов Ю.В.. Катчан И.В., Гольцов А.Н., Исламов А.Х., Горделий В.И. Термочувствительные липид-детергентные системы как модель для изучения самосборки мембран // Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва - Пущино, 25 ноября - 2 декабря 2002, С. 20.

5. Храмцов Ю.В.. Барсуков Л.И. Аналитическое описание фазового поведения термочувствительных липид-детергентных систем // XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 10-14 февраля 2003, С. 12.

6. Храмцов Ю.В.. Симонова Т.Н., Суханов C.B., Барсуков Л.И. Термоиндуцируемые структурные и фазовые переходы в смешанной системе димиристоилфосфатидилхолин-холат натрия по данным турбидиметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии // Medline.ru. 2008. Т. 9. С. 138-148.

7. Храмцов Ю.В.. Барсуков Л.И. Новый способ количественного определения состава смешанных липид-детергентных агрегатов // Medline.ru. 2008. Т. 9. С. 149-159.

8. Храмцов Ю.В.. Барсуков Л.И. Оценка площади, приходящейся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз в смешанных липид-детергентных агрегатах // Биологические мембраны. 2008. Т. 25. № 6. С. 509-519.

Подписано в печать:

19.04.2011

Заказ № 5358 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Храмцов, Юрий Викторович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структурообразование в системах, содержащих один вид амфифильных молекул

4.2. Влияние строения липидов и детергентов на переход мицеллы-везикулы в смешанных системах

2.2. Структурные превращения в смешанных липид-детергентных системах

2.2.1. Солюбилизация липидных мембран детергентом

2.2.1.1. Фазовые диаграммы для смешанных липид-детергентных ^ систем

2.2.1.2. Свойства широко использующихся детергентов

2.2.1.3. Описание взаимодействия детергента с липидной фазой

2.2.1.4. Механизмы солюбилизации липидных мембран детергентом

2.2.2. Переход мицеллы-везикулы

2.3. Применения перехода мицеллы-везикулы

2.3.1. Изучение строения и условий существования бицелл

2.3.2. Солюбилизация мембранных белков и их встраивание в липидные 58 мембраны

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Термоиндуцируемые структурные и фазовые переходы в системе ДМФХ-ХН

4.2.1. Влияние строения жирнокислотных цепей фосфолипидных молекул

4.2.2. Влияние холестерина

4.2.3. Влияние строения молекул солей желчных кислот

4.2.4. Смеси додецилсульфата натрия (ДСН) с ДМФХ

4.2.5. Смеси октилглюкозида с фосфатидилхолином

4.2.6. Смеси алкильных эфиров полиэтиленгликоля (СпЕт) с фосфатидилхолином

4.3. Математическая модель, описывающая переход мицеллы-везикулы Ю

4.3.1. Описание модели

4.3.2. Определение состава смешанных липид-детергентных агрегатов

4.3.3. Использование предложенной модели для определения основных 120 параметров, характеризующих процесс самосборки мембран

5. ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Храмцов, Юрий Викторович

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено систематическое исследование влияния различных факторов на процесс самосборки мембран в термочувствительных липид-детергентных системах.

2. Установлено, что природа липида и детергента оказывает решающее влияние на характер термоиндуцируемого перехода мицеллы-везикулы в смешанных липид-детергентных системах.

3. Показано, что самосборка мембран при повышении температуры может быть вызвана как изменением состава смешанных липид-детергентных агрегатов, так и изменением площади, приходящейся на одну молекулу детергента на поверхности этих агрегатов.

4. Изучены тепловые процессы, протекающие в термочувствительных липид-детергентных системах при нагревании, и установлена их связь с происходящими при этом структурными превращениями. Для смесей, содержащих соли желчных кислот, предложена молекулярная модель, количественно описывающая поглощение тепла при переходе мицеллы-везикулы.

5. Разработана математическая модель, описывающая переход мицеллы-везикулы в липид-детергентных системах, которая позволяет предсказать условия самосборки мембран в этих системах и определять параметры геометрической упаковки липидных и детергент-ных молекул в смешанных агрегатах разного типа.

6. В рамках этой модели предложен новый способ определения состава смешанных липид-детергентных агрегатов, образующихся на различных этапах самосборки мембран.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Храмцов, Юрий Викторович, Москва

1. Gorter Е., Grendel F. On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes in blood // J. Exp. Med. 1925. V. 41. P. 439-443.

2. Cevc G., Marsh D. Phospholipid bilayers. Physical principles and models // 1987. A Wiley -InterScience Publication, John Wiley & Sons.

3. Guida V. Thermodynamics and kinetics of vesicles formation processes // Adv. Colloid Interface Sci. 2010. V. 161. P. 77-88.

4. Tanford C. The hydrophobic effect: formation of micelles and biological membranes // 1980. 2nd Ed. John Wiley, New York.

5. Lichtenberg D. Micelles and Liposoms. In: Biomembranes. Physical Aspects // 1993. M. Schinitzky Ed. VCH.

6. Генис P. Биомембраны. Молекулярная структура и функции // 1997. М.: Мир.

7. Garavito R.M., Ferguson-Miller S. Detergents as tools in membrane biochemistry // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32403-32406.

8. Prive G.G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins // Methods. 2007. V. 41. № 4. P. 388-397.

9. Almgren M. Mixed micelles and other structures in the solubilization of bilayer lipid membranes by surfactants // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 146-163.

10. Stuart M.C.A., Boekema E.J. Two distinct mechanisms of vesicle-to-micelle and micelle-to-vesicle transition are mediated by the packing parameter of phospholipid-detergent systems // Biochem. Biophys. Acta. 2007. V. 1768. P. 2681-2689.

11. Elsayed M.M.A., Cevc G. The vesicle-to-micelle transformation of phospholipid-cholate mixed aggregates: A state of the art analysis including membrane curvature effects // Biochem. Biophys. Acta. 2011. V 1808. P. 140-153.

12. Sudbrack T.P., Archilha N.L., Itri R., Riske K.A. Observing the solubilization of lipid bilayers by detergents with optical microscopy of GUVs // J. Phys. Chem. B. 2011. V. 115. P. 269277.

13. Ollivon M., Lesieur S., Grabielle-Madelmont C., Paternostre M. Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 34-50.

14. Полозова А.И., Дубачев Г.Э., Симонова Т.Н., Барсуков Л.И. Аномальное термотропное поведение бинарных смесей насыщенных фосфатидилхолинов с холатом натрия // Биоорганическая химия. 1993. Т. 19. С. 655-662.

15. Chopineau J., Lesieur S., Carion-Taravella B., Ollivon M. Self-evolving microstructured systems upon enzymatic catalysis // Biochimie. 1998. V. 80. P. 421-435.

16. Caffrey M. Membrane protein crystallization // J. Struct. Biol. 2003. V. 142. P. 108-132.

17. Arora A., Tamm L.K. Biophysical approaches to membrane protein structure determination // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 540-547.

18. Whiles J.A., Deems R., Void R.R., Dennis E.A. Bicelles in structure-function studies of membrane-associated proteins // Bioorg. Chem. 2002. V. 30. P. 431-442.

19. Prosser R.S., Evanics F., Kitevski J.L., Al-Abdul-Wahid M.S. Current applications of bicelles in NMR studies of membrane-associated amphiphiles and proteins // Biochemistry. 2006. V. 45. № 28. P. 8453-8465.

20. Raschle T., Hiller S., Etzkorn M., Wagner G. Nonmicellar systems for solution NMR spectroscopy of membrane proteins // Cur. Opin. Struct. Biol. 2010. V. 20. P. 471-479.

21. Van Dam L., Karlsson G., Edwards K. Direct observation and characterization of DMPC/DHPC aggregates under conditions relevant for biological solution NMR // Biochem. Biophys. Acta. 2004. V. 1664. P. 241-256.

22. Rowe B.A., Neal S.L. Fluorescence probe study of bicelle structure as a function of temperature: Developing it practical bicelle structure model // Langmuir. 2003. V. 19. P. 2039-2048.

23. Nieh M.P., Glinka C.J., Krueger S., Prosser R.S., Katsaras J. SANS study of the structural phases of magnetically alignable lanthanide-doped phospholipid mixtures // Langmuir. 2001. V. 17. P. 2629-2638.

24. Sinico C., Fadda A.M! Vesicular carriers for dermal drug delivery // Expert Opin. Drug Deliv. 2009. V. 6. P. 813-825.

25. Marzio L.D., Marianecci C., Petrone M., Rinaldi F., Carafa M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between Tween 21 and Tween 20 // Colloids Surf. B: Biointerfaces. 2011. V. 82. P. 18-24.

26. Yin H., Huang J., Lin Y., Zhang Y., Qiu S., Ye J. Heating-induced micelle to vesicle transition in the cationic-anionic surfactant systems: comprehensive study and understanding // J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109. P. 4104-4110.

27. Minewaki K., Kato T., Yoshida H., Imai M., Ito K. Small-angle X-ray scattering from the lamellar phase formed in a nonionic surfactant (C16E7)-Water system. Analysis of peak position and line shape // Langmuir. 2001. V. 17. P. 1864-1871.

28. Kocherbitov V. Driving forces of phase transitions in surfactant and lipid systems // J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109. № 13. P. 6430-6435.

29. Epand R.M. Membrane lipid polymorphism: relationship to bilayer properties and protein function // Methods Mol. Biol. 2007. V. 400. P. 15-26.

30. Seddon J.M., Robins J., Gulik-Krzywicki T., Delacroix H. Inverse micellar phases of phospholipids and glycolipids // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. V. 2. № 20. P. 4485-4493.

31. Garg G., Saraf S., Swarnlata S. Cubosomes: An overview // Biol. Pharm. Bull. 2007. V. 30. №2. P. 350-353.

32. Israelachvilli J.N. Intermolecular and surface forces // 1992. Second edition. London, Academic Press, 450 p.

33. Gruen D.W.R., Lasey E.H.B. in "Surfactants in solution" V. 1 // 1984. Eds. Mittal K.N., Lindman B. / Plenum, New York. P. 279-306.

34. Fattal D.R., Ben-Shaul A. Lipid chain packing and lipid-protein interaction in membranes // Physica A. 1995. V. 220. P. 192-210.

35. Hauser H. Short-chain phospholipids as detergents // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 164-181.

36. Corti M., Boretta M., Cantu L., Favero E.D., Lesieur P. Dependence of the form factor of ganglioside micelles on a conformational change with temperature // J. Mol. Struct. 1996. V. 383. P. 91-98.

37. Lamy-Freund M.T., Riske K.A. The peculiar thermo-structural behavior of the anionic lipid DMPG // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 122. P. 19-32.

38. Fernandez R.M., Riske K.A., Amaral L.Q., Itri R., Lamy M.T. Influence of salt on the-structure of DMPG studied by SAXS and optical microscopy // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1778. №4. P. 907-916.

39. Gawrisch K., Parsegian V.A., Hajduk D.A., Tate M.W., Gruner S.M., Fuller N.L., Rand R.P. Energetics of a hexagonal-lamellar-hexagonal phase transition sequence in dioleoylphos-phatidylethanolamine membranes // Biochemistry. 1992. Y. 31. P. 2856-2864.

40. Binder H., Gawrisch K. Dehydration induced lateral expansion of polyunsaturated 18:0-22:6 phosphatidylcholine in a new lamellar phase // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 969-982.

41. Winter R. Effects of hydrostatic pressure on lipid and surfactant phases // Curr. Opin. Colloid In. 2001. V. 6. № 3. P. 303-312.

42. Winter R. Synchrotron X-ray and neutron small-angle scattering of lyotropic lipid mesophases, model biomembranes and proteins in solution at high pressure // Biochim. Bio-phys. Acta. 2002. V. 1595. P. 160-184.

43. Zulauf M., Weckstrom K., Hayter B., Degiorgio V., Corti M. Neutron scattering study of micelle structure in isotropic aqueous solutions of poly(oxyethylene) amphiphiles // J. Phys. Chem. 1985. V. 89. P. 3411-3417.

44. Strey R. Microemulsion microstructure and interfacial curvature // Colloid Polym. Sci. 1994. V. 272. P. 1005-1019.

45. Glatter O., Fritz G., Lindner H., Brunner-Popela J., Mittelbach R., Strey R., Egelhaaf S.U. Nonionic micelles near the critical point: Micellar growth and attractive interaction // Lang-muir. 2000. Y. 16. № 23. P. 8692-8701.

46. Bernheim-Groswasser A., Wachtel E., Talmon Y. Micellar growth, network formation, and criticality in aqueous solutions of the nonionic surfactant C12E5 // Langmuir. 2000. V. 16. № 9. P. 4131-4140.

47. Kato T., Nozu D. Structure and dynamics of concentrated micellar phase in nonionic surfactant-water systems // J. Mol. Liq. 2001. V. 90. P. 167-174.

48. Tate M.W., Shyamsunder E., Gruner S.M., Damico K.L. Kinetics of the lamellar inverse hexagonal phase-transition determined by time-resolved X-ray-diffraction // Biochemistry. 1992. V.31.P. 1081-1092.

49. Toombes G.E.S., Finnefrock A.C., Tate M.W., Gruner S.M. Determination of La-Hn phase transition temperature for l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 2504-2510.

50. Riske K.A., Fernandez R.M., Nascimento O.R., Bales B.L., Lamy-Freund M.T. DMPG gel-fluid thermal transition monitored by a phospholipid spin labeled at the acyl chain end // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 124. P. 69-80.

51. Riske K.A., Politi M.J., Reed W.F., Lamy-Freund M.T. Temperature and ionic strength dependent light scattering of DMPG dispersions // Chem. Phys. Lipids. 1997. V. 89. P. 31-44.55